專利名稱：作為3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶抑制劑的桔皮提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制哺乳動物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，該組合物包括有效量之作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的載體，本發(fā)明還涉及用于抑制HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物，該組合物包含有效量的桔皮提取物。
背景技術(shù)：
近些年來，冠狀心血管循環(huán)疾病，例如動脈粥樣硬化和高膽固醇血癥，已逐漸成為主要的致死原因。已有報(bào)道稱，血漿膽固醇濃度增高導(dǎo)致脂肪、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞沉積在血管壁上，此等沉積則導(dǎo)致斑塊形成，并由此引發(fā)動脈粥樣硬化(Ross,R.,Nature,362,801-809(1993))。降低血漿膽固醇濃度的方法之一是飲食料法，以降低膽固醇和脂質(zhì)的攝入。另一種方法是降低在肝臟中進(jìn)行的膽固醇的生物合成速率。已有報(bào)道稱，高膽固醇血癥可通過抑制HMG-CoA還原酶并由此降低膽固醇的生物合成速率來有效地治療，所述HMG-CoA還原酶介導(dǎo)3,5-二羥基-3-甲基戊酸的合成，該化合物是甾醇或類異戊二烯之生物合成中的中間體(Cardiovascular Pharmacology,William W.Parmley and Kanu Chatterjee Ed.,Wolfe Publishing,pages8.6-8.7,1994)。
因此，已進(jìn)行了許多努力來研制可以抑制HMG-CoA還原酶的藥物；其結(jié)果是已有幾種從Penicillium sp.和Aspergillus sp.得到的化合物進(jìn)入市場銷售。具體而言，Merck Co.,USA研制的Lovastatin和Simvastatin以及Sankyo Co.,Japan研制的Pravastatin已在市場上銷售(C.D.R.Dunn,Stroke:Trends,Treatment and Markets,SCRIPT Report,PJB Publications Ltd.,1995)。但是，這些藥物非常昂貴，而且已知長期給藥會誘發(fā)肝臟中肌酸激酶增加的副作用。因此，仍有必要繼續(xù)研制價(jià)格低廉而且無毒性的HMG-CoA還原酶抑制劑。
桔皮提取物已被用作助消化的藥物。但是，尚沒有報(bào)道桔皮提取物具有HMG-CoA還原酶抑制劑的活性。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于抑制哺乳動物中HMG-CoA還原酶活性的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于抑制哺乳動物中HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，其提供一種用于抑制哺乳動物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶之活性的藥物組合物，該組合物包括有效量之作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的載體。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種用于抑制HMG-CoA還原酶活性的藥物組合物，該組合物包括作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
柑桔屬植物可為柑桔、橙、檸檬、葡萄柚和枸桔(Poncirus trifoliata)。
桔皮提取物可通過任何常規(guī)方法使用醇或水來制備。例如，5-100升醇或水加至1kg干燥桔皮中，然后使混合物在5-80℃(溶劑為醇時(shí))或20-140℃(溶劑為水時(shí))靜置10分鐘-48小時(shí)。該提取過程可重復(fù)1-3次。例如通過真空來濃縮所得的提取物，以得到濃縮桔皮提取物。另外，桔皮提取物也可如下制備用氫氧化鈣溶液處理桔皮，加入鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至4.0-4.5，然后離心所得溶液，得到作為桔皮提取物的沉淀物黃酮類似物(FDA Report No.FDA-8F-82/62,“Evaluation of health aspects of hesperidin,naringin and citrusbiolfavonoide extracts as food ingredient”,Natl.Technical InformationService PB 82-192931(1982))。
桔皮提取物在10mg/kg/天或更高的劑量時(shí)對HMG-CoA還原酶具有抑制作用，該抑制作用隨劑量而增高。
而且，盡管有強(qiáng)的效力，但桔皮提取物在鼠實(shí)驗(yàn)中幾乎沒有表現(xiàn)出毒性或促有絲分裂性。更具體而言，當(dāng)以1000mg/kg的劑量給鼠口服給藥時(shí)，桔皮提取物沒有產(chǎn)生毒性，對于50kg重的人來說，上述劑量相當(dāng)于口服給藥50-100g桔皮提取物/kg體重。另外，桔皮提取物對肝功能沒有副作用。
可使用上述組合物根據(jù)任何常規(guī)方法來制備藥物制劑。在制備制劑時(shí)，活性成分優(yōu)選與載體混合或用載體稀釋，或者包封在膠囊、小藥囊或其他容器之形式的載體中。如果載體為稀釋劑，其可為固體、半固體或液體物質(zhì)，作為活性成分的載體、賦形劑或介質(zhì)。因此，制劑可為片劑、丸劑、粉末、小藥囊劑、甘香酒劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿、氣霧劑、軟和硬明膠膠囊、無菌注射液、無菌包裝的粉末等劑型。
合適的載體、賦形劑和稀釋劑的例子是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。藥物制劑可另外包括填料、抗附聚劑、潤滑劑、潤濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。本發(fā)明的組合物可用任何本領(lǐng)域已知的方法配制成在給藥于哺乳動物后快速、持續(xù)或延遲釋放活性成分的制劑。
本發(fā)明的藥物制劑可通過各種途徑給藥，包括口服、透皮、皮下、靜脈和肌肉給藥。對于人，桔皮提取物的典型日劑量是約10-500mg/kg體重，優(yōu)選為20-100mg/kg，而且該劑量可以單劑量或多份劑量給藥。但是，實(shí)際給藥的活性成分的量應(yīng)根據(jù)各種相關(guān)因素來確定，所述因素包括待治療的疾病、所選擇的給藥途徑、每個(gè)患者的年齡、性別和體重、以及患者癥狀的嚴(yán)重程度；因此，上述劑量絕不是用于限制本發(fā)明的范圍。
另外，本發(fā)明的桔皮提取物可摻入在食品或飲料中，用于抑制HMG-CoA還原酶活性。因此，本發(fā)明還提供用于抑制HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物，該組合物包括有效量的桔皮提取物。在此情況下，食品或飲料中的桔皮提取物含量可在0.1-50％之間。
如上所述，桔皮提取物可用作有效抑制HMG-CoA還原酶活性的非毒性藥物。
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不是限制其范圍。
另外，以下固體混合物中之固體、液體中之液體、以及液體中之固體的百分比分別是以wt/wt、vol/vol和wt/vol計(jì)算，而且所有的反應(yīng)都是在室溫下進(jìn)行，除非另有說明。實(shí)施例1桔皮提取物的制備和分析在室溫下干燥桔皮，然后在6.7kg的干燥桔皮中加入80升的95％乙醇。該混合物在室溫下靜置24小時(shí)，然后過濾得到提取液和固體殘?jiān)?。該固體殘?jiān)孟嗤姆椒ㄔ俦惶崛∫淮?。合并所得的提取液，使用大容量蒸發(fā)器(EYELA旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器N-11)在減壓下濃縮，得到濃縮提取物(d=1.3g/ml)。
用DMSO/甲醇混合物(1∶1)稀釋該濃縮提取物至濃度為10mg/ml。將100μl所得溶液注入高效液相色譜(HPLC)中，該色譜使用Phenomenex Prodigy柱(5μODS(3)100，4.6×250mm)，所述色譜柱用0.01M磷酸/甲醇(70∶30)混合物預(yù)平衡。樣品用0.01M磷酸/甲醇(70∶30)混合物以0.6ml/min的流速洗脫55分鐘，其中逐漸增加甲醇的濃度至45％。使用100μl(1mg/ml)橙皮苷和柚皮苷(SigmaChemical Co.,USA)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。在280nm下檢測洗脫液，發(fā)現(xiàn)1kg的桔皮提取物包含5950mg橙皮苷和280mg柚皮苷。
進(jìn)一步根據(jù)常規(guī)方法鑒定桔皮提取物的成分。例如，用干法在105℃下測定水含量；用Kjeldahl法測定粗蛋白；用Soxhlet法測定粗脂質(zhì)；用Bertrand法測定游離糖；在550-600℃下燃燒測定粗灰份；以及用HPLC法測定橙皮苷和柚皮苷。結(jié)果見下表Ⅰ。
表Ⅰ
實(shí)施例2向動物給藥桔皮提取物隨機(jī)將體重為90-110g的20只4周齡Sprague-Dawley小鼠(Taihanlaboratory animal center,Korea)平均分成2個(gè)組。兩個(gè)組的小鼠分別用兩種不同的高膽固醇食物喂養(yǎng)，即包含1％膽固醇的AIN-76實(shí)驗(yàn)室動物飼料(ICN Biochemicals,Cleveland,OH,USA)(對照組)，以及1％膽固醇加16.7％桔皮提取物。兩個(gè)組所用飼料的成分見下表Ⅱ。
表Ⅱ
*1從TEKLAD Premier Co.(Madison,WI,USA)購得*20.1％橙皮苷等價(jià)物無限制地用具體飼料和水喂養(yǎng)小鼠共6周，每日記錄攝取量，然后每7天稱重，并分析記錄數(shù)據(jù)。所有小鼠都顯示正常的生長速度，而且兩個(gè)組之間在食物攝取量和體重增加方面沒有顯著差異。實(shí)施例3血漿中總膽固醇、HDL-膽固醇和中性脂質(zhì)含量的測定以下測定向小鼠給藥桔皮提取物對血漿膽固醇和中性脂質(zhì)含量的影響。
從上兩個(gè)組的小鼠中采取血樣，并用包含葡萄糖硫酸酯的HDL-膽固醇試劑(Sigma Chemical Co.,Cat.No.352-2)從中分離血漿HDL成分。用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.352-100(Sigma Chemical Co.,USA)測定總膽固醇和HDL-膽固醇濃度(Allain et al.,Clin.Chem.,20,470-475(1974))。用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.339-50(SigmaChemical Co.,USA)測定中性脂質(zhì)濃度(Bucolo,G.And David,H.,Clin.Chem.,19,476-482(1973))。結(jié)果見表Ⅲ，其中，與對照組小鼠相比，桔皮提取物飼養(yǎng)組中小鼠的總血漿膽固醇濃度下降35％。
表Ⅲ
TG甘油三酯實(shí)施例4桔皮提取物在HMG-CoA抑制中的活性(步驟1)制備微粒體為確定用桔皮提取物飼養(yǎng)小鼠對HMG-CoA還原酶活性的作用，從肝組織中制備微粒體作為酶源，所述還原酶是調(diào)節(jié)肝臟中膽固醇之生物合成的酶。
首先，將上述兩組小鼠斷頭處死，取出肝臟，并立即放置在冰冷卻的勻漿介質(zhì)(50mM KH2PO4(pH7.0),0.2M蔗糖，2mM二硫蘇糖醇(DTT))中。在勻漿介質(zhì)(2ml介質(zhì)/g肝臟)中用Waring混合器(三沖程的Potter-Elvehjem型玻璃勻漿器，帶有一個(gè)馬達(dá)驅(qū)動的Teflon研杵)使肝臟勻漿15秒。在15000×g下離心勻漿10分鐘，由此得到的上清液在100000×g下離心75分鐘，得到微粒體沉淀，然后將該沉淀重新懸浮在包含50mM EDTA的勻漿介質(zhì)中，然后在100000×g下離心60分鐘。用包含微粒體的上清液作為酶源。(步驟2)HMG-CoA還原酶實(shí)驗(yàn)如下根據(jù)Shapiro等人的方法(Biochemical et Biophysica Acta,370,369-377(1974))使用[14C]HMG-CoA測定HMG-CoA還原酶的活性。
在37℃下活化含微粒體之上清液(步驟1中得到的)中的酶30分鐘。在反應(yīng)試管中加入20μl的HMG-CoA還原酶實(shí)驗(yàn)緩沖液(0.25MKH2PO4(pH7.0),8.75mM EDTA,25mM DTT,0.45MKCl和0.25mg/mlBSA)、5μl的50mM NADPH、5μl的[14C]HMG-CoA(0.05μCi/試管，最終濃度120μM)和10μl之經(jīng)活化的微粒體酶(0.03-0.04mg),然后混合物在37℃下培育該混合物30分鐘。在該混合物中加入10μl的6M鹽酸，由此使反應(yīng)停止，然后在37℃下培育該混合物15分鐘，使產(chǎn)物(甲羥戊酸)完全內(nèi)酯化。在10000×g下離心1分鐘，由此除去沉淀物，然后將上清液用在硅膠60G TLC板(Altech,Inc.,Newark,USA)上，并用苯∶丙酮(1∶1,v/v)展開。用一次性載玻片刮下Rf值在0.65-0.75之間的區(qū)域，并用1450Microbeta液體閃爍計(jì)數(shù)器(Wallacoy,Finland)進(jìn)行放射活性實(shí)驗(yàn)。以pmol合成的甲羥戊酸/分鐘/mg蛋白計(jì)算酶活性。結(jié)果見表Ⅳ。
表Ⅳ
從表Ⅳ的結(jié)果可以看出，對照組小鼠具有相對較高的HMG-CoA還原酶活性，而桔皮提取物組小鼠中觀察到的HMG-CoA活性則低于對照組34％。實(shí)施例5口服給藥桔皮提取物的毒性在22±1℃的溫度、55±5％的濕度和光照周期12L/12D的條件下，飼養(yǎng)7-8周齡、無特定病原的ICR雌鼠(8只)和雄鼠(8只)，雌鼠重量在25-29g，雄鼠重量在34-38g。將飼料(Cheiljedang Co.，鼠飼料)和水消毒，然后喂給小鼠。
將桔皮提取物溶解在0.5％Tween80中，至濃度為100mg/ml，然后將該溶液口服給藥至小鼠，用量為0.2ml/20g小鼠體重。給藥所述溶液后，按以下程序觀察小鼠10天并記錄副作用或死亡現(xiàn)象給藥后1、4、8和12小時(shí)，以后則每隔12小時(shí)觀察。每天記錄小鼠體重變化，以檢查桔皮提取物的作用。另外，在第10天時(shí)，將小鼠處死，并肉眼檢查內(nèi)部器官。
在第10天時(shí)所有小鼠都存活，而且1000mg/kg劑量的桔皮提取物沒有毒性。尸檢結(jié)果是，小鼠沒有形成任何病理非正常性，而且在10天的檢查期間沒有觀察到體重減輕。因此，可得出以下結(jié)論桔皮提取物在口服給藥動物時(shí)沒有毒性。
以下制劑實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而絕不是限制本發(fā)明的范圍。制劑實(shí)施例使用以下成分制備硬明膠膠囊量(mg/膠囊)活性成分(桔皮提取物)20干燥淀粉 160硬脂酸鎂20總計(jì) 200mg雖然已參考上述具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)認(rèn)識到，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)還可進(jìn)行各種改進(jìn)和變化，而本發(fā)明的范圍為以下權(quán)利要求書所限定。
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動物中抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，其包括有效量之作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述哺乳動物是人。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述柑桔屬植物是柑桔、橙、檸檬、葡萄柚和枸桔。
4.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中，桔皮提取物的有效量為10-500mg/kg體重/天。
5.一種用于抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的食品組合物，其包括有效量的桔皮提取物。
6.一種用于抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的飲料組合物，其包括有效量的桔皮提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抑制哺乳動物中3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶活性的藥物組合物,其包括有效量之作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及用于抑制3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶活性的食品或飲料組合物,其包括有效量的桔皮提取物。
文檔編號A61P3/06GK1233182SQ97198801
公開日1999年10月27日 申請日期1997年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月14日
發(fā)明者卜成海, 孫光熙, 鄭泰淑, 權(quán)柄穆, 金永國, 崔度一, 金成郁, 裴基煥, 樸鏞福, 崔明淑, 黃仁奎, 文錫植, 權(quán)容國, 安貞娥, 李恩淑 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)研究院