專利名稱：角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子－2(kgf－2或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子－12,fgf－12)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸，由這種多核苷酸編碼的多肽，這種多核苷酸和多肽的用途，以及這種多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明的多肽是一種角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子，下文中有時(shí)也稱之為“KGF-2”，以前也稱之為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子12(FGF-12)。本發(fā)明也涉及抑制這種多肽的作用。本發(fā)明另外還涉及KGF-2促進(jìn)或加快創(chuàng)傷愈合的治療用途。本發(fā)明也涉及KGF-2的新的突變體形式，所述突變體形式顯示出活性增強(qiáng)，穩(wěn)定性增加，產(chǎn)量更高或溶解性更好。另外，本發(fā)明涉及純化KGF-2多肽的方法。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族為涉及軟組織生長(zhǎng)和再生的生長(zhǎng)因子大家族。目前，它包括幾個(gè)在蛋白質(zhì)水平上同源性程度不同的成員，除其中的一個(gè)外，似乎都具有類似的寬的促細(xì)胞分裂譜，即它們能夠促進(jìn)多種來自中胚層和神經(jīng)外胚層之細(xì)胞的增殖和/或促進(jìn)血管生成。
從發(fā)育一些階段極端受限的表達(dá)，到與之相反的多個(gè)組織和器官中的遍在表達(dá)，該家族不同成員的表達(dá)模式非常不同。所有的成員似乎都與肝素和硫酸肝素蛋白聚糖和糖胺聚糖結(jié)合，并高度集中于胞外基質(zhì)內(nèi)。起初，通過序列同源性或因子純化和克隆，將KGF鑒定為FGF家族的成員。角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)作為經(jīng)培養(yǎng)的鼠角質(zhì)形成細(xì)胞系的促分裂原被分離(Rubin,J.S.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86:802-806(1989))。與FGF家族的其它成員不同的是它對(duì)間充質(zhì)衍生的細(xì)胞沒什么活性，但可刺激上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因編碼一種具194個(gè)氨基酸的多肽(Finch,P.W.等，科學(xué)，245:752-755(1989))。N-末端的64個(gè)氨基酸是獨(dú)特的，但該蛋白質(zhì)的其余部分與bFGF約有30％的同源性。KGF是FGF家族中最與眾不同的成員。該分子具有疏水性的信號(hào)序列并能有效地分泌。翻譯后修飾包括信號(hào)序列的切割和在一個(gè)位點(diǎn)的N-連接的糖基化，產(chǎn)生了一種28KDa的蛋白質(zhì)。角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子由來源于皮膚和胎兒肺的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生(Rubin等，(1989))。已發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子的mRNA可在成人腎臟，結(jié)腸和髂骨中表達(dá)，但不能在腦或肺中表達(dá)(Finch,P.W.等，科學(xué)，245:752-755(1989))。KGF在FGF蛋白質(zhì)家族內(nèi)呈現(xiàn)出保守區(qū)域，KGF以高親和力與FGF-2受體結(jié)合。
創(chuàng)傷愈合受損是重要的發(fā)病源，可導(dǎo)致如裂開，吻合崩潰和創(chuàng)傷久治不愈的并發(fā)癥。在正常的個(gè)體中，不難達(dá)到愈合創(chuàng)傷的目的。與之形成對(duì)照的是，愈合受損與如糖尿病，感染，免疫抑制，肥胖和營養(yǎng)不良的幾種疾病有關(guān)(Cruse,P.J.和Foord,R.，外科文獻(xiàn)(Arch.Surg),107:206(1973)；Schrock,T.R等，外科紀(jì)事(Ann.Surg),177:513(1973)；Poole,G.U.,Jr.，外科學(xué)，97:631(1985)；Irvin,G.L等，美國外科學(xué)，51:418(1985))。
創(chuàng)傷修復(fù)是復(fù)雜的相互作用和生物學(xué)過程的結(jié)果。已描述了正常創(chuàng)傷愈合的3個(gè)階段急性炎癥期，胞外基質(zhì)與膠原的合成，和重建(Peacock,E.E.,Jr.，創(chuàng)傷修復(fù)，第2版，WB Saunders,Philadelphia(1984))。所述過程涉及角質(zhì)形成細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞在受傷位點(diǎn)的相互作用。
組織再生似乎受特異性肽因子的控制，所述肽因子調(diào)節(jié)與修復(fù)過程有關(guān)的細(xì)胞的遷移和增殖(Barrett,T.B等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，81:6772-6774(1985)；Collins,T.等，自然，316:748-750(1985))，因此，生長(zhǎng)因子在治療創(chuàng)傷，燒傷和其它皮膚病中是有希望的治療劑(Rifkin,D.B.和Moscatelli，細(xì)胞生物學(xué)雜志，109:1-6(1989)；Sporn,M.B.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，105:1039-1045(1987)；Pierce,G.F.等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志，45:319-326(1991))。在急性炎癥過程中，臨時(shí)組織的沉積啟動(dòng)了愈合過程的順序，緊接其后的是上皮重新形成，膠原合成并沉積，成纖維細(xì)胞增殖和新血管形成，它們最終確定了模型重建階段(Clark,R.A.F,J.Am.Acad.Dermatol,13:701(1985))。這些事件受生長(zhǎng)因子和炎性細(xì)胞或位于創(chuàng)傷邊緣的細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子影響(Assoian,R.K等，自然(Lond.)309:804(1984)；Nemeth,G.G等，“生長(zhǎng)因子及其對(duì)創(chuàng)傷和骨折愈合的作用”，生長(zhǎng)因子和創(chuàng)傷愈合的其它方面在生物學(xué)和臨床上的意義，紐約(1988),p1-17)。
已鑒定出幾個(gè)與創(chuàng)傷愈合有關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子，包括角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)(Antioniades,H等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，88:565(1991))，衍生于血小板的生長(zhǎng)因子(PDGF)(Antioniades,H等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，88:565(1991)；Staiano-Coico,L等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，178:865-878(1993))，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Golden,M.A等，臨床研究雜志，87:406(1991))，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)(Mellin,T.N等，臨床皮膚病學(xué)雜志(J.Invest.Dermatol),104:850-855(1995))，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Whitby,D.J和Ferguson,W.J.，發(fā)育生物學(xué)，147:207(1991))，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)(Gartner,M.H等，Surg.Forum,42:643(1991)；Todd,R等，美國病理學(xué)雜志，138:1307(1991))，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)(Wong,D.T.W等，臨床研究雜志，143:622(1987)),neu分化因子(rNDF)(Danilenko,D.M等，臨床研究雜志，95:842-851(1995))，胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)(Cromack,D.T等，外科研究雜志，42:622(1987))。
已報(bào)道說皮膚中的rKGF-1會(huì)刺激表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，毛囊和皮脂腺內(nèi)的角質(zhì)形成細(xì)胞(Pierce,G-F等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，179:831-840(1994))。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的核酸分子，所述核酸分子含有編碼角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF-2)的多核苷酸，該生長(zhǎng)因子具有

圖1所示的氨基酸序列[SEQ ID NO:2]或由1994年12月16日保藏的保藏號(hào)為ATCC75977的細(xì)菌宿主中保藏的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。通過測(cè)定經(jīng)保藏的KGF-2克隆的序列確定的核苷酸序列示于圖1[SEQ IDNO:1]，該序列含有編碼208個(gè)氨基酸殘基的多肽的一個(gè)開放閱讀框，其中包括第1-3位的起始密碼子，預(yù)測(cè)前導(dǎo)序列約為35或36個(gè)氨基酸殘基，推定其分子量約為23.4kDa。成熟的KGF-2氨基酸序列示于圖1，為約36或37至208位[SEQ ID NO:2]的氨基酸殘基。
本發(fā)明的多肽被推測(cè)鑒定為FGF家族的成員，更具體地，由于其氨基酸序列與FGF家族其它成員的同源性，將所述多肽推測(cè)鑒定為KGF-2。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了新的成熟的多肽KGF-2，及其具有生物活性的、在診斷或治療上有用的片段，類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽來源于人。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了編碼人KGF-2的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA及其反義類似物，以及具有生物活性的、在診斷或治療上有用的片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法，所述重組技術(shù)為使用重組載體，如在重組生產(chǎn)KGF-2蛋白中可用作試劑的克隆和表達(dá)質(zhì)粒，以及含有人KGF-2核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了將這種多肽，或編碼這種多肽的多核苷酸用作治療目的的方法，例如用于刺激上皮細(xì)胞增殖和基底的角質(zhì)形成細(xì)胞以使創(chuàng)傷愈合，刺激毛囊產(chǎn)生和皮傷愈合。KGF-2可臨床用于刺激創(chuàng)傷愈合，所述創(chuàng)傷包括外科傷口，切除術(shù)的傷口，涉及真皮和表皮損傷的深層創(chuàng)傷，眼組織創(chuàng)傷，牙組織創(chuàng)傷，口腔創(chuàng)傷，糖尿病潰瘍，皮膚潰瘍，肘潰瘍，動(dòng)脈潰瘍，靜脈停滯潰瘍，因熱暴露或化合物引起的灼傷，和其它不正常的創(chuàng)傷愈合疾病，如尿毒癥，營養(yǎng)不良，維生素缺乏癥和與用類固醇，放射療法和抗腫瘤藥物和抗代謝物全身性治療相關(guān)的并發(fā)癥。KGF-2可被用來促進(jìn)皮損失后的皮重建。
KGF-2可被用來增加皮膚移植物與創(chuàng)傷床的粘附性，并刺激創(chuàng)傷床處重新形成上皮。下文列出了可使用KGF-2增加其與創(chuàng)傷床的粘附性的移植物類型自體移植物，人工皮膚，同種移植物，自體真皮移植物，自體表皮移植物，無血管移植物，Blair-Brown移植物，骨移植物，胚胎期形成的移植物，皮膚移植物，延遲的移植物，真皮移植物，表皮移植物，筋膜移植物，全層皮(full thickness)移植片，異源移植物，異種移植物，同種移植物，增生性移植物，角膜薄層移植物，網(wǎng)眼移植物，粘膜移植物，Ollier-Thiersch移植物，網(wǎng)膜移植物，補(bǔ)片移植物，蒂移植物，全層角膜移植物，分層皮移植片，厚分層皮移植片?？墒褂肒GF-2促進(jìn)皮膚強(qiáng)度并改善老化皮膚的外觀。
據(jù)信KGF-2也可使肝細(xì)胞的增殖，和肺、乳房、胰腺、胃、小腸和大腸中的上皮細(xì)胞的增殖產(chǎn)生變化。KGF-2可促進(jìn)如皮脂細(xì)胞(sebocyte)，毛囊，肝細(xì)胞，Ⅱ型肺細(xì)胞，產(chǎn)生粘蛋白的杯狀細(xì)胞的上皮細(xì)胞，和其它上皮細(xì)胞以及皮膚，肺，肝臟和胃腸道中所含的它們的祖細(xì)胞的增殖。KGF-2可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞和基底的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。
也可使用KGF-2降低由放射，化學(xué)療法治療或病毒感染引起的腸毒性副作用。KGF-2對(duì)小腸粘膜具有細(xì)胞保護(hù)性作用。KGF-2也可刺激由化學(xué)療法和病毒感染引起的粘膜炎(口腔潰瘍)的愈合。
KGF-2也可用于對(duì)包括燒傷(即毛囊，汗腺和皮脂腺的重新分群)的全部和部分厚度的皮膚缺陷的完全再生，和對(duì)如牛皮癬的其它皮膚缺陷的治療。KGF-2通過加速損害部位重新形成上皮也可用于治療大皰性表皮松解，該病是上皮與其下面的真皮的粘附性缺陷，可導(dǎo)致經(jīng)常性的、破潰的和疼痛的水皰。KGF-2也可用于治療胃和十二指腸潰瘍，并通過在粘膜襯里處形成疤痕和使腺粘膜和十二指腸粘膜襯里更快速地再生而幫助潰瘍處愈合。如Crohn’s病和潰瘍性結(jié)腸炎的炎性腸疾病分別是導(dǎo)致小腸或大腸粘膜表面被破壞的疾病。因此，KGF-2也可用于促進(jìn)粘膜表面重新形成表面，從而有助于更快速地愈合并阻止炎性腸疾病的進(jìn)程。預(yù)期KGF-2治療對(duì)整個(gè)胃腸道的粘膜產(chǎn)生具有顯著的作用，可用來保護(hù)腸粘膜使之遠(yuǎn)離被攝入的或外科手術(shù)后的有害物質(zhì)。KGF-2也可用于治療與KGF-2的表達(dá)不足有關(guān)的疾病。
另外，KGF-2也可用于預(yù)防和治愈因多種病理學(xué)狀態(tài)引起的對(duì)肺的損傷。如KGF-2這樣的生長(zhǎng)因子可刺激增殖和分化，并促進(jìn)肺泡和細(xì)支氣管上皮的修復(fù)以預(yù)防或治療急性或慢性肺損傷。例如，KGF-2可有效地治療導(dǎo)致肺泡漸進(jìn)損失的肺氣腫，和由吸煙和燒傷引起的可導(dǎo)致細(xì)支氣管上皮和肺泡壞死的吸入劑損傷。KGF-2也可用于刺激Ⅱ型肺細(xì)胞的增殖和分化，這有助于治療或預(yù)防如透明膜疾病之類的疾病，所述透明膜疾病如嬰兒呼吸窘迫綜合征和不成熟幼兒的支氣管肺發(fā)育不良。
KGF-2也可刺激肝細(xì)胞的增殖和分化，因此，KGF-2可用來緩解或治療肝臟疾病和如由肝硬變引起的暴發(fā)性肝臟疾病，由病毒性肝炎和毒性物質(zhì)(即撲熱息痛，四氯化碳和現(xiàn)有技術(shù)中已知的肝毒素)引起的肝損害的病理學(xué)。
另外，KGF-2也可用于治療或預(yù)防糖尿病的發(fā)作。在最近被診斷為Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病，仍維持有一些胰島細(xì)胞功能的病人中，可使用KGF-2維持胰島功能以緩解，延遲或防止疾病的永久現(xiàn)象。KGF-2也可被用作胰島細(xì)胞移植過程中的輔助物以改善或促進(jìn)胰島細(xì)胞的功能。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了抗這種多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了核酸探針，所述探針含有足夠長(zhǎng)以與人KGF-2序列特異性雜交的核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了可用作治療肽的KGF-2模擬肽，模擬的KGF-2肽是一些通過結(jié)合和激活KGF-2的同源受體從而模擬KGF-2蛋白生物活性的短肽。模擬的KGF-2肽也可結(jié)合并抑制KGF-2的同源受體。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了這種多肽的拮抗劑，使用所述拮抗劑可抑制這種多肽的作用，例如減少創(chuàng)傷愈合過程中的疤痕和預(yù)防和/或治療腫瘤增殖，糖尿病性視網(wǎng)膜病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎和腫瘤生長(zhǎng)。也可使用KGF-2拮抗劑治療與KGF-2過量表達(dá)有關(guān)的疾病。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于檢測(cè)與KGF-2核酸序列中的突變或由這種序列編碼的多肽的過量表達(dá)相關(guān)的疾病或?qū)λ黾膊〉囊赘行缘脑\斷試驗(yàn)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了將這種多肽，或編碼這種多肽的多核苷酸用于與科學(xué)研究，DNA合成和DNA載體的制備相關(guān)的體外目的的方法。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種分離的核酸分子，所述核酸分子含有具有選自下列的一種核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有圖1完整的氨基酸序列[SEQ ID NO:2]的KGF-2多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有圖1第36或37至208位的氨基酸序列[SEQ ID NO:2]的成熟KGF-2多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有由ATCC保藏號(hào)75977中所含cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列的KGF-2多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有由ATCC保藏號(hào)75977中所含cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的核苷酸序列；和(e)與上述(a),(b),(c)或(d)中任一個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括分離的核酸分子，所述核酸分子含有具有與上述(a),(b),(c),(d)或(e)中任一個(gè)核苷酸序列至少90％相同，更優(yōu)選至少95％,97％,98％或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸，或在嚴(yán)緊雜交條件下能與上述(a),(b),(c),(d)或(e)中的多核苷酸雜交的多核苷酸。雜交的此多核苷酸在嚴(yán)緊雜交條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。本發(fā)明其它的核酸實(shí)施方案涉及分離的核酸分子，所述核酸分子含有編碼具有上述(a),(b),(c)或(d)中一種氨基酸序列的KGF-2的攜有表位的部分的氨基酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明另外提供了分離的KGF-2多肽，所述多肽具有選自下列的氨基酸序列(a)具有圖1所示的完整的208個(gè)氨基酸的序列，包括前導(dǎo)序列的KGF-2多肽的氨基酸序列[SEQ ID NO:2]；(b)具有圖1第36或37至208位氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的氨基酸序列[SEQ IDNO:2](不具有前導(dǎo)序列)；(c)具有由ATCC保藏號(hào)75977中所含cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列，包括前導(dǎo)序列的KGF-2多肽的氨基酸序列；和(d)具有由ATCC保藏號(hào)75977中所含cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽也包括具有與上述(a),(b),(c)或(d)中所述氨基酸序列至少90％相似，更優(yōu)選至少95％相似的氨基酸序列的多肽，以及具有與上述氨基酸序列至少80％相同，更優(yōu)選至少90％相同，還要更優(yōu)選95％,97％,98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的另一發(fā)明涉及具有KGF-2多肽的攜有表位的部分的氨基酸序列的肽或多肽，所述KGF-2多肽具有上述(a),(b),(c)或(d)中的氨基酸序列。盡管本發(fā)明中也包括長(zhǎng)度直至和包含上述本發(fā)明多肽的整個(gè)氨基酸序列的任何長(zhǎng)度的攜有表位的多肽，但具有本發(fā)明KGF-2多肽的攜有表位的部分的氨基酸序列的肽或多肽包括具有至少6或7個(gè)，優(yōu)選至少9個(gè)，更優(yōu)選至少約30個(gè)氨基酸至約50個(gè)氨基酸的這類多肽的部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與具有上述(a),(b),(c)或(d)中的氨基酸序列的KGF-2多肽特異性結(jié)合的分離的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，描述了KGF-2的新的變體。通過缺失或取代KGF-2的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可產(chǎn)生這些變體。天然的突變被稱為等位基因變異。等位基因變異可以是沉默的(經(jīng)編碼的多肽沒有變化)，或可具有經(jīng)改變的氨基酸序列。為了嘗試改善或改變天然KGF-2的特征，可利用蛋白質(zhì)工程?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生新的多肽，突變蛋白和缺失突變體可顯示例如增強(qiáng)的活性或增加的穩(wěn)定性。另外，可以較高的得率純化它們，至少在某些純化和儲(chǔ)存條件下，它們顯示出較好的溶解性。
鑒于本文的教導(dǎo)，本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。
圖的簡(jiǎn)述下述諸圖闡明了本發(fā)明的實(shí)施方案，但并不意味著限制權(quán)利要求書中所包含的本發(fā)明的范圍。
圖1A-1C闡明了本發(fā)明多肽的cDNA和相應(yīng)的推定的氨基酸序列。起初的35或36個(gè)氨基酸殘基表示推定的前導(dǎo)序列(下劃線的)。使用了針對(duì)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫。當(dāng)嘗試測(cè)定多核苷酸序列時(shí)，測(cè)序的不準(zhǔn)確性是常見的難題。使用373型自動(dòng)化DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems公司)進(jìn)行測(cè)序，預(yù)測(cè)測(cè)序的準(zhǔn)確性大于97％準(zhǔn)確度[SEQ ID NO:1]。
圖2A-2D闡明了本發(fā)明多肽和其它成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的氨基酸序列的比較[SEQ ID NO:13-22]。
圖3A-3D顯示了KGF-2基因的全長(zhǎng)mRNA和氨基酸序列[SEQ IDNO:23和24]。
圖4A-4E顯示了KGF-2氨基酸序列的分析，顯示出α,β，轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)；親水性和疏水性；兩親性區(qū)域；柔性區(qū)域；抗原性指數(shù)和表面概率。在“抗原性指數(shù)-Jameson-Wolf”圖中，圖1中的氨基酸殘基41-109對(duì)應(yīng)于KGF-2蛋白顯示出高度抗原性的區(qū)域。疏水性區(qū)域(Hopp-Woods作圖)落在中位值線的下方(負(fù)值)，而發(fā)現(xiàn)親水性區(qū)域(Kyte-Doolittle作圖)位于中位值線的上方(正值，如氨基酸殘基41-109)。作圖針對(duì)的是全部208個(gè)氨基酸的ORF。
圖5顯示出有關(guān)KGF-2對(duì)糖尿病小鼠傷口閉合之作用的評(píng)價(jià)。受傷后立即測(cè)量創(chuàng)傷，并在連續(xù)5天中的每一天和第8天也測(cè)量創(chuàng)傷，使用下列公式來計(jì)算傷口閉合的百分比[第1天的面積]-[第8天的面積]/[第1天的面積]。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖6顯示出有關(guān)KGF-2對(duì)非糖尿病小鼠傷口閉合之作用的評(píng)價(jià)。受傷后立即測(cè)量創(chuàng)傷，并在連續(xù)5天中的每一天和第8天也測(cè)量創(chuàng)傷，使用下列公式計(jì)算傷口閉合的百分比[第1天的面積]-[第8天的面積]/[第1天的面積]。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖7顯示出糖尿病小鼠傷口閉合的時(shí)間進(jìn)程。受傷后立即測(cè)量創(chuàng)傷，并在連續(xù)5天中的每一天和第8天測(cè)量創(chuàng)傷，數(shù)值表示為總面積(mm2)。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖8顯示出非糖尿病小鼠傷口閉合的時(shí)間進(jìn)程。受傷后立即測(cè)量創(chuàng)傷，并在連續(xù)5天中的每一天和第8天也測(cè)量創(chuàng)傷，數(shù)值表示為總面積(mm2)。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖9顯示出有關(guān)KGF-2對(duì)糖尿病小鼠的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。評(píng)分由盲觀測(cè)者給出，使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖10顯示出有關(guān)KGF-2對(duì)非糖尿病小鼠的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，評(píng)分由盲觀測(cè)者給出，使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖11顯示出角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)糖尿病小鼠的作用。評(píng)分由盲觀測(cè)者給出。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖12顯示出角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)非糖尿病小鼠的作用。評(píng)分由盲觀測(cè)者給出。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖13顯示出皮膚增殖對(duì)糖尿病小鼠的作用。評(píng)分由盲觀測(cè)者給出，使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖14顯示出皮膚增殖對(duì)非糖尿病小鼠的作用。評(píng)分由盲觀測(cè)者給出。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM,n=5)。
圖15顯示出DNA序列和由pQE60-Cys37構(gòu)建體表達(dá)的蛋白質(zhì)。表達(dá)的KGF-2蛋白含有從第37位的半胱氨酸至第208位絲氨酸的序列，所述蛋白質(zhì)的N末端結(jié)合有6X(His)標(biāo)記物。
圖16顯示出甲基氫化潑尼松對(duì)大鼠傷口愈合的作用。在受傷的當(dāng)天用5mg甲基氫化潑尼松注射雄性SD成年大鼠(n=5)。動(dòng)物接受皮穿孔創(chuàng)傷(8mm)，連續(xù)5天每天用緩沖溶液或溶于50微升緩沖溶液中的KGF-2溶液治療上述大鼠。在第1-5天的每天和第8天用經(jīng)校準(zhǔn)的Jameson測(cè)徑器測(cè)量傷口，數(shù)值表示為第8天測(cè)量的結(jié)果(平均值+/-SEM)。
圖17顯示出KGF-2對(duì)傷口閉合的作用。雄性SD成年大鼠(n=5)接受皮穿孔創(chuàng)傷(8mm)，并在受傷的當(dāng)天接受5mg甲基氫化潑尼松注射。從受傷當(dāng)天開始，連續(xù)5天每天用緩沖溶液或溶于50微升緩沖溶液中的KGF-2溶液治療上述動(dòng)物。在第1-5天的每天和第8天測(cè)量傷口，使用下列公式來計(jì)算傷口閉合[第8天的面積]-[第1天的面積]/[第1天的面積]。第1天的面積測(cè)定為64mm2，此面積由皮穿孔造成。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM)。
圖18顯示出創(chuàng)傷愈合的糖皮質(zhì)激素?fù)p傷模型中創(chuàng)傷愈合的時(shí)間進(jìn)程。雄性SD成年大鼠(n=5)在第1天接受皮穿孔創(chuàng)傷(8mm)，并連續(xù)5天每天用緩沖溶液或溶于50微升緩沖溶液中的KGF-2溶液治療上述動(dòng)物。動(dòng)物在受傷當(dāng)天接受了5mg甲基氫化潑尼松注射。從受傷當(dāng)天開始，在第1-5天的每天和第8天用經(jīng)校準(zhǔn)的Jameson測(cè)徑器測(cè)量傷口。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM)。
圖19(A)顯示出受傷后第5天未用甲基氫化潑尼松注射的創(chuàng)傷愈合大鼠模型中KGF-2對(duì)傷口面積的作用。雄性SD成年大鼠(n=5)在第1天接受了皮穿孔創(chuàng)傷(8mm)，并在受傷當(dāng)天和其后連續(xù)5天每天用緩沖溶液或溶于50微升緩沖溶液中的KGF-2溶液治療上述動(dòng)物。每天用經(jīng)校準(zhǔn)的Jameson測(cè)徑器測(cè)量傷口，使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM)。(B)PDGF-BB和KGF-2在雄性SD大鼠(n=6)中的評(píng)分。所有大鼠接受了8mm的背部傷口和甲基氫化潑尼松(MP)(17mg/kg)來損害創(chuàng)傷愈合。每天用緩沖液或多種濃度的PDGF-BB和KGF-2治療傷口。在第2,4,6,8和10天使用經(jīng)校準(zhǔn)的Jameson測(cè)徑器測(cè)量傷口。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM)。*與緩沖液比較。**1微克PDGF-BB對(duì)1微克KGF-2/E3。
圖20顯示出在經(jīng)糖皮質(zhì)激素?fù)p傷的創(chuàng)傷愈合模型中KGF-2對(duì)傷口距離的作用。雄性SD成年大鼠(n=5)接受了皮穿孔創(chuàng)傷(8mm)，并在受傷當(dāng)天接受了17mg/kg甲基氫化潑尼松。在其后連續(xù)5天的每天和第8天用緩沖溶液或溶于50微升緩沖溶液中的KGF-2溶液治療上述動(dòng)物。在光學(xué)顯微鏡下用經(jīng)校準(zhǔn)的測(cè)微計(jì)測(cè)量傷口距離。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SEM)。
圖21(A)顯示了KGF-2對(duì)正常的原發(fā)性表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激。(B)顯示了KGF-2Δ33對(duì)正常的原發(fā)性表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激。(C)顯示了KGF-2Δ28對(duì)正常的原發(fā)性表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激。將正常的人原發(fā)性表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與多種濃度的KGF-2,KGF-2Δ33或KGF-2Δ28一起保溫3天，然后對(duì)所有3個(gè)實(shí)驗(yàn)加入alamarBlue 16小時(shí)，通過O.D.570nm和O.D.600nm之間的差異測(cè)定細(xì)胞由alamarBlue轉(zhuǎn)變成的紅色的強(qiáng)度。對(duì)于每種KGF-2蛋白而言，在相同的檢測(cè)板中包括含有完全的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(KGM)的陽性對(duì)照，和含有角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(KBM)的陰性對(duì)照。
圖22(A)顯示了被FGFR1b和FGFR2轉(zhuǎn)染的Baf3細(xì)胞中KGF-2和FGF7對(duì)胸苷摻入的刺激作用。測(cè)定了KGF-2(右邊的組)和FGF7(左邊的組)對(duì)被FGFR1ⅲb(空心圓圈)或FGFR2ⅲb/KGFR(實(shí)心圓圈)轉(zhuǎn)染的Baf3細(xì)胞增殖的作用。Y軸表示摻入Baf3細(xì)胞DNA中的[3H]胸苷的量(cpm),X軸表示在組織培養(yǎng)基中加入的KGF-2或FGF7的終濃度。(B)顯示了被FGFR2ⅲb轉(zhuǎn)染的Baf3細(xì)胞中KGF-2Δ33對(duì)胸苷摻入的刺激作用。(C)顯示了被FGFR2ⅲb轉(zhuǎn)染的Baf3細(xì)胞中KGF-2(白線)，KGF-2Δ33(黑線)和KGF-2Δ28(灰線)對(duì)胸苷摻入的刺激作用。
圖23顯示了大腸桿菌最優(yōu)化的全長(zhǎng)KGF-2的DNA和蛋白質(zhì)序列。
圖24A和B顯示了大腸桿菌最優(yōu)化的成熟KGF-2的DNA和蛋白質(zhì)序列。
圖25顯示了含有KGF-2氨基酸36至208位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖26顯示了含有KGF-2氨基酸63至208位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖27顯示了含有KGF-2氨基酸77至208位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖28顯示了含有KGF-2氨基酸93至208位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖29顯示了含有KGF-2氨基酸104至208位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖30顯示了含有KGF-2氨基酸123至208位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖31顯示了含有KGF-2氨基酸138至208位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖32顯示了含有KGF-2氨基酸36至153位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖33顯示了含有KGF-2氨基酸63至153位的KGF-2缺失構(gòu)建體的DNA和被編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖34顯示了KGF-2半胱氨酸-37至絲氨酸的突變體構(gòu)建體的DNA序列。
圖35顯示了KGF-2半胱氨酸-37/半胱氨酸-106至絲氨酸的突變體構(gòu)建體的DNA序列。
圖36顯示了雄性SD大鼠(n=5)中KGF-2Δ33對(duì)創(chuàng)傷愈合之作用的評(píng)價(jià)。動(dòng)物接受了6mm的背部創(chuàng)傷，并連續(xù)4天用多種濃度的緩沖液，或KGF-2Δ33治療上述動(dòng)物。每天使用經(jīng)校準(zhǔn)的Jameson測(cè)徑器測(cè)量傷口。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SE)。*與緩沖液比較。
圖37顯示了正常大鼠中KGF-2Δ33對(duì)創(chuàng)傷愈合之作用的評(píng)價(jià)。雄性，SD,250-300g，大鼠(n=5)接受了6mm的全層皮背部創(chuàng)傷。用測(cè)徑器測(cè)量傷口，并從手術(shù)當(dāng)天開始連續(xù)4天用多種濃度的KGF-2Δ33和緩沖液處理傷口，最后一天收獲傷口。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*將測(cè)量值與未治療的對(duì)照比較。#將測(cè)量值與緩沖液對(duì)照比較。
圖38顯示了KGF-2Δ33對(duì)切口創(chuàng)傷抗斷強(qiáng)度的作用。雄性成年SD大鼠(n=10)在第1天接受了2.5cm的全層皮切口創(chuàng)傷，受傷后用緩沖液或KGF-2(Δ33)(1,4和10微克)之一處理切口內(nèi)部。在第5天處死動(dòng)物，切下0.5cm的傷口樣品以進(jìn)行常規(guī)的組織學(xué)和抗斷強(qiáng)度分析。橫跨傷口施加外力，使用Instron皮膚張力計(jì)進(jìn)行生物力學(xué)試驗(yàn)，抗斷強(qiáng)度(breaking strength)被定義為破裂前受每個(gè)傷口抑制的最大外力。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SE)。
圖39顯示了KGF-2(Δ33)對(duì)切口創(chuàng)傷表皮厚度的影響。雄性成年SD大鼠(n=10)在第1天接受了2.5cm的全層皮切口創(chuàng)傷，受傷后用緩沖液或KGF-2(Δ33)(1,4和10微克)之一處理切口內(nèi)部。在第5天處死動(dòng)物，切下0.5cm的傷口樣品以進(jìn)行常規(guī)的組織學(xué)和抗斷強(qiáng)度分析。通過取受傷位點(diǎn)周圍的6次測(cè)量結(jié)果的平均值確定表皮厚度，諸測(cè)量結(jié)果是由盲觀測(cè)者在使用經(jīng)校準(zhǔn)的透鏡測(cè)微器的光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)經(jīng)Masson Trichrome染色的切片得到的。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SE)。
圖40顯示了單次皮內(nèi)注射后KGF-2(Δ33)對(duì)表皮厚度的影響。雄性成年SD大鼠(n=18)在第0天接受了用緩沖液或溶于50微升的緩沖液中的1和4微克KGF-2的6次皮內(nèi)注射。注射后24和48小時(shí)處死動(dòng)物，測(cè)量由顆粒狀層至基層底部的表皮厚度。沿著注射位點(diǎn)測(cè)量大約20次，計(jì)算出平均厚度。諸測(cè)量結(jié)果是使用經(jīng)校準(zhǔn)的透鏡測(cè)徑器在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)經(jīng)Masson Trichrome染色的切片得到的。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SE)。
圖41顯示了KGF-2(Δ33)對(duì)BrdU評(píng)分的影響。雄性成年SD大鼠(n=18)在第0天接受了安慰劑或溶于50微升的濃度為1和4微克KGF-2的6次皮內(nèi)注射。注射后24和48小時(shí)處死動(dòng)物。處死前2小時(shí)用5-2’-溴脫氧尿苷(100mg/kg腹膜內(nèi))注射動(dòng)物。盲觀測(cè)者在光學(xué)顯微鏡下使用下列評(píng)分系統(tǒng)作出評(píng)分0-3沒有標(biāo)記或被BrdU標(biāo)記很少的細(xì)胞；4-6中度標(biāo)記的細(xì)胞；7-10強(qiáng)標(biāo)記的細(xì)胞。使用非成對(duì)t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值+/-SE)。
圖42顯示了KGF-2對(duì)PAF-誘導(dǎo)的爪子水腫的抗炎癥作用。
圖43顯示了Lewis大鼠中KGF-2Δ33對(duì)PAF-誘導(dǎo)的爪子水腫的抗炎癥作用。
圖44顯示了KGF-2Δ33對(duì)全身被輻照的Balb/c小鼠存活的影響。用519 RADS輻照Balb/c雄性小鼠(n=5),22.1g。在照射前的2天里和照射后連續(xù)7天中的每一天用緩沖液或KGF-2(1和5mg/kg，皮下)治療動(dòng)物。
圖45顯示了KGF-2Δ33對(duì)被輻照小鼠的體重的影響。在用519Rad/min照射前的2天里用緩沖液或KGF-2Δ33(1和5mg/kg)注射體重為22.1g的Balb/c雄性小鼠(n=5)，每天給動(dòng)物稱重，并在輻照后連續(xù)注射7天。
圖46顯示了KGF-2Δ33對(duì)全身被輻照的Balb/c小鼠存活率的影響。用519 RADS照射Balb/c雄性小鼠(n=7),22.1g。在照射前的2天里和照射后連續(xù)7天中的每一天用緩沖液或KGF-2(1和5mg/kg，皮下)治療動(dòng)物。
圖47顯示了在糖皮質(zhì)激素?fù)p傷的大鼠模型中KGF-2Δ33對(duì)創(chuàng)傷愈合的效果。
圖48顯示了使用BrdU標(biāo)記測(cè)定時(shí)KGF-2Δ33對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
圖49顯示了KGF-2Δ33對(duì)位于大鼠結(jié)腸的吻合外科手術(shù)位點(diǎn)處的膠原含量的影響。
詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了分離的核酸(多核苷酸)，所述核酸編碼具有圖1推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的多肽，或由1994年12月16日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20852的ATCC保藏號(hào)為75977的克隆的cDNA編碼的多肽。核酸分子除非另有說明，使用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀(如373型，可得自AppliedBiosystems公司)測(cè)定通過測(cè)定本文DNA分子的序列確定的所有核苷酸序列，通過翻譯如上測(cè)定的DNA序列推測(cè)由本文測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列。因此，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)由這種自動(dòng)化方法測(cè)定的任何DNA序列已知的那樣，本文測(cè)定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯(cuò)誤。由自動(dòng)化方法測(cè)定的核苷酸序列與被測(cè)序DNA分子的實(shí)際核苷酸序列至少約90％相同，更通常為至少約95％至至少約99.9％相同。通過其它方法，包括本領(lǐng)域中眾所周知的人工DNA測(cè)序法，可更準(zhǔn)確地測(cè)定實(shí)際的序列?，F(xiàn)有技術(shù)中已知與實(shí)際序列相比，被測(cè)定的核苷酸序列中的單個(gè)插入或缺失會(huì)導(dǎo)致該核苷酸序列翻譯過程中的移碼現(xiàn)象，從而使從所述插入或缺失點(diǎn)開始，由被測(cè)定的核苷酸序列編碼的推測(cè)的氨基酸序列會(huì)與被測(cè)序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列完全不同。
除非另有說明，本文列出的每個(gè)“核苷酸序列”以脫氧核糖核苷酸(縮寫為A,G,C和T)的序列表示。然而，核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”對(duì)于DNA分子或多核苷酸而言為脫氧核糖核苷酸的序列，對(duì)于RNA分子或多核苷酸而言為相應(yīng)的核糖核苷酸(A,G,C和U)序列，其中特定的脫氧核糖核苷酸序列中的每個(gè)胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(T)被尿嘧啶核糖核苷酸(U)所代替。例如，關(guān)于具有使用脫氧核糖核苷酸縮寫列出的SEQ ID NO:1之序列的RNA分子，想表示的是其序列中SEQ ID NO:1的每個(gè)脫氧核糖核苷酸A,G或C已被相應(yīng)的核糖核苷酸A,G或C代替，而每個(gè)脫氧核糖核苷酸T已被核糖核苷酸U所代替的RNA分子。
“分離的”核酸分子指的是從其天然環(huán)境中得到的核酸分子，DNA或RNA。例如，為了本發(fā)明的目的，載體中所含的重組DNA分子被認(rèn)為是分離的。分離的DNA分子的其它例子包括異源宿主細(xì)胞中所含的重組DNA分子或溶液中純化的(部分純化或基本上純化)DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄本。本發(fā)明的分離的核酸分子另外還包括合成產(chǎn)生的這種分子。
本發(fā)明的分離的核酸分子包括含有具有圖1所示核苷酸序列(SEQID NO:1)第1-3位起始密碼子的開放閱讀框(ORF)的DNA分子；含有圖1所示的成熟KGF-2蛋白(最后的172或173個(gè)氨基酸)(SEQ IDNO:2)之編碼序列的DNA分子；和含有實(shí)質(zhì)上與上述不同的序列但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性仍編碼KGF-2蛋白的DNA分子。當(dāng)然，遺傳密碼是本領(lǐng)域中眾所周知的，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)制備上述簡(jiǎn)并變體。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸可以得自人前列腺和胎兒肺。編碼多肽的cDNA片段最初分離自得自人正常前列腺的文庫，隨后，從隨機(jī)引發(fā)的人胎兒肺cDNA文庫中分離編碼全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的開放閱讀框。所述閱讀框在結(jié)構(gòu)上與FGF家族相關(guān)，它含有編碼208個(gè)氨基酸殘基之蛋白質(zhì)的開放閱讀框，其中大約前35或36個(gè)氨基酸殘基是推定的前導(dǎo)序列以使成熟的蛋白質(zhì)含有173或172個(gè)氨基酸。該蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子最高程度的同源性，在206個(gè)氨基酸的一段序列中具有45％的同一性和82％的相似性。已發(fā)現(xiàn)在FGF整個(gè)家族中保守的序列在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中也是保守的，這一點(diǎn)也很重要。
另外，得自文庫的KGF-2 cDNA的嵌套式PCR結(jié)果表明KGF-2也存在潛在的其它剪接形式。具體地說，使用側(cè)翼于KGF-2開放閱讀框之N末端的引物，由多個(gè)cDNA文庫得到0.2kb和0.4kb的PCR產(chǎn)物。0.2kb大小是預(yù)期的KGF-2產(chǎn)物，而0.4kb大小可能是KGF-2的其它剪接形式。在得自胃癌，成人睪丸，十二指腸和胰腺的文庫中觀察到了這一0.4kb產(chǎn)物。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA的形式，也可以是DNA的形式，所述DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的DNA。該DNA可以是雙鏈或單鏈，而若是單鏈，則可以是編碼鏈，也可以是非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1所示的編碼序列(SEQ IDNO:1)或經(jīng)保藏的克隆中的編碼序列相同；或者也可以是不同的編碼序列，這一編碼序列因遺傳密碼的豐余性或簡(jiǎn)并性而編碼與圖1之DNA(SEQ ID NO:1)或經(jīng)保藏的cDNA所編碼的相同的成熟多肽。
編碼圖1推測(cè)的成熟多肽(SEQ ID NO:2)或由經(jīng)保藏的cDNA所編碼的推測(cè)的成熟多肽的多核苷酸可包括僅有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和其它編碼序列如前導(dǎo)序列或分泌序列或原蛋白質(zhì)序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的其它編碼序列)和非編碼序列如內(nèi)含子或推測(cè)的成熟多肽之編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。另外，已得到全長(zhǎng)的mRNA，它含有該基因的5’和3’非翻譯區(qū)(圖3)。
由于上文討論的測(cè)序錯(cuò)誤概率以及針對(duì)不同的已知蛋白質(zhì)中前導(dǎo)序列的切割位點(diǎn)的可變異性，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)期望由經(jīng)保藏的cDNA所編碼的真正的KGF-2多肽含有約208個(gè)氨基酸，但可以是200-220個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的任何一種情況；此蛋白質(zhì)的實(shí)際前導(dǎo)序列約為35或36個(gè)氨基酸，但可以是30-40個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的任何一種情況。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包括僅包含多肽編碼序列的多核苷酸以及包含另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明另外涉及上文所述多核苷酸的變體，所述多核苷酸變體編碼具有圖1推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)之多肽或由經(jīng)保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。所述多核苷酸的變體可以是該多核苷酸天然產(chǎn)生的等位基因變體或該多核苷酸非天然產(chǎn)生的變體。
因此，本發(fā)明包括編碼與圖1(SEQ ID NO:2)所示相同的推測(cè)成熟多肽或與經(jīng)保藏克隆的cDNA所編碼的相同的推測(cè)成熟多肽的多核苷酸，以及這種多核苷酸的變體，所述變體編碼圖1(SEQ ID NO:2)所示多肽或由經(jīng)保藏克隆的cDNA所編碼多肽的片段、衍生物或類似物。這種核苷酸變體包括缺失變體、取代變體和添加或插入變體。
本發(fā)明包括編碼可用作治療肽的KGF-2模擬肽的多核苷酸。模擬的KGF-2肽是一些短肽，它們能夠通過結(jié)合和激活KGF-2的相關(guān)受體來模擬KGF-2蛋白的生物活性。模擬的KGF-2肽也可以結(jié)合并抑制KGF-2的相關(guān)受體。KGF-2受體包括但不限于FGFR2ⅲb和FGFR1ⅲb。這種模擬肽可得自諸如，但不限于噬菌體展示或組合化學(xué)的方法。例如，Wrighton等，科學(xué)，273:458-463(1996)所述的產(chǎn)生模擬的KGF-2肽的方法。
如上所述，多核苷酸具有的編碼序列可以是圖1所示編碼序列(SEQ ID NO:1)或經(jīng)保藏克隆之編碼序列的天然產(chǎn)生的等位基因變體。正如本領(lǐng)域中所熟知，等位基因變體是多核苷酸序列的一種可替換形式，它可具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代，缺失或添加，但基本上不會(huì)改變編碼多肽的功能。
本發(fā)明也包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在相同的閱讀框中與有助于宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌多肽的多核苷酸序列(例如作為分泌序列行使功能以控制從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出多肽的前導(dǎo)序列)融合。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白，它可能具有可被宿主細(xì)胞切割從而形成多肽的成熟形式的前導(dǎo)序列。該多核苷酸也可以編碼蛋白原，所述蛋白原是成熟的蛋白質(zhì)加上額外的5’氨基酸殘基。具有原序列的成熟蛋白質(zhì)是蛋白原，它是蛋白質(zhì)的無活性形式。一旦原序列被切割掉，剩下的就是有活性的成熟蛋白質(zhì)。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟的蛋白質(zhì)，或具有原序列的蛋白質(zhì)，或既具有原序列也具有前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在框內(nèi)與一種標(biāo)記序列融合的編碼序列，所述標(biāo)記序列可用于純化本發(fā)明的多肽。在宿主為細(xì)菌的情況下，該標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記物以純化與標(biāo)記序列融合的成熟多肽，或例如，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主，如COS-7細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記序列也可以是血凝素(HA)標(biāo)記物。HA標(biāo)記物相當(dāng)于得自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson,I等，細(xì)胞，37:767(1984))。
術(shù)語“基因”指的是參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA區(qū)段；它包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域(前導(dǎo)序列和尾隨序列)以及各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
本發(fā)明全長(zhǎng)基因的片段可被用作cDNA文庫的雜交探針以分離全長(zhǎng)的cDNA和分離與該基因具有高度序列相似性或相似的生物活性的其它c(diǎn)DNA。這種類型的探針優(yōu)選具有至少30個(gè)堿基，并可含有例如50個(gè)或更多個(gè)堿基。所述探針可被用于鑒定對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆和含有包括調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子的完整基因的基因組克隆。篩選的例子包括通過使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探針以分離該基因的編碼區(qū)。使用具有與本發(fā)明基因互補(bǔ)的序列的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸篩選人cDNA、基因組DNA或cDNA文庫以確定該探針與文庫的哪個(gè)成員雜交。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括分離的核酸分子，所述核酸分子含有的多核苷酸具有與(a)編碼具有圖1(SEQ ID NO:2)完整的氨基酸序列(包括推測(cè)的前導(dǎo)序列)的全長(zhǎng)KGF-2多肽的一個(gè)核苷酸序列；(b)編碼具有圖1(SEQ ID NO:2)中約第36或37至208位氨基酸序列的成熟KGF-2多肽(除去前導(dǎo)序列的全長(zhǎng)多肽)的一個(gè)核苷酸序列；(c)編碼具有由ATCC保藏號(hào)75977中所含cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列(包括前導(dǎo)序列)的全長(zhǎng)KGF-2多肽的一個(gè)核苷酸序列；(d)編碼具有由ATCC保藏號(hào)75977中所含cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的一個(gè)核苷酸序列；(e)編碼上述任一種KGF-2類似物或缺失突變體的一個(gè)核苷酸序列；或(f)與(a),(b),(c),(d)或(e)中任一個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的一個(gè)核苷酸序列至少90％相同，更優(yōu)選至少95％,96％,97％,98％或99％相同的核苷酸序列。
具有與參照的編碼KGF-2多肽的核苷酸序列至少，例如95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸指的是除了該多核苷酸序列在參照的編碼KGF-2多肽的核苷酸序列的每100個(gè)核苷酸中可包括多至5個(gè)點(diǎn)突變外，多核苷酸的核苷酸序列與參照序列是相同的。換句話說，為了得到具有與參照的核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中多至5％的核苷酸可缺失或被另一種核苷酸取代，或者多至參照序列之總核苷酸的5％的大量核苷酸可插入?yún)⒄招蛄兄?。參照序列的這些突變可在參照核苷酸序列的5’或3’末端位置發(fā)生，也可以在這些末端位置之間的任何地方發(fā)生，它們各自散布在參照序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰接組的形式散布在參照序列內(nèi)。
實(shí)際操作過程中，使用已知的計(jì)算機(jī)程序，如Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI53711)可常規(guī)確定是否任何特定的核酸分子與例如，圖1所示的核苷酸序列或經(jīng)保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同。Bestfit使用Smith和Waterson，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Advances in Applied Mathematics),2:482-489(1981)的局部同源性算法規(guī)則來找出兩個(gè)序列之間同源性最好的區(qū)段。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列排列程序來確定特定的序列是否與，例如根據(jù)本發(fā)明的參照序列95％相同時(shí)，參數(shù)的設(shè)置當(dāng)然應(yīng)使得是對(duì)參照核苷酸序列的全長(zhǎng)計(jì)算同一性百分比，并且允許存在達(dá)參照序列總核苷酸數(shù)目5％的同源性缺口。
本中請(qǐng)涉及與圖1[SEQ ID NO:1]所示核酸序列或經(jīng)保藏cDNA的核酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的核酸分子，而不論它們是否編碼具有KGF-2活性的多肽。這是因?yàn)樯踔廉?dāng)一種特定的核酸分子不編碼具有KGF-2活性的多肽時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍知道如何將該核酸分子用作例如雜交探針或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物。不編碼具有KGF-2活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途特別地包括(1)分離cDNA文庫中的KGF-2基因或其等位基因變體；(2)與中期染色體的伸展物原位雜交(如“FISH”)以提供KGF-2基因精確的染色體定位，例見Verma等，人類染色體基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)；和Northern印跡分析以檢測(cè)特定組織中的KGF-2mRNA表達(dá)。
然而，優(yōu)選的是具有與圖1[SEQ ID NO:1]所示核酸序列或經(jīng)保藏cDNA的核酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的序列的核酸分子，所述核酸分子實(shí)際上可編碼具有KGF-2蛋白活性的多肽?！熬哂蠯GF-2活性的多肽”指的是經(jīng)特殊的生物學(xué)試驗(yàn)測(cè)定，表現(xiàn)出與本發(fā)明野生型KGF-2蛋白的活性相似，但不必相同的活性，或與野生型KGF-2蛋白(全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或，優(yōu)選為成熟的蛋白質(zhì))相比有所增強(qiáng)的活性的多肽。
例如，下文實(shí)施例10和11中公開了KGF-2活性的檢測(cè)方法。使用這些檢測(cè)方法可測(cè)定部分純化的或純化的天然或重組蛋白質(zhì)的KGF-2活性。
KGF-2可刺激表皮角質(zhì)形成細(xì)胞而不是如成纖維細(xì)胞之類的間充質(zhì)細(xì)胞的增殖。因此，“具有KGF-2蛋白活性的多肽”包括在實(shí)施例10所述的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖試驗(yàn)中表現(xiàn)出KGF-2活性，并能與FGF受體同工型1-ⅲb和2-ⅲb結(jié)合(實(shí)施例11)的多肽。盡管活性水平不必與KGF-2蛋白的相同，但優(yōu)選“具有KGF-2蛋白活性的多肽”表現(xiàn)出與KGF-2蛋白基本相似的活性(即候選多肽相對(duì)于參照的KGF-2蛋白而言表現(xiàn)出較高的活性，或不高于10倍，優(yōu)選不高于2倍的活性)。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可立即認(rèn)識(shí)到具有與經(jīng)保藏的cDNA的核酸序列或圖1[SEQ ID NO；1]所示核酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的序列的大量核酸分子可編碼“具有KGF-2蛋白活性”的多肽。實(shí)際上，由于這些核苷酸序列的簡(jiǎn)并性變體都編碼相同的多肽，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員甚至無需進(jìn)行上述的比較試驗(yàn)即可明了這一點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)意識(shí)到，對(duì)于這種不是簡(jiǎn)并變體的核酸分子而言，相當(dāng)數(shù)目也編碼具有KGF-2蛋白活性的多肽。這是因?yàn)槭炀毜募夹g(shù)人員完全能掌握不大可能或不可能顯著影響蛋白質(zhì)功能的氨基酸取代(如一個(gè)脂肪族氨基酸被另一個(gè)脂肪族氨基酸取代)。
例如，有關(guān)如何進(jìn)行表型沉默的氨基酸取代的指導(dǎo)例見Bowie,J.U等，“譯解蛋白質(zhì)序列中的信息對(duì)氨基酸取代的耐受”，科學(xué)，247:1306-1310(1990)，其中作者指出了研究氨基酸序列對(duì)變化的耐受性有兩種主要的方法。第一種方法依靠的是進(jìn)化過程，其中突變被自然選擇接受或排斥。第二種方法使用基因工程在克隆基因的特定位置導(dǎo)入氨基酸變化，并選擇或篩選以鑒定出保持功能性的序列。如作者所指出的，這些研究已揭示蛋白質(zhì)對(duì)氨基酸取代具有令人驚奇的耐受性。作者進(jìn)一步指出在蛋白質(zhì)的某些位置哪些氨基酸的變化可能是允許的。例如，大多數(shù)隱蔽的氨基酸殘基需要非極性的側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺湹奶卣饕话愫苌偈潜Ｊ氐?。其它這種表型沉默取代描述于Bowie,J.U等(文獻(xiàn)同上)和本文提及的參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明另外涉及一類多核苷酸，當(dāng)它們的序列與上文所述序列之間有至少70％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，還要更優(yōu)選96％,97％,98％,99％同一性時(shí)，能夠與上文所述序列雜交上。本發(fā)明具體地涉及在嚴(yán)緊條件下能夠與上文所述多核苷酸雜交的多核苷酸。本文所用術(shù)語“嚴(yán)緊條件”是指僅當(dāng)序列之間有至少95％和優(yōu)選至少97％同一性時(shí)才會(huì)發(fā)生雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，能夠與上文所述多核苷酸雜交上的多核苷酸所編碼的多肽能基本上維持與由圖1(SEQ ID NO:1)之cDNA或經(jīng)保藏的cDNA編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
“嚴(yán)緊雜交條件”的例子包括于42℃，在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml變性的經(jīng)剪切的鮭精DNA的溶液中保溫過夜，接著于65℃用0.1×SSC洗滌濾膜。
或者，多核苷酸可至少具有20個(gè)堿基，優(yōu)選30個(gè)堿基，更優(yōu)選至少具有50個(gè)堿基，如上所述它能與本發(fā)明的多核苷酸雜交并與本發(fā)明的多核苷酸具有同一性，它有可能維持或不能維持活性。例如，可將這種多核苷酸用作SEQ ID NO:1之多核苷酸的探針，例如用以回收多核苷酸或用作診斷探針或用作PCR引物。
當(dāng)然，能夠與參照多核苷酸(如經(jīng)保藏的cDNA克隆)的較大部分，如長(zhǎng)度為50-750nt的部分，或甚至與全長(zhǎng)的參照多核苷酸雜交的多核苷酸也可用作本發(fā)明的探針，對(duì)應(yīng)于經(jīng)保藏的cDNA的核苷酸序列或圖1[SEQ ID NO:1]所示的核苷酸序列的大部分(如果不是全部的話)的多核苷酸也一樣能用作探針。例如，“長(zhǎng)度至少為20nt”的多核苷酸部分是指參照多核苷酸的核苷酸序列(如經(jīng)保藏的cDNA或圖1[SEQID NO:1]所示的核苷酸序列)中的20個(gè)或更多個(gè)鄰接的核苷酸。如上所述，所述部分在診斷上可用作根據(jù)常規(guī)DNA雜交技術(shù)的探針或用作引物從而通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增靶序列，例見分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T(1989)編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，該文獻(xiàn)全文列入本文作為參考。
由于KGF-2 cDNA克隆已被保藏，其確定的核苷酸序列示于圖1[SEQ ID NO:1]，產(chǎn)生能與KGF-2cDNA分子的一部分雜交的多核苷酸對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)是常規(guī)技術(shù)。例如，可簡(jiǎn)單地使用限制性內(nèi)切核酸酶切割或通過超聲處理KGF-2cDNA克隆進(jìn)行剪切以產(chǎn)生不同大小的DNA部分，這些DNA部分就是能與KGF-2cDNA分子的一部分雜交的多核苷酸?；蛘撸筛鶕?jù)已知技術(shù)合成產(chǎn)生本發(fā)明的雜交多核苷酸。當(dāng)然，僅能與polyA序列(如圖1[SEQ ID NO:1]所示KGF-2cDNA之3’末端poly(A)序列)，或T(或U)殘基的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸不包括在用于與本發(fā)明的核酸部分雜交的本發(fā)明的多核苷酸中，因?yàn)檫@種多核苷酸可與含有poly(A)序列或其互補(bǔ)物的任何核酸分子(如實(shí)際上任何一種雙鏈cDNA克隆)雜交上。
本發(fā)明另外還提供了含有編碼KGF-2蛋白之?dāng)y有表位的部分的多核苷酸的分離的核酸分子。具體地說，所提供的分離的核酸分子編碼含有圖1(SEQ ID NO:2)中的下列氨基酸殘基的多肽，本發(fā)明人已測(cè)定出它們是KGF-2蛋白的抗原性區(qū)域1．Gly41-Asn71:GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[SEQID NO:25]；2．Lys91-Ser109:KIEKNGKVSGTKKENCPYS[SEQ ID NO:26]；3．Asn135-Tyr164:NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[SEQ ID NO:27]；和4-Asn181-Ala199:NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[SEQ ID NO:28]。還有另外兩個(gè)較短的推測(cè)抗原性區(qū)域，Gln74-Arg78和Gln170-Gln175。下文將詳細(xì)描述產(chǎn)生KGF-2之?dāng)y有表位的部分的方法。
可根據(jù)有關(guān)用于專利方法的微生物保藏物國際認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約中的款項(xiàng)維持本文所述的保藏物。這些保藏物僅為方便本領(lǐng)域技術(shù)人員而提供，而不是認(rèn)定根據(jù)35U.S.C.ξ112的規(guī)定需要保藏。經(jīng)保藏材料中所含的多核苷酸序列及其所編碼多肽的氨基酸序列均引入本文作為參考，當(dāng)這些序列與本文所述序列有沖突時(shí)，以前者為準(zhǔn)。制備，使用或銷售經(jīng)保藏的材料需經(jīng)許可，本申請(qǐng)未授予這種許可。KGF-2多肽和片段本發(fā)明另外涉及具有圖1(SEQ ID NO:2)的推定氨基酸序列或具有由經(jīng)保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽的片段，類似物和衍生物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，由于上文討論的測(cè)序錯(cuò)誤概率以及針對(duì)不同的已知蛋白質(zhì)中前導(dǎo)序列的裂解位點(diǎn)的可變異性，由經(jīng)保藏的cDNA所編碼的實(shí)際的KGF-2多肽含有約208個(gè)氨基酸，但可以是200-220個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的任何數(shù)目；此蛋白質(zhì)的實(shí)際前導(dǎo)序列約為35或36個(gè)氨基酸，但可以是30-40個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的任何數(shù)目。
涉及圖1(SEQ ID NO:2)的多肽或經(jīng)保藏的cDNA所編碼的多肽時(shí)，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”指的是保留了與這種多肽基本上相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括蛋白原，通過裂解該蛋白原部分以產(chǎn)生有活性的成熟多肽而能激活該蛋白原。
本發(fā)明的多肽可以是重組的多肽，天然的多肽或合成的多肽，優(yōu)選為重組的多肽。
圖1(SEQ ID NO:2)的多肽或經(jīng)保藏的cDNA所編碼的多肽的片段，衍生物或類似物可以是下列各種多肽(ⅰ)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代，這種被取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基，或(ⅱ)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基，或(ⅲ)其中成熟的多肽與另一種化合物，如提高多肽半壽期的化合物(如聚乙二醇)融合，或(ⅳ)其中另外的氨基酸與成熟多肽融合，如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或蛋白原序列。鑒于本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難掌握這種片段，衍生物和類似物。
術(shù)語“肽”和“寡肽”被認(rèn)為是同義詞(人們普遍這么認(rèn)為)，當(dāng)上下文中需要指明由肽鍵偶聯(lián)的至少2個(gè)氨基酸的鏈時(shí)，這兩個(gè)術(shù)語可以互換使用。本文中對(duì)含有10個(gè)氨基酸殘基以上的鏈?zhǔn)褂谩岸嚯摹币辉~。本文所有寡肽和多肽式或序列從左至右為氨基末端至羧基末端。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，KGF-2多肽的一些氨基酸序列可以改變，而不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。如果分析序列中的這種差異，應(yīng)能記得蛋白質(zhì)中存在決定活性的至關(guān)重要的區(qū)域。一般而言，可以取代形成四級(jí)結(jié)構(gòu)的殘基，只要使用行使類似功能的殘基即可。在其它場(chǎng)合下，如果變化發(fā)生在蛋白質(zhì)的非重要區(qū)域，那么殘基的類型有可能完全不重要。
因此，本發(fā)明另外包括基本上表現(xiàn)出KGF-2多肽活性或包括諸如下文所討論的蛋白質(zhì)部分的KGF-2蛋白區(qū)域的KGF-2多肽的各種變異。這種突變體包括缺失，插入，倒位，重復(fù)和類型取代(如原則是用一種親水的殘基取代另一種親水的殘基，而不是用強(qiáng)親水的殘基取代強(qiáng)疏水的殘基)。小的變化或這種“中性的”氨基酸取代一般對(duì)活性影響很小。
通常視為保守的取代是脂肪族氨基酸Ala,Val,Leu和Ile中相互之間的取代；羥基殘基Ser和Thr的互換，酸性殘基Asp和Glu的互換，酰胺殘基Asn和Gln之間的取代，堿性殘基Lys和Arg的互換以及芳香族殘基Phe,Tyr的相互取代。
如上文詳述，有關(guān)何種氨基酸變化很可能是表型沉默的(即不會(huì)對(duì)功能有顯著不利的影響)的其它指南例見Bowie,J.U.等人的“譯解蛋白質(zhì)序列中的信息對(duì)氨基酸取代的耐受”，科學(xué)，247:1306-1310(1990)。
本發(fā)明包括編碼可用作治療肽的KGF-2模擬肽。模擬的KGF-2肽是一些短肽，它們通過結(jié)合和激活KGF-2的相關(guān)受體來模擬KGF-2蛋白的生物活性。模擬的KGF-2肽也可以結(jié)合并抑制KGF-2的相關(guān)受體。KGF-2受體包括但不限于FGFR2ⅲb和FGFR1ⅲb。這種模擬肽可得自例如，但不限于噬菌體展示或組合化學(xué)的方法。例如，Wrighton等，科學(xué)，273:458-463(1996)所述的方法可用于產(chǎn)生模擬的KGF-2肽。
優(yōu)選以分離的形式提供本發(fā)明的多肽和多核苷酸，并優(yōu)選已被純化為均質(zhì)。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選為分離的形式，“分離的多肽”是指從其天然環(huán)境中取出的多肽，因此，為了本發(fā)明的目的，重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生和/或含有的多肽被認(rèn)為是分離的，“分離的多肽”還指從重組宿主細(xì)胞中或天然來源部分或基本上純化好的多肽。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽(尤其是成熟的多肽)以及與SEQ ID NO:2的多肽至少90％,95％,96％,97％,98％,99％相似(更優(yōu)選至少90％,95％,96％,97％,98％,99％相同)的多肽，還包括這種多肽的部分，多肽的所述部分(如下文所述的缺失突變體)一般含有至少30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。
眾所周知，通過將一種多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代與第二種多肽的序列比較即可確定兩種多肽之間的“相似性”。
兩個(gè)多肽的“相似性百分比”指的是通過使用Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI53711)和用于確定相似性的缺失設(shè)置比較兩個(gè)多肽的氨基酸序列而產(chǎn)生的相似性評(píng)分。Bestfit使用Smith和Waterson(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2:482-489,1981)的局部同源性算法規(guī)則來找出兩個(gè)序列之間相似性最好的區(qū)段。
具有與參照的KGF-2多肽的氨基酸序列至少，例如至少95％“相同”的氨基酸序列的多肽指的是除了該多肽序列在參照的KGF-2多肽的氨基酸序列的每100個(gè)氨基酸中可包括多至5個(gè)氨基酸的改變外，該多肽的氨基酸序列與參照序列是相同的。換句話說，為了得到具有與參照的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，參照序列中多至5％的氨基酸殘基可缺失或被另一種氨基酸取代，或者多至參照序列之總氨基酸殘基的5％的大量氨基酸可插入?yún)⒄招蛄兄?。參照序列的這些變化可在參照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置發(fā)生，也可以在所述末端位置之間的任何位置發(fā)生，或者各自散布在參照序列的殘基中，或者散布在參照序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)鄰接的組中。
實(shí)際操作過程中，使用已知的計(jì)算機(jī)程序，如Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI53711)可常規(guī)確定是否任何特定的多肽與例如，圖1[SEQ ID NO:2]所示的氨基酸序列或經(jīng)保藏的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列排列程序以確定特定的序列是否，例如與根據(jù)本發(fā)明的參照序列95％相同時(shí)，當(dāng)然應(yīng)設(shè)置參數(shù)以便是在參照氨基酸序列的全長(zhǎng)基礎(chǔ)上計(jì)算同一性百分比，并且達(dá)參照序列總氨基酸殘基數(shù)目5％的同源性缺口是可以允許的。
如下文詳述，本發(fā)明的多肽可被用于產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體，所述抗體可用于下文所述的檢測(cè)KGF-2蛋白表達(dá)的診斷試驗(yàn)中，或用作能增強(qiáng)或抑制KGF-2蛋白功能的激動(dòng)劑和拮抗劑。另外，這種多肽可被用于酵母雙雜合系統(tǒng)以“捕獲”也是本發(fā)明的候選激動(dòng)劑和拮抗劑的KGF-2蛋白結(jié)合蛋白。酵母雙雜合系統(tǒng)描述于Fields和Song，自然，340:245-246(1989)。
另一方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明多肽之?dāng)y有表位的部分的肽或多肽。此多肽部分的所述表位是本發(fā)明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”被定義為當(dāng)整個(gè)蛋白質(zhì)為免疫原時(shí)蛋白質(zhì)中能引發(fā)抗體應(yīng)答的部分。據(jù)信這些免疫原性表位僅限于分子上的幾個(gè)位置。另一方面，蛋白質(zhì)分子中可與抗體結(jié)合的區(qū)域被定義為“抗原性表位”。蛋白質(zhì)的免疫原性表位的數(shù)目一般少于抗原性表位的數(shù)目，例見Geysen等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，81:3998-4002(1993)。
至于攜有抗原性表位(即含有蛋白質(zhì)分子中可與抗體結(jié)合的區(qū)域)的肽或多肽的選擇，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知模擬蛋白質(zhì)序列一部分的相對(duì)短的合成肽一般能刺激產(chǎn)生可與部分模擬的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的抗血清。例見Sutcliffe,J.G,Shinnick,T.M,Green,N和Learner,R.A(1983)，與蛋白質(zhì)上預(yù)定位點(diǎn)反應(yīng)的抗體，科學(xué)，219:660-666。經(jīng)常以蛋白質(zhì)的一級(jí)序列描述能引發(fā)產(chǎn)生蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的肽，通過一套簡(jiǎn)單的化學(xué)規(guī)則可鑒定這種肽，它們既不限于完整蛋白質(zhì)的免疫決定簇區(qū)域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。極端疏水的肽和含6個(gè)或更少殘基的肽一般不能誘導(dǎo)可與模擬蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體；較長(zhǎng)的、可溶性的肽，尤其是含有脯氨酸殘基的肽通常是有效的。Sutcliffe等，文獻(xiàn)同上，p661。例如，根據(jù)這些指南設(shè)計(jì)的，含有覆蓋流感病毒血凝素HA1多肽鏈序列75％的8-39個(gè)殘基的20個(gè)肽中有18個(gè)可誘導(dǎo)產(chǎn)生能與HA1蛋白或整個(gè)病毒反應(yīng)的抗體；對(duì)于MulV聚合酶而言，12個(gè)肽中的12個(gè)，對(duì)于狂犬病糖蛋白而言，18個(gè)肽中的18個(gè)可誘導(dǎo)產(chǎn)生能沉淀各自蛋白質(zhì)的抗體。
因此，本發(fā)明攜有抗原性表位的肽和多肽可用于產(chǎn)生能特異性地與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體，包括單克隆抗體。因此，通過融合來自經(jīng)攜有抗原表位的肽免疫的供體的脾細(xì)胞而得到的大多數(shù)雜交瘤通常可分泌能與天然蛋白反應(yīng)的抗體，Sutcliffe等，文獻(xiàn)同上，p663。由攜有抗原性表位的肽或多肽產(chǎn)生的抗體可用于檢測(cè)模擬的蛋白質(zhì)，針對(duì)不同肽的抗體可用于追蹤進(jìn)行翻譯后加工的蛋白質(zhì)前體多個(gè)區(qū)域的去向。在模擬蛋白質(zhì)的多種定量或定性測(cè)定，如競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中可使用肽和抗肽抗體，因?yàn)橐呀?jīng)證明甚至短肽(如約9個(gè)氨基酸)都可在免疫沉淀試驗(yàn)中結(jié)合和替代較大的肽，例見Wilson等，細(xì)胞，37:767-778(1984),p777。本發(fā)明的抗肽抗體也可用于純化模擬的蛋白質(zhì)，例如通過使用本領(lǐng)域所熟知的方法進(jìn)行吸附層析。
根據(jù)上述指南設(shè)計(jì)的本發(fā)明攜有抗原性表位的肽和多肽優(yōu)選含有本發(fā)明多肽的氨基酸序列中所含的至少7個(gè)，更優(yōu)選至少9個(gè)，最優(yōu)選約15-約30個(gè)氨基酸的序列。然而，包括本發(fā)明多肽氨基酸序列的較大部分，含有約30,40,50,60,70,80,90,100或150個(gè)，或直至和包括本發(fā)明多肽全部氨基酸序列的任何長(zhǎng)度的氨基酸的肽或多肽也被認(rèn)為是本發(fā)明攜有表位的肽或多肽，也可用于誘導(dǎo)產(chǎn)生與模擬蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體。優(yōu)選攜有表位的肽的氨基酸序列被選擇為在含水溶劑中具有良好的溶解性(即該序列包括相對(duì)親水的殘基，而優(yōu)選避免高度疏水的殘基)；特別優(yōu)選含有脯氨酸殘基的序列。
可用于產(chǎn)生KGF-2特異性抗體的抗原性多肽或肽的非限制性例子包括下列:1．Gly41-Asn71:GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[SEQID NO:25]；2．Lys91-Ser109:KIEKNGKVSGTKKENCPYS[SEQ ID NO:26]；3．Asn135-Tyr164:NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[SEQ ID NO:27]；和4．Asn181-Ala199:NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[SEQ ID NO:28]。
還有另外兩個(gè)較短的推測(cè)抗原性區(qū)域，Gln74-Arg78和Gln170-Gln175。
通過制備肽或多肽的任何常規(guī)方法，包括使用本發(fā)明核酸分子的重組方法，可產(chǎn)生本發(fā)明攜有表位的肽和多肽。例如，可將攜有短的表位的氨基酸序列與較大的多肽融合，該多肽可在重組生產(chǎn)和純化的過程中用作載體，在免疫過程中可用來產(chǎn)生抗肽抗體。也可以使用已知的化學(xué)合成方法合成攜有表位的肽。例如，Houghten描述了合成大數(shù)目肽的一種簡(jiǎn)單方法，如在4周之內(nèi)制備和鑒定(通過ELISA-型結(jié)合研究)代表HA1多肽一個(gè)區(qū)段的單個(gè)氨基酸變體的10-20mg 248個(gè)不同的13殘基的肽，Houghten,R.A(1985)，快速固相合成大數(shù)目肽的一般方法各個(gè)氨基酸水平上的抗原-抗體相互作用的特異性，美國國家科學(xué)院院報(bào)，82:5131-5135。這種“同時(shí)合成多個(gè)肽(SMPS)”的方法進(jìn)一步描述于Houghten等人的美國專利4,631,211(1986)中。在此方法中，將用于固相合成多個(gè)肽的各個(gè)樹脂包含在各個(gè)單獨(dú)的可滲透溶劑的袋中，以最佳利用固相方法中所包括的多個(gè)相同的重復(fù)步驟。完全人工的方法可同時(shí)進(jìn)行500-1000或更多個(gè)肽的合成，Houghten等人，文獻(xiàn)同上，p5134。
可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法，使用本發(fā)明攜有表位的肽和多肽誘導(dǎo)抗體，例見Sutcliffe等人，文獻(xiàn)同上；Wilson等人，文獻(xiàn)同上；Chow,M等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)，82:910-914；和Bittle,F.J等人，普通病毒學(xué)雜志，66:2347-2354(1985)。通常，可用游離的肽免疫動(dòng)物；然而，通過將肽與大分子載體，如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)，可提高抗肽抗體的滴度。例如，使用如間-馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)的接頭，可將含有半胱氨酸的肽與載體偶聯(lián)，而使用更一般的連接劑如戊二醛可將其它肽與載體偶聯(lián)。通過例如腹膜內(nèi)和/或皮內(nèi)注射含有約100微克肽或載體蛋白和弗氏佐劑的乳劑，可用游離的或與載體偶聯(lián)的肽免疫動(dòng)物，如兔，大鼠和小鼠。需要例如以約2周為間隔進(jìn)行幾次加強(qiáng)注射以提供有用的抗肽抗體滴度，通過例如使用吸附于固體表面的游離肽的ELISA試驗(yàn)可檢測(cè)所述滴度。通過例如將肽吸附于固相支持物上并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法洗脫選定的抗體，從而選擇抗肽抗體，可提高得自經(jīng)免疫動(dòng)物的血清中的抗肽抗體滴度。
可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法鑒定本發(fā)明攜有免疫原性表位的肽，即當(dāng)整個(gè)蛋白質(zhì)是免疫原時(shí)可引發(fā)抗體應(yīng)答的所述蛋白質(zhì)的諸部分。例如，Geysen等人(文獻(xiàn)同上)公開了在固相支持物上快速地同時(shí)合成純度足以在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中反應(yīng)的上百個(gè)肽的方法。然后，不用將它們與支持物分開即可輕易地檢測(cè)合成的肽與抗體的相互作用。按此方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地鑒定攜有所需蛋白質(zhì)的免疫原性表位的肽。例如，Geysen等人通過合成一套重疊的覆蓋口蹄疫病毒外被蛋白全部213個(gè)氨基酸的序列的所有208種可能的六肽，以7個(gè)氨基酸的分辨率定位出該蛋白質(zhì)內(nèi)免疫學(xué)重要的表位。然后，合成完整一套取代肽，其中在表位內(nèi)每一個(gè)位置依次用所有20個(gè)氨基酸取代，測(cè)定賦予與抗體反應(yīng)的特異性的特殊氨基酸。因此，通過此方法可常規(guī)制備本發(fā)明攜有表位的肽的肽類似物。Geysen(1987)的美國專利4,708,781中進(jìn)一步描述了鑒定攜有所需蛋白質(zhì)的免疫原性表位的肽的方法。
Geysen(1990)的美國專利5,194,392中描述了檢測(cè)或確定單體(氨基酸或其它化合物)序列的一般方法，所述單體是與所需抗體的特定互補(bǔ)位(抗原結(jié)合位點(diǎn))互補(bǔ)之表位的拓?fù)涞葍r(jià)物(即“mimotope”)。更一般地，Geysen(1989)的美國專利4,433,092中描述了檢測(cè)或確定單體序列的方法，所述單體是與所需特定受體的配體結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)之配體的拓?fù)涞葍r(jià)物。類似地，Houghten,R.A等人(1996)的有關(guān)預(yù)先烷基化的寡肽混合物的美國專利5,480,971公開了線性的C1-C7-烷基預(yù)先烷基化的寡肽和這種肽的系列和文庫，以及使用這種寡肽系列和文庫測(cè)定優(yōu)先與所需受體分子結(jié)合的預(yù)先烷基化寡肽之序列的方法。因此，通過這些方法可常規(guī)制備本發(fā)明攜有表位的肽的非肽類似物。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所期望的，本發(fā)明的KGF-2多肽及其上述攜有表位的片段可與免疫球蛋白(IgG)的恒定區(qū)部分聯(lián)合形成嵌合的多肽。這些融合蛋白便于純化并顯示出體內(nèi)半壽期增加。例如，由人CD4多肽的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各個(gè)區(qū)域組成的嵌合蛋白已顯示出這一現(xiàn)象(EPA 394,827；Traunecker等人，自然，331:84-86(1988))。因IgG部分而具有由二硫鍵連接的二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白在結(jié)合和中和其它分子方面比單體的KGF-2蛋白或單獨(dú)的蛋白質(zhì)片段更加有效(Fountoulakis等人，生物化學(xué)雜志，270:3958-3964(1995))。
根據(jù)本發(fā)明，也描述了KGF-2新的變體。通過缺失或取代KGF-2的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可產(chǎn)生這些變體。天然的突變被稱為等位基因變異，等位基因變異可以是沉默的(所編碼的多肽沒有變化)，也可以具有改變了的氨基酸序列。
為了嘗試改善或改變天然KGF-2的特征，可利用蛋白質(zhì)工程。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生新的多肽。突變蛋白和缺失可顯示出例如增強(qiáng)的活性或增加的穩(wěn)定性。另外，它們可以較高的得率被純化，并至少在某些純化和儲(chǔ)存條件下顯示出較好的溶解性。下文所示的是所構(gòu)建的突變的例子。氨基末端和羧基末端缺失使用重組DNA技術(shù)已修飾了FGF家族的多個(gè)成員。在aFGF和bFGF中，對(duì)肝素結(jié)合至關(guān)重要的帶正電的分子已被取代或缺失。經(jīng)修飾的分子導(dǎo)致肝素結(jié)合活性的降低，因此，患者體內(nèi)被肝素結(jié)合的經(jīng)修飾分子的量會(huì)有所降低，由于更多的FGF會(huì)到達(dá)適當(dāng)?shù)氖荏w，從而增加了效力(EP 0298723)。
含水狀態(tài)的天然KGF-2相對(duì)不穩(wěn)定，它會(huì)遭遇化學(xué)和物理降解，從而導(dǎo)致加工和儲(chǔ)存過程中生物活性的損失。天然KGF-2在水溶液中，由于溫度升高會(huì)傾向于聚集，在酸性條件下會(huì)失活。
為了改善或改變天然KGF-2的一個(gè)或更多個(gè)特性，可使用蛋白質(zhì)工程。Ron等人，生物化學(xué)雜志，268(4):2984-2988(1993)報(bào)道了即使喪失氨基末端3、8或27個(gè)氨基酸殘基仍具有肝素結(jié)合活性的經(jīng)修飾KGF蛋白。缺失3和8個(gè)氨基酸具有全部的活性。KGF更多個(gè)氨基酸的缺失描述于PCT/IB95/00971。羧基末端氨基酸的缺失可增強(qiáng)蛋白質(zhì)的活性。一個(gè)例子是γ干擾素，通過缺失該蛋白質(zhì)羧基末端的10個(gè)氨基酸殘基可使活性提高達(dá)10倍(Dobeli等人，生物技術(shù)雜志，7:199-216(1988))。因此，本發(fā)明的一方面是提供KGF-2的多肽類似物和編碼這種類似物的核苷酸序列，所述類似物相對(duì)于天然KGF-2多肽而言，表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性(如當(dāng)暴露于典型的pH，熱條件或其它儲(chǔ)存條件下)。
下文所示的是特別優(yōu)選的KGF-2多肽(計(jì)數(shù)始于蛋白質(zhì)中的第一個(gè)氨基酸(Met))Thr(殘基36)-Ser(殘基208)Arg(65)-Ser(208)Cys(37)-Ser(208)Val(67)-Ser(208)Gln(38)-Ser(208)Ser(69)-Ser(208)Ala(39)-Ser(208)Val(77)-Ser(208)Leu(40)-Ser(208)Arg(80)-Ser(208)Gly(41)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-His(207)Gln(42)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Val(206)Asp(43)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Val(205)Met(44)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Met(204)Val(45)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Pro(203)Ser(46)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Leu(202)Pro(47)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Phe(201)Glu(48)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-His(200)Ala(49)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Ala(199)Thr(50)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Ser(198)Asn(51)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Thr(197)Ser(52)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Asn(196)Ser(53)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Lys(195)Ser(54)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Arg(194)Ser(55)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Arg(193)Ser(56)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Thr(192)Phe(S7)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Lys(191)Ser(59)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Arg(188)Ser(62)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Arg(187)Ala(63)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Lys(183)Gly(64)-Ser(208)優(yōu)選的實(shí)施方案包括N-末端缺失Ala(63)-Ser(208)(KGF-2Δ28)和Ser(69)-Ser(208)(KGF-2Δ33)。其它優(yōu)選的N-末端和C-末端缺失突變體描述于說明書實(shí)施例13和16(c)，并包括Ala(39)-Ser(208)；Pro(47)-Ser(208)；Val(77)-Ser(208)；Glu(93)-Ser(208)；Glu(104)-Ser(208)；Val(123)-Ser(208)；和Gly(138)-Ser(208)。其它優(yōu)選的C-末端缺失突變體包括Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Lys(153)。
本發(fā)明中也包括N-末端和C-末端氨基酸都有缺失的缺失突變體。這種突變體包括上述N-末端缺失突變體和C-末端缺失突變體的所有聯(lián)合，例如Ala(39)-His(200),Met(44)-Arg(193),Ala(63)-Lys(153),Ser(69)-Lys(153)等等。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組技術(shù)可進(jìn)行這種聯(lián)合。
因此，一方面，本發(fā)明提供了N-末端的缺失突變體，這種突變體包括那些除圖1(SEQ ID NO:2)中至少前38個(gè)N-末端氨基酸殘基(即至少M(fèi)et(1)-Gln(38))但不超過前147個(gè)N-末端氨基酸殘基缺失外，含有圖1(SEQ ID NO:2)所示其余氨基酸序列的突變體。或者，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少前38個(gè)N-末端氨基酸殘基(即至少缺失Met(1)-Gln(38))但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基。或者，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少前46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基?；蛘?，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少前62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基。或者，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少前68個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基?；蛘撸笔О▓D1(SEQ ID NO:2)中至少前76個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基。或者，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少前92個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基。或者，缺失包括圖1(SEQ IDNO:2)中至少前103個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基。或者，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少前122個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基。
除了上述N-末端缺失突變體的范圍以外，本發(fā)明也涉及上述范圍的所有聯(lián)合，如圖1(SEQ ID NO:2)中至少前62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前68個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少前62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前76個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少前62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前92個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少前62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前103個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少前68個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前76個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少前68個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前92個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ IDNO:2)中至少前68個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前103個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少前46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前62個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少前46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前68個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少前46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前76個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；等等。
另一方面，本發(fā)明提供了C-末端缺失突變體。優(yōu)選所述C-末端缺失突變體的N-末端氨基酸殘基是圖1(SEQ ID NO:2)的氨基酸殘基1(Met),36(Thr)或37(Cys)。這種突變體包括那些除圖1(SEQ IDNO:2)中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基(Ser(208))但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基缺失(即缺失氨基酸殘基Glu(154)-Ser(208))外，含有圖1(SEQ ID NO:2)所示其余氨基酸序列的突變體。或者，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后65個(gè)C-末端氨基酸殘基?；蛘?，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后10個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基。或者，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后20個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基?；蛘?，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后30個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基?；蛘?，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后40個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基?；蛘?，缺失包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后50個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基。
除了上述C-末端缺失突變體的范圍以外，本發(fā)明也涉及上述范圍的所有聯(lián)合，如圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后10個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后20個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后30個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后40個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后10個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后20個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后10個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后30個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后10個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后40個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后20個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后30個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；等等。
另一方面，本發(fā)明也包括N-末端和C-末端殘基都缺失了氨基酸的缺失突變體。這種突變體包括上述N-末端缺失突變體和C-末端缺失突變體的所有聯(lián)合。這種突變體包括除圖1(SEQ ID NO:2)中至少前46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基缺失，圖1(SEQ ID NO:2)中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基缺失外，含有圖1(SEQ ID NO:2)所示其余氨基酸序列的突變體?；蛘?，缺失可包括圖1(SEQ ID NO:2)中至少前62,68,76,92,103或122個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失，和圖1中至少最后10,20,30,40或50個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失。另外還包括上述范圍的所有聯(lián)合。氨基酸取代本發(fā)明的另一方面也包括氨基酸的取代。天然的成熟KGF-2含有44個(gè)帶電的殘基，其中的32個(gè)帶正電。根據(jù)這種殘基在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的位置，用帶負(fù)電或不帶電的氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)這些成簇的殘基可改變相鄰殘基的靜電相互作用，對(duì)于增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和減少蛋白質(zhì)聚集是有用的。蛋白質(zhì)的聚集不僅會(huì)導(dǎo)致活性的喪失，也會(huì)給藥物制劑的制備帶來問題，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)是免疫原性的(Pinckard等人，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)，2:331-340(1967),Robbins等人，糖尿病，36:838-845(1987),Cleland等人，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Systems,10:307-377(1993))。任何修飾都應(yīng)考慮到使蛋白質(zhì)分子四級(jí)結(jié)構(gòu)中的電荷排斥最小化。因此，特別令人感興趣的是用另一種帶電的氨基酸和用中性的或帶負(fù)電的氨基酸取代帶電的氨基酸，后者會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)所帶的正電荷減少，從而改善KGF-2的特性。這種改善包括與天然的KGF-2蛋白相比，類似物的穩(wěn)定性有所增加和聚集作用有所降低。
氨基酸的取代也可以改變與細(xì)胞表面受體結(jié)合的選擇性，Ostade等人，自然，361:266-268(1993)中描述了某些TNFα突變導(dǎo)致TNFα僅選擇性地與兩種已知TNF受體之一結(jié)合。
KGF-2分子可包括因自然突變或因人為操作所致的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，缺失或添加。一些優(yōu)選突變的例子是Ala(49)Gln,Asn(51)Ala,Ser(54)Val,Ala(63)Pro,Gly(64)Glu,Val(67)Thr,Trp(79)Val,Arg(80)Lys,Lys(87)Arg,Tyr(88)Trp,Phe(89)Tyr,Lys(91)Arg,Ser(99)Lys,Lys(102)Gln,Lys 103(Glu),Glu(104)Met,Asn(105)Lys,Pro(107)Asn,Ser(109)Asn,Leu(111)Met,Thr(114)Arg,Glu(117)Ala,Val(120)Ile,Val(123)Ile,Ala(125)Gly,Ile(126)Val,Asn(127)Glu,Asn(127)Gln,Tyr(130)Phe,Met(134)Thr,Lys(136)Glu,Lys(137)Glu,Gly(142)Ala,Ser(143)Lys,Phe(146)Ser,Asn(148)Glu,Lys(151)Asn,Leu(152)Phe,Glu(154)Gly,Glu(154)Asp,Arg(155)Leu,Glu(157)Leu,Gly(160)His,Phe(167)Ala,Asn(168)Lys,Gln(170)Thr,Arg(174)Gly,Tyr(177)Phe,Gly(182)Gln,Ala(185)Val,Ala(185)Leu,Ala(185)Ile,Arg(187)Gln(190)Lys,Lys(195)Glu,Thr(197)Lys,Ser(198)Thr,Arg(194)G1u,Arg(194)Gln,Lys(191)Glu,Lys(191)Gln,Arg(188)Glu,Arg(188)Gln,Lys(183)Glu。
至于符號(hào)說明，例如Ala(49)Gln指的是圖1(SEQ ID NO:2)第49位的Ala被Gln取代。
優(yōu)選變化為微不足道的，如不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的折疊或活性的保守氨基酸取代。下文所示的是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的保守氨基酸取代的例子芳香族苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸疏水的亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸極性的谷氨酰胺，天冬酰胺堿性的精氨酸，賴氨酸，組氨酸酸性的天冬氨酸，谷氨酸小的丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸當(dāng)然，熟練的技術(shù)人員可根據(jù)包括上述那些在內(nèi)的很多因素決定氨基酸取代的數(shù)目。一般而言，根據(jù)目的，任何給定KGF-2多肽的取代數(shù)目不超過50,40,30,20,10,5或3個(gè)。例如，在KGF-2 C-末端一些可改善穩(wěn)定性的取代描述于上文和實(shí)施例22中。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)，244:1081-1085(1989))可鑒定KGF-2中對(duì)功能至關(guān)重要的氨基酸。后一種方法在分子中的每個(gè)殘基處導(dǎo)入單個(gè)丙氨酸突變，然后檢測(cè)所得突變體分子的生物活性，如受體結(jié)合或體外和體內(nèi)增殖活性(例見實(shí)施例10和11)。通過結(jié)構(gòu)分析，如結(jié)晶作用，核磁共振或光親和標(biāo)記也可確定對(duì)配體-受體結(jié)合至關(guān)重要的位點(diǎn)(例見Smith等人，分子生物學(xué)雜志，224:899-904(1992)；和de Vos等人，科學(xué)，255:306-312(1992))。
本發(fā)明的另一方面是用絲氨酸取代氨基酸第37和106和150位的半胱氨酸。半胱氨酸的奇數(shù)數(shù)目意味著至少一個(gè)半胱氨酸殘基可用于分子間交聯(lián)或成鍵，所述交聯(lián)或成鍵可導(dǎo)致蛋白質(zhì)采取不符合需要的四級(jí)結(jié)構(gòu)。一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸被絲氨酸或例如丙氨酸所取代的新的KGF-2蛋白一般以較高得率的可溶的、正確折疊的蛋白質(zhì)形式被純化。盡管未被證實(shí)，但據(jù)信第106位的半胱氨酸殘基對(duì)于功能是至關(guān)重要的，此半胱氨酸在所有其它FGF家族成員中是高度保守的。
本發(fā)明的另一方面是KGF-2與其它蛋白質(zhì)或其片段的融合蛋白，如與其它FGF蛋白，如KGF(FGF-7),bFGF,aFGF,FGF-5,FGF-6等的融合蛋白或雜合體。已報(bào)道了KGF(FGF-7)的這種雜合體。在公開的PCT申請(qǐng)?zhí)?0/08771中，產(chǎn)生了由KGF的前40個(gè)氨基酸殘基和aFGF的C-末端部分組成的嵌合蛋白。據(jù)報(bào)道該嵌合體象KGF一樣靶向角質(zhì)形成細(xì)胞，但缺乏對(duì)肝素的敏感性，后者是aFGF而不是KGF的特征。與免疫球蛋白(IgG)恒定區(qū)的部分融合而成的融合蛋白經(jīng)常顯示出增加的體內(nèi)半壽期。由人CD4多肽前2個(gè)結(jié)構(gòu)域和哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各個(gè)區(qū)域組成的嵌合蛋白已顯示出這一點(diǎn)(歐洲專利申請(qǐng)，公開號(hào)為394827,Traunecker等人，自然，331,84-86(1988))。具有二硫鍵連接的二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白也能更有效地結(jié)合單獨(dú)的單體分子(Fountoulakis等人，生物化學(xué)雜志，270:3958-3964(1995))。KGF-2的抗原性/親水部分如圖4A-4E所述，KGF-2蛋白中有4個(gè)主要的高度親水性區(qū)域。即氨基酸殘基Gly41-Asn71,Lys91-Ser109,Asn135-Tyr164和Asn181-Ala199[SEQ ID NO:25-28]。還有另外兩個(gè)較短的推測(cè)抗原性區(qū)域，Gln74-Arg78和Gln170-Gln175。已知親水性部分主要位于蛋白質(zhì)的外部(表面)，因此，便于抗體識(shí)別這些區(qū)域。所述區(qū)域似乎也與KGF-2和其受體的結(jié)合相關(guān)。得自這些區(qū)域的合成肽可干擾KGF-2與其受體的結(jié)合，因此阻斷了蛋白質(zhì)的功能。得自該蛋白質(zhì)親水性部分的合成肽也可以是激動(dòng)劑，即模擬KGF-2的功能。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有KGF-2親水性區(qū)域的分離的多肽，其中所述多肽的長(zhǎng)度不超過150個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過100,75或50個(gè)氨基酸，該多肽含有一個(gè)或多個(gè)上述KGF-2親水性區(qū)域?；瘜W(xué)修飾可進(jìn)一步修飾KGF野生型和類似物以使其含有非蛋白質(zhì)的正常部分的其它化學(xué)組成成分。那些衍生化的組成成分可改善該蛋白質(zhì)的溶解性、生物半壽期或吸附作用。所述組成成分也可以減少或消除該蛋白質(zhì)任何不必要的副作用等等。有關(guān)這些組成成分的綜述例見REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack出版公司，Easton,PA(1990)。聚乙二醇(PEG)是一種已用于制備治療用蛋白質(zhì)的這類化學(xué)組成成分。PEG與蛋白質(zhì)的結(jié)合已顯示出可保護(hù)蛋白質(zhì)使之免受蛋白酶水解，Sada等人，發(fā)酵生物工程雜志，71:137-139(1991)?？墒褂枚喾N方法來結(jié)合某些PEG組成成分，例見Abuchowski等人，《用作藥物的酶》(Holcerberg和Roberts編)，p367-383(1981)。很多公開的專利描述了PEG衍生物和如何制備它們的方法，例見Ono等人，美國專利5,342,940；Nitecki等人，美國專利5,089,261；Delgado等人，美國專利5,349,052。通常，PEG分子通過蛋白質(zhì)上的反應(yīng)性基團(tuán)與該蛋白質(zhì)連接。相對(duì)而言，氨基基團(tuán)，如賴氨酸上的氨基基團(tuán)或蛋白質(zhì)的氨基末端便于這種結(jié)合。
有關(guān)“多肽和肽”這一章中提及的每篇文獻(xiàn)，其全文列入本文作為參考。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明分離的DNA分子的載體，用重組載體進(jìn)行基因工程改造的宿主細(xì)胞，和通過重組技術(shù)生產(chǎn)KGF-2多肽或其片段的方法。
可使用本發(fā)明多肽的片段或部分通過肽合成來生產(chǎn)相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽；因此，這些片段可用作生產(chǎn)全長(zhǎng)多肽的中間體。可使用本發(fā)明多核苷酸的片段或部分來合成本發(fā)明全長(zhǎng)的多核苷酸。本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體進(jìn)行基因工程改造的宿主細(xì)胞，和通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法。
用本發(fā)明的載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述載體可以是例如克隆載體或表達(dá)載體。載體的形式可以是例如質(zhì)粒，病毒顆粒，噬菌體等等?？稍谶m當(dāng)加以改進(jìn)以激活啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增KGF-2基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)改造的宿主細(xì)胞。如溫度，pH等的培養(yǎng)條件是選用來表達(dá)的宿主細(xì)胞以前所用的那些條件，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)是顯而易見的。
通過重組技術(shù)可將本發(fā)明的多核苷酸用于生產(chǎn)多肽，因此，例如，所述多核苷酸可包含在多種表達(dá)載體中的任一種中以表達(dá)多肽。這種載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA、病毒DNA(如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒和假狂犬病病毒)之聯(lián)合的載體。然而，只要能在宿主中復(fù)制和存活，任何其它的載體都可使用。
可通過多種方法將適當(dāng)?shù)腄NA序列插入載體。通常，通過本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶位點(diǎn)。這種方法和其它方法應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
表達(dá)載體中的DNA序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(啟動(dòng)子)有效地相連以介導(dǎo)cDNA合成。至于這種啟動(dòng)子的代表性例子，應(yīng)提及的有LTR或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌lac或trp，噬菌體λPL啟動(dòng)子和已知能控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或它們的病毒中的基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。表達(dá)載體也含有用于起始翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體也包括用于增強(qiáng)表達(dá)的適當(dāng)序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因以提供可用于選擇已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
可使用含有上文所述適當(dāng)?shù)腄NA序列以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或控制序列的載體來轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗饕允顾拗鞅磉_(dá)蛋白質(zhì)。
至于適當(dāng)宿主的代表性例子，應(yīng)提及的有細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌，鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2和Spodoptera Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO,COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞；腺病毒；植物細(xì)胞等。根據(jù)本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能掌握如何選擇適當(dāng)?shù)乃拗鳌?br> 更具體地，本發(fā)明也包括含有一個(gè)或多個(gè)上文廣泛描述的序列的重組構(gòu)建體。這些構(gòu)建體含有載體，如質(zhì)?；虿《据d體，其中以正向或反向插入了本發(fā)明的序列。在此實(shí)施方案優(yōu)選的方面，該構(gòu)建體進(jìn)一步包含與該序列有效相連的調(diào)控序列，如啟動(dòng)子。大量的適當(dāng)?shù)妮d體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并可商購。列出下列載體是為了舉例細(xì)菌pQE70,pQE60,pQE-9(Qiagen),pBS,pDIO,phagescript,psiX174,pBluescript SK,pbsks,pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A(Stratagene)；ptrc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5(Pharmacia)；真核細(xì)胞pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1,pSG(Stratagene),pSVK3,pBPV,pMSG,pSVL(Pharmacia)。然而，只要能在宿主中復(fù)制和存活，任何其它的質(zhì)粒或載體都可使用。
可使用具有選擇性標(biāo)記的CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它載體從任何合乎需要的基因中選擇啟動(dòng)子區(qū)域。兩個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體是pKK232-8和pCM7。特別命名的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI啟動(dòng)子，lacZ啟動(dòng)子，T3啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子，gpt啟動(dòng)子，λPR、PL啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子。真核啟動(dòng)子包括CMV即早期啟動(dòng)子，HSV胸苷激酶啟動(dòng)子，早期和晚期SV40啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR啟動(dòng)子和小鼠金屬硫蛋白-Ⅰ啟動(dòng)子。適當(dāng)載體和啟動(dòng)子的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞；或者宿主細(xì)胞也可以是原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞?？赏ㄟ^磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis,L等人，分子生物學(xué)基礎(chǔ)方法(1986))將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。
可以常規(guī)方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體以產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?；蛘撸部赏ㄟ^常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在適當(dāng)啟動(dòng)子的控制下，成熟的蛋白質(zhì)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)。使用衍生自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，也可利用無細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)來產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)?？稍谠撕驼婧怂拗髦惺褂玫倪m當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體描述于Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港，紐約(1989)，該文獻(xiàn)已列入本文作為參考。
通過在載體中插入增強(qiáng)子序列可增加高等真核細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是對(duì)啟動(dòng)子起作用以增加其轉(zhuǎn)錄的順式作用的DNA元件，通常約為10至300bp。例子包括復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的第100-270bp的SV40增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。
為了將翻譯的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、外周質(zhì)空間或胞外環(huán)境中，可將適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)摻入被表達(dá)的多肽中。所述信號(hào)對(duì)于該多肽而言可以是內(nèi)源的，也可以是外源的。
多肽可以經(jīng)修飾的形式，如融合蛋白的形式被表達(dá)，多肽不僅可包括分泌信號(hào)，也可包括其它的異源功能區(qū)域。例如，可在多肽的N-末端加上另外的氨基酸區(qū)域，尤其是帶電的氨基酸以改善多肽在宿主細(xì)胞中、純化過程中或隨后的處理和儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性和持久性。也可以在多肽中加入肽組成成分以便于純化，最終制備多肽之前可除去這類區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知在多肽中加入肽組成成分以引發(fā)分泌或外泌，改善穩(wěn)定性和便于純化等等，這是本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)。優(yōu)選的融合蛋白含有得自免疫球蛋白的異源區(qū)域，該區(qū)域可用于增溶受體。例如，EP-A-0464533(加拿大同族2045869)中公開了含有免疫球蛋白分子恒定區(qū)各個(gè)部分和另一種人蛋白質(zhì)或其部分的融合蛋白。在很多情況下，融合蛋白中的Fc部分對(duì)于治療和診斷用途十分有利，因此，導(dǎo)致例如藥物動(dòng)力學(xué)特性有所改善(EP-A0232262)。另一方面，對(duì)于一些應(yīng)用而言，需要在融合蛋白以所述有利的方式被表達(dá)、檢測(cè)和純化之后缺失掉Fc部分。如當(dāng)Fc部分成為治療和診斷用途的障礙時(shí)，如當(dāng)融合蛋白被用作免疫接種用的免疫原時(shí)即是如此。例如在篩選藥物時(shí)，將如shIL-5之類的人蛋白質(zhì)與Fc部分融合以進(jìn)行高生產(chǎn)率篩選試驗(yàn)來鑒定hIL-5的拮抗劑，例見D.Bennett等人，分子識(shí)別雜志，第8卷，52-58(1995)和K-Johanson等人，生物化學(xué)雜志，Vol.270,No.16,p9459-9471(1995)。
通常，重組的表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的抗性標(biāo)記，如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母的TRP1基因，和得自高表達(dá)基因的啟動(dòng)子以介導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這種啟動(dòng)子可得自編碼如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)之類的糖酵解酶，α-因子，酸性磷酸酶或熱休克蛋白等的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列與翻譯起始和終止序列，優(yōu)選與能介導(dǎo)被翻譯的蛋白質(zhì)分泌至外周間隙或胞外基質(zhì)中的前導(dǎo)序列以適當(dāng)?shù)姆绞窖b配在一起。任選異源序列可編碼包括賦予所需特征的N-末端鑒定肽的融合蛋白，所述特征如所表達(dá)重組蛋白的穩(wěn)定化或純化過程的簡(jiǎn)化。
通過將與功能性的啟動(dòng)子處于有效的閱讀相中的編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列以及適當(dāng)?shù)姆g起始和終止信號(hào)一起插入可構(gòu)建用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體。載體可含有一個(gè)或多個(gè)表型選擇性標(biāo)記和一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以確保載體的維持并在必要時(shí)提供宿主內(nèi)的擴(kuò)增。盡管也可利用其它的選擇，但用于轉(zhuǎn)化的合適的原核宿主包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的多個(gè)種。
作為代表性的而非局限性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體可含有選擇性標(biāo)記和得自含有已知克隆載體pBR322(ATCC37017)之遺傳元件的商購質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。這種可商購載體包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)和GEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)。這些pBR322“骨架”部分與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和欲表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列聯(lián)合在一起。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，通過適當(dāng)?shù)姆绞?如溫度變化或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選定的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
一般通過離心收獲細(xì)胞，通過物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保留所得的粗提取物以進(jìn)一步純化。
通過包括冷凍-融化循環(huán)，超聲處理，機(jī)械破碎，或使用細(xì)胞裂解劑等在內(nèi)的任何便利方法可破碎用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
可使用多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括Gluzman，細(xì)胞，23:175(1981)所述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7系，以及能表達(dá)可容性載體的其它細(xì)胞系，如C127,3T3,CHO,HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可含有復(fù)制起點(diǎn)，合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，和任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’側(cè)翼的非轉(zhuǎn)錄序列。可使用得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列提供所需的非轉(zhuǎn)錄的遺傳元件。
通過包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陽離子或陰離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析等的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化KGF-2多肽。必要時(shí)，可進(jìn)行蛋白質(zhì)的重折疊步驟來完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型。最后，可使用高效液相層析(HPLC)完成最終的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或由原核或真核宿主(如培養(yǎng)中的細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)通過重組技術(shù)產(chǎn)生。取決于重組生產(chǎn)方法中所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。KGF-2的診斷和治療應(yīng)用下文章節(jié)中所用的“KGF-2”是指本文所述的全長(zhǎng)和成熟形式的KGF-2，以及本文所述的KGF-2類似物，衍生物和突變體。本發(fā)明也涉及將KGF-2基因用作診斷試驗(yàn)的一部分以檢測(cè)與KGF-2核酸序列中存在突變有關(guān)的疾病或?qū)λ黾膊〉囊赘行浴?br> 可通過多種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)KGF-2基因內(nèi)攜有突變的個(gè)體。用于診斷的核酸可得自病人的細(xì)胞，如血液，尿，唾液，組織活檢和尸檢材料?？芍苯訉⒒蚪MDNA用于檢測(cè)，或在分析前，通過使用PCR(Saiki等，自然，324:163-166(1986))酶促擴(kuò)增基因組DNA。也可將RNA或cDNA用于相同目的。例如，可使用與編碼KGF-2的核酸互補(bǔ)的PCR引物來鑒定和分析KGF-2突變。例如，通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物與正?；蛐驮诖笮∩系淖兓蓹z測(cè)出缺失和插入。通過將已擴(kuò)增的DNA與經(jīng)放射性標(biāo)記的KGF-2 RNA，或者經(jīng)放射性標(biāo)記的KGF-2反義DNA序列雜交可鑒定出點(diǎn)突變。通過RNA酶A消化或通過解鏈溫度的差異可將完全匹配的序列與錯(cuò)配的雙螺旋區(qū)分開。
通過在含或不含變性劑的凝膠上檢測(cè)DNA片段電泳遷移率的變化可進(jìn)行基于DNA序列差異的基因試驗(yàn)。通過高分辨率的凝膠電泳肉眼可見小序列缺失和插入。在變性的甲酰胺梯度凝膠上可區(qū)分不同序列的DNA片段，在所述凝膠中，根據(jù)不同DNA片段特殊的解鏈或部分解鏈溫度，其遷移率被阻滯在凝膠的不同位置(例見Myers等，科學(xué)，230:1242(1985))。
通過如RNA酶和S1保護(hù)作用的核酶保護(hù)試驗(yàn)或化學(xué)裂解方法(如Cotton等，PNAS,USA,85:4397-4401(1985))也可揭示特定位置處的序列變化。
因此，通過諸如雜交，RNA酶保護(hù)作用，化學(xué)裂解，直接DNA測(cè)序或使用限制性酶(如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡之類的方法可檢測(cè)特定的DNA序列。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測(cè)序外，也可通過原位分析來檢測(cè)突變。
本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)各種組織中KGF-2蛋白水平之變化的診斷測(cè)定，因?yàn)橄鄬?duì)于正常的對(duì)照組織樣品而言，該蛋白質(zhì)的過量表達(dá)可檢測(cè)疾病或?qū)膊〉囊赘行缘拇嬖冢黾膊∪缒[瘤。用于檢測(cè)得自宿主的樣品中KGF-2蛋白水平的試驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，這些方法包括放射性免疫測(cè)定，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定，Western印跡分析，ELISA測(cè)定和“夾心”測(cè)定。ELISA測(cè)定(Coligan等，免疫學(xué)最新方法，1(2)，第6章，(1991))起初包括制備特異于KGF-2抗原的抗體，優(yōu)選為單克隆抗體。另外還制備抗該單克隆抗體的報(bào)道抗體。報(bào)道抗體上結(jié)合有可檢測(cè)的試劑，如放射活性，熒光標(biāo)記或，在此例中為辣根過氧化物酶。從宿主體內(nèi)取樣，將樣品置于能與樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合的固相支持物，如聚苯乙烯盤上保溫。然后通過與非特異性蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白一起保溫以覆蓋盤上任何游離的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，接著，使單克隆抗體與聚苯乙烯盤上結(jié)合的任何KGF-2蛋白結(jié)合。用緩沖液洗去所有未結(jié)合的單克隆抗體。此時(shí)將與辣根過氧化物酶連接的報(bào)道抗體置于盤中，使報(bào)道抗體與結(jié)合于KGF-2的任何單克隆抗體結(jié)合，然后洗去未結(jié)合的報(bào)道抗體。在盤中加入過氧化物酶底物，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比時(shí)，在給定時(shí)間內(nèi)顯色的量即為給定體積的病人樣品中存在的KGF-2蛋白的量的測(cè)量結(jié)果。
也可使用競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，其中特異于KGF-2的抗體與固相支持物結(jié)合，將經(jīng)標(biāo)記的KGF-2和得自宿主的樣品在固相支持物上穿過，通過例如液體閃爍層析檢測(cè)到的標(biāo)記物的量與樣品中KGF-2的量相關(guān)。
“夾心”試驗(yàn)類似于ELISA測(cè)定，在“夾心”測(cè)定中，KGF-2穿過固相支持物，并與固相支持物上結(jié)合的抗體相結(jié)合。然后使第二抗體與KGF-2結(jié)合。然后使特異于第二抗體的經(jīng)標(biāo)記的第三抗體穿過固相支持物并與第二抗體結(jié)合，再確定量的大小。
可將所述多肽，其片段或其它衍生物，或它們的類似物，或表達(dá)它們的細(xì)胞用作免疫原以產(chǎn)生其抗體。這些抗體可以是例如多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合的、單鏈的、人源化的抗體以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的多種方法產(chǎn)生這種抗體和片段。
通過將所述多肽直接注射至動(dòng)物體內(nèi)或通過給動(dòng)物，優(yōu)選為非人類動(dòng)物施用所述多肽可得到針對(duì)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明序列的多肽而產(chǎn)生的抗體。然后，如此得到的抗體會(huì)結(jié)合多肽自身。按此方法，甚至僅編碼多肽一個(gè)片段的序列也可用于產(chǎn)生能結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。然后可將這種抗體用于從表達(dá)所述多肽的組織中分離該多肽。
為了制備單克隆抗體，可使用能提供通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的任何技術(shù)。例如雜交瘤技術(shù)(Kohler & Milstein，自然，256:495-497(1975)),trioma技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，今日免疫學(xué)，4:72(1983))和用于產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，單克隆抗體和癌癥療法，Alan R.Liss,Inc,p77-96(1985))。
經(jīng)描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)也適于產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。也可使用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)針對(duì)本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
可使用本發(fā)明多肽刺激新血管的生長(zhǎng)或血管生成。尤其是，本發(fā)明的多肽可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。因此，本發(fā)明提供了將這種多肽，或編碼這種多肽的多核苷酸用于治療目的的方法，所述治療目的如刺激上皮細(xì)胞增殖和基底的角質(zhì)形成細(xì)胞以使創(chuàng)傷愈合，以及刺激毛囊產(chǎn)生和治愈真皮創(chuàng)傷。
如上所述，本發(fā)明的多肽可用來通過刺激上皮細(xì)胞增殖而治愈真皮創(chuàng)傷。這些創(chuàng)傷可以是淺表的，也可以是很深并涉及皮膚之真皮和表皮的損害。因此，本發(fā)明提供了促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的方法，所述方法包括給個(gè)體施用有效量的KGF-2。
施用KGF-2的個(gè)體可以是能以正常的速率治愈創(chuàng)傷，也可以是愈合受損。當(dāng)給愈合未受損的個(gè)體施用時(shí)，施用KGF-2可加快正常的愈合過程。當(dāng)給愈合受損的個(gè)體施用時(shí)，施用KGF-2便于創(chuàng)傷的愈合，否則的話，創(chuàng)傷愈合將很緩慢或根本不愈合。如下文所述，很多痛苦和疾病可導(dǎo)致愈合受損。這些痛苦和疾病包括糖尿病(如Ⅱ型糖尿病)，同時(shí)用類固醇和其它藥劑治療，和局部缺血障礙或受傷。已表現(xiàn)出損害創(chuàng)傷愈合的類固醇包括可的松，氫化可的松，地塞米松和甲基氫化潑尼松。
非類固醇類化合物，如奧曲肽乙酸鹽已表現(xiàn)出會(huì)損害創(chuàng)傷愈合。Waddell,B.等，美國外科手術(shù)，63:446-49(1997)。據(jù)信本發(fā)明可促進(jìn)受這種非類固醇藥劑治療的個(gè)體的創(chuàng)傷愈合。
多種生長(zhǎng)因子已顯示出可促進(jìn)愈合受損之個(gè)體的創(chuàng)傷愈合，例見Steed,D等，J.Am.Coll.Surg,183:61-64(1996)；Richard,J等，糖尿病養(yǎng)護(hù)(Diabetes Care),18:64-69(1995)；Steed,D.,J.Vasc.Surg,21:71-78(1995)；Kelley,S等，Proc.Soc.Exp.Biol.,194:320-326(1990)。這些生長(zhǎng)因子包括生長(zhǎng)激素釋放因子，血小板衍生的生長(zhǎng)因子，和堿性的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。因此，本發(fā)明也包括聯(lián)合施用KGF-2和一種或多種可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的其它生長(zhǎng)因子或其它藥劑。
本發(fā)明也提供了促進(jìn)以正常速率愈合創(chuàng)傷和愈合受損的兩種個(gè)體中吻合愈合和由外科手術(shù)導(dǎo)致的其它創(chuàng)傷的愈合的方法。所述方法包括在吻合術(shù)或其它外科手術(shù)之前，之后和/或過程中給個(gè)體施用有效量的KGF-2。吻合是兩個(gè)管狀結(jié)構(gòu)的連接，例如，當(dāng)中間一段腸被除去，剩下的部分相互連接以重新構(gòu)成腸道時(shí)即會(huì)發(fā)生吻合。與皮膚愈合不同，吻合傷口的愈合過程一般看不清楚。另外，至少胃腸道中的創(chuàng)傷愈合在無并發(fā)癥的情況下可快速發(fā)生；然而，并發(fā)癥經(jīng)常需要由額外的外科手術(shù)來糾正，Thornton,F和Barbul,A，北美外科手術(shù)及臨床(Surg.Clin.North Am.),77:549-573(1997)。如實(shí)施例21和28所示，結(jié)腸吻合術(shù)后用KGF-2治療可導(dǎo)致腹膜泄漏和吻合收縮現(xiàn)象顯著減少。據(jù)信KGF-2是通過加快愈合進(jìn)程從而降低因這種進(jìn)程引發(fā)的并發(fā)癥發(fā)生概率，而導(dǎo)致這些結(jié)果的。
因此，本發(fā)明也提供了在以正常速率愈合創(chuàng)傷或愈合受損的個(gè)體中于吻合術(shù)或其它外科手術(shù)后加快創(chuàng)傷愈合的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。
也可使用本發(fā)明的多肽刺激細(xì)胞的分化，所述細(xì)胞如肌肉細(xì)胞，組成神經(jīng)組織的細(xì)胞，前列腺細(xì)胞和肺細(xì)胞。
KGF-2可在臨床上用于在正常個(gè)體和患有會(huì)誘導(dǎo)不正常的創(chuàng)傷愈合之疾病的個(gè)體中刺激創(chuàng)傷的傷口愈合，所述創(chuàng)傷包括外科傷口，切除術(shù)的傷口，涉及真皮和表皮損傷的深層創(chuàng)傷，眼組織創(chuàng)傷，牙組織創(chuàng)傷，口腔創(chuàng)傷，糖尿病患者的潰瘍，皮膚潰瘍，肘潰瘍，動(dòng)脈潰瘍，靜脈停滯潰瘍，因暴露于熱或化合物引起的灼傷，所述疾病如尿毒癥，營養(yǎng)不良，維生素缺乏癥，肥胖癥，感染，免疫抑制和與用類固醇，放射療法，抗腫瘤藥物和抗代謝物全身性治療相關(guān)的并發(fā)癥。KGF-2可被用于促進(jìn)與局部缺血和局部缺血損傷相關(guān)之創(chuàng)傷的愈合，所述創(chuàng)傷如由靜脈循環(huán)系統(tǒng)回流受損和/或不足導(dǎo)致的慢性靜脈腿潰瘍。
也可使用KGF-2來促進(jìn)皮損傷后的皮重建。另外，也可使用KGF-2來增加表皮的抗張強(qiáng)度和表皮厚度。
也可使用KGF-2來增加皮膚移植物與創(chuàng)傷床的粘附性，并刺激創(chuàng)傷床處重新形成上皮。下文列出了可使用KGF-2增加其與創(chuàng)傷床的粘附性的移植物類型自體移植物，人工皮膚，同種移植物，自體真皮移植物，自體表皮移植物，無血管移植物，Blair-Brown移植物，骨移植物，胚胎期形成的移植物，皮膚移植物，延遲的移植物，真皮移植物，表皮移植物，筋膜移植物，全層皮移植片，異源移植物，異種移植物，同種移植物，增生性移植物，角膜薄層移植物，網(wǎng)眼移植物，粘膜移植物，Ollier-Thiersch移植物，網(wǎng)膜移植物，補(bǔ)片移植物，蒂移植物，全層角膜移植物，分層皮移植片，厚分層皮移植片?？墒褂肒GF-2促進(jìn)皮膚強(qiáng)度并改善老化皮膚的外觀。
據(jù)信KGF-2也可使肝細(xì)胞的增殖，和肺，乳房，胰腺，胃，小腸和大腸中的上皮細(xì)胞的增殖產(chǎn)生變化。KGF-2可促進(jìn)如皮脂細(xì)胞，毛囊，肝細(xì)胞，Ⅱ型肺細(xì)胞，產(chǎn)生粘蛋白的杯狀細(xì)胞之類的上皮細(xì)胞，和其它上皮細(xì)胞以及皮膚，肺，肝臟，腎臟和胃腸道中所含的它們的祖細(xì)胞的增殖。因此，KGF-2可刺激肝細(xì)胞的增殖和分化，故KGF-2可被用來緩解或治療肝臟疾病和如由肝硬變引起的暴發(fā)性肝臟疾病，由病毒性肝炎和毒性物質(zhì)(即撲熱息痛，四氯化碳和現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它肝毒素)引起的肝損害的病理狀態(tài)。也可使用KGF-2來刺激或促進(jìn)肝臟的再生。
也可使用KGF-2來降低由病毒感染的治療，放射療法，化學(xué)療法或其它治療引起的腸毒性副作用。KGF-2對(duì)小腸粘膜具有細(xì)胞保護(hù)性作用。KGF-2也可預(yù)防性地或治療性地用于預(yù)防或減少因化學(xué)療法，其它藥劑和病毒感染引起的粘膜炎并刺激粘膜炎(如口腔，食管，腸，結(jié)腸，直腸和肛門潰瘍)的愈合。因此，本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療粘膜疾病或病理學(xué)事件的方法，所述疾病或病理學(xué)事件包括潰瘍性結(jié)腸炎，Crohn’s疾病和粘膜被損害的其它疾病，所述方法包括施用有效量的KGF-2。類似地，本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療口腔(包括與咽和咽下部粘膜損傷相關(guān)的吞咽疼)，食管，胃，腸，結(jié)腸和直腸粘膜炎的方法，而不論導(dǎo)致所述損害的藥劑或用藥方式如何。
KGF-2也可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞和基底角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，因此，本發(fā)明也提供了刺激所述細(xì)胞類型增殖的方法，所述方法包括使細(xì)胞與有效量的KGF-2接觸。也可給個(gè)體施用有效量的KGF-2以體內(nèi)刺激細(xì)胞增殖，或使KGF-2在體外與這種細(xì)胞接觸。
本發(fā)明也提供了促進(jìn)泌尿道上皮愈合的方法，所述方法包括給個(gè)體施用有效量的KGF-2，因此，本發(fā)明提供了加速泌尿道上皮愈合或治療多種涉及泌尿道上皮細(xì)胞(即沿著尿道排列的細(xì)胞)的病理學(xué)的方法。包括導(dǎo)管插入術(shù)，外科手術(shù)，或細(xì)菌感染(如被可導(dǎo)致性傳播疾病，如淋病的致病因子感染)的多種機(jī)制均可能損害到含有這種細(xì)胞的組織層。
本發(fā)明也包括促進(jìn)雌性生殖道組織愈合的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。包括念珠菌感染，滴蟲病，加德納屬菌感染，淋病，衣原體，支原體感染和其它性傳播疾病的多種疾病可導(dǎo)致雌性生殖道的組織損傷。
如實(shí)施例10,18和19所示，KGF-2可刺激表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和增加表皮厚度。因此，在完整皮膚的再生；全層皮和部分厚度皮膚的缺陷，包括燒傷(即毛囊，汗腺和皮脂腺的重新分群)；和對(duì)如牛皮癬之類的其它皮膚缺陷的治療時(shí)可使用KGF-2。
KGF-2也可通過加速損害部位重新形成上皮而用于治療大皰性表皮松解，該病是上皮與其下面的真皮的粘附性缺陷，可導(dǎo)致經(jīng)常性的破潰和疼痛的水皰。KGF-2也可用于治療胃和十二指腸潰瘍，并可協(xié)助更快速地在粘膜襯里處愈合和使腺粘膜和十二指腸粘膜襯里再生而幫助潰瘍處愈合。如Crohn’s病和潰瘍性結(jié)腸炎等炎性腸疾病分別是導(dǎo)致小腸或大腸粘膜表面被破壞的疾病。因此，KGF-2也可用于促進(jìn)粘膜表面重新形成表面，目的是更快速地愈合并阻止炎性腸疾病的進(jìn)程。預(yù)期KGF-2治療對(duì)整個(gè)胃腸道的粘膜產(chǎn)生具有顯著的作用，可被用來保護(hù)腸粘膜使之免受被攝入的或外科手術(shù)后的有害物質(zhì)的影響。如上所述，也可使用KGF-2來促進(jìn)腸或結(jié)腸吻合術(shù)的愈合。KGF-2也可用于治療與KGF-2的表達(dá)不足有關(guān)的疾病。
另外，KGF-2也可用于預(yù)防和治愈因多種病理學(xué)狀態(tài)引起的對(duì)肺的損傷。作為一個(gè)生長(zhǎng)因子，KGF-2可刺激增殖和分化并促進(jìn)肺泡和支氣管上皮的修復(fù)以預(yù)防，緩解或治療急性或慢性肺損傷。例如，KGF-2可有效地治療會(huì)導(dǎo)致肺泡漸進(jìn)性損失的肺氣腫，和由吸煙和燒傷引起的、可導(dǎo)致支氣管上皮和肺泡壞死的吸入劑損傷。KGF-2也可用于刺激Ⅱ型肺細(xì)胞的增殖和分化，這有助于治療或預(yù)防如透明膜疾病之類的疾病，所述透明膜疾病比如有嬰兒呼吸窘迫綜合征和不成熟兒的支氣管肺發(fā)育異常。
導(dǎo)致急性腎衰竭的三個(gè)原因是腎前的(如心衰竭)，內(nèi)源性的(由化學(xué)治療劑誘導(dǎo)的腎中毒性)和腎后的(如尿道阻塞)，這些原因可導(dǎo)致腎小管細(xì)胞死亡，小管腔阻塞，和濾液回流至腎小球中(參見Thadhani等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，334:1448-1460(1996))。如胰島素類生長(zhǎng)因子l，成骨蛋白-1，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子等的生長(zhǎng)因子已顯示出具有改善動(dòng)物模型中腎疾病的潛力。Taub等，細(xì)胞因子，5:175-179(1993)；Vukicevic等，J.Am.Soc.Nephrol,7:1867(1996)。KGF-2也可刺激腎細(xì)胞的增殖和分化，因此可用于緩解或治療如急性和慢性腎衰竭和晚期腎疾病之類的腎疾病和病理學(xué)。
KGF-2也可刺激乳腺組織的增殖和分化，因此可用于促進(jìn)因外科手術(shù)，外傷或癌癥所致的乳腺組織損傷的愈合。
另外，也可使用KGF-2治療或預(yù)防糖尿病的發(fā)作。在剛被診斷為Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病，但仍維持有一些胰島細(xì)胞功能的病人中，可使用KGF-2來維持胰島功能從而緩解，延遲或防止疾病的永久表現(xiàn)。KGF-2也可被用作胰島細(xì)胞移植過程中的輔助物以改善或促進(jìn)胰島細(xì)胞的功能。
另外，KGF-2的抗炎癥特性對(duì)于治療其中炎癥是主要致病原因的急性和慢性疾病是有利的，所述疾病包括但不限于牛皮癬，濕疹，皮炎和/或關(guān)節(jié)炎。因此，本發(fā)明提供了預(yù)防或減輕個(gè)體中炎癥和涉及炎癥之疾病的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。
也可使用KGF-2促進(jìn)因外傷，外科手術(shù)或化學(xué)藥品所致?lián)p傷導(dǎo)致的腦組織損傷的愈合并緩解所述腦組織損傷。
另外，由于KGF-2可增加表皮的厚度，因此可使用該蛋白質(zhì)改善老化的皮膚，減少皮膚皺紋，減少外科手術(shù)后的疤痕。創(chuàng)傷組織的疤痕經(jīng)常涉及真皮成纖維細(xì)胞的過度增殖。如實(shí)施例10所示，KGF-2不刺激成纖維細(xì)胞的增殖，因此，KGF-2似乎是特異于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的有絲分裂原，并可誘導(dǎo)創(chuàng)傷愈合，同時(shí)形成最少量的疤痕。因此，本發(fā)明提供了促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，同時(shí)形成最少疤痕的方法，所述方法包括給個(gè)體施用有效量的KGF-2?？稍诋a(chǎn)生創(chuàng)傷的過程(如美容外科手術(shù)，偶發(fā)的或由利器導(dǎo)致的蓄意的組織外傷)之前，之中和/或之后施用KGF-2。
如上所述，KGF-2也可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊的增殖，因此，可使用KGF-2促進(jìn)禿頭和毛發(fā)移植病人中毛發(fā)的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的方法，所述方法包括施用足以刺激毛囊產(chǎn)生的量的KGF-2。
本發(fā)明也提供了保護(hù)個(gè)體免受電離輻射，化學(xué)療法或抗病毒劑治療之影響的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。本發(fā)明另外還提供了治療因暴露于電離輻射，化學(xué)治療劑或抗病毒劑所致的組織損害的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。個(gè)體可能因很多原因而暴露于電離輻射，這些原因包括治療目的(如治療過度增殖性疾病)，放射性同位素偶然地釋放至環(huán)境中的結(jié)果，或非侵害性醫(yī)學(xué)診斷方法(如X射線)過程中所致。另外，相當(dāng)一部分個(gè)體在其工作地點(diǎn)和家中暴露于放射性氡中。長(zhǎng)期連續(xù)的環(huán)境暴露已被用于計(jì)算估計(jì)壽命下降的估計(jì)值，Johnson,W和Kearfott,K，健康物理學(xué)，73:312-319(1997)。如實(shí)施例23所示，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可增強(qiáng)暴露于輻射之動(dòng)物的存活，因此，可使用KGF-2增強(qiáng)遭受輻射誘導(dǎo)之損傷的個(gè)體的存活率，保護(hù)個(gè)體使之免受亞致死劑量輻射的影響，在治療如過度增殖疾病的病痛時(shí)增加輻射的治療率。
也可使用KGF-2保護(hù)個(gè)體使之耐受正常情況下不能耐受的輻射，化學(xué)治療藥物或抗病毒劑的劑量。當(dāng)以此方式使用時(shí)，或要不然的話按本文所述使用時(shí)，可在輻射治療/暴露，化學(xué)療法或用抗病毒劑治療之前，之后和/或之中施用KGF-2。當(dāng)治療患有如過度增殖性疾病的晚期病痛的個(gè)體時(shí)，大劑量的輻射和化學(xué)治療劑特別有用。
另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療如輻射誘導(dǎo)的口腔和胃腸道損傷，粘膜炎，腸纖維變性，直腸炎，輻射誘導(dǎo)的肺纖維變性，輻射誘導(dǎo)的肺炎，輻射誘導(dǎo)的胸膜后縮，輻射誘導(dǎo)的生血綜合征，輻射誘導(dǎo)的骨髓中毒性之疾病的方法，所述方法包括給個(gè)體施用有效量的KGF-2。
KGF-2可單獨(dú)使用，也可與一種或多種能賦予抗輻射之保護(hù)作用的其它藥劑或其它藥劑聯(lián)合使用。多種細(xì)胞因子(如IL-1,TNF,IL-6,IL-12)已顯示出可賦予這種保護(hù)作用，例見Neta,R.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，173:1177(1991)。另外，IL-11顯示出可保護(hù)經(jīng)輻射和化學(xué)療法聯(lián)合處理后的小腸粘膜細(xì)胞(Du,X.X.等，血液，83:33(1994))和輻射誘導(dǎo)的胸?fù)p傷(Redlich,C.A.等，免疫學(xué)雜志，157:1705-1710(1996))。幾種生長(zhǎng)因子已顯示出可賦予針對(duì)輻射暴露的保護(hù)作用，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-3,Ding,I.等，腫瘤學(xué)報(bào)，36:337-340(1997)；Potten,C等，英國癌癥雜志，75:1454-1459(1997)。
本文所用的“個(gè)體”是指動(dòng)物，優(yōu)選指哺乳動(dòng)物(如類人猿，奶牛，馬，豬，公豬，綿羊，嚙齒動(dòng)物，山羊，狗，貓，雞，猴，兔，雪貂，鯨，海豚)，更優(yōu)選指人。
通常，使用KGF-2編碼氨基酸1至35或36的信號(hào)序列，通過雜交和/或計(jì)算機(jī)檢索的算法規(guī)則來鑒定分泌的蛋白質(zhì)。
可使用KGF-2的核苷酸序列通過雜交來分離5’序列，然后將含有受其天然啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列控制的KGF-2基因的質(zhì)粒用于體外研究，目的是鑒定出KGF-2基因表達(dá)的內(nèi)源性細(xì)胞的和病毒的反式激活蛋白。
在設(shè)計(jì)用于鑒定對(duì)KGF-2受體起作用的肽模擬物的實(shí)驗(yàn)中，也可將KGF-2蛋白用作陽性對(duì)照。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了將這種多肽、或編碼這種多肽的多核苷酸用于與科學(xué)研究、DNA合成和DNA載體的制備相關(guān)的體外目的和提供人類疾病之診斷和治療的目的的方法。
全長(zhǎng)KGF-2基因的片段可用作cDNA文庫的雜交探針以分離全長(zhǎng)的KGF-2基因和分離與所述基因具有高度序列相似性或相似的生物活性的其它基因。這種類型的探針一般至少具有20個(gè)堿基，然而，優(yōu)選探針具有至少30個(gè)堿基，盡管探針可含有更多個(gè)堿基，但一般不超過50個(gè)堿基。所述探針可被用來鑒定對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆和含有包括調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)域，外顯子和內(nèi)含子的完整KGF-2基因的基因組克隆。一個(gè)篩選的例子包括通過使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探針而分離KGF-2基因的編碼區(qū)。使用具有與本發(fā)明基因互補(bǔ)的序列的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸篩選人cDNA文庫，基因組DNA文庫或cDNA文庫以確定探針與文庫的哪些成員雜交。
本發(fā)明還提供了鑒定KGF-2多肽之受體的方法。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法，例如配體淘選和FACS分選(Coligan等，免疫學(xué)最新方法，1(2)，第5章(1991))可鑒定出編碼該受體的基因。優(yōu)選進(jìn)行的表達(dá)克隆中聚腺苷酸化的RNA制備自對(duì)多肽反應(yīng)的細(xì)胞，由此RNA產(chǎn)生的cDNA文庫被分成若干群，并被用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或?qū)Χ嚯牟环磻?yīng)的其它細(xì)胞。將在玻璃載玻片上生長(zhǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露于經(jīng)標(biāo)記的多肽中?？赏ㄟ^包括位點(diǎn)特異性蛋白激酶之識(shí)別位點(diǎn)的碘化作用或包含作用等的多種方式標(biāo)記所述多肽。固定和保溫之后，對(duì)載玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒定陽性群，制備亞群，使用重復(fù)的亞分群和重新篩選的方法重新轉(zhuǎn)染，最終產(chǎn)生編碼推定受體的單一克隆。
作為受體鑒定的另一可替代方法，經(jīng)標(biāo)記的多肽可與表達(dá)受體分子的細(xì)胞膜或提取物制品進(jìn)行光親和連接。通過PAGE分析分辨交聯(lián)的物質(zhì)，并將所述物質(zhì)暴露于X-射線膠片。切下含有多肽受體的經(jīng)標(biāo)記復(fù)合物，分離成肽片段，并進(jìn)行蛋白質(zhì)微量測(cè)序。使用得自微量測(cè)序的氨基酸序列設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并的寡核苷酸探針以篩選cDNA文庫從而鑒定出編碼推定受體的基因。
本發(fā)明提供了篩選化合物以鑒定出可激發(fā)KGF-2作用或阻斷KGF-2功能的那些化合物的方法。這種測(cè)定的一個(gè)例子包括在角質(zhì)形成細(xì)胞可正常增殖的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，將哺乳動(dòng)物角質(zhì)形成細(xì)胞，欲篩選的化合物和3[H]胸苷相混合?？稍谌狈τY選的化合物的情況下進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，并與存在欲測(cè)定之化合物時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的量相比較以確定該化合物是否可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。
為了篩選拮抗劑，可在KGF-2存在下進(jìn)行相同的試驗(yàn)，測(cè)定該化合物阻止角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的能力，并測(cè)定拮抗劑的能力。通過測(cè)定3[H]胸苷摻入的液體閃爍層析確定角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的量。
在另一種方法中，可在化合物存在下將表達(dá)KGF-2受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或膜制品與經(jīng)標(biāo)記的KGF-2一起保溫，然后測(cè)定化合物增強(qiáng)或阻斷此相互作用的能力。或者，在存在或缺乏該化合物的情況下測(cè)定和比較KGF-2和受體間相互作用后已知的第二信使系統(tǒng)的反應(yīng)。這種第二信使系統(tǒng)包括但不限于cAMP鳥苷酸環(huán)化酶，離子通道或磷酸肌醇水解。
潛在的KGF-2拮抗劑的例子包括能與該多肽結(jié)合的抗體，或者有時(shí)為寡核苷酸?；蛘撸瑵撛诘腒GF-2拮抗劑可以是KGF-2突變體形式，該突變體形式能與KGF-2受體結(jié)合，但不引發(fā)產(chǎn)生第二信使反應(yīng)，因此，有效地阻斷了KGF-2的作用。
另一潛在的KGF-2拮抗劑是使用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體?？墒褂梅戳x技術(shù)通過三股螺旋的形成或者反義DNA或RNA來控制基因表達(dá)，這兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，使用編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸序列5’編碼部分設(shè)計(jì)長(zhǎng)度約為10至40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被設(shè)計(jì)成與涉及轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域互補(bǔ)(三股螺旋，例見Lee等，核酸研究，6:3073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241:456(1988)；和Dervan等，科學(xué)，251:1360(1991))，從而防止轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生KGF-2。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)與cDNA雜交并阻斷cDNA分子翻譯成KGF-2多肽(反義-Okano，神經(jīng)化學(xué)雜志，56:560(1991)；作為基因表達(dá)的反義抑制劑的寡脫氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton,FL(1988))。上述寡核苷酸也可提供給細(xì)胞以在體內(nèi)表達(dá)反義RNA或DNA，從而抑制KGF-2的產(chǎn)生。
潛在的KGF-2拮抗劑包括結(jié)合并占用KGF-2受體的結(jié)合位點(diǎn)從而使受體無法接近KGF-2，進(jìn)而其正常的生物學(xué)功受到抑制的小分子，這種小分子的例子包括但不限于小肽或肽類分子。
也可使用KGF-2拮抗劑抑制對(duì)腫瘤中新血管生長(zhǎng)或血管生成的誘導(dǎo)。由KGF-2刺激的血管生成對(duì)也可由本發(fā)明拮抗劑治療的幾種病理狀況同樣可起一定的作用，所述病理狀況包括糖尿病性視網(wǎng)膜病，和對(duì)病理組織生長(zhǎng)的抑制，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
也可使用KGF-2拮抗劑治療腎小球腎炎，腎小球腎炎的特征在于腎小球上皮細(xì)胞顯著增殖，形成充滿Bowman間隙的細(xì)胞團(tuán)塊。
也可使用拮抗劑來抑制外科手術(shù)后疤痕疙瘩形成中可見的疤痕組織的過量產(chǎn)生，心肌梗死后的纖維變性或與肺纖維變性和再狹窄相關(guān)的纖維損害。也可使用KGF-2拮抗劑治療由KGF-2刺激的其它增殖性疾病，包括癌癥和卡波西肉瘤。
也可使用KGF-2拮抗劑治療角膜炎，所述角膜炎是特征在于表皮細(xì)胞增殖的眼色素層炎癥對(duì)角膜深層的慢性浸潤(rùn)。
也可在具有下文所述的藥學(xué)可接受的載體的組合物中使用拮抗劑。
可將本發(fā)明的多肽，激動(dòng)劑和拮抗劑與適當(dāng)?shù)乃幱幂d體聯(lián)合使用以制成藥物組合物。這種組合物含有治療有效量的多肽，激動(dòng)劑或拮抗劑和藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。所述載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽溶液，葡聚糖，水，甘油，乙醇及其聯(lián)合。制劑應(yīng)適合施用的模式。
本發(fā)明也提供了含有一個(gè)或多個(gè)被本發(fā)明藥物組合物的一種或多種成分充滿的容器的藥物包裝或試劑盒。隨容器所附的是管理藥品或生物制品的制備，應(yīng)用或銷售的政府機(jī)構(gòu)建議形式的注意事項(xiàng)，該注意事項(xiàng)反映有關(guān)人用藥的制備，應(yīng)用或銷售得到了該機(jī)構(gòu)的許可。另外，也可將本發(fā)明的多肽，激動(dòng)劑和拮抗劑與其它治療性的化合物一起使用。
具有KGF-2活性的多肽可在藥物組合物中與一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑聯(lián)合施用。應(yīng)理解當(dāng)施用于人患者時(shí)，護(hù)理醫(yī)生在正確的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)可決定本發(fā)明藥物組合物每天的總用量。任何具體患者的特定治療有效劑量水平取決于多種因素，包括欲達(dá)到的反應(yīng)的類型和程度，所用其它藥劑的特殊組合(如果有的話)；患者的年齡，體重，健康狀況，性別和飲食；施用的時(shí)間，施用的途徑和組合物外泌的速率；治療的期限；與特定組合物聯(lián)合或同時(shí)使用的藥物(如化學(xué)治療劑)；和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的其它因素。本領(lǐng)域已知的適當(dāng)制劑見于Remington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton,PA。
考慮到各個(gè)患者的臨床條件(尤其是僅用KGF-2治療時(shí)的副作用)，KGF-2組合物釋放的位點(diǎn)，施用的方法，施用的計(jì)劃和實(shí)際操作人員已知的其它因素，以與良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式配制和服用治療所用的KGF-2組合物。因此，通過上述考慮可確定用于本文目的的“有效量”的KGF-2(包括KGF-2有效量)。
可以簡(jiǎn)便的方式，如口服，局部，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑施用所述藥物組合物。所施用藥物組合物的量應(yīng)能有效地治療和/或預(yù)防特異性的指征。在大多數(shù)情況下，考慮到施用的途徑，癥狀等，每天的劑量為每公斤體重約1微克至50毫克。在局部給藥的特殊情況下，優(yōu)選施用的劑量約為每平方厘米0.01微克至9毫克。
盡管如上所述，可在治療上斟酌劑量，但一般建議每份更優(yōu)選的劑量中胃腸外施用的KGF-2總的藥物有效量范圍為每天每公斤患者體重1微克至100毫克。如果連續(xù)給藥，一般以約1微克/公斤/小時(shí)至50微克/公斤/小時(shí)的劑量速率，通過每天1-4次注射，或者通過使用例如微泵連續(xù)地皮下灌注來施用KGF-2。也可使用靜脈內(nèi)袋裝溶液或瓶狀溶液。
如果持續(xù)天數(shù)大于某一最小數(shù)目(對(duì)小鼠而言為7天)，影響纖維蛋白溶解系統(tǒng)的KGF-2治療過程似乎是最適的。觀察變化所需的治療時(shí)間和治療后發(fā)生反應(yīng)的間隔長(zhǎng)度似乎隨所需影響的不同而不同。
通過緩釋系統(tǒng)也適于施用KGF-2。緩釋組合物適當(dāng)?shù)睦影ǔ尚挝镔|(zhì)形式(如薄膜或微膠囊)的半透性聚合物基質(zhì)。緩釋基質(zhì)包括聚交酯類(美國專利3,773,919,EP 58,481),L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(U.Sidman等，生物聚合物，22:547-556(1983))，聚(2-羥乙基異丁烯酸酯)(R.Langer等，生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志，15:167-277(1981)，和R.Langer，化學(xué)技術(shù)，12:98-105(1982))，乙烯乙酸乙烯基酯(R.Langer，文獻(xiàn)同上)或聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。緩釋的KGF-2組合物也包括脂質(zhì)體包裹的KGF-2。通過已知方法本身可制備含有KGF-2的脂質(zhì)體，所述方法如DE 3,218,121；Epstein等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，82:3688-3692(1985)；Hwang等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請(qǐng)83-118008；美國專利4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。一般而言，脂質(zhì)體是小的(約200-800埃)單層型，其中脂類含量大于類固醇的約30摩爾百分比，調(diào)節(jié)百分比，以達(dá)到最佳的KGF-2治療。
對(duì)于胃腸外施用而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，一般通過將所需純度水平的KGF-2以單位劑量的可注射形式(溶液，懸浮液或乳劑)與藥學(xué)可接受的載體混合來配制KGF-2，所述載體在所用劑量和濃度下對(duì)受體無毒性，并且與制劑中的其它成分相容。例如，優(yōu)選制劑不包括氧化劑和已知對(duì)多肽有害的其它化合物。
通常通過將KGF-2均勻和密切地與液體載體或精細(xì)分開的固體載體或這兩者接觸可制備制劑。然后，如有必要，將產(chǎn)物制成所需的制劑形狀。優(yōu)選載體是胃腸外載體，更優(yōu)選為與受體血液等滲的溶液。這種載體的例子包括水，鹽水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。如固定油和乙基油酸之類的不含水的載體以及脂質(zhì)體在本文中也是有用的。本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)?shù)闹苿┮娪赗emington’s PharmaceuticalSciences(最新版)，Mack出版公司，Easton,PA。
載體可適當(dāng)?shù)睾袠O少量的添加劑，如增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這種物質(zhì)在所用劑量和濃度下對(duì)受體是無毒性的，包括如磷酸鹽，檸檬酸鹽，琥珀酸，乙酸，和其它有機(jī)酸或其鹽的緩沖液；如抗壞血酸之類的抗氧化劑；低分子量(少于約10個(gè)殘基)的多肽，如多精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；單糖，二糖和包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精等的其它碳水化合物；如EDTA之類的螯合劑；如甘露醇或山梨醇之類的糖醇；如鈉之類的相反離子；和/或非離子型表面活性劑，如聚山梨酯，聚羥亞烴或PEG。
一般在pH約為3至8的條件下，以約為0.01微克/毫升至100毫克/毫升，優(yōu)選為0.01微克/毫升至10毫克/毫升的濃度在所述載體中配制KGF-2。應(yīng)理解使用上述某些賦形劑，載體或穩(wěn)定劑會(huì)導(dǎo)致KGF-2鹽的形成。
用于治療應(yīng)用的KGF-2應(yīng)是無菌的。通過穿過無菌的濾膜(如0.2微米的膜)進(jìn)行過濾可容易地完成除菌。治療用的KGF-2組合物一般被置于具有無菌出入口的容器中，例如，靜脈內(nèi)溶液袋，或具有可被皮下注射針頭穿透的塞子的小瓶。
通常，KGF-2可作為含水溶液或用于恢復(fù)的凍干制劑形式儲(chǔ)存在單位劑量或多劑量的容器中，例如，密閉的安瓿瓶或小瓶中。凍干制劑的一個(gè)例子是將5ml經(jīng)除菌過濾的1％(w/v)含水KGF-2溶液灌入10ml的小瓶，將所得混合物凍干。通過使用抑菌的注射用水恢復(fù)凍干的KGF-2可制備灌注溶液。
也可以以患者特異性的方式安排服藥以便為血液提供經(jīng)諸如RIA技術(shù)測(cè)定為預(yù)定濃度的KGF-2活性。因此，可調(diào)節(jié)患者的劑量安排以達(dá)到經(jīng)RIA測(cè)定為以約50-1000ng/ml，優(yōu)選為150-500ng/ml的濃度規(guī)則地不斷流過血液的水平。
本發(fā)明藥物組合物的施用方式有口服，直腸，胃腸外，腦池內(nèi)，真皮內(nèi)，陰道內(nèi)，腹膜內(nèi)，局部(通過粉末，軟膏，凝膠，乳油，滴劑或經(jīng)皮的補(bǔ)片)，頰，或口或鼻噴霧給藥。“藥學(xué)可接受的載體”是指無毒性的固體，半固體或液體填充劑，稀釋劑，包裹材料或任何形式的制劑輔助物。本文所用的術(shù)語“胃腸外”指的是包括靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，胸骨內(nèi)，皮下和動(dòng)脈內(nèi)注射和灌注等的施用模式。
根據(jù)本發(fā)明，KGF-2多肽，身為多肽的激動(dòng)劑和拮抗劑也可通過在體內(nèi)表達(dá)而得以應(yīng)用，這就是常說的“基因療法”。
因此，例如，可離體用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)對(duì)來自患者的細(xì)胞進(jìn)行改造，然后將經(jīng)改造的細(xì)胞提供給需用該多肽治療的患者。這種方法是本領(lǐng)域所熟知的方法。例如，可以通過本領(lǐng)域熟知的方法，利用含有編碼本發(fā)明多肽之RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行改造。
類似地，可通過例如本領(lǐng)域熟知的方法，在體內(nèi)改造細(xì)胞以在體內(nèi)表達(dá)多肽。本領(lǐng)域中已知，可給患者施用能產(chǎn)生含有編碼本發(fā)明多肽之RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)者細(xì)胞以在體內(nèi)改造細(xì)胞并在體內(nèi)表達(dá)多肽。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地掌握用來施用本發(fā)明多肽的這些和其它方法。例如，用于改造細(xì)胞的表達(dá)載體不僅可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒，也可以是腺病毒，所述腺病毒與適當(dāng)?shù)膫鬟f載體聯(lián)合后可用于在體內(nèi)改造細(xì)胞。其它傳遞載體的例子包括基于HSV的載體系統(tǒng)，腺相關(guān)病毒載體，和惰性的載體，如包被有葡聚糖的鐵顆粒。
可從中得到上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒，脾壞死病毒，如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，長(zhǎng)臂猿白血病病毒(gibbon apeleukemia virus)，人免疫缺損病毒，腺病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳癌病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體得自Moloney鼠白血病病毒。
載體包括一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子，可以使用的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR；SV40啟動(dòng)子；和人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Miller等，生物技術(shù)，第7卷，9:980-990(1989))或任何其它的啟動(dòng)子(例如細(xì)胞啟動(dòng)子，如包括但不限于組蛋白，polⅢ和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等的真核細(xì)胞啟動(dòng)子)?？墒褂玫钠渌《締?dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子，胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子，和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。鑒于本文的教導(dǎo)，合適啟動(dòng)子的選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列受適當(dāng)啟動(dòng)子的控制。可使用的適當(dāng)啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如MMT啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克蛋白啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ApoAⅠ啟動(dòng)子；人珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR(包括上文所述的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；和人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動(dòng)子。
可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)者細(xì)胞系?？杀晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞系的例子包括但不限于PES01,PA317,ψ-2,ψ-AM,PA12,T19-14X,VT-19-17-H2,ψCRE,ψCRIP,GP+E-86,GP+envAm12和Miller，人基因療法，1:5-14(1990)(全文列入本文作為參考文獻(xiàn))中所述的DAN細(xì)胞系。載體可通過本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。所述方法包括但不限于電穿孔，脂質(zhì)體的應(yīng)用，和CaPO4沉淀?；蛘咭部蓪⒛孓D(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體包裹在脂質(zhì)體中，或與脂類偶聯(lián)，然后施用于宿主。
生產(chǎn)者細(xì)胞系產(chǎn)生含有編碼多肽之核酸序列的感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。然后可使用這種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞會(huì)表達(dá)編碼多肽的核酸序列。可被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞，胚胎癌細(xì)胞以及造血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成肌細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。染色體測(cè)定本發(fā)明的序列也可用于染色體鑒定。該序列特異性地靶向并能與各個(gè)人染色體上的特定座位雜交。另外，目前迫切需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)。目前可用來標(biāo)記染色體座標(biāo)的基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑較少。將那些序列同與疾病相關(guān)之基因相聯(lián)系的重要的第一步是根據(jù)本發(fā)明將DNA作圖于染色體上。
簡(jiǎn)而言之，通過由cDNA制備PCR引物(優(yōu)選為15-25bp)可將序列作圖于染色體上。使用3’非翻譯區(qū)的計(jì)算機(jī)分析快速選擇引物，所述引物在基因組DNA中跨越的區(qū)域不超過一個(gè)外顯子，因而不會(huì)使擴(kuò)增過程變得復(fù)雜。然后使用這些引物進(jìn)行含有各個(gè)人染色體的體細(xì)胞雜合體的PCR篩選。只有那些含有對(duì)應(yīng)于引物的人基因的雜合體會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
體細(xì)胞雜合體的PCR作圖是將特定DNA排布于特定染色體上的快速方法。使用相同寡核苷酸引物，通過本發(fā)明，可以類似的方法，用得自特定染色體或大基因組克隆庫的一系列片段可進(jìn)行亞定位?？深愃频赜糜谧鲌D至其染色體的其它作圖策略包括原位雜交，用經(jīng)標(biāo)記的流式分選的染色體進(jìn)行預(yù)篩選和通過與構(gòu)建染色體特異性cDNA文庫雜交進(jìn)行預(yù)選擇。
可使用cDNA克隆與中期染色體涂布物的熒光原位雜交(FISH)一步提供精確的染色體定位。短至50或60個(gè)堿基的cDNA可使用此技術(shù)，有關(guān)此技術(shù)的綜述例見Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列被作圖于精確的染色體座位，即可將序列在染色體上的物理位置與基因圖譜資料相聯(lián)系，所述資料例見V.McKusick，人類的孟德爾遺傳(可通過約翰霍普金斯大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書館在網(wǎng)上得到)。然后通過連鎖分析(物理上相鄰的基因的共遺傳性)鑒定已作圖于相同染色體區(qū)域的基因和疾病之間的關(guān)系。
接著，必需確定患病和不患病的個(gè)體之間cDNA或基因組序列的差異。如果在一些或所有患病的個(gè)體中觀察到突變，而在任何正常的個(gè)體中均未觀察到突變，那么突變就可能是疾病的引發(fā)因子。
最新的物理作圖和基因作圖技術(shù)之分辨力表明，精確定位于與疾病相關(guān)之染色體區(qū)域的cDNA可以是50至500個(gè)潛在的致病基因中的一個(gè)(假定作圖分辨力為106個(gè)堿基，一個(gè)基因?yàn)?0kb)。
參照下列實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明；然而，應(yīng)理解本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。除非另有說明，所有的部分或量均為重量。
為了便于理解下列實(shí)施例，下面將描述一些常見的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)粒”被命名為首先是小寫的p和/或接著是大寫的字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘呤强缮藤彽?，公眾可不費(fèi)力地得到的，或者是可根據(jù)公知技術(shù)由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，與本文所述質(zhì)粒等價(jià)的質(zhì)粒是本領(lǐng)域中熟知的，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
DNA的“消化”指的是用僅對(duì)DNA中的某些序列起作用的限制性酶催化切割DNA。本文所用的多種限制性酶可以商購，其所用的反應(yīng)條件，輔因子和其它需求條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。為了進(jìn)行分析，一般在約20微升的緩沖溶液中將1微克質(zhì)?；駾NA片段與約2個(gè)單位的酶一起使用。為了分離DNA片段以構(gòu)建質(zhì)粒，一般在較大的體積中用20至250單位的酶消化5至50微克DNA。特定限制性酶的適當(dāng)緩沖液和底物的量由制造商指定。一般是在37℃下保溫約1小時(shí)，但可根據(jù)廠商的說明而改變保溫時(shí)間。消化后，直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳反應(yīng)產(chǎn)物以分離所需片段。
按Goeddel,D等，核酸研究，8:4057(1980)所述使用8％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行已切割片段的大小分離。
“寡核苷酸”指可以化學(xué)合成的一條單鏈多脫氧核苷酸或兩條互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈。所述合成的寡核苷酸沒有5’磷酸，因此，在存在激酶的條件下，沒有用ATP加入磷酸時(shí)不能與另一寡核苷酸相連。合成的寡核苷酸可以與未去磷酸化的片段相連。
“連接”指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis,T.等，Id.,p.146)。除非特別說明，每0.5μg近似等摩爾量的待連接DNA片段，可用已知的緩沖液和條件，用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)完成所述連接。
當(dāng)外源DNA已經(jīng)被導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，則該細(xì)胞已被所述DNA“轉(zhuǎn)化”。對(duì)于構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA來說，外源DNA可以被整合也可以不被整合(共價(jià)連接的)至染色體DNA間。例如對(duì)于原核生物和酵母而言，外源DNA可以保持在附加型元件如質(zhì)粒上。就真核細(xì)胞而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是其中外源DNA已經(jīng)被整合至染色體中以致可通過染色體復(fù)制遺傳至子代的細(xì)胞。通過真核細(xì)胞建立由含外源DNA之子代細(xì)胞的種群組成的細(xì)胞系或克隆的能力可證明這種能力。轉(zhuǎn)化的實(shí)例參見Graham,F.&Van der Eb,A.，病毒學(xué)(Virology),52:456-457(1973)。
“轉(zhuǎn)導(dǎo)”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”指細(xì)胞吸收外源DNA并將外源DNA整合至它們的染色體中的過程。例如可通過轉(zhuǎn)染(指細(xì)胞用以吸收DNA的各種技術(shù))或感染(用病毒將DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中)完成轉(zhuǎn)導(dǎo)。
實(shí)施例1KGF-2的細(xì)菌表達(dá)和純化將編碼KGF-2的DNA序列ATCC#75977首先用PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增，所述引物對(duì)應(yīng)于加工過的KGF-2 cDNA(包括信號(hào)肽序列)的5’和3’序列。5’寡核苷酸引物含有序列5’CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3’(SEQ ID NO.3)，該序列含有AflⅢ限制酶位點(diǎn)，該位點(diǎn)包括并隨后是從推測(cè)的起始密碼子開始的KGF-2編碼序列的30個(gè)核苷酸。3’序列5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ ID NO.4)含有HindⅢ位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，隨后是KGF-2的26個(gè)核苷酸。這些限制酶位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE-60(Qiagen,Inc.Chatsworth,CA)上的限制酶位點(diǎn)相容。pQE-60編碼抗生素抗性(AMpr)，一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori),IPTG調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子操縱子(P/O)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS),6-His標(biāo)記和限制酶位點(diǎn)。然后將pQE-60用NcoⅠ和HindⅢ消化。將擴(kuò)增的序列連接到pQE-60中，并符合讀框地插入。然后按照Sambrook,J.等在分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))中描述的方法，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep4(Qiagen,Inc.)。M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，該質(zhì)粒表達(dá)lacⅠ阻遏物并賦予卡那霉素抗性(Kanr)。根據(jù)其在LB平板上的生長(zhǎng)能力來鑒定轉(zhuǎn)化體，并篩選出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。分離質(zhì)粒DNA并通過限制分析進(jìn)行鑒定。使含所期望的構(gòu)建體的克隆在補(bǔ)加了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜(O/N)。以1∶100至1∶250的比例，用O/N培養(yǎng)物接種大體積培養(yǎng)基。使細(xì)胞生長(zhǎng)至光密度600(O.D.600)為0.4-0.6。然后加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖苷)達(dá)到1mM的終濃度。通過使lacⅠ阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)清理所述P/O，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的增加。使細(xì)胞再生長(zhǎng)3至4小時(shí)。然后通過離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解于離液劑6M鹽酸胍中。澄清后，在可以緊密結(jié)合蛋白質(zhì)的條件下，在肝素親和柱上通過色譜從該溶液中純化溶解的KGF-2(Hochuli,E.等，色譜學(xué)雜志，411:177-184(1984))。用高鹽緩沖液從該柱上將KGF-2(75％純)洗脫下來。
實(shí)施例2KGF-2截短變體的細(xì)菌表達(dá)和純化將編碼KGF-2的DNA序列，ATCC#75977首先用PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增，所述引物對(duì)應(yīng)于KGF-2多肽之截短變體的5’和3’序列。所述截短變體含所述多肽減去所述36個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，在構(gòu)成全長(zhǎng)蛋白質(zhì)氨基酸37的半胱氨酸殘基前加入一個(gè)甲硫氨酸和丙氨酸殘基。所述5’寡核苷酸引物含有序列5’CATGCCATGGCGTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACATG3’(SEQ ID NO:5)，該序列含有NcoⅠ限制酶位點(diǎn)，該位點(diǎn)接著KGF-2編碼序列的24個(gè)核苷酸。3’序列5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ IDNO:6)含有與HindⅢ位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，隨后是KGF-2基因的26個(gè)核苷酸。所述限制酶位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE-60(Qiagen,Inc.Chatsworth,CA)上的限制酶位點(diǎn)相容。pQE-60編碼抗生素抗性(Ampr)，一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori),IPTG調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子操縱子(P/O)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS),6-His標(biāo)記和限制酶位點(diǎn)。然后將pQE-60用NcoⅠ和HindⅢ消化。將擴(kuò)增的序列連接到pQE-60中，并符合讀框地插入。然后按照Sambrook,J.等在分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))中描述的方法，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep4(Qiagen,Inc.)。M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，該質(zhì)粒表達(dá)lacⅠ阻遏物并賦予卡那霉素抗性(Kanr)。根據(jù)其在LB平板上的生長(zhǎng)能力來鑒定轉(zhuǎn)化體，并篩選出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。分離質(zhì)粒DNA并通過限制分析進(jìn)行鑒定。使含所需要的構(gòu)建體的克隆在補(bǔ)加了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜(O/N)。以1∶100至1∶250的比例，用O/N培養(yǎng)物接種大體積培養(yǎng)基。使細(xì)胞生長(zhǎng)至光密度600(O.D.600)為0.4-0.6。然后加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖苷)達(dá)到1mM的終濃度。通過使lacⅠ阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)清理所述P/O，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的增加。使細(xì)胞再生長(zhǎng)3至4小時(shí)。然后通過離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解于離液劑6M鹽酸胍中。澄清后，在可以緊密結(jié)合蛋白質(zhì)的條件下，在肝素親和柱上通過色譜從該溶液中純化溶解的KGF-2(Hochuli,E.等，色譜學(xué)雜志，411:177-184(1984))。用高鹽緩沖液從該柱上將KGF-2洗脫下來。
實(shí)施例3用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆并表達(dá)KGF-2將編碼全長(zhǎng)KGF-2蛋白質(zhì)的DNA序列ATCC#75977用PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增，所述引物對(duì)應(yīng)于該基因的5’和3’序列5’引物含有序列5’GCGGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTCAC3’(SEQ ID NO:7)并含有BamHⅠ限制酶位點(diǎn)(斜體字)，該位點(diǎn)后接有6個(gè)核苷酸，所述核苷酸組裝成真核細(xì)胞中的一個(gè)有效翻譯起始信號(hào)(Kozak,M.，分子生物學(xué)雜志，196:947-950(1987))并正好在KGF-2基因的前17個(gè)核苷酸后(劃線部分為翻譯起始密碼子“ATG”)。
3’引物含有序列5’GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT3’(SEQ ID NO:8)并含有限制內(nèi)切酶Asp718的切割位點(diǎn)和與KGF-2基因之3’非翻譯序列互補(bǔ)的19個(gè)核苷酸。用市售試劑盒(Qiagen,Ine.,Chatsworth,CA)從1％瓊脂糖凝膠上分離擴(kuò)增的序列。然后將該片段用內(nèi)切酶BamHⅠ和Asp718消化，再在1％瓊脂糖凝膠上純化。將該片段命名為F2。
用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(有關(guān)綜述參見Summers,M.D.& Smith,G.E.，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)方法手冊(cè)(A manual of methods forbaculovirus vectors and insect cell culture procedures),TexasAgricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987))，將載體pA2(修飾的pVL941載體，下文討論)用于表達(dá)KGF-2蛋白質(zhì)。該表達(dá)載體含有苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子后接有限制內(nèi)切酶BamHⅠ和Asp718的識(shí)別位點(diǎn)。將猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化。為了易于篩選重組體病毒，將大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動(dòng)子相同的方向插入，所述啟動(dòng)子后接有多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號(hào)。多角體蛋白序列的兩側(cè)均有病毒序列，所述病毒序列用于細(xì)胞介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA之同源重組?？梢杂迷S多其它桿狀病毒載體例如pAc373,pVL941和pAcIM1(Luckow,V.A.&Summers,M.D.，病毒學(xué)170:31-39)代替pRG1。
將該質(zhì)粒用限制酶BamHⅠ和Asp718消化。然后用市售試劑盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)從1％瓊脂糖凝膠上分離該DNA。將該載體命名為V2。
將片段F2和質(zhì)粒V2用T4 DNA連接酶連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，通過使用兩個(gè)克隆寡核苷酸的PCR，鑒定含帶KGF-2基因之質(zhì)粒(pBackGF-2)的細(xì)菌。用DNA測(cè)序確定該克隆片段的序列。
用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，84:7413-7417(1987))將5μg質(zhì)粒pBacKGF-2與1.0μg市售線性化桿狀病毒(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”,Pharmingen,San Diego,CA)共轉(zhuǎn)染。
在含50μl無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)之微滴定板的無菌孔中，將1μg BaculoGoldTM桿狀病毒DNA與5μg質(zhì)粒pBacKGF-2混合。此后，加入10μl Lipofectin加90μlGrace’s培養(yǎng)基，混合并在室溫培養(yǎng)15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物滴加至Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCCCRL 1711)中，所述Sf9昆蟲細(xì)胞接種于含1毫升無血清的Grace’s培養(yǎng)基的35毫米組織培養(yǎng)平板中。將該平板前后搖動(dòng)以混合新加入的溶液。然后將平板在27℃保溫5小時(shí)。5小時(shí)后，從平板中除去轉(zhuǎn)染溶液，并加入1毫升補(bǔ)加了10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。將平板放回至培養(yǎng)箱中，在27℃繼續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，然后按照與Summers和Smith(出處同前)所述相似的方法完成噬斑試驗(yàn)。作為一種改進(jìn)，使用含“Blue Gal”(LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠，這樣可以容易分離出藍(lán)色噬斑。(“噬斑試驗(yàn)”的詳細(xì)描述可參見Life Technologies Inc.提供的有關(guān)昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)的用戶指南，9-10頁)。
系列稀釋后4天，將病毒加到細(xì)胞中，用Eppendorf取液器的吸頭挑出染成藍(lán)色的噬斑。然后將含重組病毒的瓊脂重懸在含200μl Grace’s培養(yǎng)基的Eppendorf管中。通過簡(jiǎn)單離心除去瓊脂，利用含重組桿狀病毒的上清液來感染接種于35毫米平皿中的Sf9細(xì)胞。4天后，收集這些培養(yǎng)平皿的上清液，然后貯存于4℃。
使Sf9細(xì)胞在補(bǔ)加了10％熱失活的FBS的Grace’s培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。以感染復(fù)數(shù)(MOI)2用重組桿狀病毒V-KGF-2感染所述細(xì)胞。6小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，并換成SF900Ⅱ培養(yǎng)基減甲硫氨酸和半胱氨酸(LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg)。42小時(shí)后，加入5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。再培養(yǎng)細(xì)胞16小時(shí)，然后離心收集細(xì)胞并通過SDS-PAGE和放射自顯影肉眼觀察被標(biāo)記上的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4大部分用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)KGF-2蛋白質(zhì)基因序列的載體都應(yīng)攜有SV40復(fù)制原點(diǎn)。這樣在表達(dá)T抗原的細(xì)胞(例如COS細(xì)胞)中可以復(fù)制很多拷貝的載體，所述T抗原是啟動(dòng)病毒DNA合成所需的。也可將任何其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系用于該目的。
典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子，蛋白質(zhì)編碼序列和終止轉(zhuǎn)錄所需的信號(hào)，以及轉(zhuǎn)錄本聚腺苷酸化所需的信號(hào)。其它元件包括增強(qiáng)子，Kozak序列，和側(cè)翼是用于RNA剪接的供體和受體位點(diǎn)的間插序列。用SV40的早期和晚期啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如RSV,HTLVI,HIVI)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)和巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子可達(dá)到高效轉(zhuǎn)錄。然而，也可以使用細(xì)胞信號(hào)(例如人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。用于實(shí)施本發(fā)明的適宜的表達(dá)載體包括例如pSVL和pMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC 37152),pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)?？梢允褂玫牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞包括人Hela細(xì)胞，283細(xì)胞，H9細(xì)胞和Jurkart細(xì)胞，小鼠NIH3T3細(xì)胞和C127細(xì)胞，Cos1細(xì)胞，Cos7細(xì)胞和CV1細(xì)胞，非洲綠猴細(xì)胞，鵪鶉QC1-3細(xì)胞，小鼠L細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
或者，可在穩(wěn)定的細(xì)胞系中表達(dá)該基因，所述細(xì)胞系含有整合到染色體中的該基因。與選擇性標(biāo)記如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素基因共轉(zhuǎn)染可鑒定并分離出被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
還可擴(kuò)增被轉(zhuǎn)染的基因以表達(dá)大量的編碼蛋白。DHFR(二氫葉酸還原酶)是一種有用的標(biāo)記，可用來培育攜帶數(shù)百甚至數(shù)千拷貝之所需基因的細(xì)胞系。另一個(gè)有用的選擇性標(biāo)記是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化學(xué)雜志，227:277-279(1991)；Bebbington等，生物/技術(shù)，10:169-175(1992))。利用這些標(biāo)記，可以使哺乳動(dòng)物細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并篩選出有最大抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系含有整合至染色體中的擴(kuò)增的基因。經(jīng)常利用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞來生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
表達(dá)載體pC1和pC4含有勞氏肉瘤病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子(LTR)(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，438-447(1985年3月))和CMV增強(qiáng)子片段(Boshart等，細(xì)胞，41:521-530(1985))。多克隆位點(diǎn)，例如限制酶切割位點(diǎn)BamHⅠ,XbaⅠ和Asp718有利于所需基因的克隆。所述載體還含有大鼠前胰島素原基因的3’內(nèi)含子及聚腺苷酸化和終止信號(hào)。A．在COS細(xì)胞中表達(dá)重組KGF-2表達(dá)質(zhì)粒KGF-2 HA衍生于載體pcDNAⅠ/Amp(Invitrogen)，該載體中含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，4)接有多接頭區(qū)的CMV啟動(dòng)子，SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于前述衍生于流感病毒血凝素蛋白的一個(gè)表位(Wilson,I.等，細(xì)胞，37:767(1984))。HA標(biāo)記融合于靶蛋白上，使得用識(shí)別HA表位的抗體很容易檢測(cè)該重組蛋白。編碼整個(gè)KGF-2前體HA標(biāo)記的DNA片段與HA標(biāo)記讀框一致地融合，因此該重組蛋白質(zhì)的表達(dá)是在CMV啟動(dòng)子的指導(dǎo)下。
將質(zhì)粒構(gòu)建策略描述于下用下列兩個(gè)引物通過PCR構(gòu)建編碼KGF-2的DNA序列ATCC#75977:5’引物5’TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3’(SEQ ID NO:9)含有BamHⅠ位點(diǎn)，后接有從起始密碼子開始的KGF-2編碼序列的22個(gè)核苷酸；3’序列5’TAAGCACTCGAGTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG3’(SEQ ID NO:10)含有與XhoⅠ位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，HA標(biāo)記和KGF-2編碼序列的最后26個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)。因此，該P(yáng)CR產(chǎn)物含有BamHⅠ位點(diǎn)，KGF-2編碼序列并接有一個(gè)XhoⅠ位點(diǎn)，一個(gè)符合讀框地融合的HA標(biāo)記，與HA標(biāo)記相接的翻譯終止密碼子。將PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNA-3’HA用BamHⅠ和XhoⅠ限制酶消化并連接，得到pcDNA-3’HA-KGF-2。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1Blue(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)中，將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物鋪在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上并篩選抗性菌落。從轉(zhuǎn)化體中分離出質(zhì)粒DNA，通過PCR和限制分析以檢測(cè)是否存在正確的片段。為了表達(dá)重組KGF-2，通過DEAE-DEXTRAN方法(Sambrook,J.，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))，用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。通過放射性標(biāo)記和免疫沉淀法(Harlow,E.& Lane,D.，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1988))檢測(cè)KGF-2 HA蛋白質(zhì)的表達(dá)。轉(zhuǎn)染2天后，將細(xì)胞用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基，并用去污劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS,1％NP-40,0.5％DOC,50mM Tris,pH7.5))(Wilson,I.等，出處同前，37:767(1984))裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解產(chǎn)物和培養(yǎng)基均用HA特異性單克隆抗體進(jìn)行沉淀。將沉淀的蛋白質(zhì)在15％SDS-PAGE凝膠上分析。B．利用CHO表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化人KGF-2蛋白質(zhì)將載體pC1用于KGF-2蛋白質(zhì)的表達(dá)。質(zhì)粒pC1是質(zhì)粒pSV2-dhfr[ATcc登記號(hào)37146]的衍生物。這兩個(gè)質(zhì)粒均含有在SV40早期啟動(dòng)子控制下的小鼠DHFR基因。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的不具有二氫葉酸活性的中國倉鼠卵巢細(xì)胞或其它細(xì)胞可通過使細(xì)胞在補(bǔ)加了化療劑氨甲喋呤的選擇性培養(yǎng)基(α-MEM,Life Technologies)上生長(zhǎng)來進(jìn)行篩選。對(duì)在氨甲喋呤(MTX)抗性細(xì)胞中擴(kuò)增DHFR基因已經(jīng)有許多記載(參見例如Alt,F.W.,Kellems,R.M.,Bertino,J.R.，和Schimke,R.T.,1978，生物化學(xué)雜志，253:1357-1379,Hamlin,J.L.和Ma,C.1990，生物化學(xué)和生物物理學(xué)通報(bào)，1097:107-143,Page,MJ.和Sydenham,MA.1991，生物技術(shù)，9:64-68)。通過目標(biāo)酶DHFR的過生產(chǎn)，在濃度不斷增加的MTX中生長(zhǎng)的細(xì)胞發(fā)展了對(duì)該藥物的抗性，所述DHFR的過生產(chǎn)是DHFR基因擴(kuò)增的結(jié)果。如果將第二種基因與DHFR基因相連，則該基因通常也會(huì)被共擴(kuò)增和過表達(dá)。這是本領(lǐng)域用來培育含1000拷貝以上目標(biāo)基因之細(xì)胞系的方式。隨后，當(dāng)除去氨甲喋呤后，細(xì)胞系含有整合至染色體中的擴(kuò)增的基因。
為了表達(dá)所需基因，質(zhì)粒pC1含有勞氏肉瘤病毒之長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的強(qiáng)啟動(dòng)子(Cullen，等，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Molecular and CellularBiology),1985年3月號(hào)438-4470)加上從人巨細(xì)胞病毒(CMV)之即早期基因的增強(qiáng)子中分離出的一個(gè)片段(Boshart等，細(xì)胞，41:521-530,1985)。所述啟動(dòng)子下游是下列可使基因進(jìn)行整合的單一限制酶切割位點(diǎn)BamHⅠ,PvulⅠ和Nrul。在這些克隆位點(diǎn)后，該質(zhì)粒在所有三種閱讀框架中含有翻譯終止密碼子，其后接有大鼠前胰島素原基因的3’內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。也可將其它高效啟動(dòng)子用于該表達(dá)，例如人β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，SV40早期或晚期啟動(dòng)子或其它逆轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV和HTLVI的長(zhǎng)末端重復(fù)序列。對(duì)于mRNA的聚腺苷酸化，也可以使用例如來自人生長(zhǎng)激素或球蛋白基因的其它信號(hào)。
在與選擇性標(biāo)記例如gpt,G418或潮霉素基因共轉(zhuǎn)染后，也可以篩選攜帶整合至染色體中之基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。開始時(shí)最好使用一種以上的選擇性標(biāo)記，例如G418加氨甲喋呤。
將質(zhì)粒pC1用限制酶BamHⅠ消化，然后通過本領(lǐng)域已知的方法，用牛腸磷酸酶去磷酸化。再從1％瓊脂糖凝膠中分離所述載體。
用下列PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼KGF-2的DNA序列ATCCNo.75977，所述寡核苷酸引物對(duì)應(yīng)于該基因的5’和3’序列。5’引物含有序列5’TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3’(SEQ ID NO:9)，其中含有BamHⅠ位點(diǎn)(下劃線)，后接有圖1(SEQ ID NO:1)的KGF-2編碼序列的21個(gè)堿基。如下所述，插入到一表達(dá)載體后，編碼人KGF-2的擴(kuò)增片段的5’末端提供了一有效的信號(hào)肽。如Kozak,M.(分子生物學(xué)雜志，196:947-950(1987))所述，用于真核細(xì)胞翻譯起始的有效信號(hào)適當(dāng)?shù)夭逶谒鰳?gòu)建體的載體部分。
3’引物含有序列5’TAAGCAGGATCCTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG 3’(SEQ ID NO:10)，該序列含有BamHⅠ限制位點(diǎn)，后接有與圖1(SEQ ID NO:1)所列KGF-2編碼序列的最后26個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)互補(bǔ)的核苷酸。
按上述從1％瓊脂糖凝膠中分離擴(kuò)增的片段，用內(nèi)切核酸酶BamHⅠ消化，然后再在1％瓊脂糖凝膠上純化。
將分離的片段和去磷酸化的載體用T4 DNA連接酶連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，鑒定含質(zhì)粒pC1的細(xì)菌。通過DNA測(cè)序確定插入基因的序列和方向。CHO-DHFR細(xì)胞的轉(zhuǎn)染將缺乏活性DHFR酶的中國倉鼠卵巢細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，出處同前)將5μg質(zhì)粒C1與0.5μg質(zhì)粒pSV-neo共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒pSV2-neo含有顯性選擇性標(biāo)記neo基因，該基因來自Tn5，它編碼一種酶，該酶可賦予對(duì)一組抗生素包括G418的抗性。將細(xì)胞接種在添加了1mg/ml G418的αminus MEM中。2天后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并接種于雜交瘤克隆平板(Greiner,Germany)，然后培養(yǎng)10-14天。該期間后，將單個(gè)克隆用胰蛋白酶消化，然后接種于含不同濃度氨甲喋呤(25nM,50nM,100nM,200nM,400nM)的6孔培養(yǎng)皿中。將在最高濃度的氨甲喋呤中生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)移到含更高濃度氨甲喋呤(500nM,1μM,2μM,5μM)的新的6孔平板中。重復(fù)相同的過程，直到克隆在100μm的濃度中生長(zhǎng)。
用Western印跡分析和SDS-PAGE分析所需基因產(chǎn)物的表達(dá)。
實(shí)施例5重組KGF-2的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯PCR產(chǎn)物衍生于pA2載體中克隆的cDNA，該載體用于KGF-2的昆蟲細(xì)胞表達(dá)。用于該P(yáng)CR的引物是5’ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3’(SEQID NO:11)和5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ ID NO:12)。
第一個(gè)引物含有ATG起始密碼子5’側(cè)的T3啟動(dòng)子的序列。第二個(gè)引物與KGF-2開放閱讀框架的3’末端互補(bǔ)，并編碼終止密碼子的反向互補(bǔ)序列。
用市售的Qiagen試劑盒純化所得PCR產(chǎn)物。將0.5μg的該DNA作為模板用于體外轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)。用品名為TNT的Promega試劑盒完成該反應(yīng)。利用放射性標(biāo)記的甲硫氨酸為底物，按有關(guān)試劑盒的說明完成試驗(yàn)，不同的是，只按說明體積的1/2使用試劑，使反應(yīng)在33℃進(jìn)行1.5小時(shí)。
在10-15％變性聚丙烯酰胺凝膠上，電泳分離5μl反應(yīng)物。將凝膠用比例為6∶3∶1的水∶甲醇∶乙酸混合物固定30分鐘。然后在加熱和真空下干燥凝膠，隨后將凝膠對(duì)X射線膠片曝光16小時(shí)。該膠片顯影結(jié)果表明存在與理論上翻譯的KGF-2大小一致的放射性蛋白質(zhì)帶，這有力地說明克隆的KGF-2 cDNA含有編碼具有預(yù)期大小之蛋白質(zhì)的開放閱讀框架。
實(shí)施例6經(jīng)基因治療進(jìn)行表達(dá)通過皮膚活組織解剖從一個(gè)受試者中得到成纖維細(xì)胞。將所得的組織放在組織培養(yǎng)基中并將其分成小片。將所述組織塊放在組織培養(yǎng)瓶的濕表面，每個(gè)瓶中大約放10塊。將瓶底部朝上，擰緊并在室溫下放置過夜。在室溫下24小時(shí)后，將培養(yǎng)瓶倒過來，組織塊仍固定于燒瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如Ham’s F12培養(yǎng)基，含10％FBS，青霉素和鏈霉素)。然后將其在37℃培養(yǎng)約1周。此時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基，然后每隔數(shù)天換液一次。再培養(yǎng)2周后，就出現(xiàn)成纖維細(xì)胞單層。將所述單層用胰蛋白酶消化并刮出放入較大的培養(yǎng)瓶中。
將兩側(cè)為莫洛尼鼠肉瘤病毒之長(zhǎng)重復(fù)序列的pMV-7(Kirschmeier,P.T.等，DNA,7:219-25(1988))用EcoRⅠ和HindⅢ消化，隨后用牛腸磷酸酶處理。將線性載體在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離并用玻璃珠純化。
用分別對(duì)應(yīng)于5’和3’末端序列的PCR引物擴(kuò)增編碼本發(fā)明多肽的cDNA。5’引物含有EcoRⅠ位點(diǎn)，3’引物還含有HindⅢ位點(diǎn)。存在T4DNA連接酶的條件下，將等量莫洛尼鼠肉瘤病毒線性骨架和該擴(kuò)增的EcoRⅠ和HindⅢ片段加到一起。將所得混合物保持于可使所述兩片段進(jìn)行連接的條件下。用連接混合物轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后將轉(zhuǎn)化的HB101鋪在含卡那霉素的瓊脂上，以確定載體含有正確插入的所需基因。
在含10％牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中，使兼性pA317或GP+aml2包裝細(xì)胞在組織培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至鋪滿密度。然后將含所述基因的MSV載體加到該培養(yǎng)基中，用所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述包裝細(xì)胞。現(xiàn)在，包裝細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生含所述基因的感染性病毒顆粒(此時(shí)將所述包裝細(xì)胞稱為生產(chǎn)者細(xì)胞)。
將新鮮培養(yǎng)基加到轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)者細(xì)胞中，然后從鋪滿生產(chǎn)者細(xì)胞的10cm平板中收集培養(yǎng)基。將含感染性病毒顆粒的已消耗的培養(yǎng)基通過millopore濾紙過濾以除去脫附的生產(chǎn)者細(xì)胞，然后用該培養(yǎng)基感染成纖維細(xì)胞。從成纖維細(xì)胞的次鋪滿平板中除去培養(yǎng)基，迅速地?fù)Q入來自生產(chǎn)者細(xì)胞的培養(yǎng)基。除去該培養(yǎng)基，換入新鮮培養(yǎng)基。如果病毒效價(jià)高，將會(huì)感染所有成纖維細(xì)胞，而且無需進(jìn)行篩選。如果效價(jià)很低，則需使用具有選擇性標(biāo)記如neo和his的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
然后，將加工過的成纖維細(xì)胞單獨(dú)或已在cytodex3微載體玻珠生長(zhǎng)至鋪滿后，注射到宿主中?，F(xiàn)得到的成纖維細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
實(shí)施例7在糖尿病小鼠模型中KGF-2刺激傷口愈合為了證明角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(KGF-2)可加快傷口愈合過程，使用傷口愈合的遺傳性糖尿病小鼠模型。db+/db+小鼠的全層皮(fullthickness)傷口愈合模型是一種被表征過的臨床相關(guān)的可重現(xiàn)的傷口愈合受損的模型。糖尿病性傷口的愈合依賴于肉芽組織的形成和上皮再形成而不是收縮(Gartner,M.H.等，外科研究雜志，52:389(1992)；Greenhalgh,D.G.等，美國病理學(xué)雜志，136:1235(1990))。
糖尿病動(dòng)物有許多Ⅱ型糖尿病特征。與其正常的雜合(db+/+m)同窩幼畜相比，純合(db+/db+)小鼠比較肥胖。突變體糖尿病小鼠(db+/db+)在染色體4上有一常染色體隱性突變(db+)(Coleman等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，77:283-293(1982))。動(dòng)物有貪食、煩渴和多尿癥。突變體糖尿病小鼠(db+/db+)的血糖升高，胰島素水平升高或正常，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫受到抑制(Mandel等，免疫學(xué)雜志，120:1375(1978)；Debray-Sachs,M等，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)，51(1):1-7(1983)；Leiter等，美國病理學(xué)雜志，114:46-55(1985))。在這些動(dòng)物中還有外周性神經(jīng)病、心肌并發(fā)癥和微血管損傷、基膜增厚和腎小球過濾異常(Norido,F.等，實(shí)驗(yàn)神經(jīng)學(xué)，83(2):221-232(1984)；Robertson等，糖尿病，29(1):60-67(1980)；Giacomelli等，實(shí)驗(yàn)室研究，40(4):460-473(1979)；Coleman,D.L.，糖尿病，31(增刊)1-6(1982))。這些純合糖尿病小鼠發(fā)展成高血糖，即具有胰島素抗性，這與人Ⅱ型糖尿病類似(Mandel等，免疫學(xué)雜志，120:1375-1377(1978))。
在這些動(dòng)物觀察到的特征表明，該模型中的愈合可能與在人糖尿病中觀察到的愈合相似(Greenhalgh等，美國病理學(xué)雜志，136:1235-1246(1990))。該研究結(jié)果表明，在糖尿病性和非糖尿病性雜合的同窩幼畜中，KGF-2對(duì)全層皮傷口的愈合有強(qiáng)刺激作用。在經(jīng)KGF-2處理的動(dòng)物中，可觀察到對(duì)上皮再形成和膠原原纖維的增加以及真皮內(nèi)的肉芽組織有顯著的影響。外源施用生長(zhǎng)因子可通過將炎性細(xì)胞吸入到傷口中而加快肉芽組織的形成。動(dòng)物在這項(xiàng)研究中使用遺傳性的糖尿病雌性C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠和其非糖尿病(db+/+m)的雜合的同窩幼畜(Jackson實(shí)驗(yàn)室)。購買6周齡的動(dòng)物，在開始研究時(shí)是8周齡。將動(dòng)物單獨(dú)安置并不限量地供應(yīng)食物和水。所有操作均用無菌技術(shù)完成。按照人類基因組科學(xué)公司社會(huì)事業(yè)性動(dòng)物飼養(yǎng)和利用委員會(huì)的規(guī)則和指南，以及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用指南完成試驗(yàn)。KGF-2在pQE60-Cys37中過表達(dá)并將用于傷口愈合研究的重組人KGF-2純化，pQE60-Cys37是一種大腸桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)(pQE-9,Qiagen)。從該構(gòu)建體表達(dá)的蛋白質(zhì)是從37位半胱氨酸至208位絲氨酸的KGF-2,并在該蛋白質(zhì)N末端帶有6X(His)標(biāo)記(SEQ ID NO:29-30)(圖15)。將含有95％以上純的重組物質(zhì)的諸級(jí)分用于所述試驗(yàn)。用含100mM Tris,8.0和600mM NaCl的載體配制角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子2。終濃度為80μg/ml和8μg/ml儲(chǔ)備液。用相同的載體從儲(chǔ)備液制備稀釋溶液。外科創(chuàng)傷按以前報(bào)道的方法(Tsuboe,R.和Rifkin,D.B.，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，172:245-251(1990))產(chǎn)生傷口。簡(jiǎn)而言之，在受傷當(dāng)天，通過腹膜內(nèi)注射溶解于去離子水中的三溴乙醇(0.01mg/ml),2,2,2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇而使動(dòng)物麻醉。剃干凈動(dòng)物背部的毛，用70％乙醇溶液和碘清洗此塊皮膚。在損傷前，用無菌紗布擦干外科手術(shù)區(qū)。然后用Keyes組織穿孔器產(chǎn)生8mm全層皮傷口。損傷后立即輕輕伸展周圍的皮膚以避免傷口擴(kuò)張。在試驗(yàn)過程中，傷口一直暴露于外。從損傷當(dāng)天開始，進(jìn)行連續(xù)5天的局部治療。治療前，用無菌鹽水和紗布輕輕清洗傷口。
肉眼檢查傷口，并在手術(shù)當(dāng)天及手術(shù)后每隔2天從固定的距離位置拍照。通過在1-5天每天進(jìn)行測(cè)量并在第8天也進(jìn)行測(cè)量來確定傷口的閉合。用校正的Jameson測(cè)徑器水平和垂直地測(cè)量傷口。如果肉眼再觀察不到肉芽組織而且傷口被連續(xù)的上皮所覆蓋，就可以認(rèn)為傷口已經(jīng)愈合了。
按KGF-2的兩種不同劑量施用KGF-2，一種劑量是每一傷口每天施用50μl載體中的4μg KGF-2，持續(xù)8天，另一種劑量是每一傷口每天施用50μl載體中的40μg KGF-2，持續(xù)8天。對(duì)載體對(duì)照組施用50μl載體溶液。
在第8天，通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(300mg/kg)對(duì)動(dòng)物實(shí)行安樂死。然后收集傷口和傷口周圍的皮膚用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析。將組織樣品放在組織盒內(nèi)組織活體解剖用海綿之間的10％中性緩沖的福爾馬林中以便進(jìn)一步加工。試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)三組動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估，每組10只動(dòng)物(5只糖尿病動(dòng)物，5只非糖尿病對(duì)照動(dòng)物)1)載體安慰劑對(duì)照，2)KGF-24μg/天，和3)KGF-240μg/天。按如下設(shè)計(jì)該研究
傷口面積和閉合的測(cè)量通過在垂直和水平軸測(cè)量面積并得到傷口的總面積來分析傷口的閉合。然后通過確定最初的傷口面積(第0天)和治療后的面積(第8天)之間的差異來評(píng)估收縮情況。在第1天的傷口面積是64mm2，相當(dāng)于真皮孔的大小。用下列公式計(jì)算[第8天的開口面積]-[第1天的開口面積]/[第1天的開口面積]組織學(xué)將樣品固定在10％緩沖的福爾馬林中，將石蠟包埋的樣品塊以與傷口表面垂直的方向切開(5μm)，并用Reichert-Hung切片機(jī)切片。在一分為二的傷口的橫斷面切片上進(jìn)行常規(guī)蘇木精-曙紅(H&E)染色。通過傷口的組織學(xué)檢查來評(píng)估是否因KGF-2的治療而改變了被修補(bǔ)皮膚的愈合過程和形態(tài)外觀。所述評(píng)估包括確定是否存在細(xì)胞積累、炎性細(xì)胞、毛細(xì)管、成纖維細(xì)胞、上皮再形成和表皮成熟(Greenhalgh,D.G.等，美國病理學(xué)雜志，136:1235(1990))(表1)。由盲觀測(cè)者使用校正的透鏡測(cè)微計(jì)進(jìn)行測(cè)量。免疫組織化學(xué)上皮再形成利用ABC Elite檢測(cè)系統(tǒng)，用多克隆兔抗人角蛋白抗體，對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用人皮膚作為陽性組織對(duì)照，而用非免疫IgG作為陰性對(duì)照。用校正的透鏡測(cè)微計(jì)，通過評(píng)估傷口上皮再形成的程度來確定角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)。
細(xì)胞增殖標(biāo)記利用ABC Elite檢測(cè)系統(tǒng)，用抗PCNA抗體(1∶50)來證實(shí)皮膚樣品中增殖細(xì)胞核抗原/細(xì)胞周期蛋白(PCNA)。人結(jié)腸癌作為陽性組織對(duì)照，用人腦組織作為陰性組織對(duì)照。每個(gè)樣品都包括略去基本抗體、而代之以非免疫小鼠IgG的一張切片。這些切片的排列次序是基于增殖的程度，用0-8級(jí)表示，級(jí)別越低反映增殖較少，而級(jí)別越高反映增殖越強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)分析用非成對(duì)t檢驗(yàn)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。p值＜0.05即認(rèn)為有顯著性。將數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。結(jié)果KGF-2對(duì)傷口閉合的影響與雜合的正常小鼠相比，糖尿病小鼠顯示出愈合受損。在糖尿病和非糖尿病動(dòng)物中，每一位點(diǎn)4μg KGF-2的劑量可產(chǎn)生最大響應(yīng)(圖5,6)。與緩沖液對(duì)照組相比，這些結(jié)果有統(tǒng)計(jì)顯著性(p=0.002和p＜0.0001)。用KGF-2處理后，在劑量為4μg/天的組中，平均閉合為60.6％，在劑量為40μg/天的組中，平均閉合為34.5％。到第8天，緩沖液對(duì)照組動(dòng)物的傷口僅有3.8％閉合。在損傷后第2-5天和第8天，從用KGF-2治療的db+/db+小鼠的傷口得到的重復(fù)測(cè)量值表明，與緩沖液對(duì)照組相比，到損傷后第3天，總傷口面積(mm2)有顯著改善。這種改善一直持續(xù)著，并且，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)可觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的結(jié)果(圖7)。在接受了KGF-2的db/+m組的動(dòng)物中，與緩沖液對(duì)照組相比，重復(fù)測(cè)量也表明傷口面積有較大的減少(圖8)。這些結(jié)果證實(shí)了在KGF-2處理的動(dòng)物中，其傷口閉合率較大。
KGF-2對(duì)組織學(xué)評(píng)分的影響在第8天，KGF-2在糖尿病(db+/db+)模型中的組織病理學(xué)評(píng)估結(jié)果表明，與緩沖液對(duì)照相比，傷口評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的提高(p＜0.0001)。用4μg和40μg劑量的KGF-2觀察到的藥理學(xué)作用之間沒有顯著差異。緩沖液對(duì)照組具有最小的細(xì)胞積累，沒有肉芽組織或上皮遷移，而4μg和40μg劑量的KGF-2(分別為p＜0.0001&p=0.06)出現(xiàn)上皮覆蓋傷口，新血管形成，肉芽組織形成和成纖維細(xì)胞和膠原沉積(圖9)。
用蘇木精-曙紅染色的樣品完成皮膚傷口的組織病理學(xué)評(píng)估。記分標(biāo)準(zhǔn)有1-12級(jí)，1分表示細(xì)胞積累最小并很少或幾乎沒有肉芽形成，12分表示有豐富的成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，大量膠原沉積并有大量覆蓋傷口的新上皮(表1)。
在施用這兩種劑量的KGF-2后，評(píng)估非糖尿病同窩幼畜，表明與緩沖液對(duì)照組相比，評(píng)估的所有測(cè)量值均沒有顯著活性(圖10)。緩沖液對(duì)照組顯示出不成熟的肉芽組織，炎性細(xì)胞和毛細(xì)管。其平均值高于糖尿病組，表明在糖尿病(db+/db+)小鼠中愈合受損。
KGF-2對(duì)上皮再形成的影響用細(xì)胞角蛋白(cytokeratine)免疫染色確定上皮再形成的程度。評(píng)分以閉合程度為基礎(chǔ)，分為0(無閉合)至8(完全閉合)級(jí)。在接受了4μg/天劑量的組中，與緩沖液對(duì)照組相比，上皮再形成的分?jǐn)?shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的提高，p＜0.001(圖11)。在該組中，觀察到角質(zhì)形成形成細(xì)胞位于新形成的覆蓋傷口的表皮內(nèi)。在不同階段，兩種劑量的KGF-2都有有絲分裂外觀。在所述兩種KGF-2劑量，評(píng)估非糖尿病組也有顯著提高的上皮再形成級(jí)別(分別為p=0.006和0.01)(圖12)。
KGF-2對(duì)細(xì)胞增殖的影響增殖細(xì)胞核抗原免疫染色說明，在4μg和40μg組內(nèi)均有顯著增殖(圖13)。非糖尿病組接受兩種劑量KGF-2有相似的結(jié)果，與緩沖液對(duì)照組相比，這兩個(gè)組均有明顯較高的分?jǐn)?shù)(圖14)。特別是在表皮的基層觀察到表皮增殖。另外，在真皮，特別是在毛囊中觀察到高密度的PCNA-標(biāo)記的細(xì)胞。結(jié)論這些結(jié)果表明KGF-2特異性地刺激初級(jí)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，這些試驗(yàn)表明，在糖尿病小鼠中，局部施用的重組人KGF-2顯著加快了全層皮切割的真皮傷口的愈合速度。組織學(xué)評(píng)估表明KGF-2可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)表皮增厚。根據(jù)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)顯示，所述增殖位于上皮的基層。在真皮水平，膠原沉積、成纖維細(xì)胞增殖和新血管形成重建了皮膚的正常結(jié)構(gòu)。
與有較少PCNA標(biāo)記之細(xì)胞的緩沖液組相比，KGF-2處理之動(dòng)物上的PCNA標(biāo)記細(xì)胞密度較高，說明了對(duì)真皮-表皮水平的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和毛囊的刺激作用。因KGF-2導(dǎo)致的愈合過程的增強(qiáng)與該試驗(yàn)所觀察到的一致。對(duì)應(yīng)所評(píng)估的參數(shù)(上皮再形成和傷口閉合百分比)，這一效果是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。重要的是，主要在表皮較內(nèi)層的基層中觀察到PCNA標(biāo)記的角質(zhì)形成細(xì)胞。真皮表現(xiàn)為含成纖維細(xì)胞、膠原和肉芽組織的正?；M織。
以每天的測(cè)量值為基礎(chǔ)，在非糖尿病動(dòng)物中觀察到的活性表明KGF-2對(duì)第8天以及試驗(yàn)過程中的傷口閉合百分比產(chǎn)生顯著的藥理學(xué)反應(yīng)。盡管與緩沖液對(duì)照相比，組織病理學(xué)評(píng)估沒有顯著差異，但角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)和PCNA分?jǐn)?shù)表明有顯著影響。
總之，這些結(jié)果說明，在使用db+/db+小鼠的損傷和正常切割傷口模型中，KGF-2均有顯著活性，因此，可將KGF-2用于治療傷口，包括外科手術(shù)傷口、糖尿病潰瘍、靜脈停滯性潰瘍、灼傷和其它皮膚疾病。
實(shí)施例8在類固醇損傷的大鼠模型中KGF-2介導(dǎo)的傷口愈合在各種體外和體內(nèi)系統(tǒng)中類固醇對(duì)傷口愈合的抑制作用已有許多記載(Wahl,S.M.糖皮質(zhì)激素和傷口愈合。《抗炎類固醇作用基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用》，280-302(1989)；Wahl,S.M.等，免疫學(xué)雜志，115:476-481(1975)；Werb,Z.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，147:1684-1694(1978))。糖皮質(zhì)激素通過下列途徑來抑制傷口愈合抑制血管生成，降低血管通透性(Ebert,R.H.等，An.Intern.Med.37:701-705(1952))，減少成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成(Beck,L.S.等，生長(zhǎng)因子，5:295-304(1991)；Haynes,B.F.等，臨床研究雜志，61:703-797(1978))并可使循環(huán)中的單核細(xì)胞暫時(shí)減少(Haynes,B.F.等，臨床研究雜志，61:703-797(1978)；Wahl,S.M.，糖皮質(zhì)激素和傷口愈合?！犊寡最惞檀甲饔没A(chǔ)和臨床應(yīng)用》，學(xué)術(shù)出版社，紐約，280-302(1989))。全身性施用類固醇以阻礙傷口愈合是大鼠中很常見的現(xiàn)象(Beck,L.S.等，生長(zhǎng)因子，5:295-304(1991)；Haynes,B.F.等，臨床研究雜志，61:703-797(1978)；Wahl,S.M.，糖皮質(zhì)激素和傷口愈合《抗炎類固醇作用基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用》，學(xué)術(shù)出版社，紐約，280-302(1989)；Pierce,G.F.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86:2229-2233(1989))。
為了說明KGF-2可加快愈合過程，對(duì)向大鼠全層皮切割的皮膚傷口多次局部施用KGF-2的效果進(jìn)行評(píng)估，在所述大鼠中，已通過全身性施用甲基氫化潑尼松損害了愈合。體外研究已表明KGF-2特異性地刺激初級(jí)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)施例通過用校正的Jameson測(cè)徑器測(cè)量傷口缺口并通過組織形態(tài)測(cè)量法(histomorphometry)和免疫組織化學(xué)法，說明了局部施用重組人KGF-2可加快大鼠全層皮切割皮膚傷口的愈合速度。組織學(xué)評(píng)估表明KGF-2能加快上皮再形成，并由此加快傷口修復(fù)。動(dòng)物在本實(shí)施例中使用重量為250-300克的年青成年雄性SpragueDawley大鼠(Charles River Laboratories)。購買8周齡動(dòng)物，在研究開始時(shí)，動(dòng)物為9周齡。在損傷時(shí)，通過全身性施用甲基氫化潑尼松(17mg/kg/大鼠，肌肉內(nèi)注射)來損害大鼠的愈合反應(yīng)。將動(dòng)物單獨(dú)安置并不受限制地供給食物和水。用無菌技術(shù)完成所有操作。按照人基因組科學(xué)公司社會(huì)事業(yè)性動(dòng)物飼養(yǎng)和利用委員會(huì)的規(guī)則和指南以及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用指南完成試驗(yàn)。KGF-2在pQE60-Cys37中過表達(dá)并純化重組人KGF-2,pQE60-Cys37是一種大腸桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)(pQE-9,Qiagen)。從該構(gòu)建體表達(dá)的蛋白質(zhì)是從37位半胱氨酸至208位絲氨酸的KGF-2，并在該蛋白質(zhì)的N末端帶有6X(His)標(biāo)記(圖15)(SEQ ID NO:29-30)。將含有95％以上純的重組物質(zhì)的諸級(jí)分用于所述試驗(yàn)。用含有1X PBS的載體配制KGF-2。終濃度為20μg/ml和80μg/ml儲(chǔ)備液。用相同的載體從儲(chǔ)備液制備稀釋溶液。
在大腸桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)中過表達(dá)并純化KGF-2Δ28。將含有95％以上純的重組物質(zhì)的諸級(jí)分用于所述試驗(yàn)。用含有1X PBS的載體配制KGF-2。終濃度為20μg/ml和80μg/ml儲(chǔ)備液。用相同的載體從儲(chǔ)備液制備稀釋溶液。外科損傷按上述實(shí)施例7的方法產(chǎn)生傷口。在損傷那天，通過肌肉內(nèi)注射氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)而使動(dòng)物麻醉。剃干凈動(dòng)物的背部，用70％乙醇和碘溶液清洗皮膚。在損傷前，用無菌紗布擦干外科手術(shù)區(qū)。利用Keyes組織穿孔器產(chǎn)生一個(gè)8mm的全層皮傷口。在試驗(yàn)過程中，傷口一直暴露于外。從損傷當(dāng)天開始，連續(xù)7天每天局部施用試驗(yàn)物質(zhì)一次，隨后施用甲基氫化潑尼松。處理前，用無菌鹽水和紗布輕輕清洗傷口。
肉眼檢查傷口，并在損傷當(dāng)天及治療結(jié)束時(shí)隔一段固定的距離拍照。通過在1-5天每天進(jìn)行測(cè)量并在第8天也進(jìn)行測(cè)量來確定傷口的閉合，以進(jìn)行作圖。用校正的Jameson測(cè)距器水平和垂直地測(cè)量傷口。如果肉眼再觀察不到肉芽組織，而且連續(xù)的上皮覆蓋了傷口，就可以認(rèn)為傷口已經(jīng)愈合了。
用兩種不同劑量的KGF-2完成劑量反應(yīng)，一種劑量為每傷口每天施用50μl載體中的1μg KGF-2，第二種劑量為每傷口每天施用50μl載體中的4μg KGF-2，均持續(xù)5天。載體對(duì)照組接受50μl 1X PBS。
在第8天，通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(300mg/kg)對(duì)動(dòng)物實(shí)行安樂死。然后收集傷口和傷口周圍的皮膚用于組織學(xué)分析。將組織樣品放在組織盒內(nèi)組織活體解剖用海綿之間的10％中性緩沖的福爾馬林中以便進(jìn)一步加工。試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)四組動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估，每組10只動(dòng)物(5只用甲基氫化潑尼松，5只不用糖皮質(zhì)激素)1)未處理對(duì)照，2)載體安慰劑對(duì)照，3)KGF-21μg/天，4)KGF-24μg/天。按如下設(shè)計(jì)該研究N 組 治療·用糖皮質(zhì)激素處理N=5 未處理 -N=5 載體50μlN=5 KGF-2(1μg) 50μlN=5 KGF-2(4μg) 50μl·未用糖皮質(zhì)激素處理N=5未處理 -N=5載體 50μlN=5KGF-2(1μg) 50μlN=5KGF-2(4μg) 50μl傷口面積和閉合的測(cè)量通過在垂直和水平軸測(cè)量面積并得到傷口的總面積來分析傷口的閉合。然后通過確定最初的傷口面積(第0天)和治療后的面積(第8天)之間的差異來評(píng)估收縮情況。在第1天的傷口面積是64mm2，相當(dāng)于真皮孔的大小。用下列公式計(jì)算[第8天的開口面積]-[第1天的開口面積]/[第1天的開口面積]組織學(xué)將樣品固定在10％緩沖的福爾馬林中，將石蠟包埋的樣品塊以與傷口表面垂直的方向切開(5μm)，并用Olympus切片機(jī)切片。在一分為二的傷口的橫斷面切片上進(jìn)行常規(guī)蘇木精-曙紅(H&E)染色。通過傷口的組織學(xué)檢查使我們可以評(píng)估是否因KGF-2的治療而改變了被修補(bǔ)皮膚的愈合過程和形態(tài)外觀。由盲觀測(cè)者使用校正的透鏡測(cè)微計(jì)來測(cè)定傷口缺口的距離。統(tǒng)計(jì)分析用非成對(duì)t檢驗(yàn)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。p值＜0.05視為有顯著性。將數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。結(jié)果將用和不同甲基氫化潑尼松的未處理對(duì)照組的傷口閉合情況進(jìn)行比較的結(jié)果表明，與正常大鼠相比，在損傷后第8天，經(jīng)甲基氫化潑尼松處理的大鼠的傷口愈合明顯受損。在注射甲基氫化潑尼松的組中，總傷口面積為58.4mm2，而在未接受糖皮質(zhì)激素的組中為22.4mm2(圖16)。
KGF-2對(duì)傷口閉合的影響在損傷時(shí)向大鼠全身性施用甲基氫化潑尼松延緩了正常大鼠的傷口閉合(p=0.002)。在第8天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，甲基氫化潑尼松損害組的傷口閉合測(cè)量值表明，與未處理組相比，用KGF-2時(shí)傷口閉合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著加快(1μg p=0.002&4μg p=0.005)(圖16)。在接受1μg KGF-2的組中傷口閉合百分比為60.2％(p=0.002)，在接受4μg KGF-2的組中傷口閉合百分比為73％(p=0.0008)。與之相比，未處理組的傷口閉合百分比為12.5％，載體對(duì)照組的為28.6％(圖17)。
從第1天至第8天，糖皮質(zhì)激素組中的傷口閉合長(zhǎng)度分析表明，在處理組中，用這兩種KGF-2劑量時(shí)，從損傷后的第3天至第8天，傷口大小均有顯著減小(圖18)。
這些結(jié)果表明，與未處理組相比，用4μg KGF-2處理的組顯著(p=0.05)加快了傷口閉合(圖19A)。盡管在正常動(dòng)物中很難評(píng)估蛋白質(zhì)或其它化合物加快傷口愈合的能力(由于恢復(fù)很快)，但是已顯示在該模型中KGF-2可加快傷口愈合。用KGF-2處理過的傷口的組織病理學(xué)評(píng)估傷口缺口的組織形態(tài)測(cè)量學(xué)表明KGF-2處理組的傷口距離減小。未處理組的傷口缺口為5336μ，而用1μg KGF-2處理過的組的傷口缺口減小至2972μ；用4μg KGF-2(p=0.04)處理組的傷口缺口減小至3086μ(圖20)。KGF-2Δ28在傷口愈合中的作用在甲基氫化潑尼松損害的大鼠模型中，評(píng)估KGF-2Δ28和PDGF-BB在傷口愈合中的作用。該試驗(yàn)按照與上述有關(guān)KGF-2蛋白質(zhì)相同的方法完成，不同之處在于KGF-2Δ28蛋白質(zhì)未被His標(biāo)記，并且在第2,4,6,8和10天測(cè)量傷口愈合。用于蛋白質(zhì)的緩沖液載體均為40mMNaOAc和150mM NaCl,pH6.5，但不用于全長(zhǎng)KGF-2的“E2”制劑。用于“E2”KGF-2制劑的緩沖液載體為20mM NaOAc和400mMNaCl,pH6.4。
圖19B中的結(jié)果表明，與未處理組相比，KGF-2Δ28在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地加快傷口閉合，并可逆轉(zhuǎn)甲基氫化潑尼松對(duì)傷口愈合的影響。結(jié)論本實(shí)施例說明KGF-2可逆轉(zhuǎn)甲基氫化潑尼松對(duì)傷口愈合的影響。外源性地施用生長(zhǎng)因子通過將炎性細(xì)胞吸引至傷口而加速肉芽組織形成。以每天測(cè)量值為基礎(chǔ)，在未接受甲基氫化潑尼松的動(dòng)物中也觀察到相似的活性，表明KGF-2對(duì)第5天的傷口閉合百分比有顯著的藥理學(xué)反應(yīng)。對(duì)于測(cè)量KGF-2和其它化合物對(duì)傷口愈合面積影響的效力來說，大鼠的糖皮質(zhì)激素?fù)p害的傷口愈合模型是一個(gè)適宜的和可重現(xiàn)的模型。
總之，這些結(jié)果表明在糖皮質(zhì)激素?fù)p傷的和正常切割的傷口模型中，KGF-2均有顯著活性。因此，可將KGF-2臨床上用于刺激傷口愈合，所述傷口包括外科手術(shù)傷口、糖尿病潰瘍、靜脈停滯潰瘍，灼傷和其它異常傷口愈合疾病如尿毒癥，營養(yǎng)不良，維生素缺乏和用類固醇和抗腫瘤藥物所進(jìn)行的全身性治療。
實(shí)施例9KGF-2mRNA表達(dá)的組織分布用Sambrook等所述的方法(上文所述)，完成Northern印跡分析以檢測(cè)人組織中編碼KGF-2蛋白質(zhì)之基因的表達(dá)水平。通過PCR得到對(duì)應(yīng)于本發(fā)明KGF-2完整開放閱讀框架(SEQ ID NO:1)的探針，將所述探針用rediprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham Life Science)按照生產(chǎn)商的說明用32P標(biāo)記。標(biāo)記后，按照生產(chǎn)商方法號(hào)PT1200-1，用CHROMASPIN-100TM柱(Clontech Laboratories Inc.)純化探針。然后用純化過的標(biāo)記探針檢測(cè)各種人組織，分析編碼KGF-2的基因的表達(dá)情況。
從Clontech得到多組織Northern(MTN)印跡，所述諸印跡含有來自各種人組織(H)的polyA RNA或人免疫系統(tǒng)組織(IM)的polyA RNA，按照生產(chǎn)商方法號(hào)PT1190-1，用ExpressHybTM雜交溶液(Clontech)通過標(biāo)記的探針檢測(cè)諸印跡。雜交并洗滌后，將印跡固定并在-70℃對(duì)膠片曝光過夜，按照標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)膠片顯影。
在大部分人組織中，均可觀察到一種約4.2kb的主要mRNA類型。KGF-2mRNA在心、胰、胎盤和卵巢中相對(duì)豐富。約5.2kb的少量mRNA類型也普遍存在。此5.2kb mRNA的“身分”不清楚。有可能5.2kb轉(zhuǎn)錄本編碼KGF-2的另一種剪接形式或KGF家族的第三個(gè)成員。KGF-2cDNA是4.1kb，與4.2kb mRNA的大小一致。
實(shí)施例10角質(zhì)形成細(xì)胞增殖試驗(yàn)真皮角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚表皮中的細(xì)胞。皮膚中角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)展是傷口愈合中的一個(gè)重要過程。因此，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖試驗(yàn)是刺激角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)以及傷口愈合的蛋白質(zhì)活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
但是，角質(zhì)形成細(xì)胞很難在體外生長(zhǎng)。僅有極少量的角質(zhì)形成細(xì)胞系。這些細(xì)胞系有不同的細(xì)胞和遺傳缺陷。為了避免因細(xì)胞缺陷如關(guān)鍵生長(zhǎng)因子受體的丟失或生長(zhǎng)依賴于關(guān)鍵生長(zhǎng)因子而給該試驗(yàn)帶來的復(fù)雜化，因而選擇初級(jí)真皮角質(zhì)形成細(xì)胞完成該試驗(yàn)。這些初級(jí)角質(zhì)形成細(xì)胞是從Clonetics,Inc.(San Diego,CA)得到的。使用alamarBlue的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖試驗(yàn)alamarBlue是一種活性藍(lán)色染料，當(dāng)加到培養(yǎng)基中時(shí)，由線粒體代謝。然后該染料在組織培養(yǎng)上清液中變成紅色。通過570nm與600nm之間的光密度讀數(shù)差就可直接定量確定紅色染料的量。該讀數(shù)反應(yīng)了細(xì)胞活性和細(xì)胞數(shù)量。
從Clonetics,Inc.購買正常的初級(jí)真皮角質(zhì)形成細(xì)胞(CC-0255,NHEK-Neo群的)。這些細(xì)胞是第2代細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞在完全的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CC-3001,KGM；Clonetics,Inc.)中生長(zhǎng)至達(dá)到80％鋪滿。按照生產(chǎn)商的說明，用胰蛋白酶消化細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞用Hank’s平衡的鹽溶液洗滌兩次。將2-3ml胰蛋白酶加至細(xì)胞中，在室溫消化約3-5分鐘。加入胰蛋白酶中和溶液并收集細(xì)胞。在室溫將細(xì)胞以600×g離心5分鐘，然后使用預(yù)熱的培養(yǎng)基，以3000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度將其鋪在新培養(yǎng)瓶中。
為了進(jìn)行增殖分析，除最外行外，以1000-2000個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞/孔將細(xì)胞鋪在Corning平底96孔平板的完全培養(yǎng)基中。向外側(cè)孔中加入200μl無菌水。這樣有助于使孔的溫度濕度的波動(dòng)達(dá)到最小。在37℃，在5％CO2中使細(xì)胞生長(zhǎng)過夜。用角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CC-3101,KBM,Clonetics,Inc.)將細(xì)胞洗滌兩次，然后向各孔中加入100μlKBM。培養(yǎng)24小時(shí)。用KBM連續(xù)稀釋生長(zhǎng)因子并向各孔加入100μl。用KGM作為陽性對(duì)照，用KBM作為陰性對(duì)照。每個(gè)濃度點(diǎn)使用6個(gè)孔。培養(yǎng)2-3天。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用KBM將細(xì)胞洗滌一次，加入100μl在培養(yǎng)基中預(yù)先混有10％v/v alamarBlue的KBM。培養(yǎng)6-16小時(shí)直到KGM陽性對(duì)照的培養(yǎng)基顏色開始變紅。將平板直接放在平板讀數(shù)儀下，測(cè)量O.D.570nm減去O.D.600nm的值。結(jié)果KGF-2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激作用為了證實(shí)KGF-2(即如上述實(shí)施例7和8所述，從氨基酸Cys37開始的KGF-2)和N-末端缺失突變體KGF-2Δ33和KGF-2Δ28對(duì)于刺激表皮角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)是有活性的，將正常的人初級(jí)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與大腸桿菌中表達(dá)并純化的KGF-2蛋白質(zhì)(批號(hào)E3)(SEQ ID NO:2)，KGF-2Δ33(批號(hào)E1)和KGF-2Δ28(批號(hào)E2)一起保溫。KGF-2蛋白刺激表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)，EC50為約5ng/ml，與FGF7/KGF-1的相同(圖21A)。相比之下，其它FGF，如FGF-1和FGF-2不能刺激初級(jí)角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)。KGF-2Δ33的EC50為0.2ng/ml,KGF-2Δ28的EC50為2ng/ml(見圖21B和C)。因此，在刺激初級(jí)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖方面，KGF-2似乎與FGF7/KGF一樣有效。但是，在刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖方面，KGF-2Δ33比上述實(shí)施例7和8所述的“Cys(37)”KGF-2和KGF-2Δ28更有效。
傷口組織的結(jié)疤涉及真皮成纖維細(xì)胞的過度增殖。為確定KGF-2的刺激作用是否對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞而不是成纖維細(xì)胞特異，對(duì)小鼠Balb.c.3T3成纖維細(xì)胞和人肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。在增殖試驗(yàn)中，這兩種成纖維細(xì)胞對(duì)KGF-2都沒有反應(yīng)。因此，KGF-2看起來是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞特異性的促分裂原，而不是間充質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞的促分裂原。這表明KGF-2引起傷口組織結(jié)疤的可能性很小。
實(shí)施例11A．KGF-2對(duì)用特異性FGF受體轉(zhuǎn)染之細(xì)胞的促有絲分裂作用為了確定哪種FGF受體同工型介導(dǎo)KGF-2的增殖作用，按照Santos-Ocampo等，生物化學(xué)雜志，271:1726-1731(1996))中所述的方法，檢測(cè)KGF-2對(duì)表達(dá)特異性FGF受體同工型之細(xì)胞的影響。已知FGF7/KGF通過與FGFR2ⅲb形式結(jié)合并特異性地激活FGFR2ⅲb形式而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的有絲分裂(Miki等，科學(xué)，251:72-75(1991))。因此，用表達(dá)下列FGF受體同工型之一的細(xì)胞檢測(cè)KGF-2在有絲分裂試驗(yàn)中的增殖作用FGFR1ⅲb、FGFR2ⅲb、FGFR3ⅲb和FGFR4。表達(dá)FGF受體之細(xì)胞的有絲分裂試驗(yàn)按Santos-Ocampo等，生物化學(xué)雜志，271:1726-1731(1996))中所述的方法，將胸苷摻入表達(dá)特異性FGF受體的BaF3細(xì)胞中。簡(jiǎn)而言之，洗滌表達(dá)特異性FGF受體的BaF3細(xì)胞并重懸在Dubeco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，10％新生牛血清，L-谷胺酰胺中。在96孔試驗(yàn)平板的培養(yǎng)基中，每孔鋪約22500個(gè)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有2μg/ml肝素。將檢測(cè)試劑加到各孔中，使每孔的體積達(dá)到200μl。在37℃將細(xì)胞培養(yǎng)2天。向各孔中加入50μl體積中的1μCi3H-胸苷。4-5小時(shí)后，通過玻璃纖維濾紙過濾收集細(xì)胞。用Wallac β平板閃爍計(jì)數(shù)器對(duì)摻入的3H-胸苷計(jì)數(shù)。結(jié)果如通過3H-胸苷摻入所說明的(圖22A)，這些結(jié)果表明KGF-2蛋白質(zhì)(添加了N末端Met的圖1所示的Thr(36)-Ser(208)(SEQ ID NO:2))可強(qiáng)烈刺激表達(dá)KGF受體FGFR2ⅲb同工型之Baf3細(xì)胞的增殖。令人感興趣的是，KGF-2對(duì)表達(dá)FGFR1ⅲb同工型之Baf3細(xì)胞的增殖只有輕微的刺激作用。KGF-2對(duì)表達(dá)受體的FGFR3ⅲb或FGFR形式的細(xì)胞沒有任何作用。
FGF7/KGF刺激表達(dá)KGF受體FGFR2ⅲb同工型之細(xì)胞的增殖，但不刺激表達(dá)FGFR1ⅲb同工型的細(xì)胞的增殖。KGF-2與FGF7/KGF之間的差異是非常有趣的。在對(duì)照試驗(yàn)中，aFGF刺激其受體FGFR1ⅲb和ⅲc，而bFGF刺激其受體FGFR2ⅲc。因此，這些結(jié)果表明KGF-2與FGFR2ⅲb同工型結(jié)合并刺激有絲分裂。與FGF7/KGF相比，KGF-2也與FGFR1ⅲb同工型結(jié)合并刺激有絲分裂。B．KGF-2Δ33對(duì)用特異性FGF受體轉(zhuǎn)染之細(xì)胞的促有絲分裂作用如上所證實(shí)，F(xiàn)GF或KGF-1和-2均與FGF2ⅲb受體(FGFR2ⅲb)結(jié)合并將其激活。用表達(dá)下列FGF受體同工型之一的細(xì)胞檢測(cè)KGF-2Δ33在有絲分裂試驗(yàn)中的增殖作用FGFR2ⅲb或FGFR2ⅲc(2ⅲc受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照)。
按照本實(shí)施例上述部分A完成試驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，在RPMI中培養(yǎng)BaF3細(xì)胞，該RPMI含有10％牛血清(BCS-不是胎牛血清)，10％來自WEHI3細(xì)胞(在含5％BCS的RPMI中生長(zhǎng))培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基，50nM β-巰基乙醇，L-Glu(100X儲(chǔ)備液的2％)和青霉素/鏈霉素(100X儲(chǔ)備液的1％)。
為了進(jìn)行試驗(yàn)，用含10％BCS和1μg/ml肝素的RPMI培養(yǎng)基將BaF3細(xì)胞潤(rùn)洗兩次。將BaF3細(xì)胞(22000個(gè)細(xì)胞/孔)鋪在96孔平板的150μl RPMI培養(yǎng)基中，該RPMI培養(yǎng)基含有10％BCS和1μg/ml肝素。以從約0至10nM的濃度，加入酸性FGF、堿性FGF、KGF-1(HG15400)或KGF-2蛋白質(zhì)(HG03400,03401,03410或03411)。在37℃，將細(xì)胞在200μl的終體積中培養(yǎng)48小時(shí)。所有試驗(yàn)均以一式三份完成。將氚標(biāo)記的胸苷(0.5μCi)加至各孔中，并在37℃保溫4小時(shí)，然后通過玻璃纖維濾紙過濾收集細(xì)胞。用液體閃爍計(jì)數(shù)確定摻入的放射性總量。使用下列陽性對(duì)照FGFR2ⅲc細(xì)胞使用堿性FGF和酸性FGF；FGFR2ⅲb細(xì)胞使用酸性FGF和KGF-1。使用下列陰性對(duì)照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含有10％BCS和1μg/ml肝素的RPMI)。結(jié)果如用3H-胸苷摻入所說明的(圖22A-C)，這些結(jié)果表明KGF-2(N末端加有Met的Thr(36)-Ser(208)),KGF-2Δ33和KGF-2A28蛋白質(zhì)可強(qiáng)烈刺激表達(dá)KGF-2受體FGFR2ⅲb同工型的BaF3細(xì)胞的增殖。KGF-2蛋白質(zhì)對(duì)表達(dá)該受體的FGFR2ⅲc形式的細(xì)胞沒有任何作用。這些結(jié)果表明KGF-2蛋白質(zhì)與FGFR2ⅲb同工型結(jié)合并刺激有絲分裂。另外，似乎KGF-2Δ33也能夠比KGF-2(Thr(36)-Ser(208))更好地刺激BaF3細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例12A．構(gòu)建大腸桿菌優(yōu)化的全長(zhǎng)KGF-2
為了提高全長(zhǎng)KGF-2在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平，將該基因的氨基末端部分的密碼子優(yōu)化成最常用的大腸桿菌密碼子。為了合成最佳的KGF-2區(qū)，合成6種寡核苷酸1-6號(hào)(序列如下所示)。在下列條件下，將這些重疊寡核苷酸用于7輪PCR反應(yīng)變性95℃20秒退火58℃20秒延伸72℃60秒用與上述相同的條件，用第一個(gè)PCR反應(yīng)物1μl,KGF-2的合成引物6作為3’引物，KGF-2合成的5’BamHⅠ作為5’引物，經(jīng)25個(gè)循環(huán)完成第二個(gè)PCR反應(yīng)。將由最終反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物用AvaⅡ和BamHⅠ消化。將實(shí)施例1的KGF-2構(gòu)建體用AvaⅡ和HindⅢ消化，并分離片段。將這兩個(gè)片段在一個(gè)三片段連接中克隆至已用BamHⅠ和HindⅢ消化的pQE-9中。
用于構(gòu)建優(yōu)化的合成KGF-21/208的引物如下KGF-2的合成引物1:ATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGCGCTTCTGCTTTCCCGCACCTGCCGGGTTGCTGCTGCTGCTGCTTCCTGCTGCTGTTC(SEQ ID NO:31)KGF-2的合成引物2:CCGGAGAAACCATGTCCTGACCCAGAGCCTGGCAGGTAACCGGAACAGAAGAAACCAGGAACAGCAGCAGGAAGCAGCAGCA(SEQ ID NO:32)KGF-2的合成引物3:GGGTCAGGACATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCTTCTTCTTCTTTCTCTTCTCCGTCTTCTGCTGGTCGTCACG(SEQ ID NO:33)KGF-2的合成引物4:GGTGAAAGAGAACAGTTTACGCCAACGAACGTCACCCTGCAGGTGGTTGTAAGAACGAACGTGACGACCAGCAGAAGACGG(SEQ ID NO:34)KGF-2的合成引物5:CGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAA(SEQ ID NO:35)KGF-2的合成引物6:TTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAG(SEQ IDNO:36)KGF-2的合成5’BamHⅠ:AAAGGATCCATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGC(SEQ ID NO:37)在圖23中列出了所得的克隆(SEQ ID NO:38和39)。B．構(gòu)建大腸桿菌優(yōu)化的成熟KGF-2為了進(jìn)一步提高KGF-2成熟形式在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平，將該基因氨基末端部分的密碼子優(yōu)化成最常用的大腸桿菌密碼子。與KGF-2的成熟形式相對(duì)應(yīng)，構(gòu)建從蘇氨酸36開始的KGF-2的截短形式。將實(shí)施例12A的大腸桿菌合成KGF-2作為PCR反應(yīng)的模板，所述PCR反應(yīng)用BspHⅠ 5’KGF-2作為5’引物(下文給出的序列)，用HindⅢ3’KGF-2作為3’引物(下文給出序列)。用在實(shí)施例12A中的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行25個(gè)循環(huán)完成擴(kuò)增。將所得產(chǎn)物用BspHⅠ和HindⅢ消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的大腸桿菌表達(dá)載體pQE60中。BspHⅠ 5’KGF-2引物TTTCATGACTTGTCAAGCTCTGGGTCAAGATATGGTTC(SEQ ID NO:40)HindⅢ3’KGF-2引物GCCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCC(SEQ ID NO:41)在圖24A中列出了所得的克隆(SEQ ID NO:42和43)。C．構(gòu)建另一大腸桿菌優(yōu)化的成熟KGF-2為了進(jìn)一步提高KGF-2成熟形式在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平，將所述大腸桿菌優(yōu)化基因之氨基末端部分53個(gè)氨基酸的密碼子變成其它常用的大腸桿菌密碼子。為了合成優(yōu)化的KGF-2區(qū)，合成6個(gè)寡核苷酸編號(hào)為18062,18061,18058,18064,18059和18063(下文給出序列)。在下列條件下，將這些重疊寡核苷酸用于7輪PCR反應(yīng)變性95℃20秒退火58℃20秒延伸72℃60秒完成7輪合成后，將該區(qū)的5’引物18169和該整個(gè)區(qū)的3’引物18060加到PCR反應(yīng)中，所述PCR反應(yīng)含1μl來自所述6個(gè)寡核苷酸的初始反應(yīng)物。用下列條件，將該產(chǎn)物擴(kuò)增30輪變性95℃20秒退火55℃20秒延伸72℃60秒在與上述相同的條件下，用引物18066和18065開始第二個(gè)PCR反應(yīng)以擴(kuò)增該基因的3’區(qū)25輪。在瓊脂糖凝膠上分離所得的產(chǎn)物。將含該產(chǎn)物的凝膠塊用10mM Tris,1mM EDTA,pH7.5稀釋。利用每一稀釋過的凝膠塊各1μl再進(jìn)行另一個(gè)PCR反應(yīng)，其中使用引物18169作為5’引物，引物18065作為3’引物。用與上述相同的條件將產(chǎn)物擴(kuò)增25輪。將最后這次反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物用EcoRⅠ和HindⅢ限制性切割，然后克隆至也用EcoRⅠ和HindⅢ切割的pQE60中(現(xiàn)在為pQE6)。5’合成引物的序列18169 KGF25′EcoRⅠ/RBS:TCAGTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAATCATGACTTGCCAGG[SEQ ID NO:44]18062 KGF2合成的新R1有義引物TCATGACTTGCCAGGCACTGGGTCAAGACATGGTTTCCCCGGAAGCTA[SEQ ID NO:45]18061 KGF2合成的R2有義引物GCTTCAGCAGCCCATCTAGCGCAGGTCGTCACGTTCGCTCTTACAACC[SEQ ID NO:46]18058 KGF2合成的R3有義引物GTTCGTTGGCGCAAACTGTTCAGCTTTACCAAGTACTTCCTGAAAATC[SEQ ID NO:47]18066 KGF2 20bp AvaⅡ有義引物TCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGAC[SEQ ID NO:48]18064 KGF2合成的F1反義引物GATGGGCTGCTGAAGCTAGAGCTGGAGCTGTTGGTAGCTTCCGGGGAA[SEQID NO:49]18059 KGF2合成的F2反義引物AACAGTTTGCGCCAACGAACATCACCCTGTAAGTGGTTGTAAGAG[SEQ ID NO:50]18063 KGF2合成的F3反義引物TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAGGAAGTA[SEQ ID NO:51]18060 KGF2 AvaⅡ反義引物TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCG[SEQ ID NO:52]18065 KGF2 HindⅢ3’終止引物AGATCAGGCTTCTATTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG[SEQ ID NO:53]在圖24B中列出了合成的KGF-2基因序列和其相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO:54和55)。
實(shí)施例13構(gòu)建KGF-2缺失突變體用實(shí)施例12A的優(yōu)化KGF-2構(gòu)建體為模板，從KGF-2基因的5’末端和3’末端構(gòu)建缺失突變體。以可能對(duì)大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生不利影響的基因區(qū)為基礎(chǔ)，選擇缺失。對(duì)應(yīng)5’缺失，用下文所列的引物作為5’引物。這些引物含有標(biāo)明的限制位點(diǎn)和編碼起始甲硫氨酸的ATG。將KGF-2(FGF-12)208氨基酸3’HindⅢ引物用作3’引物。用與實(shí)施例12所列相同的標(biāo)準(zhǔn)條件完成25輪的PCR擴(kuò)增。用BspHⅠ限制性切割KGF-236aa/208aa缺失突變體產(chǎn)物的5’位點(diǎn)，用HindⅢ限制性切割3’位點(diǎn)，然后克隆至已用BspHⅠ和HindⅢ消化過的pQE60中。用NcoⅠ作為5’限制酶，用HindⅢ作為3’位點(diǎn)限制酶，對(duì)所有其它產(chǎn)物進(jìn)行限制性切割，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化過的pQE60中。對(duì)于KGF-2(FGF-12)36aa/153aa，用128aa 3’HindⅢ作為3’引物，用FGF-1236aa/208aa作為5’引物。對(duì)于FGF-12 62aa/153aa，用128aa 3’HindⅢ作為3’引物，用FGF-12 62aa/208aa作為5’引物。所得克隆的名稱顯示因所述缺失而產(chǎn)生之多肽的第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸。例如，KGF-236aa/153aa表示該缺失突變體的第一個(gè)氨基酸是KGF-2的氨基酸36，最后一個(gè)氨基酸是KGF-2的氨基酸153。另外，如在圖25-33中所說明的，每個(gè)突變體均加有N-末端Met。缺失引物的序列如下FGF12 36aa/208aa:5′BsphⅠ GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC[SEQ IDNO:56]FGF12 63aa/208aa:5′NcoⅠ GGACAGCCATGGCTGGTCGTCACGTTCG[SEQ ID NO:57]FGF12 77aa/208aa:5′NcoⅠ GGACAGCCATGGTTCGTTGGCGTAAACTG[SEQ ID NO:58]FGE12 93aa/208aa:5′NcoⅠ GGACAGCCATGGAAAAAAACGGTAAAGTTTC[SEQ ID NO:59]FGF12 104aa/208aa:5′NcoⅠ GGACCCCCATGGAGAACTGCCCGTAGAGC[SEQ ID NO:60]FGF12 123aa/208aa:5′NcoⅠ GGACCCCCATGGTCAAAGCCATTAACAGCAAC[SEQ ID NO:61]FGF12 138aa/208aa:5′NcoⅠ GGACCCCCATGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAG [SEQ IDNO:62]FGF12 3′HindⅢ(用于上述所有的缺失克隆)CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG[SEQ ID NO:63]FGF12 36aa/153aa:5′BsphⅠ(如上述)3′HindⅢ CTGCCCAAGCTTATTACTTCAGCTTACAGTCATTGT[SEQ IDNO:64]FGF12 63aa/153aa:5′NcoⅠ和3’HindⅢ，如上述。
在圖25-33中列出了所得缺失突變體的序列。(SEQ ID NO:65-82)實(shí)施例14構(gòu)建KGF-2的半胱氨酸突變體為了構(gòu)建C-37突變，用引物5457 5’BsphⅠ和5258 173aa 3’HindⅢ擴(kuò)增來自實(shí)施例12A的KGF-2(FGF-12)模板。引物5457 5’BsphⅠ將半胱氨酸37變成絲氨酸。用實(shí)施例12A的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行25輪完成擴(kuò)增。將所得產(chǎn)物用BsphⅠ和HindⅢ限制性切割，然后克隆至已用BsphⅠ和HindⅢ消化的大腸桿菌表達(dá)載體pQE60中。(圖34)(SEQ ID NO:83)為了將半胱氨酸106突變?yōu)榻z氨酸，進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)以便進(jìn)行該半胱氨酸的寡核苷酸定點(diǎn)誘變。在一個(gè)反應(yīng)中，用5453 BsphⅠ作為該反應(yīng)的5’引物，用5455作為該反應(yīng)的3’引物。在第二個(gè)反應(yīng)中，用5456作為5’引物，用5258 HindⅢ作為3’引物。在實(shí)施例12所列的標(biāo)準(zhǔn)條件下，將反應(yīng)擴(kuò)增25輪。在用5453 BsphⅠ作為5’引物、用5258 HindⅢ作為3’引物的隨后反應(yīng)中，用1μl各PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板。用實(shí)施例12所列的標(biāo)準(zhǔn)條件完成25輪的擴(kuò)增。將所得產(chǎn)物用BspHⅠ和HindⅢ消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的大腸桿菌表達(dá)載體pQE60中。
需要進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)來產(chǎn)生C-37/C-106突變體。用引物5457BsphⅠ和5455來產(chǎn)生含半胱氨酸37被絲氨酸所取代的突變體的5’區(qū)，用引物5456和5258 HindⅢ來產(chǎn)生含半胱氨酸106被絲氨酸所取代的突變體的3’區(qū)。在第二個(gè)反應(yīng)中，用從每個(gè)前期反應(yīng)得到的各1μl產(chǎn)物一起作為模板，利用5457 BsphⅠ引物作為5’引物，用5258 HindⅢ引物作為3’引物來產(chǎn)生C-37/C-106突變體。將該P(yáng)CR產(chǎn)物用BsphⅠ和HindⅢ限制性消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的pQE60中。所得克隆列于圖35(SEQ ID NO:84)。半胱氨酸突變引物的序列5457 BspHⅠ:GGACCCTCATGACCTCTCAGGCTCTGGGT(SEQ ID NO:85)5456:AAGGAGAACTCTCCGTACAGC(SEQ ID NO:86)5455:GCTGTACGGTCTGTTCTCCTT(SEQ ID NO:87)5453 BspHⅠ:GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC(SEQID NO:88)5258 HindⅢ:CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEQ ID NO:89)實(shí)施例15KGF-2(FGF-12)的生產(chǎn)和純化將編碼實(shí)施例12B中所述的優(yōu)化成熟蛋白質(zhì)(即KGF-2的氨基酸T36至S208)的DNA序列克隆至質(zhì)粒pQE-9(Qiagen)中。在37℃，含100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB中，讓大腸桿菌(M15/rep4；Qiagen)過夜生長(zhǎng)至穩(wěn)定期。以1∶50的稀釋度，用該培養(yǎng)物接種含100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基。使細(xì)胞在37℃生長(zhǎng)至O.D.595為0.7，通過加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至1mM的終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)。3-4小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，然后以5體積緩沖液1體積細(xì)胞糊的比例，將細(xì)胞重懸于含60mM NaPO4和360mM NaCl的緩沖液中。在Mautin Gaulin中破碎細(xì)胞后，通過加入NaOH將提取物的pH調(diào)至8.0，然后離心澄清。
將澄清的可溶性提取物上樣于Poros HS-50柱(2.0×10.0cm；PerSeptive Biosystems,Inc.)，然后用含0.5M,1.0M和1.5M NaCl的50mM NaPO4pH8.0分步洗脫已結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后用50mM NaPO4pH6.5將在1.5M的鹽級(jí)分中洗脫下來的KGF-2稀釋5倍，達(dá)到300mM的最終鹽濃度。使含KGF-2的該級(jí)分依次通過Poros HQ-20柱(2.0×7.0cm；PerSeptive Biosystems,Inc.)，然后結(jié)合于Poros CM-20柱(2.0×9.0cm；PerSeptive Biosystems,Inc.)中。收集在約500mM-約750mMNaCl下洗脫出來的含KGF-2(FGF-12)的諸級(jí)分，稀釋，再重上樣于CM-20柱以便進(jìn)行濃縮。最后，在凝膠過濾柱(S-75；Pharmacia)上于40mM NaOAc pH6.5,150mM NaCl中分離該蛋白質(zhì)(E-5批)。或者，在磷酸緩沖鹽溶液(PBS,E-4批)上跑凝膠過濾柱。收集含KGF-2的級(jí)分并用Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定確定蛋白質(zhì)的濃度。經(jīng)SDS-PAGE判斷蛋白質(zhì)的純度＞90％。最后，用Limulus Amebocyte Lysate檢測(cè)(Cape CodAssociates)確定的內(nèi)毒素水平≤1Eu/mg。經(jīng)這種方式制備的蛋白質(zhì)能夠與肝素結(jié)合，這是FGF家族成員的一個(gè)標(biāo)志。
實(shí)施例16A．構(gòu)建N-末端缺失突變體KGF-2Δ33為了提高KGF2在大腸桿菌中的表達(dá)水平，并提高大腸桿菌表達(dá)的KGF2的溶解性和穩(wěn)定性，制備從加工前的KGF2中除去了前68個(gè)氨基酸的缺失變體KGF-2Δ33(KGF-2aa 69-208)。產(chǎn)生該缺失變體的原理是基于下列觀察結(jié)果。首先，成熟KGF2(KGF-2aa 36-208)含奇數(shù)個(gè)(3個(gè))半胱氨酸殘基，這可因分子內(nèi)二硫鍵形成而發(fā)生聚集。KGFΔ33缺失變體僅含有2個(gè)半胱氨酸殘基，這樣降低了分子內(nèi)二硫鍵形成以及隨后發(fā)生聚集的可能性。聚集的減少可導(dǎo)致活性KGF2蛋白質(zhì)產(chǎn)率提高。第二，KGFΔ33缺失變體除去了多絲氨酸區(qū)，所述多絲氨酸區(qū)在KGF-1中不存在，而且似乎對(duì)活性并不重要，但可能會(huì)阻礙所述蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)。因此，除去多絲氨酸區(qū)可提高活性KGF-2蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第三，KGFΔ33在大腸桿菌中的表達(dá)會(huì)引起KGF-2在殘基68和69之間的自然裂解。因此，預(yù)期KGF2Δ33可以被有效地加工并在大腸桿菌中是穩(wěn)定的。
在pQE6中構(gòu)建KGF2Δ33為了進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)指導(dǎo)的擴(kuò)增并將KGF2Δ33亞克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pQE6中，合成與所需KGF2區(qū)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物(5952和19138)，它們的序列如下引物5952: 5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′引物19138:5′GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT 3′在N-末端引物(5952)的情況下，插入一個(gè)AflⅢ限制位點(diǎn)，而在C-末端引物(19138)的情況下，插入一個(gè)HindⅢ限制位點(diǎn)。引物5952還含有一個(gè)與KGF2編碼區(qū)鄰接并符合讀框的ATG序列以便在大腸桿菌中翻譯克隆的片段，而引物19138含有與KGF2編碼區(qū)鄰接并符合讀框的2個(gè)終止密碼子(在大腸桿菌中優(yōu)先使用的)，這樣可確保在大腸桿菌中正確地進(jìn)行翻譯終止。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件，將成熟KGF-2(aa 36-208)的核苷酸序列(在實(shí)施例12C中構(gòu)建的)為模板，完成聚合酶鏈反應(yīng)。將所得的擴(kuò)增子用AflⅢ和HindⅢ限制性消化并亞克隆至經(jīng)NcoⅠ/HindⅢ消化的pQE6蛋白質(zhì)表達(dá)載體中。
在pHE1中構(gòu)建KGF2Δ33為了進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)指導(dǎo)的擴(kuò)增并將KGF2Δ33亞克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pHE1中，合成對(duì)應(yīng)于所需KGF2區(qū)的兩個(gè)寡核苷酸引物(6153和6150)，它們的序列如下引物6153:5′CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG 3′引物6150:5′CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG 3′在N-末端引物(6153)的情況下，插入一個(gè)NdeⅠ限制位點(diǎn)，而在C-末端引物(6150)的情況下，插入一個(gè)Asp718限制位點(diǎn)。引物6153還含有一個(gè)與KGF2編碼區(qū)鄰接并符合讀框的ATG序列以便在大腸桿菌中翻譯克隆的片段，而引物6150含有與KGF2編碼區(qū)鄰接并符合讀框的2個(gè)終止密碼子(在大腸桿菌中優(yōu)先使用的)，這樣可確保在大腸桿菌中正確地進(jìn)行翻譯終止。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件，將成熟KGF-2(aa 36-208)的核苷酸序列(在實(shí)施例12C中構(gòu)建的)為模板，完成聚合酶鏈反應(yīng)。將所得的擴(kuò)增子用NdeⅠ和Asp718限制性消化并亞克隆至經(jīng)NdeⅠ/Asp718消化的pHE1蛋白質(zhì)表達(dá)載體中。KGF2Δ33的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAAKGF2Δ33的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHSB．構(gòu)建優(yōu)化的KGF-2Δ33為了提高KGF2Δ33在大腸桿菌中的表達(dá)水平，將完整基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化以便與大腸桿菌中最常使用的密碼子相匹配。由于用于產(chǎn)生KGF2Δ33的模板在N末端區(qū)內(nèi)已進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，因此，需要將C末端氨基酸(84-208)優(yōu)化。
首先，將氨基酸172-208進(jìn)行密碼子優(yōu)化以產(chǎn)生KGF2Δ33(s172-208)。通過重疊PCR策略可達(dá)到此目的。將寡核苷酸PM07和PM08(對(duì)應(yīng)于氨基酸172-208)合并在一起，并通過將它們加熱至70℃然后冷卻至37℃而一起退火。然后將已退火的寡核苷酸用作標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)的模板，所述標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)由引物PM09和PM10指導(dǎo)。在按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件并用KGF2Δ33為模板進(jìn)行的另一個(gè)PCR反應(yīng)中，用寡核苷酸PM05(它與KGF2編碼區(qū)內(nèi)的Pst1位點(diǎn)重疊)和PM11擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于氨基酸84-172的KGF2區(qū)。在第三個(gè)PCR反應(yīng)中，將第一個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于已優(yōu)化密碼子的氨基酸172-208)和第二個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于密碼子未被優(yōu)化的氨基酸84-172)合并并作為寡核苷酸PM05和PM10指導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)的模板。將所得擴(kuò)增子用Pst1/HindⅢ消化，并亞克隆至Pst1/HindⅢ消化的pQE6KGF2Δ33中，有效地取代對(duì)應(yīng)的密碼子未被優(yōu)化的區(qū)，從而產(chǎn)生pQE6KGF2Δ33(s172-208)。
為了完成KGF2的密碼子優(yōu)化，用重疊寡核苷酸產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于KGF2氨基酸84-172區(qū)的已優(yōu)化密碼子的合成基因。首先，將四個(gè)寡核苷酸(PM31、PM32、PM33和PM34)合并并完成7個(gè)循環(huán)的PCR:94℃,30秒；46.5℃,30秒；和72℃,30秒。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用1μl第一個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，完成由引物PM35和PM36指導(dǎo)的第二個(gè)PCR反應(yīng)。將所得的已優(yōu)化密碼子的基因片段用PstⅠ/SalⅠ消化并亞克隆至PstⅠ/SalⅠ消化的pQE6KGF2Δ33(s172-208)中以產(chǎn)生一個(gè)已完全優(yōu)化的KGF2編碼基因，pQE6KGF2Δ33s。
為了構(gòu)建另一種大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體，利用PQE6KGF2Δ33s上的引物PM102和PM130對(duì)KGF2Δ33s進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得的擴(kuò)增子用NdeⅠ和EcoRⅤ消化，并亞克隆至已用NdeⅠ和Asp718消化的pHE1表達(dá)載體(鈍末端形式)中，從而形成pHE1Δ33s。
在構(gòu)建密碼子優(yōu)化的KGF2Δ33s中所用的寡核苷酸序列PM05:CAACCACCTGCAGGGTGACGPM07:AACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACCPM08:GGGCCCAAGCTTAAGAGTGTACCACCATTGGCAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTACGACGGGTTTTCTGACCACGPM09:GCCACATACATTTGTCGACCGTTPM10:GGGCCCAAGCTTAAGAGTGPM11:GCCACATACATTTGTCGACCGTTPM31:CTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGPM32:AGCTTTAACAGCAACAACACCGATTTCAACGGAGGTGATTTCCAGGATGGAGTACGGGCAGTTTTCTTTCTTGGTACCAGAAACTTTACCPM33:GGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAACPM34:GTCGACCGTTGTGCTGCCAGTTGAAGGAAGCGTAGGTGTTGTAACCGTTTTCTTCGATACGTTCTTTCAGTTTACAGTCGTTGTTAAATTCTTTGGAACCPM35:GCGGCGTCGACCGTTGTGCTGCCAGPM36:GCGGCCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGPM102:CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGGPM130:CGCGCGATATCTTATTAAGAGTGTACCACCATTGKGF2Δ33(s172-208)的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCCATCCTGGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAACGACTGTAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAAAACGGTTACAACACCTACGCTTCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTC A G A A A A C C C G T C G T A A A A A C A C C TCTGCTCACTTTCTGCCAATGGTGGTACACTCTTAAKGF2Δ33(s172-208)的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHSC．構(gòu)建N末端缺失突變體KGF-2Δ4為了提高KGF2在大腸桿菌中的表達(dá)水平，并提高大腸桿菌表達(dá)的KGF2的溶解性和穩(wěn)定性，構(gòu)建從加工前KGF2中除去了前38個(gè)氨基酸(包括37位的半胱氨酸)的一種缺失變體KGF-2Δ4(氨基酸39-208)。由于所得KGF2缺失分子含偶數(shù)個(gè)半胱氨酸殘基，因分子內(nèi)二硫鍵形成所引起的聚集問題就可以減少，從而提高了活性蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
為了進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)指導(dǎo)的擴(kuò)增并將KGF2Δ4亞克隆至大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體pQE6中，合成兩個(gè)寡核苷酸引物(PM61和19138)，它們的堿基序列如下PM61:CGCGGCCATGGCTCTGGGTCAGGACATG19138:GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT在N-末端引物(PM61)的情況下，插入一個(gè)NcoⅠ限制位點(diǎn)，而在C-末端引物(19138)的情況下，插入一個(gè)HindⅢ限制位點(diǎn)。PM61還含有一個(gè)與KGF2編碼區(qū)鄰接且讀框一致的ATG序列以便在大腸桿菌中翻譯已克隆的片段，而19138含有與KGF2編碼區(qū)鄰接且讀框一致的2個(gè)終止密碼子(在大腸桿菌中優(yōu)先使用的)，這樣可確保在大腸桿菌中正確地發(fā)生翻譯終止。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件，以全長(zhǎng)KGF2(aa 36-208)(在實(shí)施例12C中構(gòu)建的)為模板，完成聚合酶鏈反應(yīng)。將所得的擴(kuò)增子用NcoⅠ和HindⅢ限制性消化并亞克隆至已用NcoⅠ/HindⅢ消化過的pQE6蛋白質(zhì)表達(dá)載體中。KGF2Δ4的核苷酸序列ATGGCTCTGGGTCAAGATATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCCTCTTCCTCTTTCTCTTCCCCGTCTTCCGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAAKGF2Δ4的氨基酸序列MALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS實(shí)施例17在正常大鼠內(nèi)KGF-2Δ33刺激的傷口愈合為了證實(shí)KGF-2Δ33可加快傷口愈合，用下列模型檢查切割傷口的傷口愈合情況。
用Keyes皮膚打孔器在Sprague Dawley大鼠(n=5)背上打出一6mm的切割傷口。將傷口敞開并用各種濃度KGF-2Δ33(在40mM NaOAc和150mM NaCl,pH6.5緩沖液中)和緩沖液(40mM NaOAc和150mMNaCl,pH6.5)從創(chuàng)傷當(dāng)天開始進(jìn)行局部處理，連續(xù)處理4天。每天用校正的Jameson測(cè)徑器測(cè)量傷口。用平方毫米表示傷口的大小。在最后一天測(cè)量傷口，并收集傷口進(jìn)一步分析。用非成對(duì)t檢驗(yàn)完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值±SE)。評(píng)估參數(shù)包括傷口閉合百分比，組織學(xué)分?jǐn)?shù)(1-3表示有最少的細(xì)胞積累，沒有肉芽；4-6表示不成熟肉芽，炎性細(xì)胞，毛細(xì)血管；7-9表示肉芽組織，細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、新上皮；10-12表示含成纖維細(xì)胞、膠原和上皮的成熟真皮)，上皮再形成和免疫組織化學(xué)。
在創(chuàng)傷后第3天，與緩沖液對(duì)照的38.9mm2相比，用KGF-2Δ33處理減小了傷口大小(用4μg，傷口大小為30.4mm2,p=0.006；用1μg，傷口大小為33.6mm2,p=0.0007)。在創(chuàng)傷后第4天，與緩沖液對(duì)照的33.8mm2相比，用KGF-2Δ33處理減小了傷口大小(用0.1μg，傷口大小為27.2mm2,p=0.02；用0.4μg，傷口大小為27.9mm2,p=0.04)。在創(chuàng)傷后第5天，與緩沖液對(duì)照的25.1mm2相比，用KGF-2Δ33處理減小了傷口大小(用4μg，傷口大小為18.1mm2p=0.02)。參見圖36。
在第5天收集傷口后，評(píng)估其它參數(shù)。與緩沖液對(duì)照的60.2％相比，用4μg KGF-2Δ33提高了傷口閉合的百分比(71.2％,p=0.02)。與緩沖液對(duì)照的6.4相比，施用1μg和4μg KGF-2Δ33還可提高組織學(xué)分?jǐn)?shù)(用1μg為8.4,p=0.005；用4μg為8.5,p=0.04。)。相對(duì)于緩沖液對(duì)照的923μm，施用1μg和4μg KGF-2Δ33改善了上皮再形成(用1μg為1389μm,p=0.007；用4μg為1220μm,p=0.02)。參見圖37。
該研究說明，正如通過總傷口面積的減少所表明的，每日用KGF-2Δ33處理加快了正常動(dòng)物中的傷口愈合速率。另外，傷口樣品的組織學(xué)評(píng)估和上皮再形成的評(píng)估也表明，在所述正常大鼠模型中，KGF-2Δ33也提高了愈合速率。
實(shí)施例18在正常大鼠中KGF-2Δ33對(duì)抗拉強(qiáng)度和表皮厚度的影響為了證實(shí)KGF-2Δ33可提高傷口的抗拉強(qiáng)度和表皮厚度，進(jìn)行下列試驗(yàn)。
在雄性Sprague Dawley大鼠(n=8或9)的背部切割一2.5cm的全層皮切割傷口。用3個(gè)等距離的金屬皮膚夾子縫合皮膚切口。在切割時(shí)局部涂抹緩沖液(40mM NaOAc和150mM NaCl,pH6.5)或KGF-2Δ33(在40mM NaOAc和150mM NaCl,pH6.5緩沖液中的溶液)。在第5天切割四條0.5cm寬的傷口帶。用InstronTM皮膚張力計(jì)來研究樣品的抗斷強(qiáng)度，并將樣品用于羥脯氨酸測(cè)定和組織病理學(xué)分析?？箶鄰?qiáng)度是指各傷口在裂開前所承受的最大力量。用非成對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(平均值±SE)。
在切割皮膚大鼠模型中，切割后在傷口內(nèi)局部涂抹一次KGF-2Δ33可使抗斷強(qiáng)度、抗拉強(qiáng)度和表皮厚度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加。在一項(xiàng)研究中，用KGF-2以1、4和10μg處理的傷口的抗斷強(qiáng)度明顯高于用緩沖液處理的對(duì)照組(1μg時(shí)107.3g,p=0.0006；4μg時(shí)126.4g,p＜0.0001；10μg時(shí)123.8g,p＜0.0001)。參見圖38。
在光學(xué)顯微鏡下對(duì)馬森氏三色切片進(jìn)行表皮厚度測(cè)定。與緩沖液對(duì)照組的54.8μ相比，用KGF-2Δ33處理的傷口表現(xiàn)出表皮厚度增加(1μg時(shí)60.5μ,4μg時(shí)66.51μ,p=0.01,10μg時(shí)59.6μ)。參見圖39。
這些研究表明，單次傷口內(nèi)涂抹KGF-2提高并加快了傷口的愈合過程，表現(xiàn)為切割傷口的抗斷強(qiáng)度和表皮厚度增加。
實(shí)施例19KGF-2Δ33對(duì)正常大鼠皮膚的影響為了說明真皮內(nèi)注射KGF-2Δ33后，KGF-2Δ33對(duì)正常大鼠皮膚的影響，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。
在第0天，對(duì)雄性成年SD大鼠(n=3)真皮內(nèi)注射6次50μl安慰劑或50μl的濃度為1和4μg的KGF-2Δ33(在40mM NaOAc和150mMNaCl,pH6.5緩沖液中的溶液)。在第24和48小時(shí)處死動(dòng)物，處死動(dòng)物前2小時(shí)對(duì)動(dòng)物注射5-2’-溴-脫氧尿苷(BrdU)(100mg/kg i.p.)。測(cè)定從顆粒層到基底層底部的表皮厚度。沿注射部位進(jìn)行約20次測(cè)量并計(jì)算出平均厚度。用校準(zhǔn)的測(cè)微計(jì)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)馬森氏三色切片進(jìn)行測(cè)量。由兩個(gè)盲觀察者在光學(xué)顯微鏡下用如下計(jì)分系統(tǒng)進(jìn)行BrdU計(jì)分0-3表示沒有至很少量的BrdU標(biāo)記的細(xì)胞；4-6表示中等標(biāo)記；7-10表示強(qiáng)標(biāo)記的細(xì)胞。注射后24和48小時(shí)處死動(dòng)物。用非成對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(平均值±SE)。
與緩沖液對(duì)照的27.1μ相比，KGF-2Δ33處理過的皮膚在24小時(shí)時(shí)表現(xiàn)出表皮厚度增加(1μg時(shí)為32.2μ,p＜0.001；4μg時(shí)為35.4μ,p＜0.0001)。與緩沖液對(duì)照的27.8μ相比，KGF-2Δ33處理的皮膚在48小時(shí)時(shí)表現(xiàn)出表皮厚度增加(1μg時(shí)為34.0μ,p=0.0003,4μg時(shí)為42.4μ,p＜0.0001)。參見圖40。與緩沖液對(duì)照的3.33相比，KGF-2Δ33處理過的皮膚在48小時(shí)時(shí)還表現(xiàn)出BrdU免疫染色增加(1μg時(shí)為4.37,p=0.07,4μg時(shí)為6.85,p＜0.0001)。參見圖41。
這些研究表明，皮膚內(nèi)注射KGF-2提高并加快了表皮厚度增加。因此，KGF-2可用于預(yù)防或緩解皺紋，改善老化的皮膚和減少傷疤或改善美容手術(shù)后的傷口愈合。此外，KGF-2還可預(yù)防性地用于預(yù)防或減少口腔粘膜炎(口腔潰瘍)、由于化療或其它試劑引起的腸炎。
實(shí)施例20KGF-2對(duì)PAF引起的爪水腫的抗炎效果為了說明KGF-2的抗炎效果，用PAF引起的爪水腫炎癥模型進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。
將lewis大鼠(190-210克)每4只分成一組，對(duì)大鼠右后爪的足墊用120μl含有2.5納摩爾PAF的溶液進(jìn)行皮下注射，該溶液中同時(shí)含有如下試劑125μg Ckb-10(B5),24μg LPS,73μg KGF-2[圖1(SEQ ID NO:2)的Thr(36)-Ser(208),N-末端為Met]或不加蛋白質(zhì)。對(duì)左后足注射相同量的緩沖液作為平行對(duì)照。在臨注射PAF前、注射PAF后30分鐘和90分鐘用體積描記圖系統(tǒng)測(cè)量大鼠爪的體積。計(jì)算鼠爪體積改變的百分?jǐn)?shù)(％)。實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2的試驗(yàn)試劑<
>如圖42所示，正如所預(yù)期的，右后爪單獨(dú)注射PAF 0.5小時(shí)后使鼠爪的體積顯著增加(對(duì)于實(shí)驗(yàn)1或?qū)嶒?yàn)2，分別為75或100％)；而注射緩沖液的左后爪或單獨(dú)注射LPS或SEB的右后爪僅表現(xiàn)出輕微的水腫癥狀(數(shù)據(jù)未給出)。但當(dāng)將KGF-2與PAF同時(shí)局部注射時(shí)，與單獨(dú)用PAF攻擊的鼠爪相比，前一情況下鼠爪的體積明顯減小(對(duì)于實(shí)驗(yàn)1或?qū)嶒?yàn)2，分別為25或50％)。當(dāng)將PAF與Ckb-10(一種不同的蛋白質(zhì))、LPS或SEB(兩種炎性介體)一起注射動(dòng)物時(shí)未觀察到爪水腫的減弱。這些結(jié)果表明KGF-2的抗炎效果是特異性的，而不是由于該蛋白質(zhì)的某些非特異性性質(zhì)引起的。KGF-2Δ33對(duì)大鼠中PAF引起的爪水腫的影響在上述用KGF-2Δ33證實(shí)其刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的體外生物學(xué)活性及其在體內(nèi)對(duì)傷口愈合的影響的各實(shí)驗(yàn)后，還在大鼠內(nèi)評(píng)估了KGF-2Δ33對(duì)PAF引起的大鼠爪水腫模型的效果。將lewis大鼠(190-210克)每4只分成一組，對(duì)大鼠右后爪的足墊用120μl含有2.5納摩爾PAF的溶液進(jìn)行皮下注射，該溶液中還含有210μg KGF-2Δ33或白蛋白。對(duì)左后爪單獨(dú)注射相同量的緩沖液、白蛋白或KGF-2Δ33作為平行對(duì)照。在注射PAF后的不同間隔時(shí)間用體積描記圖系統(tǒng)測(cè)量大鼠爪的體積。計(jì)算鼠爪體積改變的百分?jǐn)?shù)(％)。
如圖43所示，正如所預(yù)期的，右后爪在注射PAF和白蛋白0.5小時(shí)后，爪體積顯著增加(75％)；而只注射緩沖液、白蛋白或KGF-2Δ33的左后爪僅表現(xiàn)出輕微的水腫癥狀。但是，當(dāng)將KGF-2Δ33與PAF同時(shí)局部注射時(shí)，與用PAF+白蛋白攻擊的鼠爪相比，在持續(xù)4小時(shí)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，前一情況下鼠爪的體積明顯減小(平均20％)。這些結(jié)果證實(shí)了KGF-2Δ33的抗炎性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)試劑
因此，KGF-2可用于治療炎癥是主要病因的急性或慢性病癥，所述病癥包括但不僅限于牛皮癬、濕疹皮炎和/或關(guān)節(jié)炎。
實(shí)施例21KGF-2Δ33對(duì)結(jié)腸端-端吻合術(shù)大鼠模型的影響本實(shí)施例說明KGF-2Δ33可以在Wistar或Sprague Dawley大鼠的腸或結(jié)腸吻合術(shù)模型中提高腸修復(fù)的速率。
實(shí)驗(yàn)性吻合術(shù)中應(yīng)用大鼠是一種已很好表征過的、外科手術(shù)傷口愈合相關(guān)的可重現(xiàn)的模型。該模型還可用于研究長(zhǎng)期類固醇治療或各種化療方案對(duì)結(jié)腸和小腸內(nèi)外科手術(shù)傷口愈合的質(zhì)量和速度的影響(Mastboom W.J.B.等，英國外科手術(shù)雜志(Br.J.Surg.),78:54-56(1991),Salm R.等，外科手術(shù)腫瘤學(xué)雜志(J.Surg.Oncol.),47:5-11,(1991),Weiber S.等，歐洲外科手術(shù)研究(Eur.Surg.Res.),26:173-178(1994))。吻合術(shù)的愈合與身體其它部位傷口的愈合相似。愈合早期的特征是急性炎癥，隨后是成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成。膠原逐漸成型，當(dāng)新的膠原合成時(shí)傷口變堅(jiān)固(Koruda M.J.和Rolandelli,R.H.，外科手術(shù)研究雜志(J.Surg.Res.),48:504-515(1990))。大部分術(shù)后并發(fā)癥例如吻合泄漏發(fā)生于手術(shù)后的最初幾天-該期間內(nèi)結(jié)腸的強(qiáng)度主要由傷口邊緣承受縫合線的能力來保證。據(jù)報(bào)道，在手術(shù)后的最初幾天內(nèi)胃腸道承受縫合線的能力下降了80％(Hogstrom H和Haglund U.Acta Chir Scand151:533-535(1985),Jonsson K等，美國外科手術(shù)雜志(Am.J.Surg.),145:800-803(1983))。
肌肉內(nèi)聯(lián)合注射氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)將雄性成年SD大鼠(n=5)麻醉。沿中線切開4cm長(zhǎng)打開腹腔。在距腹膜反射區(qū)3cm處從左結(jié)腸切下1cm寬的片段并保留邊緣血管。進(jìn)行單層端-端吻合術(shù)，用5-0 Vicryl反轉(zhuǎn)縫合線縫8-10針恢復(fù)腸的連續(xù)性。然后通過注射器用緩沖液或1和4μg濃度的KGF-2Δ33局部處理吻合處。然后用3-0連續(xù)絲縫合線縫合肌肉層并用外科夾子閉合皮膚使切割傷口閉合。然后每日皮下施用緩沖液或1和5mg/kg的KGF-2Δ33。在手術(shù)當(dāng)天進(jìn)行稱重，然后每天稱座一次。最后一次處理(第5天)24小時(shí)后對(duì)動(dòng)物實(shí)行安樂死。將動(dòng)物麻醉并進(jìn)行鋇灌腸，然后以固定的距離進(jìn)行X-射線透視。結(jié)腸內(nèi)給藥后由兩個(gè)盲觀察者進(jìn)行放射分析，結(jié)果表明用KGF-2Δ33處理的組1)在手術(shù)部位的鋇泄漏速率降低，2)手術(shù)部位的收縮程度降低，和3)遠(yuǎn)離手術(shù)部位的糞便量增加。
結(jié)腸吻合術(shù)放射學(xué)分析組 糞便量吻合處近端膨脹腹膜泄漏的收縮未處理組20％ 80％ 80％60％(N=5)緩沖液組40％ 60％ 80％75％(N=5)KGF-2Δ33 60％ 20％100％20％[1mg/kg](N=5)KGF-2Δ33 100％0％ 75％ 25％[5mg/kg](N=4)實(shí)施例22構(gòu)建KGF-2羧基末端突變KGF-2的羧基末端帶有大量電荷。這些帶電荷殘基的密度有可能會(huì)影響該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而影響溶解性。為了產(chǎn)生在溶液中穩(wěn)定的突變蛋白，在所述基因的所述區(qū)域產(chǎn)生一系列突變。
為了產(chǎn)生點(diǎn)突變體194R/E、194R/Q、191K/E、191K/Q,188R/E、188R/Q，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件，在PCR反應(yīng)中用KGF2Δ33為模板，用5952 KGF2Δ33 5’AflⅢ5’引物和標(biāo)明的3’引物(所述引物含有KGF-2的適宜點(diǎn)突變)。將所得產(chǎn)物用AflⅢ和HindⅢ消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的大腸桿菌表達(dá)載體pQE60中。KGF2Δ33,194R/E的構(gòu)建使用下列引物5952 KGFΔ33 5’AflⅢ:5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′KGF2 3’HindⅢ 194aa R至E:5′CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTTTCTCGTGTTTTCTGTCC 3′KGF2Δ33,194R/E的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAGAAAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAGKGF2Δ33,194R/E的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTREKNTSAHFLPMVVHSKGF2Δ33,194R/Q的構(gòu)建使用下列引物5952 KGFΔ33 5’AflⅢ:5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3 ′KGF2 3’HindⅢ194aa R至Q:5′CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCTGTCGTGTTTTCTGTCC 3′KGF2Δ33,194R/Q的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGACAGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAGKGF2Δ33,194R/Q的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRQKNTSAHFLPMVVHSKGF2Δ33,191K/E構(gòu)建使用下列引物5952 KGFΔ33 5’AflⅢ:5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′KGF2 3’HindⅢ 191aa K至E:5′CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTCCTGTCCTCTCCTTGG 3′KGF2Δ33,191K/E核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGGAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAGKGF2Δ33,191K/E氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQETRRKNTSAHFLPMVVHSKGF2Δ33,191K/Q的構(gòu)建使用下列引物5952 KGFΔ33 5’AflⅢ:5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′KGF2 3’HindⅢ 191aa K至Q:5′CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTCTGCTGTCCTCTCCTTGG 3′KGF2Δ33,191K/Q的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGCAGACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAGKGF2Δ33,191K/Q的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQQTRRKNTSAHFLPMVVHSKGF2Δ33,188R/E的構(gòu)建使用下列引物5952 KGFΔ33 5’AflⅢ:5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′KGF2 3’HindⅢ 188aa R至E:5′CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTCTGTCCTTCCCTTGGAGCTCCTTT3′KGF2Δ33,188R/E的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGGAAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAGKGF2Δ33,188R/F的氨基酸序列MYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPREGQKTRRKNTSAHFLPMVVHSKGF2Δ33,188R/Q的構(gòu)建使用下列引物5952 KGFΔ33 5’AflⅢ:5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′KGF2 3’HindⅢ 188aa R至Q:5′CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTTCTGTCCCTGCCTTGGAGCTCCTTT3′KGF2Δ33,188R/Q的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGCAGGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAGKGF2Δ33,188R/Q的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRQGQKTRRKNTSAHFLPMVVHSKGF2Δ33,183K/E的構(gòu)建為完成突變183K/E，進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)以便對(duì)該賴氨酸進(jìn)行寡核苷酸定點(diǎn)誘變。在一個(gè)反應(yīng)中，用5952 KGFΔ33 5’AflⅢ為5’引物，用KGF2 183aa K至E有義序列作為該反應(yīng)的3’引物。在第二個(gè)反應(yīng)中，用KGF2 5’183aaK至E反義序列作為該反應(yīng)的5’引物，用KGF23’HindⅢ TAA終止序列作為3’引物。用KGF2Δ33作為這些反應(yīng)的模板。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件下擴(kuò)增所述反應(yīng)。在隨后的反應(yīng)中，用來自這些PCR反應(yīng)的產(chǎn)物各1μl作為模板，5’引物為5453BsphⅠ,3’引物為5258 HindⅢ。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。將所得產(chǎn)物用AflⅢ和HindⅢ消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的大腸桿菌表達(dá)載體pQE60中。使用下列引物5952 KGFΔ33 5’AflⅢ:5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′KGF2 5’183aa K至E有義序列5′TTGAATGGAGAAGGAGCTCCA 3′KGF2 183aa K至E反義序列5′TGGAGCTCCTTCTCCATTCAA 3′KGF2 3’HindⅢ TAA終止序列5′CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGG 3′KGF2Δ33,183K/E的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAGAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAGKGF2Δ33,183K/E的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGEGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS實(shí)施例23在Balb/c小鼠中，全身照射后KGF-2對(duì)存活的影響通常將電離輻射用于治療許多惡性腫瘤，包括肺癌和乳腺癌，淋巴瘤和骨盆腫瘤(Ward,W.F.等，肺病動(dòng)物模型的CRC手冊(cè)(CRCHandbook of Animal Models of Pulmonary Disease),CRCPress,pp.165-195(1989))。但是，輻射誘導(dǎo)的損傷(肺、腸等)限制了輻射療法的強(qiáng)度和成功(Morgan,G.W.等，國際輻射腫瘤學(xué)生物物理雜志(Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.),31:361(1995))。胃腸粘膜的細(xì)胞周期比較快，并對(duì)細(xì)胞毒性試劑特別敏感(Potten,C.S.等，In:Cytotoxic Insult toTissue,Churchill Livingstone,pp.105-152(1983))。腸輻射損傷的部分表現(xiàn)包括急性直腸炎、腸纖維變性、狹窄或瘺形成(Anseline,D.F.等，外科手術(shù)紀(jì)事(Ann.Surg.),194:716-724(1981))?？杀Ｗo(hù)正常結(jié)構(gòu)免受輻射影響但不改變腫瘤的輻射敏感性的治療方法在這些疾病的治療中是非常有益的。不管照射面積多大，輻射劑量受正常組織的輻射敏感性所限制。全身或局部身體照射后的并發(fā)癥包括肺炎、纖維變性、胃腸損傷和骨髓疾病。
在TBI后，還證實(shí)了包括IL-1、TNF、IL-6、IL-12等的多種細(xì)胞因子有輻射保護(hù)作用(Neta,R.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.),173:1177(1991))。已經(jīng)表明在輻射和化療聯(lián)用后(Du,X.X.等，血液，83:33(1994))以及輻射誘導(dǎo)的胸?fù)p傷后(Redlich,C.A.等，免疫學(xué)雜志，157:1705-1710(1996)),IL-11可保護(hù)小腸粘膜細(xì)胞。動(dòng)物所有試驗(yàn)均用BALB/c小鼠完成。購買6周齡的動(dòng)物，在研究開始時(shí)，動(dòng)物為7周齡。所有操作均用無菌技術(shù)完成。按照人類基因組科學(xué)公司社會(huì)事業(yè)性動(dòng)物飼養(yǎng)和使用委員會(huì)的規(guī)則和指南以及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用指南完成該項(xiàng)研究，該委員會(huì)審查過并贊成這一實(shí)驗(yàn)方案。KGF-2該蛋白質(zhì)是具有141個(gè)氨基酸的人蛋白質(zhì)，稱為KGF-2A33。KGF-2A33為KGF-2的截短同工型，不含成熟蛋白質(zhì)的前33個(gè)氨基末端殘基。已經(jīng)將編碼所述蛋白質(zhì)的基因克隆至一個(gè)大腸桿菌表達(dá)載體中。將含純度大于95％的重組物質(zhì)的級(jí)分用于所述試驗(yàn)。用含40mM乙酸鈉+150mM氯化鈉，pH6.5的載體配制KGF-2。用相同的載體從儲(chǔ)備液配制稀釋溶液。全身輻射和試驗(yàn)設(shè)計(jì)用68 Mark I Shepherd Cesiμm輻照器以519拉德(5.19戈瑞)照射小鼠。將KGF-2Δ33每天皮下施用，從照射前2天開始，并在照射后持續(xù)7天。每天記錄所有小鼠的體重。讓各組小鼠隨機(jī)接受下列三種治療之一全身照射(total body irradiation,TBI)加緩沖液，TBI加KGF-2Δ33(1mg/kg sq),TBI加KGF-2Δ33(5mg/kg sq)。進(jìn)行2個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。結(jié)果用照射過的動(dòng)物完成2項(xiàng)研究。在第一項(xiàng)研究中，用519拉德(5.19戈瑞)照射動(dòng)物。在照射前2天，用緩沖液或1和5mg/kg(s.q.)KGF-2Δ33處理動(dòng)物，此后每天處理，持續(xù)7天。在全身照射后第25天，緩沖液組中的動(dòng)物有1/5存活。相比之下，KGF-2處理組中，1mg/kg組有5/5動(dòng)物存活，5mg/kg組有4/5動(dòng)物存活(圖44)。
另外，在TBI后第20天，KGF-2處理的動(dòng)物體重分別增加了0.9％和5.3％。相比之下，在第20天，緩沖液處理組動(dòng)物的體重減輕了4.2％。在相同的時(shí)間內(nèi)，正常的未照射的年齡匹配的對(duì)照動(dòng)物，體重增加了6.7％(圖45)。
在第二項(xiàng)研究中的動(dòng)物也用519拉德(5.19戈瑞)照射。在照射前2天，用緩沖液或1和5mg/kg(s.q.)KGF-2Δ33處理動(dòng)物，此后每天處理，持續(xù)7天。在全身照射后第15天，緩沖液組中的動(dòng)物全部死亡。施用1mg/kg KGF-2的動(dòng)物組中有30％存活，施用5mg/kg KGF-2的動(dòng)物組中有60％存活。在TBI后第25天，施用1mg/kg KGF-2的組有20％動(dòng)物存活，施用5mg/kg KGF-2的組有50％動(dòng)物存活(圖46)。結(jié)論總之，這些結(jié)果表明在TBI后，KGF-2有保護(hù)作用。KGF-2提高經(jīng)TBI后之動(dòng)物的存活率的能力表明KGF-2在輻射誘導(dǎo)的損傷中是有用的，而且在惡性腫瘤的治療中可提高輻射的治療率。
實(shí)施例24用小鼠皮炎TPA模型評(píng)估KGF-2為了證實(shí)KGF-2可減弱接觸性皮炎的發(fā)展，使用十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)誘導(dǎo)的小鼠皮炎模型。在試驗(yàn)性皮炎中利用雌性BALB/c和雄性Swiss Webster小鼠是接觸性皮炎已被很好地表征過的、相關(guān)的且可重復(fù)的模型。在局部施用TPA后，這些小鼠品系會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)期炎性反應(yīng)，所述炎性反應(yīng)包括局部血液動(dòng)力學(xué)，血管滲透性和白細(xì)胞的局部遷移，這些病理學(xué)變化與人皮炎癥狀相似(Rao等，1993,炎癥，17(6):723；Rao等，1994,J.Kipid Mediators Cell Signalling,10:213)。
局部施用TPA(4μg/耳，耳的內(nèi)外表面各10μl)的丙酮溶液(200μg/ml)后60分鐘，給小鼠組腹膜內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)施用載體或KGF-2。對(duì)照組接受20μl丙酮作為局部給藥。施用TPA 4小時(shí)后，測(cè)量耳厚度的增加，并將耳切下進(jìn)行組織學(xué)分析。為了確定血管滲透性對(duì)TPA的反應(yīng)，在局部施用TPA后的選定時(shí)間，通過尾靜脈給小鼠靜脈內(nèi)注射埃文氏藍(lán)(Evans blue)(300mg/kg),15分鐘后，殺死小鼠。切下耳，取下來，再用二甲基甲酰胺提取并離心。用分光光度計(jì)測(cè)量590nm的吸收值。
實(shí)施例25KGF-2Δ33在傷口愈合中的作用以開始的體外數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，檢測(cè)KGF-2Δ33在皮膚中的生物學(xué)作用，所述體外數(shù)據(jù)證實(shí)了KGF-2具有刺激初級(jí)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和已用FGFR同工型2ⅲb轉(zhuǎn)染的鼠原B BaF3細(xì)胞的能力。進(jìn)行初步試驗(yàn)以確定真皮內(nèi)施用后KGF-2Δ33的生物學(xué)作用。真皮內(nèi)研究后，用各種傷口愈合模型(包括全層皮打孔器活檢傷口和切割傷口)研究KGF-2Δ33以確定其作為傷口愈合劑的潛力。KGF-2Δ33在糖皮質(zhì)激素?fù)p害的大鼠傷口愈合模型中的作用傷口愈合受損是與各種疾病如糖尿病有關(guān)的一個(gè)重要臨床問題，它是全身性施用類固醇或抗代謝產(chǎn)物導(dǎo)致的并發(fā)癥。已知在人和組織修復(fù)的動(dòng)物模型中全身性地施用糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療會(huì)損害傷口愈合。在施用糖皮質(zhì)激素后，已經(jīng)觀察到循環(huán)中的單核細(xì)胞水平有所降低，前膠原合成受到抑制。因此，愈合的炎癥期和基質(zhì)合成是與組織修復(fù)的復(fù)雜過程有關(guān)的重要因素。在本發(fā)明研究中，用大鼠全層皮切割的皮膚傷口評(píng)估了多次局部施用KGF-2的效果，在所述大鼠中，已全身性施用甲基氫化潑尼松而損害了愈合。
在Sprague Dawley大鼠(n=5/治療組)背部產(chǎn)生8mm的傷口，并接受甲基氫化潑尼松(17mg/kg，肌肉內(nèi))以損害愈合。每天用50μl體積的緩沖液或0.1,0.5和1.5μg KGF-2局部處理傷口。用校正的Jameson測(cè)徑器在第2、4、6和8天測(cè)量傷口。在第6天(數(shù)據(jù)未列出)和第8天(圖47)，與緩沖液對(duì)照組相比，KGF-2處理組的傷口閉合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減小。在糖尿病小鼠模型中KGF-2Δ33對(duì)傷口愈合的影響用6mm活檢打孔器在6周齡體重為30-35g的遺傳性糖尿病純合雌性(db+/db+)小鼠(n=6)背部打出一全層皮傷口。將傷口敞開，每天用安慰劑或0.1,0.5和1.5μg KGF-2處理。用Jameson測(cè)徑器測(cè)量傷口的閉合。在第10天，對(duì)動(dòng)物實(shí)行安樂死并收集傷口進(jìn)行組織學(xué)分析。
與安慰劑處理組或未處理組相比，0.1μg KGF-2可顯著提高傷口閉合百分比(p=0.02)。與安慰劑處理組或未處理組相比，施用0.1μg KGF-2可提高組織學(xué)分?jǐn)?shù)(p=0.03)，與未處理組相比，施用0.5μg(p=0.01)和1.5μg(p=0.05)也可提高組織學(xué)分?jǐn)?shù)。結(jié)論以上述結(jié)果為基礎(chǔ)，在受到損害的條件下如施用糖皮質(zhì)激素和患有糖尿病的情況下，KGF-2有顯著的活性。因此，KGF-2在臨床上可用來刺激手術(shù)后的傷口愈合，用于刺激糖尿病患者或循環(huán)不良患者的慢性潰瘍(例如靜脈功能不全和靜脈潰瘍)、灼傷和其它異常傷口愈合疾病如尿毒癥、營養(yǎng)不良、維生素缺乏癥以及用類固醇和抗腫瘤藥物進(jìn)行全身性治療產(chǎn)生的異常傷口愈合疾病的愈合。
實(shí)施例26KGF-2Δ33對(duì)口腔粘膜的作用臨床使用的細(xì)胞毒性試劑有不合適的作用，即它們可抑制某些部位正常上皮例如口腔粘膜的增殖，從而在粘膜屏障引起威脅生命的紊亂。我們已經(jīng)進(jìn)行了研究以確定KGF-2在所述臨床區(qū)的效力。在粘膜炎模型中，數(shù)據(jù)說明KGF-2有治療作用。KGF-2Δ33對(duì)倉鼠口腔粘膜的作用我們著手確定KGF-2是否可誘導(dǎo)正常口腔粘膜上皮的增殖。用雄性Golden Syrian倉鼠評(píng)估KGF-2在口腔粘膜中的作用。每天用緩沖液或KGF-2Δ33(0.1,1和10μg/頰)，以100μl/頰的體積局部施用于被麻醉的倉鼠的頰部從而處理倉鼠的頰囊。將所述化合物與頰接觸最少60秒然后咽下。處理7天后，按上述方法給動(dòng)物注射BrdU并殺死。用抗BrdU抗體標(biāo)記增殖中的細(xì)胞。圖48表明，當(dāng)用1μg和10μg KGF-2Δ33處理動(dòng)物時(shí)，BrdU標(biāo)記有顯著增加(細(xì)胞增殖)(與緩沖液處理相比)。
用KGF-2局部處理誘導(dǎo)了正常粘膜上皮細(xì)胞的增殖作用?；谶@些結(jié)果，可將KGF-2臨床上用于避免因任何化療劑(或其它毒性藥物方案)、輻射治療或化療-輻射治療組合引起的口腔粘膜炎。另外，KGF-2可用作治療試劑，它可減輕因毒性試劑(化療)或放射療法而造成的口腔粘膜損傷的嚴(yán)重性。
實(shí)施例27KGF-2Δ33對(duì)大鼠局部缺血傷口愈合的作用本實(shí)施例所列試驗(yàn)的目的是用局部缺血傷口愈合模型，確定KGF-2在傷口愈合中的效力。
通過增加一個(gè)全層皮隨機(jī)肌皮帶狀瓣(3×4cm)而部分地阻礙局部皮膚的血液供應(yīng)。在局部皮膚上產(chǎn)生全層皮傷口，該傷口由該肌皮瓣組成。使用60只成年Sprague-Dawley大鼠，并將其隨機(jī)分成KGF-2Δ33治療組和安慰劑組以用于該研究(5只動(dòng)物/組/時(shí)間點(diǎn))。分別在創(chuàng)傷后第1、3、5、7、10和15天收集傷口。
在創(chuàng)傷后第10天和15天前，KGF-2和緩沖液處理組之間的傷口抗斷強(qiáng)度均沒有顯著差異。
結(jié)果表明，在創(chuàng)傷后10天之后，在局部缺血的傷口修復(fù)中，KGF-2可顯著提高傷口抗斷強(qiáng)度。這些結(jié)果還說明，與以前在正常傷口愈合中得到的數(shù)據(jù)相比，在這兩組中局部缺血延遲了愈合過程。
所述肌皮瓣模型提供了有關(guān)因靜脈血回流而引起的局部缺血情況的數(shù)據(jù)和資料。這些結(jié)果說明KGF-2可用于治療因靜脈血回流受損和/或靜脈功能不全而引起的慢性靜脈性腿潰瘍。
實(shí)施例28評(píng)估KGF-2在大鼠結(jié)腸吻合術(shù)中的愈合效果本發(fā)明試驗(yàn)的結(jié)果說明在Wistar或Sprague Dawley大鼠的腸或結(jié)腸吻合術(shù)模型中，KGF-2Δ33可提高腸修復(fù)的速率。另外，可用該模型說明KGF-2和其同工型具有提高胃腸或結(jié)腸壁與縫線結(jié)合的能力。
在試驗(yàn)性吻合術(shù)中使用大鼠是一個(gè)已很好地表征過的、外科手術(shù)傷口愈合中相關(guān)的并可重現(xiàn)的模型。該模型還可用于研究在結(jié)腸和小腸中，長(zhǎng)期類固醇治療或各種化療方案對(duì)手術(shù)傷口愈合質(zhì)量和愈合速率的影響(Mastboom,W.J.B.等，英國外科手術(shù)雜志，78:54-56(1991)；Salm,R.等，外科腫瘤學(xué)雜志，47:5-11(1991)；Weiber,S.等，歐洲外科手術(shù)研究，26:173-178(1994))。吻合術(shù)的愈合與身體其它部位的傷口愈合相似。愈合早期的特征是有急性炎癥，隨后成纖維細(xì)胞增殖并有膠原合成。膠原逐漸定型，傷口由于新膠原的合成而變堅(jiān)固(Koruda,M.J.和Rolandelli,R.H.，外科手術(shù)研究雜志，48:504-515(1990))。大多數(shù)術(shù)后并發(fā)癥如吻合泄漏都發(fā)生在手術(shù)后的最初幾天-在此期間結(jié)腸的強(qiáng)度主要通過傷口邊緣固定縫線的能力來保證。已經(jīng)報(bào)道在手術(shù)后的最初幾天，胃腸道固定縫線的能力降低了80％(Hogstrom,H.和Haglund,U.,ActaChir.Scand.151:533-535(1985)；Jonsson,K.等，美國外科手術(shù)雜志，145:800-803(1983))。
肌肉內(nèi)聯(lián)用氯胺酮(50mg/kg)甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉大鼠。在皮膚消毒、手術(shù)過程中和手術(shù)后整個(gè)過程中均將動(dòng)物保持于加熱的墊上。將腹腔切開一4cm長(zhǎng)的中線切口。切除距離腹膜反射區(qū)(peritonealreflection)3厘米的1厘米寬的左結(jié)腸段，同時(shí)保留邊緣血管。完成單層端-端吻合術(shù)，使用8-0聚丙烯紡織纖維反轉(zhuǎn)縫線，縫8-10針以保持腸的連續(xù)性。肌肉層用3-0連續(xù)絲線縫合切割傷口，皮膚用外科夾子閉合。每天對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行臨床評(píng)估，包括個(gè)體體重，體溫和食物消費(fèi)情況。
手術(shù)后，立即每天皮下、局部、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、胃內(nèi)或結(jié)腸內(nèi)施用KGF-2Δ33和安慰劑，并一直持續(xù)至第7天將動(dòng)物殺死時(shí)。有未處理對(duì)照、安慰劑組和KGF-2Δ33組。安樂死前2小時(shí)，經(jīng)腹膜內(nèi)注射給動(dòng)物注射100mg/kg BrdU。最后一次處理(第5天)后24小時(shí)，對(duì)動(dòng)物實(shí)行安樂死。在前腹膜壁切割一中線傷口，取出1厘米長(zhǎng)的結(jié)腸片段，包括實(shí)行吻合術(shù)的片段。取出手術(shù)位點(diǎn)的第三段片段用于總膠原分析。
在兩個(gè)試驗(yàn)中，將雄性成年SD大鼠(n=5)麻醉并用6-0聚丙烯紡織纖維反轉(zhuǎn)縫線，縫8-10針以完成遠(yuǎn)端結(jié)腸的單層端-端吻合術(shù)。在吻合位點(diǎn)用注射器局部施用緩沖液或1和4μg KGF-2Δ33。然后每天將緩沖液或濃度為1mg/kg或5mg/kg的KGF-2Δ33腹膜內(nèi)施用給動(dòng)物。在第5天對(duì)動(dòng)物實(shí)行安樂死，切下結(jié)腸并用液氮驟冷，凍干并進(jìn)行膠原分析。膠原濃度表示為μg膠原/mg組織干重。用非成對(duì)t檢驗(yàn)完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。平均值±SE。在第5天，將大鼠麻醉并進(jìn)行鋇灌腸，然后進(jìn)行放射照相分析。對(duì)這兩個(gè)試驗(yàn)的端-端左結(jié)腸吻合術(shù)的鋇灌腸放射學(xué)評(píng)估表明用1mg/kg和5mg/kg KGF-2處理的動(dòng)物，其腹膜泄漏有一致的減少。該數(shù)據(jù)列于下表。另外，用張力計(jì)檢測(cè)手術(shù)位點(diǎn)的抗斷強(qiáng)度。在KGF-2Δ33處理組和緩沖液組之間未觀察到顯著差異。如圖49所示，相對(duì)于緩沖液對(duì)照組，施用1mg/kg KGF-2Δ33(p=0.02)和5mg/kg KGF-2Δ33(p=0.004)后，在手術(shù)位點(diǎn)的膠原含量顯著增加。
表結(jié)腸吻合術(shù)放射學(xué)分析組 糞便量 吻合處的收縮*腹膜泄漏未處理組 50％2.075％(n=8)緩沖液組 57％1.050％(n=7)KGF-2Δ33[1mg/kg]50％1.337％(n=8)KGF-2Δ33[5mg/kg]77％1.611％(n=9)*吻合的收縮分?jǐn)?shù)0-沒有收縮；1-5最小至嚴(yán)重收縮肌肉內(nèi)聯(lián)用氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉成年SD大鼠(n=5)。將腹腔切開一4cm長(zhǎng)的中線切口。切除靠近腹膜反射(peritonealreflection)3cm的1厘米寬的左結(jié)腸段，同時(shí)保留邊緣血管。完成單層端-端吻合術(shù)，使用8-10間斷的6-0聚丙烯紡織纖維反轉(zhuǎn)縫線以恢復(fù)腸的連續(xù)性。然后通過注射器用緩沖液或濃度為1μg和4μg的KGF-2局部處理吻合處。肌肉層用3-0連續(xù)絲線縫合切割傷口，皮膚用外科夾子閉合。然后每天將緩沖液或濃度為1mg/kg或5mg/kg的KGF-2Δ33皮下施用給動(dòng)物。手術(shù)后當(dāng)天給動(dòng)物稱重并此后每天稱動(dòng)物的體重。在最后一次處理(第5天)后24小時(shí)，動(dòng)物實(shí)行安樂死。麻醉動(dòng)物并使動(dòng)物接受鋇灌腸，從固定的距離進(jìn)行X-射線分析。然后切下吻合處以進(jìn)行組織病理學(xué)和生物機(jī)械分析。
實(shí)施例29用炎性腸疾病模型評(píng)估KGF-2KGF-2是一種體外可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并且在體內(nèi)對(duì)各種傷口愈合模型有活性的蛋白質(zhì)。本研究的目的是確定KGF-2在鼠結(jié)腸炎模型中是否是有效的，所述結(jié)腸炎是由于無限制地與飲用水中的葡聚糖硫酸鈉接觸而誘發(fā)的。
在炎性腸疾病模型中，使用6-8周齡的雌性Swiss Webster小鼠(20-25g,Charles River,Raleigh,NC)，所述炎性腸疾病是無限制地施用4％葡聚糖硫酸鈉(DSS,36,000-44,000MW,American InternationalChemistry,Natick,MA)一周而引發(fā)的。每天非腸道地施用KGF-2(n=10)。用三種參數(shù)確定效力1)臨床分?jǐn)?shù)，以對(duì)糞的評(píng)估為基礎(chǔ)；2)組織學(xué)分?jǐn)?shù)，以對(duì)結(jié)腸的評(píng)估為基礎(chǔ)；和3)體重變化。臨床分?jǐn)?shù)由兩部分組成，總最高分為4分。將糞便的堅(jiān)松度記為0=堅(jiān)固；1=松；2腹瀉。同樣以0-2級(jí)評(píng)估糞便中的血液情況，0=無血；1=隱約有血；2=大量直腸出血。組內(nèi)平均分?jǐn)?shù)在3分以上表明可能致死，而且疾病已經(jīng)發(fā)展至不可治療的階段。在第0、4、5、6和7天記錄臨床分?jǐn)?shù)。為了得到組織學(xué)分?jǐn)?shù)，以基于炎癥分?jǐn)?shù)(0-3)和隱窩分?jǐn)?shù)(0-4)的盲方式評(píng)估上升段、橫行段和下降段結(jié)腸的玻片。每天稱量體重。將數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。用非成對(duì)的Student’s t檢驗(yàn)確定與疾病對(duì)照之間的顯著差異(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)。
當(dāng)每天給DSS處理的小鼠腹膜內(nèi)(IP)施用劑量為1,5或10mg/kg的KGF-2Δ33，施用7天后，KGF-2顯著降低了臨床分?jǐn)?shù)，即分別降低了28％,38％和50％。組織學(xué)評(píng)估與臨床分?jǐn)?shù)的劑量依賴性抑制作用非常平行，施用1,5和10mg/kg KGF-2Δ33，將組織學(xué)分?jǐn)?shù)分別顯著降低了26％、48％和51％。KGF-2還顯著降低了與DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎有關(guān)的體重減輕。
在第二項(xiàng)研究中，比較每天腹膜內(nèi)或皮下施用KGF-2Δ33的相對(duì)效力。在第7天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹膜內(nèi)注射KGF-2的動(dòng)物，其臨床分?jǐn)?shù)降低了34％，而皮下注射KGF-2的動(dòng)物，降低了46％。相比于DSS對(duì)照，皮下給藥也顯著地降低了體重減輕的程度。基于臨床分?jǐn)?shù)和體重的測(cè)量，皮下施用KGF-2至少與腹膜內(nèi)施用一樣有效。
顯然，可以用與前文描述和實(shí)施例所述不同的方式實(shí)施本發(fā)明。
在上述教導(dǎo)下，本發(fā)明的許多修飾和改變都是可行的，因此也在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以用與具體描述不同的方式實(shí)施本發(fā)明。
全部文獻(xiàn)(包括專利、專利申請(qǐng)、雜志文章、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、書或其它文獻(xiàn))的全部?jī)?nèi)容均引入本文作為參考。
權(quán)利要求
1．分離的多肽，所述多肽選自下述成員(a)角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)N-末端的缺失突變體，其中所述突變體除圖1中至少前38個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基缺失外，含有圖1所示氨基酸序列；(b)角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)C-末端的缺失突變體，其中所述突變體除圖1中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基(Ser(208))，但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基缺失外，含有圖1所示氨基酸序列，其中所述KGF-2 C-末端缺失突變體的N-末端氨基酸殘基是圖1的氨基酸殘基1(Met),36(Thr)，或37(Cys)；(c)角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)N-末端和C-末端的缺失突變體，其中所述突變體除圖1中至少前38個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基缺失，和圖1中至少最后一個(gè)C-末端氨基酸殘基(Ser(208))，但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸殘基缺失外，含有圖1所示氨基酸序列；(d)具有與(a)中所述KGF-2缺失突變體的氨基酸序列至少95％相同之氨基酸序列的多肽；(e)具有與(b)中所述KGF-2缺失突變體的氨基酸序列至少95％相同之氨基酸序列的多肽；(f)具有與(c)中所述KGF-2缺失突變體的氨基酸序列至少95％相同之氨基酸序列的多肽；(g)除了至少一個(gè)氨基酸取代外，具有與(a)中所述KGF-2缺失突變體的氨基酸序列相同之氨基酸序列的多肽；(h)除了至少一個(gè)氨基酸取代外，具有與(b)中所述KGF-2缺失突變體的氨基酸序列相同之氨基酸序列的多肽；(i)除了至少一個(gè)氨基酸取代外，具有與(c)中所述KGF-2缺失突變體的氨基酸序列相同之氨基酸序列的多肽；其中所述分離的多肽刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。
2．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(a)。
3．權(quán)利要求2的分離的多肽，其中所述突變體具有至少前46個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失。
4．權(quán)利要求3的分離的多肽，其中所述突變體具有至少前62個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失。
5．權(quán)利要求4的分離的多肽，其中所述突變體具有至少前68個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失。
6．權(quán)利要求5的分離的多肽，其中所述突變體具有至少前76個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失。
7．權(quán)利要求6的分離的多肽，其中所述突變體具有至少前92個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失。
8．權(quán)利要求7的分離的多肽，其中所述突變體具有至少前103個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失。
9．權(quán)利要求8的分離的多肽，其中所述突變體具有至少前122個(gè)N-末端氨基酸殘基，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失。
10．權(quán)利要求9的分離的多肽，其中所述突變體具有前137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失。
11．權(quán)利要求2的分離的多肽，其中所述突變體具有選自下列的圖1所示氨基酸序列Ala(39)-Ser(208)；Pro(47)-Ser(208)；Ala(63)-Ser(208)；Ser(69)-Ser(208)；Val(77)-Ser(208)；Glu(93)-Ser(208)；Glu(104)-Ser(208)；Val(123)-Ser(208)；Gly(138)-Ser(208)。
12．權(quán)利要求2的分離的多肽，其中所述突變體與野生型KGF-2相比具有增強(qiáng)的刺激角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。
13．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(d)。
14．權(quán)利要求13的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(a)中所述KGF-2 N-末端缺失突變體的氨基酸序列至少97％相同。
15．權(quán)利要求14的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(a)中所述KGF-2 N-末端缺失突變體的氨基酸序列至少99％相同。
16．權(quán)利要求15的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(a)中所述KGF-2 N-末端缺失突變體的氨基酸序列相同。
17．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(g)。
18．權(quán)利要求17的分離的多肽，其中所述至少一個(gè)氨基酸取代選自下述Arg(194)Glu,Arg(194)Gln,Lys(191)Glu,Lys(191)Gln,Arg(188)Glu,Arg(188)Gln和Lys(183)Glu。
19．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(b)。
20．權(quán)利要求19的分離的多肽，其中所述突變體缺失了至少最后10,20,30,40或50個(gè)C-末端氨基酸但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸。
21．權(quán)利要求20的分離的多肽，其中所述突變體缺失了最后55個(gè)C-末端氨基酸。
22．權(quán)利要求19的分離的多肽，其中所述突變體具有選自下列的圖1所示的氨基酸序列Met(1)-Lys(153),Thr(36)-Lys(153)和Cys(37)-Lys(153)。
23．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(e)。
24．權(quán)利要求23的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(b)中所述KGF-2 C-末端缺失突變體的氨基酸序列至少97％相同。
25．權(quán)利要求24的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(b)中所述KGF-2 C-末端缺失突變體的氨基酸序列至少99％相同。
26．權(quán)利要求25的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(b)中所述KGF-2 C-末端缺失突變體的氨基酸序列相同。
27．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(h)。
28．權(quán)利要求27的分離的多肽，其中所述至少一個(gè)氨基酸取代選自下述Cys(37)Ser和Cys(106)Ser。
29．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(c)。
30．權(quán)利要求29的分離的多肽，其中所述突變體缺失了圖1中至少前46,62,68,76,92,103或122個(gè)N-末端氨基酸，但不超過前137個(gè)N-末端氨基酸，還缺失了圖1中至少最后10,20,30,40或50個(gè)C-末端氨基酸，但不超過最后55個(gè)C-末端氨基酸。
31．權(quán)利要求29的分離的多肽，其中所述突變體具有選自下列的圖1所示的氨基酸序列Ala(39)-His(200),Met(44)-Arg(193),Ala(63)-Lys(153)和Ser(69)-Lys(153)。
32．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(f)。
33．權(quán)利要求32的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(c)中所述KGF-2 N-末端和C-末端缺失突變體的氨基酸序列至少97％相同。
34．權(quán)利要求33的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(c)中所述KGF-2 N-末端和C-末端缺失突變體的氨基酸序列至少99％相同。
35．權(quán)利要求34的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(c)中所述KGF-2 N-末端和C-末端缺失突變體的氨基酸序列相同。
36．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是(i)。
37．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述突變體的所述氨基酸序列包括在N末端添加的Met。
38．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是融合蛋白的一部分。
39．權(quán)利要求38的分離的多肽，其中所述多肽是與標(biāo)記序列融合的。
40．權(quán)利要求39的分離的多肽，其中所述標(biāo)記序列選自六組氨酸標(biāo)記或血凝素標(biāo)記。
41．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽產(chǎn)生于或包含于重組的宿主細(xì)胞中。
42．權(quán)利要求41的分離的多肽，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
43．一種分離的多肽，它選自下列成員(a)角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)N-末端缺失突變體，其中所述突變體基本上由圖1氨基酸序列Ser(69)-Ser(208)組成；(b)具有與(a)所述的KGF-2 N-末端缺失突變體之氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(c)除了至少一個(gè)氨基酸取代外，具有與(a)所述的KGF-2 N-末端缺失突變體之氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽；其中所述分離的多肽刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。
44．權(quán)利要求43的分離的多肽，其中所述多肽是(a)。
45．權(quán)利要求44的分離的多肽，其中所述突變體與野生型KGF-2相比具有增強(qiáng)的刺激角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。
46．權(quán)利要求43的分離的多肽，其中所述多肽是(b)。
47．權(quán)利要求46的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(a)中所述KGF-2 N-末端缺失突變體的氨基酸序列至少97％相同。
48．權(quán)利要求47的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(a)中所述KGF-2 N-末端缺失突變體的氨基酸序列至少99％相同。
49．權(quán)利要求48的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與(a)中所述KGF-2 N-末端缺失突變體的氨基酸序列相同。
50．權(quán)利要求43的分離的多肽，其中所述多肽是(c)。
51．權(quán)利要求50的分離的多肽，其中所述至少一個(gè)氨基酸取代增加了所述突變體的穩(wěn)定性。
52．權(quán)利要求51的分離的多肽，其中所述至少一個(gè)氨基酸取代選自下述Arg(194)Glu,Arg(194)Gln,Lys(191)Glu,Lys(191)Gln,Arg(188)Glu,Arg(188)Gln和Lys(183)Glu。
53．權(quán)利要求43的分離的多肽，其中所述多肽包括在N末端添加的氨基酸Met。
54．權(quán)利要求43的分離的多肽，其中所述多肽是融合蛋白的一部分。
55．權(quán)利要求54的分離的多肽，其中所述多肽是與標(biāo)記序列融合的。
56．權(quán)利要求55的分離的多肽，其中所述標(biāo)記序列選自六組氨酸標(biāo)記或血凝素標(biāo)記。
57．權(quán)利要求43的分離的多肽，其中所述多肽產(chǎn)生于或包含于重組的宿主細(xì)胞中。
58．權(quán)利要求57的分離的多肽，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
59．含有角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)一個(gè)親水區(qū)域的分離的多肽，其中所述肽的長(zhǎng)度不超過150個(gè)氨基酸，并含有選自下列的圖1所示氨基酸序列Gly(41)-Asn(71),Lys(91)-Ser(109),Asn(135)-Tyr(164)和Asn(181)-Ala(199)。
60．權(quán)利要求59的多肽，其中所述多肽的長(zhǎng)度不超過100個(gè)氨基酸。
61．權(quán)利要求60的多肽，其中所述多肽的長(zhǎng)度不超過50個(gè)氨基酸。
62．權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽與一種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑混合。
63．權(quán)利要求43的分離的多肽，其中所述多肽與一種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑混合。
64．權(quán)利要求59的分離的多肽，其中所述多肽與一種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑混合。
65．編碼權(quán)利要求1的多肽的分離的多核苷酸。
66．編碼權(quán)利要求43的多肽的分離的多核苷酸。
67．編碼權(quán)利要求59的多肽的分離的多核苷酸。
68．權(quán)利要求65的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸已被優(yōu)化以適于在大腸桿菌中表達(dá)。
69．權(quán)利要求68的分離的多核苷酸，所述多核苷酸具有圖23的核苷酸序列。
70．權(quán)利要求68的分離的多核苷酸，所述多核苷酸具有圖24A的核苷酸序列。
71．權(quán)利要求68的分離的多核苷酸，所述多核苷酸具有圖24B的核苷酸序列。
72．權(quán)利要求66的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸已被優(yōu)化以適于在大腸桿菌中表達(dá)。
73．權(quán)利要求72的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有說明書，第125頁，第7至17行所示的核苷酸序列。
74．制備重組載體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求65,66或67的核酸分子插入載體中。
75．由權(quán)利要求74的方法產(chǎn)生的重組載體。
76．制備重組宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括將權(quán)利要求75的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
77．由權(quán)利要求76的方法產(chǎn)生的重組宿主細(xì)胞。
78．權(quán)利要求1,43或59的分離的多肽，所述多肽由包括下列步驟的方法產(chǎn)生將含有編碼所述多肽的多核苷酸的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和回收所述多肽。
79．生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括在能表達(dá)所述載體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求77的重組宿主細(xì)胞；和回收所述多肽。
80．刺激角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1或43的多肽接觸。
81．權(quán)利要求80的方法，其中將所述多肽施用于個(gè)體。
82．權(quán)利要求81的方法，其中將所述多肽施用于個(gè)體是為了下列目的防止或改善皺紋或老化皮膚的出現(xiàn)，改善皮膚強(qiáng)度，促進(jìn)表皮增厚，減少疤痕或改善美容外科手術(shù)后的愈合。
83．促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的方法，所述方法包括給個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
84．權(quán)利要求83的方法，其中所述個(gè)體的創(chuàng)傷愈合受損。
85．權(quán)利要求84的方法，其中所述創(chuàng)傷愈合的損害是由糖尿病，局部缺血障礙或受傷，類固醇，非類固醇化合物，尿毒癥，營養(yǎng)不良，維生素缺乏癥，肥胖癥，感染，免疫抑制，輻射療法或化學(xué)療法導(dǎo)致的。
86．權(quán)利要求83的方法，其中所述創(chuàng)傷選自下述外科傷口，切除術(shù)傷口，涉及真皮和表皮損傷的深層創(chuàng)傷，眼組織創(chuàng)傷，牙組織創(chuàng)傷，口腔創(chuàng)傷，糖尿病患者的潰瘍，皮膚潰瘍，肘潰瘍，動(dòng)脈潰瘍，靜脈停滯潰瘍或灼傷。
87．治療由結(jié)腸或胃腸道(GI)外科手術(shù)導(dǎo)致的創(chuàng)傷的方法，所述方法包括給有此需要的個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
88．權(quán)利要求87的方法，其中所述手術(shù)是吻合術(shù)。
89．權(quán)利要求87的方法，其中所述個(gè)體是創(chuàng)傷愈合受損的個(gè)體。
90．權(quán)利要求89的方法，其中所述損害是由糖尿病，局部缺血障礙或受傷，類固醇，非類固醇化合物，尿毒癥，營養(yǎng)不良，維生素缺乏癥，肥胖癥，感染，免疫抑制，輻射療法或化學(xué)療法導(dǎo)致的。
91．治療或預(yù)防粘膜炎的方法，所述方法包括給有此需要的個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
92．權(quán)利要求91的方法，其中所述粘膜炎選自口腔，食管，胃，腸，結(jié)腸，直腸或肛門粘膜炎。
93．治療炎性腸疾病的方法，所述方法包括給有此需要的個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
94．權(quán)利要求93的方法，其中所述疾病選自潰瘍性結(jié)腸炎或Crohn’s病。
95．減少炎癥的方法，所述方法包括給有此需要的個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
96．權(quán)利要求95的方法，其中所述炎癥與選自牛皮癬，濕疹，皮炎或關(guān)節(jié)炎的疾病或狀況相關(guān)。
97．促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的方法，所述方法包括給有此需要的個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
98．治療已暴露于輻射中的組織或保護(hù)待暴露于輻射中的組織的方法，所述方法包括給有此需要的個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
99．權(quán)利要求98的方法，其中施用所述多肽以增加用于治療所述個(gè)體內(nèi)惡性腫瘤的輻射劑量。
100．權(quán)利要求98的方法，其中施用所述多肽以治療輻射誘導(dǎo)的疾病，所述疾病選自下述口腔損傷，胃腸道損傷，粘膜炎，腸纖維變性，直腸炎，肺纖維變性，肺炎，胸膜后縮，生血綜合征，或骨髓中毒。
101．促進(jìn)泌尿道上皮愈合的方法，所述方法包括給有此需要的個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
102．促進(jìn)雌性生殖道組織生長(zhǎng)或修復(fù)的方法，所述方法包括給有此需要的個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1或43的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及多種新鑒定的多核苷酸,由這類多核苷酸編碼的多肽,這類多核苷酸和多肽的用途,以及這類多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地,本發(fā)明的多肽是角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子,下文中有時(shí)也稱之為“KGF－2”,以前也稱之為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子12(FGF－12)。本發(fā)明也涉及抑制這類多肽的作用。本發(fā)明另外還涉及KGF－2促進(jìn)或加快創(chuàng)傷愈合的治療用途。本發(fā)明也涉及KGF－2的新的突變體形式,所述突變體形式顯示出活性增強(qiáng),穩(wěn)定性增加,產(chǎn)量較高或溶解性較好。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1234071SQ97197264
公開日1999年11月3日 申請(qǐng)日期1997年8月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月13日
發(fā)明者R·杜安, S·M·魯賓, P·希門尼斯, M·A·拉姆派, D·門德里克, J·張, J·倪, P·A·穆勒, T·A·科雷曼, R·L·根特茨 申請(qǐng)人:人類基因組科學(xué)公司