專(zhuān)利名稱(chēng)：T-bam(cd40l)技術(shù)在治療涉及平滑肌細(xì)胞的疾病中的治療應(yīng)用的制作方法
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在本申請(qǐng)中，各種參考文獻(xiàn)被歸總在括號(hào)中。這些出版物的全文公開(kāi)在此被加入到本申請(qǐng)以作參考，從而更全面地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)狀況。這些參考文獻(xiàn)的全部文獻(xiàn)引用可在本文中找到或由實(shí)驗(yàn)詳述部分之后的數(shù)字列出。
CD40是一種在各種細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面分子，且與稱(chēng)為CD40L的30-33kDa活化誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞反受體相互作用。在T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用中，CD40L-CD40相互作用已被廣泛研究，并且其對(duì)于T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞分化以及IgG,IgA和IgE的產(chǎn)生是必需的。CD40還在單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)。在體外，這些細(xì)胞中的CD40表達(dá)由細(xì)胞因子，最顯著的是IFN-γ正調(diào)節(jié)。令人感興趣的是，體內(nèi)研究已證實(shí)在炎癥位點(diǎn)，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜或牛皮癬斑點(diǎn)有明顯正調(diào)節(jié)的CD40表達(dá)。使用抗CD40單克隆抗體或CD40L+細(xì)胞的體外研究證實(shí)CD40在單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中功能性表達(dá)。
例如，CD40L-CD40相互作用誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-Iα、IL1β、IL-6和TNF-α以及樹(shù)突細(xì)胞分泌TNF-α。CD40L-CD40相互作用還促進(jìn)單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞分泌趨化因子IL-8和MIP1α。而且，CD40連接增強(qiáng)胸腺上皮細(xì)胞的IL-1介導(dǎo)的GM-CSF的產(chǎn)生。此外，CD40L介導(dǎo)的信號(hào)誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-10和氧化氮并增加成纖維細(xì)胞IL-6的產(chǎn)生。在CD40L-CD40相互作用后成纖維細(xì)胞也增殖。最后，在CD40連接后，內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞正調(diào)節(jié)胞間粘著因子。
已用各種藥物，包括降低膽固醇的藥物、β阻斷劑、鈣通道阻斷劑和抗凝血?jiǎng)﹣?lái)治療血管病，如動(dòng)脈粥樣硬化。目前已證實(shí)平滑肌細(xì)胞能表達(dá)CD40。這為通過(guò)抑制CD40與CD40配體(也稱(chēng)為T(mén)-BAM、5c8Ag、gp39和TRAP)之間的相互作用來(lái)治療血管病提供了基礎(chǔ)。涉及平滑肌的其他疾病也通過(guò)抑制CD40-CD40L相互作用來(lái)治療。
本發(fā)明提供抑制細(xì)胞表面具有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD配體活化的方法，包括將細(xì)胞與能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的物質(zhì)接觸，其中該物質(zhì)以有效抑制該細(xì)胞活化的量存在。
本發(fā)明提供在宿主中抑制細(xì)胞表面具有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD配體活化的方法，包括給予該宿主能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的物質(zhì)，其中該物質(zhì)以在該宿主中有效抑制細(xì)胞活化的量存在。
本發(fā)明提供在宿主中治療平滑肌細(xì)胞依賴性疾病的方法，包括包括給予該宿主能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的物質(zhì)，其中該物質(zhì)以在該宿主中有效抑制細(xì)胞活化的量存在，從而治療平滑肌細(xì)胞依賴性疾病。


圖1A靜息人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的FACS分析。虛線代表同型對(duì)照單克隆抗體；短劃線代表抗CD54單克隆抗體；實(shí)線代表抗CD40單克隆抗體。該圖表明平滑肌細(xì)胞不組成性地表達(dá)CD40。
圖1B在存在IFN-γ(1000U/cc)下，在細(xì)胞培養(yǎng)物中72小時(shí)后的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的FACS分析。該圖表明對(duì)IFN-γ產(chǎn)生應(yīng)答的平滑肌細(xì)胞CD40表達(dá)的正調(diào)節(jié)。
圖1C在存在IL-1α(1ng/cc)下，在細(xì)胞培養(yǎng)物中72小時(shí)后的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的FACS分析。未觀察到平滑肌細(xì)胞CD40表達(dá)的正調(diào)節(jié)。
圖1D在細(xì)胞培養(yǎng)物中72小時(shí)后，在存在TNF-α(200U/cc)下，人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的FACS分析。未觀察到平滑肌細(xì)胞CD40表達(dá)的正調(diào)節(jié)。
圖2A-Y含殘基Gly116-Leu261(在Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)格式中)(SEQ ID NO:1)的人CD40L的可溶性細(xì)胞外片段的晶體結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)。
圖3A-3B在與移植相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化損傷部位的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中CD40原位表達(dá)。顯示的是二色免疫組織化學(xué)研究的顯微照片，表明在患有與移植相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化的病人中的圖3A中的平滑肌細(xì)胞(紅色染色)以及圖3B中的巨噬細(xì)胞(紅色染色)中的CD40表達(dá)(褐色染色)。
圖4A-4B用蘇木精和伊紅(圖4A)以及抗CD40單克隆抗體(圖4B)染色的來(lái)自患有特發(fā)性心肌炎的病人的正常冠狀動(dòng)脈。圖4A注意不存在內(nèi)膜加厚或炎癥感染。圖4B:CD40的表達(dá)局限于貼附在血管腔的內(nèi)皮細(xì)胞。對(duì)同型特異性對(duì)照單克隆抗體沒(méi)有反應(yīng)性(未顯示)。(圖4A，圖4B×25)。
圖5A-5B用蘇木精和伊紅(圖5A)以及抗CD40單克隆抗體(圖5B)染色的患有局部缺血心肌病的病人的冠狀動(dòng)脈中的纖維動(dòng)脈粥樣硬化斑點(diǎn)。圖5A覆蓋在部分鈣化的動(dòng)脈粥樣硬化核心的纖維帽含有許多炎癥細(xì)胞(箭頭)。圖5B纖維帽中的大多數(shù)炎癥細(xì)胞為強(qiáng)CD40+(箭頭)。相鄰的內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也為CD40+(圖5A，圖5B×25)。
圖6A-6C用蘇木精和伊紅(圖6A)以及抗CD40單克隆抗體(圖6B,6C)染色的患有與移植相關(guān)的冠狀動(dòng)脈疾病(TCAD)的病人中的在泡沫細(xì)胞中富集的早期內(nèi)膜損傷。圖6A內(nèi)膜損傷包含許多泡沫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。圖6B在TCAD的早期損傷中，CD40在許多內(nèi)膜細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。圖6C特別是，泡沫細(xì)胞顯示大量的對(duì)CD40的染色。(圖6A×25，圖6B×50，圖6C×400)。
圖7A-7D在用抗CD40L單克隆抗體(圖7A)，對(duì)照單克隆抗體(圖7B)，抗CD4單克隆抗體(圖7C)和抗CD8單克隆抗體(圖7D)標(biāo)記的天然CA中的內(nèi)膜損傷的纖維帽中存在的炎癥感染。圖7A僅局限于淋巴細(xì)胞的特征性胞質(zhì)和細(xì)胞表面CD40L的免疫反應(yīng)性。圖7B用無(wú)關(guān)的同型配對(duì)對(duì)照單克隆抗體染色的相同損傷未顯示免疫染色。圖7C事實(shí)上天然CA損傷中的所有淋巴細(xì)胞(以及許多巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞)是CD4+，表明CD40L+淋巴細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞。圖7D在天然CA的內(nèi)膜斑點(diǎn)中，CD8+T細(xì)胞很少。(圖7A,7B×1000，圖7C,7D×400)。
圖8A-8C在用抗CD40L單克隆抗體(圖8A)，對(duì)照單克隆抗體(圖8B)，抗CD4單克隆抗體(圖8C)標(biāo)記的TCAD中的深處內(nèi)膜淋巴聚集物。圖8A在內(nèi)膜中以及遠(yuǎn)離內(nèi)皮表面的淋巴聚集物中發(fā)現(xiàn)了TCAD中的大多數(shù)CD40L+細(xì)胞(箭頭)。圖8B無(wú)關(guān)同型配對(duì)對(duì)照單克隆抗體表明在該內(nèi)膜淋巴聚集物中沒(méi)有細(xì)胞染色。圖8C如上相同的內(nèi)膜淋巴聚集物差不多只包含CD4+T細(xì)胞，表明在這些損傷中CD40L在CD4+T細(xì)胞中表達(dá)(圖8A-8C×400)。
圖9A-9B用抗CD8(圖9A)和抗CD40L(圖9B)單克隆抗體染色的TCAD中的內(nèi)皮炎病灶。圖9A與對(duì)內(nèi)皮炎為特征性的TCAD中的腔內(nèi)皮細(xì)胞相連的CD8+T細(xì)胞。大多數(shù)CD8+T細(xì)胞存在于內(nèi)皮炎的病灶中，而它們很少出現(xiàn)在遠(yuǎn)離內(nèi)皮表面的內(nèi)膜淋巴聚集物中。圖9B內(nèi)皮炎病灶中的炎癥細(xì)胞為CD40L+。類(lèi)似地，在內(nèi)皮細(xì)胞中未檢測(cè)到CD40L的表達(dá)(圖9A-9B×400)。
圖10A-10B圖10A用抗CD40單克隆抗體(褐色)和作為巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的抗CD68單克隆抗體(紅色)對(duì)天然CA的內(nèi)膜損傷的雙免疫標(biāo)記。細(xì)胞的中心群(箭頭)顯示出強(qiáng)的對(duì)CD40和CD68的染色。圖10B用抗CD40單克隆抗體(褐色)和抗平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(紅色)對(duì)TCAD的雙免疫標(biāo)記證實(shí)了CD40+平滑肌細(xì)胞(箭頭)。CD40反應(yīng)性局限于內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞(箭頭)，而內(nèi)側(cè)的肌原細(xì)胞為CD40-。(圖10A-B×400)。
圖11A-11D天然CA的系列區(qū)說(shuō)明了內(nèi)膜新血管形成，并被用抗CD34(圖11A)，抗CD40(圖11B)，抗ICAM-1(圖11C)和抗VCAM-1(圖11D)單克隆抗體染色。圖11A用CD34染色突出的內(nèi)膜新血管的內(nèi)皮細(xì)胞。圖11B內(nèi)膜新血管內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)CD40。相鄰的炎癥細(xì)胞也可標(biāo)記CD40。圖11C,11D新血管形成的病灶也顯示強(qiáng)烈的對(duì)ICAM-1(圖11C)和VCAM-1(圖11D)的內(nèi)皮反應(yīng)性(圖11A-11D×400)。
圖12A-12C在用抗CD40單克隆抗體(褐色)和粘著分子(紅色)抗ICAM-1單克隆抗體(圖12A)，抗VCAM-1單克隆抗體(圖12B)和無(wú)關(guān)對(duì)照單克隆抗體(圖12C)對(duì)天然CA的活化刺激的內(nèi)膜損傷的雙免疫標(biāo)記。圖12A事實(shí)上所有的CD40+(褐色)細(xì)胞，主要是巨噬細(xì)胞(長(zhǎng)箭頭)，和內(nèi)膜肌原細(xì)胞(短箭頭)對(duì)ICAM-1(紅色)強(qiáng)烈反應(yīng)。圖12B許多CD40+(褐色)炎癥細(xì)胞和內(nèi)膜肌原細(xì)胞(箭頭)也對(duì)VCAM-1(紅色)反應(yīng)。圖12C對(duì)代替抗ICAM-1和抗VCAM-1單克隆抗體(紅色)的CD40(褐色)和無(wú)關(guān)同型配對(duì)對(duì)照抗體雙標(biāo)記的相同的內(nèi)膜損傷。僅分辨出了褐色染色而沒(méi)有紅色染色，表明不存在順序應(yīng)用抗CD40和抗ICAM或抗VCAM單克隆抗體的檢測(cè)技術(shù)的干擾(參見(jiàn)材料和方法)。(圖12A-C×400)。
圖13用抗p65單克隆抗體標(biāo)記活化的NF-kB(褐色)和CD40(紅色)對(duì)天然CA的內(nèi)膜損傷的雙免疫標(biāo)記。在CD40+細(xì)胞的核中僅僅分辨出活化的NF-kB(箭頭)，其中大多數(shù)為巨噬細(xì)胞(×400)。
本發(fā)明提供一種抑制細(xì)胞表面具有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD40配體活化的方法，包括將細(xì)胞與能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的物質(zhì)接觸，其中該物質(zhì)以有效抑制該細(xì)胞活化的量存在。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)能抑制CD40配體與CD40之間的任何相互作用?！癈D40配體與細(xì)胞表面的CD之間的相互作用”指CD40-CD40配體一個(gè)或多個(gè)功能或結(jié)構(gòu)方面的相互作用。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抑制相互作用的物質(zhì)可競(jìng)爭(zhēng)性地與CD40配體結(jié)合以此方式來(lái)阻斷或減少CD40配體與細(xì)胞CD40的結(jié)合。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抑制相互作用的物質(zhì)可以不抑制CD40配體與細(xì)胞CD40結(jié)合的方式與CD40或CD40配體結(jié)合，但它影響對(duì)CD40連接的細(xì)胞應(yīng)答，例如通過(guò)改變細(xì)胞CD40或CD40-物質(zhì)復(fù)合物的轉(zhuǎn)化率，或通過(guò)改變CD40與CD40配體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，或通過(guò)改變?cè)趯?duì)CD40連接的應(yīng)答中細(xì)胞活化的比例或程度。
在具體的實(shí)施方案中，具有CD40的平滑肌細(xì)胞為膀胱平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、支氣管平滑肌細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、肺平滑肌細(xì)胞或胃腸道平滑肌細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，胃腸道平滑肌細(xì)胞為食管、胃或腸道平滑肌細(xì)胞，包括小腸或大腸(腸)平滑肌細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40的結(jié)合。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)為非蛋白質(zhì)。如本文所采用的，術(shù)語(yǔ)非蛋白質(zhì)包括任何或所有包含除簡(jiǎn)單或共軛多肽鏈外的部分的化合物或物質(zhì)。這包括例如具有非肽鍵的氨基酸的成分；非蛋白氨基酸，如β、γ或δ氨基酸、D構(gòu)型氨基酸或其他非蛋白氨基酸，包括高半胱氨酸、高絲氨酸、瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸、γ-氨基丁酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸或β-氰基丙氨酸；單糖、多糖或碳水化合物部分；脂肪酸或脂質(zhì)部分；核苷酸部分、無(wú)機(jī)物部分；或其他非蛋白分子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該物質(zhì)為肽模擬化合物。肽模擬化合物可至少部分為非天然的。肽模擬化合物可為小分子模擬物。由于為模擬物，該化合物可具有提高的穩(wěn)定性、功效、效價(jià)和生物利用度。而且，該化合物可具有降低的毒性。肽模擬化合物可具有改善的腸粘膜通透性?？珊铣芍苽湓摶衔铩１景l(fā)明的化合物可包括L-,D-或非天然氨基酸，α、α-雙取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸(丙氨酸的等電類(lèi)似物)。該化合物的肽骨架可具有至少一個(gè)被PSI-[CH=CH]替代的鍵(Kempf等(1991)國(guó)際肽和蛋白質(zhì)研究雜志38,237-241)。該化合物可進(jìn)一步包括三氟酪氨酸、對(duì)氯苯丙氨酸、對(duì)溴苯丙氨酸、多-L-炔丙基甘氨酸、多-D,L-烯丙基甘氨酸或多-L-烯丙基甘氨酸。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，具有抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD相互作用的生物活性的肽模擬化合物可具有一個(gè)鍵，肽骨架或被適宜模擬物替代的氨基酸部分。可為適宜氨基酸模擬物的非天然氨基酸的實(shí)例包括β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸、L-γ氨基丁酸、L-α氨基異丁酸、L-ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、半胱氨酸(乙酰氨基甲基)、N-∈-Boc-N-α-CBZ-L-賴氨酸、N-∈-Boc-N-α-Fmoc-L-賴氨酸、L-甲硫氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正頡氨酸、N-α-Boc-N-δCBZ-L-鳥(niǎo)氨酸、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-鳥(niǎo)氨酸、Boc-對(duì)硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羥基脯氨酸、Boc-L-硫代脯氨酸(Blondelle,S.E.等(1994)抗微生物劑和化學(xué)療法38,2280-2286；Pinilla,C.等(1995)肽科學(xué)37,221-240)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包括能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的的抗體或其一部分?？贵w為單克隆或多克隆抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，單克隆抗體特異性地與單克隆抗體5c8(ATCC登記號(hào)為HB10916)特異性與其結(jié)合的表位結(jié)合。該單克隆抗體的一個(gè)實(shí)例為單克隆抗體5c8(ATCC登記號(hào)為HB10916)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體特異性地與CD40結(jié)合?？笴D40抗體的一個(gè)實(shí)例為單克隆小鼠抗人CD40，其可從Genzyme CustourerService(product 80-3702-01,Cambridge,MA)獲得。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，單克隆抗體為嵌合抗體，靈長(zhǎng)類(lèi)源化抗體，人源化抗體或包含來(lái)自第一個(gè)人的CDR區(qū)的抗體和來(lái)自第二個(gè)人的支架的抗體。
“嵌合”，“靈長(zhǎng)類(lèi)源化”和“人源化”抗體的含義以及制備它們的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講是熟知的。參見(jiàn)例如1990年7月26公開(kāi)的PCT國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O 90/07861(Queen等)；和Queen等Proc.Natl Acad.Sci.USA(1989)86:10029。制備靈長(zhǎng)類(lèi)源化抗體的方法公開(kāi)在例如對(duì)應(yīng)于國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US92/06194的PCT國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO/02108(Idec藥物)；和Newman等，生物技術(shù)(1992)10:1455-1460中，它們被引入本申請(qǐng)以作參考。
通常，人源化抗體為包含一個(gè)或多個(gè)功能性地與人框架部分相連的非人抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)的抗體?？扇芜x存在其他與非人抗體相關(guān)的其它部分。通常，至少一個(gè)重鏈或一個(gè)輕鏈包含非人CDRs。通常，非人互補(bǔ)性決定區(qū)為小鼠互補(bǔ)性決定區(qū)。一般來(lái)講，靈長(zhǎng)類(lèi)源化抗體為包含一個(gè)或多個(gè)功能性地與非人靈長(zhǎng)類(lèi)的框架區(qū)部分連接的除非人靈長(zhǎng)類(lèi)外的種類(lèi)的抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)的抗體?？扇芜x存在與其中CDR從中產(chǎn)生的種類(lèi)相關(guān)的其它部分。通常，至少一個(gè)重鏈或一個(gè)輕鏈包含不是非人靈長(zhǎng)類(lèi)種類(lèi)的互補(bǔ)性決定區(qū)。典型地，互補(bǔ)性決定區(qū)為人互補(bǔ)性決定區(qū)。一般，嵌合抗體為其輕鏈和/或重鏈含來(lái)自不同種類(lèi)的區(qū)域的抗體。例如，一個(gè)種類(lèi)的一個(gè)或多個(gè)可變(V)區(qū)部分可與另一個(gè)種類(lèi)的一個(gè)或多個(gè)恒定(C)區(qū)部分相連。雖然可采用其他的哺乳動(dòng)物種類(lèi)，但通常嵌合抗體包含與人恒定區(qū)部分相連的小鼠的可變區(qū)部分。
通過(guò)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體，其中根據(jù)用于專(zhuān)利程序目的的國(guó)際承認(rèn)的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的條款，該雜交瘤細(xì)胞于1991年11月14日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC),12301 ParklawnDrive Rockville，馬里蘭州20852，美國(guó)。該雜交瘤的ATCC登記號(hào)為10916。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抗體的某部分包含輕鏈或重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)或可變區(qū)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體的該部分含互補(bǔ)決定區(qū)或可變區(qū)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體的該部分包含F(xiàn)ab或單鏈抗體。單鏈抗體由在單蛋白鏈中通過(guò)蛋白間隔區(qū)相連的可變區(qū)組成。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該蛋白包含能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的CD40配體，其一部分或其變異體的可溶性細(xì)胞外區(qū)；或能抑制細(xì)胞中CD40配體與CD40相互作用的CD40，其一部分或其變異體的可溶性細(xì)胞外區(qū)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，CD40配體或CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)為單體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)為寡聚體。
變異體可在氨基酸序列上或以不涉及序列或兩種序列的方式不同于天然存在的CD40或CD40配體。當(dāng)天然存在的CD40或CD40配體中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被不同的天然氨基酸，氨基酸衍生物或非天然氨基酸置換時(shí)產(chǎn)生氨基酸序列的變異體。特別優(yōu)選的變異體包括天然存在的CD40或CD40配體，或天然存在的CD40或CD40配體的生物活性片段，其序列因一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代與野生型序列不同它們通常對(duì)蛋白質(zhì)或肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性具有最小的影響。變異體還可具有因一個(gè)或多個(gè)非保守氨基酸的取代，缺失或插入而不同的序列，其不影響CD40或CD40配體生物活性。保守取代通常包括用具有類(lèi)似特性的氨基酸取代另一個(gè)氨基酸，例如下面組中的取代纈氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷胺酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸和苯丙氨酸，酪氨酸。非極性氨基酸(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
可從表1中看到其他保守取代，且其它的見(jiàn)Dayhoff在蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜中(1988)描述。
表1保守氨基酸取代
本發(fā)明的其他變異體為具有增加肽穩(wěn)定性的修飾的那些。該變異體在肽序列中可包含，例如一個(gè)或多個(gè)非肽鍵(它代替肽鍵)。還包括包含非天然存在的L-氨基酸殘基的變異體，例如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，例如β或γ氨基酸和環(huán)狀變異體。用D-氨基酸代替L-氨基酸摻入到多肽中可增加其對(duì)蛋白酶的耐受。參見(jiàn)如美國(guó)專(zhuān)利5,219,990。
本發(fā)明肽也可通過(guò)各種保守或非保守的變化，如插入，缺失和取代來(lái)修飾，其中這些變化可在它們的應(yīng)用中提供一些優(yōu)點(diǎn)。
在其他具體實(shí)施方案中，具有保守性較少的氨基酸取代的變異體也可通過(guò)如電荷，構(gòu)型和其他生物特性的改變來(lái)產(chǎn)生所需的衍生物。這些取代包括如親水性殘基取代疏水性殘基，半胱氨酸或脯氨酸取代其他殘基，具有小側(cè)鏈的殘基取代具有大側(cè)鏈的殘基或帶凈正電的殘基取代帶凈負(fù)電的殘基。當(dāng)取代結(jié)果不能被肯定地預(yù)測(cè)時(shí)，根據(jù)本文公開(kāi)的方法可容易地分析該衍生物以確定所需特性的存在與否。
本發(fā)明范圍中的變異體包括具有與CD40的細(xì)胞外區(qū)或CD40配體的細(xì)胞外區(qū)具有至少80％同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)和肽。較優(yōu)選，序列同源性為至少90％，或至少95％。
正如可代替支架的組成一樣，也可取代功能性基團(tuán)，其中該功能性基團(tuán)可用類(lèi)似特征的基團(tuán)修飾支架。這些取代開(kāi)始是保守的，即該替代基團(tuán)將具有與原來(lái)基團(tuán)差不多的相同大小，形狀，疏水性和電荷。非序列修飾可包括例如對(duì)天然存在的CD40或CD40配體的某部分的體內(nèi)或體外化學(xué)修飾，以及乙?；谆?，磷酰化，羧化或糖基化修飾。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，包括CD40配體和CD40細(xì)胞外區(qū)的蛋白質(zhì)被化學(xué)修飾所修飾，其中活性被保留。例如，蛋白質(zhì)可被酰胺化，硫酸化，單或多鹵代，烷基化，羧化或磷酸化。蛋白質(zhì)也可被如乙?；鼗糠?，或飽和，單不飽和或多不飽和脂肪酸單和多?；Ｖ舅嵋部杀粏位蚨喾?。本發(fā)明還包括蛋白質(zhì)的甲硫氨酸類(lèi)似物，例如甲硫氨酸砜和甲硫氨酸亞砜類(lèi)似物。本發(fā)明還包括蛋白質(zhì)的鹽，如銨鹽，包括烷基或芳基銨鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、硫代硫酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、苯甲酸鹽、磺酸鹽、硫代磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽和苯磺酸鹽。
可溶性單體CD40-L蛋白可包括CD40-L細(xì)胞外區(qū)的全部或一部分。CD40-L的細(xì)胞外區(qū)包含與CD40結(jié)合的區(qū)域。因此，可溶性的CD40-L可抑制CD40L與含有CD40的細(xì)胞的相互作用。本發(fā)明預(yù)測(cè)sCD40-L可構(gòu)成含與CD40結(jié)合的區(qū)域的CD40-L或片段或衍生物的完整細(xì)胞外區(qū)。
可溶性CD40蛋白(sCD40)包含CD40的細(xì)胞外區(qū)。sCD40抑制CD40L與含有CD40細(xì)胞的相互作用。sCD40可為單體或寡聚體形式。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，包含CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分的蛋白進(jìn)一步包含與CD40的細(xì)胞外區(qū)或其一部分融合的Fc區(qū)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)能與蛋白A或蛋白G結(jié)合。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。
可使用常規(guī)的酶方法，通過(guò)切斷和連接來(lái)自所需序列的片段來(lái)制備可溶性CD40/Fc融合蛋白。融合蛋白適宜的Fc區(qū)為可與蛋白A或蛋白G結(jié)合，或能被可用于純化或檢測(cè)包含F(xiàn)c區(qū)的融合蛋白中的抗體識(shí)別的Fc區(qū)。例如，F(xiàn)c區(qū)可包括人IgG1或鼠IgG1的Fc區(qū)。本發(fā)明還提供編碼CD40/Fc融合蛋白的核酸分子。
已熟知通過(guò)重組方法產(chǎn)生可溶形式的膜分子的方法，其中缺失編碼跨膜和胞質(zhì)區(qū)的序列。通常參見(jiàn)Hammonds等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,057,417。此外，已熟知制備sCD40和CD40/Fc融合蛋白的方法。參見(jiàn)如PCT國(guó)際申請(qǐng)No.WO93/08207；Fanslow等“可溶形式的CD40抑制人B細(xì)胞的生物應(yīng)答”，免疫學(xué)雜志，149卷，pp655-60(1922年7月)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)通過(guò)篩選方法來(lái)選擇。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)用篩選方法選擇，它包括分離細(xì)胞樣品；在允許含有CD40的細(xì)胞活化的條件下培養(yǎng)樣品；將樣品與有效活化含有CD40細(xì)胞的表達(dá)被由具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白，或與有效活化含有CD40細(xì)胞被具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白接觸；如果物質(zhì)能抑制含有CD40細(xì)胞活化，則將樣品與有效量的抑制含有CD40細(xì)胞活化的物質(zhì)接觸；并測(cè)定在存在該物質(zhì)時(shí)，表達(dá)被由具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別蛋白的細(xì)胞，或被具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白是否活化含有CD40細(xì)胞。細(xì)胞樣品可從不同組織中分離，包括培養(yǎng)物中的細(xì)胞系或從動(dòng)物中分離的細(xì)胞，如來(lái)自固體組織的分散細(xì)胞、來(lái)自骨髓活體的細(xì)胞，或從如血液或淋巴液的體液中分離的細(xì)胞。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的CD40配體的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分的三維結(jié)構(gòu)來(lái)選擇物質(zhì)(分子)。該物質(zhì)可從已知物質(zhì)庫(kù)中選擇，或根據(jù)三維結(jié)構(gòu)從已知物質(zhì)修飾而來(lái)，或根據(jù)三維結(jié)構(gòu)從頭設(shè)計(jì)或合成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)CD40配體的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分與先導(dǎo)抑制劑的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)先導(dǎo)抑制劑的結(jié)構(gòu)最優(yōu)化設(shè)計(jì)該物質(zhì)(分子)。先導(dǎo)抑制劑為已被鑒定的分子，其中當(dāng)與CD40配體接觸時(shí)，它與CD40配體，CD40或其一部分的可溶性細(xì)胞外區(qū)結(jié)合或復(fù)合，從而降低復(fù)合或結(jié)合的CD40配體或CD40配體的一部分活化含有CD40細(xì)胞的能力。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，先導(dǎo)抑制劑可通過(guò)與CD40配體或CD40的細(xì)胞外區(qū)，或在三級(jí)復(fù)合物中與CD40配體和CD40的一部分相互作用，從中降低復(fù)合的CD40配體-CD40活化含有CD40細(xì)胞的能力。在本發(fā)明的方法中，CD40配體可為可溶性的或與細(xì)胞結(jié)合，如活化的T細(xì)胞，并可為足夠長(zhǎng)度的天然CD40配體或其一部分?？梢圆煌绞綔y(cè)定降低的活化含有CD40細(xì)胞的能力。一種可測(cè)定它的方法為通過(guò)與在類(lèi)似條件下，不存在抑制劑時(shí)，用相似量的CD40配體處理細(xì)胞比較，顯示在存在抑制劑時(shí)，CD40配體產(chǎn)生的含有CD40細(xì)胞的活化程度降低。活化含有CD40細(xì)胞的能力降低也可通過(guò)與未結(jié)合的CD40配體比較，在類(lèi)似條件下產(chǎn)生類(lèi)似程度的含有CD40細(xì)胞的活化所需的更高濃度的抑制劑-CD40配體復(fù)合物來(lái)說(shuō)明。極端地，在允許通過(guò)未結(jié)合的CD40配體或其指定部分活化這些細(xì)胞的濃度和條件下，與抑制劑接觸的CD40配體可能不能活化含有CD40的細(xì)胞。
可通過(guò)計(jì)算機(jī)篩選法，使用包含殘基Gly116-Leu261的人CD40L(sCD40L(116-261))的細(xì)胞外區(qū)的可溶性片段晶體結(jié)構(gòu)來(lái)選擇物質(zhì)(分子)。
已通過(guò)分子置換法，以2A的分辨率確定了篩選法中使用的晶體結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，首先制備可溶性形式的包含氨基酸殘基Gly116至C末端殘基Leu 261的人CD40配體的細(xì)胞外區(qū)的可溶性片段，接著純化和結(jié)晶。晶體被用來(lái)收集衍射數(shù)據(jù)。用XPLOR程序包和QUANTA(分子模擬公司)軟件進(jìn)行分子置換和精制。尤其是，使用鼠CD40L模型，用QUANTA蛋白質(zhì)同源性模型軟件構(gòu)建人sCD40L的三維模型。該模型被用作用于晶體學(xué)分析計(jì)算的探針并使用XPLOR精制。確定sCD40L的晶體結(jié)構(gòu)的方法更詳細(xì)地描述在Karpusas等“人CD40配體的細(xì)胞外區(qū)的2晶體結(jié)構(gòu)”，結(jié)構(gòu)(1995,10)3(10):1031-1039。sCD40L(116-261)的原子坐標(biāo)提供在圖2A-Y中。用于選擇物質(zhì)的篩選方法包括如下所述的計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)和迭代結(jié)構(gòu)最優(yōu)化。
物質(zhì)可為使用計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)選擇的抑制劑。使用該方法，sCD40L的晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)被用作如DOCK的計(jì)算機(jī)程序的輸入數(shù)據(jù)，它輸出一系列預(yù)期與CD40L結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)。該計(jì)算機(jī)程序的使用已為熟知。參見(jiàn)如Kuntz“基于結(jié)構(gòu)的用于藥物設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)的策略”，科學(xué)，257卷，p1078(1992)。接著可通過(guò)對(duì)CD40L結(jié)合的生化分析篩選分子結(jié)構(gòu)表?？墒褂檬熘母?jìng)爭(zhēng)類(lèi)型的生化分析。參見(jiàn)如Baiorath等“對(duì)于受體-配體相互作用至關(guān)重要的CD40和其配體的殘基的鑒定”生物化學(xué)，34,p1833(1995)。因此，被發(fā)現(xiàn)與CD40L結(jié)合的結(jié)構(gòu)可用作本發(fā)明的物質(zhì)。由結(jié)構(gòu)最優(yōu)化的相互作用循環(huán)所證實(shí)，該物質(zhì)也可為被修飾或設(shè)計(jì)的分子。使用該方法，使用上述計(jì)算機(jī)程序和其他方法找到的CD40L的小分子抑制劑可與sCD40L一起共結(jié)晶，且該復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可通過(guò)分子置換解決。通過(guò)分子置換揭示的信息可通過(guò)探明分子如何與CD40L相互作用而被用來(lái)最優(yōu)化抑制劑的結(jié)構(gòu)。該分子可被修飾以改善其理化性質(zhì)，包括對(duì)CD40L的特異性和親和性。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，物質(zhì)為小分子。如本文所采用的，小分子為具有20Da-1×106Da，優(yōu)選50Da-2KDa分子量的化合物。
本發(fā)明還提供一種在宿主中，抑制細(xì)胞表面具有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD40配體活化的方法，包括對(duì)宿主施用能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40的相互作用的物質(zhì)，其中該物質(zhì)以有效抑制宿主中細(xì)胞活化的量存在。
在具體的實(shí)施方案中，含有CD40的平滑肌細(xì)胞為膀胱平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、支氣管平滑肌細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、肺平滑肌細(xì)胞或胃腸道平滑肌細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，胃腸道平滑肌細(xì)胞為食管、胃或腸道平滑肌細(xì)胞，包括小腸或大腸(腸)平滑肌細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)抑制CD40配體與細(xì)胞上CD40的結(jié)合。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)為蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該物質(zhì)為非蛋白質(zhì)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包括能抑制CD40配體與細(xì)胞上面的CD40相互作用的抗體或其一部分?？贵w為單克隆抗體或多克隆抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，單克隆抗體特異性地與單克隆抗體5c8(ATCC登記號(hào)為HB10916)特異性與表位結(jié)合的表位結(jié)合。該單克隆抗體的一個(gè)實(shí)例為單克隆抗體5c8(ATCC登記號(hào)為HB10916)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，單克隆抗體為嵌合抗體或人源化抗體。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抗體的一部分包含輕鏈或重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)或可變區(qū)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體的該部分包括互補(bǔ)決定區(qū)或可變區(qū)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體的該部分包含F(xiàn)抗體或單鏈抗體。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含能抑制CD40配體與細(xì)胞上CD40相互作用的CD40配體可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分；或能抑制CD40配體與細(xì)胞上CD40相互作用的CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，CD40配體或CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)為單體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)為寡聚體。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，包含CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分的蛋白進(jìn)一步包含與CD40細(xì)胞外區(qū)或其一部分融合的Fc區(qū)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)能與蛋白A或蛋白G的結(jié)合。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。
當(dāng)給藥時(shí)，蛋白質(zhì)通常迅速地被從循環(huán)中清除，從而產(chǎn)生相對(duì)短壽命的藥物學(xué)活性。結(jié)果，需要經(jīng)常注射相對(duì)大劑量的生物活性蛋白以維持治療功效。通過(guò)與如聚乙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸的水溶性聚合物的共價(jià)連接而修飾的蛋白已知在靜脈注射后從實(shí)質(zhì)上顯示比相應(yīng)的未修飾的蛋白更長(zhǎng)的血液半衰期(抗體uchowski等，在“作為藥物的酶”，Holcenberg等編Wiley-Interscience，紐約，NY,367-383(1981；Anderson,W.F.(1992)人基因治療科學(xué)256:808-813；Newmark等(1982)應(yīng)用生物化學(xué)雜志4:185-189；和Katre等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:1487-1491(1987))。這些修飾還可增加蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解性，消除聚集，增加蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性以及大大降低蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性。結(jié)果，通過(guò)比未修飾蛋白更少次或更低劑量地給藥該聚合物-蛋白質(zhì)加合物可獲得所需的體內(nèi)生物學(xué)活性。
由于PEG在哺乳動(dòng)物中具有非常低的毒性，所以將聚乙二醇與蛋白質(zhì)相連尤其有用(Carpenter等1971)。例如，在美國(guó)，腺苷脫氨酶的PEG加合物已被批準(zhǔn)用于人類(lèi)治療嚴(yán)重的混合型的免疫缺乏綜合癥。PEG結(jié)合物提供的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是有效降低異源蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性。例如，人蛋白質(zhì)的PEG加合物可用于治療其他哺乳動(dòng)物種類(lèi)的疾病而不具有引發(fā)嚴(yán)重免疫應(yīng)答的危險(xiǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以微囊化手段遞送蛋白質(zhì)以降低或防止抗蛋白質(zhì)的宿主免疫應(yīng)答。還可以微膠囊化在膜中的形式遞送蛋白質(zhì)，如脂質(zhì)體的形式。
可方便地將聚合物如PEG與蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)活性氨基酸殘基相連，如氨基末端氨基酸的α-氨基、賴氨基側(cè)鏈的ε-氨基、半胱氨酸側(cè)鏈的巰基、天冬氨酰和谷氨酰側(cè)鏈的羧基、C末端氨基酸的α-羧基、酪氨基側(cè)鏈，或與跟一些天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基相連的糖基鏈的活化衍生物連接。
已描述了許多適宜于與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)的PEG活化形式?？捎糜谂c蛋白質(zhì)氨基基團(tuán)反應(yīng)的PEG試劑包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，尤其是其中離去基團(tuán)為N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)硝基苯酚、咪唑或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸鹽的那些。含有馬來(lái)酰亞胺基或鹵代乙?；鶊F(tuán)的PEG衍生物為可用于無(wú)巰基基團(tuán)蛋白質(zhì)修飾的試劑。同樣，含有氨基肼或酰肼基團(tuán)的PEG試劑可用于與由蛋白質(zhì)糖類(lèi)基團(tuán)的高碘酸氧化產(chǎn)生的醛反應(yīng)。
可用上述方法治療的宿主為動(dòng)物。優(yōu)選該動(dòng)物為哺乳動(dòng)物?？杀恢委煹牟溉閯?dòng)物的實(shí)例包括，但不局限于人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙齒類(lèi)(包括大鼠、小鼠、蒼鼠和豚鼠)，牛、馬、羊、豬、狗和貓。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，用篩選法選擇物質(zhì)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用篩選法選擇該物質(zhì)，它包括分離細(xì)胞樣品；在允許含有CD40的細(xì)胞活化的條件下培養(yǎng)樣品；將樣品與有效活化含有CD40細(xì)胞的表達(dá)被具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白的細(xì)胞，或與有效活化含CD40細(xì)胞的且被具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白接觸；如果物質(zhì)能抑制含有CD40細(xì)胞活化，則將樣品與有效量的抑制含有CD40細(xì)胞活化的物質(zhì)接觸；并測(cè)定在存在該物質(zhì)時(shí)，表達(dá)被具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白的細(xì)胞，或被具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白是否活化含有CD40細(xì)胞。細(xì)胞樣品可從不同組織中分離，包括培養(yǎng)物中的細(xì)胞系或從動(dòng)物中分離的細(xì)胞，如來(lái)自固體組織的分散細(xì)胞、來(lái)自骨髓活體的細(xì)胞，或從如血液或淋巴液的體液中分離的細(xì)胞。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的CD40配體的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分的三維結(jié)構(gòu)來(lái)選擇物質(zhì)(分子)。該分子可從已知分子庫(kù)中選擇，或根據(jù)三維結(jié)構(gòu)從已知分子修飾而來(lái)，或根據(jù)三維結(jié)構(gòu)從頭設(shè)計(jì)或合成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)CD40配體的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分與先導(dǎo)抑制劑的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)先導(dǎo)抑制劑的結(jié)構(gòu)最優(yōu)化設(shè)計(jì)該物質(zhì)(分子)。治療方法本發(fā)明提供一種包括上述抑制在細(xì)胞表面含有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD40配體活化的方法的治療宿主平滑肌細(xì)胞依賴疾病的方法，包括給予宿主能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的物質(zhì)，其中該物質(zhì)以有效抑制宿主細(xì)胞活化的量存在。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞依賴疾病為血管病。在一個(gè)特定的具體實(shí)施方案中，血管病為動(dòng)物粥樣硬化。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞依賴疾病為胃腸道疾病。在一個(gè)特定的具體實(shí)施方案中，胃腸道疾病選自食管異常游動(dòng)性、炎癥性腸道疾病和硬皮病。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞依賴疾病為膀胱疾病。
可用醫(yī)學(xué)上可接受的任何方式給藥予本發(fā)明化合物。這包括注射，胃腸外途徑，如靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、硬膜內(nèi)或其他方式以及口、鼻、眼、直腸、局部或吸入。持續(xù)釋放給藥也特定地包括在本發(fā)明中，將這些方式作為外科手術(shù)中直接運(yùn)用的對(duì)易受侵蝕的移植物的給藥注射。
以醫(yī)學(xué)上可接受的任何劑量/體重和任何劑量頻率給予化合物。可接受的劑量包括約0.01-200mg/Kg宿主體重的范圍。優(yōu)選的劑量范圍為約0.1-50mg/Kg之間。尤其優(yōu)選的是約1-30mg/Kg之間的劑量。以每天至個(gè)月的間隔重復(fù)該劑量。一個(gè)優(yōu)選的給藥方案是在治療的開(kāi)始3天每天給予本發(fā)明化合物，此后每3周給予化合物，其中每次為靜脈給藥5或10mg/Kg。另一個(gè)優(yōu)選的方案為治療的開(kāi)始3天每天靜脈內(nèi)給藥5mg/Kg本發(fā)明化合物，此后每周以10mg/宿主經(jīng)皮下或肌肉內(nèi)給藥化合物。另一個(gè)優(yōu)選的方案為以20mg/Kg體重經(jīng)胃腸外給予單劑的本發(fā)明的化合物，接著每周以10mg/宿主經(jīng)皮下或肌肉內(nèi)給予化合物。
可以單劑的形式給藥本發(fā)明的化合物以用于某些適應(yīng)癥，如防止宿主短時(shí)間暴露于抗原產(chǎn)生的抗原的免疫應(yīng)答，如在治療的某一天給予的外源抗原。該抗原的實(shí)例包括同時(shí)給予本發(fā)明化合物和基因治療載體或治療劑，如抗原藥物或血液產(chǎn)品。在抗原緩慢出現(xiàn)的適應(yīng)癥中，如在控制對(duì)移植組織或緩慢給藥的抗原藥物的免疫反應(yīng)中，以一定的間隔，在如醫(yī)學(xué)上指示的從數(shù)天，數(shù)星期至宿主終身的時(shí)間內(nèi)給予本發(fā)明化合物。
由于伴隨有水腫的毛細(xì)血管擴(kuò)張和吞噬白細(xì)胞的遷移的結(jié)果，炎癥反應(yīng)的特征表現(xiàn)為發(fā)紅、腫脹、發(fā)熱和疼痛。炎癥進(jìn)一步由Gallin定義(第26章，基礎(chǔ)免疫學(xué)，第二版，Raven出版，紐約，1989,pp721-733)，其被本文引作參考。
從下面的實(shí)驗(yàn)詳述中將更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解如后面權(quán)利要求中更全面描述的，所討論的具體的方法和結(jié)果僅僅只是說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)詳述下面的實(shí)施例1和2證實(shí)炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表達(dá)CD40。而且，它們表明CD40介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的功能。實(shí)施例1FACS被用來(lái)研究是否平滑肌細(xì)胞表達(dá)CD40。在6孔平板中，將人主動(dòng)脈平滑肌培養(yǎng)在補(bǔ)充有25％FCS,5％人血清，肝素90ug/ml，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子15ug/ml和1％青霉素-鏈霉素的M199培養(yǎng)基中。每2-3天更換培養(yǎng)基，并且當(dāng)細(xì)胞接近鋪滿時(shí)，在存在或不存在IFN-γ(1000U/cc),IL-1α(1ng/cc)或TNF-α(200U/cc)下，將它們培養(yǎng)72小時(shí)。用胰蛋白酶-EDTA處理收集細(xì)胞，并使用抗CD40單克隆抗體G28.5，通過(guò)FACS分析測(cè)定CD40的表達(dá)。還用同型陰性對(duì)照單克隆抗體將細(xì)胞染色，并使用抗-CD54(ICAM-1)單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。
如圖1A所證實(shí)，平滑肌細(xì)胞不組成性地表達(dá)CD40。然而，與IL-1α或TNF-α相反，IFN-γ正調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的CD40的表達(dá)(圖1A,1B和1C)。這些研究證明IFN-γ正調(diào)節(jié)人主動(dòng)脈平滑肌中的CD40的表達(dá)。實(shí)施例2就地測(cè)定平滑肌細(xì)胞的CD40的表達(dá)。在正常血管的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的形態(tài)學(xué)上與平滑肌細(xì)胞相似的細(xì)胞不與抗CD40單克隆抗體反應(yīng)。然而，在與移植相關(guān)的加速動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥損傷中發(fā)現(xiàn)的在形態(tài)學(xué)上與平滑肌細(xì)胞相似的細(xì)胞原位表達(dá)CD40。這些研究表明炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表達(dá)CD40。而且，這些研究證實(shí)CD40L介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的功能。實(shí)施例3CD40L+CD40+T細(xì)胞和CD40+靶細(xì)胞出現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化和移植冠狀動(dòng)脈疾病中活化的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)，巨噬細(xì)胞(Mac)和CD4+T細(xì)胞早期出現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(CA)和心移植動(dòng)脈粥樣硬化(TA)的損傷中。由于CD40L為一種將接觸依賴活化信號(hào)遞送到CD40+靶細(xì)胞的活化誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞表面因子，因此我們研究了在CA(n=5)和TA(n=5)中的原位CD40L和CD40表達(dá)，其中CD40+靶細(xì)胞包括EC(正調(diào)節(jié)ICAM、VCAM和E-選擇表達(dá))和Mac(誘導(dǎo)NO,TNF-α和IL-1的產(chǎn)生)。使用抗CD40L單克隆抗體5C8，抗CD40單克隆抗體G28.5或適宜的對(duì)照單克隆抗體測(cè)定CD40L和CD40的表達(dá)。正常冠狀動(dòng)脈的冷凍切片(n=3)不含有T細(xì)胞，CD40的表達(dá)局限于EC。相反，如通過(guò)對(duì)連續(xù)切片的免疫標(biāo)記所證實(shí)的，與CA和TA相關(guān)的損傷含有CD40L+CD4+T細(xì)胞。另外，來(lái)自患有CA和TA的病人的冰凍切片中，CD40的表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、侵染單核細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞(SMC)中明顯被正調(diào)節(jié)。使用SMC(平滑肌肌動(dòng)蛋白)或Mac(HAM-56)特異性標(biāo)記物對(duì)石蠟固定組織的二色免疫組織化學(xué)分析證實(shí)了這些細(xì)胞中的CD40表達(dá)。令人感興趣的是，遠(yuǎn)離炎癥細(xì)胞的內(nèi)膜SMC和中膜SMC為CD40+，表明在體內(nèi)局部炎癥介導(dǎo)物正調(diào)節(jié)SMC中CD40的表達(dá)。在TA的所有階段發(fā)現(xiàn)CD40正調(diào)節(jié)和CD40L+CD4+T細(xì)胞，并在CA的早期損傷包括脂肪條斑中最顯著?？傊?，這些研究表明CD40L+T細(xì)胞可與CA和TA中的CD40+靶細(xì)胞相互作用，并通過(guò)促進(jìn)炎癥原分子的產(chǎn)生導(dǎo)致這些疾病的發(fā)病。實(shí)施例4:CD40在移植動(dòng)脈粥樣硬化損傷中的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)用二色免疫組織化學(xué)分析研究在自然動(dòng)脈粥樣硬化或與移植相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化中的CD40的原位表達(dá)。對(duì)被固定在10％福爾馬林緩沖液并被用石蠟包埋的冠狀動(dòng)脈中進(jìn)行雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)分析。將切片在二甲苯中脫蠟，水合，并用1/5％H2O2的80％乙醇溶液淬滅內(nèi)源過(guò)氧化物酶。接著在37℃下，將切片用0.01％胃蛋白酶的鹽酸溶液(pH1.5)消化15分鐘。然后，將切片用PBS漂洗，與10％馬血清一起保溫20分鐘以阻止非特異性染色。利用Vector ABC Elite盒(Vector)，依次使用生物素標(biāo)記的第二抗體、親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物和3,3’二氨基聯(lián)苯作為顯影劑檢測(cè)抗CD40染色。觀察到CD40的存在為褐色染色。此后，將切片用PBS漂洗，再用10％馬血清阻斷。將切片與對(duì)平滑肌細(xì)胞(平滑肌肌動(dòng)蛋白)或巨噬細(xì)胞(HAM 56)特異性的單克隆抗體一起保溫1小時(shí)。使用親和素-生物素體系(Vector)將一抗與堿性磷酸酶共軛。Vector Red(Vector)被用來(lái)檢測(cè)堿性磷酸酶活性和產(chǎn)生紅色反應(yīng)的染色。因此，雙標(biāo)記細(xì)胞被染成褐色(CD40)和紅色(平滑肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)。為了控制用于雙重標(biāo)記分析的兩種免疫組織化學(xué)方法之間的干擾，還對(duì)各樣品的連續(xù)切片的CD40、平滑肌肌動(dòng)蛋白或HAM56進(jìn)行染色。參見(jiàn)圖3A和3B。對(duì)照切片顯示出相同的每個(gè)第一單克隆抗體與雙染色切片相的免疫活性分布。實(shí)施例5在自發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和與移植相關(guān)的冠狀動(dòng)脈疾病中的CD40L和CD40的分布CD40的表達(dá)與細(xì)胞間粘附分子，活化的NF-KB和T淋巴細(xì)胞之間的相互關(guān)系T細(xì)胞在自發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(CA)和與移植相關(guān)的冠狀動(dòng)脈疾病(TCAD)的發(fā)病中起作用，然而，對(duì)在這些損傷中T細(xì)胞與其他細(xì)胞相互作用機(jī)理了解不甚全面。CD40L是一種與包括巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的CD40+靶細(xì)胞相互作用的活化誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞表面分子，并誘導(dǎo)包括ICAM-1和VCAM-1的促炎癥分子的產(chǎn)生。而且，已知CD40的連接活化轉(zhuǎn)錄因子NF-KB。為了研究CD40L-CD40相互作用是否可能在CA或TCAD的發(fā)病中起作用，在從患有CA(n=10)或TCAD(n=9)的心臟異源移植受體獲得的冠狀動(dòng)脈的冷凍切片中進(jìn)行CD40L和CD40表達(dá)的免疫組織化學(xué)研究。使用兩種不同的抗CD40L單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)CD40L的表達(dá)局限在CA和TCAD的侵染淋巴細(xì)胞中。在兩種疾病中的內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中CD40的表達(dá)被顯著地正調(diào)節(jié)。雙重免疫標(biāo)記證明許多CD40+細(xì)胞共表達(dá)ICAM-1、VCAM-1或活性形式的NF-KB。CD40、ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的程度表明了與疾病的嚴(yán)重性和內(nèi)膜淋巴細(xì)胞量的統(tǒng)計(jì)顯著相關(guān)性。這些研究在一起證明了在CA和TCAD損傷中活化的CD40L+和CD40+細(xì)胞的存在，并表明CD40L介導(dǎo)與CD40+巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用可導(dǎo)致這些疾病的發(fā)病。
一些方面的證據(jù)說(shuō)明細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)理導(dǎo)致自發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(CA)(5-10)和與移植相關(guān)的冠狀動(dòng)脈疾病(TCAD)(11-13)特有的炎癥損傷(1-4)。例如，表達(dá)如CD25和MHCⅡ型分子的活化標(biāo)記的侵染內(nèi)膜T細(xì)胞早期出現(xiàn)在這兩種疾病的血管損傷進(jìn)展中(5,14)。通常在這兩種疾病的損傷中發(fā)現(xiàn)活化的巨噬細(xì)胞，它們?yōu)榕cT細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子，包括IFN-γ、IL-1和TNF-α(5-17)。由于進(jìn)一步的證據(jù)表明T細(xì)胞可在CA中起著致病作用，已從人纖維粥樣硬化CA斑點(diǎn)中分離了CD4+T細(xì)胞克隆，其中當(dāng)存在自發(fā)CA和TCAD損傷的主要組成的氧化的LDL(18)時(shí)，人纖維粥樣硬化的斑點(diǎn)增殖并分泌IFN-γ(1,19,20)。而且，在用抗CD4單克隆抗體的小鼠中高脂血誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化損傷減少(21)。類(lèi)似的，當(dāng)異源移植安排在T細(xì)胞遺傳缺失的小鼠品種中(13)或用抗CD413或抗IFN-γ單克隆抗體處理時(shí)(22),TCAD的血管損傷顯著改善。這些數(shù)據(jù)在一起有利地說(shuō)明T細(xì)胞和T細(xì)胞衍生效應(yīng)分子參與這些疾病的發(fā)病。
CD40L是一種在將接觸依賴信號(hào)遞送到如B細(xì)胞(25-29)的CD40+靶細(xì)胞的活化CD4+T細(xì)胞中表達(dá)的30-33kDa分子量的表面分子。CD40L介導(dǎo)的信號(hào)在體外和體內(nèi)T細(xì)胞依賴激素免疫應(yīng)答的過(guò)程中極其重要(30)。目前已知CD40L-CD40相互作用還在體外和體內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起作用(31,32)。令人感興趣的是，已知參與CA和TCAD的發(fā)病的細(xì)胞類(lèi)型的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)CD40(33-37)。而且，在體外，巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的CD40的連接誘導(dǎo)增強(qiáng)免疫應(yīng)答和/或促炎癥作用的分子產(chǎn)生。例如，在體外，CD40L-CD40相互作用正調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中MHCⅡ型和共同刺激分子CD86的表達(dá)(38)。而且，巨噬細(xì)胞中CD40的連接通過(guò)誘導(dǎo)NO合成2，促凝血?jiǎng)┑鞍捉M織因子和基質(zhì)金屬蛋白酶來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-12)、化學(xué)因子(IL-8、MIP-1α)、氧化氮(NO)的產(chǎn)生(33,34,39-42)。在內(nèi)皮細(xì)胞中，CD40L-CD40相互作用正調(diào)節(jié)胞間粘附分子CD54(ICAM-1)、CD106(VCAM-1)和CD62E(E-選擇蛋白)(35-37)。CD40連接的多種作用效果取決于轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活化(43-45)。
這些結(jié)果在一起表明這樣一種想法，即在體內(nèi)各種靶細(xì)胞中的CD40的連接可影響CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。支持這種假設(shè)的是，在患有狼瘡性腎小球腎炎、IgA腎病和ANCA+T細(xì)胞腎小球腎炎的病人的腎以及在患有牛皮癬的病人的皮膚中CD40的表達(dá)被正調(diào)節(jié)(35,46)。而且，CD40L+T細(xì)胞侵染患有炎癥性腎疾病的病人的腎(46)。由于T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和可能的其他細(xì)胞的相互作用在CA和TCAD的發(fā)病中起作用，因此，在本次研究中，使用免疫組織化學(xué)研究CD40L和CD40在這兩種疾病中的表達(dá)。CD40L在T細(xì)胞中表達(dá)，且CD40的表達(dá)在這兩種疾病的內(nèi)膜損傷中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和“泡沫”細(xì)胞中被正調(diào)節(jié)。而且，使用雙重免疫染色發(fā)現(xiàn)這些損傷中的許多CD40+細(xì)胞共表達(dá)CD54、CD106和活性形式的NF-kB。方法人冠狀動(dòng)脈從23個(gè)心臟異源移植受體的外植心臟獲得左主冠狀動(dòng)脈的節(jié)段或左前下動(dòng)脈的近端部分。由于他們已發(fā)展成嚴(yán)重的與移植相關(guān)的冠狀動(dòng)脈疾病(TCAD)，因此9位病人進(jìn)行重新移植。在這些病人中，第一次異源移植的存活期在38至103個(gè)月之間變化。因?yàn)樗麄円寻l(fā)展成嚴(yán)重的冠狀動(dòng)脈疾病和局部缺血性心肌病，所以10位病人接受了心臟異源移植。從4位病人的外植心臟獲得沒(méi)有動(dòng)脈粥樣硬化變化的對(duì)照冠狀動(dòng)脈；其中3位患有自發(fā)性心肌病，1位患有心臟肉瘤。-80℃下，將各血管段驟凍在異戊烷中，在恒冷切片機(jī)(Reichert Histostat)中以4mm的厚度進(jìn)行連續(xù)切片。將切片粘貼在唾液酸覆蓋的載玻片上，空氣干燥，在冷丙酮中固定1分鐘，在1∶1冷丙酮/氯仿混合物中再固定7分鐘，貯藏于-80℃下。將來(lái)自各冠狀動(dòng)脈的一個(gè)切片固定在10％福爾馬林中，用蘇木精和伊紅染色用于組織學(xué)評(píng)價(jià)。一抗抗CD40雜交瘤G28.5(IgG1)從美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(Rockville,MD)購(gòu)得。如前所述產(chǎn)生抗CD40L單克隆抗體5C8(IgG2a)。使用蛋白G柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)從腹水中純化G28.5和5C8單克隆抗體。另外的抗CD40L單克隆抗體(IgG1)購(gòu)自Calbiochem(SanDiego,CA)。IgM抗CD40單克隆抗體從Caltag(Burlingame,CA)獲得，并用于雙重免疫染色研究。CD3、CD4、CD8、CD34、CD68(Novocastra,Burlingham,CA，所有IgG1)和平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)(DAKO,Carpinteria,CA,IgG2a)的單克隆抗體被用來(lái)區(qū)分內(nèi)膜斑點(diǎn)的各種細(xì)胞類(lèi)型，包括T細(xì)胞(CD3、CD4或CD8)、內(nèi)皮細(xì)胞(CD34)、巨噬細(xì)胞(CD68)和平滑肌細(xì)胞(SMA)?？笽CAM-1(IgG1)和抗VCAM-1(IgG1)單克隆抗體從CHEMICONTM(Temecula,CA)購(gòu)得。用與被IKB阻斷的NF-KB的p65亞單位中的表位結(jié)合的p65單克隆抗體(IgG3)(BOEHRINGER MANNHEIMTM)證明活化的NF-KB的分布，因此僅當(dāng)通過(guò)解離IKB來(lái)活化NF-KB時(shí)才可達(dá)到(47)。同型對(duì)照單克隆抗體(Mopec21,22)從SIGMAQTM(St.Louis,MO)獲得。免疫組織化學(xué)用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗冰凍切片并將內(nèi)源過(guò)氧化物酶猝滅在0.5％的過(guò)氧化氫中。將切片用10％山羊血清和聚集的人Ig(80mg/ml)的PBS溶液“阻斷”，接著與所述第一單克隆抗體或各自對(duì)照單克隆抗體一起保溫一小時(shí)。帶有濾泡增生的扁桃體的冰凍切片被用作陽(yáng)性對(duì)照以確定各單克隆抗體的最佳稀釋度。將與靶抗原結(jié)合的第一單克隆抗體與生物素標(biāo)記的同型特異性山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG3或IgM(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)相連，然后共軛成親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(VECTOR ELITE KITTM,VECTORTM,Burlingham,CA)。用顯色劑(紅色)3-氨基-9-乙基咔唑(AEC,VECTORTM,Burlingham,CA)檢測(cè)過(guò)氧化物酶活性，將切片用Mayer氏蘇木精復(fù)染(SIGMATM,St.Louis,MO)。
用雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)來(lái)鑒定表達(dá)CD40的細(xì)胞類(lèi)型以及確定在動(dòng)脈粥樣硬化損傷中相對(duì)于ICAM-1、VCAM-1或活化的NF-KB的CD40的分布。首先將所有切片用IgM抗CD40單克隆抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記。二抗是隨后與親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物共軛的生物素化的山羊抗小鼠IgM。用來(lái)檢測(cè)抗CD40 IgM單克隆抗體的存在的顯色劑是3,3’二氨基聯(lián)苯胺(褐色)。然后，充分漂洗切片，與靶向用于平滑肌細(xì)胞(SMA)或巨噬細(xì)胞(CD68)、白細(xì)胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)或活化形式的NF-KB的細(xì)胞特異性標(biāo)記的第二初級(jí)單克隆抗體一起保溫。所有第二初級(jí)單克隆抗體為IgG1、IgG2a或IgG3同型。使用適宜的同型特異性生物素化的二抗并將其與親和素-生物素-堿性磷酸酶復(fù)合物(VECTORTM,Burlingham,CA)結(jié)合。用顯色劑Vector Red(VECTORTM,Burlingham,CA)證明堿性磷酸酶活性。通過(guò)使用不同的免疫酶技術(shù)(過(guò)氧化物酶對(duì)堿性磷酸酶)和各種靶抗原的同型特異性二抗可避免依次使用的染色方法之間的干擾。而且，制備雙標(biāo)記對(duì)照切片，其中兩種一級(jí)單克隆抗體中的一種被同型匹配的對(duì)照單克隆抗體替代。損傷的半定量分析通過(guò)以0-4等級(jí)定義血管腔狹窄的程度來(lái)定量各切片中動(dòng)脈粥樣硬化損傷的程度，其中0代表無(wú)狹窄，1代表小于25％,2代表小于50％,3代表小于90％,4代表大于90％的腔狹窄。還統(tǒng)計(jì)每個(gè)冠狀動(dòng)脈損傷的內(nèi)膜巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(新血管化)48和T細(xì)胞的含量，其中0代表不存在各種細(xì)胞類(lèi)型，1代表很少量分出的細(xì)胞，2代表少量細(xì)胞，3代表存在集中密度的聚集物，4代表遍及整個(gè)斑點(diǎn)中的濃密的聚集物。類(lèi)似的，以0-4的等級(jí)統(tǒng)計(jì)CD40、ICAM-1和VCAM-1的存在，其中0代表不存在各種分子，1代表其存在于極少細(xì)胞中，2,3和4分別代表其存在于少于50％,90％和大于90％的細(xì)胞中(49)。由于陽(yáng)性樣品中的CD40L的表達(dá)局限于分離的細(xì)胞中，因此，其存在對(duì)于定量評(píng)價(jià)是不適合的。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用非參數(shù)Kruskal Wallis法分析各組樣品組織學(xué)記分的差別。使用Spearman氏相關(guān)性評(píng)價(jià)可變量之間的關(guān)系。結(jié)果正常冠狀動(dòng)脈如H$E染色所證實(shí)(圖4A-4B)，來(lái)自4位對(duì)照病人的冠狀動(dòng)脈片段未顯示出濃密增厚或炎癥。具體講，巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞或淋巴細(xì)胞未存在于內(nèi)膜中，并且沒(méi)有細(xì)胞與本研究中所采用的任一抗CD40L單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。存在CD40免疫反應(yīng)性，并局限在沿對(duì)照動(dòng)脈的血管腔排列的內(nèi)皮細(xì)胞中(圖4B)。在對(duì)照血管中不表達(dá)VCAM-1或活化的NF-KB，并且ICAM-1在極少量的血管內(nèi)皮細(xì)胞中有弱表達(dá)。自發(fā)CA和TCAD的組織學(xué)在10位患有CA的7位中，冠狀動(dòng)脈片段顯示出具有偏心狹窄，非細(xì)胞脂富集核心，膽固醇裂和重疊的纖維帽的凸起的動(dòng)脈粥樣硬化斑點(diǎn)。損傷的多孔性在含有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的“臂”區(qū)最大(圖5A)。在內(nèi)膜損傷中還分散有平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和新血管形成的病灶?；加兄卸仍缙谘軗p傷的3位病人的斑點(diǎn)為偏心小型的，并富含巨噬細(xì)胞、“泡沫”細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
9位患有TCAD的病人的冠狀動(dòng)脈損傷表明內(nèi)膜隨著腔的明顯狹窄而纖維狀增厚(表2)。
表2自發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(CA)和移植冠狀動(dòng)脈疾病(TCAD)的內(nèi)膜損傷中的細(xì)胞組成和對(duì)CD40、ICAM-1和VCAM-1的免疫反應(yīng)性的半定量評(píng)價(jià)(等級(jí)0-4)。值以平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示
通過(guò)Kruskal-Wallis試驗(yàn)，p,0.05,CA或TCAD與對(duì)照比較損傷由平滑肌細(xì)胞和間質(zhì)基質(zhì)的同心層組成，并且沿著新血管形成區(qū)域有大量的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的侵蝕。在4個(gè)冠狀動(dòng)脈中，除平滑肌細(xì)胞的同心層外，還觀察到富含脂質(zhì)的動(dòng)脈粥樣硬化損傷和“泡沫”細(xì)胞(圖6A-C)。淋巴細(xì)胞的內(nèi)皮下集中(“內(nèi)皮炎”)和淋巴細(xì)胞在外膜的聚集也是在TCAD損傷中注意到的特征。CA和TCAD中CD40L表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析與缺乏侵染淋巴細(xì)胞或CD40L表達(dá)細(xì)胞的正常冠狀動(dòng)脈明顯相反，CA和TCAD損傷含有CD40L+細(xì)胞。在自發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化中，CD40L的陽(yáng)性免疫染色局限于少數(shù)內(nèi)膜淋巴細(xì)胞中。CD40L染色通常很弱，并在小的胞質(zhì)顆?；蛟诩?xì)胞表面被觀察到(圖7A-D)。在自發(fā)CA中，大多數(shù)內(nèi)膜淋巴細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞；僅存在極少CD8+T細(xì)胞(圖7A-D)。用抗CD4或抗CD8單克隆染色的連續(xù)切片的分析表明CD40L+淋巴細(xì)胞主要為CD4+T細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和“泡沫”細(xì)胞不與本研究所采用的任何一種抗CD40L單克隆抗體反應(yīng)。用同型對(duì)照單克隆抗體未觀察到染色。
在TCAD損傷中，CD40L的陽(yáng)性免疫染色也僅僅與淋巴細(xì)胞相關(guān)(圖8A-C)。與CA相反，CD8+和CD4+T細(xì)胞均存在于TCAD損傷中。然而，CD8+T細(xì)胞主要在“內(nèi)皮炎”的內(nèi)皮下區(qū)域發(fā)現(xiàn)(圖9A-B)，而CD4+T細(xì)胞集中在與內(nèi)彈性膜相鄰的內(nèi)膜深處(圖8A-C)以及冠狀動(dòng)脈外膜的聚集物中。CD40L的表達(dá)在空間上與患有TCAD的冠狀動(dòng)脈的內(nèi)膜和外膜中的CD4+T細(xì)胞相關(guān)。TCAD中的CD40L+T細(xì)胞的數(shù)目高于自發(fā)CA損傷中的。類(lèi)似于CA,TCAD損傷中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和“泡沫”細(xì)胞不與本研究中采用的任一抗CD40L單克隆抗體反應(yīng)(圖9A-B)。這些數(shù)據(jù)表明可能為CD4+T細(xì)胞的CD40L表達(dá)細(xì)胞存在于自發(fā)CA和TCAD的損傷中。CA和TCAD中CD40表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析與局限在正常冠狀動(dòng)脈中的腔內(nèi)皮細(xì)胞的弱CD40表達(dá)相反(圖4A-B),CD40免疫反應(yīng)性在自發(fā)CA的損傷中被正調(diào)節(jié)，并廣泛分布(圖5A-B)。在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和“泡沫”細(xì)胞中觀察到CD40的表達(dá)。在自然CA的內(nèi)膜損傷中CD40陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)目明顯高于對(duì)照動(dòng)脈(2.2+0.7對(duì)0.5+0.6，表2)。用巨噬細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記的雙重免疫染色證實(shí)兩種譜系的這些細(xì)胞和“泡沫”細(xì)胞表達(dá)CD40(圖10A-B)。令人感興趣的是，CD40+平滑肌細(xì)胞存在于靠近炎癥侵染的內(nèi)膜中，而動(dòng)脈基質(zhì)中的平滑肌細(xì)胞未顯示出對(duì)CD40的陽(yáng)性免疫反應(yīng)性(圖10A-B)。對(duì)用CD40或內(nèi)皮標(biāo)記物CD34染色的連續(xù)切片的分析表明沿內(nèi)膜新血管和外膜血管排列的內(nèi)皮細(xì)胞也為強(qiáng)的CD40+(圖11A-D)。
在來(lái)自患有TCAD的病人的動(dòng)脈中，CD40表達(dá)的分布圖類(lèi)似于自發(fā)CA。然而，TCAD中的CD40免疫反應(yīng)性的平均值明顯高于自然CA或?qū)φ談?dòng)脈(表2)。雙重免疫染色表明內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)CD40(圖10A-B)。而且，沿血管腔、內(nèi)膜新血管和外膜血管排列的泡沫細(xì)胞(圖6A-B)和內(nèi)皮細(xì)胞明顯地為CD40+。這些數(shù)據(jù)結(jié)合在一起證明在自發(fā)CA和TCAD中內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)CD40。在CA和TCAD損傷中CD40的表達(dá)與胞間粘附分子和NF-KB的活化的關(guān)系CA和TCAD中的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)調(diào)節(jié)將淋巴細(xì)胞運(yùn)輸?shù)綋p傷的胞間粘附分子。由于在體外CD40的連接誘導(dǎo)細(xì)胞中胞間粘附分子的正調(diào)節(jié)和NF-KB的活化，因此人們關(guān)注CD40的表達(dá)是否與CA或TCAD損傷中的胞間粘附分子或NF-KB的共表達(dá)相關(guān)。首先在自發(fā)CA中證明腔內(nèi)皮細(xì)胞顯示出對(duì)帶有極少表達(dá)VLAM-1的內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1的病灶陽(yáng)性免疫染色。相反，沿內(nèi)膜新血管和外膜血管排列的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ICAM-1和VCAM-1為強(qiáng)陽(yáng)性(圖11A-D)。內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和“泡沫”細(xì)胞對(duì)ICAM-1和VCAM-1也為中等強(qiáng)陽(yáng)性(圖12A-C)。在CD40值與ICAM-1(r=0.85)和VCAM-1(r=0.72)的那些值之間具有顯著的相關(guān)性(p＜0.05)。內(nèi)膜淋巴細(xì)胞的數(shù)目與CD40和白細(xì)胞粘附分子的值顯著相關(guān)(表3)。表3:CA(n=10)或TCAD(n=9)的內(nèi)膜損傷的各種細(xì)胞類(lèi)型的值(0-4)與CD40和粘附分子(ICAM-1,VCAM-1)的表達(dá)值(0-4)的相關(guān)性。值以Spearmen相關(guān)性系數(shù)表示(范圍為-1至1，其中“0”為不相關(guān)，“-1”或“1”為極為相關(guān))。
*p＜0.05,**p＜0.01和***p＜0.001,Spearman相關(guān)顯著性水平在所有所列細(xì)胞類(lèi)型中，只有內(nèi)膜淋巴細(xì)胞的值與CA和TCAD中的內(nèi)膜斑點(diǎn)中的CD40的表達(dá)和ICAM-1和VCAM-1的程度顯著相關(guān)，這表明淋巴細(xì)胞參與這兩種疾病中的CD40和粘附分子的誘導(dǎo)。在CA和TCAD中，巨噬細(xì)胞和新血管形成也顯示出與CD表達(dá)的顯著的相關(guān)性。
用抗CD40單克隆抗體和抗ICAM-1單克隆抗體或抗VCAM-1單克隆抗體的對(duì)CA損傷的雙重免疫染色表明CD40和這些粘附分子共存在于許多細(xì)胞中(圖1A-C)。此外，在新內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的核中觀察到活化的NF-KB(圖13)，并且雙重免疫標(biāo)記證明許多CD40+細(xì)胞也表達(dá)活化的NF-KB。
在TCAD中，對(duì)ICAM-1和VCAM-1的強(qiáng)陽(yáng)性免疫染色存在于腔內(nèi)皮細(xì)胞中，尤其是靠近內(nèi)皮炎病灶的那些中。內(nèi)膜新血管外膜血管的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ICAM-1和VCAM-1為強(qiáng)免疫反應(yīng)性。TCAD中的粘附分子的免疫染色值高于CA或正常冠狀動(dòng)脈(表2)。在CD40值與ICAM-1值(r=0.82)和VCAM-1值(r=0.89)之間具有顯著的相關(guān)性(p＜0.05)。內(nèi)膜淋巴細(xì)胞的數(shù)目也與CD40、ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)顯著相關(guān)(表3)。類(lèi)似于CA，雙色免疫組織化學(xué)研究證明TCAD損傷中的許多CD40+細(xì)胞共表達(dá)ICAM-1或VCAM-1(圖12A-C)。與自發(fā)CA比較，活化的核類(lèi)型的NF-KB的免疫染色更廣泛地分布于TCAD中。NF-KB陽(yáng)性巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞一致為CD40+(圖13)。這些數(shù)據(jù)一起證實(shí)在自發(fā)CA和TCAD的損傷中，CD40和胞間粘附分子和/或NF-KB在許多細(xì)胞中共表達(dá)。討論自然動(dòng)脈粥樣硬化(CA)和與移植相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化(TCAD)為由活化T細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用介導(dǎo)的炎癥性疾病(2,8,12,13,17)。T細(xì)胞被認(rèn)為在CA和TCAD的發(fā)病中起作用，然而，對(duì)它們參與這些過(guò)程的機(jī)理還未充分了解(5,9,50)。研究表明為活化誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞表面分子的CD40L將接觸依賴活化信號(hào)遞送到表達(dá)CD40的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，這將導(dǎo)致促炎癥分子的產(chǎn)生，如胞間粘附分子ICAM-1和VCAM-1(31,32,35-37)和轉(zhuǎn)錄活化因子NF-KB的活化(43-45，體外)。令人感興趣的是，鼠模型中的TCAD至少部分依賴于CD40L-CD40相互作用(51)。在Larson和其同事的研究中，抗CD40L單克隆抗體治療明顯抑制異源異位移植排斥和部分阻斷相關(guān)的血管病。而且，通過(guò)給予抗CD40L單克隆抗體和阻斷T細(xì)胞助刺激途徑的CTLA4-Ig融合蛋白質(zhì)(為分子)的混合物可幾乎完全防止了該模型中的TCAD(51)。CD40L-CD40相互作用可能參與了人CA和/或TCAD的發(fā)病中。
為了證實(shí)這種假設(shè)，進(jìn)一步將免疫這種化學(xué)方法用于正常和動(dòng)脈粥樣硬化的冠狀動(dòng)脈中以研究CD40L和CD40的表達(dá)和細(xì)胞分布。正常冠狀動(dòng)脈不含有CD40L表達(dá)細(xì)胞，CD40免疫反應(yīng)性局限于這些血管中的腔內(nèi)皮細(xì)胞中。相反，CD40L在自發(fā)CA和TCAD的損傷中的淋巴細(xì)胞中表達(dá)。發(fā)現(xiàn)CA損傷含有少數(shù)CD8+T細(xì)胞，而TCAD損傷在內(nèi)膜和外膜較深處的腔內(nèi)皮(“內(nèi)皮炎”)和CD4+T細(xì)胞附近含有CD8+T細(xì)胞。根據(jù)用抗CD40單克隆抗體或抗CD8單克隆抗體的定位和染色，推出在兩種疾病的損傷中CD40L+淋巴細(xì)胞幾乎類(lèi)似于CD4+T細(xì)胞。使用兩種不同的抗CD40L單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)CD40L免疫反應(yīng)性弱，且與顆粒和胞質(zhì)或細(xì)胞表面相關(guān)。在腎小球腎炎中的CD40L和CD40表達(dá)的研究中觀察到相似類(lèi)型的CD40L免疫反應(yīng)性(46)。炎癥組織中CD40L表達(dá)的微弱常見(jiàn)的胞質(zhì)染色類(lèi)型可能與活化T細(xì)胞的CD40L表達(dá)的暫時(shí)性(27-29)和靶細(xì)胞中的CD40的參與通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用(52)和釋放作用(53)誘導(dǎo)CD40L的負(fù)調(diào)節(jié)的這一事實(shí)相關(guān)。這些調(diào)節(jié)機(jī)理可能起著將CD40L介導(dǎo)的信號(hào)事件集中于適宜的相關(guān)靶細(xì)胞中的作用。
發(fā)現(xiàn)在兩種疾病損傷中CD40表達(dá)在許多細(xì)胞中明顯被正調(diào)節(jié)。表達(dá)CD40的巨噬細(xì)胞和“泡沫”細(xì)胞在富含脂質(zhì)斑點(diǎn)的“臂”區(qū)的炎癥侵染中尤其突出，其中這些斑點(diǎn)已知含有濃密的炎癥滲液(54,55)。在兩種疾病的腔內(nèi)皮細(xì)胞中CD40表達(dá)也被正調(diào)節(jié)，這在TCAD中尤其突出。兩種疾病中的內(nèi)膜新血管和外膜血管內(nèi)皮細(xì)胞為強(qiáng)CD40+。表達(dá)CD40的平滑肌細(xì)胞存在于CA和TCAD的內(nèi)膜中，通常在炎癥滲液附近。令人感興趣的是，相同血管基質(zhì)中的平滑肌細(xì)胞為CD40-。在體外，IFN-γ正調(diào)節(jié)包括平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞中的CD40的表達(dá)，并且如IL-1β和TNF-α的細(xì)胞因子增強(qiáng)這種作用(36)。因此，這些損傷中的許多細(xì)胞類(lèi)型中CD40表達(dá)的明顯正調(diào)節(jié)可能是由損傷T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的結(jié)果。雙重免疫染色表明許多CD40+細(xì)胞也共表達(dá)胞間粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及活化形式的NF-KB?？傊狙芯孔C實(shí)了在自發(fā)CA和TCAD的血管損傷中CD40L+T細(xì)胞和活化的CD40+靶細(xì)胞的存在。
早期研究表明CD40在一些上皮細(xì)胞腫瘤和B細(xì)胞中表達(dá)(57,58)。最近已注意到在體外在許多細(xì)胞類(lèi)型中CD40被組成性地表達(dá)或可誘導(dǎo)(33-37,56)。而且，日趨證實(shí)在體內(nèi)，C40L-CD40相互作用在細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用(31,32)。在這方面，最近報(bào)導(dǎo)證明了人炎癥疾病中的原位CD40L和/或CD40表達(dá)(35,46,59)。例如，在侵染患有多發(fā)性硬化病人的腦的巨噬細(xì)胞中(59)，牛皮癬皮膚內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞中(35)以及患有炎癥性腎小球性腎炎病人的腎臟中的許多細(xì)胞中(46),CD40表達(dá)被正調(diào)節(jié)。而且，在患有多發(fā)性硬化的病人的腦中(59)以及患有炎癥性腎小球性腎炎的病人腎臟中(46)的炎性滲液含有CD40L+T細(xì)胞。因此有可能在許多炎性疾病中CD40的表達(dá)被正調(diào)節(jié)，并且代表一種允許T細(xì)胞將炎癥原信號(hào)遞送到多種靶細(xì)胞中的分子機(jī)理。在這方面，這里提供的研究結(jié)果，即在CA和TCAD中CD40表達(dá)被正調(diào)節(jié)以及在損傷中發(fā)現(xiàn)CD40L+侵染T細(xì)胞作為在免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的證據(jù)在這些疾病的發(fā)病中起作用(5-7,9,18,21,23,50)。
有關(guān)在體外CD40L介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化的觀察以及在TCAD鼠模型發(fā)病中的CD40L-CD40相互作用研究表明了CD40L-CD40相互作用在CA和TCAD中的可能的致病作用。例如，在體外，CD40L介導(dǎo)的信號(hào)正調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)(35-37)。調(diào)節(jié)炎癥位點(diǎn)的白細(xì)胞的超常狀態(tài)和滯留的這些胞間粘附分子在CA和TCAD內(nèi)皮細(xì)胞中被正調(diào)節(jié)，并在內(nèi)膜新血管和血管內(nèi)皮細(xì)胞中尤其突出(49,60)。因此，令人感興趣的是，在CA和TCAD中發(fā)現(xiàn)了許多CD40+細(xì)胞，尤其是內(nèi)膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞共表達(dá)ICAM-1和/或VCAM-1。已知ICAM-1和VCAM-1的正調(diào)節(jié)依賴于NF-KB的活化(61)。在本發(fā)明中，還證明了CD40+內(nèi)膜巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)活性形式的NF-KB。這些研究表明CD40L+CD4+T細(xì)胞可部分通過(guò)活化NF-KB來(lái)誘導(dǎo)CA和TCAD中CD40+靶細(xì)胞上的胞間粘附分子的正調(diào)節(jié)。
CD40L介導(dǎo)的信號(hào)還誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6和IL-8(62)并通過(guò)正調(diào)節(jié)組織因子和負(fù)調(diào)節(jié)凝血調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)啟動(dòng)前凝血?jiǎng)┍砻?。在體外，對(duì)于巨噬細(xì)胞，CD40L-CD40相互作用誘導(dǎo)這些細(xì)胞分泌炎癥原細(xì)胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α)、化學(xué)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和表達(dá)組織因子(33,34,38,41,42)。所有這些炎癥原分子可能在CA和TCAD的發(fā)病中起作用(10,17,63-66)。巨噬細(xì)胞中的CD40的連接也誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生(39,40)。令人感興趣的是，在TCAD的鼠模型中阻斷CD40L-CD40相互作用與iNOS表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)和TCAD損傷的減少相關(guān)(51)。證明了iNOS在CA(67,68)，心臟異源移植排斥(69,70)和TCAD(71,72)損傷中表達(dá)。CD40L介導(dǎo)的信號(hào)可能參與促進(jìn)CA或TCAD中任何分子的產(chǎn)生。CD40L-CD40相互作用顯然在TCAD(51)以及膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(73)、狼瘡樣腎小球性腎炎(74)和實(shí)驗(yàn)變態(tài)性腦脊髓炎(59)的鼠模型中明顯具有炎癥原作用。
進(jìn)行了人頸動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化中的CD40L和CD40的表達(dá)的研究(62)。發(fā)現(xiàn)在損傷中CD40被正調(diào)節(jié)并具有廣泛的細(xì)胞分布。CD40L被報(bào)導(dǎo)廣泛地在動(dòng)脈粥樣硬化損傷中的平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)，而在使用兩個(gè)不同的抗CD40L單克隆抗體分本研究中，CD40L表達(dá)局限于T細(xì)胞。這里在任一疾病中的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞中未觀察到原位CD40L表達(dá)。類(lèi)似的，發(fā)現(xiàn)在其他炎癥疾病中，CD40L免疫反應(yīng)性局限于T細(xì)胞，其中炎癥疾病包括腎小球性腎炎(46)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性腸炎。另外，Gerritse等報(bào)導(dǎo)在多發(fā)性硬化斑點(diǎn)中CD40L的表達(dá)局限于CD4+T細(xì)胞(59)。這里的結(jié)果與Mach和同事的結(jié)果之間的差異目前不清楚，但可能與免疫組織化學(xué)方法或損傷性質(zhì)的細(xì)微不同有關(guān)。參考文獻(xiàn)1．Nilsson,J.1993移植方法25:2063-2064。2．Munro,J.和R.Cotran.1988實(shí)驗(yàn)室研究58:249-261。3．Cramer,D.等1992心肺移植雜志11:458-466。4．Billingham,M.1992心肺移植雜志11:S38-S44。5．Zhou,X.等1996.美國(guó)病理學(xué)雜志149:359-366。6．Wick,G.等1995.今日免疫學(xué)16:27-33。7．Stemme,S.等1992.動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成12:206-211。8．Ross,R.1993自然362:801-809。9．Lichtman,A.等1996美國(guó)病理學(xué)雜志149:351-357。10．Kishikawa,H.等1993 Virchows考古學(xué)423:433-442。11．Krensky,A.1994腎臟研究45；50S-56S。12．Salomon,R.等1991美國(guó)病理學(xué)雜志138:791-798。13．Shi,C.等1996.Proc Natl Acad Sci,USA.93:4051-4056。14．Jonasson,L.等1985.臨床研究雜志76:125-131。15．Russell,P.S.等1994.美國(guó)病理學(xué)雜志144:260-274。16．Moyer,C.等1992.病理學(xué)雜志138:951-960。17．Libby,P.和Z.Gallis 1995.Ann NY Acad Sci 748:158-168.18．Stemme,S.等1995.Proc Natl Acad Sci,USA.92:3893-3897。19．Witztum,J.和D.Steinberg 1991臨床研究雜志88:1785-1792。20．de Lorgeril,M.等1993.美國(guó)心臟雜志125:974-980。21．Emeson,E.等1996.美國(guó)病理學(xué)雜志149:675-685。22．Russell,P.等1994.移植57:1367-1371。23．Russell,M.等1996.臨床研究雜志97:833-838。24．Hancock,W.等1996.Proc Natl Acad Sci 93:13967-13972。25．Graf,D.等1992.歐洲免疫學(xué)雜志22:3191-3194。26．Armitage,R.J.等1992.自然357(6373):80-2。27．Lane,P.等1992.歐洲免疫學(xué)雜志22:2573-2578。28．Lederman,S.等1992.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志175(4):1091-101。29．Noelle,R.等1992.Proc Natl Acad Sci USA.89:6550-6554。30．Banchereau,J.等1994.免疫學(xué)年述12:881-922。31．Noelle,R.1996.免疫4:415-419。32．Stout,R.和J.Suttles 1996.今日免疫學(xué)17:487-492。33．Alderson,M.R.等1993.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志178(2)；669-74。34．Caux,C.等1994.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志180:1263-1272。35．Hollenbaugh,D.等1995.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志182:33-40。36．Karmann,K.等1995.Proc Natl Acad Sci,USA.92:4342-4346。37．Yellin,M.J.等1995.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志182:1857-1864。38．Kiener,P.等1995.免疫學(xué)雜志155:4917-4925。39．Stout,R.等1996.免疫學(xué)雜志156:8-11。40．Tian,L.等1995.歐洲免疫學(xué)雜志25:306-309。41．Pardier,O.等1996.歐洲免疫學(xué)雜志26:3048-3054。42．Malik,N.等1996.免疫學(xué)雜志156:3952-3960。43．Berberich,I.等1994.免疫學(xué)雜志153:4357-4366。44．Hess,S.等1995.免疫學(xué)雜志155:4588-4595。45．Karmann,K.等1996.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志184:173-182。46．Yellin,M.等1997.風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎40:124-34。47．Brand,K.等1996.臨床研究雜志97:1715-1722。48．Kuamamoto,M.等1995.人類(lèi)病理學(xué)26:450-456。49．O’Brien,K.等1996.循環(huán)93；672-682。50．Haraoka,S.等1995.Virchows關(guān)節(jié)炎426:307-315。51．Larsen,C.等1996.自然381:434-438。52．Yellin,M.J.等1994.免疫學(xué)雜志152(2):598-608。53．Graf,D.等1995.歐洲免疫學(xué)雜志25:1749-1754。54．Bioerkerud,S.和B.Bjoerkerud 1996.美國(guó)病理學(xué)雜志149:367-380。55．van der Wal,A.等1994.循環(huán)89:36-44。56．Yllin,M.J.等1995.白細(xì)胞生物學(xué)雜志58:209-216。57．Pauli,S.等1985.癌癥免疫學(xué)與免疫治療20:23-28。58．Clark,E.A.和J.A.Ledbetter1986.Proc Natl Acad Sci。USA.83:4494-4498。59．Gerritse,K.等1996.Proc Natl Acad Sci.93:2499-2504。60．Davies,M.等1993.病理學(xué)雜志171:223-229。61．Collins,T.等1995.FASEB J.9:899-909。62．Mach,F.等1997 Proc Natl Acad Sci,USA.94:1931-1936。63．Berliner,J.等1995循環(huán)91:2488-2496。64．Libby,P.等1995心血管藥物25增訂版2:S9-12。65．Li,Z.等1996美國(guó)病理學(xué)雜志148:121-128。66．Galis,Z.等1994.臨床研究雜志94:2493-2503。67．Buttery,L.等1996.實(shí)驗(yàn)室研究75:77-85。68．Aji,W.等1997.循環(huán)95:430-437。69．Yang,X.等1994.臨床研究雜志94:714-721。70．Worrall,N.等1995.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志181:63-70。71．Russell,M.等1995.循環(huán)92:457-464。72．Akyurek,L.等1996.美國(guó)病理學(xué)雜志149；1891-1990。73．Durie,F.H.等1993.科學(xué)261:1328-1330。74．Mohan,C.等1995.免疫學(xué)雜志154:1470-1480。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Yellin,Michalel J.
Lederman,SethChess,LeonardKarpusas,Mihail N.
Thomas,David W.
(ⅱ)發(fā)明題目T-BAM(CD40L)技術(shù)在治療涉及平滑肌細(xì)胞的疾病中的治療應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)目1(ⅳ)通訊地址(A)地址Cooper & unham LLP(B)街道1185 Avenue of the Americas(C)城市紐約(D)州紐約(E)國(guó)家USA(F)郵編10036(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介面類(lèi)型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)柸匀晃粗?B)申請(qǐng)日同此附上(C)分類(lèi)
(ⅷ)代理人信息(A)姓名White Esq.,John P.
(B)登記號(hào)28,678(C)參考/記錄號(hào)48559/JPW/JML(ⅸ)通訊信息(A)電話(212)278-0400(B)傳真(212)391-0525(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度146氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser1 510 15Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr20 25 30Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val35 40 45Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser50 55 60Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu65 70 75 80Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr85 90 95His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly100 105 110Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp115 120 125Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu130 135 140Lys Leu14權(quán)利要求
1．一種抑制在細(xì)胞表面具有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD40配體活化的方法，包括將細(xì)胞與能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的物質(zhì)接觸，其中該物質(zhì)以有效抑制該細(xì)胞活化的量存在。
2．權(quán)利要求1的方法，其中平滑肌細(xì)胞為膀胱平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、支氣管平滑肌細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、肺平滑肌細(xì)胞或胃腸道平滑肌細(xì)胞。
3．權(quán)利要求2的方法，其中胃腸道平滑肌細(xì)胞為食管平滑肌細(xì)胞、胃平滑肌細(xì)胞，小腸平滑肌細(xì)胞或大腸平滑肌細(xì)胞。
4．權(quán)利要求1的方法，其中該物質(zhì)抑制CD40配體與細(xì)胞上的CD40結(jié)合。
5．權(quán)利要求1的方法，其中該物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
6．權(quán)利要求5的方法，其中蛋白質(zhì)包括抗體或其一部分。
7．權(quán)利要求6的方法，其中抗體為單克隆抗體。
8．權(quán)利要求7的方法，其中單克隆抗體特異性地與單克隆抗體5c8(ATCC保藏登記號(hào)為HB10916)特異性結(jié)合的表位結(jié)合。
9．權(quán)利要求8的方法，其中單克隆抗體為單克隆抗體5c8(ATCC保藏登記號(hào)為HB10916)。
10．權(quán)利要求7的方法，其中單克隆抗體特異性地與CD40結(jié)合。
11．權(quán)利要求10的方法，其中抗體為人源化，嵌合或靈長(zhǎng)類(lèi)源化的抗體。
12．權(quán)利要求7的方法，其中單克隆抗體為嵌合抗體。
13．權(quán)利要求7的方法，其中單克隆抗體為人源化抗體。
14．權(quán)利要求6的方法，其中抗體的一部分包含輕鏈或重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)或可變區(qū)。
15．權(quán)利要求6的方法，其中抗體的一部分包含互補(bǔ)決定區(qū)或可變區(qū)。
16．權(quán)利要求15的方法，其中抗體的一部分包含F(xiàn)ab或單鏈抗體。
17．權(quán)利要求5的方法，其中蛋白質(zhì)包括CD40配體的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其包含保守置換的變異體或其一部分；或CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其包含保守置換的變異體或其一部分。
18．權(quán)利要求17的方法，其中CD40配體或CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)為單體。
19．權(quán)利要求17的方法，其中CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)為寡聚體。
20．權(quán)利要求17的方法，其中包含CD40或其一部分或CD40配體或其一部分的可溶性細(xì)胞外區(qū)的蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含與CD40或其一部分或CD40配體或其一部分融合的Fc區(qū)。
21．權(quán)利要求20的方法，其中Fc區(qū)能與蛋白A或蛋白G結(jié)合。
22．權(quán)利要求21的方法，其中Fc區(qū)包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE或其亞類(lèi)。
23．權(quán)利要求22的方法，其中IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA為IgA1或IgA2。
24．權(quán)利要求1的方法，其中物質(zhì)為非蛋白質(zhì)。
25．權(quán)利要求1的方法，其中物質(zhì)選自已知物質(zhì)庫(kù)。
26．權(quán)利要求1的方法，其中物質(zhì)從已知物質(zhì)修飾而來(lái)。
27．權(quán)利要求26的方法，其中根據(jù)CD40配體的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分與先導(dǎo)抑制劑的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)先導(dǎo)抑制劑的結(jié)構(gòu)最優(yōu)化來(lái)設(shè)計(jì)被修飾的物質(zhì)。
28．權(quán)利要求1的方法，其中物質(zhì)通過(guò)篩選方法選擇，它包括分離細(xì)胞樣品；在允許含有CD40的細(xì)胞活化的條件下培養(yǎng)樣品；將樣品與有效活化含有CD40細(xì)胞的表達(dá)被由具有ATCC登記號(hào)HB 10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白的細(xì)胞，或有效活化含有CD40細(xì)胞且被由具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白接觸；如果物質(zhì)能抑制含有CD40細(xì)胞活化，則將樣品與有效量的抑制含有CD40細(xì)胞活化的物質(zhì)接觸；和測(cè)定在存在該物質(zhì)時(shí)，表達(dá)由具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白的細(xì)胞，或由具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白是否活化含有CD40細(xì)胞。
29．權(quán)利要求28的方法，其中物質(zhì)選自已知物質(zhì)庫(kù)。
30．權(quán)利要求29的方法，其中已知物質(zhì)為非蛋白物質(zhì)。
31．一種在個(gè)體中抑制細(xì)胞表面具有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD配體活化的方法，包括給予宿主能抑制CD40配體與細(xì)胞表面的CD40相互作用的物質(zhì)，其中該物質(zhì)以在宿主中有效抑制該細(xì)胞活化的量存在。
32．權(quán)利要求31的方法，其中平滑肌細(xì)胞為膀胱平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、支氣管平滑肌細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、肺平滑肌細(xì)胞或胃腸道平滑肌細(xì)胞。
33．權(quán)利要求32的方法，其中胃腸道平滑肌細(xì)胞為食管平滑肌細(xì)胞、胃平滑肌細(xì)胞，小腸平滑肌細(xì)胞或大腸平滑肌細(xì)胞。
34．權(quán)利要求31的方法，其中該物質(zhì)抑制細(xì)胞中CD40配體與CD40結(jié)合。
35．權(quán)利要求31的方法，其中該物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
36．權(quán)利要求35的方法，其中蛋白質(zhì)包括抗體或其一部分。
37．權(quán)利要求36的方法，其中抗體為單克隆抗體。
38．權(quán)利要求37的方法，其中單克隆抗體特異性地與單克隆抗體5c8(ATCC保藏登記號(hào)為HB10916)特異性結(jié)合的表位結(jié)合。
39．權(quán)利要求38的方法，其中單克隆抗體為單克隆抗體5c8(ATCC保藏登記號(hào)為HB10916)。
40．權(quán)利要求37的方法，其中單克隆抗體特異性地與CD40結(jié)合。
41．權(quán)利要求40的方法，其中抗體為人源化，嵌合或靈長(zhǎng)類(lèi)源化的抗體。
42．權(quán)利要求37的方法，其中單克隆抗體為嵌合抗體。
43．權(quán)利要求37的方法，其中單克隆抗體為人源化抗體。
44．權(quán)利要求36的方法，其中抗體的一部分包含輕鏈或重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)或可變區(qū)。
45．權(quán)利要求36的方法，其中抗體的一部分包含互補(bǔ)決定區(qū)或可變區(qū)。
46．權(quán)利要求45的方法，其中抗體的一部分包含F(xiàn)抗體或單鏈抗體。
47．權(quán)利要求31的方法，其中為哺乳動(dòng)物。
48．權(quán)利要求47的方法，其中哺乳動(dòng)物為嚙齒類(lèi)。
49．權(quán)利要求47的方法，其中哺乳動(dòng)物為人。
50．權(quán)利要求31的方法，包括蛋白質(zhì)包含CD40配體的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其包含保守置換的變異體或其一部分；或CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其包含保守置換的變異體或其一部分。
51．權(quán)利要求50的方法，其中CD40配體或CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)為單體。
52．權(quán)利要求50的方法，其中CD40的可溶性細(xì)胞外區(qū)為寡聚體。
53．權(quán)利要求50的方法，其中包含CD40或其一部分或CD40配體或其一部分的可溶性細(xì)胞外區(qū)的蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含與CD40或其一部分或CD40配體或其一部分融合的Fc區(qū)。
54．權(quán)利要求53的方法，其中Fc區(qū)能與蛋白A或蛋白G結(jié)合。
55．權(quán)利要求53的方法，其中Fc區(qū)包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE或其亞類(lèi)。
56．權(quán)利要求55的方法，其中IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA為IgA1或IgA2。
57．權(quán)利要求31的方法，其中物質(zhì)為非蛋白質(zhì)。
58．權(quán)利要求57的方法，其中物質(zhì)為小分子。
59．權(quán)利要求31的方法，其中物質(zhì)選自已知物質(zhì)庫(kù)。
60．權(quán)利要求31的方法，其中物質(zhì)從已知物質(zhì)修飾而來(lái)。
61．權(quán)利要求60的方法，其中根據(jù)CD40配體的可溶性細(xì)胞外區(qū)或其一部分與先導(dǎo)抑制劑的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)先導(dǎo)抑制劑的結(jié)構(gòu)最優(yōu)化來(lái)設(shè)計(jì)被修飾的物質(zhì)。
62．權(quán)利要求31的方法，其中物質(zhì)通過(guò)篩選方法選擇，該方法包括分離細(xì)胞樣品；在允許含有CD40的細(xì)胞活化的條件下培養(yǎng)樣品；將樣品與有效活化含有CD40細(xì)胞的表達(dá)被由具有ATCC登記號(hào)HB 10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白的細(xì)胞，或有效活化含CD40細(xì)胞且被由具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白接觸；如果物質(zhì)能抑制含有CD40細(xì)胞活化，則將樣品與有效量的抑制含有CD40細(xì)胞活化的物質(zhì)接觸；和測(cè)定在存在該物質(zhì)時(shí)，表達(dá)被由具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白的細(xì)胞，或被由具有ATCC登記號(hào)HB10916的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體5c8特異性識(shí)別的蛋白是否活化含有CD40細(xì)胞。
63．權(quán)利要求62的方法，其中物質(zhì)選自已知物質(zhì)庫(kù)。
64．權(quán)利要求63的方法，其中已知物質(zhì)為非蛋白物質(zhì)。
65．一種治療個(gè)體平滑肌細(xì)胞依賴疾病的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求31的方法抑制細(xì)胞表面具有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD配體的活化。
66．權(quán)利要求65的方法，其中平滑肌細(xì)胞依賴疾病為血管病。
67．權(quán)利要求66的方法，其中血管疾病為動(dòng)脈粥樣硬化。
68．權(quán)利要求65的方法，其中平滑肌依賴疾病為胃腸道疾病。
69．權(quán)利要求68的方法，其中胃腸道疾病選自食管異常游動(dòng)性、炎性腸疾病和硬皮病。
70．權(quán)利要求65的方法，其中平滑肌依賴疾病為膀胱疾病。
全文摘要
通過(guò)將細(xì)胞與能抑制CD40L與細(xì)胞表面的CD40相互作用的物質(zhì)接觸在體內(nèi)和體外抑制在細(xì)胞表面具有CD40的平滑肌細(xì)胞的CD40配體(CD40L)的活化。在體內(nèi)，具有CD40的平滑肌細(xì)胞的抑制被用于治療平滑肌細(xì)胞依賴疾病。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1227494SQ97197174
公開(kāi)日1999年9月1日 申請(qǐng)日期1997年7月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月8日
發(fā)明者M·J·耶林, S·勒德曼, L·徹斯, M·N·卡普薩斯, D·W·托馬斯 申請(qǐng)人:紐約市哥倫比亞大學(xué)理事會(huì), 生物基因公司