專利名稱：GnRH－白細胞毒素嵌合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來說本發(fā)明涉及免疫學(xué)載體系統(tǒng)。更具體地說，本發(fā)明涉及白細胞毒素GnRH嵌合體，它包括一個以上的GnRH多肽的拷貝。與單獨的GnRH多肽比較，該嵌合體顯示出增強的免疫原性。
背景技術(shù)：
在脊椎動物中，兩種促性腺激素，促黃體素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和釋放稱為促性腺素釋放激素(GnRH)(過去稱為LHRH)的多肽的調(diào)節(jié)。因此，一條控制動物群體的生育的途徑是降低GnRH的水平，如通過抗GnRH的免疫接種，這一方法使LH和FSH的水平降低，并伴隨著破壞發(fā)情周期和精子生成。參見例如Adams等人，動物科學(xué)雜志(1990)68:2793-2802。
對GnRH分子的早期研究已經(jīng)表明在對重復(fù)注射合成的GnRH肽的應(yīng)答中產(chǎn)生抗血清是可能的(Arimura等人，內(nèi)分泌學(xué)(1973)93(5):1092-1103)。另外，在許多種類中，通過將GnRH與適當?shù)妮d體化學(xué)地共軛并以適當?shù)闹鷦┲械墓曹椢锝o藥已經(jīng)產(chǎn)生抗GnRH的抗體(Carelli等人，美國核酸科學(xué)進程(1982)79:5392-5395)。已經(jīng)敘述過將含有GnRH或GnRH類似物的重組融合蛋白用于肽疫苗中，以便對各種馴養(yǎng)的和農(nóng)場的動物進行免疫去雄或抑制它們的生育功能(Meloen等人，疫苗(1994)12(8):741-746；Hoskinson等人，澳大利亞生物技術(shù)雜志(1990)4:166-170；和1992年11月12日公開的國際公開號，WO92/19746；1991年3月7日公開的WO91/02799,1990年10月4日公開的WO90/11298,1986年12月公開的WO86/07383)。
但是，由于不能提供適當?shù)拿庖邔W(xué)絕育產(chǎn)品這樣的嘗試失敗，因為GnRH肽的免疫原性較小，和化學(xué)共軛方案難于控制，使GnRH共軛物基本上是異源的并且不確定的事實。另外，基于GnRH的肽疫苗在對單個動物個體提供均一的效果的成功率是有限的，甚至在重復(fù)接種后。關(guān)于這一點，過去的GnRH構(gòu)建體不能提供均一的成功的免疫絕育疫苗產(chǎn)品，因為GnRH是小的“自體”分子，個體的免疫系統(tǒng)不能正常識別，使該分子的免疫原性較小，并且內(nèi)在地不能誘導(dǎo)對內(nèi)源GnRH的明顯的免疫應(yīng)答。
通常認為通過生產(chǎn)這些含有選定的表位的多重拷貝的分子的免疫原性形式可以明顯地提高病毒抗原，小蛋白或內(nèi)源物質(zhì)的免疫原性。在這一點上，基于1型單純皰疹病毒糖蛋白D的肽9-12的兩個或四個重復(fù)(Ploeg等人，免疫學(xué)方法雜志(1989)124:211-217)，惡性瘧原蟲抗原瘧的原蟲四肽NPNA的兩個到六個重復(fù)(Lowell等人，科學(xué)(1988)240:800-802)，口啼疫疾病病毒的VP1的主要免疫原位點的兩個或四個拷貝(Broekhuijsen等人，J.gen.Virol.(1987)68:3137-3143)和類似GnRH的多肽的任意重復(fù)(Meloen等人，疫苗(1994)12(8):741-746)的構(gòu)建體已經(jīng)表明能有效地增加這些分子的免疫原性。
為了在受到攻擊的寄主中引發(fā)明顯的免疫應(yīng)答，將小蛋白或內(nèi)源物質(zhì)也可以與適當?shù)妮d體共軛。通常適當載體是多肽，包括起源于感染物質(zhì)的蛋白質(zhì)如病毒表面蛋白，或載體肽序列的抗原區(qū)。這些載體的作用是非特異地刺激T輔助細胞的活性，和幫助指導(dǎo)抗原到提供抗原的細胞以便在細胞表面加工和呈現(xiàn)該肽，該肽與主要的組織相容性復(fù)合物(NHC)的分子結(jié)合。
為了這一目的，已經(jīng)研制了幾個載體系統(tǒng)。例如，小肽抗原經(jīng)常與蛋白質(zhì)載體如匙孔血藍蛋白(Bittle等人，自然(1982)298:30-33)，破傷風(fēng)類毒素(Muller等人，美國核酸科學(xué)進程(1982)79:569-573)，卵清蛋白，和鯨精子肌紅蛋白偶聯(lián)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這些偶聯(lián)反應(yīng)通常導(dǎo)致在每摩爾的載體蛋白中摻入幾摩爾的肽抗原。雖然肽抗原以多重拷貝呈現(xiàn)通常能增強免疫原性，載體可以引發(fā)與肽抗原不相關(guān)的強免疫性，這可以抑制次級免疫接種的肽疫苗的免疫應(yīng)答(Schutze等人，免疫學(xué)雜志(1985)135:2319-2322)。
抗原傳遞系統(tǒng)也是基于顆粒載體的。例如，可以將預(yù)先形成的顆粒用作平臺，抗原可以與其偶聯(lián)和摻入其中。已經(jīng)開發(fā)的有基于蛋白體(Lowell等人，科學(xué)(1988)240:800-802)，免疫刺激復(fù)合物(Morein等人，自然(1984)308:457-460)，和病毒顆粒如HBsAg(Neurath等人，分子免疫學(xué)(1989)26:53-62)，和輪狀病毒內(nèi)部衣殼蛋白(Redmond等人，分子免疫學(xué)(1991)28:269-278)的系統(tǒng)。
利用重組生產(chǎn)的嵌合蛋白也已經(jīng)設(shè)計了載體系統(tǒng)，該嵌合蛋白可以自我組裝成顆粒。例如，酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，Ty，編碼一系列蛋白，可以組裝成類似病毒顆粒(Ty-VLPs；Kingsman,S.M.，和A.J.Kingsman疫苗(1988)6:304-306)。已經(jīng)將外源基因插入TyA基因并在酵母中以融合蛋白形式表達。融合蛋白保留了自我組裝成均一大小的顆粒的能力。
已經(jīng)檢測了其它嵌合蛋白顆粒如HBsAg,(Valenzuela等人，生物/技術(shù)(1985)3:323-326；美國專利號，4,722,840；Delpeyroux等人，科學(xué)(1986)233:472-475)，乙型肝炎核心抗原(Clarke等人，疫苗88(Ed.H.Ginsberg，等人，1988)pp.127-131)，脊髓灰質(zhì)炎病毒(Burke等人，自然(1988)332:81-82)和煙草花葉病毒(Haynes等人，生物/技術(shù)(1986)4:637-641)。但是，這些載體的用途受到限制，因為活性試劑的大小有限，它可以插入結(jié)構(gòu)蛋白而不干擾顆粒的組裝。
最后，利用與選定的抗原融合的溶血性巴斯德菌白細胞毒素(LKT)多肽已經(jīng)設(shè)計了嵌合系統(tǒng)。參見，例如1993年4月29日公開的國際公開號WO93/08290,1992年3月5日公開的WO92/03558以及美國專利號5,238,823和5,273,889。通過提供具有廣譜種類反應(yīng)性的T-細胞表位，肽抗原嵌合體中的LKT載體部分的內(nèi)含物提供的對嵌合體的免疫原性增強，從而在免疫接種個體中引發(fā)了依賴于T細胞的免疫應(yīng)答。在這點上，在產(chǎn)生對嵌合體的肽抗原部分的免疫應(yīng)答中誘導(dǎo)適當?shù)腡細胞輔助是必要的，特別是其中抗原是內(nèi)源分子。但是，到現(xiàn)在為止，還沒有敘述將白細胞毒素多肽載體與GnRH肽的多重表位結(jié)合使用。
本發(fā)明公開內(nèi)容本發(fā)明基于溶血性巴斯德菌(P.haemolytica)白細胞毒素基因，其突變體，和編碼多個GnRH多肽的一個或多個核苷酸序列之間構(gòu)建新基因融合體。當與GnRH單獨給藥引發(fā)的免疫原性反應(yīng)比較時，這些構(gòu)建體產(chǎn)生免疫原性驚人地增強的嵌合蛋白。
所以，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有與一個或多個多聚體融合的白細胞毒素多肽的嵌合蛋白，其中每個多聚體含有不止一個選定的GnRH多肽。該嵌合體的白細胞毒素部分的作用是增強GnRH多肽的免疫原性。更具體地說，本文所用的GnRH多聚體可以對應(yīng)于不止一個拷貝的選定的GnRH多肽或表位，或選定的GnRH多肽或表位的多個任意重復(fù)。另外，GnRH多聚體可以定位于白細胞毒素多肽的羧基和/或氨基末端，白細胞毒素多肽的內(nèi)部位點，或任何這樣的位點的聯(lián)合。每個GnRH多聚體也可以為對應(yīng)于通式GnRH-X-GnRH的分子，其中X選自下組肽鍵，氨基酸間隔基團和[GnRH]n，其中n大于或等于1，并且其中的“GnRH”可以包括任何GnRH多肽。在一個特定的實施方案中，提供了含有與兩個GnRH多聚體融合的白細胞毒素多肽的嵌合蛋白。在該分子中，一個GnRH多聚體的C-末端與白細胞毒素的多肽的N-末端融合，白細胞毒素多肽的N-末端與其它GnRH多聚體的N-末端融合。
同時公開的是含有該嵌合體蛋白以及藥物可接受載體的疫苗組合物，以及通過以有效量的所述疫苗組合物給藥對寄主提呈一個或多個選定的GnRH多聚體的方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及編碼該嵌合體蛋白的DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體包括與一個或多個選定的核苷酸序列可操作地連接的編碼白細胞毒素多肽的第一個核苷酸序列，每個選定的核苷酸序列編碼一個以上的GnRH多肽或表位的拷貝。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及由上面敘述的DNA構(gòu)建體組成的表達盒，該構(gòu)建體與控制序列可操作地連接，控制序列指導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，從而該構(gòu)建體可以在寄主細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用這些表達盒轉(zhuǎn)化的寄主細胞。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了產(chǎn)生重組多肽的方法。該方法包括(a)提供如上所述的寄主細胞群體和(b)在可以表達由表達盒編碼的嵌合體多肽的條件下培養(yǎng)細胞群體。
參考本文的公開內(nèi)容，本發(fā)明的這些和其它實施方案對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖的簡要說明

圖1A和1B顯示用于嵌合白細胞毒素GnRH多肽基因融合的GnRH構(gòu)建體的核苷酸序列和氨基酸序列。圖1A描述了包括單個拷貝的GnRH十肽的GnRH-1；圖1B描述了包括四個拷貝的GnRH十肽，n=1，和8個拷貝的GnRH,n=2等等的GnRH-2。
圖2描述了質(zhì)粒pAA352的結(jié)構(gòu)，其中tac是來自大腸桿菌的雜合trp::lac啟動子；bla代表了β-內(nèi)酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)；ori是基于ColE1的質(zhì)粒復(fù)制原點。1ktA是溶血性巴斯德菌白細胞毒素結(jié)構(gòu)基因；lac1是大腸桿菌lac操縱子阻遏物。箭頭指出了白細胞毒素基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯方向。每個成分的大小沒有按比例畫出。
圖3-1到3-9顯示了白細胞毒素352(LKT352)的核苷酸序列和推測的氨基酸序列。圖中顯示了LKT352的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)接載體區(qū)的序列。
圖4顯示了攜帶白細胞毒素GnRH(LKT-GnRH)基因融合體的質(zhì)粒pCB113的結(jié)構(gòu)。
圖5-1到5-8顯示了來自pCB113的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推測的氨基酸序列。來自pCB112的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推測的氨基酸序列與起源于pCB113的嵌合蛋白的序列相同，不同的是如上在圖4中所述多重拷貝的GnRH的序列插入兩次。
圖6顯示了攜帶白細胞毒素-GnRH(LKT-GnRH)基因融合體的質(zhì)粒pCB111的結(jié)構(gòu)。
圖7-1到7-5顯示了來自pCB111的LKT-嵌合蛋白的核苷酸序列和推測的氨基酸序列。來自pCB114的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推測的氨基酸序列與起源于pCB111的嵌合蛋白的序列相同，不同的是如上圖6中所述將多重拷貝的GnRH的序列插入了兩次。
圖8-1到8-2顯示了質(zhì)粒pCB111的截短的白細胞毒素基因的平齊末端融合點的核苷酸序列和推測的氨基酸序列(圖8-2)，其中通過用限制酶BstB1和Nae1消化從LKT352中除去了內(nèi)部DNA片斷(約1300bp長)(圖8-1)。
圖9-1到9-6顯示了來自pCB122的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推測的氨基酸序列。
圖10顯示了攜帶失去細胞毒素活性的LKT101白細胞毒素多肽的質(zhì)粒pAA101的結(jié)構(gòu)。
圖11描述了LKT101白細胞毒素多肽的推測的氨基酸序列。
圖12顯示了如實施例10所述，閹豬，未處理的公豬，和免疫去雄的公豬(用白細胞毒素GnRH融合蛋白接種)的平均血清抗GnRH抗體效價的比較。
圖13顯示了如實施例10所述在閹豬，未處理的公豬，和免疫去雄的公豬(用白細胞毒素GnRH融合蛋白接種)中的平均血清睪酮的水平的比較。
圖14顯示了如實施例10所述在閹豬，未處理的公豬，和免疫去雄的公豬(用白細胞毒素-GnRH融合蛋白)中的飼料轉(zhuǎn)化效率的比較(表示為公斤飼料公斤獲得重量)。
圖15顯示了如實施例11所述，在注射含有LKT::8拷貝GnRH融合蛋白的疫苗組合物，或含有8拷貝GnRH::LKT::8拷貝GnRH融合蛋白疫苗組合物的動物中的平均血清抗GnRH抗體的效價的比較。
圖16顯示了如實施例13中所述，在對照動物(實心塊)和用含有8拷貝GnRH::LKT::8拷貝的GnRH融合蛋白的疫苗組合物處理的動物(十字交叉格子塊)中平均卵巢的重量(毫克)，平均子宮的重量(毫克)，和平均血清雌二醇(皮克/毫升)的比較。
圖17描述了如實施例14中所述在閹豬，公豬，去雄后動物，和免疫去雄動物(用白細胞毒素-GnRH融合蛋白接種)中的脂肪雄烯酮水平的比較。
詳細敘述除非特別說明，本發(fā)明的實踐中將利用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)，微生物學(xué)，病毒學(xué)，重組DNA技術(shù)，和免疫學(xué)技術(shù)，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。文獻中完全解釋了這些技術(shù)。參見Sambrook,Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗室手冊，DNA克隆，第Ⅰ和Ⅱ版(D.N.Glover編輯)；低聚核苷酸的合成(M.J.Gait編輯)；核酸雜交(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯)；動物細胞培養(yǎng)(R.K.Freshney編輯)；固定化細胞和酶(IRL出版)；B.Perbal，分子克隆的實驗指導(dǎo)；酶學(xué)方法系列(S.Colowick和N.Kaplan編輯，學(xué)術(shù)出版公司)；和實驗免疫學(xué)手冊，第Ⅰ-Ⅳ期(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯，Blackwell科學(xué)出版社)A．定義在本發(fā)明的敘述中，將利用下面的術(shù)語，并按如下所述定義它們。
術(shù)語“促性腺素釋放激素”或“GnRH”指在脊椎動物中控制黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的釋放的下丘腦分泌的十肽(Fink,G.，英國醫(yī)藥手冊(1979)35:155-160)。在脊椎動物中，特別是哺乳動物中GnRH的氨基酸序列是高度保守的。在這點上，起源于大多數(shù)哺乳動物包括人，小牛，小豬和綿羊GnRH(過去稱為LHRH)的GnRH具有氨基酸序列焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(Murad等人，激素和激素拮抗物，治療的藥學(xué)基礎(chǔ)，第六版，(1980)和Seeburg等人，自然(1984)311:666-668)。
如本文所用“GnRH多肽”包括起源于天然GnRH序列的分子以及重組生產(chǎn)或化學(xué)合成的GnRH多肽，該多肽具有與天然GnRH基本上同源的氨基酸序列，并如下所述保留免疫原性。所以，該術(shù)語包括含有任何單個或多個氨基酸疊加，替代和/或缺失的GnRH的衍生物和類似物，這些GnRH存在于內(nèi)部或在肽的氨基或羧基末端。因此，在本發(fā)明中，“GnRH多肽”包括具有天然序列的分子，如圖1A描述的分子(具有N-末端Gln殘基，而不是焦Glu殘基)，和具有其它氨基酸疊加，替代和/或缺失的分子，這些分子保留了激發(fā)與天然存在的GnRH交叉反應(yīng)的抗體的形成能力。本文特別關(guān)注的是GnRH多肽的重復(fù)序列，如圖1B中描述的低聚物中(其中每個選定的GnRH多肽含有N-末端Gln替代，另外其中每個其它的GnRH多肽在位置2含有Asp殘基替代)。該定義同時也包括了GnRH的表位。
術(shù)語“表位”指在抗原或半抗原上的位點，該位點與特異的抗體分子結(jié)合。因為GnRH是非常小的分子，利用本領(lǐng)域的已知技術(shù)可以容易地鑒定能夠激發(fā)抗體應(yīng)答的表位。參見如Geysen等人，美國核酸科學(xué)進程(1984)81:3998-4002(快速合成肽以便在給定的抗原中定位免疫原性表位的常用方法)；美國專利號4,708,871(鑒定和化學(xué)合成抗原表位的方法)；Geysen等人，分子免疫學(xué)(1986)23:709-715(鑒定與給定抗體具有高親和力的肽的技術(shù))。
如本文所用，術(shù)語“T細胞表位”指肽結(jié)構(gòu)的特征，該特征是能夠誘導(dǎo)對肽結(jié)構(gòu)或相關(guān)的半抗原的T細胞免疫性。在這點上，這是本領(lǐng)域可接受的，即T細胞表位含有在MHC分子的肽結(jié)合裂口內(nèi)確定擴展的構(gòu)型的線性肽決定簇，(Unanue等人，科學(xué)(1987)236:551-557)。將多肽到MHCⅡ類相關(guān)的線性肽決定簇的轉(zhuǎn)換(通常長度為5-14個氨基酸長度)稱為“抗原加工”，這是由呈現(xiàn)抗原的細胞(APCs)進行的。更具體地說，T細胞表位是用不依賴于整個多肽的折疊來定義的。短肽結(jié)構(gòu)的局部特征，如包括帶電性和疏水性的初級氨基酸序列，和如螺旋性的某些類型的次級結(jié)構(gòu)。另外，可以相信輔助T細胞能夠識別的短肽通常是兩親性結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括疏水側(cè)鏈(以便與MHC分子相互作用)和親水側(cè)鏈(以便與T細胞受體相互作用)，(Margalit等人，T細胞表位的計算機推測，新生代疫苗Marcel-Dekker公司出版，G.C.Woodrow等人(1990)109-116)，另外，兩親性結(jié)構(gòu)具有α螺旋構(gòu)型(參見，如Spouge等人，免疫學(xué)雜志(1987)138:204-212；Berkower等人，免疫學(xué)雜志(1986)136:2498-2503)。
所以，利用許多的計算機程序可以容易地推測包括T細胞表位的蛋白質(zhì)片斷。(參見如，Margalit等人，T細胞表位的計算機推測，新生代疫苗Marcel-Dekker公司，G.C.Woodrow等人(1990)109-116)。這樣的程序通常將肽的氨基酸序列與已知誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答的序列比較，尋找確認是T細胞表位需要的氨基酸的圖譜。
“免疫原性蛋白”或“免疫原性氨基酸序列”分別是蛋白質(zhì)或氨基酸序列，它們能在給藥的個體中引發(fā)免疫學(xué)應(yīng)答。在本發(fā)明中，“GnRH免疫原”指GnRH分子，當將它導(dǎo)入寄主個體中時，刺激免疫應(yīng)答。在這點上，GnRH免疫原包括對應(yīng)于不止一個選定GnRH多肽的多聚體；更具體地說，對應(yīng)于具有多重或任意重復(fù)的選定GnRH多肽序列的多聚體，多重或任意重復(fù)的選定GnRH表位，或它們的任何可想象的聯(lián)合的多聚體。
對抗原或疫苗的“免疫應(yīng)答”是在寄主中發(fā)展對需要的組合物或疫苗的細胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，這樣的應(yīng)答包括，但不限于一個或幾個下面的效應(yīng)產(chǎn)生特異地抗需要的組合物或疫苗中的抗原或幾種抗原的抗體，B細胞，輔助T細胞，阻遏T細胞，和/或有細胞毒性的T細胞和/或γδT細胞。
利用本領(lǐng)域已知的任何幾個免疫測試，可以檢測免疫應(yīng)答。術(shù)語”白細胞毒性多肽”或“LKT多肽”指至少包括一個T細胞表位并起源于一類分子的家族蛋白質(zhì)的多肽，該類分子的特征是在羧基末端具有共有氨基酸序列Gly-Gly-X-Gly-X-Asp(Highlander等人，DNA(1989)8:15-28)，其中X是Lys,Asp,Val或Asn。這樣的蛋白質(zhì)包括起源于溶血性巴斯德菌和大葉性肺炎放線桿菌的白細胞毒素，以及大腸桿菌α溶血素(Strathdee等人，感染免疫學(xué)(1987)55:3233-3236；Lo,Can.J.Vet.Res.(1990)54:S33-S35；Welch，分子微生物學(xué)(1991)5:521-528)。已知這一毒素家族是“RTX”毒素家族(Lo,Can.J.Vet.Res.(1990)54:S33-S35)。另外，術(shù)語“白細胞毒素多肽”指化學(xué)地合成，和從表達它的生物體中分離，或重組地產(chǎn)生的白細胞毒素多肽。另外，該術(shù)語指具有基本與鄰接的氨基酸序列同源的氨基酸序列的免疫原性蛋白質(zhì)，該氨基酸序列存在于特定的天然白細胞毒素分子中。所以，該術(shù)語包括全長和部分序列以及類似物。雖然天然全長白細胞毒素顯示了細胞毒素的活性，術(shù)語“白細胞毒素”也指保留免疫原性，但仍然缺乏天然白細胞毒素的細胞毒性特征的分子。幾個白細胞毒素的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列是已知的。參見，如，美國專利號，4,957,739和5,055,400；Lo等人，感染免疫學(xué)(1985)50:667-67；Lo等人，感染免疫學(xué)(1987)55:1987-1996；Strathdee等人，感染免疫學(xué)(1987)55:3233-3236；Highlander等人，DNA(1989)8:15-28；Welch，分子微生物學(xué)(1991)5:521-528。在本發(fā)明生產(chǎn)的嵌合體中，通過提供含有小肽片斷的T細胞表位，該小肽片斷的長度范圍是5到14個氨基酸，它能夠與MHCⅡ類分子復(fù)合，以呈現(xiàn)和激活T輔助細胞，選定的白細胞毒素多肽序列給予一個或幾個融合GnRH多聚體的免疫原性增強，如下面進一步討論，這些T細胞表位存在于白細胞毒素分子中，并被認為集中在白細胞毒素的N末端部分，即在氨基酸殘基1到199之間。
如本文所用，“失去細胞毒素活性”的白細胞毒素多肽指如上所述的白細胞毒素多肽，與天然的，全長的白細胞毒素比較(如美國專利號，5,055,400和4,957,739中所述的全長的溶血性巴斯德菌白細胞毒素)，它喪失明顯的細胞毒性，但仍然保留了免疫原性和至少一個T細胞表位。利用任何幾個已知的測試如Korzeniewski等人在免疫學(xué)方法雜志64:313-320中所述的乳酸脫氫酶釋放測試可以測試白細胞毒素多肽的細胞毒素多肽的活性，其中通過從小牛嗜中性粒細胞釋放乳酸脫氫酶測定細胞毒性。確定白細胞毒素分子具有細胞毒性，如果將它與對照非細胞毒性分子比較時，它導(dǎo)致釋放產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著的乳酸脫氫酶。
含有缺乏白細胞毒素多肽的LKT-GnRH嵌合體提供了幾個重要的優(yōu)點。首先，缺乏細胞毒素活性的白細胞毒素多肽是如人所愿的，因為在個體中注射活性毒素可以導(dǎo)致局部細胞的死亡(PMNs和巨噬細胞)，并且它本身導(dǎo)致嚴重炎癥應(yīng)答以及在注射位點膿腫。在這點上，導(dǎo)致巨噬細胞死亡的細胞毒素活性可以導(dǎo)致抗原的呈現(xiàn)減少，所以免疫應(yīng)答在最適度以下。如在用于生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白的非細胞毒性LKT多肽中發(fā)現(xiàn)的細胞毒素部分的除去也導(dǎo)致產(chǎn)生截短的LKT基因，它能夠以比全長LKT更高的水平表達。另外，在本文構(gòu)建的保留了足夠的T細胞抗原性的融合體中使用非毒性LKT多肽減少了為了對選定的GnRH多肽產(chǎn)生足夠的B-細胞響應(yīng)而需要的對寄主個體施用的白細胞毒素GnRH抗原的總量。缺乏細胞毒素活性的免疫原性白細胞毒素多肽的特定例子包括LKT352,LKT111，和LKT101，下面將非常詳細地論述它們。
“LKT352”指起源于1ktA基因的蛋白質(zhì)，該基因存在于質(zhì)粒pAA352(圖2,ATCC登記號68283)。國際公開號WO91/15237中敘述了該基因的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列，并表示在圖3中。該基因編碼截短的白細胞毒素，具有914個氨基酸，估計的分子量約為99千道爾頓，它失去了分子的細胞毒性部分。這樣產(chǎn)生的截短的基因的表達水平比全長分子高得多(超過40％的細胞總蛋白相對于全長形式的小于1％的細胞總蛋白)并且更容易純化。衍生的LKT352不是必然物理地起源于質(zhì)粒pAA352中存在的序列。而是，它可以以任何方式產(chǎn)生，包括例如，化學(xué)合成或重組生產(chǎn)。另外，蛋白質(zhì)的氨基酸序列只需要與描述的序列基本同源。所以，可以存在序列突變，只要LKT多肽的功能是增強與之結(jié)合的抗原的免疫原性，但也失去細胞毒性活性。
LKT111”指白細胞毒素多肽，它起源于質(zhì)粒pCB111中存在的1ktA基因(圖6,ATCC登記號69748)。這一基因的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列表示在圖7。通過除去長度約為1300bp的內(nèi)部DNA片斷，該基因編碼更短的白細胞毒素變體，這種白細胞毒素是從質(zhì)粒pAA352(圖2,ATCC登記號68283)中存在的重組白細胞毒素基因發(fā)展而來的。LKT111多肽的估計分子量是52千道爾頓(與LKT352多肽的分子量99千道爾頓比較)，但保留了含有T細胞表位的LKT352N-末端部分，這是足夠的T細胞免疫原性所必須的，和保留了含有方便的限制位點的LKT352C-末端的部分，以便用于生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。在本發(fā)明中，LKT111白細胞毒素多肽不是必須物理地起源于質(zhì)粒pCB111中存在的序列。而是，它可以以任何方式產(chǎn)生，包括例如，化學(xué)合成或重組生產(chǎn)。另外，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列只需要與所述的序列基本同源。所以，可以存在序列突變，只要蛋白質(zhì)的功能是增強與之結(jié)合的抗原的免疫原性，并失去細胞毒性。
“LKT101”指起源于質(zhì)粒pAA101中存在的1ktA基因的白細胞毒性多肽(圖10,ATCC登記號67883)。圖11描述了從pAA101構(gòu)建體產(chǎn)生的溶血性巴斯德菌白細胞毒素的推測的氨基酸序列。從截短的1ktA基因形式可以表達LKT101多肽，該形式含有基因的5’末端到唯一的Pst1限制內(nèi)切酶位點。將截短的基因與β-半乳糖苷酶基因(lacZ)融合，以便簡化LKT101多肽的純化。在本發(fā)明中，LKT101白細胞毒素肽不是必然物理地起源于質(zhì)粒pAA101中存在的序列。而且，它可以以任何方式產(chǎn)生，包括例如，化學(xué)合成或重組產(chǎn)生。另外，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列只需要與描述的序列基本同源。所以，可以存在序列突變只要蛋白質(zhì)的功能是增強與之結(jié)合的抗原的免疫原性，并失去細胞毒性。
白細胞毒素GnRH多肽嵌合體顯示了“增強的免疫原性”，當它具有比對應(yīng)的一個或多個單獨的GnRH多聚體更大的引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。通過對動物給藥特定的白細胞毒素GnRH多肽和GnRH多聚體對照，并利用標準測試如本領(lǐng)域已知的放射免疫測試和ELISA將這樣得到的抗GnRH抗體的效價進行比較可以確定這樣的增強的免疫原性。
“重組”蛋白或多肽指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽，即從編碼需要的多肽的外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生的多肽?！昂铣伞钡鞍踪|(zhì)或多肽是那些經(jīng)過化學(xué)合成制備的。
DNA“編碼序列”或“編碼特定蛋白的核苷酸序列”是當置于適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列的控制下，在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄和翻譯為多肽的DNA序列。由5’末端(氨基末端)的起始密碼和3’末端(羧基末端)的翻譯終止密碼確定該編碼序列的邊界。編碼序列可以包括，但不限于，原核生物的序列，來自真核生物mRNA的cDNA，來自真核生物(如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，和甚至是合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’末端。
DNA“控制序列”集合性地指啟動子序列，核糖體結(jié)合位點，多聚腺苷酸化信號，轉(zhuǎn)錄終止序列，上游調(diào)節(jié)區(qū)，增強子，和諸如此類，它們集合性提供寄主細胞中的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
一個編碼序列“可操作地”與另一個編碼序列連接的條件是RNA聚合酶將轉(zhuǎn)錄兩個編碼序列成mRNA，并隨后將它們轉(zhuǎn)譯成由兩個編碼序列編碼的嵌合體多肽。這些編碼序列不需要相互鄰接，只要轉(zhuǎn)錄序列最終加工產(chǎn)生需要的嵌合體蛋白質(zhì)。一個控制序列當它控制一個編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，該控制序列與該編碼序列為“可操作地連接”。
當RNA聚合酶與啟動子序列結(jié)合，并將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后轉(zhuǎn)錄成編碼序列編碼的多肽，該控制序列在細胞中為“指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄”。
“寄主細胞”是已經(jīng)被或能夠被外源DNA序列已經(jīng)轉(zhuǎn)化或能夠轉(zhuǎn)化的細胞。
當將這樣的外源DNA導(dǎo)入細胞膜內(nèi)時，外源DNA“轉(zhuǎn)化”了細胞。外源DNA可以或可以不整合(共價地連接)到染色體DNA中組成細胞的基因組。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以保留游離的元件，如質(zhì)粒。至于真核生物細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞是外源DNA已經(jīng)整合到染色體中，以致能通過染色體復(fù)制遺傳給子細胞。真核生物細胞能建立由含有外源DNA的子細胞的群體組成的細胞系或克隆的能力證明了這一穩(wěn)定性。
當核苷酸或氨基酸的至少80％(優(yōu)選地至少約90％，和最優(yōu)選地至少約95％)與該分子的確定長度匹配時，兩個DNA或多肽序列“基本同源”。在用于特定系統(tǒng)的嚴格條件下進行的Southern雜交實驗可以確定基本同源的DNA序列。確定的適當雜交條件是在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的范圍內(nèi)的，參見，例如Sambrook等人，出處同上，DNA克隆，Ⅰ和Ⅱ版，出處同上，核酸雜交，出處同上。
DNA構(gòu)建體的”異源”區(qū)是在另一個DNA分子內(nèi)或附著于它的DNA的可鑒定部分，這部分是天然的其它相關(guān)分子中沒有發(fā)現(xiàn)的。所以，當異源區(qū)編碼細菌基因時，該基因通常與來源細菌的基因組中與細菌基因不側(cè)接的DNA側(cè)接。異源編碼序列的另一個例子是構(gòu)建體，其中的編碼序列本身在自然界中不存在(如，具有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。如本文所用，等位基因突變體或天然存在的突變事件不產(chǎn)生DNA的異源區(qū)。
“脊椎動物個體”是指脊索動物亞門，包括，但不限于，哺乳動物如嚙齒動物，小牛，豬，羊，山羊，馬和人；家養(yǎng)動物如狗和貓；鳥，包括家養(yǎng)的，野生的和可捕獵的鳥，如公雞和母雞包括小雞，火雞和其它家禽類鳥的任何成員。該術(shù)語沒有規(guī)定特定的年齡。所以，包括了成年和新生動物。
B．總的方法本發(fā)明的中心是發(fā)現(xiàn)了當與選定的GnRH多肽重復(fù)(或多聚體)偶聯(lián)時，白細胞毒素多肽能夠授予相關(guān)的GnRH成分很高的免疫原性。在這點上，白細胞毒性多肽的作用是在個體的免疫系統(tǒng)中以高度免疫原性形式提供選定的GnRH多聚體的載體蛋白。所以在本發(fā)明中構(gòu)建的嵌合體蛋白可以配制成疫苗組合物，該組合物提供給其中出現(xiàn)的GnRH多肽的免疫原性增強。將白細胞毒素基因與選定的GnRH多肽融合也簡化了從表達它的細胞中純化嵌合體蛋白的過程。
因此，本文舉證的是白細胞毒素嵌合體，它包括與不止一個GnRH多肽融合的白細胞毒素。本發(fā)明的特定實施方案包括含有與一個或多個GnRH多聚體融合的白細胞毒性多肽的嵌合體，其中所述的多聚體至少具有一個重復(fù)的GnRH十肽序列，或至少具有對應(yīng)于至少一個選定GnRH分子的表位的重復(fù)序列單位。另外，選定的GnRH肽序列可以全部相同，或可以對應(yīng)于不同的衍生物，類似物，突變體或GnRH表位，只要它們保留引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。圖1A描述了GnRH十肽的代表性核苷酸序列。通過將天然序列中發(fā)現(xiàn)的N-末端的焦Glu氨基酸用谷氨酸殘基替代修飾個體的GnRH序列。這一特定的替代使分子保留了天然谷氨酸結(jié)構(gòu)但也保留了焦Glu的未帶電結(jié)構(gòu)。因此，得到的肽不需要谷氨酸殘基的環(huán)化，并可以在缺乏實現(xiàn)環(huán)化的必要條件時產(chǎn)生。
因為GnRH序列相對較短，它能容易地利用下面詳細敘述的合成技術(shù)產(chǎn)生。在本發(fā)明中，利用白細胞毒素多肽序列授予相關(guān)的GnRH多肽(作為載體蛋白)免疫原性，以便幫助在脊椎動物個體中引發(fā)對外源GnRH的適當?shù)拿庖邞?yīng)答。以這種方式，通過破壞發(fā)情周期或精子生成可以利用GnRH免疫接種調(diào)節(jié)接種個體的生育率。在美國專利號4,975,420中可以發(fā)現(xiàn)GnRH的詳細討論。
本發(fā)明的特定目的是提供侵入性絕育方法的可依賴和有效的替代方法，侵入性絕育方法目前常用于家養(yǎng)和農(nóng)場的動物畜牧業(yè)，如外科閹割，外科卵巢子宮切除術(shù)，和諸如此類。利用本發(fā)明構(gòu)建的白細胞毒素-GnRH嵌合體在脊椎動物個體中免疫抑制繁殖活性提供了有效的替代方法，其中構(gòu)建體在免疫接種的動物中均一地失活了繁殖活性。在這點上，為了提供成功地替代外科手術(shù)方法，對應(yīng)于最小量的接種，適當?shù)慕^育疫苗產(chǎn)品必須均一地失活各個動物的繁殖能力。對于免疫絕育動物群，這一特征特別重要，特別是在需要免疫去雄的雄性小豬以便防止“公豬沾染”的情況中，這種情況是由于雄性小豬的正常功能的睪丸中性類固醇的合成導(dǎo)致的。參見例如，Meloen等人，疫苗(1994)12(8):741-746。過去開發(fā)這些產(chǎn)品的嘗試還沒有產(chǎn)生均一的結(jié)果，因為GnRH肽和/或相關(guān)的載體系統(tǒng)的免疫原性不夠，并且因此各種過去的基于GnRH的疫苗不能誘導(dǎo)對內(nèi)源GnRH的足夠的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一個特定目的是提供降低哺乳動物個體中乳腺癌的發(fā)生率的方法，該方法是在疫苗中利用本文產(chǎn)生的白細胞毒素-GnRH融合分子阻止接種個體中GnRH調(diào)節(jié)的子宮功能如產(chǎn)生子宮激素雌激素和黃體酮。在乳房腫瘤中雌激素和黃體酮的作用已經(jīng)確定。這些子宮類固醇在癌癥的早期是重要的，但一旦乳房腫瘤形成，一些腫瘤就獨立于類固醇。參見例如，內(nèi)分泌教科書，第7版，Wilson等人(1985)68-69頁。已知雌激素和黃體酮在狗中也是致癌的，起始時對乳房腫瘤負有責(zé)任。
因此，本文關(guān)注的白細胞毒素-GnRH多肽嵌合體含有一個或多個GnRH部分，具有多個選定的GnRH多肽序列，以便提供更多的免疫原性GnRH肽抗原。這一特征是基于這樣的認識，即內(nèi)源性蛋白質(zhì)通常情況下通過如上所述的它們的表位的多聚體化可有效地提供自身免疫原性。更具體地說，本發(fā)明的白細胞毒素-GnRH嵌合體的GnRH部分可以含有選定GnRH序列的多個或任意重復(fù)，選定GnRH表位的多個或任意重復(fù)，或它們的任何可以想象的聯(lián)合。利用如上所述的技術(shù)可以鑒定GnRH表位，或者可以測試GnRH蛋白質(zhì)的片斷的免疫原性和用于組合物中替代整個多肽的活性片斷。當不止一個GnRH多聚體包含于嵌合體分子中時，每個GnRH部分可以與分子中包括的其它GnRH部分相同或不同。
圖1B描述了本文所用的一個特定的GnRH部分的序列，其中含有絲氨酸和甘氨酸殘基的各種聯(lián)合的三聯(lián)體氨基酸隔開序列分開了四個分別標明為(1),(2),(3)和(4)的GnRH序列。在一個個體的多聚體中，每隔一個的GnRH序列(那些分別表明為(2)和(4))在GnRH十肽的第二個位置含有非保守的氨基酸替代，該替代包括在天然的GnRH序列中發(fā)現(xiàn)的His殘基位置被Asp殘基替代。這樣生產(chǎn)的替代GnRH多聚體序列提供了用于本發(fā)明的融合蛋白具有高度的免疫原性的GnRH抗原肽。對應(yīng)于任何單個或多個氨基酸疊加，替代和/或缺失的其它GnRH類似物也受到本文的特別關(guān)注，可用于重復(fù)或替代的多聚體序列。在一個特定的白細胞毒素GnRH融合體中，將圖1B描述的四個拷貝的GnRH部分與白細胞毒素分子融合，以致白細胞毒素分子在它的N-和C-末端與兩個拷貝的個體GnRH多聚體側(cè)接。
另外，圖1B描述的特定的GnRH部分含有GnRH成分之間的隔開序列。使用本文的選定GnRH多肽之間戰(zhàn)略性地使用各種隔開序列使主體的構(gòu)建體的免疫原性增強。因此，在本發(fā)明中，選定的隔開基因可以編碼很多種類的一個或多個氨基酸長度的成分。選定的隔開基團可以優(yōu)選地提供酶切割位點，以致通過體內(nèi)的蛋白酶(通過APC和諸如此類)可以加工表達的嵌合體以便產(chǎn)生許多多肽，其中的每個至少含有一個起源于載體部分的T細胞表位(白細胞毒素部分)，它們優(yōu)選地與基本完整的GnRH多肽序列融合?？梢詷?gòu)建隔開的基團以致選定的GnRH成分之間的連接區(qū)含有免疫個體中明顯的外源序列，從而授予相關(guān)的GnRH肽的免疫原性增強。另外，可以構(gòu)建隔開序列以致提供T細胞抗原性，例如那些編碼兩親性和/或α螺旋肽序列的序列的那些，這些序列通常在本領(lǐng)域被認作為提供了免疫原性的輔助T細胞表位。根據(jù)特定的接種的脊椎動物種類，對這樣的隔開序列提供的特定T細胞表位的選擇可以變化。雖然舉證的特定GnRH部分包括隔開序列，本發(fā)明的一個目的也是提供含有直接鄰接的GnRH序列的一個或多個多聚體(沒有插入隔開序列)。
白細胞毒素-GnRH多肽復(fù)合物可以以嵌合體蛋白質(zhì)形式重組地方便地產(chǎn)生。可以將嵌合體的GnRH部分在5’和/或3’與分子的白細胞毒素部分融合，一個或多個GnRH部分可以定位于白細胞毒素分子的內(nèi)部的位點，或者嵌合體可以含有在這些位點的GnRH部分的任何聯(lián)合。編碼全長溶血性巴斯德菌A1白細胞毒素的核苷酸序列已經(jīng)確定。參見例如，Lo，感染免疫學(xué)(1987)55:1987-1996；美國專利號5,055,400。另外，本文已經(jīng)公開了幾個突變的白細胞毒素基因的序列。
同樣，小豬，小牛和綿羊的GnRH的編碼序列已經(jīng)確定(Murad等人，激素和激素拮抗物，治療學(xué)的藥物原理，第6版，(1980))，并且已經(jīng)克隆了人GnRH的cDNA，以致它的序列已經(jīng)很好地確立了(Seeburg等人，自然(1984)311:666-668)。已知序列的其它GnRH多肽已經(jīng)公開，如存在于大馬哈魚和小雞中的GnRH分子(1986年12月18日公開的國際公開號，WO86/07383)。脊椎動物，特別是哺乳動物，和小豬，小牛，綿羊和人GnRH序列在高度保守的GnRH編碼序列是相互相同的。利用本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)可以克隆，分離需要的白細胞毒素和GnRH基因并連接在一起。參見例如，Sambrook等人，出處同上。
可替代地，通過合成而不是克隆，可以制備編碼嵌合體蛋白質(zhì)的DNA序列。利用特定氨基酸序列的適當密碼子可以設(shè)計DNA序列。通常，如果該序列將用于表達，可以選擇對于目的寄主是優(yōu)選的密碼子。從標準方法制備的交迭的低聚核苷酸組裝完整的序列并組裝成完整的編碼序列。參見例如，Edge，自然(1981)292:756；Nambair等人，科學(xué)(1984)223:1299；Jay等人，生物化學(xué)雜志(1984)259:6311。
一旦已經(jīng)制備或分離了嵌合體蛋白質(zhì)的編碼序列，它們能夠克隆進任何適當?shù)妮d體或復(fù)制子。許多克隆載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。適當?shù)目寺≥d體的選擇是機會的問題?？寺〉闹亟MDNA載體和它們轉(zhuǎn)化的寄主細胞的例子包括λ噬菌體(大腸桿菌)，pBR322(大腸桿菌)，pACYC177(大腸桿菌)，pKT230(革蘭氏陰性細菌)，pGV106(革蘭氏陰性細菌)，pLAFR1(革蘭氏陰性細菌)，pME290(非大腸桿菌-革蘭氏陰性細菌)，pHV14(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)，pBD9(芽孢桿菌)，pIJ61(鏈霉菌)，pUC6(鏈霉菌)，YIp5(酵母屬)，YCp19(酵母屬)和小牛乳頭狀瘤病毒(哺乳動物細胞)。通常參見，DNA克隆，第Ⅰ和Ⅱ版，出處同上，T.Maniatis等人，出處同上；B.Perbal，出處同上。
可以將融合基因置于啟動子，核糖體結(jié)合位點(用于細菌表達)和非強制性地操縱子(本文總稱為“對照”元素)的控制下，以致編碼嵌合體蛋白質(zhì)的DNA序列在含有這一表達構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化的寄主細胞中轉(zhuǎn)錄成RNA。編碼序列可以或可以不含有信號肽或引導(dǎo)序列。利用，天然溶血性巴斯德菌啟動子，大腸桿菌tac啟動子或蛋白質(zhì)A基因(spc)啟動子和信號序列可以表達本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)。細菌寄主在翻譯后的加工過程中可以除去引導(dǎo)序列。參見例如，美國專利號4,431,739；4,425,437；4,338,397。
除了控制序列，可以如人所愿地加入調(diào)節(jié)序列，它可用于調(diào)節(jié)與寄主細胞生長相關(guān)的蛋白質(zhì)序列的表達。調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例子包括那些應(yīng)答化學(xué)或物理刺激包括調(diào)節(jié)化合物的存在，導(dǎo)致基因表達的啟動和關(guān)閉的，載體中也可以存在其它類型的調(diào)節(jié)元素，例如增強子序列。
構(gòu)建表達載體以致特定的融合體編碼序列定位于含有適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列的載體中，與控制序列相關(guān)的編碼序列的定位和取向是該編碼序列在控制序列的“控制”下轉(zhuǎn)錄(即，在控制序列中結(jié)合DNA分子的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄編碼序列)。修飾編碼需要的特定嵌合體蛋白的序列可以如人所愿地達到這一目的。例如，在某些情況下，修飾序列是必須的，能使它附著于適當取向的控制序列；即，維持讀碼框架。控制序列和其它調(diào)節(jié)序列可以在插入載體如如上所述的克隆載體中之前與編碼序列連接?？商娲?，編碼序列可以直接克隆進入表達載體，該載體已經(jīng)含有控制序列和適當?shù)南拗莆稽c。
在一些情況中，可以如人所愿地加入一些序列，這些序列導(dǎo)致從寄主有機體分泌多肽，隨后切割分泌信號。也可以如人所愿地生產(chǎn)需要的嵌合體蛋白質(zhì)的突變體或類似物。通過缺失部分編碼蛋白質(zhì)的序列，通過插入序列，和/或通過替代序列內(nèi)的一個或多個核苷酸可以制備突變體或類似物。修飾核苷酸序列的技術(shù)如特異于位點的誘變是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見，例如，T.Maniatis等人，出處同上，DNA克隆，第Ⅰ和Ⅱ卷，出處同上；核酸雜交，出處同上。
許多原核生物表達載體是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國專利號4,440,859；4,436,815；4,431,740；4,431,739；4,428,941；4,425,437；4,418,149；4,411,994；4,366,246；4,342,832；同時參見英國專利申請GB2,121,054；GB2,008,123；GB2,007,675；和歐洲專利申請103,395。酵母表達載體也是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國專利號，4,446,235；4,443,539；4,430,428；也參見歐洲專利申請，103,409；100,561；96,491。
根據(jù)表達系統(tǒng)和選定的寄主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是通過如上所述的表達載體轉(zhuǎn)化的寄主細胞在各種條件下生長時產(chǎn)生的，從而表達了需要的蛋白質(zhì)。然后從寄主細胞分離嵌合體蛋白質(zhì)并純化。如果表達系統(tǒng)將蛋白質(zhì)分泌到生長培養(yǎng)基中，蛋白質(zhì)可以直接從培養(yǎng)基中純化。如果蛋白質(zhì)沒有分泌，可從細胞溶菌物中分離。適當?shù)纳L條件和回收方法的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。
本發(fā)明的嵌合體蛋白質(zhì)也可以通過化學(xué)合成生產(chǎn)，如根據(jù)確定的氨基酸序列合成固相肽。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第二版，Pierce化學(xué)公司，Rockford,IL(1984)和G,Barany和R.B.Merrifield，肽分析，合成，生物學(xué)，作者E.Gross和J.Meienhofer，第二卷，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1980)3-234，固相肽合成技術(shù)；和M.Bodansky，肽合成原理，Springer-Verlag,Berlin(1984)和E.Gross和J.Meienhofer,Eds.，肽分析，合成，生物學(xué)，出處同上，1卷，經(jīng)典的溶液合成。
通過包括本嵌合體白細胞毒素GnRH蛋白質(zhì)的疫苗組合物的給藥，可以給個體接種以抗內(nèi)源GnRH。在接種之前，它可以如人所愿地進一步增強特定的嵌合體蛋白質(zhì)的免疫原性。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法中的任何一個完成。例如，將白細胞毒素GnRH多肽融合體蛋白質(zhì)與次級載體連接用于給藥。例如，可以將片斷與大分子載體共軛。適當?shù)妮d體通常是大的，慢慢代謝的大分子，如蛋白質(zhì)，多糖，如葡聚糖，瓊脂糖，纖維素，纖維素小珠和諸如此類；多聚體氨基酸如聚谷氨酸，聚賴氨酸，和諸如此類；氨基酸共聚物；和失活的病毒顆粒。特別有用的蛋白質(zhì)底物是血清白蛋白，匙孔血藍蛋白，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的蛋白質(zhì)。
該蛋白質(zhì)底物可以其天然形式使用或者它們的功能基團可以通過例如，賴氨酸殘基的琥珀?；蚺cCys-硫代內(nèi)酯反應(yīng)進行修飾。通過例如，將氨基官能團與2-亞胺thiolane或3-(4-二硫代吡啶基丙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)可以在載體(或選定的GnRH多肽)中摻入硫氫基。為了肽的附著也可以修飾適當?shù)妮d體摻入間隔臂(如六亞甲基二胺或其它同樣大小的雙功能分子)。
如美國專利號5,071,651中公開的本發(fā)明的嵌合體蛋白的其它適當?shù)妮d體包括輪狀病毒的VP6多肽，或其功能片斷。同時使用的是病毒蛋白的融合產(chǎn)物和白細胞毒素GnRH免疫原，其中融合產(chǎn)物是通過美國專利號4,722,840公開的方法制造的。仍然是其它適當?shù)妮d體包括細胞如淋巴細胞，因為這一形式的呈現(xiàn)模仿了在個體中的呈現(xiàn)的天然方式，產(chǎn)生了免疫接種狀態(tài)?？商娲?，本發(fā)明的融合蛋白可以與紅細胞偶聯(lián)，優(yōu)選地主體自身的紅細胞。將肽與蛋白質(zhì)或細胞偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明的嵌合體蛋白也可以通過表達它的載體病毒給藥。將在本文中使用的載體病毒包括，但不限于，牛痘和其它痘病毒，腺病毒和皰疹病毒。通過實施例，可以如下構(gòu)建表達新嵌合體蛋白的牛病毒重組體。首先將編碼特定的白細胞毒素GnRH嵌合體蛋白的DNA插入適當?shù)妮d體，使它與牛痘啟動子和側(cè)接的牛痘DNA序列如編碼胸苷激酶(TK)的序列鄰接。然后將這一載體用于轉(zhuǎn)染牛痘自發(fā)感染的細胞。同源重組的作用是將牛痘啟動子和編碼本發(fā)明的嵌合體蛋白的基因插入病毒基因組。通過在存在5-溴脫氧尿苷時培養(yǎng)細胞挑選病毒抗性噬菌斑和選擇得到的TK重組體。
通過單獨給藥，或與藥物可接受載體或賦形劑混合，也可以利用本發(fā)明的嵌合體蛋白免疫個體。通常，以可注射的液體溶液或懸浮液制備疫苗，也可以制備在注射之前適于在液體載體中制成溶液或懸浮液的固體形式。也可以將制劑乳化，或?qū)⒒钚猿煞职谥|(zhì)體載體中成為膠囊?；钚悦庖咴煞纸?jīng)常與含有賦形劑的載體混合，該賦形劑是藥學(xué)可接受并與活性成分相容的。適當?shù)妮d體例如，水，鹽，葡萄糖，甘油，乙醇，或諸如此類，和它們的聯(lián)合。另外，如果需要，載體可以含有最小量的輔助物質(zhì)，如加濕劑或乳化劑，pH緩沖試劑，或助劑，它們能增強疫苗的效果。助劑可以包括例如，胞壁酰二肽，avridine，氫氧化鋁，油，皂苷，和其它本領(lǐng)域已知的物質(zhì)。制備這樣的劑量形式的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或?qū)⒚髁说?。參見例如，Renington藥物科學(xué)，Mack出版公司，Easton，賓夕法尼亞，第18版，1990。在然后事件中給藥的組合物或配方將含有定量的蛋白質(zhì)適于待治療的個體中達到需要的免疫接種狀態(tài)。
適于其它給藥方式的其它疫苗配方包括栓劑，和有些情況下，氣霧劑，鼻內(nèi)的，口服的配方，和持續(xù)釋放的配方。對于栓劑，組合物將包括傳統(tǒng)的結(jié)合劑和載體如，聚堿性乙二醇，或甘油三酯。這樣的栓劑可以從含有活性成分的混合物配制，活性成分的范圍在約0.5％到約10％(w/w)，優(yōu)選地約1％到約2％?？诜d體包括正常使用的賦形劑，如藥物級的甘露醇，乳糖，淀粉，鎂，硬脂酸，纖維素糖精鈉，碳酸鎂，和諸如此類。這些口服疫苗組合物可以采取溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，持續(xù)釋放的配方，或粉末的形式制備，并含有約1％到約30％的活性成分，優(yōu)選地約2％到約20％。
鼻內(nèi)配方通常包括既不引起刺激鼻粘膜，也不明顯干擾纖毛功能的載體。稀釋劑如水，水狀鹽溶液或其它已知物質(zhì)可以用于本發(fā)明。鼻配方也可以含有防腐劑，如，但不限于，氯丁醇新潔而滅。可以存在表面活性劑以便增強鼻粘膜對主體蛋白的吸收。
在載體如脂質(zhì)體，非吸收不滲透的多聚體如乙烯乙烯基乙酸共聚物和Hytrel共聚物，可膨脹的多聚體如水凝膠，或可吸收的多聚體如膠原和某些聚酸或聚酯如那些用于制作可吸收的縫線中摻入嵌合體蛋白質(zhì)配制控制或持續(xù)釋放的制劑。嵌合體蛋白也可以利用植入小泵提供，這是本領(lǐng)域已知的。
另外，嵌合體蛋白(或它的復(fù)合物)可以配制成中性或鹽形式的疫苗組合物。藥物可接受鹽包括酸加成的鹽(與活性多肽的游離氨基一起形成)，和與無機酸一起形成的，無機酸如鹽酸或磷酸，或如有機酸，如乙酸，草酸，酒石酸，苦杏仁酸，和諸如此類。從游離羧基基團形成的鹽也可以起源于無機堿，如氫氧化鈉，鉀，銨，鈣，或鐵，和有機堿如異丙胺，三甲胺，2-乙胺乙醇，組胺，普魯卡因和諸如此類。
為了免疫接種個體，通常是以適當?shù)妮d體肌肉內(nèi)注射而將選定的GnRH白細胞毒素嵌合體非腸道給藥。但是，其它給藥方式，如皮下，靜脈內(nèi)注射和鼻內(nèi)釋放也是可接受的?？勺⑸涞囊呙缗浞綄⒑休d體中的有效量的活性成分，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定準確的量。通?；钚猿煞值姆秶墙M合物的約1％到約95％(w/w)。如果適當?shù)脑挘踔粮呋蚋?。給藥的量根據(jù)待治療的動物，動物的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，和需要的保護程度而變化。
當給藥時，對于本發(fā)明的疫苗配方，每毫升注射溶液中約1微克到1毫克，通常5微克到200微克GnRH多肽應(yīng)該能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在這點上，根據(jù)構(gòu)建那些分子而選擇的特定的白細胞毒素和GnRH多肽成分，本發(fā)明的疫苗配方中的白細胞毒素-GnRH抗原中的GnRH與白細胞毒素的比例可以變化。更具體地說，在用于本發(fā)明條件下生產(chǎn)疫苗配方的白細胞毒素GnRH多肽中，每個融合分子中將有約1到40％GnRH，優(yōu)選地約3到30％，最優(yōu)選地是約7到27％GnRH多肽。LKT-GnRH抗原中存在的GnRH的百分數(shù)的增加減少了總抗原的量，這個量是為了引發(fā)B細胞對GnRH的有效的應(yīng)答而必須對個體給藥的。通過常規(guī)試驗確定劑量應(yīng)答曲線，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地確定有效劑量。免疫接種個體時以至少一個劑量，優(yōu)選地兩個劑量的特定白細胞毒素GnRH多肽給藥。另外，可以以保持免疫狀態(tài)需要的劑量給動物給藥。
下面是實施本發(fā)明的特定的實施方案的實施例。提供實施例只是為了說明的目的，并不打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
c．實驗材料和方法從商業(yè)來源購買酶，根據(jù)制造商的指導(dǎo)說明使用。同樣從商業(yè)來源購買放射性核苷酸和硝酸纖維素濾膜。
在克隆DNA片斷時，除了特別注明，所有DNA操作都按照標準方法進行。參見Sambrook等人，出處同上，限制性酶，T4DNA連接酶，大腸桿菌，DNA聚合酶Ⅰ,Klenow片斷，和其它生物學(xué)試劑都從商品供應(yīng)商購買，根據(jù)制造商的指導(dǎo)說明使用。在瓊脂糖凝膠上分離雙鏈DNA片斷。
通過標準技術(shù)分別在pUC13和λ噬菌體gt11中制備cDNA和基因組文庫，參見DNA克隆第Ⅰ和Ⅱ卷，出處同上。
從死于肺炎巴士德菌病的小牛的肺中分離溶血性巴斯德菌生物型A，血清型1(“A1”)菌株B122，并儲藏于-70℃的去纖維蛋白的血液中。在血液瓊脂平板或腦心泡制的肉湯(Difco實驗室，低特律，MI)中進行常規(guī)的繁殖，培養(yǎng)基補充5％(v/v)馬血清(Gibco加拿大公司，Burlington，加拿大)。所有培養(yǎng)物在37℃下溫育。
實施例1分離溶血性巴斯德菌白細胞毒素基因為了分離白細胞毒素基因，利用標準方法構(gòu)建溶血性巴斯德菌A1(菌株B122)的基因文庫。參見，Lo等人，感染免疫學(xué)，出處同上，DNA克?、窈廷蚓沓鎏幫?；和Sambrook等人，出處同上。在質(zhì)粒載體pUC13中構(gòu)建基因組文庫，并在λgt11噬菌體中構(gòu)建DNA文庫。將得到的克隆用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，合并單個菌落，篩選與來自小牛的血清的反應(yīng)，小牛已經(jīng)幸免于溶血性巴斯德菌感染，并且已經(jīng)利用濃縮的溶血性巴斯德菌的培養(yǎng)上清液加強接種以便增強抗白細胞毒素抗體水平。篩選陽性菌落生產(chǎn)白細胞毒素的能力，方法是用小牛嗜中性粒細胞溫育細胞溶菌物和隨后測量從后者釋放的乳酸脫氫酶。
鑒定了幾個陽性菌落，通過限制性內(nèi)切酶圖譜定位分析這些重組體。一個克隆似乎與前面克隆的白細胞毒素基因相同。參見Lo等人，感染免疫學(xué)，出處同上。為了證實這一點，再克隆更小的片斷，比較限制性圖譜?？梢源_定已經(jīng)克隆的DNA約為4kbp。為了分離約8kb的全長的重組體進行染色體步行(5’到3’方向)分離過逐漸較大的克隆。最后的構(gòu)建體命名為pAA114。這一構(gòu)建體含有整個白細胞毒性基因序列。
利用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片斷加三磷酸核苷酸處理含有整個白細胞毒素基因的pAA114的1ktA,MaeⅠ限制性核酸內(nèi)切酶片斷，并連接到克隆載體pUC13的SmaⅠ位點。這一質(zhì)粒命名為pAA179。由這一質(zhì)粒，在用SmaⅠ消化的基于ptac的載體pGH432:lacⅠ中產(chǎn)生兩個表達構(gòu)建體。一個是pAA342，由1ktA基因的5’-AhaⅢ片斷組成。而另一個是pAA345，含有如上所述的整個MaeⅠ片斷?？寺AA345中以高水平表達截短的白細胞毒素肽，而pAA345非常低水平表達全長白細胞毒素。所以，1ktA基因的3’末端(來自pAA345的StyⅠBamHⅠ片斷)連接到StyⅠ BamHⅠ消化的pAA342上，產(chǎn)生質(zhì)粒pAA352。圖2顯示了pAA352的結(jié)構(gòu)，圖3顯示了從pAA352構(gòu)建體(下文稱為LKT352)產(chǎn)生的溶血性巴斯德菌白細胞毒素的核苷酸序列和推測的氨基酸序列。
pAA114表達了幾個截短形式的白細胞毒素基因．這些截短的形式與B-半乳糖苷酶(lacZ)基因融合。從pAA114分離純化的限制片斷(分別為1.0kb和2.1kb)形式的來自EcoRⅤ Pst1的雙鏈消化物的兩個LTX1.1和LTX3.2的片斷．將這些片斷克隆進入克隆載體pTZ18R，該質(zhì)粒已經(jīng)利用HincⅡ和Pst1消化。利用得到的裁體，命名為pLTX3P.1轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM105。通過在含有氨芐青霉素加Xgal和IPTG的培養(yǎng)基上涂板鑒定轉(zhuǎn)化的細胞。藍色菌落標志著有功能性的lacZ基因的存在。通過限制性核酸內(nèi)切酶消化分析來自轉(zhuǎn)化細胞的DNA，發(fā)現(xiàn)含有白細胞毒素基因的5’末端(1ktC和1ktA)。
將白細胞毒素EcoRⅤ/Pst15’片斷(來自pLTX3P.1)亞克隆到克隆載體pBR325，該質(zhì)粒已經(jīng)利用EcoR1和Pst1消化。pBR325質(zhì)粒也含有天然白細胞毒素啟動子(從pLTX3P.1得到)和無啟動子的，全長1acZ基因。利用得到的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，從Xgal瓊脂板分離藍色菌落。將新的構(gòu)建體命名為pAA101(ATCC No.67883)并描述在圖10中。圖11描述了來自pAA101構(gòu)建體(下文稱為LKT101)產(chǎn)生的溶血性巴斯德菌白細胞毒素的推測的氨基酸序列。
實施例2LKT-GnRH融合體的構(gòu)建如下構(gòu)建了代表性的LKT-GnRH融合體。利用標準的亞磷酰胺化學(xué)法，在Pharmacia基因組裝器上構(gòu)建含有對應(yīng)于單個拷貝的GnRH和GnRH的四個重復(fù)的序列的低聚核苷酸。圖1A和1B顯示了這些低聚核苷酸的序列。將主體低聚核苷酸退火，連接到載體pAA352(ATCC No.68283，和如上所述)，該質(zhì)粒已經(jīng)利用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ消化。這一質(zhì)粒含有溶血性巴斯德菌白細胞毒素基因。利用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株MH3000。提供限制性內(nèi)切酶圖譜定位鑒定含有低聚核苷酸插入片斷的轉(zhuǎn)化體。
通過退火四個拷貝的GnRH低聚核苷酸且將它們連接到載體制備8個拷貝GnRH串聯(lián)重復(fù)序列，其中載體已經(jīng)利用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ消化。當插入時，將低聚物設(shè)計為使上游的BamHⅠ位點殘缺，保證插入的低聚物的附加拷貝定位于適當?shù)淖x碼框架中。圖1B顯示了個體的低聚核苷酸的序列。然后，分離來自大腸桿菌MH3000菌株的質(zhì)粒DNA，并用于轉(zhuǎn)化菌株JM105。將重組質(zhì)粒命名為pCB113(LKT352:4拷貝GnRH,ATCC入藏號69749和pCB112(LKT352:8個拷貝的GnRH)。圖4顯示了重組質(zhì)粒pCB113，質(zhì)粒pCB112與pCB113相同，不同的是如上所述多重拷貝的GnRH序列(對應(yīng)于圖1B的低聚物)插入了兩次。圖5顯示了pCB113的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列。重組LKT-GnRH融合體pCB112的核苷酸序列是相同的，不同的是多重拷貝的GnRH序列插入了兩次。
實施例3構(gòu)建縮短的LKT載體肽從質(zhì)粒pAA352中存在的重組基因構(gòu)建縮短的重組白細胞毒性肽變體(如上所述)。通過從如下的重組LKT基因中缺失約1300bp長度的內(nèi)部DNA片斷產(chǎn)生縮短的LKT基因。
用限制性酶BstB1(新英格蘭實驗室)消化質(zhì)粒pCB113,(ATCC登記號，69749)，該質(zhì)粒包括與四個拷貝的GnRH多肽融合的LKT352多肽。然后利用綠豆核酸酶(Pharmacia)消化得到的線性質(zhì)粒，以便除去由BstB1消化產(chǎn)生的單鏈的突出末端。然后利用限制性酶Nae1(新英格蘭實驗室)消化平齊化的DNA，將消化的DNA加載到1％的瓊脂糖凝膠上，在凝膠上通過電泳分離DNA片斷。分離出約6190bp的大DNA片斷，并利用Gene Clean試劑盒(Bio101)從瓊脂糖凝膠中純化，利用T4噬菌體DNA連接酶(Pharmacia)允許將純化的片斷自身連接。將得到的連接混合物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM105細胞，由它們產(chǎn)生分子量約為57千道爾頓的凝聚體蛋白質(zhì)的能力鑒定陽性克隆。將這樣形成的重組質(zhì)粒命名為pCB111,(ATCC登記號，69748)，并產(chǎn)生縮短的白細胞毒素多肽(下文中稱為LKT111)，該多肽與四個拷貝的GnRH多肽融合。PCB111的結(jié)構(gòu)顯示于附圖6。質(zhì)粒pCB114與pCB111相同，不同的是多重拷貝的GnRH序列(對應(yīng)于圖1B的低聚物)插入了兩次。圖7顯示了pCB111的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列，pCB114的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列是相同的，不同的是多重拷貝的GnRH序列插入了兩次。
通過噬菌體T7聚合酶測序試劑盒(Pharmacia)進行測序已經(jīng)證明了個體克隆的連接融合點的核苷酸序列。圖8顯示了這些融合點的核苷酸序列。
實施例4構(gòu)建含有8個拷貝的氨基末端和羧基末端GnRH多聚體的LKT-GnRH融合體重組LKT-GnRH融合體分子含有8個拷貝的GnRH多聚體，一個排列在LKT111的N’末端，其它排列在LKT111的C’末端，從pCB114質(zhì)粒得到的LKT-GnRH融合體序列構(gòu)建可以這樣融合體分子，方法是將GnRH序列的多重拷貝(對應(yīng)于圖1B的低聚物)在LKT111編碼序列的5’末端連接兩次。將含有下面的核苷酸序列5’-ATGGCTACTGTTATAGATCGATCT-3’的合成核酸分子與多個拷貝的GnRH序列的5’末端連接。合成核酸分子編碼8個氨基酸的序列(Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser)。得到的重組分子以5’到3’方向給定的順序含有合成核酸分子；編碼開始8個拷貝的GnRH的核苷酸序列；編碼縮短的LKT肽(LKT111)的核苷酸序列；和編碼第二個8個拷貝的GnRH多聚體的核苷酸序列。
將重組分子環(huán)化，利用得到的分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM105細胞。由生產(chǎn)分子量約為74千道爾頓的凝聚體蛋白質(zhì)的能力鑒定陽性克隆。將這樣形成的重組質(zhì)粒命名為pCB122，它產(chǎn)生了與16個拷貝的GnRH多肽融合的LKT111多肽。圖9-1到9-6顯示了pCB122的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列。
實施例5純化LKT-抗原融合體利用下面的方法可以純化來自實施例2,3和4的重組LKT-GnRH融合體。對于每個融合體，將5到10個轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株的菌落接種到10毫升用100微克/毫升氨芐青霉素補充的TB肉湯，并在37℃，在G10搖床上，在220rpm溫育6小時。將4毫升培養(yǎng)物稀釋到2個含有400毫升TB肉湯+氨芐青霉素的Fernbach燒瓶的每一個中，并如上所述溫育過夜。通過以4000rpm，在500毫升體積的聚丙烯瓶中，在Sorvall GS3離心機中離心10分鐘收集細胞。將沉淀在含有預(yù)熱到37℃的氨芐青霉素的等體積的TB肉湯(即2×400毫升)中再懸浮，并將細胞如上所述溫育2小時。
為了誘導(dǎo)合成重組融合體蛋白，在每個培養(yǎng)物中加入3.2毫升異丙基-β,D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG,Gibco/BRL)，溶解于水的500毫摩爾濃度(最后濃度為4毫摩爾濃度)。將培養(yǎng)物溫育2小時。如上所述，通過離心收集細胞，再懸浮于30毫升的50毫摩爾濃度Tris-HCl,25％(w/v)蔗糖，pH8.0，冷凍到-70℃。在-70℃保持60分鐘后，在室溫下熔化冷凍的細胞，加入5毫升溶菌酶(Sigma，溶于250毫摩爾濃度Tris-HCl,pH8.0的20毫克/毫升)，高速旋轉(zhuǎn)混合物10秒，然后置于冰上15分鐘。然后在1000毫升燒瓶中的500毫升溶解緩沖液中加入細胞，用2個抽吸管攪拌混合。將含有溶解細胞懸浮液的燒瓶置于冰上并用超聲波處理2.5分鐘(5-30秒脈沖，之間1分鐘冷卻)，儀器是Braun超聲波處理器，大探針，設(shè)定在100瓦的動力。將等體積的溶液置于Teflon SS34離心管只，以10,000rpm，在Sorvall SS34離心機中離心20分鐘。通過高速旋轉(zhuǎn)，重復(fù)離心步驟，將沉淀再懸浮于100毫升無菌重蒸水中。丟棄上清液，將沉淀合并在20毫升的10毫摩爾濃度Tris-HCl,150毫摩爾濃度氯化鈉，pH8.0(Tris緩沖鹽)中，在-20℃冷凍懸浮液過夜。
在室溫解凍重組懸浮液，加入溶于Tris緩沖鹽中的100毫升8摩爾的鹽酸胍(Sigma)中，并劇烈混合。在瓶中加入磁攪拌棒，在室溫下混合溶解的樣品30分鐘。將溶液轉(zhuǎn)移到2000毫升的Erlenmeyer燒瓶中，快速加入1200毫升Tris-緩沖鹽。在室溫下再攪拌這一混合物2小時。將500毫升等分試樣置于透析袋中(Spectrum,63.7毫米直徑，6,000-8,000mw截止分子量，#132670，來自Fisher scientific)，將這些置于4,000毫升含有3,500毫升Tris-緩沖鹽+0.5摩爾濃度鹽酸胍的燒瓶中。將燒瓶置于4℃的室內(nèi)，在磁攪拌器上攪拌過夜，然后用Tris緩沖鹽+0.1摩爾濃度鹽酸胍替代透析緩沖液，繼續(xù)透析12小時。然后用Tris-緩沖鹽+0.05摩爾濃度鹽酸胍替代緩沖鹽，繼續(xù)透析過夜。用Tris緩沖鹽(沒有胍)替代緩沖液，繼續(xù)透析12小時。重復(fù)3次以上。將最后的溶液倒入2000毫升塑料園瓶中，加入13毫升100毫摩爾濃度PMSF(在乙醇中)，以便抑制蛋白酶活性。將溶液以100毫升的等分試樣儲存于-20℃。
為了證實已經(jīng)分離融合蛋白，將每種制劑的等分試樣在重蒸水中稀釋20倍，并與等體積的SDS-PAGE樣品緩沖液混合，置于沸水浴5分鐘，在12％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。同時電泳的有重組白細胞毒素對照。
所有融合蛋白以內(nèi)含體形式高水平表達。根據(jù)融合蛋白的DNA序列推測的分子量是104,869(LKT352::4拷貝的GnRH，來自pCB113；110,392(LKT352::8拷貝GnRH，來自pCB112)；57,542(LKT111::4拷貝的GnRH，來自pCB111)；63,241(LKT111::8拷貝GnRH，來自pCB14)；和73,886(8拷貝GnRH::LKT 111::8拷貝GnRH，來自pCB122)。重組LKT352分子的推測分子量是99,338，重組LKT111分子的推測分子量是51,843。
實施例6LKT-GnRH融合體的體內(nèi)免疫活性為了測試LKT-GnRH融合體誘導(dǎo)體內(nèi)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力，和將這一應(yīng)答與對其它GnRH載體共軛物的應(yīng)答比較，進行了下面的接種試驗。利用了三組，每組8個雄性豬，約8星期大(35-50公斤)，它們是沒有特異的病原體的。將動物保持在最小的疾病條件下，在試驗的0天和21天接種，接種的配方如下組1--含有鹽水的安慰劑，鹽水是在含有15毫克二甲基二十八烷基銨溴(DDA)(2毫升)的Emulsigen Plus助劑中配制的；組2--在同樣的助劑(2毫升)中配制的LKT352-GnRH(如前面的實施例中所述制備的250微克LKT)；組3--VP6-GnRH，在同樣的助劑(2毫升)中配制得到0.5微克VP6和5微克GnRH。如美國專利號5,071,651中所述，利用其中所述的結(jié)合肽制備VP6制劑。
在0,21和35天，取血樣，允許凝塊，在1500g離心，除去血清。利用Silversides等人，免疫學(xué)再雜志(1985)7:171-184的RIA方法測量抗GnRH的血清抗體效價。
這一試驗的結(jié)果表明只有那些用LKT352-GnRH配方免疫接種的動物產(chǎn)生明顯的抗GnRH效價(效價＞1∶70)。安慰劑和VP6-GnRH組都不產(chǎn)生抗GnRH效價。如上所述，誘導(dǎo)抗激素效價需要用與其它載體蛋白共軛的100微克以上的劑量的GnRH多次接種。這些結(jié)果表明LKT-GnRH載體系統(tǒng)提供了比過去的載體系統(tǒng)大大增強的免疫原。
實施例7與LKT連接的多個任意GnRH重復(fù)的體內(nèi)免疫效果為了測試含有多個GnRH多肽重復(fù)的重組LKT-GnRH融合體蛋白在體內(nèi)誘導(dǎo)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力，進行了下面的接種試驗。如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB113和pCB175(分別含有4和8個拷貝的與LKT352連接的GnRH)，和具有1個拷貝的與LKT352連接的GnRH的質(zhì)粒的大腸桿菌培養(yǎng)物。將來自上面每個培養(yǎng)物的疫苗配制含有同等的溶解于0.2毫升的Emulsigen Plus的5微克GnRH。每隔23天給三組10個雌性小鼠皮下注射兩次，在初次注射后23,35和44天收集血樣。利用標準放射性免疫測試方法以1∶100和1∶1000最后稀釋液測量抗GnRH的血清抗體效價。如果結(jié)合的碘化GnRH小于5％，認為抗體是不可檢測的。表1概括了這樣得到的抗體效價。
這一研究的結(jié)果表明等劑量的多個串聯(lián)重復(fù)提供的GnRH(4或8個拷貝)比單個拷貝的GnRH產(chǎn)生的抗體明顯增加(如通過結(jié)合碘化的天然GnRH測量的)。另外，上面的結(jié)果表明含有與LKT52連接的4個拷貝的GnRH串聯(lián)重復(fù)的融合體蛋白表示了有效的免疫原GnRH抗原形式，雖然劑量或個體種類可以影響免疫原性。
表1

>*平均應(yīng)答是只有那些結(jié)合超過5％的那些動物的結(jié)合I125-GnRH的平均結(jié)合。
實施例8LKT352::GnRH和LKT111::GnRH融合體的體內(nèi)免疫活性和生物學(xué)效果為了測試含有多個串聯(lián)重復(fù)的GnRH(與LKT352或LKT111連接)的融合體蛋白質(zhì)在體內(nèi)引發(fā)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力，和證實體內(nèi)的生物學(xué)效果，進行了下面的接種試驗。如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB113和pCB111(分別與LKT352或LKT111連接的4個拷貝的GnRH)的大腸桿菌培養(yǎng)物。將來自上面各個培養(yǎng)物的疫苗配制成含有溶于0.2毫升的VSA-3助劑(修飾的Emulsigen Plus助劑)的5微克GnRH的當量，同時制備的有含有0.2毫升的助劑的對照疫苗。間隔21天給予三組各5個雄性的小鼠兩次皮下注射，在5-6星期大的時候給予第一次注射(0天)。在49天殺死個體。
利用標準的放射性免疫測試方法在1∶1000血清稀釋度，測量抗GnRH抗體效價測量個體GnRH-LKT融合體的免疫活性。通過標準的放射性免疫測量血清睪酮水平，其敏感度為25皮克/毫升，定量測定GnRH-LKT融合體的生物學(xué)效果，稱重睪丸組織并進行組織學(xué)檢測。表2概括了這一試驗的結(jié)果。
在試驗中，所有注射GnRH:LKT抗原的動物個體具有容易檢測的抗體水平；但是，LKT111::GnRH融合體(來自pCB111質(zhì)粒)顯示了如由應(yīng)答和效價的均一性指明的優(yōu)越的免疫原性。血清睪酮以搏動方式分泌(睪丸的間質(zhì)細胞產(chǎn)生)，因此，在正常的動物個體中可以預(yù)期血清水平的低值并且變化特別大。在試驗中，對照組(接受0.2毫升輔助疫苗注射)具有正常的睪酮水平，而兩組處理個體基本沒有檢測到血清睪酮。
另外在試驗中，對睪丸組織的組織學(xué)評估發(fā)現(xiàn)不同程度的間質(zhì)細胞萎縮，減小了精細管直徑和干擾了被治療個體中的精子生成；但是，治療動物中睪丸重量仍然接近正常，甚至存在高抗GnRH抗體效價時，雖然在接受LKT111::4個拷貝的GnRH融合體的5個個體中有2個有睪丸抑制的明顯證據(jù)。
因此，這些結(jié)果顯示與LKT352或LKT111連接的多個拷貝的GnRH含有潛在的免疫原；另外表明的是，用本融合蛋白接種引發(fā)了抗體的產(chǎn)生，該抗體能夠中和體內(nèi)的內(nèi)源GnRH，并且在接受這樣的接種的動物個體中伴隨的體內(nèi)生物學(xué)效果是明顯的。
表2

*1∶1000血清稀釋度時I125-GnRH的結(jié)合％+納克/毫升實施例9在小豬個體中LKT::GnRH融合體的體內(nèi)免疫活性為了測試含有多個串聯(lián)GnRH重復(fù)(與LKT352或LKT111連接)融合體蛋白在小豬個體體內(nèi)引發(fā)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力，進行下面的接種試驗。如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB113,pCB111,pCB175和pCB114(分別是LKT352::4個拷貝GnRH,LKT111::4個拷貝的GnRH,LKT352::8個拷貝GnRH，和LKT111::8個拷貝GnRH)的大腸桿菌培養(yǎng)物。將來自上面每個培養(yǎng)物的疫苗配制成含有同等的50微克GnRH，并溶解于2.0毫升體積的VSA-3助劑中給藥。在0天對4組各5個雄性和5個雌性的35天大(0天)的剛斷奶的小豬注射，在試驗的21天再注射。在0,21和35天收集血樣，利用標準放射性免疫測試在最后稀釋度1∶1000時測量抗GnRH抗體的效價，表3概括了測試結(jié)果。
在試驗中，在任何個體中，在接種之前，檢測不到抗GnRH抗體，但在35天時大多數(shù)個體中容易地檢測到該抗體(在治療組4中一個個體死于與治療無關(guān)的感染)。這一試驗中的結(jié)果表明含有與LKT352或LKT111載體多肽連接的多個GnRH重復(fù)的融合蛋白形成小豬個體中有用的免疫原。根據(jù)十肽GnRH(1,200),LKT111多肽(52,000)和LKT352多肽(100,000)的推測分子量，LKT-GnRH抗原融合體中GnRH的百分數(shù)如下4.9％(LKT352::4個拷貝的GnRH)；8.5％(lkt111::4個拷貝的GnRH)；9.3％(LKT352::8個拷貝的GnRH)和15.7％(LKT111::8個拷貝的GnRH)。因此，這樣得到的實際結(jié)果表明通過利用含有LKT111多肽載體的LKT-GnRH融合體，給個體給藥的全部抗原(LRt-GnRH)的量可以減半(與利用LKT352載體多肽系統(tǒng)的疫苗組合物比較)，但得到同等的抗GnRH應(yīng)答。
表3

實施例10對LKT111::8個拷貝的GnRH免疫去雄的疫苗效果進行評估為了對含有LKT111::8個拷貝的GnRH融合蛋白的疫苗制劑的效果和商業(yè)用途，進行了下面的接種試驗。如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB114(LKT111::8個拷貝GnRH)的大腸桿菌培養(yǎng)物。制備來自上面的培養(yǎng)物的疫苗配方，它含有同等的50微克GnRH。將疫苗配方溶解于2.5毫升終體積的VSA-3助劑中給藥。建立3個治療組，每個含有30個雄性小豬(公豬)。3個組包括30個閹豬(公豬在性成熟之前外科去雄)，30個對照公豬和30個免疫去雄的豬(通過GnRH免疫原接種去雄的公豬)。在斷奶時(21天)，用安慰劑(僅VSA-3助劑)注射閹豬和對照公豬組動物，而用上面所述的疫苗配方注射免疫去雄的組。當動物在屠宰之前3星期達到預(yù)定重量時，給予免疫去勢組加強劑量的疫苗，而閹豬和對照公豬組再次用安慰劑注射。測量包括抗GnRH的血清抗體效價，血液睪酮水平，尸體特征，動物行為，飼料效率，增重速度，和唾液腺體和身體脂肪雄甾酮水平(作為公豬沾染的措施)。
(a)血清抗GnRH抗體效價利用標準的放射性免疫測試方法，在1∶5000血清稀釋度時通過測量抗GnRH抗體效價測量8個拷貝的GnRH-LKT融合體疫苗配方的免疫活性。圖12提供了在3個實驗組中的血清抗體效價的比較。可以看到，在免疫去雄(接種)的公豬中抗GnRH抗體效價明顯提高，并在接種后20天內(nèi)保持在明顯超過產(chǎn)生生物學(xué)效果(圖12中的約10到20％的結(jié)合率)需要的最小量的水平。
(b)免疫去勢疫苗對性腺大小的生物學(xué)影響通過比較來自對照公豬和免疫去雄(接種)的公豬的性腺的重量和測量結(jié)果，和通過測量和比較這兩實驗組的血清睪酮水平可以確定8拷貝GnRH-LKT融合體疫苗配方的生物學(xué)效果。特別是，稱重和測量了動物的尿道球腺和睪丸。下面的表4敘述了結(jié)果?？梢钥吹?，在接種動物中尿道球腺的平均重量比對照動物減少約32％。另外，接種動物中睪丸的重量比對照動物減少約32％。這些結(jié)果與接種動物中睪酮生成減少是一致的。
表4

*平均±標準誤差通過敏感度為25皮克/毫升的血清睪酮水平的標準放射性免疫測試確定所有三個實驗組中的平均血清睪酮水平。在加強接種后(在對照公豬和閹豬組中安慰劑接種)，在0天，7天，14天，和21天進行測試。圖13描述了測試的結(jié)果?？梢钥吹皆诮臃N后，在接種動物中，血清睪酮的水平下降，而對照公豬中的水平上升。
(c)尸體組合物在動物屠宰后，評估兩組每個實驗組的動物的尸體組合物的商業(yè)價值。特別是，確定了平均體重和脂肪含量。進行腰眼的平均測量，確定修整的股臀部和腰的平均重量。表5報道了尸體評估的結(jié)果?？梢钥吹?，尸體資料顯示對照公豬和免疫去雄(接種動物)具有非常相似的尸體組合物，而閹豬具有更多的身體脂肪，更少的瘦肉。另外，閹豬的生長表現(xiàn)在生命期的最后24天達到平穩(wěn)(結(jié)果未顯示)。這些尸體資料與使免疫去雄動物的尸體組成模仿對照公豬，除了在生長期的最后幾天，的目的是一致的。
表5尸體資料

d)飼料轉(zhuǎn)換從斷奶到屠宰的時期中測量每個實驗組的動物的飼料轉(zhuǎn)換效率。特別是，將平均飼料轉(zhuǎn)換效率表達為公斤飼料獲得的公斤重量的比例。圖14描述了結(jié)果?？梢钥吹皆趯φ展i和免疫去雄(接種動物)中飼料轉(zhuǎn)換約為10％，比閹豬中的飼料轉(zhuǎn)換更有效。
(e)閹豬沾染成分水平通過測試來自各個實驗組的動物的脂肪和唾液腺中的雄甾酮水平(閹豬沾染成分)評估在接種動物中8拷貝GnRH-LKT融合疫苗制劑減少公豬沾染的能力。通過對從各組得到的脂肪和唾液腺樣品進行標準化學(xué)過程可以定量測定雄甾酮水平。表6報道了結(jié)果?？梢钥吹綄φ展i與閹豬和免疫去雄(接種動物)相比具有非常高的雄甾酮濃度。
表6<

p小于.01
所有上面的結(jié)果表明含有短LKT::8個拷貝的GnRH融合分子的免疫去雄疫苗制劑提供了外科去雄方法的商業(yè)可行的替代方法。
實施例11具有一個或兩個GnRH多聚體的融合分子的體內(nèi)免疫原活性的比較為了比較含有單個GnRH多聚體(含有8個GnRH的串聯(lián)重復(fù))，或兩個GnRH多聚體(兩個都含有8個GnRH的串聯(lián)重復(fù))的LKT-GnRH融合蛋白在體內(nèi)引發(fā)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力，進行了幾個接種試驗。
如上所述，制備了含有質(zhì)粒pCB114(一個與LKT111的C’末端連接的8拷貝GnRH多聚體)，和質(zhì)粒pCB122(兩個8拷貝GnRH多聚體，一個與LKT111的N’末端連接，另一個與LKT111的C’末端連接)的大腸桿菌培養(yǎng)物。將起源于含有pCB114質(zhì)粒的培養(yǎng)物的疫苗配制成在2毫升終體積的VSA-3助劑中含有160微克融合分子(25微克總的GnRH)。將起源于含有pCB122質(zhì)粒的疫苗配制成在2毫升終體積的VSA-3助劑中含有185微克融合分子(50微克總GnRH)。以這樣的方式，保持兩種制劑中LKT載體分子的量不變(每個配方135微克總LKT)。在下面的接種試驗中利用疫苗制劑。
(a)抗GnRH抗體效價和抗GnRH抗體分子的功能活性進行了兩個實驗疫苗制劑引發(fā)的抗GnRH抗體效價之間的比較，其中也評估了引發(fā)的抗體阻止內(nèi)源地產(chǎn)生GnRH的影響的能力。特別是，如下確立了三組雄性小豬50個動物用單個GnRH多聚體疫苗組合物(pCB114得到的LKT111::8個拷貝的GnRH融合體)注射，10個動物用多倍的GnRH多聚體疫苗組合物注射(從pCB122得到的8拷貝GnRB::LKT111::8拷貝GnRH融合體)，和10個對照動物只注射2毫升VSA-3助劑。
在斷奶時(21天大)進行接種，在30天后加強接種動物。在加強接種后14到28天收集血液。獲得血清并測試抗GnRH抗體效價和黃體激素(LH)的血清水平。利用標準放射性免疫測試的碘化GnRH，在最后血清稀釋度1∶5000時確定血清抗GnRH抗體效價。在標準放射性免疫測試中利用小豬LH作為參考標準測試血清LH水平。表7報道了測試結(jié)果，以平均值±標準誤差表示。正如在表7中描述的數(shù)據(jù)可以看到，與接受單個GnRH多聚體疫苗(LKT111::8個拷貝GnRH)的動物相比，注射多倍GnRH多聚體的疫苗組合物(8個拷貝GnRH::LKT111::8個拷貝GnRH)的動物抗GnRH的抗體效價更高。另外，接受多倍GnRH多聚體疫苗的動物的血清LH水平更低。血清LH水平的降低反映了疫苗動物中產(chǎn)生的抗GnRH抗體阻止內(nèi)源產(chǎn)生的GnRH效果的能力。最后，通過產(chǎn)生抗GnRH抗體100％的接受多倍GnRH多聚體疫苗的動物應(yīng)答疫苗，而90-92％的接受單個GnRH多聚體的動物產(chǎn)生應(yīng)答。
表7

(b)比較抗GnRH的效價和增加疫苗劑量的效果的評估如下再次評估兩個疫苗配方的免疫原性(8個拷貝的GnRH單個多聚體抗原和16個拷貝的GnRH多倍多聚體抗原)。建立了每個20個雄性小豬的兩個實驗組。在斷奶時(21天)用160微克單個多聚體抗原制劑接種第一組動物，然后用同樣的劑量在33天后加強接種。在斷奶時(21天)用185微克多倍多聚體抗原制劑接種第二組中的動物，同樣在33天后加強接種。在加強注射后8,14，和24天時收集血液，如上所述，利用標準的放射性免疫測試，在最后稀釋度1∶5000測試血清的抗GnRH抗體分子。圖15敘述了結(jié)果。可以看到，應(yīng)答多倍多聚體疫苗(8個拷貝GnRH::LKT111::8個拷貝GnRH)的抗體比單個多聚體疫苗(LKT111::8個拷貝GnRH)的高(p＜.001)。仍然參考圖15，在Y軸上20％處的水平線代表了抗體效價，這在前面的試驗中沒有報道，它已經(jīng)顯示接種動物抑制LH的分泌。又一次，接受多倍GnRH多聚體疫苗的動物100％應(yīng)答(產(chǎn)生抗GnRH抗體)，而接受單個多聚體疫苗的動物的90-92％產(chǎn)生應(yīng)答。
為了確定用多倍GnRH多聚體疫苗觀察到增強的免疫原性是GnRH抗原劑量增強造成的(例如，在[8拷貝GnRH::LKT111::8拷貝GnRH]疫苗中50微克GnRH，相比之下，在[LKT111::8拷貝GnRH]疫苗中25微克GnRH)，進行了下面的研究。在斷奶時(21天)接種三組各20個小豬，在約30天后用單個GnRH多聚體疫苗組合物(從pCB114得到的LKT111::8個拷貝的GnRH融合體)加強接種，接種劑量如下分別50微克，150微克和450微克融合蛋白。在加強注射后14,28和64天收集血液。如上所述在最后稀釋度1∶5000測試血清的抗GnRH抗體。表8敘述了結(jié)果?？梢钥吹綄τ迷龃髣┝康膯蝹€GnRH多聚體疫苗組合物的應(yīng)答沒有得到抗GnRH抗體效價的明顯增加。這表明用多倍GnRH多聚體疫苗(從pCB122得到的8個拷貝GnRH::LKT111::8個拷貝的GnRH融合體)觀察到的免疫原性增強不是由GnRH抗原濃度增高導(dǎo)致的；而增強的免疫原性似乎是由特定的LKT-GnRH融合分子的三維結(jié)構(gòu)造成的，或者在于GnRH抗原對產(chǎn)生抗體的細胞的物理表現(xiàn)。
表8

實施例12具有兩個GnRH多聚體的LKT-GnRH融合分子進行的劑量應(yīng)答研究為了確定從含有兩個GnRH多聚體(兩者含有8個GnRH串聯(lián)重復(fù))的LKT-GnRH融合蛋白形成的疫苗組合物的最適劑量，進行了下面的體內(nèi)劑量應(yīng)答的研究。
如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB122的大腸桿菌培養(yǎng)物(兩個8拷貝的GnRH多聚體，一個與LKT111的N’末端連接，一個與LKT111的C’末端連接)。以下面的總?cè)诤系鞍讋┝颗渲坪衟CB122質(zhì)粒培養(yǎng)物起源的7個疫苗0微克(對照)；1微克；5微克；10微克；20微克；40微克；和80微克，每個溶解于最后體積為1毫升的VSA-3助劑中。
組成各20個動物的7個實驗組，并用上面所述的疫苗配方接種。在接種后35天取血樣，在如上所述的標準放射性免疫測試中，在稀釋度為1∶100時測量抗GnRH抗體的效價。表9報道了測試的結(jié)果。如上所述效價表示為％結(jié)合率?？梢钥吹綇慕y(tǒng)計學(xué)看0微克融合蛋白不同于所有其它值。1微克融合蛋白劑量(p＜.009)低于所有從接受蛋白質(zhì)抗原的組中得到的其它值。5微克劑量小于20微克劑量(p＜.06)，但是，所有10微克以上的劑量的總?cè)诤系鞍椎闹到y(tǒng)計地看基本相同。這些數(shù)據(jù)表明起源于質(zhì)粒pCB122的融合蛋白(8個拷貝nRH::LKT111::8個拷貝GnRH)的疫苗的最適劑量約為20-40微克融合蛋白。
表

<p>實施例13雌性大鼠的GnRH免疫接種為了評估雌性個體的GnRH接種的生物學(xué)效果，進行了下面的研究。
如上所述制備了含有pCB122質(zhì)粒的大腸桿菌培養(yǎng)物(2個8拷貝的GnRH多聚體，一個與LKT111的N’末端連接，一個與LKT111的C’末端連接)。將起源于培養(yǎng)物的疫苗配制成在1毫升最后體積的VSA-3助劑中含有185微克融合分子(50微克總GnRH)。然后將配方用于下面的接種試驗，以評估GnRH接種對雌性個體中的卵巢重量，子宮重量，血清雌激素濃度的影向。
組成各10個雌性Sprague Dawley大鼠的兩個實驗組。在實驗的0天給對照組(組1)安慰劑注射(僅VSA-3助劑)。在第二組的動物接受GnRH/LKT疫苗配方的單次注射。在處理后檢測抗GnRH抗體效價，在組2中的動物在注射后21天到研究的約50天達到最大水平顯示了效價上升，然后水平逐漸下降直到在研究的224天殺死動物。
然后確定和記錄卵巢重量，子宮重量，和血清雌激素水平。圖16描述了這些測量的結(jié)果。可以看到，在治療動物(用GnRH-LKT疫苗配方接種)中的卵巢重量比對照動物明顯減少。對組織的組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)在卵巢組織中沒有活性卵泡。在治療動物中子宮重量也明顯減少。子宮重量提供了血清雌激素濃度的良好反映，與生殖巢類固醇的分泌相關(guān)。另外，治療動物中血清雌激素水平下降到約20皮克/毫升，而在對照動物中血清雌激素水平約為50皮克/毫升。由于雌激素起源于卵巢，可以預(yù)期在處理動物中血清雌激素將下降。這些結(jié)果證明本發(fā)明的GnRH/LKT接種方法可以有效地控制卵巢功能，表明這是子宮切除術(shù)或用GnRH拮抗物治療的可行的替代方法。
實施例14利用含有兩個GnRH多聚體的LKT-GnRH融合分子對雄性小豬個體免疫去雄為了確定從含有兩個GnRH多聚體(兩者含有8個GnRH的串聯(lián)重復(fù))的LKT-GnRH融合蛋白形成的疫苗組合物減少脂肪中雄甾酮的能力，進行了下面的研究。
如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB122的大腸桿菌培養(yǎng)物(兩個8拷貝的GnRH多聚體，一個與LKT111的N’末端連接，一個與LKT111的C’末端連接)。也如上所述制備了起源于該培養(yǎng)物的疫苗組合物。如下所述形成4個雄性小豬個體的實驗組組1，包括6個閹豬(在出生后幾天內(nèi)外科去勢的雄性動物)；組2，包括7個公豬(在研究過程中保留雄性器官完整)；組3，包括6個后去勢動物(保留雄性器官完整直到135天大，麻醉動物并外科去勢)；組4，包括10個完整的雄性動物，將它們在斷奶時(21天)和約135天大時用LKT-GnRH疫苗組合物免疫接種。
在42天后，完成研究，并殺死動物。通過標準化學(xué)方法定量在各實驗組中，來自動物的脂肪樣品中的脂肪雄甾酮水平(公豬沾染成分)。圖17敘述了結(jié)果。在圖中可以看到，在閹豬(組1)，后去勢小豬(組3)和免疫去勢組(組4，用LKT-GnRH疫苗處理)中脂肪雄甾酮水平相同，與組2的公豬相比，所有3組的脂肪雄甾酮水平都低。
同時確定了試驗動物中尸體組合物的各個方面。特別是，在各組中確定了尸體重量，背部脂肪測量，睪丸重量(恰當?shù)脑?和尿道球腺長度(BU)。下面的表10敘述了測量的平均值。BU腺體是依賴于睪酮來維持大小和功能的。
表10

<p>在表10中可以看到，與未測量公豬組2相比，組4的免疫去勢動物中睪丸重量和BU腺體長度明顯減少，表明在接種動物中，LKT-GnRH疫苗組合物有效地減少了血清睪酮的水平和/或效果。
實施例15在重組LKT352和LKT111分子中T細胞表位的推測為了推測用于本發(fā)明的LKT-GnRH嵌合體中的白細胞毒素多肽序列中的潛在的T細胞表位，如表11所述對對應(yīng)于LKT分子1到199編號的氨基酸序列進行Margalit和其合作者建議的方法(Margalit等人，免疫學(xué)雜志(1987)138:2213)。在本方法中，將白細胞毒素多肽序列的氨基酸序列與其它已知誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答的序列比較和確信是T細胞表位需要的氨基酸類型模式比較。表11描述了比較的結(jié)果。
從這樣推測的結(jié)果可以看到，在白細胞毒素肽中存在幾個短序列，利用Margalit等人(出處同上)提出的原則鑒定了它們是潛在的T細胞表位。更具體地說，鑒定了9個序列具有(帶電/Gly-疏水-疏水-極性/Gly)序列(在表11中表示為模式“1”)，和3個序列具有(帶電/Gly-疏水-疏水-疏水/Pro-極性/Gly)序列(在表11中表示為模式“2”)。將這些數(shù)據(jù)與上面的實施例7和8中的LKT352和LKT111載體系統(tǒng)在體內(nèi)產(chǎn)生的抗GnRH活性結(jié)合，可以表明關(guān)鍵的T細胞表位保留在短LKT111分子中，并且那些表位似乎是包含在LKT352和LKT111分子的N’末端部分。
表11對應(yīng)于潛在的T細胞表位的LKT序列圖譜顯示模式“1”的LKT氨基酸序列GTID(氨基酸27-30)GITG(氨基酸66-69)GVIS(氨基酸69-72)HVAN(氨基酸85-88)
KIVE(氨基酸93-96)DLAG(氨基酸152-155)KVLS(氨基酸162-165)DAFE(氨基酸171-174)KLVQ(氨基酸183-186)GIID(氨基酸192-195)顯示模式“2”的LKT氨基酸序列RYLAN(氨基酸114-118)KFLLN(氨基酸124-128)KAYVD(氨基酸167-171)實施例16推測從pCB122得到的LKT-GnRH融合蛋白的物理結(jié)構(gòu)為了推測從pCB122構(gòu)建體得到的8個拷貝的GnRH::LKT111::8拷貝的GnRH融合分子的B細胞表位的物理結(jié)構(gòu)，利用前面所述的方法分析了pCB122的氨基酸序列(在圖9-1到9-6中有描述)，以便確定蛋白質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)。Rost等人(1993)分子生物學(xué)雜志232:584-599,Rost等人(1994)蛋白質(zhì)19:55-72，和Rost等人(1994)蛋白質(zhì)20:216-226。特別是，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)進行推測，其中輸人數(shù)據(jù)包括多個序列排列。利用程序MaxHom(Sander等人(1991)蛋白質(zhì)9:56-68)進行網(wǎng)絡(luò)分析，其中殘留溶劑可接近性的訓(xùn)練來自Kabsch等人(1983)生物多聚體22:2577-2637。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析評估了在pCB122序列中的每個氨基酸，并推測是否殘基將以環(huán)，螺旋或暴露的結(jié)構(gòu)存在。在推測過程中，推測了pCB122分子的氨基末端的8拷貝GnRH主要以環(huán)結(jié)構(gòu)存在，而羧基末端的8個拷貝的GnRH具有混合的推測結(jié)構(gòu)(環(huán)，螺旋和暴露殘基)。
這些數(shù)據(jù)表明用從pCB122構(gòu)建體得到的8拷貝GnRH::LKT111::8拷貝GnRH融合分子觀察到的免疫原性增強可以與分子中GnRH抗原的不同的三維結(jié)構(gòu)有關(guān)。
D．工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的白細胞毒素GnRH嵌合體用于提供免疫原，當對脊椎動物寄主給藥時，該免疫原的作用是接種寄主抗內(nèi)源GnRH，它的作用依次是抑制寄主的繁殖功能和能力。
除了本說明書中舉證的特殊用途，本文公開的新嵌合體分子提供了得到含有一個以上的GnRH多肽，以多個或串聯(lián)重復(fù)存在的融合蛋白的方法，這些多肽與分子的白細胞毒素多肽部分提供的免疫原表位融合(在某些情況下，由選定的GnRH序列之間存在的間隔肽序列提供)。在本發(fā)明中關(guān)鍵的個體嵌合體蛋白提供了對融合GnRH肽序列的免疫原性增強，使接種脊椎動物寄主對內(nèi)源GnRH有效免疫應(yīng)答；有效地干擾了兩種促性腺激素，黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和釋放，并使寄主暫時不育。以這樣的方式，新白細胞毒素GnRH構(gòu)建體可以應(yīng)用免疫絕育疫苗，提供目前在家養(yǎng)和農(nóng)場動物畜牧業(yè)中使用的侵入性絕育方法的替代方法。
白細胞毒素GnRH融合分子也可以用于在哺乳動物個體中減少乳房腫瘤的跡象，所用的疫苗含有妨礙乳房功能如產(chǎn)生子宮激素雌激素和黃體酮的那些分子。以差不多相同的方法，免疫絕育的犬科和貓科個體將不發(fā)展子宮積膿(子宮感染)，因為接種動物將不產(chǎn)生的能誘導(dǎo)這一癥狀黃體酮。
本融合分子的其它受關(guān)注的用途包括控制群體數(shù)目，例如干擾野生嚙齒動物群體的再生能力。在這點上，LKT-GnRH融合分子可以用作目前實施的如毒殺和諸如此類的控制群體的措施的替代方法。本發(fā)明的融合體產(chǎn)物也可以處于含有慢和快釋放成分的構(gòu)建體中給藥。以這種方式，可以避免多次接種。另外，由于在種類之間GnRH的氨基酸序列是高度保守的，可以生產(chǎn)單個白細胞毒素GnRH融合體疫苗，該疫苗將展示廣泛的種類交叉的有效性。
所以，已經(jīng)公開了各種含有與選定GnRH多肽融合的白細胞毒素的嵌合體蛋白。雖然本發(fā)明的優(yōu)選實施方案已經(jīng)較為詳細地敘述了，可以理解的是，不脫離附加的權(quán)利要求確定的本發(fā)明的精神和范圍，可以有各種變化。
在本發(fā)明的實施中有用的菌株的保藏在美國典型培養(yǎng)物收藏處(ATCC),12301Parklawn大道，Rockville，馬利蘭州，進行下面菌株的生物學(xué)純化培養(yǎng)物的保藏。在成功的存活性測試后，分配了所指明的登記號，同時交付了必要的費用。按照國際公認的用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約和其規(guī)則進行保藏。這保證在保藏之日起30年的時期，和最后要求保藏機構(gòu)提供保藏物的樣品后至少5年的時期內(nèi)維持存活的培養(yǎng)物。按照布達佩斯條約可以ATCC獲得微生物，這保證對于美國專利和商標委員會根據(jù)35USC§122和委員會的規(guī)則(包括37CFR§1.12)確定登記的對象是永遠和不受限制地可以得到該培養(yǎng)物的。在專利授權(quán)的情況下，所有對公眾獲得保藏培養(yǎng)物的限制將不可改變地去除。
這些保藏物僅僅是為了方便本領(lǐng)域技術(shù)人員而提供，沒有承認保藏物是35USC§112所需要的。這些質(zhì)粒的核酸序列以及它們編碼的多肽的氨基酸序列將引入本文作為參考，并在任何與本文的敘述有爭議的事件中起作用。生產(chǎn)，使用或銷售保藏物質(zhì)需要許可證，還沒有授序這樣的許可。菌株號保藏日期ATCC號溶血性巴斯德菌1989年2月1日53863血清型1B122大腸桿菌JM105中 1989年2月1 日 67883的pAA101大腸桿菌W1485中 1990年3月30 68283的pAA352大腸桿菌JM105中 1995年2月1日69749的pCB113大腸桿菌JM105中 1995年2月1日69748的pCB11權(quán)利要求
1．一種嵌合體蛋白，它含有與第一個和第二個多聚體融合的白細胞毒性多肽，其中第一個多聚體的C末端與白細胞毒素多肽的N末端融合，第二個多聚體的N末端與白細胞毒素多肽的C末端融合，另外其中每個所述的多聚體含有一個以上的選定GnRH多肽。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合體蛋白質(zhì)，其中第一個和第二個GnRH多聚體是不同的，并含有通式[GnRH-X-GnRH]n的分子，其中GnRH包括一個GnRH多肽；X選自下組肽鍵，氨基酸間隔基團和白細胞毒素多肽；n是大于或等于1的整數(shù)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合體蛋白，其中第一個和第二個GnRH多聚體是相同的，并且包括通式[GnRH-X-GnRH]n的分子，其中GnRH包括一個GnRH多肽；X選自下列組肽鍵，氨基酸間隔基團和白細胞毒素多肽；n是大于或等于1的整數(shù)。
4．根據(jù)權(quán)利要求2或3的任何一項所述的嵌合體蛋白，其中X是氨基酸間隔基團，它具有至少一個輔助T細胞表位。
5．根據(jù)權(quán)利要求2或3的任何一項所述的嵌合體蛋白，其中n=4。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合體蛋白，其中白細胞毒素多肽缺乏細胞毒素活性。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合體蛋白，其中白細胞毒素多肽是LKT352。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7的任何一項所述的嵌合體蛋白，其中第一個多聚體還含有與其N末端融合的氨基酸序列(Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser)。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合體蛋白，含有圖9-1到9-6描述的氨基酸序列，或與其基本同源和功能等當?shù)陌被嵝蛄小?br> 10．含有權(quán)利要求1-9的任何一個所述的嵌合體蛋白和藥物可接受載體的疫苗組合物。
11．一種對個體提呈選定的GnRH多聚體的方法，包括對所述個體給藥有效量的權(quán)利要求10所述的疫苗組合物。
12．編碼一種嵌合體蛋白的DNA構(gòu)建體，其中該嵌合體蛋白含有與第一個和第二個多聚體融合的白細胞毒素多肽，其中第一個多聚體的C末端與白細胞毒素多肽的N末端融合，第二個多聚體的N末端與白細胞毒素多肽的C末端融合，另外其中每個所述的多聚體含有一個以上的選定GnRH多肽，所述DNA構(gòu)建體含有編碼第一個GnRH多聚體的第一個核苷酸序列；和編碼第二個GnRH多聚體的第二個核苷酸序列；其中所述的第一個和第二個核苷酸序列可操作地與第三個編碼白細胞毒素多肽的核苷酸序列連接。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA構(gòu)建體，其中第一個和第二個GnRH多聚體是不同的，并含有通式[GnRH-X-GnRH]n的分子，其中GnRH含有一個GnRH多肽；X選自下列組肽鍵，氨基酸間隔基團和白細胞毒素多肽；n是大于或等于1的整數(shù)。
14．根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA構(gòu)建體，其中第一個和第二個GnRH多聚體是相同的，并含有通式[GnRH-X-GnRH]n的分子，其中GnRH含有一個GnRH多肽；X選自下列組肽鍵，氨基酸間隔基團和白細胞毒素多肽；n是大于或等于1的整數(shù)。
15．根據(jù)權(quán)利要求13或14的任何一個所述的DNA構(gòu)建體，其中X是氨基酸間隔基團，它至少含有一個輔助T細胞表位。
16．根據(jù)權(quán)利要求13或14的任何一個所述的DNA構(gòu)建體，其中n=4。
17．根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA構(gòu)建體，其中白細胞毒素多肽缺乏細胞毒素活性。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的DNA構(gòu)建體，其中白細胞毒素多肽是LKT352。
19．根據(jù)權(quán)利要求12-18的任何一個所述的DNA構(gòu)建體，其中第一個多聚體還含有與其N末端融合的氨基酸序列(Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser)。
20．根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA構(gòu)建體，其中嵌合體蛋白包括圖9-1到9-6描述的氨基酸序列，或其基本同源和功能等當?shù)陌被嵝蛄小?br> 21．表達盒，含有(a)權(quán)利要求12-20的任一項所述的DNA構(gòu)建體；(b)指導(dǎo)所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的控制序列，從而可以在寄主細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯所述的構(gòu)建體。
22．用權(quán)利要求21所述的表達盒轉(zhuǎn)化的寄主細胞。
23．產(chǎn)生重組多肽的方法，包括(a)提供權(quán)利要求22所述的寄主細胞的群體；和(b)在表達所述的表達盒編碼的多肽的條件下培養(yǎng)所述的細胞的群體。
24．在哺乳動物個體中降低乳房腫瘤的發(fā)生率的方法，包括對所述個體以治療有效量的權(quán)利要求10所述的疫苗組合物給藥。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的免疫載體系統(tǒng),編碼它的DNA以及這些系統(tǒng)的應(yīng)用。這些系統(tǒng)包括嵌合體蛋白質(zhì),該嵌合體蛋白質(zhì)包括一種與一個或多個選定的GnRH多聚體融合的白細胞毒素多肽,該GnRH多聚體包含至少一個重復(fù)的GnRH十肽序列,或至少一個相應(yīng)于至少一個選定的GnRH分子的表位的序列的重復(fù)單元。在本發(fā)明中,該選定的GnRH序列可以全部相同,或者可以相應(yīng)于GnRH的不同的衍生物、類似物或表位,只要該GnRH序列可引發(fā)免疫反應(yīng)。該白細胞毒素的作用是提高與其融合的GnRH多聚體的免疫原性。
文檔編號A61K47/48GK1233288SQ97197161
公開日1999年10月27日 申請日期1997年8月8日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月9日
發(fā)明者安德魯·A·波特, 約翰·G·曼斯 申請人:薩斯喀徹溫大學(xué)