專利名稱：分離的編碼癌聯(lián)抗原的核酸分子和該抗原本身及它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在此用作參考的1996年10月3日提交的順序號(hào)為08/725182的申請(qǐng)部分繼續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及與癌癥相關(guān)的抗原，和編碼其的核酸分子，以及它們的應(yīng)用。
眾所周知在許多病理?xiàng)l件下，例如感染、癌癥、自體免疫疾病等，其特征在于特定分子的不適宜表達(dá)。這些分子因此成為了特導(dǎo)病理或異常狀態(tài)的“標(biāo)記”。除去其作為診斷“指標(biāo)”，即作為診斷這些異常狀態(tài)時(shí)所鑒定的物質(zhì)的用途之外，它們還可作為反應(yīng)物來(lái)用于生產(chǎn)診斷和/或治療劑。一個(gè)非限制性的實(shí)例就是使用癌癥標(biāo)記來(lái)產(chǎn)生特異于特定標(biāo)記的抗體。還有一個(gè)非限制性的例子是使用與MHC分子復(fù)合的肽來(lái)產(chǎn)生異常細(xì)胞的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
當(dāng)然，這些物質(zhì)的制備是要有先決條件的，那就是必須有用于產(chǎn)生這些物質(zhì)的反應(yīng)物的來(lái)源。從細(xì)胞中純化是繁重的，這遠(yuǎn)非進(jìn)行這種生產(chǎn)的確定方法。另外一種優(yōu)選的方法是分離編碼特定標(biāo)記的核酸分子，然后用此分離的編碼分子來(lái)表達(dá)所需的分子。
到目前為止，已有兩種策略用來(lái)在例如人腫瘤中檢測(cè)這類抗原。這些被稱為是遺傳方法和生化方法。遺傳方法的實(shí)例見(jiàn)被在此處用作參考的dePlaen等，Proc.Natl.Sci.USA 85:2275(1988)。在此種方法中，將幾百個(gè)來(lái)自于腫瘤的cDNA文庫(kù)的質(zhì)粒庫(kù)用于轉(zhuǎn)染到受體細(xì)胞中，例如COS細(xì)胞中，或者用于測(cè)試特定抗原表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系的抗原陰性變體中。該生化方法的實(shí)例見(jiàn)被在此處用作參考的Kawakami等Nature 369:69(1994)中，其首先根據(jù)結(jié)合到腫瘤細(xì)胞的MHC的I型分子上的肽的酸性洗脫物，然后以反相高效液相色譜(HPLC)處理。在其結(jié)合到無(wú)MHC的I類分子的突變細(xì)胞系上(抗原肽在抗原加工中有缺陷)，而且誘導(dǎo)了與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的特異反應(yīng)而鑒定抗原肽。這些反應(yīng)包括CTL增殖的誘導(dǎo)、TNF釋放、以及標(biāo)靶細(xì)胞的裂解，它們可在MTT測(cè)試或者51Cr釋放測(cè)試中檢測(cè)。
這兩種分子確定抗原的方法具有下述缺點(diǎn)首先，這些方法極其繁重、耗時(shí)而且費(fèi)用昂貴；其次，它們依賴于帶有預(yù)定特性的細(xì)胞毒T細(xì)胞系(CLTs)的建立。
對(duì)兩種已知的鑒定和分子定義抗原的方法所固有的問(wèn)題的最好說(shuō)明是，這兩種方法到目前為止僅僅限制在非常少的人類腫瘤的新抗原上取得了成功。參見(jiàn)，例如，Van der Bruggen等，Science 254:1643-1647(1991)；Brichard等，J.Exp.Med 178:489-495(1993)；Coulie等，J.Exp.Med 180:35-42(1994)；Kawakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515-3519(1994)。
此外，所述的方法依賴于建立所研究的癌癥類型永久細(xì)胞系的可行性。而要從某些癌癥類型建立細(xì)胞系是非常困難的，例如Oettgen等在Immunol.Allerg.Clin.North.Am.10:607-637(1990)中所表明的一樣。而且還已知一些上皮細(xì)胞類型的癌癥在體外對(duì)CTLs是非常不敏感的，這使得人們不可能進(jìn)行常規(guī)分析。這些問(wèn)題都推動(dòng)著本領(lǐng)域技術(shù)人員開(kāi)發(fā)鑒定癌聯(lián)抗原的其它方法。
一種關(guān)鍵方法是引入此文作為參考的Sahin等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:11810-11913(1995)中所述的方法。同樣，還可參考美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?8/580,980，及申請(qǐng)?zhí)?8/479,328，它們分別是1995年7月7日和1996年1月3日提交的。所有這三種參考文獻(xiàn)均引入本文作為參考。簡(jiǎn)言之，該方法涉及原核宿主中cDNA文庫(kù)的表達(dá)(該文庫(kù)來(lái)自于腫癌標(biāo)本)。然后用吸收和稀釋的血清對(duì)表達(dá)的文庫(kù)進(jìn)行了免疫篩選以能夠檢測(cè)那些誘導(dǎo)高滴度體液反應(yīng)的抗原。這種方法被稱之為SEREX方法(Serological identificationof antigens by Recombinant Expression Cloning”)。該方法已用于確證以前識(shí)別的腫癌相關(guān)抗原的表達(dá)，以及用于檢測(cè)新的抗原。參見(jiàn)上述參考專利申請(qǐng)及Sahin等，Supra，以及Crew等，EMBO J144:2333-2340(1995)。
該SEREX方法已被用于食管癌標(biāo)本，而且目前也已鑒定出了一個(gè)抗原，還分離和克隆了編碼其的核酸分子。已發(fā)現(xiàn)該抗原更廣泛地存在于癌癥中，但在非癌細(xì)胞中卻并未發(fā)現(xiàn)。此外，這尤其是本發(fā)明的目的，這將在下面的公開(kāi)中進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示NY-ESO-1抗原RNA在不同類型組織中的表達(dá)圖譜。
圖2表示NY-ESO-1 mRNA的Northern印跡分析，該mRNA發(fā)現(xiàn)于睪丸和SK-MEL-19細(xì)胞系中，但在其它細(xì)胞和組織樣品中則未見(jiàn)到。
圖3表明推論所得的NY-ESO-1氨基酸序列的可能的修飾位置。
圖4表明NY-NEO-1的親水性曲線，顯示在其氨基端的親水結(jié)構(gòu)域及在接近其羧基端的一段長(zhǎng)的疏水序列。
圖5表明用HLA-A2陽(yáng)性、NY-NEO-1陽(yáng)性、二者均陽(yáng)性或者二者均非陽(yáng)性的各種細(xì)胞進(jìn)行CTL裂解研究的結(jié)果。
圖6的數(shù)據(jù)說(shuō)明HLA-A2是呈遞SEQ ID No.1衍生肽的呈遞分子。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述實(shí)施例1可用熟知的方法從中度分化的食管的鱗狀細(xì)胞癌的速凍樣品中提取總RNA。這當(dāng)中的一種方法參見(jiàn)例如Chomzynski,J.Analyt.Biochem.162:156-159(1987)。用該RNA制備cDNA文庫(kù)，然后再將該文庫(kù)轉(zhuǎn)染到λZAP噬菌體載體中，方法依照產(chǎn)商說(shuō)明書。然后將λZAP文庫(kù)轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，產(chǎn)生了1.6×106初級(jí)分離物。
然后采用了在此引作參考的Salin等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11810-11813(1995)的SEREX方法。簡(jiǎn)言之，通過(guò)將血清與用不含食道癌細(xì)胞的cDNA克隆的噬菌體λZAP轉(zhuǎn)染的大腸桿菌的裂解物混合從自體血清中去除了大腸桿菌內(nèi)源分子的抗體。
然后將耗竭的血清進(jìn)行稀釋，并與含噬菌體斑的硝酸纖維濾膜混合。將噬菌斑在室溫下溫育過(guò)夜。隨后進(jìn)行洗滌，并將濾膜與堿性磷酸酶結(jié)合的羊抗人FCγ二級(jí)抗體進(jìn)行溫育，然后，通過(guò)與5-溴-4氯-吲哚磷酸及氮藍(lán)四唑溫育可觀察到反應(yīng)的噬菌斑?？偣舶l(fā)現(xiàn)了13個(gè)陽(yáng)性克隆。實(shí)施例2鑒定之后，通過(guò)稀釋克隆及用人血清測(cè)試，將反應(yīng)的克隆亞克隆成為單克隆。然后用產(chǎn)商建議純化這些克隆，在體外切割，并轉(zhuǎn)變成pBK-CMV質(zhì)粒形式。用EcoRⅠ-XbaⅠ限制圖來(lái)評(píng)價(jià)插入的DNA并確定各種插入片段。鑒定了8種不同的插入片段，其大小范圍為從約500到1.3kbp。以ABI PRISM自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)序。
表Ⅰ總結(jié)了結(jié)果。一個(gè)基因由4個(gè)重疊克隆所代表，第二個(gè)基因由3個(gè)重疊克隆代表，余下的6個(gè)僅由一個(gè)克隆代表。
同源性檢索表明被稱之為NY-ESO-2、3、6、7的克隆是已知的。參見(jiàn)Elisei等.J.Endocrin.Invest.16:533-540(1993)；Spritz等Nucl.AcidsRes.15:10373-10391(1987)；Rabbits等Nature Genetics 4:175-180(1993)；Crozat等，Nature 363:640-644(1993)；GenBank H18368和D25606。此前已表明其中的兩個(gè)克隆(NY-ESO-3和NY-ESO-6)在各種正常人組織中部有表達(dá)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)譜系限制的證據(jù)。NY-ESO-6(cDNA)似乎是FUS/TLS基因的3＇非翻譯部分。在此處未報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中，NY-ESO-6測(cè)序和Southern印跡分析未發(fā)現(xiàn)癌中有轉(zhuǎn)位或點(diǎn)突變的證據(jù)。其中的四個(gè)克隆，即NY-ESO-1、4、5和8并未表現(xiàn)出與所檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)中序列有強(qiáng)烈的同源性，因此對(duì)它們進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。表1以自身血清通過(guò)免疫篩選從食道癌文庫(kù)中分離的基因基因 克隆編號(hào) 大小 DNA文庫(kù)注*NY-ESO-1 E1-5b 679bp 沒(méi)有強(qiáng)烈 在睪丸和卵巢中表達(dá)E1-114b 614bp 同源性E1-153c 670bpE1-50 679bpNY-ESO-2 E1-71a605bp U1小核 以Ab篩選克隆(甲狀E1-140874bp RNP1同系物 腺炎患者)E1-31 750bpNY-ESO-3 E1-141b 517bp 結(jié)腸3＇同向MboI(dpi D25606,gbcDNA；成人腦H18638)cDNA未公開(kāi)NY-ESO-4 E1A-10c 400bp 沒(méi)有強(qiáng)的同源性 正常組織中普遍表達(dá)NY-ESO-5 E1A-54670bp 沒(méi)有強(qiáng)的同源性 在正常食管中表達(dá)NY-ESO-6 E1B-9b -1.2kb 人fus mRNA 脂肉瘤中轉(zhuǎn)位t(12；16)NY-ESO-7 E1B-20f -1.0kb 人U1-70k sn RNP 與NY-ESO-2(emblHSU17052,gbM22636)不同NY-ESO-8 E1B-20g -1.3kb 沒(méi)有強(qiáng)的同源性 在正常組織中普遍表達(dá)實(shí)施例3
開(kāi)展研究以進(jìn)行NY-ESO-1、4、5和8克隆的mRNA表達(dá)。為了達(dá)到這個(gè)目的，對(duì)每個(gè)序列設(shè)計(jì)了特定的寡核苷酸引物，以使得300-400個(gè)堿基對(duì)的cDNA節(jié)段能夠得以擴(kuò)增，從而使引物的解鏈溫度在65-70℃的范圍之內(nèi)。用市場(chǎng)上可買到的試劑和標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。測(cè)試了各種正常和腫瘤細(xì)胞?？寺Y-ESO-4和NY-ESO-8是普遍存在的，故未對(duì)其作進(jìn)一步的研究。在原發(fā)腫瘤中和正常食管組織中NY-ESO-5有高水平表達(dá)，表明它是一種分化標(biāo)記。
發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1在腫瘤mRNA和睪丸中有表達(dá)，但在正常的結(jié)腸、腎臟、肝臟或腦組織中并沒(méi)有表達(dá)。這種表達(dá)方式是與其它腫瘤排斥抗原前體是一致的。實(shí)施例4在一套完全的多的正常和腫瘤組織中對(duì)NY-ESO-1以上述建立的RT-PCR方法進(jìn)行了分析。表2、3和4表明了這些結(jié)果。簡(jiǎn)而言之，發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1在正常睪丸和卵巢細(xì)胞中是高度表達(dá)的。在正常的子宮肌層也發(fā)現(xiàn)了少量的RT-PCR產(chǎn)物，而在子宮內(nèi)膜中卻并沒(méi)有、但陽(yáng)性結(jié)果是不一致的。各種細(xì)胞類型的鱗狀上皮，包括正常食管和皮膚也是陰性的。
當(dāng)對(duì)各種無(wú)關(guān)的細(xì)胞系的腫瘤進(jìn)行測(cè)試時(shí)，11個(gè)黑素瘤細(xì)胞系中的2個(gè)有相當(dāng)強(qiáng)的表達(dá)，67個(gè)黑素瘤標(biāo)本中的16個(gè)相當(dāng)強(qiáng)的表達(dá)，33個(gè)乳腺癌標(biāo)本有6個(gè)，而4個(gè)膀胱癌樣品中有4個(gè)都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的表達(dá)。在其它類型的腫瘤中也有零星的表達(dá)。表2正常組織中NY-ESO-1的mRNA分布組織mRNA 組織 mRNA食管 - 腎上腺 -腦*- 胰腺-胎兒腦 - 精囊-心臟 - 胎盤-肺 - 胸腺-肝臟 - 淋巴結(jié) -脾 - 扁桃體 -腎 - PBL -胃 - PBL，活化的#-小腸-黑素細(xì)胞 -結(jié)腸-甲狀腺 -直腸-子宮 +/-**乳房-睪丸 +皮膚-卵巢 +*來(lái)自于一些待測(cè)部分的組織#用IL-2及PHA**在有些樣品中微弱陽(yáng)性，Northern印跡為陰性表3黑素瘤及乳腺癌細(xì)胞系中NY-ESO-1的mRNA分布細(xì)胞系 NY-ESO-l mRNAMZ2-MEL3.1-MZ2-MEL2.2-SK-MEL-13 -SK-MEL-19 +SK-MEL-23 -SK-MEL-29 -SK-MEL-30 -SK-MEL-31 -SK-MEL-33 -SK-MEL-37 +SK-MEL-179-SK-BR-3 -SK-BR-5 -734B -MDA-MR-231-表4通過(guò)RT-PCR測(cè)到的各種人腫瘤中NY-ESO-1 mRNA的表達(dá)腫瘤類型 mRNA(陽(yáng)性/總數(shù))腫瘤類型 mRNA(陽(yáng)性/總數(shù))黑素瘤 25/77 卵巢癌 2/8乳腺癌 17/43 甲狀腺癌2/5前列腺癌4/16 膀胱癌 9/13結(jié)腸癌 0/16 Burkitt淋巴癌 1/2神經(jīng)膠質(zhì)瘤 0/15 基底細(xì)胞癌 0/2胃癌0/12 Jejomyosarcoma 0/2肺癌5/17 其它肉瘤0/2腎癌0/10 胰腺癌 O/2淋巴癌*0/10 精原細(xì)胞瘤 0/1肝細(xì)胞瘤2/7 脊髓瘤 0/1*非Hodgkin、非Burkitt類型還進(jìn)行了另外一套實(shí)驗(yàn)以確證是否可以通過(guò)ELISA來(lái)確定在癌癥患者的血清中是否存在抗NY-ESO-1抗體。簡(jiǎn)言之，可用常規(guī)方法將通過(guò)下面建立的方法產(chǎn)生的重組NY-ESO-1蛋白質(zhì)包被到固體表面上。血清樣品來(lái)自于正?；颊呒盎加胁煌┌Y的患者。應(yīng)將抗NY-ESO-1抗體結(jié)合到其上。然后將它們與羊抗IgG接觸，其以堿性過(guò)氧化物酶進(jìn)行標(biāo)記，并以底物進(jìn)行顯色。結(jié)果見(jiàn)于下表Eso1+/總測(cè)試 ％癌癥患者黑素瘤 11/127 8.7卵巢癌 4/3112.9肺癌1/244.0供血者 0/70 0實(shí)施例5接著進(jìn)行Northern 印跡來(lái)研究NY-ESO-1轉(zhuǎn)錄體的大小，并確定組織表達(dá)模式。采用的是Ausubel等當(dāng)代分子生物學(xué)方法(Current Protocds InMokcular Biology)(John Wiley & Sons,1995)的方法。具體而言，將總共20微克/泳道的RNA溶于含甲醛和甲酰胺的緩沖液中，加熱到65℃，分離于1.2％瓊脂糖胺，含3％甲醛，然后轉(zhuǎn)到硝酸纖維濾膜上。用32P標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，接著進(jìn)行高度嚴(yán)緊洗滌。最后一次洗滌為0.1×SSC、0.1％SDS、60℃,15分鐘。
在前面的實(shí)驗(yàn)中對(duì)NY-ESO-1表現(xiàn)陽(yáng)性的來(lái)自于睪丸和黑素瘤細(xì)胞系(SK-MEL-19)的RNA表現(xiàn)出有0.8-0.9kb的RNA轉(zhuǎn)錄物。而食管癌樣品則表現(xiàn)出0.4-0.9kb范圍內(nèi)的不清晰的成片電泳條帶，說(shuō)明有部分降解。來(lái)自于所測(cè)試的其它組織或細(xì)胞系的RNA沒(méi)有表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄。
為了得到編碼全部轉(zhuǎn)錄物的cDNA，對(duì)食管cDNA文庫(kù)進(jìn)行了再篩選，用噬菌斑雜交而雜交探針是原初cDNA克隆。從3×105個(gè)克隆中篩選出來(lái)6個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)3個(gè)最長(zhǎng)的克隆進(jìn)行了測(cè)序。對(duì)開(kāi)放讀碼框的分析表明這三個(gè)全部都含有全長(zhǎng)編碼區(qū)以及不同長(zhǎng)度的5＇非翻譯區(qū)。最長(zhǎng)的克隆其長(zhǎng)度為755堿基對(duì)(不包括多聚腺苷酸)，含有543堿基對(duì)的編碼區(qū)，以及5＇端的53個(gè)非翻譯堿基和3＇端的151非翻譯堿基對(duì)。參見(jiàn)SEQ ID No.1(也見(jiàn)于圖3)。
長(zhǎng)ORF表明NY-ESO-1蛋白質(zhì)的推定序列是180個(gè)氨基酸。單個(gè)的免疫陽(yáng)性克隆含有編碼其中的173個(gè)的序列。其推定分子量為17995道爾頓。
分析表明在N端部分富含甘氨酸殘基(頭80個(gè)中有30個(gè)，其余100個(gè)中有4個(gè))。親水性分析表明在分子的N端一半有親水的抗原序列，其帶有可變的親水和疏水序列，末端有長(zhǎng)的C端疏水尾部(氨基酸152-172)，其后為短的親水尾。這種形式暗示其有一穿膜結(jié)構(gòu)域。還有幾個(gè)潛在的N-豆蔻?；稽c(diǎn)、3磷酸化位點(diǎn)，而并沒(méi)有N-糖基化位點(diǎn)的證據(jù)。實(shí)施例61995年從一例惡性黑素瘤患者建立了黑素瘤細(xì)胞系“NW-MEL-38”。在本研究的整個(gè)過(guò)程中，從患者取得了血清樣品，外周血淋巴細(xì)胞以及腫瘤樣品并冷凍至進(jìn)行本文所述的研究。期望在該患者中評(píng)測(cè)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)，將該患者HLA分類為HLA-A1和HLA-A2。
為了確定從此患者得到的黑素瘤是否表達(dá)NY-ESO-1，用常規(guī)技術(shù)從腫瘤樣品和細(xì)胞系NW-MEL-38中分離到了總RNA。然后，再次通過(guò)常規(guī)手段將來(lái)自于每個(gè)樣品的兩毫克總RNA進(jìn)行cDNA合成。
然后將cDNA進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，所使用的引物為
5＇-CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G＇-3＇(SEQ ID NO:2)，和CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG-3＇(SEQ ID NO:3)這些引物應(yīng)該可以擴(kuò)增SEQ ID:1的核苷酸271到599之間的節(jié)段。
擴(kuò)增進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，所用的退火溫度為60℃。在1.5％瓊脂糖膠上以溴化乙錠染色來(lái)觀察PCR產(chǎn)物。
結(jié)果表明腫瘤和細(xì)胞系都表達(dá)了SEQ ID No:1。細(xì)胞系和腫瘤樣品用于下面的實(shí)驗(yàn)中。實(shí)施例7然后用前面討論過(guò)的分離的cDNA分子用于制備重組蛋白質(zhì)。具體而言，用常規(guī)方法通過(guò)PCR擴(kuò)增cDNA，然后克隆到市場(chǎng)上可買到的質(zhì)粒載體即pQE9中，其中含有His標(biāo)記。在此處未進(jìn)行詳細(xì)描述的研究工作中還使用了另一種載體，即pQE9K。這與pQE9是不同的，因?yàn)閜QE9K帶有卡那霉素抗性，而非氨卡氨芐青霉素抗性。
將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)到大腸桿菌菌株XL1-Blue中，通過(guò)限制圖譜和DNA測(cè)序識(shí)別陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。以異丙基β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白的產(chǎn)生，用熟知的方法在Ni2+離子色譜柱上純化該蛋白質(zhì)。在以15％SDS-PAGE和銀染分析蛋白質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)其分子量大約為22千道爾頓的蛋白質(zhì)。這與通過(guò)其序列推測(cè)的分子量大小是一致的。
然后產(chǎn)生真核轉(zhuǎn)染子。為了達(dá)到此目的，從前述的pQE9載體中分離NY-ESO-1編碼序列，然后克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1的BamHⅠ-HindⅢ位點(diǎn)上。接下來(lái)，用此載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，方法是將細(xì)胞樣品與150納克前面討論過(guò)的質(zhì)粒以及含有HLA-A2.1的cDNA或HLA-A1的cDNA的質(zhì)粒pcDNA1 Amp進(jìn)行接觸，方法用的是周知的DEAE-葡聚糖氯喹法。然后在37℃下將細(xì)胞進(jìn)行溫育48小時(shí)，然后在CTL刺激測(cè)試中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體地，該實(shí)驗(yàn)方法采用在此處用作參考的Traversari等lmmunogenetics35:145-148(1992)的方法。簡(jiǎn)而言之，將置于補(bǔ)充有100％人血清以及25V/毫升的重組IL-2的100微升RPMI中的2500CTLs(NW38-1Vs-1，參見(jiàn)后面的實(shí)施例9)加到含有COS-7轉(zhuǎn)染子(20000個(gè)細(xì)胞/孔)的微孔中。在24小時(shí)之后，從每個(gè)孔中回收50毫升的上清液，以常規(guī)方法確定TNF-α的水平，也就是用MTT測(cè)定了對(duì)WEHI164克隆13細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在下述實(shí)施例描述中，用陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行Westem印跡分析。
根據(jù)在此處用作參考的Knuth等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3511-3515(1984)的方法制備用作CTLs的CTL NW38-IVS-1。具體而言，建立混合的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物，其方法是將從受試者取得的105個(gè)自身NW38-MEL-1腫瘤細(xì)胞和106個(gè)外周血淋巴細(xì)胞混合。加入細(xì)胞因子IL-2，將混合培養(yǎng)物在37℃溫育一周。除去腫瘤細(xì)胞，將5×104個(gè)腫瘤細(xì)胞的新等分試樣與IL-2一起加入。該過(guò)程每周重復(fù)，只到用51Cr標(biāo)記的NW-MEL-38細(xì)胞測(cè)試時(shí)能見(jiàn)到強(qiáng)烈的反應(yīng)。收集效應(yīng)器T細(xì)胞，冷凍待用。實(shí)施例8進(jìn)行Westerm印跡分析，所用的血清樣品、從細(xì)胞系NW-MEL-38得來(lái)的細(xì)胞裂解物、COS-7轉(zhuǎn)染物和純化的重組蛋白在前面均有描述。血清樣品從患者治療不同點(diǎn)得來(lái)。結(jié)果無(wú)差異。
在這些實(shí)驗(yàn)中，將1微克的重組NY-ESO-1蛋白或5微升任一種細(xì)胞裂解物稀釋于SDS中并煮沸5分鐘，然后在15％SDS膠上電泳。在硝酸纖維上過(guò)液雜交之后，用3％BSA封阻，將印跡用血清溫育，稀釋到1∶1000，1∶10000和1∶100000，或用NY-ESO-1的單克隆抗體稀釋至1∶50作為陽(yáng)性對(duì)照。單克隆抗體如下制備。以2-3周的間隔用重組NY-ESO-1對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行5次皮下注射使其免疫。免疫試劑包括佐劑中的50微克重組蛋白。第一次注射使用完全Freund佐劑，其后使用不完全Freund佐劑。脾臟細(xì)胞取自免疫后的小鼠，并將其與小鼠黑素瘤細(xì)胞系SP2/0融合產(chǎn)生雜交瘤。
一旦產(chǎn)生雜交瘤就將其進(jìn)行克隆，并用重組蛋白質(zhì)對(duì)其上清進(jìn)行篩選，用微滴定板標(biāo)準(zhǔn)固相ELISA進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)根據(jù)在此處用作參考的Dippold等Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:6114-6118(1980)的方法。還用重組NY-ESO-1作為一系列的陰性對(duì)照進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。由大腸桿菌按前述方法產(chǎn)生的結(jié)合到重組蛋白質(zhì)上血清抗體，通過(guò)羊抗人IgG來(lái)顯影，IgG用1∶10000稀釋度的堿性磷酸酶進(jìn)行標(biāo)記，然后用NBT-磷酸進(jìn)行顯影。對(duì)照使用未轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞。來(lái)自于健康個(gè)體的血清也用作對(duì)照。
在血清稀釋度降到1∶100000時(shí)，發(fā)現(xiàn)與重組蛋白有強(qiáng)烈反應(yīng)性，而且與NW-MEL-38的裂解物也有反應(yīng)性。未發(fā)現(xiàn)有與未轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的反應(yīng)性，與來(lái)自于健康個(gè)體的血清也不具有反應(yīng)性。實(shí)施例9在前述的COS-7轉(zhuǎn)染子測(cè)試和本實(shí)施例的試驗(yàn)中，使用了細(xì)胞溶解T細(xì)胞系“NW38-IVS-1”。用腫瘤細(xì)胞系NW-MEL-38通過(guò)體外刺激前面提到的外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生“CTL”。方法為常規(guī)技術(shù)。
用CTL進(jìn)行的細(xì)胞毒性測(cè)試，這些細(xì)胞為NW-MEL-38(HLA-A1,A2為陽(yáng)性，NY-ESO-1陽(yáng)性)，以及兩個(gè)同種異基因細(xì)胞系(NY-ESO-1和HLA-A2陽(yáng)性)(SK-MEL-37和MZ-MEL-19)，一個(gè)MHC的Ⅰ型陰性細(xì)胞系(SK-MEL-19),HLA-A2陽(yáng)性，但NY-ESO-1陰性細(xì)胞系(NW-MEL-145)，以及對(duì)照細(xì)胞系K562和刺激胚細(xì)胞的自身植物凝集素。利用了各種效應(yīng)器/標(biāo)靶(effector/target)比率，所測(cè)定的指標(biāo)是15C標(biāo)記的靶細(xì)胞裂解。
結(jié)果表明CTL NW38-IVS-1同時(shí)裂解了自身細(xì)胞系NW-MEL-38和HLA-A2及ESO-1陽(yáng)性的同種異基因細(xì)胞系。因此，該CTL與同種異基因物質(zhì)反應(yīng)。參見(jiàn)圖6。實(shí)施例10由于患者NW38是HLA-A1和HLA-A2陽(yáng)性的，故進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來(lái)確定哪一個(gè)MHC分子是呈遞分子。
進(jìn)行前述用COS-7細(xì)胞的相同實(shí)驗(yàn)，只不過(guò)在這些實(shí)驗(yàn)中小心地確保把已用HLA-A1cDNA或HLA-A2cDNA，但不是二者同時(shí)轉(zhuǎn)化的共轉(zhuǎn)化子分開(kāi)。這些結(jié)果表明CTL NW38-IVS-1僅裂解了同時(shí)包含NY-ESO-1和HLA-A2的COS-7轉(zhuǎn)染子。參見(jiàn)圖6。該項(xiàng)工作也確證了CTL的特異性，由于實(shí)施例9中所述的NY-ESO-1陰性，HLA-A2陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)其它已知加工成被HLA-A2分子呈遞的肽是陽(yáng)性的。實(shí)施例11一旦識(shí)別出呈遞MHC分子為HLA-A2，則進(jìn)行NY-ESO-1氨基酸序列的篩選，以鑒別能滿足這一基序的所有肽，方法采用在此文中引作參考的D＇Amaro等Human Immunol 43:13-18(1995)和Drijfhout等Human Immunol.43:1-12(1995)的方法。從而合成了相應(yīng)于所有推論所得的氨基酸序列的肽，方法為常規(guī)技術(shù)，然后將其用于毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)方法根據(jù)在此處用作參考的Knuth等Proc.Natl.Acad.Sci USA81:3511-3515(1984)所述。具體而言，采用細(xì)胞系CEMX721.174.T2(此后為“T2”)，因?yàn)樗粚⒖乖庸こ蒑HC復(fù)合的肽，因此使其成為了此處所述類型的實(shí)驗(yàn)中的理想物質(zhì)。用常規(guī)方法以100微居里的Na(51Cr)O4對(duì)T2細(xì)胞的樣品進(jìn)行標(biāo)記，并洗滌三次，隨后與10微克/毫升的肽和2.5微克/毫升的β2-微球蛋白一起溫育。溫育在室溫下進(jìn)行一小時(shí)。然后將效應(yīng)器細(xì)胞(100微升的CTL NW38-IVS-1懸浮液)加入，其效應(yīng)器/靶比率為90∶1，在5％CO2,37℃的水飽和氣氛中溫育4個(gè)小時(shí)。然后，將板在200×g下離心5分鐘，移去100微升的上清并測(cè)定其放射活性。用已知的方法確定51Cr釋放百分率，發(fā)現(xiàn)肽SLLMWITQCFL(SEQ ID No:4)、SLLMWITQC(SEQ ID No:5)和QLSLLMWIT(SEQID No:6)是CTL的三個(gè)最佳刺激物。如前面所示，當(dāng)用NW-MEL-38和細(xì)胞系SK-MEL-37和MZ-MEL-19用作靶時(shí)得到類似結(jié)果。
前面的實(shí)施例描述了編碼食管癌相關(guān)抗原的核酸分子的分離。此處所用的“相關(guān)”指的是雖然明確該相關(guān)分子是由食管癌表達(dá)的，但其它癌，例如黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌也表達(dá)該抗原。
本發(fā)明涉及編碼前述的抗原，而且在嚴(yán)緊緊條件下與參考序列SEQ IDNo:1雜交的核酸分子。此處所說(shuō)的“嚴(yán)緊條件”指的是美國(guó)專利號(hào)5342774中所指的那些條件，即65℃雜交18個(gè)小時(shí)，隨后以2×SSc和0.1％SDS洗滌4次，每次1個(gè)小時(shí)，最后一次用0.2×SSc洗滌，更優(yōu)選以0.1×SSc、0.1％SDS洗滌30分鐘，以及其它能給予同樣水準(zhǔn)的嚴(yán)緊性和更高的嚴(yán)緊性的條件。
本發(fā)明的另一部分涉及以可操作的連接本發(fā)明的核酸分子摻入到啟動(dòng)子上的表達(dá)載體。構(gòu)建這樣的載體的方法在本領(lǐng)域是成熟的，跟產(chǎn)生編碼目的分子的真核細(xì)胞系或者原核細(xì)胞系株的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染一樣。以此方式使用的宿主細(xì)胞的實(shí)例是COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(例如Spodoptera frugiperda)、UH 3T3細(xì)胞等等。原核細(xì)胞，例如大腸桿菌及其它細(xì)菌也是可用的。
本發(fā)明的另一部分還包括此處所述的抗原，原始肽形式和翻譯后修飾形式均可。該分子足夠大從而在不經(jīng)過(guò)翻譯后修飾即會(huì)具有抗原性，因此它當(dāng)與佐劑(或沒(méi)有也可)結(jié)合時(shí)，可以使用前體和轉(zhuǎn)錄化修飾兩種形式用作免疫原。用該抗原產(chǎn)先的抗體是單克隆或多克隆的，同樣也是本發(fā)明的一個(gè)組成部分，制備單克隆抗體的雜交也是本發(fā)明的內(nèi)容之一。其可以全蛋白或如上述討論部分用于治療。本發(fā)明的另外部分還包括這些抗原的抗體，多克隆的和單克隆的，活性片段，例如Fab,F(ab)＇2及其它片段，以及嵌合體、人源化抗體、重組產(chǎn)生的抗體，諸如此類。
從本公開(kāi)中可明白，人們可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸分子用于診斷。此處所述的SEREX方法學(xué)的前提是病理相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)。因此，人們可以通過(guò)例如檢測(cè)受試者的體液標(biāo)本例如血清來(lái)測(cè)定與抗原本身的相關(guān)病理學(xué)反應(yīng)性。反應(yīng)性可看作是可能的病理學(xué)出現(xiàn)的指標(biāo)，因此人們也可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)核酸雜交方法來(lái)測(cè)定抗原的表達(dá)，這些核酸雜交方法沒(méi)有必要在此詳述。人們還可以用免疫測(cè)試法來(lái)測(cè)試受試分子的抗體。
對(duì)SEQ ID No:1的分析表明其上有5＇和3＇非編碼區(qū)，本發(fā)明涉及至少包含編碼節(jié)段，即核苷酸54-593的，以及可能含有SEQ ID No:1的核苷酸1-53和/或594-747任何或全部的分離的核酸分子。
如前面所述的進(jìn)一步的分析表明該分子是被加工成通過(guò)溶細(xì)胞T細(xì)胞誘發(fā)裂解的肽。實(shí)施例7表明了這種類型的基序分析是如何可以為HLA-A2分子進(jìn)行的。在各種MHC或HLA分子的基序方面已進(jìn)行大量的工作，這些在這里也是適用的。因此，本發(fā)明的另一方面是一種治療方法，其中將結(jié)合到患者腫瘤細(xì)胞表面上的HLA分子上的一種或多種肽對(duì)患者進(jìn)行給藥，其量足以使肽結(jié)合到MHC/HLA分子上，并通過(guò)T細(xì)胞誘發(fā)裂解。前面給出的HLA-A2分子的實(shí)例并非是可用的這種給藥的唯一方式?？梢允褂眠@些肽的任何組合?？梢詥为?dú)或組合起來(lái)給藥的這些肽，以及全蛋白或其免疫活性部分也可以對(duì)需要它們的患者進(jìn)行給藥，給藥方法可以是常規(guī)給藥方法中的任何一種，包括靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口、經(jīng)直腸以及透皮給藥。常規(guī)的藥物載體，佐劑，例如皂苷，GM-CSF以及白介素等等都可以使用。而且，這些肽或蛋白質(zhì)可以用所列物質(zhì)，如樹(shù)狀細(xì)胞或其它可呈遞相關(guān)MHC/肽復(fù)合物的細(xì)胞配成疫苗。
類似地，本發(fā)明設(shè)計(jì)了治療方法，其中編碼NY-ESO-1的核酸分子被摻入到了載體中，例如基于腺病毒的載體，使其可轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中，例如人細(xì)胞。類似地可將編碼一條或多條肽的核酸分子摻入到這些載體中，然后其是核酸基治療的主要成分。
這些實(shí)驗(yàn)中的任何一個(gè)試驗(yàn)也可用于進(jìn)展/退化研究中。人們可以使用前面建立的所有方法中的任一種僅通過(guò)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)水平，其表達(dá)等來(lái)監(jiān)測(cè)涉及NY-ESO-1表達(dá)的異常過(guò)程。
應(yīng)當(dāng)明確的是這些方法可以用來(lái)研究某種治療方法的有效性。一般而言，人們可以使用前述的任何方法確定一個(gè)NY-ESO-1蛋白的基準(zhǔn)值，可用某種特定的治療劑給藥，然后檢測(cè)給藥后的蛋白質(zhì)水平，觀察作為該方法的有效性的ESO-1水平的變化。
如同上面所說(shuō)的，本發(fā)明尤其還涉及對(duì)NY-ESO分子的“整套”免疫反應(yīng)的識(shí)別。其中一個(gè)方面就是其檢測(cè)癌癥治療的過(guò)程的能力。在該方法中，讓一名需要這種治療的受試者接受了此處所述的一種接種，該方法是本發(fā)明的一部分。這種接種導(dǎo)致了例如對(duì)呈遞HLA/肽復(fù)合物的細(xì)胞的T細(xì)胞反應(yīng)。該反應(yīng)還包括抗體反應(yīng)，這可能是通過(guò)T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的裂解釋放誘發(fā)抗體的蛋白質(zhì)的結(jié)果。因此，我們可以通過(guò)檢測(cè)抗體反應(yīng)來(lái)檢測(cè)疫苗的效應(yīng)。如同前面所說(shuō)的，可將抗體滴度的增加看作是疫苗的進(jìn)步的指標(biāo)，反之亦然。所以，本發(fā)明的另一方面是一種監(jiān)測(cè)疫苗有效性的方法，方法是在以其給藥后來(lái)確定受試者中對(duì)疫苗本身有特異性的或?qū)σ呙缢诘拇蠓肿犹禺愋缘目贵w的水平。
牽涉一些病理?xiàng)l件例如癌癥的NY-ESO-1蛋白質(zhì)的鑒定也提示了在前面所述的治療方法之外的一些其它的治療方法。前面所建立的實(shí)驗(yàn)表明抗體的產(chǎn)生是對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的表達(dá)的。因此本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案是通過(guò)抗體，例如人源化抗體，抗體片段等的給藥來(lái)對(duì)其特征是NY-ESO-1蛋白的異常水平的疾病的治療。它們可以用適當(dāng)?shù)募?xì)胞靜止或細(xì)胞毒性試劑進(jìn)行標(biāo)記。
也可以用T細(xì)胞進(jìn)行給藥。同樣應(yīng)注意到用免疫反應(yīng)細(xì)胞例如樹(shù)狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或任何其它免疫反應(yīng)細(xì)胞在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞，然后對(duì)所治療的受試者進(jìn)行再灌注。
應(yīng)注意到T細(xì)胞和/或抗體的產(chǎn)生可以伴隨對(duì)細(xì)胞給藥，優(yōu)選處理使其不增殖，其呈遞反應(yīng)的相關(guān)T細(xì)胞或B細(xì)胞的表位，例如前面所述的表位。
本治療方法還可包括反義治療，其中將反義分子，優(yōu)選其長(zhǎng)度為10到100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，對(duì)受試者“凈”或于載體中進(jìn)行給藥，這些載體例如脂質(zhì)體，其作用是便于摻入細(xì)胞，然后抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種反義序列也可以摻入到適當(dāng)?shù)囊呙缰?，例如病毒載體(例如痘苗)、細(xì)菌構(gòu)建體、例如已知BCG疫苗的變體等等。
本發(fā)明的再一部分是肽，它們可以是具有下面核心序列LLMWIT(SEQ ID No:7)的九聚物、十聚物或十一聚物，其在第一個(gè)L殘基末端至少有一個(gè)額外的殘基，優(yōu)選絲氨酸，而且可以多至三個(gè)，其中絲氨酸連到L上形成-SL-，而且在C端有0-4個(gè)額外的氨基酸，如前面所示，它們結(jié)合到HLA-A2分子上，從而誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。這些肽可以用于治療，其方法是將其對(duì)HLA-A2陽(yáng)性的患者進(jìn)行給藥，該患者表達(dá)出與病狀相關(guān)的NY-ESO-1；而且該肽也可用于診斷，即確定是否存在HLA-A2陽(yáng)性細(xì)胞或相關(guān)的CTLs，等等。
HLA-A2分子是Ⅰ型MHC分子，對(duì)肽和Ⅰ型分子的復(fù)合物發(fā)生應(yīng)答的細(xì)胞一般是CD8+細(xì)胞。另外一個(gè)T細(xì)胞亞群即CD4+細(xì)胞，其應(yīng)答的是Ⅱ型MHC分子和肽的復(fù)合物；對(duì)黑素瘤患者中檢測(cè)到自身培養(yǎng)樹(shù)狀細(xì)胞所呈遞的重組NY-ESO-1發(fā)生應(yīng)答的是Ⅱ型MHC限制的CD4+1細(xì)胞。具體而言，在此處未描述的結(jié)果中，可用已知的方法將CD4+細(xì)胞與其它自PBLs或血清樣品的CD4+細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)。然后，將其與已和NY-ESO-1蛋白脈沖過(guò)的樹(shù)狀細(xì)胞混合。觀察到CD4+細(xì)胞的增殖，并形成了此處所述的整套免疫反應(yīng)的另一個(gè)方面。因此，本發(fā)明的另一方面是這些CD4T細(xì)胞，結(jié)合到Ⅱ型MHC分子上的肽，以及它們?cè)谥委熤械膽?yīng)用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的其它特征和應(yīng)用了然于胸而無(wú)需在此贅述。
所用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)都僅表示是描述性的，而非是限制性的，但這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)的運(yùn)用其用意并不在于排除任何具有所述特征或其部分的等同用法，而且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明范圍之內(nèi)可以有各種變動(dòng)。(1)基本信息(ⅰ)申請(qǐng)人Yao-Tseng Chen；Scanlan,Matthew；Gure,Ali；Old,Lloyd；Knuth,Alexander；Jager,Elke；Drijfhout,Jan W.
(ⅱ)發(fā)明題目編碼食管癌相關(guān)抗原的分離的核酸分子，抗原本身以及它們的應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)7(ⅳ)通信地址(A)收信人Felfe & Lynch(B)街第三大道805(C)城市紐約市(D)州紐約(E)美國(guó)(F)ZIP:10022(Ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤、3.5英寸、144kb存儲(chǔ)(B)計(jì)算機(jī)IBM(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/752,182(B)申請(qǐng)日1996年10月3日(C)分類935(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Hanson,Norman D.
(B)登記號(hào)30,946(C)參考/案卷號(hào)LUD5466.1-PCT(ⅸ)電訊信息(A)電話(212)688-9200
(B)傳真(212)838-3884(2)SEQ IDNo:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度752堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:1ATCCTCGTGG GCCCTGACCT TCTCTCTGAG AGCCGGGCAG AGGCTCCGGA GCC 53ATG CAG GCC GAA GGC CGG GGC ACA GGG GGT TCG ACG GGC GAT GCT 98Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala5 10 15GAT GGC CCA GGA GGC CCT GGC ATT CCT GAT GGC CCA GGG GGC AAT 143Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn20 25 30GCT GGC GGC CCA GGA GAG GCG GGT GCC ACG GGC GGC AGA GGT CCC 188Ala Gly Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Aly Pro35 40 45CGG GGC GCA GGG GCA GCA AGG GCC TCG GGG CCG GGA GGA GGC GCC 233Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala50 55 60CCG CGG GGT CCG CAT GGC GGC GCG GCT TCA GGG CTG AAT GGA TGC 278Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys65 70 75TGC AGA TGC GGG GCC AGG GGG CCG GAG AGC CGC CTG CTT GAG TTC 323Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe80 80 90TAC CTC GCC ATG CCT TTC GCG ACA CCC ATG GAA GCA GAG CTG GCC 368Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala95100 105CGC AGG AGC CTG GCC CAG GAT GCC CCA CCG CTT CCC GTG CCA GGG 413Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly110 115 120GTG CTT CTG AAG GAG TTC ACT GTG TCC GGC AAC ATA CTG ACT ATC 458Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Ash Ile Leu Thr Ile125 130 135CGA CTG ACT GCT GCA GAC CAC CGC CAA CTG CAG CTC TCC ATC AGC 503Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser140 145 150TCC TGT CTC CAG CAG CTT TCC CTG TTG ATG TGG ATC ACG CAG TGC 548Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys155 160 165TTT CTG CCC GTG TTT TTG GCT CAG CCT CCC TCA GGG CAG AGG CGC 593Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg170 175 180
TAA GCCCAGCCTG GCGCCCCTTC CTAGGTCATG CCTCCTCCCC TAGGGAATGG 646TCCCAGCACG AGTGGCCAGT TCATTGTGGG GGCCTGATTG TTTGTCGCTG GAGGAGGACG706GCTTACATGT TTGTTTCTGT AGAAAATAAA ACTGAGCTAC GAAAAA 752(2)SEQ IDNo:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:2CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G 31(2)SEQIDNo:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:3CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG 32(2)SEQ IDNo:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:4Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu5 10(2)SEQ ID No:5的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:5Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys5(2)SEQ IDNo:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅰ)序列描述SEQ ID No:6Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr5(2)SEQ IDNo:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:7Leu Leu Met Trp Ile Thr權(quán)利要求
1．編碼癌相關(guān)抗原的分離的核酸分子，其在嚴(yán)緊條件下與該核酸分子雜交的互補(bǔ)序列具有SEQ ID NO:1的核苷酸54-593的核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其由SEQ ID NO:1的核苷酸54-593組成。
3．權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其由SEQ ID NO:1的核苷酸1到核苷酸747之間任何一段組成，前提是所說(shuō)的分離的核酸分子至少含有SEQID NO:1的核苷酸54-593。
4．含有權(quán)利要求1的分離的核酸分子的表達(dá)載體，其與啟動(dòng)子可操作地相連。
5．含有權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子的表達(dá)載體，其與啟動(dòng)子可操作地相連。
6．用權(quán)利要求4的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞系或原核細(xì)胞株。
7．以權(quán)利要求5的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞系或原核細(xì)胞株。
8．含有SEQ ID NO:1的核苷酸54-593所編碼的氨基酸序列的部分或全部的分離的癌相關(guān)抗原。
9．以權(quán)利要求1的分離的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞系或原核細(xì)胞株。
10．權(quán)利要求9的真核細(xì)胞系，其中所說(shuō)的細(xì)胞系也以編碼細(xì)胞因子的核酸分子轉(zhuǎn)染。
11．權(quán)利要求10的真核細(xì)胞系，其中所說(shuō)的細(xì)胞系進(jìn)一步用編碼HLA分子的核酸分子轉(zhuǎn)染。
12．權(quán)利要求10的真核細(xì)胞系，其中所說(shuō)的細(xì)胞因子是白介素。
13．權(quán)利要求12的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其中所說(shuō)的白介素是IL-2、IL-4和IL-12。
14．權(quán)利要求9的真核細(xì)胞系，其中所說(shuō)的細(xì)胞系已變成非增殖性的。
15．權(quán)利要求9的真核細(xì)胞系，其中所說(shuō)的細(xì)胞系是成纖維細(xì)胞系。
16．含有突變或減毒病毒和權(quán)利要求1的分離的核酸分子的表達(dá)載體。
17．權(quán)利要求16的表達(dá)載體，其中的病毒是腺病毒。
18．權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其進(jìn)一步含有編碼MHC或HLA的核酸分子。
19．權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其進(jìn)一步含有編碼細(xì)胞因子的核酸分子。
20．權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其中所說(shuō)的細(xì)胞因子是白介素。
21．權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其中所說(shuō)的白介素是IL-2、IL-4或IL-12。
22．權(quán)利要求16的表達(dá)載體，其中所說(shuō)的病毒是痘苗病毒。
23．用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，其包括(1)含有編碼權(quán)利要求8的分離的癌相關(guān)抗原的核酸分子的第一個(gè)載體以及(2)選自下列的第二個(gè)載體(a)含有編碼呈遞來(lái)自所說(shuō)癌相關(guān)抗原的抗原的MHC或HLA分子的核酸分子的載體和(b)含有編碼白細(xì)胞介素的核酸分子的載體。
24．分離的癌相關(guān)抗原，其含有由序列SEQ ID NO:1的核苷酸54-593所編碼的氨基酸序列。
25．含有權(quán)利要求24的分離的抗原和可藥用佐劑的免疫原性組合物。
26．權(quán)利要求25的免疫原性組合物，其中所說(shuō)的佐劑是細(xì)胞因子、皂苷或GM-CSF。
27．含有至少一種由在權(quán)利要求24中的分離的癌相關(guān)抗原中互相聯(lián)環(huán)的8到12個(gè)氨基酸形成的氨基酸序列組成的肽以及一種可藥用佐劑的免疫原性組合物。
28．權(quán)利要求27的免疫原性組合物，其中的佐劑是皂苷、細(xì)胞因子或GM-CSF。
29．權(quán)利要求27的免疫原性組合物，其中所說(shuō)的組合物包括與特定MHC分子復(fù)合在一起的多種抗原。
30．權(quán)利要求29的免疫原性組合物，其中所說(shuō)的MHC分子是HLA-A2。
31．由SEQ ID NO:1所編碼氨基酸序列所衍生的分離的肽，其中所說(shuō)的分離的肽結(jié)合到HLA分子上，該肽是九聚物、十聚物或十一聚物，而且它還含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列，從1到3個(gè)額外的N末端氨基酸，以及多至4個(gè)的C末端氨基酸。
32．權(quán)利要求31的分離的肽，其中所說(shuō)的HLA分子是HLA-A2。
33．權(quán)利要求31的分離的肽，選自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6。
34．含有至少一個(gè)編碼由SEQ ID NO:1編碼的氨基酸序列所衍生的肽的表達(dá)載體和佐劑或載體的免疫原性組合物。
35．權(quán)利要求34的免疫原性組合物，其中所說(shuō)的至少一種載體編碼多種肽。
36．用于治療受癌癥折磨的受治者的疫苗，包括權(quán)利要求11的分離的細(xì)胞系以及藥用佐劑。
37．權(quán)利要求36的疫苗，其中所說(shuō)的細(xì)胞系已變成非增殖性的。
38．權(quán)利要求37的疫苗，其中所說(shuō)的細(xì)胞系是人細(xì)胞系。
39．用于治療癌癥的組合物，包括在其表面有由SEQ ID NO:1編碼的氨基酸序列衍生的肽表達(dá)的非增殖性細(xì)胞系。
40．權(quán)利要求39的組合物，其中所說(shuō)的細(xì)胞系是人細(xì)胞系。
41．用于治療癌癥的組合物，包括(ⅰ)由SEQ ID NO:1編碼的氨基酸序列衍生的肽，(ⅱ)MHC或HLA分子，以及(ⅲ)可藥用的載體。
42．特異于權(quán)利要求24的抗原的分離的抗體。
43．權(quán)利要求42的分離的抗體，其中所說(shuō)的抗體是單克隆抗體。
44．在樣品中篩選癌癥的方法，包括將所說(shuō)的樣品與能和SEQ ID NO:1的全部或部分雜交的核酸分子相接觸，并且鑒定作為所說(shuō)樣品中癌細(xì)胞存在的指標(biāo)的雜交。
45．在樣品中篩選癌的方法，包括將所說(shuō)樣品與權(quán)利要求42的分離的抗體相接觸，并且鑒定作為癌癥的指示的所說(shuō)抗體與靶物質(zhì)的結(jié)合。
46．診斷受試者癌癥疾病的方法，包括將所說(shuō)受試者的含有免疫活性細(xì)胞的樣品與用權(quán)利要求1的分離的核酸分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系接觸，并且測(cè)定所說(shuō)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的和所說(shuō)免疫活性細(xì)胞之間的相互作用，所說(shuō)的相互作用是所說(shuō)癌癥的指標(biāo)。
47．鑒測(cè)癌癥疾病開(kāi)始退化或加劇的方法，包括監(jiān)測(cè)具所說(shuō)癌癥的患者的標(biāo)本的一些指標(biāo)，這些指標(biāo)選自(ⅰ)NY-ESO-1蛋白，(ⅱ)衍生自NY-ESO-1蛋白的肽和(ⅲ)對(duì)所說(shuō)的肽具特異性的溶細(xì)胞T細(xì)胞以及與其形成非共價(jià)復(fù)合物的MHC分子，其中所說(shuō)指標(biāo)的量是所說(shuō)癌癥疾病開(kāi)始加劇或退化的指示。
48．權(quán)利要求47的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)本是體液或溢泌物。
49．權(quán)利要求47的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)本是組織。
50．權(quán)利要求47的方法，包括將所說(shuō)標(biāo)本與和所說(shuō)蛋白或肽特異結(jié)合的抗體進(jìn)行接觸。
51．權(quán)利要求50的方法，其中所說(shuō)的抗體用放射活性標(biāo)記或酶標(biāo)記。
52．權(quán)利要求50的方法，其中所說(shuō)的抗體是單抗降抗體。
53．權(quán)利要求47的方法，包括編碼所說(shuō)蛋白的RNA的擴(kuò)增。
54．權(quán)利要求53的方法，其中所說(shuō)的擴(kuò)增包括進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
55．權(quán)利要求47的方法，包括將所說(shuō)標(biāo)本與和編碼或表達(dá)所說(shuō)蛋白的核酸分子特異性雜交的核酸分子進(jìn)行接觸。
56．權(quán)利要求47的方法，包括測(cè)試所說(shuō)標(biāo)本的脫落蛋白。
57．診斷癌癥疾病的方法，包括測(cè)試從受試者取得的標(biāo)本對(duì)衍生自NY-ESO-1的與MHC分子復(fù)合的肽特異性的免疫活性細(xì)胞，所說(shuō)免疫活性細(xì)胞的存在是所說(shuō)癌癥疾病的指示。
58．治療遭受所說(shuō)癌癥疾病折磨的受試者的方法，包括(ⅰ)從受試者取出含免疫活性細(xì)胞的標(biāo)本，(ⅱ)將含有免疫活性細(xì)胞的標(biāo)本在有利于所說(shuō)免疫活性細(xì)胞增殖的條件下與用編碼ESO-1的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系接觸，以及(ⅲ)將所說(shuō)的免疫活性細(xì)胞用足以減輕所說(shuō)癌癥的量導(dǎo)入受試者。
59．權(quán)利要求46的方法，其中所說(shuō)的含免疫活性細(xì)胞的樣品包括血液和血清。
60．治療癌癥受試者的方法，包括用足以減輕癌癥疾病的量的用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)所說(shuō)受試者給藥，這些物質(zhì)有(ⅰ)編碼NY-ESO-1的核酸序列和(ⅱ)編碼呈遞衍生自NY-ESO-1的肽的MHC或HLA分子的核酸序列，其中所說(shuō)的肽由與所說(shuō)癌癥疾病相關(guān)的細(xì)胞呈遞。
61．權(quán)利要求60的方法，進(jìn)一步包括處理細(xì)胞以使其成為非增殖性的。
62．治療由癌癥疾病折磨的受試者的方法，包括用一定量的主要由非增殖性細(xì)胞組成的試劑對(duì)所說(shuō)的受試者給藥，該非增殖性細(xì)胞在其表面有表達(dá)有MHC分子和衍生自ESO-1的肽的非共價(jià)復(fù)合物。
63．治療由癌癥疾病折磨的受試者的方法，包括以與所說(shuō)疾病相關(guān)的癌細(xì)胞上表達(dá)的ESO-1衍生的肽特異性結(jié)合的抗體對(duì)該受試者給藥，所說(shuō)的抗體偶聯(lián)到抗癌劑上，其量是足以治療所說(shuō)癌癥疾病。
64．治療由癌癥疾病折磨的受試者的方法，包括以與ESO-1特異性結(jié)合的抗體以足以治療所說(shuō)癌癥疾病的量對(duì)所說(shuō)受試者給藥，其中所說(shuō)抗體偶聯(lián)到抗癌劑上。
65．預(yù)防癌癥疾病發(fā)生的方法，包括用權(quán)利要求25的免疫原性組合物對(duì)受試者進(jìn)行給藥，其給藥量足以預(yù)防所說(shuō)癌癥疾病在受試者身上的發(fā)生。
66．預(yù)防癌癥疾病發(fā)生的方法，包括用權(quán)利要求27的免疫原性組合物對(duì)受試者進(jìn)行給藥，其給藥量足以預(yù)防所說(shuō)癌情以受試者身上的發(fā)生。
67．預(yù)防癌癥疾病發(fā)生的方法，包括用權(quán)利要求29的免疫原性組合物對(duì)受試者進(jìn)行給藥，其給藥量足以預(yù)防所說(shuō)癌情在受試者身上的發(fā)生。
68．預(yù)防癌癥疾病發(fā)生的方法，包括用權(quán)利要求34的免疫原性組合物對(duì)受試者進(jìn)行給藥，其給藥量足以預(yù)防所說(shuō)癌情在受試者身上的發(fā)生。
69．預(yù)防癌癥疾病發(fā)生的方法，包括用權(quán)利要求36的免疫原性組合物對(duì)受試者進(jìn)行給藥，其給藥量足以預(yù)防所說(shuō)癌情在受試者身上的發(fā)生。
70．預(yù)防癌癥疾病發(fā)生的方法，包括用權(quán)利要求39的免疫原性組合物對(duì)受試者進(jìn)行給藥，其給藥量足以預(yù)防所說(shuō)癌情在受試者身上的發(fā)生。
71．預(yù)防癌癥疾病發(fā)生的方法，包括用權(quán)利要求35的免疫原性組合物對(duì)受試者進(jìn)行給藥，其給藥量足以預(yù)防所說(shuō)癌情在受試者身上的發(fā)生。
72．治療癌癥病人的方法，包括以治療有效量的權(quán)利要求24的分離的癌相關(guān)抗原對(duì)所說(shuō)患者進(jìn)行給藥。
73．在用所說(shuō)疫苗對(duì)受試者給藥之后確定疫苗有效性的方法，包括測(cè)定從受試者中取得的標(biāo)本中的抗體，該抗體與所說(shuō)疫苗或包含所說(shuō)疫苗的分子結(jié)合，其中在該疫苗給藥后所說(shuō)抗體的水平相對(duì)于給藥前水平的變化是其有效或無(wú)效的指標(biāo)。
74．權(quán)利要求58的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
75．權(quán)利要求60的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
76．權(quán)利要求62的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
77．權(quán)利要求63的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
78．權(quán)利要求64的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
79．權(quán)利要求65的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
80．權(quán)利要求66的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
81．權(quán)利要求67的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
82．權(quán)利要求68的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
83．權(quán)利要求69的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
84．權(quán)利要求70的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
85．權(quán)利要求71的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
86．權(quán)利要求72的方法，其中所說(shuō)受試者至少具有一個(gè)由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者是特異于HLA分子和所說(shuō)受試者體液中的衍生自所說(shuō)受試者的肽的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼癌聯(lián)抗原的核酸分子(如圖示)的分離。本發(fā)明還有一個(gè)方面是該抗原本身及該核酸分子及其衍生的抗原和肽的用途。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1232467SQ97198538
公開(kāi)日1999年10月20日 申請(qǐng)日期1997年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月3日
發(fā)明者陳耀楨, 馬修·斯坎蘭, 艾利·古爾, 勞埃德·J·奧爾德, 艾爾克·賈格爾, 亞歷山大·克努特, 瓊·W·德里吉夫豪特 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究院