專利名稱：含有曲格列酮的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有曲格列酮(troglitazone)或其可藥用鹽的優(yōu)良的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽在生物體組織內(nèi)廣泛存在，是細(xì)胞內(nèi)主要的還原劑，在氧化還原代謝方面擔(dān)負(fù)著重要的責(zé)任。特別是還原型谷胱甘肽(GSH)，其分子內(nèi)存在的巰基對于各種細(xì)胞防御及修復(fù)機(jī)能擔(dān)負(fù)著重要職責(zé)。谷胱甘肽過氧化酶是催化GSH引起的過氧化物(過氧化氫和脂過氧化物等)還原反應(yīng)的酶，是一種對抗氧化物結(jié)構(gòu)很重要的酶。另一方面，谷胱甘肽還原酶是在NADPH存在條件下將被氧化的谷胱甘肽(氧化型谷胱甘肽GSSG)還原，再生為GSH的酶。
由于含有這些化合物及酶的抗氧化物結(jié)構(gòu)，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化促進(jìn)物(例如上述的過氧化物及自由基等)的有害作用。氧化促進(jìn)物與抗氧化物結(jié)構(gòu)之間的平衡為前者處于優(yōu)勢時，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[J.Appl.Physiol.1996 Nov.,81(5),2199-2202頁]。其氧化應(yīng)激反應(yīng)與各種疾病有關(guān)，例如與冠心病，白內(nèi)障，特發(fā)性肺纖維癥，慢性腎衰竭，帕金森病、阿爾氏海默病、癲癇、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、腦缺血等包括神經(jīng)末梢及中樞神經(jīng)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及胃潰瘍之間的關(guān)聯(lián)均有報告[J.Appl.Physiol.1996 Nov.,81(5),2199-2202頁；FreeRadical Biology&Medicine,Vol.21,No.6,845-853頁(1996年)；Free Radical Biology&Medicine,Vol.20,No.7,925-931頁(1996年)；Gastoroenterology,112,855-863頁(1997年)]。
另外，在WO94/12527中，明確表示促進(jìn)內(nèi)因性GSH合成的化合物適于治療氧化性組織損傷、特別是涉及因過剩自由基損傷引起的疾病等由于谷胱甘肽缺乏而引起的各種疾病，這樣的疾病例如，由于過多飲酒、生物體異物、放射線引起的損傷、肝病引起的細(xì)胞內(nèi)氧化狀態(tài)、藥物及化學(xué)物質(zhì)中毒、重金屬中毒、腦的生理學(xué)老化(喪失記憶及學(xué)習(xí)能力等帕金森病，它是由于對氧化物質(zhì)防御機(jī)能的變化導(dǎo)致谷胱甘肽濃度減少引起腦的衰退而導(dǎo)致的)、以及急性及慢性神經(jīng)變性疾病(急性病癥如急性缺血狀態(tài)、特別是大腦發(fā)作、低血糖癥及癲癇發(fā)作；慢性病癥如肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾察默病、亨廷頓舞蹈病)、免疫機(jī)能異常、特別是癌癥的免疫治療、不育癥、特別是男性不育癥。進(jìn)一步明確表示其化合物也使用于以自由基為主要原因的缺血狀態(tài)及器官的持續(xù)再灌流。而且，在特開昭64-26516號中，表明能使谷胱甘肽濃度上升的化合物對于以白內(nèi)障、肝病、腎病為首的各種疾病的治療及預(yù)防都是有作用的。
因此增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶的活性、增加GSH供應(yīng)量的化合物與促進(jìn)上述內(nèi)因性GSH合成的化合物及能使谷胱甘肽濃度上升的化合物具有同樣的效果，也就是說可以用于上述疾病的預(yù)防或治療。
因而，如上所述，白內(nèi)障也是與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的疾病，白內(nèi)障患者晶狀體中的GSH急劇減少的事實(shí)，以及對老年人的晶狀體、X線白內(nèi)障患者的晶狀體、及核白內(nèi)障患者的晶狀體中的蛋白質(zhì)的巰基高度氧化的事實(shí)均有報導(dǎo)[V.N.Reddy,Exp.Eye Res.50,771-778(1990)]。因而可以認(rèn)為由于氧化應(yīng)激反應(yīng)為主要病因的此類白內(nèi)障，可以通過增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶的活性進(jìn)行預(yù)防或治療。
另一方面，糖尿病性白內(nèi)障是因糖尿病而引起的白內(nèi)障，也是糖尿病并發(fā)癥的一個病癥。糖尿病患者的多元醇代謝系統(tǒng)亢進(jìn)，這種現(xiàn)象被看作是糖尿病性自內(nèi)障等各種糖尿病并發(fā)癥的原因。在該多元醇代謝系統(tǒng)中，在NADPH的存在下，通過醛糖還原酶(AR)的作用將細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖被還原成山梨醇的反應(yīng)是限速反應(yīng)，因此由于多元醇代謝系統(tǒng)的亢進(jìn)，山梨醇的生成量上升[Satish K.Srivastava et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.82,7222-7226(1995)]。由于山梨醇的生物膜通透性低，蓄積在細(xì)胞內(nèi)。山梨醇在晶狀體中蓄積的時候，滲透壓增高、晶狀體膨脹[Kinoshhita et al.,Metabolism 28-4 sup-1,462-469(1979)]、產(chǎn)生浮腫、細(xì)胞變性，產(chǎn)生白內(nèi)障。因此，以通過阻礙AR抑制細(xì)胞內(nèi)山梨醇的蓄積，以能夠預(yù)防或治療白內(nèi)障的假說為基礎(chǔ)，研究開發(fā)了多種AR抑制劑。
對此，當(dāng)谷胱甘肽還原酶和AR共存的時候，由于前者優(yōu)先消耗NADPH，通過增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶的活性抑制AR的機(jī)能，其結(jié)果是抑制了多元醇的蓄積，這個事實(shí)也已報道[Yokoyama et al.,Exp.Eye Res.58,207-218(1994)]。
也就是說，能夠增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶活性的化合物也可以預(yù)防或治療糖尿病性白內(nèi)障。
已知曲格列酮作為胰島素非依賴性糖尿病藥品在市場上銷售，而且被用于其他糖尿病并發(fā)癥等各種疾病的治療或預(yù)防，但是并不知道其具有增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶活性的作用。
發(fā)明公開本發(fā)明者就曲格列酮的醫(yī)藥用途進(jìn)行認(rèn)真的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)曲格列酮具有優(yōu)良的增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶活性的作用，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及(1)含有曲格列酮或其可藥用鹽的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑。
優(yōu)選(2)(1)中記載的用于預(yù)防或治療由于缺乏還原型谷胱甘肽引起的疾病的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，更優(yōu)選(3)(1)中記載的用于預(yù)防或治療因氧化應(yīng)激反應(yīng)所引起疾病的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，進(jìn)一步更優(yōu)選(4)(1)中記載的用于預(yù)防或治療冠心病的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，(5)(1)中記載的用于預(yù)防或治療特發(fā)性肺纖維化的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，(6)(1)中記載的用于預(yù)防或治療慢性腎炎的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，(7)(1)中記載的用于預(yù)防或治療因氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，(8)(1)中記載的用于預(yù)防或治療胃潰瘍的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，及(9)用于預(yù)防或治療白內(nèi)障的(1)中記載的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，特別是(9)中記載的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑優(yōu)選用于
(10)(9)中記載的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，其中白內(nèi)障是因晶狀體中多元醇的蓄集而引起的白內(nèi)障、因晶狀體中大分子蛋白質(zhì)的蓄積而引起的白內(nèi)障或晶狀體中過氧化物的蓄積而引起的白內(nèi)障，更優(yōu)選(11)(9)中記載的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，其中自內(nèi)障是因晶狀體中大分子蛋白質(zhì)的蓄積而引起的白內(nèi)障或晶狀體中過氧化物的蓄積而引起的白內(nèi)障，進(jìn)一步更優(yōu)選(12)(9)中記載的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，其中白內(nèi)障是老年性白內(nèi)障，最優(yōu)選(13)(9)中記載的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，其中白內(nèi)障不是糖尿病性的，而是老年性白內(nèi)障。
本發(fā)明中所謂‘因還原型谷胱甘肽缺乏引起的疾病’是指由于過多飲酒、生物體異物或放射線引起的損傷；肝病引起的細(xì)胞內(nèi)氧化狀態(tài)；藥物及化學(xué)物質(zhì)中毒；重金屬中毒；腦及神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病(例如腦血虛、大腦的發(fā)作、低血糖癥、癲癇、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾察默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病)類神經(jīng)系統(tǒng)的疾??；免疫機(jī)構(gòu)的機(jī)能異常、特別是癌癥的免疫治療；不育癥、特別是男性不育癥；冠心??；白內(nèi)障；特發(fā)性肺纖維癥、慢性腎衰竭及胃潰瘍類疾病。
所謂‘氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的疾病’是指上述的‘神經(jīng)系統(tǒng)疾病’、冠心病、白內(nèi)障、特發(fā)性肺纖維癥、慢性腎炎、及胃潰瘍類疾病、所謂‘氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病’是指上述的‘神經(jīng)系統(tǒng)疾病’。
所謂‘多元醇’是指糖被醛糖還原酶(AR)還原生成的糖醇，此類糖醇例如山梨糖醇、半乳糖醇。
所謂‘因晶狀體中多元醇的蓄積而引起的白內(nèi)障’特別能舉出的例子有糖尿病性白內(nèi)障、蔗糖白內(nèi)障及半乳糖白內(nèi)障。
所謂‘大分子蛋白質(zhì)’是指分子中至少有一個巰基的多肽或蛋白質(zhì)，由于它的巰基，通過分子內(nèi)或分子間形成二硫鍵從而生成的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步的說，在‘分子中至少有一個巰基的多肽或蛋白質(zhì)’包括含有巰基的與陽離子轉(zhuǎn)移和膜透過相關(guān)的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)。
所謂‘由于大分子量蛋白質(zhì)蓄積在晶狀體中引起的白內(nèi)障’特別可以舉出的例子有老年性白內(nèi)障、X線白內(nèi)障、核性白內(nèi)障。
所謂‘過氧化物’是指超氧離子(O2-)、羥基自由基(·OH)、單線態(tài)氧(·O2)、過氧基、烷氧基等氧化自由基；以及過氧化氫(H2O2)、及過氧化脂肪等能釋放氧化自由基的化合物。
所謂‘因晶狀體中過氧化物的蓄積而引起的白內(nèi)障’特別能舉出的例子有老年性白內(nèi)障。
所謂‘不是糖尿病性的、而是老年性白內(nèi)障’是指由于年齡大而引起的白內(nèi)障，不是因?yàn)樘悄虿〉脑颉⒁簿褪钦f，沒得糖尿病的老年人發(fā)生的白內(nèi)障。
另外，上述‘因還原型谷胱甘肽缺乏引起的疾病’，是指一次發(fā)病不能完全恢復(fù)到正常狀態(tài)的疾病，所謂此類疾病的‘治療’是指阻止或延遲病癥的發(fā)展。
曲格列酮是具有下列化學(xué)式(Ⅰ)的化合物

本發(fā)明中的可藥用鹽是指曲格列酮可以成鹽析出稱其為它的鹽，此類鹽中，優(yōu)選鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等堿金屬鹽；鈣鹽等堿土金屬鹽。
曲格列酮的分子內(nèi)有2個不對稱碳原子，所以存在4種異構(gòu)體。本發(fā)明的化合物中，這些異構(gòu)體及這些異構(gòu)體的混合物都用一個化學(xué)式、即上述化學(xué)式(Ⅰ)表示。因而，本發(fā)明包含所有這些異構(gòu)體及這些異構(gòu)體的混合物。
可將本發(fā)明的曲格列酮放于空氣中，或者讓其重結(jié)晶，這時它可吸收或吸附水分，本發(fā)明也包含這些水合物。
本發(fā)明的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑含有曲格列酮或其可藥用鹽。曲格列酮可以采用特開昭60-51189號記載的方法制造。
曲格列酮或其藥理上允許鹽的給藥形式，可以舉出的例子有片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿類經(jīng)口給藥，或注射劑或栓劑等非經(jīng)口給藥的形式。這些制劑使用賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、矯味劑等添加劑，采用眾所周知的方法制造。
這里的賦形劑可舉出的例子有有機(jī)賦形劑例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等糖衍生物，玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、α-淀粉、糊精、羧甲基淀粉等淀粉衍生物；結(jié)晶纖維素等纖維等衍生物；阿拉伯膠、葡聚糖、Pullulan等，以及無機(jī)賦形劑例如輕質(zhì)硅酸酐、合成硅酸鋁、硅酸鈣、偏硅酸鋁酸鎂等硅酸鹽衍生物，磷酸氫鈣等磷酸鹽、碳酸鈣等碳酸鹽、硫酸鈣等硫酸鹽等。
潤滑劑可以舉出的例子有硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等硬脂酸金屬鹽，滑石粉，膠體二氧化硅、蜂蠟、鯨蠟等蠟類；硼酸；己二酸；硫酸鈉等硫酸鹽；乙二醇；富馬酸；苯甲酸鈉；DL-亮氨酸；十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鎂等十二烷基硫酸鹽；無水硅酸、硅酸水和物等硅酸類；以及上述淀粉衍生物。
粘合劑可以舉出的例子有羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇及與上述賦形劑相同的化合物。
崩解劑可以舉出的例子有低取代度的羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、內(nèi)部橋聯(lián)交叉羧甲基纖維素鈉等纖維素衍生物；羧甲基淀粉鈉、橋聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮等經(jīng)化學(xué)修飾的淀粉·纖維素類。
穩(wěn)定劑可以舉出的例子有對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等對羥基苯甲酸酯類；氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇等醇類；氯代新潔爾滅、苯酚、甲酚等苯酚類；硫柳撒、脫水醋酸及山梨酸。
矯味劑可以舉出的例子有通常使用的甜味劑、酸味劑、香料等。
同時，含有本發(fā)明曲格列酮的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑可以在眼部局部給藥。適于眼部局部給藥的劑型是給藥后幾乎完全殘留的固形插入劑、或溶解于淚液或用其它方法崩解的崩解性插入劑，可以舉出的例子有溶液、懸濁液、凝膠、眼用軟膏及固形插入劑等。
這些眼科用的組合物處方中，曲格列酮或其可藥用鹽的含量的下限是0.01％，優(yōu)選0.1％，上限是10％，優(yōu)選5％。
眼科用的組成物中可以含有無毒的眼科用無機(jī)或有機(jī)載體，典型的眼科用組合物的載體如水、低級鏈烷醇或芳烷醇可以與水混合的溶劑與水的混合物、植物油、聚亞烷基二醇、以石油為基質(zhì)的凍膠、乙基纖維素、油酸乙酯、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、肉豆蔻酸異丙酯及其它通常使用的可接受的載體。另外，眼科用組合物可以含有乳化劑、防腐劑、潤濕劑、賦形劑等無毒的添加劑，例如聚乙二醇200、300、400及600，碳蠟1000、1500、4000、6000及10000，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等對羥基苯甲酸酯，已知具有低溫殺菌性且使用的無毒的季銨鹽化合物(例如氯化芐甲乙氧銨、氯化芐胺)、苯酚汞鹽等抗菌劑、硫柳撒、對羥基苯甲酸甲酯及丙酯、苯甲醇、苯乙醇、食鹽、硼酸鈉、醋酸鈉等緩沖劑成分、葡萄糖酸緩沖劑及脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺、聚氧乙烯脫水山梨糖醇軟脂酸酯、二辛基鈉磺化琥珀酸酯、單硫代甘油、硫代山梨醇、乙二胺四乙酸。
進(jìn)一步的說，可以使用適當(dāng)?shù)难劭朴觅x形劑，其中包括常用的磷酸緩沖賦形劑(例如磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液)、等滲硼酸賦形劑、等滲食鹽賦形劑、等滲硼酸鈉賦形劑等。
本發(fā)明中，曲格列酮或其可藥用鹽的給藥量根據(jù)癥狀、年齡、給藥方法等有所不同，例如口服給藥的時候，成人可以對應(yīng)癥狀每日1次或分?jǐn)?shù)次給藥，下限是0.1mg(優(yōu)選1mg)、上限是1000mg(優(yōu)選500mg)。靜脈給藥的時候，成人可以對應(yīng)癥狀每日1次或分?jǐn)?shù)次給藥，下限是0.01mg(優(yōu)選0.1mg)、上限是500mg(優(yōu)選200mg)。
含有曲格列酮或其藥理上允許鹽的制劑可以用如下方法制造。
制劑例1散劑曲格列酮5g、乳糖895g及玉米淀粉100g用混合機(jī)混合，得到散劑。
制劑例2顆粒劑將曲格列酮5g、乳糖895g及低取代羥丙基纖維素100g混合后，加入10％羥丙基纖維素水溶液300g混合。將其擠出后使用造粒機(jī)造粒、干燥，從而得到顆粒劑。
制劑例3膠囊劑使用V型混合機(jī)將曲格列酮5g、乳糖115g、玉米淀粉58g及硬脂酸鎂2g混合后，于每粒3號膠囊中充填180mg，從而得到膠囊劑。
制劑例4片劑曲格列酮5g、乳糖90g、玉米淀粉34g、結(jié)晶纖維素20g及硬脂酸鎂1g用混合機(jī)混合后，使用打片機(jī)打片，從而得到片劑。
制劑例5滴眼劑曲格列Ⅰ酮 2.0g磷酸氫二鈉 0.716g磷酸二氫鈉 0.728g氯化鈉 0.400g對羥基苯甲酸甲酯0.026g對羥基苯甲酸丙酯0.014g滅菌蒸餾水 適量氫氧化鈉適量余量100ml將PH調(diào)節(jié)為7.0，采用常用方法制造滴眼劑。
以下結(jié)合實(shí)施例更詳細(xì)的說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。
實(shí)施例1還原酶活性增強(qiáng)劑(1)晶狀體器官的培養(yǎng)6至8周的SD系雄性大鼠(日本SLC)吸入二氧化碳使其窒息死亡后，摘除兩眼球。切開眼球后部的鞏膜，除去玻璃體及虹膜-睫狀體、取出品狀體。
將所得的各種晶狀體在6孔組織培養(yǎng)板(FALCON)中用后述的任一種培養(yǎng)液3ml浸潤，培養(yǎng)。5％的二氧化碳(空氣中)存在、濕度為100％、37℃的條件下，在二氧化碳?xì)怏w保溫箱中放置48小時。
陰性對照用的培養(yǎng)液使用含有青霉素(20單位/ml)及鏈霉素(20μg/ml)的培養(yǎng)基199(GIBCO)。
正對照用的培養(yǎng)液使用的是將半乳糖(D-galactose)溶于上述陰性對照培養(yǎng)液和純化水的混合液(85∶15)制成的濃度為30mM的半乳糖溶液。
試驗(yàn)用的培養(yǎng)液使用的是用10％丙酮水溶液使曲格列酮溶解或懸濁，并按照1％的比例添加到上述陽性對照用的培養(yǎng)液中所得到的物質(zhì)。該試驗(yàn)用的培養(yǎng)液使用曲格列酮的濃度分別為0.2μM、2μM及20μM的溶液。
另外，冷凍保存培養(yǎng)的晶狀體。
這里在陰性對照用培養(yǎng)液中培養(yǎng)的晶狀體相當(dāng)于正常狀態(tài)下的晶狀體，在陽性對照用培養(yǎng)液中培養(yǎng)的晶狀體相當(dāng)于受半乳糖負(fù)荷的晶狀體，在試驗(yàn)用培養(yǎng)液中培養(yǎng)的晶狀體相當(dāng)于受半乳糖負(fù)荷且投給曲格列酮的晶狀體。
(2)谷胱甘肽還原酶活性的測定使用(1)培養(yǎng)的晶狀體，配制谷胱甘肽還原酶溶液，測定其酶的樣品。
也就是說，在2ml蒸餾水中將冷凍的大白鼠的晶狀體勻漿后，進(jìn)行離心分離(10000g、20分鐘)，將得到的上清液作為酶樣品。
向含有l(wèi)mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)及100μM NADPH的磷酸緩沖液0.6ml中加入酶樣品400μl,25℃下進(jìn)行反應(yīng)6分鐘。測定未消耗的反應(yīng)液中剩余的NADPH的吸光度(340nm∶OD340nm)，以反應(yīng)前的OD340nm和反應(yīng)后的OD340nm的差(ΔOD340nm)作為NADPH的消耗量，作為谷胱甘肽還原酶活性的指標(biāo)。結(jié)果(ΔOD340nm/分/晶狀體)如表1所示。
表1

從表1可以看出，添加曲格列酮組的ΔOD340nm比陰性、陽性對照試驗(yàn)d大，消耗NADPH的多。也就是說，由于添加了曲格列酮，谷胱甘肽還原酶的活性被增強(qiáng)。
實(shí)施例2對醛糖還原酶(AR)的抑制作用采用與實(shí)施例1(1)相同的方法培養(yǎng)的晶狀體作為酶的來源，按照Hayman and Kinos hita等的方法(J.Biol.Chem.240,877-882(1965))測定AR活性。
也就是說，用與實(shí)施例1(1)相同的方法培養(yǎng)的大白鼠晶狀體用生理鹽水洗凈，在0.05mM EDTA中勻漿。對其進(jìn)行離心分離(1000g、15分鐘)，得到的上清液用作酶的標(biāo)本。將該酶溶液加入到含有0.5mMDL-甘油醛、0.4M硫酸鋰、0.05mM NADPH、67mM磷酸氫二鈉及1mMEDTA的蒸餾水溶液中，開始進(jìn)行酶反應(yīng)。室溫下，反應(yīng)進(jìn)行7分鐘后，測定未消耗的反應(yīng)液中剩余的NADPH的吸光度(340nm:OD340nm)。以反應(yīng)開始前的吸光度和反應(yīng)的吸光度的差作為NADPH的消耗量，作為AR活性的指標(biāo)。
在曲格列酮的濃度為2μM、20μM時，不顯示AR的抑制作用。
實(shí)施例3 晶狀體內(nèi)多元醇集聚的抑制作用測定在晶狀體內(nèi)半乳糖參加AR引起的還原反應(yīng)所生成多元醇即半乳糖的量。
也就是說，按照實(shí)施例(1)培養(yǎng)，在1ml 0.6mM二甲基巰基葡萄糖(內(nèi)標(biāo)物)的蒸餾水溶液中將冷凍的大白鼠的晶狀體勻漿，再向其中加入冷卻的乙醇2.4ml，放置5分鐘，將其離心分離(1000g、5分鐘)，得到的上清液25μl放入螺口小玻璃瓶中，冷凍干燥。再向其中添加70μl吡啶及20μl苯基異氰酸酯后，在55℃下，恒溫5分鐘。進(jìn)一步添加20μl甲醇，55℃下恒溫1小時。向其中加入90μl吡啶，以此為檢測溶液，注入高效液相色譜分析儀(流動相；乙腈∶乙醇∶水(=5∶2∶3)混合液、流速1ml/分)，用分光光度計測定吸光度(240nm)，計算出1個晶狀體中含半乳糖醇的量。以正對照組半乳糖醇的量為100時，添加曲格列酮組的半乳糖醇的量如表2所示。
表2

從表2中可以看出，曲格列酮根據(jù)濃度可以抑制晶狀體中半乳糖醇的蓄積。
實(shí)施例4 降低過氧化脂肪的作用測定按照實(shí)施例1(1)培養(yǎng)的大鼠晶狀體中過氧化脂肪的量。
也就是說，測定晶狀體的濕重后，在含有1mM EDTA的50mM tris鹽酸緩沖液(PH7.6)0.5ml中勻漿。進(jìn)行離心分離(2500g、30分鐘)，測定得到的上清液中含有的過氧化脂肪，測定時使用過氧化脂肪測定工具(LPO-585,BIOXY TWCHS.A.公司)，以丙二醛和羥基アルクナ-ル作為過氧化脂肪的指標(biāo)，比色定量過氧化脂肪。得到的結(jié)果(晶狀體中過氧化脂肪量nmol/g)如表3所示。
表3

從表3中可以看出，由于負(fù)荷了半乳糖，晶狀體中脂肪過氧化物濃度上升，但其上升的程度可以根據(jù)添加的曲格列酮的濃度而被抑制。
如實(shí)施例1所示，曲格列酮具有增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶活性的作用能夠增加生物體內(nèi)GSH的供應(yīng)量，因此可以用于預(yù)防或治療還原型谷胱甘肽缺乏引起的疾病。進(jìn)一步的說，如實(shí)施例4所示，曲格列酮可以降低脂過氧化物，所以能夠用于預(yù)防或治療氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的疾病(特別是晶狀體氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的白內(nèi)障)。
另外，實(shí)施例1、2及3的結(jié)果表明，即使在曲格列酮不顯示抑制AR活性的濃度(2μM)下，也能顯示增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶活性的作用及抑制多元醇的蓄積作用。也就是說，曲格列酮通過增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶活性抑制多元醇代謝系統(tǒng)，抑制了多元醇的蓄積。因此，含有曲格列酮的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑可用于預(yù)防或治療糖尿病性白內(nèi)障等由于細(xì)胞內(nèi)多元醇的蓄積而引起的疾病。
權(quán)利要求
1.谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，含有曲格列酮及其可藥用鹽的。
2.如權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，用于預(yù)防或治療由于缺乏還原型谷胱甘肽而引起的疾病。
3.如權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，用于預(yù)防或治療因氧化應(yīng)激反應(yīng)所引起的疾病。
4.如權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，用于預(yù)防或治療冠心病。
5.如權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，用于預(yù)防或治療特發(fā)性肺纖維化。
6.如權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，用于預(yù)防或治療慢性腎功能衰竭。
7.如權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，用于預(yù)防或治療因氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
8.如權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，用于預(yù)防或治療胃潰瘍。
9.如權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，用于預(yù)防或治療白內(nèi)障。
10.如權(quán)利要求9所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，其中白內(nèi)障是指由于晶狀體中多元醇蓄積而引起的白內(nèi)障、由于晶狀體中大分子量蛋白質(zhì)蓄積而引起的白內(nèi)障或晶狀體中過氧化物蓄積而引起的白內(nèi)障。
11.如權(quán)利要求9所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，其中白內(nèi)障是指由于晶狀體中大分子蛋白質(zhì)的蓄積而引起的白內(nèi)障或晶狀體中過氧化物的蓄積而引起的白內(nèi)障。
12.如權(quán)利要求9所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，其中白內(nèi)障是老年性白內(nèi)障。
13.如權(quán)利要求9所述的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑，其中白內(nèi)障不是糖尿病性的，而是老年性白內(nèi)障。
全文摘要
提供一種谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑。解決手段:含有曲格列酮或其可藥用鹽的谷胱甘肽還原酶活性增強(qiáng)劑。
文檔編號A61K31/427GK1235543SQ9719933
公開日1999年11月17日 申請日期1997年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月12日
發(fā)明者橫山富久, 藤原俊彥, 掘越大能, 吉岡慎二 申請人:三共株式會社