專(zhuān)利名稱(chēng)：用于自身免疫性疾病的診斷及治療的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明述及由HLA-B27的α1,α2功能域或人類(lèi)角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽，以及這種特定的由HLA-B27α1,α2功能域或人類(lèi)角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽在HLA-依賴(lài)性自身免疫疾病的診斷及治療中的應(yīng)用。
自身免疫性疾病，如風(fēng)濕，銀屑病，多發(fā)性硬化，潰瘍性結(jié)腸癌及自身免疫性眼色素層炎，是當(dāng)機(jī)體防御系統(tǒng)(免疫系統(tǒng))不再耐受作為機(jī)體自身一部分的結(jié)構(gòu)，而是將其作為外侵病原體來(lái)攻擊時(shí)產(chǎn)生的一種疾病。將導(dǎo)致機(jī)體自身組織損傷甚至損毀，引起疼痛及生理功能失常的癥狀例如風(fēng)濕病中出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵化；銀屑病中出現(xiàn)炎癥，皮膚剝落甚至有時(shí)出現(xiàn)大面積皮膚損傷；多發(fā)性硬化中出現(xiàn)遺傳性低角質(zhì)化，意志喪失及語(yǔ)言障礙；潰瘍性結(jié)腸癌中出現(xiàn)的嚴(yán)重腹瀉及營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，甚至致命的腸穿孔；眼色素層炎中出現(xiàn)的視力減退甚至導(dǎo)致失明。
多數(shù)自身免疫病癥為慢性進(jìn)程，有時(shí)能夠維持在某一病程期，有時(shí)則持續(xù)惡性發(fā)展。免疫系統(tǒng)損毀的組織很少能夠再生。風(fēng)濕病中，自身攻擊免疫反應(yīng)導(dǎo)致疼痛的關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)退化，最終導(dǎo)致功能喪失。銀屑病中出現(xiàn)的皮膚損傷，有時(shí)是大面積的，有強(qiáng)烈的搔癢感并且十分明顯，常引起病人心理問(wèn)題，給人際交往帶來(lái)問(wèn)題。
這些自身免疫性疾病發(fā)生的原因大多還未知。一些病例中，伴有細(xì)菌或病毒感染，因而誤導(dǎo)免疫系統(tǒng)，這也許是引起自身免疫性疾病的主要原因。在風(fēng)濕病和銀屑病的病理形成過(guò)程中，細(xì)胞免疫反應(yīng)起著重要作用，與此同時(shí)，也能檢測(cè)到抗體反應(yīng)。
傳統(tǒng)用于自身免疫性疾病治療的手段不但影響免疫系統(tǒng)自身反應(yīng)(自身攻擊)部分，同時(shí)抑制了抵抗外侵病原體或腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)細(xì)胞。傳統(tǒng)的免疫抑制劑如皮質(zhì)類(lèi)固醇，環(huán)孢霉素A及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑不但引起全身免疫抵抗力下降，腫瘤發(fā)病率增加，而且有許多非免疫的，有時(shí)危及生命的副作用。
自身免疫性疾病的遺傳素因可能與特定的主要組織相容性抗原(MHC)或稱(chēng)HLA(人類(lèi)白細(xì)胞抗原，最初是以移植抗原而發(fā)現(xiàn)的)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系。其機(jī)制應(yīng)建立在免疫系統(tǒng)將病原抗原(細(xì)菌和病毒)與自身HLA抗原混淆的基礎(chǔ)上。
HLA-B27抗原是一個(gè)特例，它經(jīng)常與特定的某些自身免疫性疾病如虹膜炎，銀屑病及風(fēng)濕病如Bechterew′s病(關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎)，銀屑病性關(guān)節(jié)炎以及男孩常發(fā)的青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎伴隨出現(xiàn)。
在自身免疫性眼色素層炎疾病中已發(fā)現(xiàn)(G.Wildner,&R.Thurau,Eur.J.Immunol.24,2579-2585(1994))HLA-Ⅰ類(lèi)抗原在病理形成過(guò)程中并不作為抗原呈遞因子，而是本身作為抗原，以肽的形式，由HLA-Ⅱ類(lèi)或其它分子呈遞。自身攻擊免疫反應(yīng)中的組織特異性也可以用與特異自身抗原交叉反應(yīng)來(lái)解釋。(例如，眼色素層炎疾病中的視黃醛S抗原)與本發(fā)明相聯(lián)系，HLA抗原在病理形成中起主要作用的自身免疫性疾病稱(chēng)之為“HLA-依賴(lài)”自身免疫性疾病。
在風(fēng)濕病綜合征(關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎及銀屑病關(guān)節(jié)炎)中的HLA-依賴(lài)疾病中，迄今為止，最可能的抗原是由HLA-Ⅰ、Ⅱ類(lèi)分子呈遞的細(xì)菌蛋白，有時(shí)傾向于HLA-B27，或其它(關(guān)節(jié)特異性)Ⅱ型膠原，而它與HLA-B27間的聯(lián)系尚未建立起來(lái)。鏈球菌蛋白及角化細(xì)胞蛋白可能是銀屑病中的抗原。
風(fēng)濕病及銀屑病病人對(duì)HLA-B27和/或皮膚角質(zhì)素序列肽的細(xì)胞免疫反應(yīng)表明這些肽是潛在的自身抗原肽，即不再被識(shí)別為自體肽或自身肽。對(duì)HLA-B27前兩個(gè)功能域的免疫反應(yīng)在1986年即有報(bào)道(G.Wildner et al,Abstract 2.33.13,Sixth Intenational Congress ofImmunology,Toronto,Canada,6 toll July 1986；G.Wildner,disswetation,LMU munich,1987；G.wildner et al.,Mol.Immunol.26,33-40,1989)。
近年來(lái)，為恢復(fù)存在于自身耐受與病原體抵抗間的正常平衡，進(jìn)行了許多免疫系統(tǒng)控制的嘗試。著眼點(diǎn)不再是非特異的抑制所有的免疫反應(yīng)，而是只影響作用于自身攻擊的免疫反應(yīng)。因此，其副作用如增加感染幾率或腫瘤形成率很有希望能夠避免。
在此聯(lián)系中，比較已知的能引起自身免疫性疾病或急性慢性移植排斥的生理機(jī)制十分重要。這些機(jī)制曾為尋求治療這些病癥的方法而深入研究過(guò)?，F(xiàn)在認(rèn)為細(xì)胞毒作用，特別是CD8陽(yáng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，在急性移植排斥中起主要作用，而在慢性移植排斥中細(xì)胞毒作用作為次等重要因素。CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞，尤其是輔助性T淋巴細(xì)胞和抑制性T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫反應(yīng)水平上更為重要。以目前的知識(shí)，自身免疫性疾病與慢性移植排斥的情況類(lèi)似。
與抑制急性移植排斥方法不同，治療自身免疫性疾病的方法不需要由調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性主導(dǎo)，而是可以在細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)兩種水平進(jìn)行更廣泛的嘗試。
作為解決上文所述與HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病相關(guān)的方法，特別是HLA-Ⅰ類(lèi)相關(guān)、HLA-Ⅱ類(lèi)相關(guān)的自身免疫性疾病，尤其是些特異與HLA-B27相關(guān)者，對(duì)于本發(fā)明而言，包括應(yīng)用特定的由HLA-B27α1,α2功能域或人類(lèi)角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽來(lái)診斷及治療HLA-依賴(lài)性自身免疫疾病的方法。
1986,1987及1989年，G.Wildner等人(loc.cit.)描述了包含由HLA-B27α1,α2功能域衍生蛋白的融合蛋白。由HLA-Ⅰ類(lèi)分子α1,α2功能域衍生而來(lái)的肽被Krensky等人在WO 88/05784中，CA.Clayberger和A.M.Krensky在WO 93/17699中，C.A.Clayberger等人的WO 95/26979中描述，并為C.A.Claybergeh和A.M.Krensky在Current Opinion in Immunology 7,644-648(1995),E.Nossner等人在JExp.Med.183,339-348,(1996)上發(fā)表。
文件WO 88/05784,WO 93/17699,WO 95/26979,CurrentOpinion in Immunology(1995,loc.cit)和J.Exp.Med.(1996,loc.cit)發(fā)表的特定類(lèi)肽是為-調(diào)節(jié)病人的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞毒性/細(xì)胞溶解活性，特別是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，對(duì)于病人來(lái)說(shuō)，稱(chēng)為--抑制CTL活性，·通過(guò)將肽結(jié)合到CTL上，特別是通過(guò)T細(xì)胞受體，抑制由CTL引起的靶細(xì)胞溶解(可能是通過(guò)與CTL正常結(jié)合的配體的競(jìng)爭(zhēng)(Current Opinion Immunol.(1 995),a.a.0.)和/或·通過(guò)與HSP70熱休克蛋白家族成員，以與其它免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物如FK506和環(huán)孢霉素A行為類(lèi)似的方式結(jié)合，這是因?yàn)樘綔y(cè)與相關(guān)T細(xì)胞表面有關(guān)的熱休克蛋白并不容易(J.Exp.Med.(1996),a.a.0.)·通過(guò)抑制/阻斷CTL分化(WO 93/17699)，或--將MHC限制性靶細(xì)胞敏化，使其具有CTL/刺激CTL活性，可能通過(guò)在MHC介入條件下將肽呈遞給CTL，利用將CTL與相應(yīng)肽結(jié)合來(lái)鑒定CTL，或診斷特異CTL的出現(xiàn)，-利用將特異CTL群體與相應(yīng)肽結(jié)合使其從混合T細(xì)胞中分離出來(lái)。
所有文件將所描繪肽的申請(qǐng)領(lǐng)域定位于移植藥物，特別是與急性移植排斥相結(jié)合(見(jiàn)Clayberger等人的WO 95/26979,C.A.Claybergeh和A.M.Krensky的Current Opinion in Immunology 7,644-648(1995),E.Nossner等人的J.Exp.Med.183,339-348,(1996))以及在病毒，細(xì)菌和寄生蟲(chóng)感染的治療和瘤形成的治療上。
文件WO 88/05784和WO 93/17699僅概括提到利用肽診斷和/或治療自身免疫性疾病，而沒(méi)有具體化，例如并未考慮到特殊的自身免疫性疾病。但是，正如上文解釋過(guò)的，在自身免疫性疾病中，特異輔助性T淋巴細(xì)胞和抑制性T淋巴細(xì)胞中CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的活性，細(xì)胞因子和其它機(jī)制在細(xì)胞免疫反應(yīng)水平上比細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性更為重要，就治療自身免疫性疾病而言，一種其它的，被設(shè)想可能具有更廣譜活性的肽是必要的。
用肽代替完整抗原蛋白或由蛋白的衍生長(zhǎng)鏈片段具有一些說(shuō)服性的原因，特別是在計(jì)劃給予人或動(dòng)物時(shí)采用完整抗原蛋白或衍生長(zhǎng)鏈片段帶來(lái)了以下的困難1)所謂“加工”，即免疫活性片段(表位)的精確刪除并不總在受體機(jī)制中起作用。
2)無(wú)論怎樣，抗原“重組”合成需要很大的花費(fèi)和努力。
3)抗原一般從自然組織中分離。在此聯(lián)系中，細(xì)菌，病毒和/或病毒體感染很易出現(xiàn)，可能由(逆)病毒或細(xì)菌DNA引起繼發(fā)轉(zhuǎn)染。
4)抗原蛋白即使在干燥形式和特殊、精細(xì)的保存條件下也可能僅有很短的保存時(shí)間。
5)敏化的危險(xiǎn)，當(dāng)將抗原用于人類(lèi)或動(dòng)物時(shí)引起典型的食物或接觸過(guò)敏，這是由于漿細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞表面的IgE很易發(fā)生交叉反應(yīng)。
正如前文所述及，本發(fā)明所基于的物質(zhì)是在由HLA-B27α1,α2功能域或人類(lèi)角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽在HLA-依賴(lài)性自身免疫疾病的診斷及治療中的應(yīng)用中獲得的。
這里所考慮的自身免疫性疾病包括HLA-Ⅰ類(lèi)相關(guān)和HLA-Ⅱ類(lèi)相關(guān)自身免疫性疾病，特別是，但并不排除，風(fēng)濕病綜合征的疾病，例如關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)濕和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎和青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，以及虹膜炎，銀屑病及眼色素層炎。本發(fā)明上文定義的肽能夠應(yīng)用于HLA-B27相關(guān)自身免疫性疾病的診斷與治療，這種病也將述及。病癥中存在與HLA-B27抗原的聯(lián)系，例如，關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(Bechterew′s病)和上文述及的風(fēng)濕病綜合征特殊病癥，特別是青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎，以及虹膜炎，眼色素層炎和銀屑病的特殊病癥。需要強(qiáng)調(diào)的是上文定義的肽，其適用性并不局限于診斷和治療和/或抑制HLA-B27相關(guān)自身免疫性疾病。相反，它可以擴(kuò)展到那些與Ⅰ類(lèi)HLA抗原相關(guān)的自身免疫性疾病，例如非HLA-B27相關(guān)的青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎。其適用性也可以擴(kuò)展到HLA-Ⅱ類(lèi)相關(guān)自身免疫性疾病，例如特異的HLA-Ⅱ類(lèi)相關(guān)的關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明所用的肽包括由HLA-B27α1,α2功能域或人類(lèi)角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽，更精確的說(shuō)，是核心序列B27PA,B27PA*,B27PB,B27PC和Ker333或其衍生物肽B27PA:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Tle-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr,肽B27PA*:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln,肽B27PB:Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr肽B27PC:Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val肽Ker333:Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser依照由H.Szots,G.Riethmuller,E.Weiss和T.Meo在Proc.Natl.Acad.Scj.USA83,1428-1432(1986)提供的HLA-B27氨基酸序列，-肽B27PA與HLA-B27的α1功能域內(nèi)60-80氨基酸相對(duì)應(yīng)，-肽B27PA*與HLA-B27的α1功能域內(nèi)60-72氨基酸相對(duì)應(yīng)，-肽B27PB與HLA-B27的α2功能域內(nèi)109-118氨基酸相對(duì)應(yīng)，和-肽B27PC與HLA-B27的α2功能域內(nèi)151-165氨基酸相對(duì)應(yīng)。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)僅有所述核心序列中不連續(xù)分布的有限數(shù)量的氨基酸是抑制或治療HLA-依賴(lài)性自身免疫性疾病的肽活性所必需的。因此，在這方面不重要的氨基酸位點(diǎn)可以被進(jìn)一步刪除，插入，轉(zhuǎn)換及替代，而不損壞肽所述及的生物學(xué)活性?；镜陌被岬难苌靶揎?甲基化，酰胺化，糖基化，結(jié)合脂肪酸殘基(飽和及不飽和脂肪酸殘基)，等)也包括在本文中。
肽相對(duì)于核心序列的改變的關(guān)鍵是使形成的肽表現(xiàn)出一種空間或稱(chēng)三維結(jié)構(gòu)，基于本發(fā)明之目的。此結(jié)構(gòu)并不比上文定義序列形成的帶電和/或表面結(jié)構(gòu)遜色。更優(yōu)越的是這種改變肽的空間結(jié)構(gòu)在其表面結(jié)構(gòu)和電荷分布上與上文述及核心肽或至少其中為生物活性所必需的核心肽之片段是一致的。
因此，本發(fā)明可用的肽及由B27PA,B27PA*和Ker333而來(lái)的衍生物可用下文的公式表示BL1-X-BL2-Y-BL3-Z-BL4-W-BL5和BL1-X-BL2-Y-BL3-Z簡(jiǎn)寫(xiě)B(tài)L代表與下文表中所給信息相關(guān)的氨基酸嵌段，可以包括1-8個(gè)氨基酸。單獨(dú)的氨基酸或氨基酸集團(tuán)(X,Y,Z和W)定位在這些氨基酸之間，它們很有特點(diǎn)并且很可能在上文述及生物活性中起重要作用。肽B27PAh和Ker333是以X,Y,Z和W的氨基酸位置為基礎(chǔ)分別從其全序列中選出來(lái)的。
但是，還需考慮到在核心序列中的其它氨基酸在肽的生物學(xué)活性中也很重要。正如上文所述及的，在本文中很重要的是所得肽的空間或三維結(jié)構(gòu)與上文述及核心肽或至少一部分一致。
在上文所提及B27PA和/或B27PA*的核心序列中-X(在肽的2位；相當(dāng)于Szots等人報(bào)道的61位(a.a.O.))相當(dāng)于天冬氨酸(Asp)，-Y(在肽的7位；相當(dāng)于Szots等人報(bào)道的66位(a.a.O.))相當(dāng)于異亮氨酸(Ile)，-Z(在肽的11-13位；相當(dāng)于Szots等人報(bào)道的70-72位(a.a.O.))相當(dāng)于三肽序列Lys-Ala-Gln，或Lys-Ala-Glu,-W(在肽的20位；相當(dāng)于Szots等人報(bào)道的79位(a.a.O.))相當(dāng)于精氨酸(Arg),所有這些在替代中優(yōu)先考慮同系(例如，結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相近的)的氨基酸或氨基酸集團(tuán)。
在上文提及的Ker333核心序列中，殘基X,Y,Z和W對(duì)應(yīng)于由B27PA和B27PA*衍生而來(lái)的肽中相同的氨基酸，例如，-X(在肽的2位；)相當(dāng)于天冬氨酸(Asp),-Y(在肽的7位；)相當(dāng)于異亮氨酸(Ile),-Z(在肽的11-13位；)相當(dāng)于三肽序列Lys-Ala-Gln，或Lys-Ala-Glu,-W(在肽的20位；)相當(dāng)于精氨酸(Arg),所有這些在替代中優(yōu)先考慮同系的(例如，結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相近的)的氨基酸或氨基酸集團(tuán)。
在下文表中給出的嵌段序列BL的氨基酸和肽與肽B27PA,B27PA*和Ker333中相同位置的氨基酸一致；其中BL1是1到2個(gè)氨基酸的嵌段，如Trp或Leu，正如在肽B27PA,B27PA*和Ker333的同樣位置上所出現(xiàn)的。設(shè)計(jì)的BL2包括一個(gè)含有4到5個(gè)氨基酸的嵌段。還可以想象這兩個(gè)嵌段的進(jìn)一步轉(zhuǎn)換，修飾和替代結(jié)果。同樣情況，BL3到BL5肽嵌段分別含有3到4個(gè)，6到8個(gè)和1到2個(gè)氨基酸。盡管在BL的位置上，可以在維持所需生物學(xué)活性的同時(shí)進(jìn)行更廣泛的替代，但在這種情況下，替代中仍?xún)?yōu)先考慮B27PA,B27PA*和Ker333核心序列的同系氨基酸，正如前文多次述及的，最重要的是產(chǎn)生空間結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)的并不比上文定義序列形成帶電和/或表面結(jié)構(gòu)遜色，更優(yōu)越的是這種修飾肽的空間結(jié)構(gòu)在整體上，或至少在長(zhǎng)度上多于6，最好是8個(gè)氨基酸，其表面結(jié)構(gòu)和電荷分布上與上文述及核心肽或相關(guān)片段的是一致的。BL1XBL2Y BL3ZBL4W BL5名稱(chēng)1-2as (2) 4-5as (7)3-4as (11,12,13) 6-8as (20) 1-2asAsp Ile Lys-Ala-GlnArg或Lys-Ala-GluTrp ″ Arg-Glu ″ Cys-Lys-Ala″Thr-Asp- ″ ThrB27PA-Thr-Gln Arg-Glu-或Asn-LeuIleTrp ″ Arg-Glu ″ Cys-Lys-Ala″ - - - B27PA*-Thr-GlnLeu ″ Leu-Asp ″ Ala-Glu-Val″ Thr-Glu- ″ SerKer333-Ser-Ile Glu-Ile-Ala-Asn由上文述及核心序列B27PA衍生而來(lái)的肽中，BL4也可以特異表達(dá)以下其中一個(gè)氨基酸集團(tuán)Thr-Asp-Arg-Glu-Asp-Leu或Thr-Asp-Arg-Glu-Ser-Leu或
Thr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Leu或Thr-Tyr-Arg-Glu-Asp-Leu或Thr-Tyr-Arg-Glu-Ser-Leu這也同樣適用于由上文述及的核心序列B27PB和B27PC衍生的及含有以下序列的肽。
BL6-O-BL7-M-BL8肽B27PB和B27PC在設(shè)計(jì)的O和M肽位點(diǎn)是一致的。
優(yōu)選的，在上文述及的核心序列B27PB中-O(在肽的2-3位；相當(dāng)于Szots等人報(bào)道的110-111位(a.a.O.))相當(dāng)于二肽序列Leu-Arg，和-M(在肽的5位；相當(dāng)于Szots等人報(bào)道的113位(a.a.O.))相當(dāng)于酪氨酸(Tyr)。
在上文述及的核心序列B27PC中-O(在肽的6-7位；相當(dāng)于Szots等人報(bào)道的156-157位(a.a.O.))同樣相當(dāng)于二肽序列Leu-Arg，和-M(在肽的9位；相當(dāng)于Szots等人報(bào)道的159位(a.a.O.))相當(dāng)于酪氨酸(Tyr)。
這種情況下，O和M位點(diǎn)，及BL位點(diǎn)在替代中優(yōu)先考慮同系(例如，結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相近的)的氨基酸或氨基酸集團(tuán)。氨基酸的替換，修飾，轉(zhuǎn)換，刪除和插入可能處于這樣的程度之內(nèi)基于本發(fā)明的目的，這些改變不會(huì)不利地影響以上定義序列造成的電荷和/或表面結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，基于表面結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)和電荷分布與核心片段的至少一部分，在長(zhǎng)度上多于6，最好是多于8個(gè)氨基酸的，對(duì)肽的生物學(xué)活性至關(guān)重要的片段一致。
下表主要通過(guò)舉例說(shuō)明在基本核心序列B27PB和B27PC中找到的相應(yīng)氨基酸或肽序列位點(diǎn)。名稱(chēng)BL6OBL7M BL81-5as 2as 1as 1as0-6asLeu-Arg TyrB27PB Leu ″ Gly ″ His-Gln-Asp-Ala-TyrB27PC Arg-Val-Ala-Glu-Glu ″ Ala ″ Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val但是，必須強(qiáng)調(diào)的是由上文述及一般公式中得來(lái)的肽并不需要有同樣的所研究的活性譜，例如，HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病治療活性。單個(gè)或僅僅一些氨基酸變異足以使之能夠作為成功治療HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的肽，如虹膜炎，銀屑病及風(fēng)濕病如Bechterew′s病(關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎)，銀屑病性關(guān)節(jié)炎以及男孩常發(fā)的青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，它與開(kāi)始用的肽不同。
上文所示序列中由8-20個(gè)，較好的是10-18個(gè)，更好的是12-16個(gè)氨基酸氨基酸組成的肽也是本發(fā)明述及的與上文描述的應(yīng)用于診斷和治療的肽。
在本發(fā)明方法中，肽的N-末端和/或C-末端進(jìn)行替換；例如脂肪酸和磷酸脂，糖基和C1-C12-烷基或C1-C12-鏈烯殘基所需偶聯(lián)制劑和偶聯(lián)方法為技術(shù)熟練人員所知。用甲基二硫苯甲酸(MDTB)通過(guò)肽的NH2基團(tuán)，與激活的烯烴結(jié)合，運(yùn)用雙功能連接試劑，如MBSE，戊二醛和甲基二硫苯甲酸(MDTB)與磷酸脂如磷酸酰膽堿或磷酸酰乙醇胺偶聯(lián)可作為例子。
本發(fā)明方法中肽直接或通過(guò)取代基或偶聯(lián)系統(tǒng)(如生物素/結(jié)合素)與有機(jī)或無(wú)機(jī)支持物，或如下文將詳細(xì)介紹的通過(guò)直接或間接可探測(cè)的標(biāo)記物結(jié)合或吸附。
上文定義的肽可以進(jìn)行很多改變而不丟失其基本功能，例如1)肽可在N-末端或C-末端擴(kuò)展。2)肽可在N-末端或C-末端截短，然而僅限于至少含有6個(gè)氨基酸的肽，最好是至少8個(gè)氨基酸。
尤其是在由B27PA和Ker333衍生的肽中，幾個(gè)特征性氨基酸之外N-末端或C-末端的截除可以不引起上文定義的生物學(xué)活性的丟失。舉一個(gè)C-末端截除的例子，B27PA衍生肽B27PA*，如同上文述及，含有由Szots等人(a.a.O.)編號(hào)的HLA-B27序列中60-72的氨基酸。
本發(fā)明還包括以下用在本發(fā)明中的肽肽B27PA:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr,肽B27PA*:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln,肽B27PB:Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr,肽B27PC:Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val,肽Ker333:Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser.
本發(fā)明還與由上文述及肽序列衍生、和本申請(qǐng)所具有的HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病治療活性具有可比性的肽相關(guān)，可比活性是指高達(dá)200％，某些情況下高達(dá)300％，或低于25％的活性。本發(fā)明所述由上文述及序列衍生的肽主要是由單一氨基酸或較小的氨基酸集團(tuán)替代序列衍生而來(lái)的。這些肽優(yōu)選用以下方法衍生-少量，不超過(guò)4或5個(gè)氨基酸，單一或小集團(tuán)被一個(gè)或幾個(gè)，最好是同系氨基酸替代，和/或-少量，不超過(guò)3個(gè)氨基酸的特定氨基酸加至N-末端和/或C-末端，和/或-肽在N-末端和/或C-末端截除一小部分氨基酸；一般只在含多于6，最好是8個(gè)氨基酸的肽中截除。
正如前文所述，肽B27PA和Ker333是根據(jù)與某些特定位點(diǎn)氨基酸序列同源性，由各自全序列中選擇出來(lái)的?，F(xiàn)認(rèn)為至少一些特異氨基酸位點(diǎn)在肽的生物學(xué)活性中很重要。在以下核心序列B27PA和Ker333，和通過(guò)C-末端截除衍生于B27PA的核心序列B27PA*中，具有相同的單個(gè)氨基酸，下文用下劃線(xiàn)表示肽B27PA:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arq-Thr,肽Ker333:Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arq-Ser,肽B27PA*:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln.
同系氨基酸的替代優(yōu)先在下劃線(xiàn)的氨基酸位點(diǎn)上進(jìn)行，反之非同系氨基酸的替代以一定的程度可能發(fā)生在其余位點(diǎn)上。但是，必須考慮到肽序列中其它氨基酸位點(diǎn)對(duì)肽的生物學(xué)活性也很重要。正如前文述及多次，肽形成的三維結(jié)構(gòu)對(duì)肽的生物學(xué)功能至關(guān)重要結(jié)構(gòu)的變化，只要是對(duì)于上文定義序列的帶電和/或表面結(jié)構(gòu)，最好是修飾肽的三維結(jié)構(gòu)與核心序列的或生物學(xué)功能必需的核心序列之段的結(jié)構(gòu)保持基本不變，即為可行。
上文所述在HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病診斷中具有可比應(yīng)用性，和/或治療中具有可比活性的方案，基于上述聲明中肽的空間結(jié)構(gòu)，除替代之外，同樣也包括本發(fā)明中通過(guò)對(duì)上文述及序列的個(gè)別氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)修飾(例如，甲基，脂肪酸或糖基基團(tuán)的修飾)轉(zhuǎn)換，刪除和/或插入的肽結(jié)構(gòu)。
另外，本發(fā)明還涉及按照正確順序和已知方法通過(guò)連接氨基酸及其衍生物產(chǎn)生上文定義肽的方法。
按照上文所述核心序列產(chǎn)生肽的策略包括依照核心序列或這些核心序列片段的空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的特異方法。以上文所述同系氨基酸的替代為例來(lái)說(shuō)明計(jì)算機(jī)輔助分子模型，以建立影響所得肽空間結(jié)構(gòu)最大可能的氨基酸替代，修飾，刪除或插入為目的。肽構(gòu)建學(xué)的概念，以產(chǎn)生非肽類(lèi)似物為目的，是建立與所給原始肽十分類(lèi)似的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)上文述及核心序列或其片段而言，提供一個(gè)與“正?！卑被嵝纬汕抖嗡煌奶娲桨?。
與上文定義相似的肽還包括上文述及的與之結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)，此標(biāo)記物并不顯著影響肽診斷HLA-依賴(lài)性自身免疫性疾病的適用性。
本發(fā)明中可用的肽，或發(fā)明中的肽，可由多種制備方法。例如，化學(xué)合成可以用自動(dòng)或手動(dòng)操作市售肽合成儀，例如，Beckman或?qū)嵱眯訠iosystems公司。這種情況下，肽合成的操作按照儀器制造商所提供的包括在方法容許條件下所用試劑的明確介紹。
其它的可能性包括在手工操作化學(xué)合成中。以下是一些關(guān)于技術(shù)熟練人員所知方法的參考文獻(xiàn)，R.B.Merrifield所用的固相方法(“固相合成”，Science232,341-347(1986))，此方法是通過(guò)用二環(huán)己碳二亞胺(DCCI)激活原始氨基酸復(fù)合物的羰基或所需結(jié)構(gòu)的原始肽部分序列的羰基，和通過(guò)一定復(fù)合物或最終肽中定位于相同位點(diǎn)的片段中的氨基官能團(tuán)激活具有活化羰基末端的復(fù)合物。后一種方法中，需要封閉在同等條件下具有活性的反應(yīng)物的基團(tuán)；例如，用三丁氧羰基基團(tuán)(t-BOC基團(tuán))處理氨基。
肽可以由自然來(lái)源分離，特別是某些由DNA編碼肽轉(zhuǎn)染的細(xì)菌或真核細(xì)胞，在這些細(xì)胞中可以表達(dá)DNA。所用方法為技術(shù)熟練人員所掌握，例如DNA擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染和肽純化分離，例如用層析方法，(離子交換層析和免疫親合層析，膠濾過(guò)等)和電泳。這種由自然來(lái)源分離的肽十分適用于HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的治療。
正如前文所述，本發(fā)明特別包括所述肽在HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的診斷和治療中的應(yīng)用。a)HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的診斷由HLA-B27和角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽用于診斷中，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。這使臨床綜合征的免疫分類(lèi)更為精確，使特異治療成為可能。在所描繪的基礎(chǔ)上，這些肽呈遞了更為特異的抗原而非相對(duì)完整抗原。另外，對(duì)角蛋白來(lái)說(shuō)，與蛋白不同，肽的可溶性在應(yīng)用上更為優(yōu)越。
這里所述的自身免疫性疾病包括HLA-Ⅰ類(lèi)相關(guān)和HLA-Ⅱ類(lèi)相關(guān)的自身免疫性疾病，特別是，并不限于，風(fēng)濕病復(fù)合征，如關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)濕和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎和青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，還有虹膜炎，銀屑病和眼色素層炎。還提及可用于HLA-B27相關(guān)自身免疫性疾病診斷和治療的本發(fā)明上文定義的肽。在關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(Bechterew′s疾病)以及上文提及風(fēng)濕病綜合征的某些情況下，存在與HLA-B27抗原的聯(lián)系，特別是某些青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎，及某些虹膜炎，眼色素層炎和銀屑病。必須強(qiáng)調(diào)的是，上文定義的肽并不限于適用于HLA-B27相關(guān)自身免疫性疾病的診斷和治療和/或抑制HLA-B27-相關(guān)自身免疫性疾病。相反，還可以用在與其它HLA-Ⅰ類(lèi)抗原相關(guān)的自身免疫性疾病，如非-HLA-B27-相關(guān)青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎。另外，其實(shí)用性還可擴(kuò)展到HLA-Ⅱ類(lèi)相關(guān)自身免疫性疾病，如特異HLA-Ⅱ類(lèi)相關(guān)關(guān)節(jié)炎。
這些肽特別適用于作為檢測(cè)抗體的體外測(cè)試系統(tǒng)的抗原，如在酶聯(lián)免疫吸收測(cè)試(ELISA)或免疫熒光測(cè)試，和適用于細(xì)胞免疫反應(yīng)，如T細(xì)胞刺激測(cè)試。
在這些測(cè)試中，肽可以直接在溶解狀態(tài)或吸附或共價(jià)結(jié)合于支持物上使用。所用肽與可探測(cè)的標(biāo)記底物直接或間接結(jié)合。如技術(shù)熟練人員所知，這些標(biāo)記底物包括熒光底物，酶，含放射活性元素(3H,13C,32P,35S,125I，等)的基團(tuán)或分子，和磁性粒子，通過(guò)直接結(jié)合或結(jié)合系統(tǒng)(如生物素/抗生物素蛋白)來(lái)結(jié)合。另外，肽的游離或相應(yīng)修飾形式可以以試劑盒的形式獲得，其中包括檢測(cè)方法中所需的其它試劑。
肽也可以直接用于人類(lèi)診斷。在這種情況下，可通過(guò)皮內(nèi)或皮下注射以溶液或吸收或結(jié)合于支持物形式存在的肽產(chǎn)生免疫反應(yīng)，然后測(cè)定。肽尤其適用于作為在健康受試者身上引起的延遲性免疫反應(yīng)的診斷研究方法，或用于特殊診斷的病人。肽通過(guò)傳統(tǒng)途徑給予，如口服。靜脈注射，皮下注射，肌內(nèi)注射，等，以包括添加或輔助成分的形式給予，這是由技術(shù)熟練人員所熟悉的應(yīng)用。b)HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的抑制/治療上文定義的由HLA-B27和角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽，可以以a)中例子中的方法作為以上所列HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的治療劑。
本發(fā)明還與抑制或治療HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的肽的應(yīng)用，特別是為抑制和/或治療HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病制備制劑的應(yīng)用有關(guān)。
本發(fā)明還與治療人類(lèi)HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的方法有關(guān)，包括給予上文定義的肽。
本發(fā)明中，給予所述肽的目的是為使受試對(duì)象耐受作為免疫活性引起的免疫反應(yīng)靶體的不同自身抗原。在這種情況下，肽產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)，包括特異-T細(xì)胞的耐受，滅活或消除。但是，耐受也可以由封阻消化性(professionell)或非特定抗原呈遞細(xì)胞上的抗原呈遞限制因子而引起。
如上文所述，與自身免疫性疾病相關(guān)的免疫系統(tǒng)的反應(yīng)并不局限在血淋巴細(xì)胞中。體液免疫反應(yīng)，通過(guò)抗體，巨噬細(xì)胞和其它免疫系統(tǒng)細(xì)胞，也應(yīng)包括本發(fā)明中肽的可能靶體。
病人和正常志愿者的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以用于確定肽的治療強(qiáng)度。一方面，例如，體外檢測(cè)Bechterew′s疾病(關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎)病人和正常志愿者的外周血(PBL)中分離的淋巴細(xì)胞。這些淋巴細(xì)胞用不同的蛋白和肽及反應(yīng)進(jìn)行孵育，細(xì)胞擴(kuò)增增加，用3H-胸腺嘧啶摻入檢測(cè)。在此聯(lián)系中發(fā)現(xiàn)，Bechterew′s疾病病人的淋巴細(xì)胞與正常志愿者不同，對(duì)肽B27PA*的反應(yīng)強(qiáng)于肽B27PD(與上文定義不同)?？梢酝ㄟ^(guò)肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)推論淋巴細(xì)胞表現(xiàn)的交叉反應(yīng)活性正是自身免疫反應(yīng)的原因。
另外，用肽B27PA*和Ker333在大鼠上作免疫實(shí)驗(yàn)，引起類(lèi)似銀屑病關(guān)節(jié)炎的指關(guān)節(jié)腫脹例數(shù)分別為四個(gè)中有一個(gè)，兩個(gè)中有一個(gè)。這些發(fā)現(xiàn)同時(shí)表明在反應(yīng)動(dòng)物中，肽能夠表現(xiàn)出與正常存在于指關(guān)節(jié)區(qū)的表位的交叉反應(yīng)活性。此交叉反應(yīng)活性為自身免疫性疾病的原因。如果能夠獲得這方面的結(jié)果，那么正如前文舉例描述，將相同肽包括在診斷和進(jìn)一步判定自身免疫性疾病的類(lèi)型就很有價(jià)值。
在自身免疫眼色素層炎中，前文已經(jīng)提到交叉反應(yīng)活性直接提供了治療方法(見(jiàn)，如，WO 95/29194；S.R.Thurau，等人，ImmunologyLetters 57,193-201(1997))。肽免疫反應(yīng)活性的知識(shí)在治療病人中有診斷重要性，因?yàn)榇朔磻?yīng)活性直接提供這些肽用于治療的可能性，如，通過(guò)它們調(diào)節(jié)自身攻擊免疫反應(yīng)。
可以通過(guò)靜脈注射，皮下或肌內(nèi)給予，特別是，向予粘膜表面如鼻腔氣管區(qū)，肺或胃腸道(特別是口服給予)上文定義的肽，或含有這些肽的制備物，產(chǎn)生耐受。
在此聯(lián)系中，要考慮到單個(gè)給予或兩個(gè)或多個(gè)上文定義的肽結(jié)合給予。當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)肽給予時(shí)，可以同時(shí)或次序給予。
制備包括所述肽可以干粉，溶液，懸濁液或氣溶膠，如鼻噴霧或吸入噴霧形式給予。制備包括活性底物和傳統(tǒng)的輔助和攜帶底物。肽可以每日10微克到1000微克每公斤體重的劑量給予。
本發(fā)明中的優(yōu)選給予模式是通過(guò)粘膜，特別是鼻腔，肺和胃腸道粘膜，用鼻腔或吸入噴霧或口服給予肽?？诜腔蛭氘a(chǎn)生耐受機(jī)制還屬未知，目前的知識(shí)認(rèn)為細(xì)胞效應(yīng)并不重要，至少不通過(guò)CTL的途徑。由給予粘膜抗原產(chǎn)生的調(diào)節(jié)細(xì)胞還未完全分辨或功能定性。
口服給予時(shí)，可以用釋放系統(tǒng)，如，膠囊，肽可以通過(guò)它在特定的胃腸道部位釋放，如小腸的某段區(qū)域，通過(guò)這種釋放，在其特定位置，持續(xù)一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間。這樣可以，例如，使制備物免于與胃中的攻擊性，酸性物質(zhì)接觸。植入的緩釋設(shè)計(jì)也可用于皮下給予。技術(shù)熟練人員對(duì)上文所述類(lèi)型的緩釋設(shè)計(jì)很熟悉。
雖然本文并不排除以治療為目的通過(guò)皮膚給予肽，以目前的知識(shí)它并不作為優(yōu)選方案。例如，在銀屑病中，皮膚潰瘍處的自身攻擊T淋巴細(xì)胞能夠?qū)⑵つw給予的肽識(shí)別為已制備的在相應(yīng)MHC條件下的抗原，如，蛋白水解裂解，這樣會(huì)加強(qiáng)自身攻擊反應(yīng)。
與目前一些中心所嘗試的用完整蛋白誘導(dǎo)耐受的方法相比，用上文所述肽誘導(dǎo)耐受在HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病中有很多優(yōu)越性，如1)肽可以用蛋白化學(xué)相對(duì)簡(jiǎn)單的合成。
2)肽并不由天然組織中分離得到。減少了組織可能感染的病毒，病原體或細(xì)菌感染的可能性，和由相應(yīng)(逆)病毒或細(xì)菌DNA引起的二次感染的可能性。
3)作為由動(dòng)物物質(zhì)分離蛋白的替代方法的重組產(chǎn)生方法并不需要，因?yàn)楹苜M(fèi)力且產(chǎn)量相對(duì)低。
4)肽在干粉狀態(tài)有很長(zhǎng)的保存壽命，且并不需要如何特殊的儲(chǔ)存條件。
5)與蛋白相比較，以食物或接觸過(guò)敏為形式的敏化危險(xiǎn)，在肽中并不出現(xiàn)，因?yàn)樗荒芘c漿細(xì)胞或嗜酸性細(xì)胞表面的IgE發(fā)生交聯(lián)效應(yīng)。
6)如上文描述，肽在免疫系統(tǒng)中有調(diào)節(jié)效應(yīng)。實(shí)施例本發(fā)明中，上文定義的肽，用作測(cè)定細(xì)胞免疫反應(yīng)的體外探測(cè)系統(tǒng)抗原的適用性，由肽B27PA*一系列檢測(cè)來(lái)例證。肽所測(cè)試肽是上文提及的肽B27PA*，它是由B27PA的核心序列的C-未端截除8個(gè)氨基酸所得，其包括Szots等人(Loc.cit.)所述HLA-B27序列中的60-72氨基酸B27PA*:
Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln及對(duì)照肽B27PD，它與本發(fā)明可用的肽情況不同，包含Szots等人(Loc.cit)所述HLA-B27序列中的125-138氨基酸B27PD:
Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr.
肽B27PD在實(shí)驗(yàn)性自身免疫眼色素層炎(EAU)大鼠模型中引起眼色素層炎(WO 95/29194；G.Wildner&S.R.Thurau,Eur.J.Immunol.24,2579-2585(1994))。
肽B27PA*是在半自動(dòng)肽合成儀上按照制造商說(shuō)明書(shū)制備的。肽B27PD由Neosystems,Strasbourg,France制備。肽由未添加RPMI-1640溶解。病人所探測(cè)的外周血T淋巴細(xì)胞(PBL)來(lái)源于有關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(AS)的HLA-B27+病人，其它脊椎關(guān)節(jié)病HLA-B27+病人，有類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的HLA-B27-病人，健康HLA-B27+對(duì)照主體和健康HLA-B27-對(duì)照主體。有關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(AS)的HLA-B27+病人本研究中有關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(AS)的55個(gè)病人完全符合Newyork修正的關(guān)于準(zhǔn)確AS的定義(S.Vander Linden,H.A.Valkenburg,A.Cats,Arthritis Rheum.27,361-368,(1984)):(36男性和19女性；平均年齡40.9年，年齡范圍18-71歲)。所有病人符合臨床“急性”病的前提條件。其它脊椎關(guān)節(jié)病HLA-B27+病人本研究中的28個(gè)患有其它脊椎關(guān)節(jié)病HLA-B27+病人包括5個(gè)有反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，10個(gè)有銀屑病關(guān)節(jié)炎和13個(gè)有腸病關(guān)節(jié)炎并發(fā)Crohn′s疾病或潰瘍性大腸炎(15男性和13女性；平均年齡42.4年，年齡范圍22-76歲)的病人。健康HLA-B27+對(duì)照主體本研究中包括30個(gè)主體(18男性和12女性；平均年齡46.2年，年齡范圍20-78歲)。健康HLA-B27-對(duì)照主體本研究中包括22個(gè)主體(10男性和12女性；平均年齡30.8年，年齡范圍22-53歲)。有類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的HLA-B27-病人本研究中包括7個(gè)急性類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的HLA-B27-病人(1個(gè)男性和4個(gè)女性；平均年齡56.8年，年齡范圍30-72歲)。
對(duì)照血捐獻(xiàn)者中沒(méi)有人有脊椎關(guān)節(jié)炎個(gè)人或家族發(fā)病史，也沒(méi)有近期發(fā)生過(guò)胃腸道或泌尿生殖道感染。外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的分離由肝素化外周血獲得的PBLs是用Ficoll-Hypaque梯度標(biāo)準(zhǔn)離心，三次清洗并重懸于RH10培養(yǎng)基中(含2mM L-谷氨酰胺，HEPES,100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素和10％熱滅活人類(lèi)AB血清的RPMI-1640基質(zhì))。淋巴細(xì)胞擴(kuò)增檢測(cè)用或不用刺激物，用RH10培養(yǎng)基在96孔圓底微孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)上制備5×10E4 PBLs，終體積為10ul。所用肽終濃度為10ug/ml。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。培養(yǎng)物在潮濕環(huán)境(5％CO2,95％空氣)下37攝氏度孵育6天。第5天，向每孔加入0.25uCi3H-胸腺嘧啶(3H-TdR；Amersham,Braunschweig,Germany)。第6天，細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)收集法通過(guò)玻璃濾紙收集。3H-TdR摻入用液閃計(jì)數(shù)定量。結(jié)果以刺激結(jié)果([有刺激物的cpm-無(wú)刺激物的cpm][無(wú)刺激物的cpm])表示。肽B27PA*劑量/反應(yīng)曲線(xiàn)的測(cè)定與B27PA*反應(yīng)的來(lái)源于病人(AS1)的1×10E5 PBLs在不含或含0.1到50.0ug/ml不同濃度的合成肽B27PA*的100ulRH10培養(yǎng)基中孵育6天，在第5天用0.25uCi的3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)刺激，第6天用玻璃濾紙收集。結(jié)果用每分平均計(jì)數(shù)(cpm)+-三次重復(fù)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤差。B27PA1*特異T細(xì)胞系的產(chǎn)生3×10E6PBLs在含10ug肽B27PA*/ml的總體積為2ml的RH10培養(yǎng)基的12孔板上孵育。PBLs由有關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎的AS1和AS2病人和健康HLA-B27+(H1)血液捐獻(xiàn)者分離得到，所有測(cè)試者在開(kāi)始淋巴細(xì)胞擴(kuò)增鑒定(見(jiàn)“結(jié)果”)中表現(xiàn)出對(duì)B27PA*明顯的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；有關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎，AS2，而不表現(xiàn)出增殖反應(yīng)的病人的PBLs作為對(duì)照。經(jīng)過(guò)3天的培養(yǎng)，培養(yǎng)基由新鮮添加20U重組IL-2(rIL-2,Boehringer Ingelheim,Germany)/ml的RH10替代。在第10天，培養(yǎng)物用自體，照射(4000rads)過(guò)的PBLs作為飼細(xì)胞，添加了10ug的B27PA*肽/ml和rIL-2的RH10清洗和再刺激。再刺激過(guò)程中，每1×10E6反應(yīng)者細(xì)胞用2×10E6飼養(yǎng)細(xì)胞，所得T細(xì)胞系用淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)進(jìn)行功能定性，其中用1×10E4T細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞和1×10E4自身E-(例如，通過(guò)綿羊紅細(xì)胞玫瑰花形成實(shí)驗(yàn)由自身PBLs中分離單核細(xì)胞/B細(xì)胞侵蝕部分)作為飼養(yǎng)細(xì)胞，總體積為150ulRH10，以上方法在E.Hermann,B.Fleischer,W.-J.Mayet,T.Poralla,K.-H Meyer zum Buschenfelde,Clin Exp.Immunol.75,365-370(1989)中描述過(guò)。肽B27PA*(10或1ug/ml)和B27PD(10ug/ml)作為刺激劑，植物血凝素(PHA；1ug/ml)作為陽(yáng)性肽。為了檢測(cè)單克隆抗體(Mabs)阻斷肽-特異T細(xì)胞增殖的能力，Mabs w6/32(抗-HLA-Ⅰ類(lèi)，1∶400),DA6.231(抗-HLA-Ⅱ；1∶400)和1ug/ml TCR-δ1(γδ-TCR的δ-鏈上片段決定蔟特異性；T Cell Sciences,Cmbridge,MA,USA)加入含B27PA*的培養(yǎng)物。培養(yǎng)的第3天，細(xì)胞用0.25uCi的3H-TdR刺激并按上文描述收獲和計(jì)數(shù)。肽刺激T細(xì)胞系的表現(xiàn)型分析(FACS)在培養(yǎng)第8和20天的培養(yǎng)物中T細(xì)胞系，及未刺激的PBLs用細(xì)胞分類(lèi)器分析。每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始3×10E5細(xì)胞用未結(jié)合Mabs抗-CD3(OKT3)，抗-CD4(OKT4)，抗-CD8(OKT8)(混合上清液)BMA.031(TCR-αβ上片段決定蔟特異性)和TCR-δ1標(biāo)記，然后用RPMI-1640/10％胎牛血清中熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的多克隆羊抗小鼠-IgG抗體(Medac,Hamburg,Germany)標(biāo)記。用熒光活化細(xì)胞分類(lèi)器(FACStar,Becton Dickinson)進(jìn)行細(xì)胞熒光測(cè)定分析，每個(gè)樣品中6000個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果用單克隆抗體(Mabs)-描述陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比比上所有CD3-陽(yáng)性T細(xì)胞百分比來(lái)表示。結(jié)果PBLs對(duì)HLA-B27-衍生肽的增殖反應(yīng)如表1所示，B27PA*在17/55有AS(SI在2.5和17之間)的測(cè)試病人和3/30正常HLA-B27+血液捐贈(zèng)者(SI在2.5和9.8)中引起明顯PBL擴(kuò)增(SI＞=2.5)。有AS的測(cè)試病人和3/30正常HLA-B27+血液捐贈(zèng)者組間有明顯差異(p=0.0135；Mann-Whitneyrank sum test；Stat Exact Programme)。在2/28其它HLA-B27-相關(guān)脊椎關(guān)節(jié)炎和2/22正常HLA-B27-對(duì)照主體中只有輕微PBL增殖(SI=2.5)由于已知一些T細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)時(shí)可以被刺激后分泌細(xì)胞因子而不增殖，對(duì)肽反應(yīng)(AS1)或不反應(yīng)(AS2)的病人的PBLs中分泌IFN-γ的T細(xì)胞比例用酶聯(lián)免疫點(diǎn)印跡(ELISPOT)測(cè)定(按D.M.Klinman,T.B.Nutman修正的，“ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells″,in:Current Protocols in Immunology,7th edition,Eds:J.E.coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober,Brooklyn,New York,Greene PublishingAssociates,1994)靈敏的ELISPOT技術(shù)表明10E5的AS1病人PBLs中的8個(gè)和10E5的AS2病人PBLs中的1個(gè)表現(xiàn)出B27PA*-刺激T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的特異性。
RA病人PBLs并不被這兩種所用肽刺激。
有趣的是，健康的HLA-B27+血液捐贈(zèng)者(稱(chēng)為H1)，健康的HLA-B27+實(shí)驗(yàn)主體組中一個(gè)30歲男性血液捐贈(zèng)者對(duì)B27pA*肽(SI=9.8)表現(xiàn)出最強(qiáng)的PBL擴(kuò)增反應(yīng)，在我們?nèi)⊙獦?個(gè)月后，表現(xiàn)出炎癥類(lèi)型的后期疼痛，僵直持續(xù)1h。不幸的是，此人，H1，并未為風(fēng)濕病學(xué)者進(jìn)行病理檢查。
如下表所示，一個(gè)AS病人的PBLs的B27PA*特異反應(yīng)(為PBLs對(duì)肽的反應(yīng))，是劑量依賴(lài)并在培養(yǎng)基終濃度為10ug/ml時(shí)達(dá)到最大。肽終濃度B27PA*:(ug/ml)cpm±標(biāo)準(zhǔn)誤0 165±200.1 218±251.0 565±475.0 1576±707.5 2492±7210.0 2718±7620.0 2695±8850.0 2733±84這些結(jié)果表明有HLA-B27序列合成的肽，如B27PA*，被有關(guān)節(jié)硬化脊椎炎HLA-B27+病人的PBLs作為自身抗原特異識(shí)別，至少還能為HLA-B27+對(duì)照主體以較低程度識(shí)別。
盡管HLA-B27衍生肽B27PA*和B27PD對(duì)PBL捐贈(zèng)者為外源，在HLA-B27-對(duì)照主體中不誘導(dǎo)增殖或僅有輕微增殖。缺乏與這些HLA-B27決定蔟反應(yīng)的對(duì)照PBLs的增殖可以解釋為這種反應(yīng)活性表現(xiàn)出的“間接共識(shí)別”，其特點(diǎn)是宿主MHC-限制性T細(xì)胞共反應(yīng)固定地指向外源MHC抗原上單一或一些主要決定簇。(G.Benichou,R.C.Tam,L.R.B.Loares,E.V.Fedoseyeva,Immnol.Today18:67-71(1997))另外，在本研究中所檢測(cè)的肽并不表現(xiàn)出與可能在HLA-B27-志愿者中引起共反應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)的HLA-B27分子相同的決定簇。B27PA*-特異T細(xì)胞系的功能鑒定如上文所描述，3個(gè)不同的B27PA*-特異T細(xì)胞系通過(guò)培養(yǎng)和再刺激含B27PA*肽的來(lái)源于病人AS1和AS3及健康HLA-B27+血液捐贈(zèng)者(H1)的PBLs而產(chǎn)生。AS1和AS3是其PBLs在與肽B27PA*反應(yīng)時(shí)強(qiáng)烈增殖的病人(AS1∶SI=17.5；AS3∶SI=15.4)。血液捐獻(xiàn)者H1的PBLs用B27PA*(SI=9.8)刺激。對(duì)照T細(xì)胞系B27PA*-AS2由與B27PA*(SI=1)反應(yīng)不增殖的PBLs衍生而來(lái)。T細(xì)胞系在培養(yǎng)第20天分析。如下表所示，細(xì)胞系B27PA*-AS1,B27PA*-AS3,B27PA*-H1與B27PA*肽反應(yīng)特異性增殖，而對(duì)照細(xì)胞系B27PA*-AS2并不如此。不可能用抗-MHC-Ⅰ類(lèi)Mabs(w6/32)或抗MHC-Ⅱ類(lèi)Mabs(DA6.231)抑制這種特異的T細(xì)胞增殖。而單克隆抗體TCR-δ1抗-γδ-TCR)可以阻斷大于50％的用1ug/mlB27PA*刺激的培養(yǎng)物中B27PA*特異性增殖反應(yīng)，而對(duì)PHA誘導(dǎo)的增殖沒(méi)有效應(yīng)。
T-細(xì)胞系B27PA*-AS1 B27PA*-AS3 B27PA*-H1B27PA*-AS2T+培養(yǎng)基72±5 75±868±8 86±9T+E-+培養(yǎng)基 89±9 96±11 85±10114±16T+E-+B27PA*(10μg/ml) 1548±34 1120±48 1368±58 134±18+w6/32 1576±55 1105±41 1379±67n.best.
+DA6.2311513±102 1077±83 1322±117 n.best.
+TCR-δ1 855±85635±64 893±82n.best.T+E-+B27PA*(1μg/ml) 912±90725±48 816±55126±22+w6/32 925±82730±50 827±69n.best.
+DA6.231 896±77695±55 803±53n.best.
+TCR-δ1 411±42304±29 410±40n.best.T+E-+B27PD(10μg/ml)101±16 95±10 94±21125±12T+E-+PHA(1μg/ml) 3689±177 4248±1243480±145 4068±170+TCR-δ13650±158 4268±1353538±170 4103±182nh=未確定B27PA*特異性T細(xì)胞系的流式細(xì)胞分析從上表可以看出，與未刺激的PBLs(0天)或僅用rIL-2刺激的PBLs系相比較，B27PA*特異性T細(xì)胞系B27PA*-AS1,B27PA*-AS3,B27PA*-H1(培養(yǎng)第8和20天的產(chǎn)物)表現(xiàn)型源于B27PA*-刺激細(xì)胞系中γδ-TCR+淋巴細(xì)胞的擴(kuò)展。在第20天，γδ-TCR+淋巴細(xì)胞在所有CD3陽(yáng)性細(xì)胞中分別含有25.5％(志愿者AS1),30.4％(志愿者AS3),32.7％(志愿者H1)。相反，B27PA*-刺激對(duì)照細(xì)胞系B27PA*-AS2僅含7.4％γδ-TCR+細(xì)胞。下表數(shù)據(jù)以占總CD3-陽(yáng)性T細(xì)胞的百分比形式給出。
TCR-αβ(％) CD4(％) CD8(％)TCR-γδ(％)供體AS1新鮮分離的PBLs 93.5 69.8 24.6 5.3B27PA*刺激，第8天 84.9 52.9 28.2 13.7B27PA*刺激，第20天 73.6 45.1 30.5 25.5rIL-2刺激，第20天93.0 67.7 26.7 6.3供體AS3新鮮分離的PBLs 93.3 71.0 22.4 5.8B27PA*刺激，第8天 83.6 63.5 21.3 15.5B27PA*刺激，第20天 59.2 34.4 25.6 30.4rIL-2刺激，第20天92.2 75.8 16.6 7.2供體H1新鮮分離的PBLs 95.7 73.1 22.3 4.1B27PA*刺激，第8天 85.2 58.4 26.5 14.0B27PA*刺激，第20天 67.1 34.9 31.5 32.7rIL-2刺激，第20天93.7 75.0 18.4 6.0供體AS2新鮮分離的PBLs 94.1 66.3 27.4 5.3B27PA*刺激，第8天 92.3 68.6 24.0 7.2B27PA*刺激，第20天 91.9 70.2 21.4 7.8rIL-2刺激，第20天92.1 74.3 18.5 7.4用Mabs阻斷B27PA*-特異性T細(xì)胞系的FACScan分析和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明γδ-TCR+T細(xì)胞，比起CD4-陽(yáng)性αβ-TCR+T細(xì)胞，在與HLA-B27-衍生肽體外孵育后刺激和膨脹細(xì)胞中占多數(shù)。在此聯(lián)系中，值得一提的是自身反應(yīng)γδ-TCR+細(xì)胞可能與一些人類(lèi)自身免疫性疾病有關(guān)(J.Soderstrom,E.Halapi,e.Nisson,A.Gronberg,j.van Embden,L.Klareskog,R.Kiessling,Scand.J.Immunol.32,503-515(1990))，包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，盡管在RA病人的外周血或滑液和膜中γδ-TCR+細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量并不增加。(M.Smith,B.Broker,L.Moretta,E.Ciccone,C.E.Grossi,J.C.W.Edwards,F.yuksel,B.Colaco,C.Worman,L.Mackenzie,R.Kinne,G.Weseloh,K.GLuckert,P.M.Lydyard,Scand.J.Immunol.32,585-593(1990))在脊椎關(guān)節(jié)炎中，Klebsiella肺炎中增殖的γδ-TCR+細(xì)胞(E.Hermann,B.Sucke,U.Droste,K.-H Meyer zum Buschenfelde,Arthtisis Rheum.38,1277-1282,(1995))或?qū)ψ陨戆畜w，Daudi細(xì)胞系或感染了腸細(xì)菌的B細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性的γδ-TCR+細(xì)胞(E.Hermann,B.Ackermann,R.Duchmann,K.-H.Meyer zum Buschenfelde,Clin.Exp.Rheumatol.13,187-191,(1995))由滑液中分離得到。按照脊椎關(guān)節(jié)炎的病理機(jī)制推論，γδ-TCR+細(xì)胞可能在抗感染致關(guān)節(jié)炎的細(xì)菌的細(xì)胞或自身相同的炎癥“應(yīng)激”組織的早期防御機(jī)制中起作用(E.Hermann,B.Ackermann,R.Duchmann,K.-H.Meyer zum Buschenfelde,Clin.Exp.Rheumatol.13,187-19l,(1995)。另一個(gè)著眼于HLA-B27肽特異性γδ-TCR+細(xì)胞作用的觀(guān)察是在實(shí)驗(yàn)自身免疫眼色素層炎(EAU)的動(dòng)物模型中進(jìn)行。從由口服產(chǎn)生眼色素層炎自身抗性S-Ag肽或交叉反應(yīng)肽B27PD誘導(dǎo)耐受的大鼠轉(zhuǎn)移出來(lái)的γδ-TCR+細(xì)胞能夠以抗原特異的形式抑制眼色素層炎(G.Wildner,T.Hunig,S.Thurau,Eur.J.Immunol.26,2140-48,(1996))。在結(jié)果中能夠獲得具有對(duì)源于HLA-B抗原B27肽的特異性的γδ-TCR+細(xì)胞，其中與疾病有關(guān)的HLA-B抗原B27可能與免疫調(diào)節(jié)，甚至下調(diào)人類(lèi)關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎中的炎癥有關(guān)。這項(xiàng)在以上文描述檢測(cè)方法進(jìn)行的觀(guān)察中，健康者，HLA-B27陽(yáng)性血捐獻(xiàn)者的周邊T細(xì)胞與B27PA*肽反應(yīng)這一現(xiàn)象與后期可能性并不矛盾。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)Wildner,Gerhild(B)街道Rupprechtstrasse 8a(C)城市Munich(E)國(guó)家Germany(F)郵編(ZIP):80636(ⅱ)發(fā)明題目用作自身免疫疾病的診斷和治療劑的肽(ⅲ)序列數(shù)11個(gè)(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(Ⅴ)目前申請(qǐng)數(shù)據(jù)申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP97/05124(Ⅵ)先有申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朌E 196 38 108.08(B)申請(qǐng)日18-SEP-1996(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假說(shuō)的非(ⅴ)片段類(lèi)型內(nèi)部的(ⅵ)原始來(lái)源(A)生物人類(lèi)
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…21(D)其它信息/標(biāo)記=來(lái)自HLA-B27的α-1-結(jié)構(gòu)域的肽B27PA(氨基酸60-80)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln Thr Asp Arg1 5 10 15Glu Asn Leu Arg Thr20(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假說(shuō)的非(ⅴ)片段類(lèi)型內(nèi)部的(ⅵ)原始來(lái)源(B)生物人類(lèi)(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…13(D)其它信息/標(biāo)記=來(lái)自HLA-B27的α-1-結(jié)構(gòu)域的肽B27PA*(氨基酸60-72)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln1 5 10(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假說(shuō)的非(ⅴ)片段類(lèi)型內(nèi)部的(ⅵ)原始來(lái)源(C)生物人類(lèi)(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…10(D)其它信息/標(biāo)記=來(lái)自HLA-B27的α-2-結(jié)構(gòu)域的肽B27PB(氨基酸109-118)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述Leu Leu Arg Gly Tyr His Gln Asp Ala Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假說(shuō)的非(ⅴ)片段類(lèi)型內(nèi)部的
(ⅵ)原始來(lái)源(D)生物人類(lèi)(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…15(D)其它信息/標(biāo)記=來(lái)自HLA-B27的α-2-結(jié)構(gòu)域的肽B27PC(氨基酸151-165)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述Arg Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Cys Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假說(shuō)的非(ⅴ)片段類(lèi)型內(nèi)部的(ⅵ)原始來(lái)源(E)生物人類(lèi)(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…13(D)其它信息/標(biāo)記=來(lái)自人類(lèi)角蛋白Ⅵ的肽Ker333(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述Leu Asp Leu Asp Ser Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Glu1 5 10 15Ile Ala Asn Arg Ser20(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=1-2個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Trp或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置3(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=4-5個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Cys-Lys-Ala或，例如由Ker33衍生的肽中的Ala-Gly-Val。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置9(C)其它信息/標(biāo)記“Xaa=6-8個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Thr-Asp/Tyr-arg-Glu-Asn/Asp/Ser-Leu或，例如由Ker33衍生的肽中的Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置11(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=1-2個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Thr or Ile或，例如由Ker33衍生的肽中的Ser。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…11(D)其它信息/標(biāo)記=衍生于肽B27PA或肽Ker333的肽，如果合適，在其C或N端延長(zhǎng)或截短(截短通常限于至少6個(gè)氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Gln Xaa Arg Xaa1 5 10(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=1-2個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Trp或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置3(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=4-5個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Arg-Glu-Thr-Gln或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu-Asp-Ser-Ile。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域
(B)位置5(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=3-4個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Cys-Lys-Ala或，例如由Ker33衍生的肽中的Ala-Glu-Val。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置9(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=6-8個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Thr-Asp/Tyr-Arg-Glu-Asn/Asp/Ser-Leu或，例如由Ker33衍生的肽中的Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置11(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=1-2個(gè)氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的ThrorIle或，例如由Ker33衍生的肽中的Ser。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…11(D)其它信息/標(biāo)記=衍生于肽B27PA或肽Ker333的肽，如果合適，在其C或N端延長(zhǎng)或截短(截短通常限于至少6個(gè)氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Glu Xaa Arg Xaa1 5 10(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型
(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=1-2個(gè)氨基酸，例如，Trp。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置3(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=4-5個(gè)氨基酸，例如，Arg-Glu-Thr-Gln。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置5(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=3-4個(gè)氨基酸，例如Cys-Lys-Ala。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…8(D)其它信息/標(biāo)記=衍生于肽B27PA*如果合適，在其C或N端延長(zhǎng)或截短(截短通常限于至少6個(gè)氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Gln1 5(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅸ)特征’
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=1-2個(gè)氨基酸，例如，Trp。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置3(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=4-5個(gè)氨基酸，例如，Arg-Glu-Thr-Gln。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置5(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=3-4個(gè)氨基酸，例如Cys-Lys-Ala。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…8(D)其它信息/標(biāo)記=衍生于肽B27PA*如果合適，在其C或N端延長(zhǎng)或截短(截短通常限于至少6個(gè)氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Glu1 5(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置1
(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=1-5個(gè)氨基酸，例如，衍生于B27PB的肽中的Leu，或，衍生于B27PC的Arg-Val-Ala-Glu-Gln。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置4(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=1個(gè)氨基酸，例如，衍生于B27PB的肽中的Gly，或，衍生于B27PC的Ala。
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞區(qū)域(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記“Xaa=0-6個(gè)氨基酸，例如，衍生于B27PB的肽中的His-Gln-Asp-Ala-Tyr，或，衍生于B27PC的Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val.
(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…6(D)其它信息/標(biāo)記=衍生于肽B27PB或肽B27PC，如果合適，在其C或N端延長(zhǎng)或截短(截短通常限于至少6個(gè)氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述Xaa Leu Arg Xaa Tyr Xaa1 5(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列描述(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假說(shuō)的非(ⅴ)片段類(lèi)型內(nèi)部的
(ⅵ)原始來(lái)源(A)生物人類(lèi)(ⅸ)特征’(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置1…14(D)其它信息/標(biāo)記=可比于肽B27PD(ⅹ)公開(kāi)信息(A)作者Wildner,GerhildThurau Stephan(C) 雜志Eur.J,Immunol.
(D) 卷24(E) 頁(yè)2579-2585(F) 日期1994(ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述Ala Leu Asn Glu Asp Leu Sar Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr1 5 10
權(quán)利要求
1．含有以下用來(lái)診斷和/或治療HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的下列通式序列的一個(gè)或多個(gè)肽的應(yīng)用BL1-X-BL2-Y-BL3-Z或BL1-X-BL2-Y-BL3Z-BL4-W-BL5其中BL1表示1到2個(gè)氨基酸，X表示天冬氨酸，BL2表示4到5個(gè)氨基酸，Y表示異亮氨酸，BL3表示3到4個(gè)氨基酸，Z表示Lys-Ala-Gln或Lys-Ala-Glu,BL4表示6到8個(gè)氨基酸，W表示精氨酸，BL5表示1到2個(gè)氨基酸，單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)的插入，刪除，替代，修飾和轉(zhuǎn)換(Inversion)也包括在內(nèi)，合適的話(huà)，包括C-末端和/或N-末端呈現(xiàn)相應(yīng)的氨基酸殘基，糖基，脂肪酸殘基或烷基/鏈烯殘基(C1-C16)，和/或在C-末端和/或N-末端截除相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
2．權(quán)利要求1的用途，其中，肽Trp-Asp-Arg-Glu--Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr或由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)的肽的應(yīng)用。
3．權(quán)利要求1的用途，其中，肽Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln或由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)的肽的應(yīng)用。
4．權(quán)利要求1的用途，其中，肽Leu-Asp-Leu-Asp-SeR-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser或由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)的肽的應(yīng)用。
5．含有以下用來(lái)診斷和/或治療HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病的通式序列的一個(gè)或多個(gè)肽的應(yīng)用BL6-O-BL7-M-BL8其中BL6表示1到5個(gè)氨基酸，O表示Leu-Arg,BL7表示1個(gè)氨基酸，M表示酪氨酸，及BL8表示0到6個(gè)氨基酸，單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)的插入，刪除，替代，修飾和轉(zhuǎn)換也包括在內(nèi)，合適的話(huà)，包括C-末端和/或N-末端呈遞相應(yīng)的氨基酸殘基，糖基，脂肪酸殘基或烷基/鏈烯殘基(C1-C16)，和/或在C-末端和/或N-末端截除相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
6．權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中，肽Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr或由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)的肽的應(yīng)用。
7．權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中，肽Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val或由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)的肽的應(yīng)用。
8權(quán)利要求1到7中定義的用于HLA-依賴(lài)自身免疫性疾病診斷和/或治療的一個(gè)或多個(gè)肽以合適的順序的結(jié)合應(yīng)用。
9．權(quán)利要求1到7中定義的用于HLA-Ⅰ類(lèi)相關(guān)或HLA-Ⅱ類(lèi)相關(guān)的依賴(lài)自身免疫性疾病診斷和/或治療的一個(gè)或多個(gè)肽的應(yīng)用。
10．權(quán)利要求10的，權(quán)利要求1到7中定義的用于以下非-HLA-B27相關(guān)自身免疫性疾病診斷和/或治療的一個(gè)或多個(gè)肽的應(yīng)用。這些疾病包括虹膜炎，眼色素層炎，銀屑病或風(fēng)濕病。
11．權(quán)利要求10的，權(quán)利要求1到7中定義的用于風(fēng)濕病綜合征如關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎或青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷和/或治療的一個(gè)或多個(gè)肽的應(yīng)用。
12．權(quán)利要求1到7中定義的用于HLA-B27相關(guān)自身免疫性疾病診斷和/或治療的一個(gè)或多個(gè)肽的應(yīng)用。
13．權(quán)利要求12的，權(quán)利要求1到7中定義的用于關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(Bechterew′s疾病)，銀屑病關(guān)節(jié)炎，青少年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，虹膜炎，眼色素層炎或銀屑病的診斷和/或治療的一個(gè)或多個(gè)肽的應(yīng)用。
14以含有給予權(quán)利要求1到7中定義的一個(gè)或多個(gè)肽為特點(diǎn)的，治療患有HLA-依賴(lài)的自身免疫性疾病病人的治療方法。
15．以含有給予人體權(quán)利要求1到7中定義的一個(gè)或多個(gè)肽為特點(diǎn)的，體內(nèi)診斷人HLA-依賴(lài)的自身免疫性疾病的方法。
16．用于診斷HLA-依賴(lài)性自身免疫性疾病的試劑盒，其中包括權(quán)利要求1到7中定義的一個(gè)或多個(gè)肽以及測(cè)試中所需的其它試劑。
17．具有下列序列的肽Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr或具有由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)序列的肽。
18．具有下列序列的肽Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln或具有由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)序列的肽。
19．具有下列序列的肽Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser或具有由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)序列的肽。
20．具有下列序列的肽Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr或具有由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)序列的肽。
21．具有下列序列的肽Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val或具有由上文提及的序列通過(guò)替代，修飾，刪除，插入和/或末端加入單個(gè)氨基酸或相對(duì)較小的氨基酸集團(tuán)衍生而來(lái)序列的肽。
22．通過(guò)常規(guī)方式按正確順序?qū)被徇B接起來(lái)，制備按照權(quán)利要求18到22之一的肽的方法。
全文摘要
本發(fā)明述及由HLA－B27的α1，α2功能域或人類(lèi)角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽，以及這種特定的由HLA－B27α1，α2功能域或人類(lèi)角蛋白Ⅵ衍生而來(lái)的肽在HLA－依賴(lài)性自身免疫疾病的診斷及治療中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P19/02GK1237981SQ97199833
公開(kāi)日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1997年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月18日
發(fā)明者格希爾德·韋爾納 申請(qǐng)人:格希爾德·韋爾納