專利名稱：Tie－2受體配體(tie配體－3;tie配體－4)及其應(yīng)用的制作方法
本國際申請要求申請日為1996年6月19日的美國申請U.S.流水號08/665,926,1996年7月2日申請的美國臨時申請60/021,087和1996年8月2日申請的美國臨時申請60/022,999的優(yōu)先權(quán)。在本申請全文中引用了多種公開物，這些公開物的內(nèi)容以其全文引用進本申請以供參考。
前言本發(fā)明總的說來涉及遺傳工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及受體酪氨酸激酶及其相關(guān)配體的基因，其插入重組DNA載體和編碼的蛋白質(zhì)在微生物的接受體株和接受體真核細胞中的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明涉及結(jié)合TIE-2受體的稱為TIE配體-3和TIE配體-4的新配體以及涉及制備和使用該新配體的方法。本發(fā)明進一步提供了編碼TIE配體-3或TIE配體-4的核酸序列，產(chǎn)生該核酸及其基因產(chǎn)物的方法。該新TIE配體以及編碼它們的核酸可能在涉及內(nèi)皮細胞和有關(guān)TIE受體的某些疾病，如涉及腫瘤血管形成的贅生性疾病，傷口愈合，血栓栓塞疾病，動脈粥樣硬化和發(fā)炎疾病的診斷和治療中有用。另外，該配體可用于促進造血干細胞的增生和/或分化。
本發(fā)明的生物學活性配體可用于促進表達TIE受體的細胞生長，存活，遷移，和/或分化和/或穩(wěn)定或去穩(wěn)定。生物學活性TIE配體可用于在培養(yǎng)物中體外維持表達TIE受體的細胞。例如，表達TIE受體的細胞和組織包括心和血管內(nèi)皮細胞，晶狀體上皮和心外膜及早期造血細胞。另外，這種配體可用于支持改造成表達TIE受體的細胞。而且，該配體和其相關(guān)受體可用于鑒定該受體的激動劑或拮抗劑的試驗系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
負責分化的細胞和組織的發(fā)育，維持和修復(fù)的細胞行為大部分受經(jīng)生長因子和相似配體及其受體傳遞的細胞間信號調(diào)控。受體位于相應(yīng)細胞的細胞表面且它們結(jié)合稱為生長因子以及其它激素樣配體的肽或多肽。這種相互作用的結(jié)果是在相應(yīng)的細胞中的快速生化變化以及細胞基因表達的快速和長期重調(diào)，與不同細胞表面相關(guān)的一些受體可結(jié)合特定的生長因子。
酪氨酸激酶對蛋白質(zhì)上酪氨酸殘基的磷酸化是一個主要的模式，其中信號通過質(zhì)膜轉(zhuǎn)導(dǎo)。一些熟知的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶基因編碼多肽生長因子和激素的跨膜受體，如上皮生長因子(EGF)，胰島素，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，來源于血小板的生長因子(PDGF-A和-B)和成纖維細胞生長因子(FGFs)。(Heldin等，細胞調(diào)節(jié)，1:555-566(1990)；Ullrich等，細胞，61:243-54(1990))。在每種情況下，這些生長因子經(jīng)過與其相關(guān)受體的細胞外部分結(jié)合發(fā)揮其作用，這導(dǎo)致存在于受體細胞質(zhì)部分的固有的酪氨酸激酶的活化。對內(nèi)皮細胞的生長因子受體特別感興趣是由于在一些重要的生理和病理過程，如血管形成，血管發(fā)生，動脈粥樣硬化和發(fā)炎性疾病中可能涉及生長因子(Folkman等，科學，235:442-447(1987))。另外，一些造血生長因子的受體是酪氨酸激酶；這些包括c-fms，它是集落刺激因子1受體，Sherr等，細胞，41:665-676(1985)和c-kit在Huang等，細胞，63:225-33(1990)中報道的原始造血生長因子受體。
受體酪氨酸激酶根據(jù)其胞外結(jié)構(gòu)域的特征性結(jié)構(gòu)被分成進化亞家族(Ullrich等，細胞，61:243-54(1990))。這些亞家族包括EGF受體樣激酶(亞類Ⅰ)和胰島素受體樣激酶(亞類Ⅱ)，各自在其細胞外結(jié)構(gòu)域含有重復(fù)的同源富含半胱氨酸的序列。在eph樣激酶的細胞外結(jié)構(gòu)域也發(fā)現(xiàn)單個富含半胱氨酸的區(qū)域。Hirai等，科學，238:1717-1720(1987)；Lindberg等，分子細胞生物學，10:6316-24(1990)；Lhotak等，分子細胞生物學，11:2496-2502(1991)。PDGF受體以及c-fms和c-kit受體酪氨酸激酶可分成亞類Ⅲ；而FGF受體形成亞類Ⅳ。這些亞類的成員典型地經(jīng)鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定細胞外折疊單元。這些所謂的免疫球蛋白(Ig)樣折疊在含具有細胞結(jié)合或可溶性配體的許多種其它細胞表面受體的免疫球蛋白超家族的蛋白中發(fā)現(xiàn)。Williams等，免疫學年鑒，6:381-405(1988)。
受體酪氨酸激酶在其特異性和親和力方面有區(qū)別。一般來說，受體酪氨酸激酶是糖蛋白，它由下列結(jié)構(gòu)組成(1)能結(jié)合特異性生長因子的細胞外結(jié)構(gòu)域；(2)通常是蛋白質(zhì)α-螺旋部分的跨膜結(jié)構(gòu)域；(3)近膜結(jié)構(gòu)域，受體可能在此受諸如蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)節(jié)；(4)酪氨酸激酶區(qū)，它是受體的酶成份；(5)羧基末端尾巴，在許多受體中它涉及酪氨酸激酶底物的識別和結(jié)合。
諸如另外的外顯子剪接和基因啟動子或多聚腺苷酸化位點的其它選擇的過程據(jù)報道能從相同基因產(chǎn)生一些明顯不同的多肽。這些多肽可含有或不含上面列出的各個結(jié)構(gòu)域。因此，一些細胞外結(jié)構(gòu)域可作為單獨的，分泌蛋白表達，該受體的一些形式可缺乏酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和僅含有經(jīng)跨膜區(qū)插入質(zhì)膜的細胞外結(jié)構(gòu)域加上短羧基末端尾巴。
以前經(jīng)RT-PCR作為未知酪氨酸激酶同源cDNA片段從人白血病細胞鑒定的編碼內(nèi)皮細胞跨膜酪氨酸激酶的基因由Partanen等，美國國家科學院院刊，87:8913-8917(1990)描述。該基因和其編碼的蛋白質(zhì)稱為“TIE”，它是“具有Ig和EGF同源結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶”的縮寫，Partanen等，分子細胞生物學，12:1698-1707(1992)。
已報道tie mRNA存在于所有人類胎兒和小鼠胚胎組織中。經(jīng)檢查，tie信使已定位于心血管內(nèi)皮細胞。具體地說，tie mRNA定位于9.5至18.5日齡小鼠胚胎的血管和心內(nèi)內(nèi)皮中。與發(fā)育的卵泡和皮膚傷口肉芽組織相關(guān)的新血管形成期間顯示出tie表達增強。Korhonen等，血液，80:2548-2555(1992)。因此認為TIEs在血管形成中發(fā)揮作用，它對形成治療實體腫瘤和一些其它血管形成依賴性疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病，牛皮癬，動脈粥樣硬化和關(guān)節(jié)炎較重要。
已報道2個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的大鼠TIE受體蛋白質(zhì)由具有相關(guān)表達情況的不同基因編碼。一個基因稱為tie-1，它是人tie的大鼠同源物，Maisonpierre等，癌基因，8:1631-1637(1993)。另一基因tie-2可能是鼠tek基因的大鼠同源物，它與tie一樣，已報道專一性地在小鼠內(nèi)皮細胞和其假定的祖先細胞中表達。Dumont等，癌基因，8:1293-1301(1993)。tie-2的人類同源物在1995年9月5日批準的Ziegler的美國專利號5,447,860中描述(其中tie-2的人類同源物被稱為“ork”)，本文引用其全文。
發(fā)現(xiàn)兩個基因都在胚胎和出生后的細胞內(nèi)皮細胞中廣泛表達。tie-2轉(zhuǎn)錄物的明顯水平也存在于其它胚胎細胞群體中，包括晶狀體上皮，心外膜和間質(zhì)區(qū)。Maisonpierre等，癌基因，8:1631-1637(1993)。
TIE受體在血管內(nèi)皮中的優(yōu)勢表達表明TIE在血管系統(tǒng)的發(fā)育和維持中起作用。這可能包括在內(nèi)皮細胞決定，增生，分化和細胞遷移及血管成分定型中的作用。對TIE-2缺陷型小鼠胚胎的分析顯示它在血管形成，特別是在內(nèi)皮細胞血管網(wǎng)形成中是重要的。Sato,T.N.等，自然，376:70-74(1995)。在成熟血管系統(tǒng)中，TIEs在內(nèi)皮細胞存活，維持及對病原性感染的反應(yīng)中發(fā)揮功能。
TIE受體也在原始造血干細胞，B細胞和巨核細胞亞組中表達，由此表明在早期造血，在B細胞分化和/或增生中及在巨核細胞分化途徑中結(jié)合這些受體的配體作用。Iwama等，生物化學和生物物理研究通訊，195:301-309(1993)；Hashiyama等，血液，87:93-101(1996),Batard等，血液，87:2212-2220(1996)。
申請人以前鑒定了一種血管生成因子，它最初稱為TIE-2配體-1(TL-1)，但也稱為血管生成素-1(Ang1)，它通過TIE-2受體傳遞信號且對小鼠正常血管形成是必需的。經(jīng)過同源性篩選，申請人還鑒定了一種Ang1相關(guān)物，稱為TIE-2配體-2(TL2)或血管生成素-2(Ang2)，它是Ang1和TIE2受體的天然存在的拮抗物。為了描述TL1(Ang1)和TL2(Ang2)的克隆和測序及其制備和使用方法，本文參考1996年4月18日公開的PCT國際公開號WO 96/11269和1996年10月10日公開的PCT國際公開號WO 96/31598(兩者均屬于Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，和S.Davis等，細胞，87:1161-1169(1996)，各文獻在本文引用以供參考。Ang 1缺乏在發(fā)育的小鼠胚胎中引起嚴重的血管異常，C.Suri等，細胞，87:1171-1180(1996)。Ang1和Ang2提供天然存在的血管形成的正、負調(diào)節(jié)劑。根據(jù)同時作用的血管形成，TIE2的正或負調(diào)節(jié)很可能產(chǎn)生不同的結(jié)果。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含基本上不含其它蛋白質(zhì)的TIE配體-3或TIE配體-4的組合物。本發(fā)明還提供了分離的編碼TIE配體-3的核酸分子和編碼TIE配體-4的分離的核酸分子。該分離的核酸可以是DNA，cDNA或RNA。本發(fā)明還提供了包含分離的編碼TIE配體-3或TIE配體-4的核酸分子的載體。本發(fā)明進一步提供了在合適的宿主細胞中生產(chǎn)具有TIE配體-3或TIE配體-4生物學活性的多肽的宿主載體系統(tǒng)。合適的宿主細胞可以是細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)具有TIE配體-3或TIE配體-4生物學活性的多肽的方法，包含在允許該多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主-載體系統(tǒng)的細胞并回收所產(chǎn)生的多肽。
本文描述的本發(fā)明的編碼TIE配體-3或TIE配體-4的分離的核酸分子進一步用于形成配體、其片段或衍生物，或稱為受體激動劑或拮抗劑的另一分子作為用于治療患有涉及表達TIE受體的細胞，組織或器官的紊亂的病人的治療劑。本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合這種治療分子的抗體。該抗體可以是單克隆或多克隆的。本發(fā)明還提供了使用該單克隆或多克隆抗體測量病人樣品中治療性分子含量的方法以便監(jiān)測治療過程。
本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的抗體。該抗體可以是單克隆或多克隆的。因此，本發(fā)明進一步提供了包含一種特異性地結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的抗體和一種藥用上可接受的載體的治療組合物。本發(fā)明還提供了經(jīng)過施用有效量的包含在藥用上可接受的載體中的特異性地結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的抗體的治療組合物阻斷哺乳動物血管生長的方法。
本發(fā)明進一步提供了包含在藥用上可接受的載體中的TIE配體-3或TIE配體-4的治療組合物。本發(fā)明還提供了經(jīng)過施用有效量的包含在藥用上可接受的載體中的TIE配體-3或TIE配體-4的治療組合物促進病人新血管形成的方法。在一個實施方案中，該方法可用于促進傷口愈合。在另一實施方案中，該方法可用于治療局部缺血。在另外一個實施方案中，單獨或與其它造血因子結(jié)合使用TIE配體-3或TIE配體-4以促進造血干細胞，B細胞或巨核細胞的增生或分化。
另外，本發(fā)明提供了TIE配體-3或TIE配體-4可偶聯(lián)到細胞毒劑上并由此制備治療組合物。本發(fā)明進一步提供了特異性地結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的受體。本發(fā)明進一步提供了包含在藥用上可接受的載體中的特異性地結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的受體的治療組合物。本發(fā)明還提供了經(jīng)過施用有效量的包含在藥用上可接受的載體中的特異性結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的受體融合體的治療組合物阻斷哺乳動物血管生長的方法。
本發(fā)明還提供了TIE受體拮抗劑以及在哺乳動物中抑制TIE配體-3或TIE配體-4生物學活性的方法，包含給哺乳動物施用有效量的TIE拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明，該拮抗劑可以是本文描述的TIE配體-3或TIE配體-4，抗體或能特異性地結(jié)合TIE配體-3，TIE配體-4或TIE受體的其它分子，或含TIE配體-3或TIE配體-4的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的配體融合體。
附圖簡述

圖1A和1B.TIE-2受體融合體(TIE-2RB)抑制雞胚胎絨毛膜尿囊膜(CAM)中的血管形成。用6μgRB浸泡的單片可消溶的明膠泡(Gelfoam)立即插入1日齡雞胚CAM中。再培養(yǎng)3天后，取出4日齡胚及周圍的CAM并檢查。圖1A用EHK-1RB(rEHK-1 ecto/hIgG1 Fc)處理的胚存活并在其周圍CAM中具有正常形成的血管。圖1B全部用TIE-2RB(rTIE-2 ecto/h IgG1 Fc)處理的胚死亡，大小減小并幾乎完全缺乏周圍血管。
圖2.TIE-2/TIE配體在血管形成中假定的作用的示意圖。TL1以(·)表示，TL2以(*)表示，TIE-2以(T)表示，VEGF以(□)表示，flk-1(VEGF受體)以(Y)表示。
圖3.TIE-2配體的示意圖，顯示了“螺旋狀圈”和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域以及使用抗myc-標記和Fc標記改造纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的多聚體。
圖4.在定量無細胞結(jié)合試驗中TIE-2-IgG結(jié)合固著的TL1的典型曲線。
圖5.顯示在定量無細胞結(jié)合試驗中含有結(jié)合于IgG(TL1-fFc)的Fc結(jié)構(gòu)域上的配體纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的TIE-2配體1配體融合體結(jié)合固著的TIE-2胞外結(jié)構(gòu)域的典型曲線。
圖6A-6B.TIE配體-3的核苷酸和推斷的氨基酸(單字母密碼)序列。該編碼序列開始于47位。纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域開始于929位。
圖7.TIE配體家族成員的氨基酸序列比較。mAng3=mTL3=小鼠TIE配體-3；hAng 4=hTL 4=人TIE配體-4；hAng 1=hTL 1=人TIE-2配體1；mAng 1=mTL 1=小鼠TIE-2配體1；mAng 2=mTL 2=小鼠TIE-2配體2；hAng 2=hTL 2=人TIE-2配體2。下面劃線的區(qū)域表示在家族成員中保守的同源區(qū)域。
圖8A-8C.TIE配體-4的核苷酸和推斷的氨基酸(單字母密碼)序列。箭頭表示核苷酸位置569。
發(fā)明詳述正如下文以更詳細的方式所描述的，申請人分離了并鑒定了一種與結(jié)合TIE-2受體的TIE-2配體相關(guān)的新配體。該新配體可從天然純化或經(jīng)重組制備，在本文中稱之為TIE配體-3(TL3)和TIE配體-4(IL4)。其它TIE配體家族成員在本文稱為TIE-2配體1(TL1)(也稱為血管生成素-1(Ang1))和TIE-2配體2(TL2)(也稱為血管生成素-2(Ang2))。申請人在本文中描述了一個TIE配體家族并鑒定了家族成員中的保守同源區(qū)。因此預(yù)期該新的配體TL3和TL4在血管形成和造血過程中具有相似于已知配體TL1(Ang1)和TL2(Ang2)的功能和用途。
本發(fā)明包括該新的配體和其氨基酸序列，以及包含天然存在的等位變異體的其功能等同變異體，結(jié)合TIE受體并充當其激動劑或拮抗劑的蛋白質(zhì)或包含對所述序列的取代，缺失或插入突變的多肽。該變異體包括序列內(nèi)氨基酸殘基被殘基取代導(dǎo)致沉默變化的多肽。例如，序列內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基被發(fā)揮相當功能的極性相似的另一氨基酸取代導(dǎo)致沉默變化。序列內(nèi)的氨基酸取代物可選自該氨基酸所屬類型的其它成員。例如，非極性(疏水)氨基酸類型包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的有表現(xiàn)出與TIE配體-3或TIE配體-4相同或相似生物學活性的蛋白質(zhì)或其片段或衍生物及在翻譯期間或之后進行不同修飾的衍生物，例如，經(jīng)糖基化，蛋白水解裂解，連接到抗體分子或其它細胞配體上，等等。功能等同分子還包括含有修飾的分子，包括在特定重組宿主細胞中表達產(chǎn)生的N端修飾，例如，在某些細菌(例如，大腸桿菌)表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的N端甲基化。功能等同物還包括對半胱氨酸分子進行氨基酸取代以增強分子穩(wěn)定性并防止不需要的交聯(lián)的突變體。
本發(fā)明還包括編碼本文描述為TIE配體-3的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，編碼本文描述為TIE配體-4的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以及經(jīng)過諸如轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染，電穿孔或顯微注射存在于合適表達載體中的編碼本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4的核酸遺傳改造為產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的宿主細胞，包括酵母，細菌，病毒和哺乳動物細胞。本發(fā)明還包含諸如在Finkel和Epstein,FASEB J.9:843-851(1995)；Guzman等，PNAS(USA)91:10732-10736(1994)中所述的通過基因治療技術(shù)導(dǎo)入編碼TIE配體-3或TIE配體-4的核酸。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認識到本發(fā)明包含在諸如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，Vol.1.pp.101-104，冷泉港實驗室出版(1989)限定的中等嚴格條件下與推斷的TIE配體3或TIE配體-4編碼序列雜交的DNA和RNA序列。因此，本發(fā)明包含的核酸分子包括具有從本文所述制備的TIE配體-3或TIE配體-4氨基酸序列推導(dǎo)的序列的分子以及具有與該核酸序列雜交的核酸序列的分子，還有上述序列由于遺傳密碼的簡并編碼能結(jié)合TIE受體的配體并具有作為本文所述的配體的足夠相同點的氨基酸序列和其它第一，第二和第三級特征以賦予該分子與本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4相似的生物學活性的核酸序列。
因此，本發(fā)明包含一種分離并純化的核酸分子，它含有編碼哺乳動物TIE配體-3的核苷酸序列，其中該核苷酸序列選自(a)含有圖6A-6B所示的TIE配體-3編碼區(qū)的核苷酸序列；(b)含有圖6A-6B所示的TIE配體-3纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)的核苷酸序列；(c)在中等嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交且編碼結(jié)合TIE受體的配體的核苷酸序列；和(d)除了遺傳密碼子的簡并性外能與(a),(b)或(c)的核苷酸序列雜交且編碼能結(jié)合TIE受體的配體的核苷酸序列。
本發(fā)明進一步提供了分離并純化的由本發(fā)明分離的核酸分子編碼的TIE配體-3。本發(fā)明還提供了一種載體，它含有包含編碼哺乳動物TIE配體-3的核酸序列的分離的核酸分子。
本發(fā)明還包含一種分離并純化的核酸分子，它含有編碼人TIE配體-4的核苷酸序列，其中該核苷酸序列選自
(a)含有包含在1996年7月2日保藏的命名為hTL-4的載體(ATCC保藏號98095)中的人TIE配體-4編碼區(qū)的核酸序列；(b)含有包含在1996年7月2日保藏的命名為hTL-4的載體(ATCC保藏號98095)中的TIE配體-4纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的核酸序列；(c)在中等嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交且編碼結(jié)合TIE受體的配體的核苷酸序列；和(d)除了遺傳密碼的簡并性外，能與(a),(b)或(c)的核苷酸序列雜交并編碼結(jié)合TIE受體的配體的核苷酸序列。
本發(fā)明進一步包含一種分離并純化的核酸分子，它含有編碼人TIE配體-4的核苷酸序列，其中該核苷酸序列選自(a)含有圖8A-8C所示的人TIE配體-4編碼區(qū)的核苷酸序列；(b)含有圖8A-8C所示的人TIE配體-4纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)的核苷酸序列；(c)在中等嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交并編碼結(jié)合TIE受體的配體的核苷酸序列；和(d)由于遺傳密碼的簡并性而不同于(a),(b)或(c)的核苷酸序列，但編碼結(jié)合TIE-2受體的TIE-2配體的核苷酸序列。
本發(fā)明進一步提供了分離并純化的由本發(fā)明分離的核酸分子編碼的TIE配體-4。本發(fā)明還提供了一種載體，它含有包含編碼人TIE配體-4的核酸序列的分離的核酸分子。
使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何將DNA片段插入載體的方法可利用合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和蛋白質(zhì)編碼序列構(gòu)建編碼TIE配體-3或TIE配體-4的表達載體。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)及體內(nèi)重組(遺傳重組)。編碼TIE配體-或TIE配體-4或其肽片段的核酸序列的表達可用有效連接到TIE配體-3或TIE配體-4編碼序列上的第二種核酸序列來調(diào)節(jié)以便在用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中表達TIE配體-3或TIE配體-4蛋白質(zhì)或肽。例如，本文描述的TIE配體-3或TIE配體-4的表達可用本領(lǐng)域已知的任何啟動子/增強子元件來控制?？捎糜诳刂婆潴w表達的啟動子包括，但不限于在Squinto等，(細胞，65:1-20(1991))中所述的長末端重復(fù)序列；SV40早期啟動子區(qū)域(Bernoist和Chambon，自然，290:304-310)；CMV啟動子，M-MuLV5′末端重復(fù)序列，在Rous肉瘤病毒3′長末端重復(fù)中包含的啟動子(Yamamoto等，細胞，22:787-797(1980))，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，美國國家科學院院刊，78:144-1445(1981))，腺病毒啟動子，金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，自然，296:39-42(1982))。原核表達載體，如β內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，美國國家科學院院刊，75:3727-3731(1978))，或tac_啟動子(DeBoer等，美國國家科學院院刊，80:21-25(1983))，也見“來自重組細菌的有用蛋白質(zhì)”，科學的美國人，242:74-94(1980)；來自酵母或其它真菌的啟動子成分如Gal4啟動子，ADH(乙醇脫氫酶)啟動子，PGK(磷酸甘油激酶)啟動子，堿性磷酸酶啟動子，和下面的表現(xiàn)出組織特異性并用于轉(zhuǎn)基因動物的動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等，細胞，38:639-646(1984))；Ornitz等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986),MacDonald，肝學，7:425-515(1987)；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，自然，315_:115-122(1985))，在淋巴樣細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等，1984，細胞，38:647-658；Adames等，1985，自然，318:533-538；Alexander等，1987，分子細胞生物學，7:1436-1444)，在睪丸，乳腺，淋巴樣和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制區(qū)(Leder等，1986，細胞，45:485-495)，在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，基因和發(fā)育，1:268-276)，在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，1985，分子細胞生物學，5:1639-1648；Hammer等，1987，科學，235:53-58)；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，基因和發(fā)育，1-:161-171)，在髓樣細胞中有活性的β-球蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，1985，自然，315:338-340；Kollias等，1986，細胞，46_:89-94)；在腦少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白質(zhì)基因控制區(qū)(Readhead等，1987，細胞，48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Shani,1985，自然，314:283-286)，在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，1986，科學，234:1372-1378)。本發(fā)明進一步包含能與編碼TIE配體-3或TIE配體-4的RNA序列特異性地雜交以調(diào)節(jié)其表達的反義化合物的生產(chǎn)。(Ecker,U.S.專利號5,166,195,1992年11月24日出版)。
因此，根據(jù)本發(fā)明，將能在細菌或真核宿主中復(fù)制的包含編碼本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4的核酸的表達載體用于轉(zhuǎn)染宿主，從而使該核酸表達以生產(chǎn)TIE配體-3或TIE配體-4，然后以生物學活性形式回收。本文所使用的生物學活性形式包括能與TIE受體結(jié)合并引起諸如分化功能的生物學反應(yīng)或影響表達受體的細胞表型的形式。例如，這種生物學活性形式可誘導(dǎo)TIE受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化。另外，該生物學活性可以是作為TIE受體的拮抗劑的效應(yīng)。在另一實施方案中，TIE配體-3或TIE配體-4的活性形式是能識別TIE受體并從而在診斷和治療中均用作靶向試劑的形式。根據(jù)該實施方案，該活性形式不必給任何表達TIE的細胞提供任何表型變化。
含基因插入物的表達載體可用4種常規(guī)方法鑒定(a)DNA-DNA雜交，(b)“標記”基因功能的存在或缺失，(c)插入序列的表達和(d)PCR檢測。在第一種方法中，插入表達載體中的外源基因的存在可使用包含與插入的TIE配體-3或TIE配體-4編碼基因同源的序列的探針經(jīng)DNA-DNA雜交檢測。在第二種方法中，重組載體/宿主系統(tǒng)可基于載體中外源基因的插入引起的某些“標記”基因功能(例如，胸苷激酶活性，對抗生素的抗性，轉(zhuǎn)化表型，桿狀病毒中包含體形成等)的存在或缺乏來鑒定和選擇。例如，如果編碼TIE配體-3或TIE配體-4的核酸插入到載體的標記基因序列內(nèi)，含該插入子的重組體以缺乏標記基因功能來鑒定。在第三種方法中，重組表達載體經(jīng)過測定重組體表達的外源基因產(chǎn)物來鑒定。這種測定可基于諸如TIE配體-3或TIE配體-4基因產(chǎn)物的物理或功能特征，例如以配體與用諸如可檢測的抗體或其部分示蹤的TIE受體或其部分的結(jié)合或以與產(chǎn)生的抗TIE配體-3或TIE配體-4蛋白或其部分的抗體的結(jié)合來測定。本發(fā)明的細胞可瞬時或優(yōu)選在組成性永久地表達本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4。在第四種方法中，可制備相應(yīng)于tie特異性DNA序列的DNA核苷酸引物。然后，這些引物用于PCR tie基因片段。(PCR流程方法和應(yīng)用指南，Michael A.Innis等編輯，Academic Press(1990))。
可用允許隨后形成穩(wěn)定生物活性蛋白質(zhì)的任意技術(shù)純化重組配體。優(yōu)選的是，該配體分泌進培養(yǎng)基中并從中回收它。另外，該配體可從細胞中以可溶性蛋白質(zhì)或作為包含體回收，對于包含體，可用8M鹽酸胍并根據(jù)熟知方法經(jīng)透析大量提取。為了進一步純化配體，可使用親和色譜，常規(guī)離子交換層析，疏水相互作用層析，反相色譜或凝膠過濾。
在本發(fā)明的另外的實施方案中，正如在實施例中更詳細所描述的，重組TIE配體-3或TIE配體-4編碼基因可用于經(jīng)同源重組滅活或“敲除”(khock out)內(nèi)源基因，從而產(chǎn)生TIE配體-3或TIE配體-4缺陷細胞，組織或動物。例如但并非用作限制，重組TIE配體-3或IIE配體-4編碼基因可改造成含插入突變，例如，neo基因，它可滅活本身的TIE配體-3或TIE配體-4編碼基因。這種構(gòu)建體在合適的啟動子控制下可經(jīng)過諸如轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)或注射的技術(shù)導(dǎo)入細胞，如胚胎干細胞。含該構(gòu)建體的細胞可用G418抗性來選擇。然后可經(jīng)過諸如Southern印跡，PCR檢測，Northern印跡或表達測定鑒定缺乏完整的TIE配體-3或TIE配體-4編碼基因的細胞。然后將缺乏完整TIE配體-3或TIE配體-4編碼基因的細胞與早期胚細胞融合以產(chǎn)生該配體缺陷型的轉(zhuǎn)基因動物。該動物可用于限定在正常情況下依賴于該配體的特定體內(nèi)過程。
本發(fā)明還提供了抗本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4的抗體，它在配體的檢測，例如診斷應(yīng)用中有用。為了制備針對TIE配體-3或TIE配體4的單克隆抗體，可使用提供經(jīng)培養(yǎng)物中的連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)。例如，最早由Kohler和Milstein建立的雜交瘤技術(shù)(1975，自然，256:495 497)，以及三體瘤技術(shù)，人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，當今免疫學，4:72)和生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，見“單克隆抗體和癌癥治療”Alan R.Liss,Inc.pp.77-96)和類似方法在本發(fā)明范圍內(nèi)。
單克隆抗體可以是人單克隆抗體或嵌合人-小鼠(或其它種類)單克隆抗體?？捎枚喾N本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)制備人單克隆抗體(例如，Teng等，1983，美國國家科學院院刊，80:7308-7312；Kozbor等，1983，當今免疫學，4:72-79；Olsson等，1982，酶學方法，92:3-16)。可制備含小鼠抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域及人恒定區(qū)的嵌合抗體分子(Marrison等，1984，美國國家科學院院刊，81:6851,Takeda等，1985，自然，314:452)。
本領(lǐng)域已知的各種方法可用于生產(chǎn)抗本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4的表位的多克隆抗體，為了生產(chǎn)抗體，可用TIE配體-3或TIE配體-4或其片段或衍生物注射免疫各種宿主動物，包括但不限于兔，小鼠和大鼠。根據(jù)宿主種類，可使用各種佐劑增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏(完全和不完全佐劑)，礦物膠，如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，多聚陰離子，肽，油乳劑，鑰孔血藍蛋白，二硝基苯酚，和潛在有用的人佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒桿菌。
可用已知技術(shù)制備抗選定TIE配體-3或TIE配體-4表位的抗體的分子克隆。重組DNA方法(例如，見Maniatis等，1982，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室，紐約冷泉港)可用于構(gòu)建編碼單克隆抗體分子或其抗原結(jié)合區(qū)的核酸序列。
本發(fā)明提供了抗體分子及該抗體分子的片段。含該分子獨特型的抗體片段可用已知技術(shù)生產(chǎn)。例如，該片段包括但不限于經(jīng)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片段；經(jīng)還原F(ab′)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab′片段，經(jīng)過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段?？捎靡阎夹g(shù)純化抗體分子，例如，免疫吸附或免疫親和層析，色譜方法如HPLC(高效液相色譜)或其組合。
本發(fā)明進一步包含測量生物學樣品中TIE配體-3或TIE配體-4含量的免疫試驗，經(jīng)過a)將生物學樣品與至少一種能特異性地結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的抗體結(jié)合以便該抗體與存在于樣品中的任何TIE配體-3或TIE配體-4形成復(fù)合物；和b)測量復(fù)合物的量并由此測定生物學樣品中TIE配體-3或TIE配體-4的總量。
本發(fā)明進一步包含一種測定生物學樣品中TIE受體總量的試驗，經(jīng)過a)將生物學樣品與至少一種本發(fā)明的配體接觸從而使配體與TIE受體形成復(fù)合物；和b)測定復(fù)合物的總量，從而測定生物學樣品中TIE受體總量。
本發(fā)明還提供了使用TIE配體-3或TIE配體-4支持TIE受體表達細胞存活和/或生產(chǎn)和/或遷移和/或分化。因此，該配體可用作一種添加劑以支持例如培養(yǎng)物中的內(nèi)皮細胞。
另外，申請人對TIE受體的其它配體的發(fā)現(xiàn)使試驗系統(tǒng)的利用對TIE受體激動劑或拮抗劑的鑒定有用。該試驗系統(tǒng)在鑒定能啟動或抑制血管形成的分子中有用。例如，在一個實施方案中，TIE受體拮抗劑可鑒定為能干擾TIE受體與生物活性TIE配體-3或TIE配體-4相互作用的試驗分子。按其能力鑒定該拮抗劑是1)使用例如BIAcore生物傳感器技術(shù)(BIAcore；Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)測量時抑制生物活性TIE配體-3或TIE配體-4與受體的結(jié)合；或2)抑制生物活性TIE配體-3或TIE配體-4引起生物學反應(yīng)的能力。該生物學反應(yīng)包括但不限于TIE受體或TIE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游成分的磷酸化，或攜帶TIE受體的細胞的存活，生長或分化。
在一個實施方案中，改造成表達TIE受體的細胞可依賴于加入TIE配體-3或TIE配體-4的生長。該細胞提供鑒定TIE受體的其它激動劑或能干擾TIE配體3或TIE配體-4對該細胞之活性的拮抗劑的有用的試驗系統(tǒng)。另外，改造成能共同表達TIE配體-3和受體，或TIE配體-4和受體的自分泌型細胞可在分析潛在的激動劑或拮抗劑中提供有用的系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明提供了將TIE受體導(dǎo)入正常情況下不表達該受體的細胞，從而使該細胞表現(xiàn)出深度的且易于區(qū)分的對結(jié)合該受體的配體的反應(yīng)。誘導(dǎo)的反應(yīng)類型取決于所用的細胞，而不是導(dǎo)入細胞的特定受體?？蛇x擇合適的細胞系以產(chǎn)生對分析及發(fā)現(xiàn)能作用于酪氨酸激酶受體的分子最有用的反應(yīng)。該分子可以是任意類型的分子，包括但不限于將在受體特異性方式中進行描述的在系統(tǒng)中發(fā)揮作用的肽和非肽分子。
采用的一個更有用的系統(tǒng)包括將TIE受體(或含有另一受體酪氨酸激酶，例如，trkC的胞外結(jié)構(gòu)域和TIE受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合受體)導(dǎo)入成纖維細胞系(例如，NIH3T3細胞)，從而在正常情況下不介導(dǎo)增生反應(yīng)的這類受體在導(dǎo)入成纖維細胞后可經(jīng)過許多已建立的方法定量成纖維細胞生長因子的效應(yīng)來分析(例如，胸苷摻入或其它類型的增生試驗；見van Zoelen,1990，“檢測多肽生長因子的生物學分析的應(yīng)用”，Progress.Fatcor Research,Vol.2.pp.131-152；Zhan和M.Goldfarb,1986，分子細胞生物學，Vol.6,pp.3541-3544)。這些分析的額外優(yōu)勢是可能具有導(dǎo)入的受體的細胞系及缺乏該受體的親本細胞系分析任何制品；由于通過導(dǎo)入的受體介導(dǎo)，僅可判斷對具有受體的細胞系的特定影響。該細胞可進一步改造成表達TIE配體-3或TIE配體-4，從而產(chǎn)生對分析以拮抗劑/激動劑相互作用起作用的分子有用的自分泌型系統(tǒng)。因此，本發(fā)明提供了包含編碼TIE配體-3或TIE配體-4的核酸及編碼TIE受體的核酸的宿主細胞。
TIE受體/TIE配體-3或TIE配體-4的相互作用還提供了對鑒定小分子TIE受體的激動劑或拮抗劑有用的系統(tǒng)。例如，可鑒定結(jié)合TIE受體但不誘導(dǎo)任何其它生物學活性的TIE配體-3或TIE配體-4片段，突變體或衍生物。另外，TIE配體-3或TIE配體-4的鑒定使該分子的活性部分的測定成為可能。而且，配體的鑒定使受體/配體復(fù)合物X-射線晶體結(jié)構(gòu)的測定成為可能，從而能夠鑒定受體的結(jié)合位點。對結(jié)合位點的認識將提供合理設(shè)計新激動劑和拮抗劑的有用參考。
試驗分子與TIE受體的特異性結(jié)合可以許多方法來測定。例如，試驗分子與表達TIE的細胞的實際結(jié)合可經(jīng)過檢測或測量下列物質(zhì)來檢測或測量(ⅰ)結(jié)合到完整細胞表面的試驗分子；(ⅱ)與細胞溶胞產(chǎn)物中TIE蛋白質(zhì)交聯(lián)的試驗分子；或(ⅲ)體外與TIE結(jié)合的試驗分子。試驗分子與TIE之間的特定相互作用可經(jīng)過使用證實該相互作用獨特特征的試劑來評價。
作為一個具體的非限制性的例子，可如下使用本發(fā)明的方法，考慮其中樣品中的TIE配體3或TIE配體-4待測的情況。將各種稀釋度的樣品(試驗分子)與不含TIE配體-3或TIE配體-4活性的陰性對照(NC)和含已知量TIE配體-3或TIE配體-4的陽性對照(PC)在可檢測標記的TIE配體-3或TIE配體-4(在本實施例中是放射性碘標記的配體)存在下平行地與表達tie的細胞接觸。試驗樣品中TIE配體-3或TIE配體-4的總量可經(jīng)過測定與對照及在各稀釋度下結(jié)合的125I-標記的TIE配體-3或125I-標記的TIE配體-4總量，然后比較樣品值與標準曲線來評價。樣品中TIE配體-3或TIE配體-4越多，與TIE結(jié)合的125I-配體越少。
125I-配體結(jié)合總量可經(jīng)過測量每細胞中的放射活性總量或按Meakin和Shooter,1991-,Neuron 6:153-163所述使用DSS將TIE配體-3或TIE配體-4交聯(lián)到細胞表面蛋白上并使用諸如能揭示具有相應(yīng)于TIE受體/TIE配體-3或TIE受體/TIE配體-4大小的標記蛋白的SDS聚丙烯凝膠電泳檢測細胞提取物中標記蛋白質(zhì)的總量來測定。特定的試驗分子/TIE相互作用可進一步經(jīng)過向分析物中加入各種稀釋度的不結(jié)合TIE受體并因此對標記的TIE配體-3或TIE配體-4和試驗分子競爭結(jié)合TIE基本上無影響的未標記的對照配體來測定。另外，已知能破壞TIE受體/TIE配體-3或TIE配體-4結(jié)合的分子，例如，但不局限于抗TIE抗體，或本文所述的TIE受體融合體預(yù)期會干擾125I-TIE配體-3或125I TIE配體-4和試驗分子對TIE受體結(jié)合的競爭。
可檢測的標記的TIE配體-3或TIE配體-4包括，但不限于共價或非共價連接到放射活性物質(zhì)，熒光物質(zhì)，具有酶活性的物質(zhì)，用作酶底物的物質(zhì)(優(yōu)選與比色法可檢測到的相關(guān)的酶和底物)或能被抗體分子(優(yōu)選可檢測標記的抗體分子)識別的物質(zhì)上的TIE配體-3或TIE配體-4。
另外，試驗分子與TIE的特異性結(jié)合可經(jīng)過評價TIE配體-3或TIE配體-4/TIE受體結(jié)合的次級生物學效應(yīng)，包括但不限于細胞生長和/或分化或立即早期基因表達或TIE磷酸化來測定。例如，試驗分子誘導(dǎo)分化的能力可在缺乏tie的細胞及在表達tie的可比較細胞中測定，在表達tie的細胞中分化但不在缺乏tie的可比較細胞中分化表明有特異性的試驗分子/TIE相互作用，經(jīng)過測定立即早期基因(例如fos和jun)在tie陰性和tie陽性細胞中的誘導(dǎo)，或經(jīng)過使用本領(lǐng)域已知的標準磷酸化測定檢測TIE的磷酸化可進行相似分析。這類分析在鑒定激動劑或不競爭性結(jié)合TIE的拮抗劑中可能有用。
同樣，本發(fā)明提供了一種鑒定具有TIE配體-3或TIE配體-4生物學活性的分子的方法，包括(ⅰ)將表達tie的細胞與試驗分子接觸，(ⅱ)檢測試驗分子與TIE受體的特異性結(jié)合，其中與TIE的特異性結(jié)合與TIE樣活性正相關(guān)。如上文所述，可經(jīng)過分析直接結(jié)合或結(jié)合的次級生物學效應(yīng)來檢測特異性結(jié)合。該方法在鑒定TIE配體家族的新成員或在制藥工業(yè)中，在篩選大量肽和非肽分子(例如，肽類似物)與TIE相關(guān)的生物學活性中特別有用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的、具體的非限制性實施方案中，制備許多孔的培養(yǎng)物孔，在不同的孔排中含有PC12(或成纖維細胞，見下面)細胞，它們是tie陰性或改造成tie陽性。然后加入各類試驗分子，使各孔中或其一部分中含有不同的試驗分子。然后計數(shù)各孔是否存在生長和/或分化。以這種方式可篩選出極大數(shù)目的試驗分子的該活性。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了檢測或測量TIE配體樣活性或鑒定具有該活性的分子的方法，包含(ⅰ)在允許發(fā)生結(jié)合的條件下，將試驗分子與體TIE受體蛋白質(zhì)接觸，(ⅱ)檢測試驗分子與TIE受體蛋白質(zhì)的結(jié)合，其中試驗分子與TIE受體的結(jié)合與TIE配體樣活性相關(guān)。根據(jù)該方法，TIE受體可以是或不是基本上純化的，可以固定于固相支持物上(例如，作為親和柱或作為ELISA試驗)，或可以摻入人工膜上。試驗分子與TIE受體的結(jié)合可用本領(lǐng)域已知的任何方法來評價。在優(yōu)選的實施方案中，試驗分子的結(jié)合可經(jīng)過評價其與可檢測標記的已知TIE配體競爭結(jié)合TIE受體的能力來評價。
本發(fā)明還提供了檢測試驗分子發(fā)揮TIE配體樣活性拮抗劑的能力的方法，包含檢測該分子抑制TIE配體結(jié)合表達該受體的細胞上TIE受體的效應(yīng)的能力。該拮抗劑可干擾或不干擾TIE受體/TIE配體-3或TIE配體4結(jié)合。TIE配體-3或TIE配體-4與TIE受體結(jié)合的效應(yīng)優(yōu)選是生物學或生化效應(yīng)，包括但不限于細胞存活或增生，細胞轉(zhuǎn)化，立即早期基因誘導(dǎo)或TIE磷酸化。
本發(fā)明進一步提供了鑒定抗體或其它能中和配體或抑制與受體結(jié)合的分子的方法以及該方法鑒定的分子。作為非限制性例子，該方法可以經(jīng)過在概念上相似于ELISA試驗的試驗來進行。例如，TIE受體融合體可結(jié)合于固相支持物上，如塑料多孔板。作為對照，將已進行Myc標記的已知量的TIE配體-3或TIE配體-4導(dǎo)入孔中，然后借助于抗Myc-標記的報道抗體鑒定結(jié)合受體融合體的任何標記的TIE配體-3或TIE配體-4。然后，該試驗系統(tǒng)可用于篩選試驗樣品中具下列能力的分子(ⅰ)結(jié)合標記的配體，(ⅰ)結(jié)合受體融合體，從而抑制標記的配體與受體融合體的結(jié)合。例如，將含推定的目的分子及已知量標記配體的試驗樣品導(dǎo)入孔中并測定結(jié)合受體融合體的標記配體的總量。經(jīng)過比較試樣中結(jié)合的標記配體總量與對照的總量，可鑒定含有能抑制配體與受體結(jié)合的分子的樣品。由此鑒定的目的分子可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法分離。
一旦發(fā)現(xiàn)了配體結(jié)合的阻斷劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道進行次級試驗以確定該阻斷劑是與受體還是與配體結(jié)合，以及進行確定是否阻斷劑分子能中和配體生物學活性的試驗。例如，經(jīng)過使用采用BIAcore生物傳感器技術(shù)(或相當技術(shù))的結(jié)合試驗，其中TIE受體融合體或TIE配體-3或TIE配體-4或配體融合體共價附著于固相支持物(例如，在金表面的羧甲基葡聚糖)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能測定阻斷劑分子是否能特異性地結(jié)合配體，配體融合體或結(jié)合受體融合體。為了確定阻斷劑分子是否能中和配體的生物學活性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進行磷酸化試驗(見1996年10月10日公開的國際公開號WO 96/31598中的實施例5)或另外的功能生物測定，如經(jīng)過使用諸如內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)物進行存活測定。另外，結(jié)合受體融合體的抑制劑分子可以是一種激動劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員經(jīng)過進行合適的分析鑒定TIE受體的其它激動劑將了解如何進行確定。
另外，本發(fā)明還涉及組合物，其中TIE配體是本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，TIE-2配體1含有“螺旋圈”結(jié)構(gòu)域和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。據(jù)信TIE-2配體2的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域與配體1在相同的氨基酸序列處或附近開始(FRDAC)。據(jù)信TIE配體-3的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域開始或大約開始的氨基酸序列由大約圖6A-6B所示的位置929處開始的核苷酸編碼。配體產(chǎn)生期間螺旋狀圈結(jié)構(gòu)域的多聚體化妨礙了純化。如實施例7所述，申請人卻發(fā)現(xiàn)了含有TIE-2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。
然而，纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的單聚體形式似乎不結(jié)合受體。利用以抗myc抗體“聚集”的myc-標記的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域進行研究卻結(jié)合TIE-2受體。[產(chǎn)生“聚集的”配體和配體融合體的方法在Davis等，科學，266:816-819(1994)中描述]。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，申請人生產(chǎn)了“配體融合體”，它含有偶聯(lián)到IgG Fc結(jié)構(gòu)域上的TIE-2配體的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域(“fFc′s”)。這些形成二聚體的配體融合體有效結(jié)合TIE-2受體。因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)TIE配體-3或TIE配體-4的配體融合體，它們在診斷或治療應(yīng)用中可用作靶向試劑，例如，用于腫瘤和/或有關(guān)維管結(jié)構(gòu)的靶向試劑，其中指示TIE拮抗劑。
在本文中本發(fā)明進一步提供了配體，其片段或衍生物，或作為受體激動劑或拮抗劑并用于治療患有涉及表達TIE受體的細胞，組織或器官的疾病的病人的治療劑的另一分子的形成。該分子可用于人或動物體的治療方法或診斷方法。
由于已確定TIE受體與內(nèi)皮細胞相關(guān)，且正如本文所證實的，對TIE-2配體1的阻斷似乎防止血管形成，申請人預(yù)期TIE配體-3或TIE配體-4對于表明有血管形成的疾病或紊亂中血管形成的誘導(dǎo)有用。該疾病或紊亂包括傷口愈合，局部缺血和糖尿病。該配體可在動物模型中試驗并按對其它試劑所述在治療上使用，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，但血管形成的另一內(nèi)皮細胞特異性因子，F(xiàn)errara等，1994年7月26日出版的美國專利號5,332,671。Ferrara的參考文獻，及其它研究描述了體外和體內(nèi)的研究，可用于證實血管生成因子在促進血液流進局部缺血心肌，促進傷口愈合及在需要新血管形成的其它治療情況中的效應(yīng)。[見Sudo等，1993年7月7日公開的歐洲專利申請0 550 296A2；Banai等，循環(huán)，89:2183-2189(1994)；Unger等，美國生理學雜志，266:H1588-H1595(1994)；Lazarous等，循環(huán)，91:145 153(1995)]。根據(jù)本發(fā)明，TIE配體-3或TIE配體-4可單獨或與一種或多種其它藥用上有活性的化合物，如VEGF或堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，以及細胞因子，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白等結(jié)合使用。
相反，TIE受體的拮抗劑，如本文實施例2和3所述的受體融合體，和1996年10月10日公開的國際申請?zhí)朩O 96/31598中的實施例9中所述的TIE-2配體2對于防止或減緩血管形成，從而防止或延緩，例如腫瘤生長有用。這些試劑可單獨或與其它成分結(jié)合使用，如已顯示在治療其中治療目的是抑制血管形成的癥狀中有用的抗-VEGF抗體。申請人預(yù)期本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4也可與諸如細胞因子拮抗劑，如已知抑制炎癥的IL-6拮抗劑的試劑結(jié)合使用。
例如，申請人已確定TIE配體在腫瘤內(nèi)的或與腫瘤相關(guān)的細胞中表達。例如，TIE-2配體2似乎與腫瘤內(nèi)皮細胞密切相關(guān)。因此，它和其它TIE拮抗劑也在防止或減緩諸如腫瘤生長中有用。而且，TIE配體或配體融合體對于將毒素傳遞給攜帶受體的細胞中有用。另外，其它分子，如生長因子，細胞因子或營養(yǎng)物可經(jīng)過TIE配體或配體融合體傳遞給攜帶TIE受體的細胞。諸如TIE配體-3或TIE配體-4的TIE配體或配體融合體也可用作TIE受體的診斷劑以檢測體內(nèi)或體外的受體。在與TIE受體相關(guān)的疾病狀態(tài)中，諸如TIE配體-3或TIE配體-4的TIE配體或配體融合體可用作經(jīng)過諸如組織染色或全身造影檢測該疾病的診斷劑。該試劑包括放射性同位素、熒光染料，染料，酶和生物素。該診斷或靶向試劑可按Alitalo等，1995年10月5日公開的WO 95/26364和Burrows,F.和P.Thorpe,PNAS(USA)90:8996-9000(1993)所述來制備，本文以其全文進行引用。
在其它實施方案中，本文所述的諸如TIE配體-3或TIE配體-4的TIE配體用作造血因子。在血液中含有的各種細胞類型的增殖和/或分化和/或遷移中涉及許多造血因子及其受體。由于TIE受體在早期造血細胞中表達，所以預(yù)期TIE配體在這些細胞的增殖或分化或遷移中起相當大的作用。因此，例如，可制備，測定，在體外和體內(nèi)生物學系統(tǒng)中檢查含TIE的組合物并在治療上使用，如下列任一文獻所述Sousa，美國專利號4,810,643,Lee等，美國國家科學院院刊，82:4360-4364(1985)；Wong等，科學，228:810-814(1985)；Yokota等，美國國家科學院院刊，81:1070(1984)；Bosselman等，1991年5月2日公開的題目為“干細胞因子”的WO 9105795和Kirkness等，1995年7月27日公開的題目為“造血成熟因子”的WO 95/19985。因此，TIE配體-3或TIE配體-4可用于診斷或治療正常造血受抑制的癥狀，包括，但不限于貧血，血小板減少癥，白細胞減少癥和粒性白細胞減少癥。在優(yōu)選的實施方案中，TIE配體-3或TIE配體-4可用于刺激在如下情況中的血細胞前體分化，即具有引起正常血細胞水平下降的諸如獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的疾病的病人的情況中，或在需要造血群體增強的臨床情況中，如在與骨髓移植相聯(lián)的情況中，或在治療由輻射，化學處理或化療引起的發(fā)育不全或骨髓抑制中。
本發(fā)明的TIE配體-3或TIE配體-4可單獨或與諸如細胞因子，神經(jīng)營養(yǎng)因子，白細胞介素等的另一藥用活性劑結(jié)合使用。在優(yōu)選的實施方案中，該配體可以與已知誘導(dǎo)干細胞或其它造血前體增殖的任一上述眾多因子或作用于造血途徑晚期細胞的因子，包括，但不限于造血成熟因子，血小板生成素，干細胞因子，促紅細胞生成素，G-CSF，GM-CSF等結(jié)合使用。
在另一實施方案中，TIE受體拮抗劑可用于診斷或治療病人，其中所需結(jié)果是抑制造血途徑，如治療血液形成器官的骨髓增生或其它增生疾病，如血小板增多癥，紅細胞增多癥和白血病。在該實施方案中，治療可包括使用治療上有效量的TIE配體-3或TIE配體-4,TIE抗體，TIE受體融合體，TIE配體-3或TIE配體-4連接物或配體融合體或本文所述的fFC。
本發(fā)明還提供了藥用組合物，包含存在于藥物學上可接受的載體中的本文所述的TIE配體-3或TIE配體-4或配體融合體，其肽片段或衍生物，可全身性或局部施用TIE配體-3或TIE配體-4蛋白，肽片段或衍生物?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的用藥方式，包括但不限于靜脈內(nèi)，鞘內(nèi)，動脈內(nèi)，鼻內(nèi)，口內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)或經(jīng)過局部注射或手術(shù)移植用藥。還提供了緩釋制劑。
本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合該治療分子的抗體。該抗體可以是單克隆或多克隆的。本發(fā)明還提供了使用該單克隆或多克隆抗體測定取自病人的樣品中的治療性分子總量方法以監(jiān)測治療過程。
本發(fā)明進一步提供了包含TIE配體-3或TIE配體-4或配體融合體和連接到其上的細胞毒劑的治療組合物。在一個實施方案中，細胞毒劑可以是放射性同位素或毒素。
本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的抗體。該抗體可以是單克隆或多克隆的。
本發(fā)明進一步提供了純化TIE配體-3或TIE配體-4的方法，包括a)將至少一種TIE結(jié)合底物偶聯(lián)到固相基質(zhì)上；b)保溫a)的底物與細胞溶胞產(chǎn)物使底物與細胞溶胞產(chǎn)物中的TIE配體-3或TIE配體-4形成復(fù)合物；c)洗滌固相基質(zhì)；和d)從偶聯(lián)的底物上洗脫出TIE配體-3或TIE配體-4。
該底物可以是特異性地接合TIE配體-3或TIE配體-4的任意底物。在一個實施方案中，該底物選自抗-TIE配體-3或抗-TIE配體-4抗體，TIE受體和TIE受體融合體。本發(fā)明進一步提供了特異性地結(jié)合TIE配體-3或TIE配體-4的受體融合體以及包含在藥用上可接受的載體中的受體融合體的治療組合物和抑制人體血管生長的方法，包括施用有效量的治療組合物。
本發(fā)明還提供了包含在藥用上可接受的載體中的TIE配體-3或TIE配體-4或配體融合體的治療組合物，以及促進病人新血管形成的方法，包含給病人施用有效量的治療組合物。
另外，本發(fā)明提供了鑒定表達TIE受體的細胞的方法，包含在允許可檢測標記的配體與TIE受體結(jié)合的條件下將細胞與可檢測標記的TIE配體-3或TIE配體-4或配體融合體接觸并測定可檢測標記的配體是否結(jié)合到TIE受體上，從而鑒定表達TIE受體的細胞。本發(fā)明還提供了治療組合物，包含TIE配體-3或TIE配體-4或配體融合體和連接到其上的細胞毒劑。細胞毒劑可以是放射性同位素或毒素。
本發(fā)明還提供了檢測細胞表達TIE配體-3或TIE配體-4的方法，包含從細胞獲得mRNA，在雜交條件下將所獲得的mRNA與編碼TIE配體-3或TIE配體-4的標記的核酸分子接觸，測定與標記分子雜交的mRNA的存在，從而檢測細胞中TIE配體-3或TIE配體-4的表達。
本發(fā)明進一步提供了檢測組織切片中TIE配體-3或TIE配體-4表達的方法，包含在雜交條件下，將組織切片與編碼TIE配體-3或TIE配體-4的標記的核酸分子接觸，測定與標記分子雜交的mRNA的存在，從而檢測組織切片中TIE配體-3或TIE配體-4的表達。
實施例1-ABAE細胞系作為TIE-2受體報告細胞的鑒定成年BAE細胞以ECACC#92010601在歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心登記(見PNAS 75:2621(1978))。Northern(RNA)分析揭示在ABAE(成年牛動脈內(nèi)皮細胞)細胞系中tie-2轉(zhuǎn)錄子的中等水平，這與證實tie-2 RNA幾乎專一性地位于血管內(nèi)皮細胞的原位雜交結(jié)果一致。因此，我們檢查了ABAE細胞溶胞產(chǎn)物中TIE-2蛋白質(zhì)的存在，以及在正常情況下相對于無血清生長條件時TIE-2蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的程度。收獲ABAE細胞溶胞產(chǎn)物并進行免疫沉淀，接著對用TIE-2特異的和磷酸酪氨酸特異性的抗血清免疫沉淀的蛋白質(zhì)進行Western印跡分析。在TIE-2免疫沉淀期間包含或者去作為特異性抑制分子的TIE-2肽允許明確鑒定TIE-2是一種約150 KD的中等可測蛋白，其穩(wěn)定狀態(tài)的磷酸酪氨酸水平經(jīng)預(yù)先的細胞血清饑餓減少到幾乎不可檢測的水平。
按下面所述進行ABAE細胞的培養(yǎng)和細胞溶胞產(chǎn)物的收獲。低傳代數(shù)的ABAE細胞以2×106個細胞/150mm塑料培養(yǎng)板(Falcon)的密度涂布成單層并在含10％小牛血清(10％BCS),2mM L-谷氨酰胺(Q)和青霉素及鏈霉素(P-S)各1％的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中在5％CO2氣體中培養(yǎng)。收獲細胞溶胞產(chǎn)物前，細胞在DMEM/Q/P-S中血清饑餓24小時，接著吸出培養(yǎng)基并用加有正釩酸鈉，氟化鈉及苯甲脒鈉的冰凍磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗平板。細胞在加有1％NP40去污劑和蛋白酶抑制劑，PMSF和抑蛋白酶肽的少量體積的該漂洗緩沖液中溶胞。經(jīng)過在4℃以14000×G離心10分鐘從細胞溶胞產(chǎn)物中去掉不溶性碎片，在含有或不含加至～20μg/ml溶胞產(chǎn)物的抑制肽的條件下用對TIE-2受體特異性的抗血清對上清液進行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)PAGE(7.5％Laemmli凝膠)分辨，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并與各種TIE-2或磷酸酪氨酸特異性的抗血清保溫。經(jīng)過將膜與HRP-連接的第二抗血清保溫，接著用ECL試劑(Amersham)處理可觀察TIE-2蛋白質(zhì)。實施例2-TIE-2受體融合體的克隆和表達以便對TIE-2配體相互作進行親和性研究構(gòu)建了一個表達構(gòu)建體以產(chǎn)生由大鼠TIE-2受體完整細胞外部分與人免疫球蛋白γ-1恒定區(qū)(IgG1 Fc)融合組成的分泌蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)稱為TIE-2“受體融合體”(RB)，且在正常情況下根據(jù)在單個IgG1 Fc尾之間形成二硫鍵預(yù)期在溶液中以二聚體存在。TIE-2 RB的Fc部分制備如下。用相應(yīng)于公開的人IgG1序列的寡核苷酸經(jīng)PCR從人胎盤cDNA中擴增編碼跨越鉸合區(qū)到該蛋白質(zhì)羧基末端的人IgG1 Fc部分的DNA片段；將所得的DNA片段克隆進質(zhì)粒載體。將來自編碼全長TIE-2受體的質(zhì)粒和來自人IgG1 Fc質(zhì)粒的合適的DNA限制性片段連接到短的PCR產(chǎn)生的片段任一側(cè)，設(shè)計成融合的符合閱讀框的TIE-2和人IgG1 Fc蛋白編碼序列。因此，所得TIE-2胞外域-Fc融合蛋白質(zhì)被精確取代，由IgG1 Fc代替跨越TIE-2跨膜和胞質(zhì)域的區(qū)域。另一種制備RB的方法在Goodwin等，細胞，73:447-456(1993)中描述。
經(jīng)過將TIE-2RB DNA片段克隆進pVL1393桿狀病毒載體并隨后感染草地葉蛾SF-21AE昆蟲細胞系可獲得毫克量的TIE-2 RB。另外，也可使用細胞系SF-9(ATCC保藏號CRL-1711)或細胞系BT1-TN-561-4。編碼TIE-2RB的DNA以EcoRⅠ-NotⅠ片段克隆進桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVL1393。經(jīng)過氯化銫密度梯度離心純化的質(zhì)粒DNA經(jīng)過將3μg該質(zhì)粒DNA與0.5μg Baculo-Gold DNA(Pharminigen)混合重組進病毒DNA中，接著使用30μg Lipofectin(GIBCO-BRL)導(dǎo)入脂質(zhì)體中。將DNA脂質(zhì)體混合物加入在TMN-FH培養(yǎng)基(改良的Grace氏昆蟲細胞培養(yǎng)基(GIBCO-BRL))中的SF-21AE細胞(2×106細胞/60mm培養(yǎng)皿)中27℃保溫5小時，接著在補充有5％小牛血清的TMN-FH培養(yǎng)基中27℃5天。收獲組織培養(yǎng)基，對重組病毒進行噬斑純化，該步驟使用以前描述的方法(O′Reilly,D.R.,L. K.Miller，和V.A.Luckow，桿狀病毒表達載體-實驗手冊，1992,New York；W.H.Freeman)進行，除了瓊脂糖覆蓋層含125μg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷；GIBCO-BRL)。27℃培養(yǎng)5天后，以對X-gal底物的陽性生色反應(yīng)計數(shù)非重組噬斑，標記其位置。然后經(jīng)過加入含100μg/ml MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基溴化四唑；Sigma)的第二層觀察重組噬斑。經(jīng)栓塞吸出挑選推定的重組病毒噬斑，經(jīng)多輪噬斑分離來純化以保證其均一性。經(jīng)過對噬斑純化的病毒進行系列低復(fù)數(shù)傳代生產(chǎn)病毒種子。生產(chǎn)了一個病毒克隆(vTIE-2受體融合體)的低傳代種子。
在含1×抗生素/抗真菌溶液(Gibco BRL)和25mg/L慶大霉素(Gibco BRL)的無血清培養(yǎng)基(SF-900Ⅱ,Gibco BRL)中培養(yǎng)基SF-21AE細胞。加入Pluronic F-68作為表面活性劑至終濃度為1g/L。感染前在生物反應(yīng)器(Artisan Cell Station System)中培養(yǎng)細胞(4L)至少3天。以80mL/分的氣體流速(在噴氣環(huán)中通氣)通氣至50％溶氧，在27℃生長細胞。借助于船用葉輪以100rpm的速度攪拌。在對數(shù)生長中期(-2×106個細胞/mL)收獲細胞，離心濃縮并用每細胞5個噬斑形成單位的vTIE-2受體融合體感染。用新鮮培養(yǎng)基使細胞和接種物為400mL，在轉(zhuǎn)瓶中27℃吸收病毒2小時。然后用新鮮無血清培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)物至8L終體積，使用前面描述的條件在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞。
感染72小時后離心(500×g,10分鐘)收集vTIE-2受體融合體感染的SF21AE細胞的培養(yǎng)基。用NaOH將細胞上清液調(diào)至pH8。加入EDTA至終濃度為10mM，將上清pH重調(diào)至8。過濾(0.45μm，Millipore)上清并上樣到蛋白質(zhì)A柱(蛋白質(zhì)A瓊脂糖4快速流動或HiTrap蛋白質(zhì)A，均來自Pharmacia)。用含0.5M NaCl的PBS洗柱至280mm吸光率減少到基線。在PBS中洗滌柱并用0.5M乙酸洗脫。經(jīng)過洗脫進含1M Tris pH9的管立即中和柱級分。合并含TIE-2RB的峰級分并用PBS透析。實施例3-證實TIE-2在血管形成中起關(guān)鍵作用經(jīng)過將“過多的”可溶性TIE-2受體融合體(TIE-2RB)導(dǎo)入發(fā)育系統(tǒng)可獲得對TIE-2功能的了解。TIE-2RB結(jié)合，從而中和現(xiàn)存TIE-2配體的潛在能力可導(dǎo)致正常血管形成的可見的破壞及配體的鑒定。為了檢查TIE-2 RB是否能用于破壞早期雞胚的血管形成，用TIE-2RB浸泡小片生物學可吸收泡并在正靠原胚側(cè)面的位置立即插入到絨毛膜尿囊膜下面。
早期雞胚在卵黃頂上從被絨毛膜尿囊膜(CAM)覆蓋的一小盤細胞上形成。將要在胚胎中排成血管的內(nèi)皮細胞來自胚外和胚內(nèi)細胞。胚外來源的內(nèi)皮細胞提供胚胎內(nèi)皮細胞的主要來源，它由位于固有胚側(cè)面周圍CAM正下方的間質(zhì)的添加生長產(chǎn)生。隨著這些間質(zhì)細胞的成熟，產(chǎn)生內(nèi)皮和造血細胞的共同祖先，稱為血管母細胞。接著，血管母細胞產(chǎn)生成血管細胞(內(nèi)皮細胞祖先)和成血細胞(多能造血前體)的混合群體。當內(nèi)皮細胞后代圍繞原始血細胞分開形成一個細胞厚的導(dǎo)管時開始形成循環(huán)系統(tǒng)原基。這些細胞成分的增生和遷移最終在CAM下產(chǎn)生龐大的充滿血液的毛細血管的網(wǎng)絡(luò)，并最后侵入胚胎與有限的胚內(nèi)來源的血管單元連接。
從Spafas,Inc.(Boston,MA)獲得的剛受精的雞卵在99.5 F°,55％RH下培養(yǎng)。在發(fā)育大約24小時時，用70％乙醇消毒蛋殼并用牙醫(yī)鉆在每個蛋的鈍端鉆一個1.5cm的孔。去掉殼膜以暴露胚上方的氣室。用解剖刀切下無菌Gelfoan(Upjohn)的小矩形片并浸泡于等濃度的TIE-2或EHK-1受體融合體中。使用EHK-1胞外區(qū)域代替TIE-2細胞外域按實施例2所述制備EHK-1受體融合體(Maisonpierre等，癌基因，8:3277-3288(1993))。各Gelfoam片大約吸收30μl中的6μg蛋白。在原胚側(cè)面幾毫米的位置用無菌鐘表鑷在CAM上撕一缺口。將浸泡有RB的Gelfoam片大部分插入到CAM下面，用一片膠粘帶密封蛋殼。其它相似狀態(tài)的卵平行地用無關(guān)RB，神經(jīng)表達受體酪氨酸激酶，EHK-1處理((Maisonpierre等，癌基因，8:3277-3288(1993))。使發(fā)育進行4天，然后經(jīng)肉眼觀察檢查胚。經(jīng)過在溫PBS碟中小心弄破殼并小心切下帶有周圍CAM的胚來取出胚。在12個用各種RB處理蛋中，6個TIE-2RB和5個EHK-1RB處理的胚發(fā)育超過實驗開始觀察的狀態(tài)。在這些形成的胚中觀察到顯著區(qū)別，如圖1A和1B所示。那些用EHK-1RB處理的胚似乎相當正常地發(fā)育。以存在跳動的心臟判斷5個EHK-1胚中4個是活的。而且，胚外血管豐富并在CAM下側(cè)面延伸幾厘米，由于存在紅血細胞，這肉眼觀察明顯。與此相反，TIE-2RB處理的胚與直徑超過10mm的EHK-1RB胚相比發(fā)育嚴重受阻，直徑范圍為2-5mm。全部TIE-2處理的胚死亡且其CAM無血管。TIE-2RB在雞中抑制血管形成的能力證實TIE-2RB配體對血管發(fā)育是必須的。實施例4-TIE-2配體融合體的構(gòu)建構(gòu)建一個表達構(gòu)建體，它產(chǎn)生分泌型蛋白質(zhì)，由人TIE-2配體1(TL1)或TIE-2配體2(TL2)的完整編碼序列與人免疫球蛋白γ-1恒定區(qū)(IgG1 Fc)融合組成。這些融合蛋白質(zhì)稱為TIE-2“配體融合體”(TL1-Fc或TL2-Fc)。按下面制備TL1-Fc和TL2-Fc的Fc部分。用相應(yīng)于人IgG1公開序列的寡核苷酸經(jīng)PCR從人胎盤cDNA擴增編碼跨越鉸合區(qū)到羧基末端的人IgG1 Fc部分的DNA片段；所得的DNA片段被克隆進質(zhì)粒載體。來自編碼全長TL1或TL2的質(zhì)粒或來自人IgG1 Fc質(zhì)粒的合適的DNA限制性片段在來自短PCR片段的任一側(cè)連接，設(shè)計成融合的，符合閱讀框的TL1或TL2與人IgG1 Fc蛋白質(zhì)的編碼序列。
經(jīng)過將TL2-Fc DNA片段克隆進pVL 1393桿狀病毒載體并隨后感染草地夜蛾SF-21AE昆蟲細胞系獲得毫克量的TL2-Fc。另外，可使用細胞系SF-9(ATCC保藏號CRL-1711)或細胞系BTI-TN-5b1-4。編碼TL2-Fc的DNA以EcoRI-NotⅠ片段克隆進桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVL 1393。經(jīng)過將3μg質(zhì)粒DNA與0.5μgBaculo-Gold DNA(Pharminigen)混合將質(zhì)粒DNA重組進病毒DNA，接著使用30μg Lipofectin(GIBCO-BRL)導(dǎo)入脂質(zhì)體。將DNA-脂質(zhì)體混合物加入在TMN-FH培養(yǎng)基(改良的Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)基(GIBCO-BRL))中的SF-21AE細胞(2×106細胞/60mm平皿)中27℃保溫5小時，接著在補充有5％胎牛血清的TMN-FH培養(yǎng)基中27℃培養(yǎng)5天。收獲組織培養(yǎng)基用于對重組病毒進行噬斑純化，使用以前所述的方法(O′Reilly,D.R.,L.K.Miller，和V.A.Luckow，桿狀病毒表達載體-實驗手冊，1992,New York.W.H.Freeman)進行該步驟，除了瓊脂糖覆蓋層含有125mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-吡喃半乳糖苷，GIBCO-BRL)。27℃培養(yǎng)5天后，經(jīng)過與X-gal底物的陽性生色反應(yīng)計數(shù)非重組噬斑并標記其位置。然后經(jīng)過加入含100mg/mL MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]2,5-二苯基溴化四唑；Sigma)的第二層觀察重組噬斑。經(jīng)栓塞吸出挑出推定的重組病毒噬斑，經(jīng)多輪噬斑分離純化以保證均一性。經(jīng)系列低復(fù)數(shù)傳代噬斑純化的病毒產(chǎn)生病毒貯液。產(chǎn)生一個病毒克隆(vTL2-Fc克隆#7)的低傳代種子。
在含1X抗生素/抗真菌劑溶液(Gibco BRL)和25mg/L慶大霉素(Gibco BRL)的無血清培養(yǎng)基(SF-900Ⅱ,Gibco BRL)中培養(yǎng)SF-21AE細胞。加入Pluronic F-68作為表面活性劑至終濃度為1g/L。感染前在生物反應(yīng)器(Artisan Cell Station System)中培養(yǎng)培養(yǎng)物(4L)至少3天。細胞在27℃，通入50％溶氧，氣體流速為80mL/min(在噴氣環(huán)中通氣)的條件下生長。借助于船用葉輪以100rpm的速率攪拌。在對數(shù)生長中期(～2×106細胞/mL)收獲細胞，經(jīng)離心濃縮，用每細胞5個vTL2-Fc噬斑形成單位感染。細胞和接種物用新鮮培養(yǎng)基加至400mL，在燒瓶中27℃吸收病毒2小時。然后將培養(yǎng)物重懸于新鮮無血清培養(yǎng)基中至終體積8L，使用以前描述的條件在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞。
感染72小時后經(jīng)離心(500×g,10分鐘)收集vTL2-Fc-感染的SF21AE細胞的細胞培養(yǎng)基。細胞上清用NaOH調(diào)成pH8。加EDTA至終濃度為10mM，將上清pH重調(diào)成8。過濾(0.45μm,Millipore)上清并上樣到蛋白質(zhì)A柱(蛋白質(zhì)A瓊脂糖4快速流動或HiTrap蛋白質(zhì)A，均來自Pharmacia)。用含0.5M NaCl的PBS洗柱至280nm處吸光率減至基線。在PBS中洗柱并用0.5M乙酸洗脫。經(jīng)過洗脫進含1M Tris pH9的管中立即中和柱級分。合并含TL2-Fc的峰值級分并用PBS透析。實施例5-血管形成中的TIE受體/配體系統(tǒng)盡管TIE-2/TIE配體系統(tǒng)似乎在內(nèi)皮細胞生物學中起重要作用，但尚未顯示在血管形成的早期到中期(例如，成血管細胞或內(nèi)皮細胞增生和遷移，血管形成和在血管成型中的其它早期事件)發(fā)揮明顯的活性作用。與已知介導(dǎo)血管形成的這些方面的受體和因子相反，在血管形成過程中TIE-2和TL1表達在時間上較晚的情況表明該系統(tǒng)在晚期血管發(fā)育，包括新血管結(jié)構(gòu)和功能分化和穩(wěn)定中發(fā)揮明顯的作用。TIE-2/TL1的表達方式也與在維持結(jié)構(gòu)完整和/或形成的血管的生理學特征中的連續(xù)作用一致。
TIE配體2(TL2)似乎是TL1的競爭抑制劑。TL2表達的時空特性表明該單獨的抑制分子可能發(fā)揮對適當?shù)难馨l(fā)育或再成型(例如，允許從現(xiàn)存的血管形成新血管的成熟內(nèi)皮細胞的去穩(wěn)定/去分化，抑制不合適的血管形成，成熟血管的退化/衰退)所必需的多種環(huán)境依賴性作用)。圖2是血管形成中TIE-2/TIE配體的假定作用的示意圖。在該附圖中，TL1由(·)表示，TL2由(*)表示，TIE-2由(T)表示，VEGF由(□)表示，flk-1(VEGF受體)由(Y)表示。實施例6-Cys-TL1突變體的構(gòu)建和鑒定TIE-2配體具有2個主要的結(jié)構(gòu)域，一個描述為“螺旋圈”結(jié)構(gòu)域，含有該蛋白質(zhì)的合適的C端三級結(jié)構(gòu)，另一個為“纖維蛋白原樣”結(jié)構(gòu)域，含有該蛋白質(zhì)的接近N-末端的兩個三級結(jié)構(gòu)。盡管稱為TL1和TL2的TIE-2配體具有相似的結(jié)構(gòu)同源性，但它們表現(xiàn)出不同的物理和生物學特性。在非還原電泳條件下，兩種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出共價多聚體結(jié)構(gòu)，其中TL1主要表現(xiàn)為三聚體，TL2主要表現(xiàn)為二聚體。圖3是TIE-2配體如何相互作用形成多聚體的示意圖。至于生物學活性，經(jīng)過在表達TIE-2的細胞中誘導(dǎo)磷酸化證實TL1表現(xiàn)為TIE-2受體的激動劑。另一方面TL2似乎是TL1的競爭性抑制劑。對何種因素負責該兩種分子的不同物理和生物學特性的研究表明在TL1纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域前存在半胱氨酸(CYS 265)而在TL2中沒有。TL1中的CYS 265殘基由TGC編碼且位于大約在螺旋圈和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域之間的大約核苷酸1102-1104處。由于半胱氨酸殘基一般涉及二硫鍵形成，因此其存在可能有助于分子的三級結(jié)構(gòu)和生物學特性，據(jù)認為在TL1中存在CYS 265也許至少部分負責兩種分子的不同特性。為了試驗該假設(shè)，構(gòu)建了一種表達質(zhì)粒，它含有突變的TL1，其中用不形成二硫鍵的氨基酸代替CYS。除了這種TL1/CYS-突變體外，還構(gòu)建了第二種表達質(zhì)粒，它在TL2的相應(yīng)位置突變使該殘基變?yōu)榘腚装彼?。將TL1和TL2的非突變和突變的表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染進COS細胞。收獲含重組蛋白質(zhì)的細胞上清并對樣品進行還原和非還原的SDS/PAGE電泳并隨后進行Western印跡。未突變的和突變的TL1和TL2蛋白質(zhì)的Western印跡表明TL1/CYS-突變體行為更象TL2，其以二聚體形式遷移，TL2/CYS+突變體行為更象TL1，它能形成三聚體及更高級的多聚體。令人感興趣的是，當在表達TIE-2的細胞中試驗兩種突變蛋白質(zhì)誘導(dǎo)磷酸化的能力時，TL1/CYS-突變體能激活TIE-2受體，而TL2/CYS+突變體不能得到任何激活活性。實施例7-構(gòu)建并鑒定僅含纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的突變體為了試驗TIE-2配體的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域(F-結(jié)構(gòu)域)是否含有TIE-2激活活性，構(gòu)建去掉螺旋圈結(jié)構(gòu)域，僅制編碼F-結(jié)構(gòu)域的部分DNA序列(開始于大約核苷酸1159，氨基酸殘基ARG 284)的表達質(zhì)粒。將該突變構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染進COS細胞。收獲含重組蛋白的上清。試驗TL1/F-結(jié)構(gòu)域突變體結(jié)合TIE-2受體的能力。結(jié)果表明，作為單體，TL1/F-結(jié)構(gòu)域突變體在可檢測水平上不能結(jié)合TIE-2。然而，當TL1/F-結(jié)構(gòu)域單體用myc標記并隨后用針對myc標記的抗體聚集時，它表現(xiàn)出可檢測到的與TIE-2的結(jié)合。然而，抗體聚集的TL1/F-結(jié)構(gòu)域突變體在表達TIE-2的細胞系中不能誘導(dǎo)磷酸化。圖3顯示了F-結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體的示意圖及其在經(jīng)過和不經(jīng)過抗體聚集時的結(jié)合能實施例8-受體融合體結(jié)合試驗及配體結(jié)合和競爭試驗用2種任選的方式進行定量無細胞結(jié)合試驗以檢測TIE-2受體融合體結(jié)合或配體結(jié)合及競爭。在受體融合體結(jié)合型試驗中，將TIE-2配體(純化的或部分純化的TL1或TL2)覆蓋到ELISA平板上。然后加入不同濃度的受體融合體，它以劑量依賴性方式結(jié)合固定配體。在2小時末，洗去剩余的受體融合體，然后使用堿性磷酸酶標記的特異性抗-人Fc抗體報道結(jié)合在平板上的量。洗去剩余的報道抗體，然后使用有色底物進行AP反應(yīng)。使用分光光度計定量該試驗。圖4顯示了典型的TIE-2-IgG結(jié)合曲線。使用該測定評價注射進大鼠和小鼠后TIE-2-IgG的完整性。該試驗也可以這一方式用作配體競爭試驗，其中，純化的或部分純化的TIE配體與受體融合體的固著配體競爭。在該結(jié)合試驗的配體結(jié)合和競爭形式中，將TIE-2胞外結(jié)構(gòu)域覆蓋到ELISA平板上。然后將TIE配體的Fc-標記的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域片段(TL1-fFc和TL2-fFc)結(jié)合到胞外結(jié)構(gòu)域上并按上述使用相同抗人Fc抗體檢測。圖5顯示了結(jié)合TIE-2胞外結(jié)構(gòu)域的TL1-fFc的例子。該試驗方式也可用于血清或其它樣品中TL1-fFc的定量水平。如果未標記的配體(同樣可以是純化的或未純化的)與TL1-fFc同時加入，那么在標記的配體片段與全長配體間形成競爭。全長配體可代替Fc-標記的片段并繪制了競爭曲線。實施例9-EA.hy926細胞系可用作TIE配體活性的報道細胞系EA.hy 926是經(jīng)過融合HUVEC與來自人肺癌的細胞系A(chǔ)549建立的細胞雜交系[Edgell等，美國國家科學院院刊，80,3734-3737(1983)]。已發(fā)現(xiàn)EA.hy 926細胞表達明顯水平的具有低堿性磷酸酪氨酸水平的TIE-2受體蛋白質(zhì)。在其用于受體測定前傳代EA.hy 926細胞的密度以及在測定時其匯合程度可影響TIE-2受體豐度及與配體處理反應(yīng)的相對誘導(dǎo)力。經(jīng)過采用下面的方案生長細胞可將EA.hy 926細胞系用作測定TIE-2配體活性的可依賴的系統(tǒng)。
EA.hy 926細胞在T-75瓶(Falconware)中以1.5×106個細胞接種，并隔天用高葡萄糖Dulbecco′s MEM，10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素-鏈霉素和1×次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT，Gibco/BRL)更新培養(yǎng)基。生長3至4天后，將細胞以每T-75瓶1.5×106個細胞再次傳代一次并再培養(yǎng)3到4天。對于磷酸化試驗，經(jīng)過用高葡萄糖DMEM代替培養(yǎng)基并在37℃培養(yǎng)2-3小時血清饑餓按上述制備的細胞。從瓶中吸出該培養(yǎng)基并以1.5ml的總體積向瓶中加入條件培養(yǎng)基樣品或純化的配體，隨后在37℃培養(yǎng)5分鐘。從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶并放置于冰床上。去掉培養(yǎng)基并用1.25ml含1％乙基苯基聚乙二醇，0.5％脫氧膽酸鈉，在20mM Tris,pH7.6中的0.1％SDS,150mMNaCl,50mM NaF,1mM原釩酸鈉，5mM芐脒，和含蛋白酶抑制劑PMSF，抑酶肽和亮抑蛋白酶肽的1mM EDTA的裂解緩沖液代替。在冰上使膜溶解10分鐘后，刮下平板并經(jīng)過4℃以頂級速度微量離心10分鐘澄清細胞溶解產(chǎn)物。經(jīng)過用抗-TIE-2多克隆抗血清和蛋白質(zhì)G-連接的瓊脂糖珠冷培養(yǎng)從澄清上清中免疫沉淀TIE-2受體。用冷細胞溶解緩沖液洗滌珠3次并在Laemmli樣品緩沖液中煮沸5分鐘，然后上樣到7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。將分辨出的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF(Lamblia-P)膜上，然后使用抗磷酸酪氨酸抗體和ECL試劑對其進行Western印跡。隨后經(jīng)過去掉抗磷酸酪氨酸抗體并用對TIE-2胞外結(jié)構(gòu)域特異性的多克隆抗血清再培養(yǎng)對相同印跡上的總TIE-2蛋白質(zhì)水平進行比較。實施例10-分離和測序編碼哺乳動物TIE配體-3的全長cDNA克隆經(jīng)過用相應(yīng)于該基因全長編碼序列的小鼠TL1或小鼠TL2探針雜交文庫拷貝從小鼠BAC基因組文庫(Research Genetics)克隆TIE配體-3(TL3)。使用磷酸緩沖液在55℃雜交各文庫拷貝過夜。雜交后，用2×SSC,0.1％SDS在60℃洗滌濾膜，隨后用X射線膠片曝光濾膜。鑒定相應(yīng)于小鼠TL1和小鼠TL2的強雜交信號。另外，鑒定了與小鼠TL1和小鼠TL2微弱雜交的信號。純化相應(yīng)于這些克隆的DNA，然后用限制性酶消化，將與原始探針雜交的兩個片段亞克隆進細菌質(zhì)粒并測序。該片段的序列含與小鼠TL1和小鼠TL2均同源的兩個外顯子。對這些序列特異性的引物用作鑒定含相應(yīng)于TL3的轉(zhuǎn)錄子的組織的PCR引物。在N gt-11的小鼠子宮cDNA文庫(Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)中鑒定相當于TL3的PCR帶。
以1.25×106/20×20cm平板的密度涂布噬斑并按標準方法取復(fù)制濾膜(Sambrook等，分子克隆，實驗手冊，第2版，第8.46頁，冷泉港實驗室，紐約冷泉港)。在“正?！眹栏?2×SSC,65℃)條件下用針對小鼠TL3序列制備的200bp PCR放射活性探針篩選復(fù)制濾膜。雜交在含0.5mg/ml魚精DNA的溶液中65℃下進行。濾膜在2×SSC中65℃下洗滌并對X射線膠片曝光6小時。挑出在復(fù)制膜中雜交的2個陽性克隆。EcoRⅠ消化從這些克隆獲得的噬菌體DNA顯示出具有插入大小約1.2kb和大約2.2kb的兩個獨立的克隆。將2.2kb EcoRⅠ插入片段亞克隆進pBluescript KS(Stratagene)的EcoRⅠ位點。序列分析表明較長的克隆缺乏起動子甲硫氨酸和信號肽，但編碼同源于小鼠TL1和小鼠TL2的探針。
然后，合成兩個TL3-特異性PCR引物如下US2:cctctgggctcgccagtttgttaggUS1:ccagctggcagatatcagg使用來自小鼠細胞系C2C12ras和MG87的表達文庫進行下列PCR反應(yīng)。在一級PCR反應(yīng)中，使用特異性引物US2與載體特異性寡聚體結(jié)合以允許以任一方向擴增。PCR使用94℃，1分鐘；42℃或48℃1分鐘；72℃1分鐘循環(huán)35次在100ml的總體積中進行。二級PCR反應(yīng)包括二級特異性引物US1(它包含于一級PCR產(chǎn)物中)與相同的載體寡聚體結(jié)合。二級反應(yīng)使用前述相同的溫度和時間循環(huán)30次。凝膠分離PCR產(chǎn)物并進行序列分析。根據(jù)使用2個不同的cDNA文庫從總共4個獨立的PCR反應(yīng)獲得的序列推斷TL3序列的5′端。Northern分析表明在小鼠胎盤中有中等到低等水平的小鼠TL3轉(zhuǎn)錄子。小鼠TL3的表達由大約3kb的轉(zhuǎn)錄子組成。全長TL3編碼序列在圖6A-6B中表示。
然后可使用小鼠TL3序列經(jīng)過用相應(yīng)于以前所述，例如，在1996年10月10日公開的國際公開號WO 96/31598的實施例8中，小鼠TL3的探針雜交人基因組或cDNA文庫可獲得含有其人配偶體編碼序列的人克隆。實施例11-分離編碼人TIE配體-4的全長基因組克隆經(jīng)過用相應(yīng)于TL1完整纖維蛋白原編碼序列(核苷酸1153至1806)的人TL1放射活性探針或相應(yīng)于小鼠TL3纖維蛋白原區(qū)域186核苷酸片段(圖6A-6B的核苷酸1307至1492)的小鼠TL3放射活性探針雜交文庫復(fù)制膜從小鼠BAC基因組文庫(BAC HUMAN(Ⅱ)，基因組系統(tǒng)公司)克隆TIE配體-4(TL4)。使用精確的寡核苷酸和標準PCR條件標記各探針，除了用P32dCTP代替dCTP外。然后將PCR混合物通過凝膠過濾柱以便從游離的P32dCTP分離該探針。使用標準雜交條件用磷酸緩沖液和放射活性探針在55℃雜交各文庫拷貝過夜，用2×SSC,0.1％SDS在55℃洗滌濾膜，隨后對X射線膠片曝光。觀察到相應(yīng)于人TL1的強雜交信號。另外，鑒定出與人TL1和TL3均微弱雜交的信號。使用標準程序純化相應(yīng)于這些克隆的DNA，然后用限制性酶消化，將與原始探針雜交的一個片段亞克隆進細菌質(zhì)粒并測序。片段的序列含有與人TL1和小鼠TL3及TIE配體家族的其它成員均同源的一個外顯子。對這些序列特異性的引物可用作鑒定含相應(yīng)于TL4轉(zhuǎn)錄子的組織的PCR引物。
經(jīng)過測序包含于保藏的細菌細胞中的全長BAC克隆可獲得人TL4的完整序列。以同源于TIE配體家族的已知成員，如TL1,TL2和TL3可鑒定外顯子。然后，經(jīng)過將TL4基因組克隆的外顯子剪接在一起可測定TL4的完整編碼序列，隨后，后者可用于產(chǎn)生TL4蛋白質(zhì)。另外，該外顯子可用作探針以獲得全長cDNA克隆，然后可用后者生產(chǎn)TL4蛋白質(zhì)。也可經(jīng)過與諸如纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域，螺旋圈結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或諸如信號肽序列的蛋白質(zhì)信號的同源性從BAC克隆序列鑒定外顯子。經(jīng)過鑒定連續(xù)的BAC克隆，例如，經(jīng)過使用保藏的BAC克隆兩端作探針篩選諸如本文所用的人基因組文庫，經(jīng)過使用包含于BAC克隆中的外顯子序列篩選cDNA文庫，或經(jīng)過使用根據(jù)TL4外顯子序列的寡核苷酸引物進行5′或3′RACE程序可獲得從BAC克隆丟失的外顯子。鑒定另外的TIE配體家族成員在對TIE配體家族的其它成員的合理研究中可使用新TIE配體-4序列，其中使用利用已知家族成員間存在強同源性的保守片段的方案。例如，TIE配體氨基酸序列的序列對比顯示了一些保守序列區(qū)域(見圖7中下劃線的區(qū)域)。
可使用基本上根據(jù)這些盒中的簡并寡核苷酸結(jié)合以前已知的或新的TIE配體同源性片段鑒定新的TIE配體。
TL1,TL2和TL3之間的高度保守區(qū)域可用于設(shè)計簡并的寡核苷酸引物，用該引物引發(fā)使用cDNA的PCR反應(yīng)。使用寡聚d(T)或其它合適的引物經(jīng)組織RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA模板。然后將PCR反應(yīng)的等分試樣在瓊脂糖凝膠上進行電泳。所得的擴增的DNA片段可經(jīng)過插入質(zhì)粒進行克隆，測序并將該DNA序列與全部已知的TIE配體進行比較。
從這些PCR反應(yīng)選定大小擴增的DNA片段可克隆進質(zhì)粒，經(jīng)電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌，并將轉(zhuǎn)化子涂布在選擇瓊脂上。經(jīng)過測序以標準質(zhì)粒方法純化的質(zhì)粒DNA可分析PCR轉(zhuǎn)化的細菌菌落。
含新TIE配體片段的克隆片段可用作雜交探針以獲得cDNA文庫的全長cDNA克隆。例如，人TL4基因組序列可用于經(jīng)過用相應(yīng)于前面所述的人TL4的探針雜交人cDNA文庫獲得含人TL4完整編碼序列的人cDNA克隆。實施例12-克隆hTL4的全長編碼序列經(jīng)過限制性酶消化，Southern印跡并將hTL-4克隆與小鼠TL3編碼序列雜交，隨后亞克隆和測序雜交片段可獲得編碼人TIE配體-4的基因組人TL-4克隆(hTL-4ATCC保藏號98095)的5′和3′編碼序列。相應(yīng)于hTL4的N-端和C-端氨基酸的編碼序列可用于設(shè)計PCR引物(下面顯示)，隨后該引物用于以人卵巢cDNA進行TL4的PCR擴增。經(jīng)過使用ABI 373A DNA測序儀和Taq雙氧脫末端循環(huán)測序試劑盒(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster City,CA)進行DNA測序可鑒定相應(yīng)于人TL4的PCR帶。然后將PCR帶亞克隆進載體pCR-script并經(jīng)測序分析一些質(zhì)?？寺?。然后編輯完整的人TL4編碼序列且在圖8A-8C中顯示。在本發(fā)明的另一實施方案中，569位的核苷酸從A變?yōu)镚，導(dǎo)致氨基酸從Q變?yōu)镽。
上述使用的PCR引物設(shè)計如下hTL4atg 5′-gcatgctatctcgagccaccATGCTCTCCCAGCTAGCCATGCTGCAG-3′hTL4not 5′-gtgtcgacgcggccgctctagatcagacTTAGATGTCCAAAGGCCGTATCATCAT-3′小寫字母表示加到PCR引物上的“尾巴”序列以幫助克隆擴增的PCR片段。
保藏下面按布達佩斯條約在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Parklawn Drive12301,Rockville,Maryland 20852進行了保藏。編碼TIE-2受體融合體的重組苜銀紋夜蛾桿狀病毒于1994年10月7日保藏在ATCC，命名為“vTIE-2受體融合體”，ATCC保藏號VR 2484。含編碼人TIE配體-4的人TL-4基因插入片段的質(zhì)粒pBeLoBac11的大腸桿菌菌株DH10B于1996年7月2日保藏在ATCC，命名為“hTL-4”,ATCC保藏號為98095。
本發(fā)明范圍不受本文所述具體實施方案的限制。事實上，除了上文所述外，對本發(fā)明的各種修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言從上面說明書和附圖來看是顯而易見的。這些修改試圖落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種組合物，包括基本上不含其它蛋白質(zhì)的TIE配體。
2．一種分離的編碼TIE配體的核酸分子。
3．一種分離的編碼TIE配體-3或TIE配體-4的核酸分子。
4．一種分離并純化的核酸分子，包括編碼人TIE配體-4的核苷酸序列，其中該核苷酸序列選自(a)包含圖8A-8C所列的人TIE配體-4編碼區(qū)的核苷酸序列；(b)包含圖8A-8C所列的人TIE配體-4纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的核苷酸序列；(c)在中等嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，且它編碼結(jié)合TIE受體的配體；(d)由于遺傳密碼的簡并性而不同于(a)，(b)或(c)的核苷酸序列且編碼結(jié)合TIE-2受體之TIE-2配體的核苷酸序列。
5．一種載體，包括權(quán)利要求4的核酸分子。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的載體，其中該核酸分子可操作地連接到在宿主細胞中能指導(dǎo)其表達的表達控制序列上。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的載體，它是一種質(zhì)粒。
8．一種分離的基本上不含其它蛋白質(zhì)的TIE配體-4。
9．由根據(jù)權(quán)利要求4的核酸分子編碼的分離的TIE配體-4。
10．用于生產(chǎn)人TIE配體-4的宿主載體系統(tǒng)，包括在宿主細胞中的根據(jù)權(quán)利要求6的載體。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的宿主載體系統(tǒng)，其中宿主細胞是細菌、酵母，昆蟲或哺乳動物細胞。
12．一種宿主載體系統(tǒng)，包括權(quán)利要求10的宿主載體系統(tǒng)和編碼TIE受體的核酸。
13．生產(chǎn)TIE配體-4的方法，包括在允許TIE配體-4生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11的宿主-載體系統(tǒng)的細胞并回收所產(chǎn)生的TIE配體-4。
14．一種與權(quán)利要求9的配體特異性結(jié)合的抗體。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的抗體，它是一種單克隆抗體。
16．一種特異性地結(jié)合權(quán)利要求9的配體的受體融合體(receptorbody)。
17．包含與細胞毒劑連接的根據(jù)權(quán)利要求8的配體的偶聯(lián)物。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中細胞毒劑是放射性同位素或毒素。
19．一種藥用組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求9的配體和藥用上可接受的載體。
20．一種藥用組合物，包括權(quán)利要求14的抗體和藥用上可接受的載體。
21．一種藥用組合物，包括權(quán)利要求16的受體融合體和藥用上可接受的載體。
22．一種藥用組合物，包括權(quán)利要求17的偶聯(lián)物和藥用上可接受的載體。
23．一種分離并純化的核酸分子，包括編碼哺乳動物TIE配體-3的核苷酸序列，其中該核苷酸序列選自(a)包含圖6A-6B所列的TIE配體-3編碼區(qū)的核苷酸序列；(b)包含圖6A-6B所列的TIE配體-3纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的核苷酸序列；(c)在中等嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，且它編碼結(jié)合TIE受體的配體；和(d)除了遺傳密碼的簡并性外能與(a),(b)或(c)的核苷酸序列雜交且編碼結(jié)合TIE受體之配體的核苷酸序列。
24．包括權(quán)利要求23的核酸分子的載體。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的載體，其中該核酸分子可操作地連接到在宿主細胞中能指導(dǎo)其表達的表達控制序列上。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的載體，它是一種質(zhì)粒。
27．一種分離的基本上不含其它蛋白質(zhì)的TIE配體-3。
28．分離的由根據(jù)權(quán)利要求23的核酸分子編碼的TIE配體-3。
29．用于生產(chǎn)哺乳動物TIE配體-3的宿主-載體系統(tǒng)，包括在宿主細胞中的權(quán)利要求25的載體。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的宿主載體系統(tǒng)，其中宿主細胞是細菌、酵母，昆蟲或哺乳動物細胞。
31．一種宿主載體系統(tǒng)，包括權(quán)利要求29的宿主載體系統(tǒng)和編碼TIE受體的核酸。
32．生產(chǎn)TIE配體-3的方法，包括在允許TIE配體-3生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求30的宿主-載體系統(tǒng)的細胞并回收所產(chǎn)生的TIE配體-3。
33．一種與權(quán)利要求28的配體特異性結(jié)合的抗體。
34．根據(jù)權(quán)利要求33的抗體，它是一種單克隆抗體。
35．一種特異性地結(jié)合權(quán)利要求28的配體的受體融合體(receptorbody)。
36．包含與細胞毒劑連接的根據(jù)權(quán)利要求28的配體的偶聯(lián)物。
37．根據(jù)權(quán)利要求36的偶聯(lián)物，其中細胞毒劑是放射性同位素或毒素。
38．一種藥用組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求28的配體和藥用上可接受的載體。
39．一種藥用組合物，包括權(quán)利要求33的抗體和藥用上可接受的載體。
40．一種藥用組合物，包括權(quán)利要求35的受體融合體和藥用上可接受的載體。
41．一種藥用組合物，包括權(quán)利要求36的偶聯(lián)物和藥用上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的編碼TIE配體家族成員的核酸分子。本發(fā)明還提供了編碼TIE配體－3或TIE配體－4的分離的核酸分子。另外，本發(fā)明提供了一種特異性地結(jié)合TIE配體－3或TIE配體－4的受體。本發(fā)明還提供了特異性地結(jié)合TIE配體－3或TIE配體－4的抗體。本發(fā)明進一步提供了TIE的拮抗劑。本發(fā)明還提供了治療組合物以及阻止血管生長的方法，促進新血管形成的方法，促進表達TIE受體的細胞生長或分化的方法，阻止表達TIE受體的細胞生長或分化的方法及減弱或抑制人腫瘤生長的方法。
文檔編號A61K51/00GK1227603SQ97197208
公開日1999年9月1日 申請日期1997年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月19日
發(fā)明者D·M·巴倫蘇埃拉, P·F·瓊斯, G·D·揚科波烏洛斯 申請人:里珍納龍藥品有限公司