專(zhuān)利名稱(chēng)：可溶性β－淋巴毒素受體和抗淋巴毒素受體的抗體以及抗淋巴毒素配體的抗體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含封閉β-淋巴毒素受體信號(hào)傳導(dǎo)的“β-淋巴毒素受體封閉劑”的組合物和方法。β-淋巴毒素受體封閉劑可用于治療免疫性疾病，更具體地用于抑制抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)地址素的表達(dá)和細(xì)胞運(yùn)輸，以及影響小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞的分化。本發(fā)明也涉及可溶形式的β-淋巴毒素受體胞外域，以及針對(duì)β-淋巴毒素受體或其配體、表面淋巴毒素產(chǎn)生的抗體，它們可作用為β-淋巴毒素受體的封閉劑。
背景技術(shù)：
獲得性免疫由兩部分組成，它們能夠聯(lián)合作用以達(dá)到清除抗原的共同目標(biāo)，但它們受免疫系統(tǒng)的不同部分介導(dǎo)以達(dá)到不同的效果。獲得性免疫反應(yīng)的一部分，體液免疫，主要是由B細(xì)胞和循環(huán)抗體介導(dǎo)。另一部分，被稱(chēng)為細(xì)胞的或細(xì)胞介導(dǎo)免疫，由合成和釋放細(xì)胞因子以影響其它細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)。
B細(xì)胞對(duì)大多數(shù)抗原應(yīng)答活化和分化需要(1)B細(xì)胞通過(guò)它們抗原特異的受體、膜免疫球蛋白接受抗原信號(hào)，并且(2)B細(xì)胞接受來(lái)自活化T細(xì)胞的接觸依賴(lài)型和非依賴(lài)型信號(hào)。B細(xì)胞CD40受體與活化的T輔助細(xì)胞上表達(dá)的CD40配體的連接產(chǎn)生接觸依賴(lài)型共刺激信號(hào)。(Laman等，Crit.Rev.Immunol.,16，第59-108頁(yè)(1996)；Van Kooten和Banchereau，免疫學(xué)進(jìn)展，61，第1-77頁(yè)(1996))。非接觸依賴(lài)型信號(hào)是由活化的T細(xì)胞合成和釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)的。接觸依賴(lài)型和非依賴(lài)型信號(hào)共同驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞分化為(1)記憶B細(xì)胞，當(dāng)?shù)诙谓佑|抗原時(shí)，它將介導(dǎo)更快的反應(yīng)，或(2)分泌抗體的漿細(xì)胞。漿細(xì)胞是B細(xì)胞的終末分化階段，合成和分泌抗體。
T輔助細(xì)胞(“Th”)在免疫系統(tǒng)中起多種作用。已表明免疫攻擊開(kāi)始時(shí)由Th細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子影響了隨后活化的免疫效應(yīng)途徑。Th細(xì)胞的活化是通過(guò)其抗原特異的受體與呈現(xiàn)于抗原呈遞細(xì)胞(APCs)表面的多肽片段相互作用實(shí)現(xiàn)的，這些多肽片段是與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合的經(jīng)加工后的外來(lái)抗原。反過(guò)來(lái)，活化的Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(淋巴因子)以活化合適的免疫效應(yīng)機(jī)制。
根據(jù)其細(xì)胞因子的分泌形式，Th細(xì)胞可分成三個(gè)亞群Tho,Th1和Th2(Fitch等，免疫學(xué)年鑒，11，第29-48頁(yè)(1993))。在小鼠中，未經(jīng)刺激的“天然”T輔助細(xì)胞合成IL-2。Th細(xì)胞的短期刺激可使Tho前體細(xì)胞合成包括IFN-α,IL-2,IL-4,IL-5和IL-10的多種細(xì)胞因子。Tho細(xì)胞的慢性刺激可使之分化成Th1或Th2細(xì)胞，于是細(xì)胞因子的表達(dá)形式發(fā)生了改變。某些細(xì)胞因子如IL-3,GM-CSF和TNF可由Th1和Th2細(xì)胞共同釋放。其它細(xì)胞因子只能由一種Th細(xì)胞亞群合成(Romagnani等，免疫學(xué)年鑒，12，第227-57頁(yè)(1994))。Th1細(xì)胞合成LT-α、IL-2和IFN-γ以活化巨噬細(xì)胞和與細(xì)胞免疫相關(guān)的炎癥反應(yīng)并抵抗細(xì)胞內(nèi)感染。
Th2細(xì)胞合成細(xì)胞因子IL-4,IL-5,IL-6和IL-10以增加嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞并促進(jìn)B細(xì)胞的擴(kuò)展和成熟。(Howard等，“T-細(xì)胞起源的細(xì)胞因子及其受體”，基礎(chǔ)免疫學(xué)，第3版；RavenPress,New york(1993))。Th2細(xì)胞也參與了產(chǎn)生B細(xì)胞記憶的產(chǎn)生、體細(xì)胞突變以及親和性成熟，并參與了調(diào)節(jié)從頭免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換。例如，Th2細(xì)胞因子IL-4使活化的B細(xì)胞轉(zhuǎn)換成IgG1同時(shí)抑制其它同種型。IL-4也刺激Ⅰ型超敏反應(yīng)中IgE的過(guò)量合成。Th2細(xì)胞因子IL-5誘導(dǎo)粘膜免疫中重要的IgA。
次級(jí)淋巴組織如淋巴結(jié)(LN)、脾和粘膜淋巴組織可有效地捕捉和富集外來(lái)物質(zhì)，因此是T和B淋巴細(xì)胞的抗原驅(qū)動(dòng)活化和分化的主要部位。這些過(guò)程依賴(lài)于這些組織中細(xì)胞的多樣性和組成，提供了體液免疫反應(yīng)諸多方面的框架如T/B細(xì)胞相互作用、生發(fā)中心(GC)形成、親和性成熟，免疫球蛋白類(lèi)別轉(zhuǎn)換和細(xì)胞運(yùn)輸(Klein,J.，免疫學(xué)，JohnWiley和Sons(1982))。還未完全弄清外周淋巴組織發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能維持的分子機(jī)制。
盡管次級(jí)淋巴組織的整體結(jié)構(gòu)明顯不同并且哺乳動(dòng)物綱的不同種之間有差異，這些次級(jí)淋巴組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)有些共同特征，如<1>抗原可接近性，<2>結(jié)構(gòu)特征保證抗原與淋巴細(xì)胞持續(xù)接觸，<3>T細(xì)胞富集區(qū)圍繞著B(niǎo)細(xì)胞，<4>B細(xì)胞富集的濾泡，<5>邊緣區(qū)型位點(diǎn)，<6>特化的內(nèi)皮細(xì)胞，以及<7>抗體合成位點(diǎn)，這一點(diǎn)將在下文進(jìn)一步詳述。
次級(jí)淋巴組織可接觸到系統(tǒng)中的抗原。例如，抗原可通過(guò)竇狀血供應(yīng)與脾接觸，通過(guò)輸入淋巴管與LN接觸，并可通過(guò)特化的上皮細(xì)胞運(yùn)送到粘膜淋巴組織。
各種物種中的次級(jí)淋巴組織也有某些共同的結(jié)構(gòu)特征如小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞(FDC)和交錯(cuò)突細(xì)胞(IDC)，它們保證組織中淋巴細(xì)胞富集區(qū)域抗原的持續(xù)呈遞。
另一共同特征是T細(xì)胞富集區(qū)域圍繞著B(niǎo)細(xì)胞。T細(xì)胞富集區(qū)域包括，例如，脾臟白髓的動(dòng)脈周?chē)馨颓屎蚅N的皮質(zhì)，它們包含大量的循環(huán)T細(xì)胞和IDC，繼而作為T(mén)和B細(xì)胞的附屬細(xì)胞。
另外，通常情況下，淋巴組織在脾的白髓和LN的皮質(zhì)內(nèi)有B細(xì)胞富集的初級(jí)和次級(jí)濾泡。這些淋巴組織中的次級(jí)濾泡也被稱(chēng)為生發(fā)中心(GC)并且有一個(gè)濃密的FDC網(wǎng)絡(luò)以捕捉和呈遞抗原。
邊緣區(qū)型區(qū)域定義為鼠脾的組織學(xué)區(qū)域和人次級(jí)淋巴器官中較為彌散的位點(diǎn)。這些區(qū)域主要包括邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞(MZM)、噬金屬性巨噬細(xì)胞(MM)、邊緣區(qū)B細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞，但也可包括T細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞(Kraal,Int.Rev.Cytol,132，第31-74頁(yè)(1992))。動(dòng)脈血流入邊緣區(qū)域使抗原與這些細(xì)胞直接接觸并促進(jìn)這個(gè)部位對(duì)抗原的細(xì)胞反應(yīng)(Kraal,Int.Rev.Cytol.,132，第31-74頁(yè)(1992))。MZM的存在對(duì)于B細(xì)胞在脾白髓中的最佳運(yùn)輸是必需的(Kraal,1992；Kraal等，免疫學(xué)，68，第227-232頁(yè)(1989))。
通常，血淋巴細(xì)胞通過(guò)特化的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入次級(jí)淋巴組織，如淋巴結(jié)的微靜脈內(nèi)皮襯(毛細(xì)血管后微靜脈-HEV)和邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)中的脾血竇狀隙的內(nèi)皮襯。這種內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子和地址素，在細(xì)胞向次級(jí)淋巴組織的運(yùn)輸中發(fā)揮作用。例如，外周淋巴結(jié)地址素(PNAd)與粘膜淋巴結(jié)地址素、MAdCAM-1不同，參與了淋巴細(xì)胞向粘膜淋巴組織包括腸系膜淋巴結(jié)、淋巴集結(jié)以及固有層的運(yùn)輸。
并非所有的地址素都得到清楚地鑒定，例如將淋巴細(xì)胞定位于脾臟的地址素仍未得到鑒定。地址素的重量作用包括促進(jìn)合適的抗原特異的淋巴細(xì)胞參與到免疫反應(yīng)中，以及隨后的免疫反應(yīng)在整個(gè)身體內(nèi)的傳播。
最后，可在與由抗原活化的前體B不同的部位檢測(cè)到產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。例如，脾紅髓內(nèi)由漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體源自T細(xì)胞區(qū)B細(xì)胞的活化，淋巴結(jié)髓質(zhì)的漿細(xì)胞起源于同一節(jié)內(nèi)T細(xì)胞區(qū)內(nèi)活化的B細(xì)胞。同樣，骨髓內(nèi)漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體是脾和淋巴結(jié)內(nèi)活化的B細(xì)胞的衍生物，腸道固有層的漿細(xì)胞主要來(lái)源于腸系膜淋巴結(jié)或腸道淋巴組織內(nèi)活化的B細(xì)胞。
見(jiàn)例如，ICM Maclennan，“次級(jí)淋巴組織的結(jié)構(gòu)和功能”ClinicalAspects of Immunology第五版，P.J.Lachman,Sir D.K.Peters,F.S.Rosen,M.J.Walport，編，Blackwell Scientific Publications第13-30頁(yè)(1993)。
總的來(lái)說(shuō)，對(duì)T依賴(lài)型抗原的體液免疫反應(yīng)的細(xì)胞/組織事件如下(Toellner，等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，183，第2303-2312頁(yè)(1996))在誘發(fā)期，抗原進(jìn)入身體的最初幾天，天然B和T細(xì)胞被活化并參加到免疫反應(yīng)中。在脾臟中，例如，在二次反應(yīng)免疫后的12小時(shí)內(nèi)，記憶B細(xì)胞在邊緣區(qū)遇到來(lái)自血液的抗原然后離開(kāi)邊緣區(qū)進(jìn)入T細(xì)胞區(qū)。24小時(shí)內(nèi)可在T細(xì)胞區(qū)檢測(cè)到B細(xì)胞。在第二次接觸抗原后12小時(shí)內(nèi)可檢測(cè)到免疫球蛋白轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)錄子，這表明已經(jīng)發(fā)生了T-B細(xì)胞相互作用。然后B細(xì)胞轉(zhuǎn)移至出口區(qū)和紅髓內(nèi)增殖以形成B細(xì)胞母細(xì)胞并分化成漿細(xì)胞。B細(xì)胞也在IDC豐富的T細(xì)胞區(qū)繼續(xù)增殖。免疫后的4天內(nèi)，在生發(fā)中心增殖后，B記憶細(xì)胞形成開(kāi)始。在初次應(yīng)答中，發(fā)育好的生發(fā)中心在免疫后第10天比較明顯，14天時(shí)達(dá)到最大。
免疫后48-72小時(shí)，T細(xì)胞區(qū)內(nèi)T細(xì)胞增殖明顯，7天時(shí)達(dá)到高峰。T細(xì)胞的增殖歸因于T細(xì)胞依賴(lài)的B細(xì)胞的活化。隨著生發(fā)中心形成，T細(xì)胞區(qū)的增殖水平下降。T細(xì)胞也在生發(fā)中心增殖，同時(shí)，暗區(qū)的中心細(xì)胞(centrocytes)(B細(xì)胞)從IDC獲取抗原并將抗原呈遞至明區(qū)的T細(xì)胞。
T細(xì)胞依賴(lài)的抗原能夠活化邊緣區(qū)B細(xì)胞，地址素和粘附分子能夠?qū)⑿庐a(chǎn)生的天然B細(xì)胞和再循環(huán)淋巴細(xì)胞吸引至并保留在次級(jí)淋巴器官。天然B細(xì)胞與活化的B細(xì)胞在到達(dá)T細(xì)胞等方面具同樣的動(dòng)力學(xué)。T細(xì)胞依賴(lài)的反應(yīng)建成期次級(jí)淋巴器官濾泡中記憶B細(xì)胞的持續(xù)活化維持T細(xì)胞依賴(lài)反應(yīng)的建成期。在這個(gè)階段幾乎沒(méi)有天然B細(xì)胞的加入，這時(shí)的反應(yīng)主要是由保留于FDC上的抗原推動(dòng)。生發(fā)中心對(duì)于產(chǎn)生最佳記憶、同種型轉(zhuǎn)換、體細(xì)胞突變以及免疫球蛋白的親和性成熟是必需的。
淋巴細(xì)胞反應(yīng)的封固產(chǎn)生能夠以多種途徑在體內(nèi)循環(huán)的抗體，例如，抗體通過(guò)血液離開(kāi)脾臟，通過(guò)輸出淋巴管離開(kāi)淋巴結(jié)?？贵w由此遇到并與入侵的病原體結(jié)合。這種識(shí)別事件引發(fā)了一系列免疫效應(yīng)機(jī)制，包括補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的活化以及針對(duì)病原體對(duì)宿主進(jìn)行間接保護(hù)的細(xì)胞反應(yīng)。
抗體在某些病理反應(yīng)中也起一定的作用，如超敏反應(yīng)-與原來(lái)接觸過(guò)的抗原接觸后引發(fā)的不適當(dāng)?shù)幕虿幌喾Q(chēng)的免疫反應(yīng)。超敏反應(yīng)有四種類(lèi)型。
Ⅰ型“即發(fā)型超敏反應(yīng)”涉及過(guò)敏原誘發(fā)的Th2細(xì)胞活化以及Th2細(xì)胞因子釋放。Th2細(xì)胞因子IL-4刺激B細(xì)胞進(jìn)行同種型轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生IgE，繼而活化肥大細(xì)胞以產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致濕疹、哮喘和鼻炎。
Ⅱ型和Ⅲ型超敏反應(yīng)是由，針對(duì)細(xì)胞表面抗原或特異的組織抗原(Ⅱ型)或形成循環(huán)免疫復(fù)合物的可溶性血清抗原(Ⅲ型)產(chǎn)生的IgG和IgM引起的。
Ⅳ型“遲發(fā)性”超敏反應(yīng)(DTH)是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)并可通過(guò)Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移在小鼠間轉(zhuǎn)移，但不能僅通過(guò)轉(zhuǎn)移血清實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。這一特征可將Ⅳ型超敏反應(yīng)與其它三類(lèi)超敏反應(yīng)區(qū)分開(kāi)，后者需要主要由抗體引起的體液免疫反應(yīng)并可通過(guò)無(wú)細(xì)胞血清轉(zhuǎn)移。(Roitt等，免疫學(xué)，第19.1-22.12頁(yè)(Mosby-Year Book Europe Ltd，第三版1993))。
病理體液免疫反應(yīng)與多種器官特異的和系統(tǒng)自身免疫條件有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，韋格內(nèi)氏肉芽腫病，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(PAN)，快速進(jìn)行性新月形腎小球型腎炎和自發(fā)性血小板減少紫癜，以及慢性炎癥疾病如突眼性甲狀腺腫和南美洲錐蟲(chóng)病。體液免疫反應(yīng)也參與移植組織和移植器官的排斥。
目前，利用免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑治療多種免疫疾病。通常使用的三種免疫抑制劑是類(lèi)固醇，環(huán)磷酰胺和咪唑硫嘌呤。
類(lèi)固醇是多效抗炎劑，它可逆轉(zhuǎn)許多病理T細(xì)胞效應(yīng)以抑制活化的巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的活性。環(huán)磷酰胺是烷化劑，通過(guò)抑制DNA復(fù)制和修復(fù)介導(dǎo)細(xì)胞死亡。咪唑硫嘌呤是抗增殖劑，可抑制DNA合成。這些非特異性免疫抑制劑需要的用量高因此增加了毒性(如腎和肝毒性)并帶來(lái)副作用。因此它們不適于長(zhǎng)期治療。
由此，需要其它的試劑和治療方法以克服由常規(guī)治療帶來(lái)的問(wèn)題。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)提供用于治療免疫疾病的藥物組合物和方法來(lái)解決上述問(wèn)題，其中使用β-淋巴毒素受體封閉劑抑制β-淋巴毒素受體(LT-β-R)信號(hào)傳導(dǎo)。更詳細(xì)地說(shuō)，此組合物和方法包含LT-β-R封閉劑，它可有效抑制抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)地址素表達(dá)水平和細(xì)胞運(yùn)輸，影響小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞分化以及改變病理?xiàng)l件如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自發(fā)性血小板減少紫癜時(shí)產(chǎn)生的次級(jí)淋巴組織和相似淋巴結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)組成。另外，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于改變免疫復(fù)合物和B細(xì)胞的結(jié)合性。更具體地，本發(fā)明的方法可阻止抗原在細(xì)胞上的呈遞或沉積，或換言之，基本上溶解或清除已在細(xì)胞上呈遞的抗原。
在另一實(shí)施方案中，LT-β-R封閉劑選自由可溶性淋巴毒素-β-R、直接針對(duì)LT-β-R產(chǎn)生的抗體和針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供可溶形式的淋巴毒素-β受體胞外結(jié)構(gòu)域作為L(zhǎng)T-β-R封閉劑。此實(shí)施方案的優(yōu)選組合物和方法包含的，具有與免疫球蛋白恒定區(qū)重鏈區(qū)域融合的LT-β-R胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組淋巴毒素-β受體融合蛋白。更優(yōu)選地，LT-β-R配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人的IgG Fc區(qū)域融合。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了作為L(zhǎng)T-β-R封閉劑的抗體。此實(shí)施方案的優(yōu)選組合物和方法包含一個(gè)或多個(gè)針對(duì)β-淋巴毒素受體產(chǎn)生的抗體。更優(yōu)選地，此抗體為單克隆抗體。此實(shí)施方案的其它優(yōu)選組合物和方法包含一個(gè)或多個(gè)針對(duì)表面淋巴毒素產(chǎn)生的抗體。更優(yōu)選地，此抗體是針對(duì)β-淋巴毒素產(chǎn)生的單克隆抗體。優(yōu)選的抗體包括抗人BT-β-RmAb BDA8和抗人LT-βmAb B9。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)施用含有治療有效劑量的LT-β-R封閉劑的藥物組合物以改變動(dòng)物體液免疫反應(yīng)的方法。在某些其它實(shí)施方案中，藥物組合物以足夠包被LT-β-R陽(yáng)性細(xì)胞的劑量施用1-14天。此藥物組合物可在某些實(shí)施方案中進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體或佐劑。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用上述LT-β-R封閉劑抑制LT-β-R信號(hào)而不抑制TNF-R信號(hào)。治療、預(yù)防或消除哺乳動(dòng)物中人免疫缺陷病毒的方法也包含在本發(fā)明中，包括單獨(dú)或與藥物載體、佐劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于治療或減輕HIV或AIDS的藥物結(jié)合使用LT-β-R封閉劑。
另外，本發(fā)明涉及移植領(lǐng)域，即移植排斥的治療方法。具體地，某些實(shí)施方案涉及了CD40途徑的封閉劑與LT途徑封閉劑的聯(lián)合使用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是編碼人LTβ受體胞外區(qū)，即配體結(jié)合區(qū)域的序列。
圖2是對(duì)接受了LT-R-Ig或LFA-3-Ig融合蛋白和抗原多次注射后的小鼠脾的免疫組織化學(xué)分析。
圖3是免疫組織化學(xué)分析，表明LT-R-Ig處理以及MR-1(抗CD40配體的抗體)處理的小鼠脾中缺乏生發(fā)中心，并且MR-1而不是LT-β-R-Ig處理的小鼠脾中出現(xiàn)小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞。以圖2中描述的方法注射融合蛋白和SRBC抗原。
圖4是免疫組織化學(xué)分析，表示了以LT-β-R-Ig連續(xù)處理子宮內(nèi)及出生后的小鼠淋巴結(jié)中地址素表達(dá)的改變。
圖5是對(duì)以LT-β-R-Ig連續(xù)處理子宮內(nèi)及出生后的小鼠(同圖4)的腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞定位及巨噬細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。
圖6是免疫組織化學(xué)分析，表示了用LT-β-R-Ig處理小鼠抑制了針對(duì)SRBC的抗體反應(yīng)。
圖7表示了捕捉于FDC上的免疫復(fù)合物。
發(fā)明詳述為了使在此所述的發(fā)明被完全理解，先進(jìn)行以下詳細(xì)的描述。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白應(yīng)答”或“體液應(yīng)答”指動(dòng)物對(duì)外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答，由此動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)外來(lái)抗原的抗體。T輔助細(xì)胞中的Th2類(lèi)對(duì)于有效產(chǎn)生高親和性的抗體是重要的。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“生發(fā)中心”指抗原免疫后形成的次級(jí)B細(xì)胞濾泡。這個(gè)組織位點(diǎn)與抗體反應(yīng)中產(chǎn)生最佳記憶，型別轉(zhuǎn)換，體細(xì)胞超突變及親和性成熟相關(guān)。
術(shù)語(yǔ)“邊緣區(qū)”或“邊緣-區(qū)型區(qū)域”指組織學(xué)上描述的次級(jí)淋巴組織的部分，主要包括邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞(MZM)，嗜金屬巨噬細(xì)胞(MM)，邊緣區(qū)B細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞，以及T細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞。動(dòng)脈血流開(kāi)口于邊緣竇從而使抗原與這些細(xì)胞直接接觸以促進(jìn)此位點(diǎn)針對(duì)抗原的細(xì)胞反應(yīng)。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“地址素”指參與淋巴細(xì)胞定位于次級(jí)淋巴器官的分子。這樣的分子表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，尤其是淋巴結(jié)中的毛細(xì)血管后微靜脈。脾地址素還未確定。MAdCAM-1是粘膜地址素，PNAd是外周地址素。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“T輔助(Th)細(xì)胞”指T細(xì)胞的功能性亞類(lèi)，它有助于產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞并與B細(xì)胞合作以刺激產(chǎn)生抗體。輔助T細(xì)胞與Ⅱ類(lèi)主要組織相容性復(fù)合物聯(lián)合識(shí)別抗原并向效應(yīng)細(xì)胞提供接觸依賴(lài)型或非接觸依賴(lài)型(細(xì)胞因子)信號(hào)。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”，指在細(xì)胞間傳遞信號(hào)的分子?！傲馨鸵蜃印敝赣闪馨图?xì)胞釋放的細(xì)胞因子。
術(shù)語(yǔ)“Th2”指T輔助細(xì)胞的一個(gè)亞類(lèi)，它產(chǎn)生LTα,γ干擾素和IL-2(及其它細(xì)胞因子)；它與細(xì)胞即非免疫球蛋白應(yīng)答聯(lián)合引發(fā)針對(duì)攻擊的炎癥反應(yīng)。
術(shù)語(yǔ)“Th2”指T輔助細(xì)胞的一個(gè)亞類(lèi)，它產(chǎn)生細(xì)胞因子，如IL-4,IL-5,IL-6和IL-10從而與針對(duì)攻擊的免疫球蛋白(體液)應(yīng)答聯(lián)合作用。
術(shù)語(yǔ)抗體的“Fc區(qū)域”指分子的一部分，包括絞鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū)，但缺少抗原結(jié)合位點(diǎn)。此術(shù)語(yǔ)也包括IgM或其它抗體同種型的相應(yīng)區(qū)域。
術(shù)語(yǔ)“抗LTβ受體的抗體”指能夠與LTβ受體的至少一個(gè)表位特異結(jié)合的任何抗體。
術(shù)語(yǔ)“抗LT的抗體”指能夠與LTα,LTβ或LTα/β復(fù)合物的至少一個(gè)表位特異結(jié)合的任何抗體。
術(shù)語(yǔ)“LTβ-R信號(hào)傳導(dǎo)”指與LTβ-R途徑相關(guān)的分子反應(yīng)以及由此產(chǎn)生的隨后的分子反應(yīng)。
術(shù)語(yǔ)“LTβ-R封閉劑”指一種因子，它可減少配體與LTβ-R結(jié)合、細(xì)胞表面LTβ-R成簇或LTβ-R信號(hào)傳導(dǎo)，或能夠影響LTβ-R信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的解釋。
在配體-受體結(jié)合步驟起作用的LTβ-R封閉劑能抑制配體與LTβ-R的結(jié)合至少20％。Tβ-R封閉劑的例子包括可溶性LTβ-R-Fc分子及抗LTα、LTβ、LTα/β和LTβ-R的抗體。優(yōu)選地，這些抗體不與分泌形式的LTα發(fā)生交叉反應(yīng)。
術(shù)語(yǔ)“LTβ-R生物學(xué)活性”指1)LTβ-R分子或其衍生物與可溶的或表面LTβ-R分子競(jìng)爭(zhēng)與可溶的或表面LT配體結(jié)合的能力；或2)天然LTβ活性如刺激免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答或細(xì)胞毒性活性的能力。
術(shù)語(yǔ)“LT配體”指能夠與LTβ受體特異性結(jié)合的LTα/β異源復(fù)合物或其衍生物。
術(shù)語(yǔ)“LTβ-R配體結(jié)合區(qū)域”指參與特異地識(shí)別并與LT配體相互作用的LTβ-R部分。
術(shù)語(yǔ)“表面LT”和“表面LT復(fù)合物”指包含LTα和展示于細(xì)胞表面的膜結(jié)合的LTβ亞單位-包括突變、改變的以及一個(gè)或多個(gè)亞單位的嵌合形式-的復(fù)合物?！氨砻鎀配體”指能夠與LTβ受體特異結(jié)合的表面LT復(fù)合物或其衍生物。
術(shù)語(yǔ)“受試者”指動(dòng)物或來(lái)自動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。優(yōu)選地，此動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。細(xì)胞可以任何形式出現(xiàn)，包括但不限于保留于組織中的細(xì)胞，細(xì)胞簇，固定的、轉(zhuǎn)染的或未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以及來(lái)自生理或表型改變的動(dòng)物的細(xì)胞。β淋巴毒素TNF家族的成員腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的細(xì)胞因子是宿主防御和免疫調(diào)節(jié)的大家族。此家族的成員可以膜結(jié)合形式通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸局部作用，或以分泌蛋白的形式對(duì)遠(yuǎn)距離目標(biāo)起作用。TNF相關(guān)受體的平行家族與這些細(xì)胞因子反應(yīng)從而引發(fā)包括細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、組織分化和促炎反應(yīng)在內(nèi)的多種途徑。
TNF,α-淋巴毒素(LTα，也稱(chēng)作TNFβ)和β-淋巴毒素(LTβ)是TNF配體家族的成員，此家族也包括Fas,CD27,CD30,CD40,OX-40和4-1BB受體的配體(Smith等，細(xì)胞，76，第959-62頁(yè)(1994))。TNF家族幾個(gè)成員-包括TNF,LTα,LTβ和Fas-的信號(hào)傳導(dǎo)能夠通過(guò)壞死或凋亡(程序細(xì)胞死亡)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。在非致瘤細(xì)胞中，TNF和許多TNF家庭配體-受體相互作用影響免疫系統(tǒng)發(fā)育和對(duì)多種免疫攻擊的應(yīng)答。
多數(shù)膜相關(guān)的LTα/β復(fù)合物(“表面LT”)具有LTα1/β2化學(xué)計(jì)量。(Browning等，細(xì)胞，72，第847-56頁(yè)(1993)；Browning等，免疫學(xué)雜志，154第33-46頁(yè)(1995))。表面LT配體不與TNF-R以高親和力結(jié)合也不活化TNF-R信號(hào)通路。LTβ受體(LTβ-R)并不以高親和力與這些表面淋巴毒素復(fù)合物結(jié)合(Crone等，科學(xué)，264，第707-10頁(yè)(1994))。
LTβ-R信號(hào)傳導(dǎo)與TNF-R信號(hào)傳導(dǎo)一樣，具抗增殖效應(yīng)并對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性。在申請(qǐng)人共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/378,968中，公開(kāi)了用LTβ-R活化因子選擇性地刺激LTβ-R的組合物和方法。LTβ-R活化因子可用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而不同時(shí)活化TNF-R誘導(dǎo)的促炎癥或免疫調(diào)節(jié)途徑。
最近的基因打靶研究證明LTα/β在次級(jí)淋巴器官發(fā)育中起作用(Banks等，免疫學(xué)雜志，155，第1685-1693頁(yè)(1995)；De Togni等，科學(xué)，264，第703-706頁(yè)(1994))。的確，缺失LTα的小鼠缺失淋巴結(jié)(LN)和淋巴集結(jié)(PP)。而且，其脾結(jié)構(gòu)遭到破壞，脾邊緣區(qū)細(xì)胞上功能標(biāo)記的表達(dá)也改變了(Banks等，1995；De Togni等，科學(xué)，264，第703-706頁(yè)(1994),Matsumoto等，科學(xué)，271，第1289-1291頁(yè)(1996))。TNF受體敲除小鼠中未發(fā)現(xiàn)這些特征的任何一個(gè)(Erickson等，自然372，第560-563頁(yè)(1994)；Pfeffer等，細(xì)胞，73，第457-467頁(yè)(1993)；Rothe等，自然，364，第798-802頁(yè)(1993))。申請(qǐng)人通過(guò)表明在懷孕期間注射與人IgG1Fc部分融合的可溶形式的鼠LTβ-R(LTβ-R-Ig)產(chǎn)生的子代小鼠缺乏大部分的淋巴結(jié)并有破壞的脾結(jié)構(gòu)，從而確定了膜LTα/β復(fù)合物在次級(jí)淋巴器官發(fā)育中的作用(Rennert等，1996，“表面淋巴毒素α/β復(fù)合物是周?chē)馨推鞴侔l(fā)育所必需的”實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，184,1999-2006)。在另一個(gè)研究中，含有相似LTβ-R-Ig構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后三天開(kāi)始表達(dá)LTβ-R-Ig，表明具有LN。然而，其脾結(jié)構(gòu)遭到破壞并且脾邊緣區(qū)細(xì)胞的幾個(gè)標(biāo)記未得到表達(dá)。(Ettinger等，“表達(dá)可溶性LTβ-R/IgG1融合蛋白的小鼠中脾結(jié)構(gòu)被破壞而淋巴結(jié)發(fā)育正常”美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)93:13102-7)。這些數(shù)據(jù)綜合表明膜LT對(duì)次級(jí)淋巴器官發(fā)育的調(diào)節(jié)效應(yīng)有時(shí)間要求，但對(duì)脾結(jié)構(gòu)的效應(yīng)沒(méi)有時(shí)間要求。
TNF系統(tǒng)在脾的發(fā)育中也起作用。TNF缺失小鼠的脾邊緣區(qū)細(xì)胞不表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)記或MAdCAM-1(Alexopoulou等，第60屆國(guó)際TNF會(huì)議，歐洲細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，第228頁(yè)(1996)；Pasparakis等，第60屆國(guó)際TNF會(huì)議，歐洲細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，第239頁(yè)(1996))。TNF-R75缺失小鼠也缺失脾邊緣區(qū)的MAdCAM-1(但不缺失MOMA-1)。(Neumann等，實(shí)驗(yàn)區(qū)學(xué)雜志，184，第259-264頁(yè)(1996),Matsumoto等，科學(xué)，271，第1289-1291頁(yè)(1996))。這些標(biāo)記在TNF-R75缺失小鼠中的表達(dá)正常(Matsumoto等，科學(xué)，271，第1289-1291頁(yè)(1996))。
淋巴樣組織不僅在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)，而且也在某些病理?xiàng)l件下如在被稱(chēng)為新淋巴器發(fā)生過(guò)程的慢性炎癥中出現(xiàn)(Picker和Butcher，免疫學(xué)年簽，10，第561-591頁(yè)(1992),Kratz等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，183，第1461-1471頁(yè)(1996))。顯然，TNF家族成員影響了這些過(guò)程。由大鼠胰島素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的TLα基因轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了LT誘導(dǎo)的有組織的淋巴組織特征的慢性炎癥病變(Kratz等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1183，第1461-1471頁(yè)(1996)；Picarella等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，89，第10036-10040頁(yè)(1992))。
用LTα缺失小鼠評(píng)估T細(xì)胞依賴(lài)的免疫反應(yīng)的功能，表明LT對(duì)于GC的形成，有組織的小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞(FDCs)結(jié)構(gòu)的維持，以及體液應(yīng)答是必需的(Banks等，免疫學(xué)雜志，155，第1685-1693頁(yè)(1995)；Matsumoto等，自然，382，第462-466頁(yè)(1996))。TNF-R55缺失小鼠也缺失FDCs，不能產(chǎn)生生發(fā)中心以及不能夠產(chǎn)生針對(duì)綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)的最佳抗體應(yīng)答。這表明TNF-R55也許是由引起這些反應(yīng)的可溶性LT或TNF信號(hào)引發(fā)的(Le Hir等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，183，第2367-2372頁(yè)(1996),Alexopoulou等，第60屆國(guó)際TNF會(huì)議，歐洲，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，第228頁(yè)(1996)；Pasparakis等，第60屆國(guó)際TNF會(huì)議，歐洲，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，第239頁(yè)(1996))。至今還未闡明表面LT/LTβ-R通路在體液免疫反應(yīng)中的作用。
LTβ受體是TNF受體家族的成員，特異地與表面LT配體結(jié)合。LTβ-R與LT異源復(fù)合物結(jié)合(主要是LTα1/β2和LTα2/β1)但不與TNF或LTα結(jié)合(Crowe等，科學(xué)，264，第707-10頁(yè)(1994))。LTβ-R mRNA存在于人的脾，胸腺以及參與免疫系統(tǒng)的一般器官中。
盡管對(duì)于LTβ-R表達(dá)的研究尚處于早期，LTβ-R表達(dá)方式與TNF-R55相似，只是在外周血T和B細(xì)胞以及T和B細(xì)胞系上缺乏LTβ-R。
已在高水平表達(dá)LT的CD4+T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(Ⅱ-23.D7)中鑒定了細(xì)胞表面淋巴毒素(LT)復(fù)合物(Browning等，免疫學(xué)雜志，147，第1230-37頁(yè)(1991)；Androlewicz等，生物化學(xué)雜志，267,第2542-47頁(yè)(1992)，兩者在此引用作為參考)。LTβ-R,LT亞基和表面LT復(fù)合物的表達(dá)及其生物學(xué)作用在C.F.Ware等，“淋巴毒素系統(tǒng)的配體和受體”，細(xì)胞溶解途徑，現(xiàn)代微生物學(xué)和免疫學(xué)專(zhuān)題，Springer-Verlag，第175-218頁(yè)(1995)中進(jìn)行綜述，特地在此引用作為參考。
LTα表達(dá)的誘導(dǎo)及LTα的分泌主要是由活化的T和B淋巴細(xì)胞以及自然殺傷(NK)細(xì)胞完成的。在T輔助細(xì)胞中，LTα是由Th1而不是由Th2細(xì)胞合成的。在黑色素細(xì)胞中也可檢測(cè)到LTα。多發(fā)性硬化病人病灶中的小膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞可被抗LTα抗血清染色(Selmaj等，臨床研究雜志，87，第949-954頁(yè)(1991))。
β淋巴毒素(也稱(chēng)為P33)在人和鼠T淋巴細(xì)胞，T細(xì)胞系，B細(xì)胞系和淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞的表面表達(dá)。LTβ是申請(qǐng)人共同未決的以WO92/00329公布于1992年1月9日的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US91/04588和以WO94/13808公布于1994年6月23日的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US93/11669的主體，在此引用作為參考。
表面LT復(fù)合物主要是由活化的T和B淋巴細(xì)胞以及自然殺傷(NK)細(xì)胞表達(dá)，這可通過(guò)FACS分析或用抗LTα抗體或可溶性LTβ-R-Ig融合蛋白作的免疫組織學(xué)確定。在于1995年7月21日申請(qǐng)的申請(qǐng)人共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/505,606中，公開(kāi)了用可溶性LTβ受體以及抗LTβ受體和配體的特異抗體作為治療方法用于由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性疾病。在人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)克隆活化的外周單核淋巴細(xì)胞(PML)、IL-2活化的外周血淋巴細(xì)胞(LAK細(xì)胞)商陸有絲分裂劑活化的或抗CD40活化的外周淋巴細(xì)胞(PBL)以及多種T和B細(xì)胞系的淋巴瘤上的表面LT也得到描述。具同種抗原的靶細(xì)胞參與特異地誘導(dǎo)CD8+和CD4+CTL克隆表達(dá)表面LT。
申請(qǐng)人在此描述了表面LT的幾種免疫學(xué)功能，以及LTα/β結(jié)合劑對(duì)免疫球蛋白反應(yīng)的產(chǎn)生和特征的影響，對(duì)次級(jí)淋巴組織的細(xì)胞組成的維持包括對(duì)小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞分化狀態(tài)和生發(fā)中心形成的影響，對(duì)影響細(xì)胞運(yùn)輸?shù)牡刂匪氐谋磉_(dá)水平的影響。因此，申請(qǐng)人將治療性的申請(qǐng)定義為表面LTα/β和LTβ受體結(jié)合劑。
到目前，還未完全弄清楚LT-β-R信號(hào)通路對(duì)體液或免疫原性反應(yīng)的影響。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)阻斷LT途徑。LT-β或LT-β-R可改變動(dòng)物的體液免疫反應(yīng)。因此，本專(zhuān)利申請(qǐng)的發(fā)明在廣泛實(shí)施方案中涉及了改變動(dòng)物體液免疫反應(yīng)的方法，包括使用包含治療有效量的LT途徑封閉劑，特別優(yōu)選地LT-β-R封閉劑的藥物組合物。
任何封閉劑可用于本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定封閉LT-β-R的試劑。例如，這樣的封閉劑可包括小分子受體抑制劑、可溶性β-淋巴毒素受體、針對(duì)LT-β-R的抗體以及針對(duì)表面LT配體的抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，封閉劑包括具有可選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)的可溶性LT-β-R，更優(yōu)選地可溶性LT-β-R包括人免疫球蛋白Fc區(qū)。
在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選的封閉劑包括針對(duì)LT-β-R的單克隆抗體，優(yōu)選地包括抗人LT-β-R的單抗BDA8和抗人LT-β的單抗B9。更優(yōu)選的抗體包括A1.D5.18、AO.D12.10和BB-F6。在某些情況下，用針對(duì)鼠表面LT配體的單克隆抗體更可取。
FDC的長(zhǎng)期抗原呈遞對(duì)自身免疫疾病可能很重要，內(nèi)源或自身抗原導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)的持續(xù)活化可使疾病長(zhǎng)期發(fā)作。捕獲于FDC上的免疫復(fù)合物列于圖7。將免疫復(fù)合物從FDC去掉可減少免疫活化的數(shù)量并使疾病減輕甚至阻斷疾病發(fā)展。涉及異?？贵w應(yīng)答的自身免疫疾病顯然是LT通路抑制劑的目標(biāo)，盡管其它更“經(jīng)典的”T細(xì)胞介導(dǎo)的自然免疫疾病或許具未被識(shí)別的體液成分，所以也可受到有益的影響。
同樣，在移植領(lǐng)域，移植排斥，即受體對(duì)移植疾病和移植對(duì)受體疾病需要抗原持續(xù)呈遞。在此所述的控制FDC的機(jī)制可運(yùn)用于與非自身即移植識(shí)別相關(guān)的問(wèn)題。
另外，抗原的持續(xù)呈遞或抗原記憶的維持在由分子模擬引起的自身免疫疾病中起作用。例如，對(duì)于Lyme氏疏螺旋體病感染因子Borreliaburgdorferi的免疫反應(yīng)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎樣病，可能的原因是此細(xì)菌的Saome抗原決定簇與正常的關(guān)節(jié)組成成分相似。去掉FDC保留的Lyme氏細(xì)菌抗原可減輕Lyme氏疏螺體病誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎。這樣的治療方法可用于其它與感染因子相關(guān)的摸擬病例。
申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)使用LT-β-R的封閉劑能夠干擾抗原在小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞上的呈遞和/或沉積。通常，B細(xì)胞將抗原看作是結(jié)合于小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞表面的免疫復(fù)合物。小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞可將抗原保留一段未特別指出的時(shí)間。與保留于FDC上的抗原的周期性接觸與B細(xì)胞記憶保持有關(guān)。因此，本專(zhuān)利申請(qǐng)的方法包括多種依賴(lài)于抗原在樹(shù)突細(xì)胞呈遞的疾病狀態(tài)。本發(fā)明的封閉劑可在抗原引入動(dòng)物前使用，在這種情況下，封閉劑將阻止所有或一部分抗原在小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞上的積累，由此阻止，或減少預(yù)料中的免疫原性反應(yīng)。選擇性地，本發(fā)明的封閉劑可在小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞與抗原發(fā)生關(guān)聯(lián)后的某一點(diǎn)對(duì)動(dòng)物施用。申請(qǐng)人專(zhuān)利申請(qǐng)的方法可破壞這種關(guān)聯(lián)，以使預(yù)料中的免疫原性反應(yīng)減小或消失。因此，本發(fā)明的治療方法涉及清除已捕獲于B細(xì)胞濾泡上的全部或部分免疫復(fù)合物，或全部或部分地阻止免疫復(fù)合物捕獲在B細(xì)胞濾泡上。
破壞呈遞于小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞的這些抗原與免疫復(fù)合物結(jié)合的能力是LT-β通路所特有的。例如，抗CD4OL(MR-1)是TNF家族的另一成員并且也在小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞上表達(dá)。與LT-β-R/Ig一樣，MR-1可阻止生發(fā)中心形成但不影響FDC標(biāo)記的表達(dá)?？笴D40-L不同于LT-β-R，不能阻止免疫復(fù)合物捕獲于小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞上，也不能清除已捕獲于小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞上的免疫復(fù)合物。另外，申請(qǐng)人已表明抗CD40-L不能影響原來(lái)產(chǎn)生的記憶B細(xì)胞的存活/維持。
盡管還不明確抗CD-40L和LT-β-R封閉劑的效果差異的精確基礎(chǔ)，推測(cè)CD40可向B細(xì)胞提供存活信號(hào)。然而，LT系統(tǒng)對(duì)于小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞維持完全的分化和功能狀態(tài)是至關(guān)重要的。這種狀態(tài)是生發(fā)中心反應(yīng)以及記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生和維持所必需的。因此，封閉CD40/CD40L途徑可阻止記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生，但不會(huì)影響已建成的記憶B細(xì)胞庫(kù)。另一方面，封閉LT途徑不僅阻止記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生和維持，而且也影響了原來(lái)產(chǎn)生的記憶B細(xì)胞的維持。
抑制LT途徑進(jìn)一步的應(yīng)用在于治療在小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞(FDC)區(qū)室中形成儲(chǔ)存庫(kù)的病毒。HIV病毒是一個(gè)恰如其分的例子。病毒感染后，大量的病毒滯留于次級(jí)淋巴器官B細(xì)胞濾泡的FDC上(Heathe等，1995，“小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞和人免疫缺損病毒”，自然，377:740-4)。據(jù)猜測(cè)，病毒與補(bǔ)體或免疫球蛋白形成復(fù)合物并與Fc受體、補(bǔ)體受體或兩者結(jié)合。這樣，病毒可利用免疫系統(tǒng)的正常機(jī)制使抗原記憶保留很長(zhǎng)時(shí)期。在發(fā)病過(guò)程中，淋巴細(xì)胞的主動(dòng)侵染主要發(fā)生在這些部位。據(jù)計(jì)算，在感染的無(wú)癥狀期，在此小室內(nèi)的病毒庫(kù)比T細(xì)胞和單核細(xì)胞含有的病毒多10位以上(Cavert等，1997，“淋巴組分對(duì)HIV-1感染的抗病毒治療反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)”，科學(xué)276:960-4)。目前的HIV治療模式聯(lián)合運(yùn)用多種抗病毒因子以減少病毒量并防止抗性突變體的逃逸。這種治療方法的可能限制在于這種治療的非應(yīng)變性并且在間隔中殘留病毒任意突變以產(chǎn)生抗性突變體從而逃避了治療過(guò)程。盡管FDC小室中病毒量在多藥治療受到很大影響，藥物本身主要是針對(duì)病毒復(fù)制機(jī)制并不針對(duì)FDC表面的非復(fù)制病毒。因此，F(xiàn)DC的病毒庫(kù)可作為藥物治療終止后的再接種物。而且，F(xiàn)DC能夠?qū)⒅泻偷牟《巨D(zhuǎn)變成感染形式從而進(jìn)一步加強(qiáng)了這些細(xì)胞在HIV發(fā)病中的重要性。
因?yàn)橐种芁T通路能夠使FDC釋放細(xì)胞表面的免疫復(fù)合物，以免疫組合物形式出現(xiàn)的HIV也被釋放。緊接多重治療體系之前應(yīng)該將此區(qū)室內(nèi)的HIV病毒全部釋放出來(lái)，因?yàn)椴《緫?yīng)被加工并從體內(nèi)或在感染開(kāi)始時(shí)清除掉，它對(duì)于藥物治療敏感。這樣的聯(lián)合可使病毒量減小至影響治療的最小量。在這種情況下，LTβ-R/Ig或針對(duì)配體或受體的封閉抗體是有效的。有力的治療方法涉及開(kāi)始進(jìn)行藥物治療，然后在幾天后，以LT通路抑制劑進(jìn)行一次或幾次治療以釋放任何結(jié)合狀態(tài)的病毒。一旦降低了病毒量，進(jìn)一步的治療不需要針對(duì)LT的試劑。
盡管HIV是經(jīng)特別詳盡地研究的例子，其它病毒很可能以靜止?fàn)顟B(tài)滯留或藏在FDC上，等待可以導(dǎo)致大量附加抗原產(chǎn)生的免疫紊亂一類(lèi)的事件，隨后釋放結(jié)合于FDC的病毒，這樣病毒重新出現(xiàn)。因此，本發(fā)現(xiàn)涉及任何抑制LT通路避免FDC結(jié)合病毒發(fā)作的方法。
此發(fā)現(xiàn)對(duì)于依賴(lài)于抗原在樹(shù)突細(xì)胞上呈遞和記憶B細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答的多種疾病有重要意義。LTα1/β2有效地傳遞信號(hào)并且是抗LTb封閉單克隆抗體有效治療的例子。另外，被命名為AOD12的抗人LTα的單克隆抗體能夠很好地封閉LTα1/β2信號(hào)通路，然而與大多數(shù)抗人LTα的單克隆抗體相比，對(duì)LTα的作用效果較差。以可溶性LTα1/β2配體免疫小鼠后得到的這些單克隆抗體發(fā)現(xiàn)了具獨(dú)特特異性的單克隆抗體。而且，我們認(rèn)為只有經(jīng)這種免疫方式而不是單獨(dú)用LTα免疫才能得到優(yōu)先對(duì)LTα1/β2復(fù)合物具特異性的抗LTα單克隆抗體，由此包括了一群獨(dú)特的抗LTα抗體。
實(shí)施例材料和方法小鼠控制時(shí)間受孕的Bal b/c小鼠購(gòu)自Jackson Laboratory(BarHarbor,ME)，飼養(yǎng)于常規(guī)隔柵屏障內(nèi)，并以指導(dǎo)性說(shuō)明管理。通過(guò)帶孕小鼠的尾靜脈(靜脈內(nèi))注射受體-Ig蛋白或單克隆抗體。通過(guò)腹膜途徑(腹膜內(nèi))將融合蛋白注射給這些小鼠的子代以及5周齡雌性Balb/c小鼠(購(gòu)自Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。
融合蛋白和抗體按(Force等，免疫學(xué)雜志，155，第5280-5288頁(yè)(1995)；Miller等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，178，第211-222頁(yè)(1993))描述的方法制備包含有與人IgG1的鉸鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū)融合的鼠LTβ-R，人TNF-R55或人LFA-3(不與鼠CD2結(jié)合)的胞外區(qū)融合蛋白。用作對(duì)照的純化的人IgG1購(gòu)自Protos Immunorsearch(San Fran Cisco,CA)。MR1，抗小鼠CD40配體抗體購(gòu)自Pharmingen(San Diego,CA)。
由小鼠嗜金屬巨噬細(xì)胞(MM)表達(dá)的標(biāo)記特異的抗體(MPMA-1,ED3),(ED3識(shí)別唾酸粘附素)，或小鼠網(wǎng)狀纖維母細(xì)胞特異的抗體(ER-TR-7)購(gòu)自Serotec(Oxon,UK)。小鼠B220,CD4和MadCAM-1特異的抗體(MECA367)購(gòu)自Pharmingen(SanDiego,CA)。小鼠邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記特異的抗體(ER-TR-9)由Reina Mebins博士惠贈(zèng)(Vrje Universiteit,Amsterdam)。小鼠小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞(FDC)特異的抗體(FDC-M1和FDC-M2)已被描述過(guò)(Maeda等，免疫學(xué)雜志，148，第2340-2347頁(yè)(1992))?？剐∈驝R1抗體(也可將FDC染色)由Randolph J.Noelle博士惠贈(zèng)(Dartmonth Medical School)。利用抗體MECA 79檢測(cè)周?chē)馨徒Y(jié)地址素(PNAD)(細(xì)胞上清來(lái)自購(gòu)自ATCC,Rockville,MD的細(xì)胞)。
抗原和免疫以100μl 10％的SRBC懸液腹膜內(nèi)免疫小鼠(購(gòu)自Colorado SerumCompany)。每次免疫物相當(dāng)于1-5×108個(gè)SRBC。
免疫組織化學(xué)將脾和淋巴結(jié)冷凍于OCT包埋劑(Miles,Elkhart,IN)并封固以進(jìn)行恒冷箱切片。7-10mm厚的切片干燥后以丙酮固定。切片與經(jīng)Tris緩沖鹽溶液A稀釋(TBS-A,0.05M Tris,0.15M Nacl,0.05％Tween-20(v/v),0.25％牛血清白蛋白(BSA))的偶聯(lián)抗體于室溫下的濕室中溫育1小時(shí)，以TBS-B(0.05M Tris,0.15M NaCl,0.05％Tween-20)洗滌，在起始酶反應(yīng)以前在甲醇中固定1分鐘。分別用DAB片劑底物盒(Sigma,st.Louis,MO)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基藍(lán)四氮唑(BCIP/NBT,Sigma)分別顯現(xiàn)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶活性。組織切片在甲醇中固定5分鐘后以Giemsa(Fluka,Buchs,Switzerland)進(jìn)行復(fù)染。
熒光圖像分析為了進(jìn)行免疫熒光染色，用丙酮固定冷凍切片，令其空氣干燥；用以5μg/ml的濃度溶解于含0.25％BSA,0.05％Tween-20和10％熱凝集兔血清的Tris緩沖鹽水的抗CD16/CD32 Fc封閉劑(Pharmingen,San Diego；CA)預(yù)封閉。用下列單克隆抗體和檢測(cè)試劑在相同緩沖液中對(duì)切片進(jìn)行染色10μg/ml生物素化的抗B220的單克隆抗體(pharmingen)，然后是20μg/ml鏈親和素-FITC(SouthernBiotechnology Associates,Birmingham,AL)；10μg/ml MECA 367；然后是10μg/ml PE-山羊F(ab’)2抗大鼠IgG(Southern BiotechnologyAssociates)；MECA 79培養(yǎng)上清，然后是20μg/ml FITC-小鼠抗大鼠IgM(pharmingen)；20μg/ml抗唾酸粘附素單克隆抗體，然后是10μg/ml PE-山羊F(ab’)2抗大鼠IgG(Southem BiotechnologyAssociates),50μg/ml生物素化的PNA(Vector Laboratiories,Burlingame,CA)，然后是10μg/ml鏈親和素-PE(SouthernBiotechnology Associates)；以1∶5稀釋的單克隆抗體MOMA-1細(xì)胞培養(yǎng)上清，然后是20μg/mL FITC-小鼠抗大鼠IgM(pharmingen)。有些切片以多種單克隆抗體同時(shí)染色以進(jìn)行圖像遮蓋分析。所有的切片在50X光學(xué)顯微鏡下觀察并用Ektachrome P 1600拍照(Kodak,Rochester,NY)或用(Rennert等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，(1996年11月，出版中))描述的方法將其捕捉為單獨(dú)的紅色和綠色圖像文件。
血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)以PBS/1％葡萄糖在96孔微量滴定板上(Costar,Cambridge；M)連續(xù)稀釋血清。向每一孔中加入25μl 10％的SRBC懸液并將此板在潮濕的37℃孵箱中溫育1小時(shí)以測(cè)定SRBC特異的IgM的滴度。對(duì)于SRBC特異的IgG，每孔中加入20μl 1％2-巰基乙醇(體積/體積)(Bio-Rad,Richmond,CA)后將血清于37℃溫育30分鐘以清除IgM五聚體。然后每孔加入25ul 10％SRBC懸液，隨后每孔加入25ul山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechology,Birmingham,AL)的10mg/ml溶液(PBS/1％葡萄糖)作為血細(xì)胞凝集的交聯(lián)劑。最后血細(xì)胞凝集明顯時(shí)的血清稀釋度的倒數(shù)確定為滴度。
ELISA將鼠LTβ-R(Browning等，底稿在準(zhǔn)備中)、LFA-3(Miller等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志；178；第211-222頁(yè)(1993))或人IgG1的CH3特異的單克隆抗體直接固定于(10μg/ml)96孔微量滴定板上用于捕捉，用驢抗人IgG1-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)檢測(cè)(Jackson Immuno Research,West Grove PA,1∶4000稀釋)，以分析血漿中受體Ig。
可溶性LTβ-R分子的制備本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的LTβ-R封閉劑包括可溶性LTβ受體分子。圖1表示了人LTβ-R胞外部分的序列，它編碼配體結(jié)合區(qū)。運(yùn)用圖1中的序列信息和本領(lǐng)域中眾所周知的重組DNA技術(shù)，將編碼LTβ-R配體結(jié)合區(qū)域的功能片段將克隆到載體中并在合適的宿主中表達(dá)以合成可溶性LTβ-R分子。根據(jù)申請(qǐng)人共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/505,606,1995年7月21日提交中描述的測(cè)定，與天然LTβ受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LT配體的可溶性LTβ-R分子可選作LTβ-R封閉劑。
包含選自圖1所示的氨基酸序列的可溶性受體可與一個(gè)或多個(gè)異源蛋白區(qū)域(“融合區(qū)域”)相連接以提高受體結(jié)合蛋白在體內(nèi)穩(wěn)定性或調(diào)節(jié)其生物學(xué)活性或定位。
優(yōu)選地，穩(wěn)定的血漿蛋白質(zhì)-通常其在循環(huán)中的半衰期在20小時(shí)以上-可用于構(gòu)建受體融合蛋白。這樣的血漿蛋白質(zhì)包括但不限于免疫球蛋白，血清白蛋白，脂蛋白，載脂蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。能夠?qū)⒖扇苄訪Tβ-R分子定位于特定細(xì)胞或組織類(lèi)型，也可連接到LTβ-R配體結(jié)合區(qū)域以產(chǎn)生特定定位的可溶性LTβ-R融合蛋白。
包含LTβ-R受體結(jié)合區(qū)域的LTβ-R胞外區(qū)(圖1)的全部或部分可與人IgG1重鏈Fc區(qū)域一類(lèi)的免疫球蛋白融合(Browning等，免疫學(xué)雜志，154，第33-46頁(yè)(1995))。可溶性受體IgG融合蛋白是優(yōu)選的，是普通的免疫試劑，它們的構(gòu)建方法在本領(lǐng)域中為人所知(見(jiàn)如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,225,538，在此引入作為參考)。
功能性的LTβ-R配體結(jié)合區(qū)域可與IgG1以外的免疫球蛋白群或亞群的免疫球蛋白(Ig)Fc區(qū)域相融合。屬于不同Ig群或亞群抗體的Fc區(qū)能活化不同的次級(jí)效應(yīng)功能。活化發(fā)生于Fc區(qū)與同源Fc受體結(jié)合時(shí)，次級(jí)效應(yīng)物功能包括活化補(bǔ)體系統(tǒng)的能力，通過(guò)胎盤(pán)的能力，與各種微生物蛋白結(jié)合的能力。不同免疫球蛋白群和亞群的特征在Roitt等，免疫學(xué)，第48頁(yè)(Mosby-Year BookEurope Ltd.，第3段1993)中有所描述。
補(bǔ)體系統(tǒng)的活化引發(fā)介導(dǎo)炎癥的級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)。補(bǔ)體系統(tǒng)的產(chǎn)生具有多種功能，包括與細(xì)菌結(jié)合、內(nèi)吞作用、吞噬作用、細(xì)胞毒性、自由基形成和免疫復(fù)合物的溶解。
補(bǔ)體酶級(jí)聯(lián)由結(jié)合抗原的抗體IgG1,IgG3和IgM的Fc區(qū)活化。IgG2的Fc區(qū)效果較差，IgG4,IgA,IgD和IgE的Fc區(qū)不能活化補(bǔ)體。因此，可根據(jù)其相關(guān)的次級(jí)效應(yīng)物功能對(duì)于特定的免疫反應(yīng)或以LTβ-R-Ig融合蛋白治療的疾病是否可取來(lái)選擇Fc區(qū)。
如果損害或殺死具有LT配體靶細(xì)胞是有利的，可選擇具特別活性的Fc區(qū)(IgG1)以制備LTβ-Ig融合蛋白。替代地，如果將LTβ-R-Fc融合蛋白而不引發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)，則應(yīng)選擇無(wú)活性的IgG4 Fc區(qū)。
已描述了降低或清除與Fc受體結(jié)合和補(bǔ)體活化的Fc區(qū)中的突變(S.Morrison，免疫學(xué)年鑒，10，第239-65頁(yè)(1992))?？蓡为?dú)或聯(lián)合使用這些或其它突變，以使用于構(gòu)建LTβ-R-Ig融合蛋白的Fc區(qū)的活性最佳。
包含與人免疫球蛋白Fc區(qū)融合的配體結(jié)合序列的可溶性人LTβ-R融合蛋白(hLTβ-R-Ig)的產(chǎn)生描述于實(shí)施例1。一個(gè)根據(jù)實(shí)施例1制備分泌h LTβ-R-Fc的CH0系被稱(chēng)為“hLTβ-R；hG1CHO#14”。根據(jù)Bidapest條約的規(guī)定，這個(gè)細(xì)胞系的樣品于1995年7月21日貯存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定其ATCC注冊(cè)號(hào)CRL11965。
可溶性鼠LTβ-R融合蛋白分子(LTβ-R-Ig)的產(chǎn)生在實(shí)施例2中進(jìn)行了描述。一個(gè)根據(jù)實(shí)施例2制備的CHO系被稱(chēng)為“mLTβ；R-hG1 CHO#1.3.BB?！备鶕?jù)Budapest條約的規(guī)定，這個(gè)細(xì)胞系的樣品于1995年7月21日貯存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定其ATCC注冊(cè)號(hào)CRL11964。
一旦本申請(qǐng)被授予專(zhuān)利，上述ATCC保存物對(duì)公眾可得到性的所有限制將不可挽回地被撤消。
形成受體-Ig融合蛋白連接點(diǎn)的不同氨基酸殘基可改變可溶性融合蛋白的結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性及其最終的生物學(xué)活性?？蓪⒁粋€(gè)或多個(gè)氨基酸添加到所選LTβ-R片段的C末端從而用所選的融合區(qū)修飾連接點(diǎn)。
改變所選LTβ-R DNA片段插入重組表達(dá)載體時(shí)5’末端的切割位置可改變LTβ-R融合蛋白的N末端?？捎贸Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)和此處所述的選擇LTβ-R封閉劑的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和優(yōu)化每一LTβ-R融合蛋白的穩(wěn)定性和活性。
利用圖1中所示的胞外區(qū)內(nèi)的LTβ-R配體結(jié)合區(qū)的序列，可構(gòu)建氨基酸變異體以修飾可溶性受體或融合蛋白對(duì)LT配體的親和力。本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子可與內(nèi)源性細(xì)胞表面LTβ受體競(jìng)爭(zhēng)與表面LT配體結(jié)合?？梢灶A(yù)想，任何包含能與細(xì)胞表面LTβ受體競(jìng)爭(zhēng)與LT配體結(jié)合的可溶性分子是本發(fā)明范圍內(nèi)的LTβ-R封閉劑。
抗LTβ-R抗體的來(lái)源在本發(fā)明中的另一實(shí)施方案中，針對(duì)人LTβ受體的抗體(抗-LTβ-R抗體)可作為L(zhǎng)Tβ-R封閉劑。本發(fā)明的抗LTβ-R抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體(mAbs)并且可被修飾以優(yōu)化其封閉LTβ-R信號(hào)通路的能力，其體內(nèi)生物可利用性，穩(wěn)定性或其它希望的特征。
用常規(guī)技術(shù)通過(guò)用皮下注射方式將完全弗氏佐劑中的人LTβ受體-Ig融合蛋白(實(shí)施例1)注射山羊，兔子，大鼠，倉(cāng)鼠或小鼠一類(lèi)的動(dòng)物，然后以不完全弗氏佐劑通過(guò)腹膜內(nèi)或皮下注射加強(qiáng)，以制備針對(duì)人LTβ受體的多克隆抗體血清。用常規(guī)免疫學(xué)方法對(duì)包含有希望的針對(duì)LTβ受體抗體的多克隆抗血清進(jìn)行篩選。
針對(duì)人LTβ受體-Ig融合蛋白的小鼠單克隆抗體(mAb)可用申請(qǐng)人共同未決于1995年7月21日提交的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/505,606中所述的制備。根據(jù)Budapest條約的規(guī)定，合成小鼠抗人LTβ-R mAb BDA8的雜交瘤細(xì)胞系(BD.A8.AB9)于1995年1月12日貯存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)，并指定了注冊(cè)號(hào)HB11798。一旦本申請(qǐng)被授予專(zhuān)利，上述ATCC保存物對(duì)公眾可得到性的所有限制將不可挽回地被撤消。
用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)(Winter和Milstein，自然，349，第293-99頁(yè)(1991))，可制備各種形式的抗LTβ-R抗體。例如，將動(dòng)物抗體的抗原結(jié)合區(qū)與人恒定區(qū)連接以構(gòu)建“嵌合”抗體(如，Cabilly等，美國(guó)4,816,567；Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，81，第6851-55頁(yè)(1984))。當(dāng)用于人類(lèi)臨床治療時(shí)，嵌合抗體減少了由動(dòng)物抗體引發(fā)的免疫反應(yīng)。
另外，可合成識(shí)別LTβ-R的重組“人源化抗體”。人源化抗體是主要包含插入有特定抗原結(jié)合區(qū)人IgG序列的嵌合體(如，WO94/04679)。以希望的抗原免疫動(dòng)物，分離相應(yīng)的抗體，移掉特異抗原結(jié)合的可變區(qū)序列。來(lái)自動(dòng)物的抗原結(jié)合區(qū)克隆到刪除了抗原結(jié)合區(qū)的人抗體基因合適的位置。人源化抗體使人抗體中異源(種間)序列的使用降低至最小，在受治療對(duì)象中不可能引發(fā)免疫應(yīng)答。
制備包含有抗LTβ-R可變區(qū)和從不同免疫球蛋白群分離的人恒定區(qū)(CH1,CH2,CH3)的嵌合或人源化抗體可構(gòu)建不同類(lèi)的重組抗LTβ-R抗體。例如，將抗原結(jié)合位點(diǎn)克隆到攜帶人μ鏈恒定區(qū)的載體中可用重組方法制備具有提高了的抗原結(jié)合位點(diǎn)效價(jià)的抗LTβ-RIgM抗體(Arunlanandam等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，177，第1439-50頁(yè)(1993)；Lane等，歐洲免疫學(xué)雜志，22，第2573-78頁(yè)(1993)；Traunecker等，自然，339，第68-70頁(yè)(1989))。
另外，通過(guò)改變抗原結(jié)合位點(diǎn)附近的氨基酸殘基，標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)可用于改變重組抗體與其抗原的結(jié)合親和力。根據(jù)分子模型進(jìn)行的突變可提高人源化抗體的抗原結(jié)合親和力(Queen等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，86，第10029-33頁(yè)(1989)；WO94/04679)。
依據(jù)靶組織類(lèi)型或預(yù)想的特定治療計(jì)劃，也許希望提高或降低抗LTβ-R對(duì)LTβ-R的親和力。例如，對(duì)于半預(yù)防性治療而言，用LT-β路通傳遞信號(hào)能力低而具恒定水平的抗LTβ-R抗體治療病人是有利的。同樣，對(duì)LTβ-R有親和力增加的抑制性抗LTβ-R抗體對(duì)于短期治療是有利的。
抗表面LT配體抗體的來(lái)源本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及了包含有針對(duì)作為L(zhǎng)Tβ-R封閉劑的LT配體的抗體的組合物和方法。如上所述制備抗LTβ抗體的方法，作為L(zhǎng)Tβ-R封閉劑的抗LT配體抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，可根據(jù)常規(guī)方法調(diào)節(jié)其抗原結(jié)合特征及其免疫原性對(duì)其進(jìn)行修飾。
本發(fā)明的抗LT抗體可以是針對(duì)兩個(gè)LT亞單位中的任何一個(gè)，包括可溶性的，突變的，改變的和嵌合形式的LT亞單位。如果將LT亞單位作為抗原，優(yōu)選地是LTβ亞單位。如果使用LTα亞單位，優(yōu)選的與表面LT配體結(jié)合的抗LTα抗體不與分泌的LTα發(fā)生交叉反應(yīng)或不調(diào)節(jié)TNF-R活性(根據(jù)1995年7月21日提交的申請(qǐng)人共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/505,606所述的實(shí)驗(yàn))。
替代地，可制備針對(duì)包含一個(gè)或多個(gè)LT亞單位的同源(LTβ)或異源(LTα/β)復(fù)合物并篩選作為L(zhǎng)Tβ-R封閉劑活性。優(yōu)選地，將LTAα1/β2復(fù)合物作為抗原。如上文所討論的，優(yōu)選的抗LTα1/β2抗體與表面LT配體結(jié)合而不與分泌的LTα結(jié)合也不影響TNF-R活性。
抗人LTα多克隆抗體的制備在申請(qǐng)人共同未決申請(qǐng)(WO94/13808)中有所描述?？筁Tα和抗LTβ的單克隆抗體在(Browning等，免疫學(xué)雜志，154，第33-46頁(yè)(1995))中描述。
按1995年7月21日提交的申請(qǐng)人共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/505,606所述制備小鼠抗人LTβ單克隆抗體。根據(jù)Budapest條約的規(guī)定，合成小鼠抗人LTβ-R單克隆抗體B9的雜交瘤細(xì)胞系(B9、C9.1)于1995年7月21日貯存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定了ATCC注冊(cè)號(hào)HB11962。
按1995年7月21日提交的申請(qǐng)人共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/505,606所述制備倉(cāng)鼠抗小鼠LTα/β的單克隆抗體。根據(jù)Budapest條約的規(guī)定，合成倉(cāng)鼠抗小鼠LTα/β的單克隆抗體BB.F6的雜交瘤細(xì)胞系(BB.F6.1)于1995年7月21日貯存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定了ATCC注冊(cè)號(hào)HB11963。
一旦本申請(qǐng)被授予專(zhuān)利，上述ATCC保存物對(duì)化從可得到性的所有限制將不可挽回地被撤消。
用可溶性LTβ-R-Ig抑制表面LT復(fù)合物的免液功能。
我們表明了表面LT結(jié)合劑，由小鼠LTβ-R的胞外區(qū)和人IgG1的鉸鏈區(qū)，CH2及CH3組成的融合蛋白(LTβ-R-Ig)對(duì)于免疫球蛋白應(yīng)答的產(chǎn)生和特征的影響，以于包括對(duì)小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞分化狀態(tài)和生發(fā)中心形成影響的次級(jí)淋巴組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持的影響，對(duì)于影響細(xì)胞運(yùn)輸?shù)牡刂匪乇磉_(dá)水平的影響。
用LTβ-R-Ig多次注射改變脾淋巴細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以及脾邊緣區(qū)細(xì)胞功能標(biāo)記的表達(dá)。
連續(xù)將LTβ-R-Ig注射小鼠六周；每周一次，以觀察表面LT阻斷對(duì)脾結(jié)構(gòu)的影響。然后以SRBC免疫小鼠；4天后再注射一次LTβ-R-Ig。注射SRBC后10天將小鼠處死。冷凍脾切片的免疫組織化學(xué)染色揭示了幾種組織變化。組成正常小鼠脾B細(xì)胞室的濾泡經(jīng)LTβ-R-Ig處理后不再是分立的。相反，B細(xì)胞圍繞T細(xì)胞區(qū)形成彌散的帶(圖2B),T和B細(xì)胞之間的界限遭到破壞(圖2B)。相反，作為對(duì)照的LFA-3-Ig處理小鼠脾B細(xì)胞濾泡是分立的并且T和B細(xì)胞區(qū)之間有明顯的界限(圖2A)。
LTβ-R-Ig處理小鼠的脾邊緣區(qū)的兩種不同巨噬細(xì)胞群不表達(dá)被單克隆抗體ER-TR-9和MOMA-1識(shí)別的細(xì)胞表面標(biāo)記。ER-TR-9染MZM上的標(biāo)記(Dijkstra等，免疫學(xué)，55,23-30(1985),MOMA-1染嗜金屬巨噬細(xì)胞上的標(biāo)記(Krael和Janse，免疫學(xué)，58,665-669,(1986))(分別是圖2D,F)。這些標(biāo)記在對(duì)照(LFA-3-Ig)處理小鼠的細(xì)胞上表達(dá)(圖2C,E)。LTβ-R-Ig處理小鼠的鼠脾邊緣區(qū)MOMA-1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的另一標(biāo)記，唾酸粘附素，也不表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
抗體EMCA-367與最初表達(dá)于淋巴集結(jié)，腸系膜淋巴結(jié)；腸粘膜和固有層內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子和粘附地址素MAdCAM-1結(jié)合(Briskin等，自然，363，第461-464頁(yè)(1993)；Nakache等，自然，337，第179-181頁(yè)(1989))。MAdCAM-1也在脾邊緣區(qū)(假定在開(kāi)口于邊緣竇的小終端微動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá))和生發(fā)中心內(nèi)的網(wǎng)眼上表達(dá)(Kraal等，美國(guó)病理學(xué)雜志，147，第763-771頁(yè)(1995))(圖2G)。LTβ-R-Ig處理的小鼠切片用MECA 367染色，表明脾不再表達(dá)MAdCAM-1(圖2H)。
同樣，分辨邊緣區(qū)網(wǎng)狀上皮細(xì)胞的ER-TR-7抗體染色(Van,vliet等，細(xì)胞化學(xué)，34，第883-890頁(yè)(1986))(圖2I)異常分化且LTβ-R-Ig處理后的動(dòng)物白髓比LFA-3-Ig處理的動(dòng)物白髓染色強(qiáng)(圖2J)。LTβ-R-Ig處理小鼠中觀察到的變化不依賴(lài)于抗原，因?yàn)槿旧Ｊ脚cLTβ-R-Ig處理的未經(jīng)免疫小鼠的染色模式相同(數(shù)據(jù)未顯示)。
LTβ-R-Ig處理的小鼠脾中不再形成生發(fā)中心，也檢測(cè)不到小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞為了在組織水平上檢測(cè)多次給小鼠注射LTβ-R-Ig是否影響對(duì)SRBC的免疫反應(yīng)，對(duì)抗原引發(fā)下生發(fā)中心(GC)的形成和小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞(FDC)的分布進(jìn)行了分析。用商陸凝集素(PNA)對(duì)以圖2描述的方法經(jīng)LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig多次預(yù)理的小鼠冷凍脾切片進(jìn)行染色以顯現(xiàn)GC，以FDC-M1抗體染色以檢測(cè)FDC,FDC-M1是GC形成必需的細(xì)胞組分(Scrhriever和Nadter，免疫學(xué)進(jìn)展，51，第243-284頁(yè)(1992)；Tew等，免疫學(xué)評(píng)述115，第185-211頁(yè)(1990))。CD40與CD40配體的相互作用對(duì)于GC形成也是至關(guān)重要的(Foy等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，180，第157-163頁(yè)(1994))。因此為了進(jìn)行比較，用抗小鼠CD40配體抗體MR1處理一組小鼠，然后進(jìn)行可抑制GC形成的注射方法處理小鼠(Han等，免疫學(xué)雜志，155，第556-567頁(yè)(1995))。SRBC攻擊后10天，以對(duì)照LFA-3-Ig蛋白處理的小鼠脾中有很多PNA染亮的GC(圖3A)。LTβ-R-Ig或MR1-處理的小鼠脾中未檢測(cè)到GC(分別是圖3B、C)。然而，MR-1和LTβ-R-Ig的作用可由另外的兩項(xiàng)觀察區(qū)分開(kāi)。LTβ-R-Ig處理小鼠脾中(圖3E)缺少GC內(nèi)FDCS(FDC-M1)染色(圖3D)然而MR1-處理小鼠內(nèi)仍有這種染色(圖3F)。用FDC-M2抗體對(duì)FDCS進(jìn)行染色得到相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，LTβ-R-Ig處理導(dǎo)致了脾中FDC表型改變并且不能形成GC。
除了染GC外，PNA也可對(duì)正常小鼠脾的邊緣區(qū)進(jìn)行染色。LFA-3-Ig處理小鼠(圖3A)和MR1處理小鼠(圖3C)中也觀察到這種染色；而LTβ-R-Ig處理小鼠脾中沒(méi)有這種染色(圖3B)。
MR1處理小鼠的脾可正常表達(dá)唾酸粘附素，MOMA-1,ER-TR-9,ER-TR-7和MAdCAM-1(數(shù)據(jù)未顯示)，進(jìn)一步區(qū)分干擾CD40和LTβ-R信號(hào)通路的分子效應(yīng)。
LTβ-R-Ig誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞組織和邊緣區(qū)細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)改變的動(dòng)力學(xué)分析了影響脾淋巴細(xì)胞組織和邊緣區(qū)細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)所需的注射LTβ-R-Ig的次數(shù)。用LTβ-R-Ig通過(guò)腹膜內(nèi)一次或多次注射小鼠，如表1所示。在末次注射LTβ-R-Ig的當(dāng)天，以SRBC免疫部分小鼠。分別檢測(cè)了經(jīng)處理小鼠的冷凍脾切片上B220和CD40的表達(dá)，以PNA(針對(duì)GC)和MECA367(針對(duì)MAdCAM-1),MOMA-1,ER-TR-9以及FDC-M1進(jìn)行染色。對(duì)嗜金屬巨噬細(xì)胞，邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞，MAdCAM-1,GCS以及FDCs染色消失的動(dòng)力學(xué)是不同的。
注射1次LTβ-R-Ig足以使MAdCAM-1染色在一周后消失。每周一次，注射三次LTβ-R-Ig后，檢測(cè)不到GCs和FDCs染色，T/B淋巴細(xì)胞室被破壞。清除嗜金屬巨噬細(xì)胞染色至少需要注射4次LTβ-R-Ig。注射LTβ-R-Ig六次也不能完全清除用ER-TR-9抗體對(duì)邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞進(jìn)行的染色(如圖2D所示)。
在缺少抗原的情況下，對(duì)注射1次LTβ-R-Ig后，MOMA-1,MAdCAM-1,FDC-M1。FDC-M2和CR1染色的快速抑制進(jìn)行了精確分析(表2)。表1成年小鼠對(duì)SRBC作出反應(yīng)時(shí)，LTβ-R-Ig對(duì)脾組織和生發(fā)中心形成的影響

每周注射一次，每次100ug LTβ-R-Ig腹膜內(nèi)注射小鼠1-5周然后處死。除非特別說(shuō)明，腹膜內(nèi)注射SRBC(100ul10％的懸液)之前使用LTβ-R-Ig，最后一次LTβ-R-Ig與抗原注射在同一天進(jìn)行。注射SRBC后10天處死動(dòng)物。用生物標(biāo)記的大鼠抗小鼠B220和大鼠抗小鼠CD4雙染冷凍脾切片，然后分別使用鏈親和素堿性磷酸酶和小鼠抗大鼠Ig過(guò)氧化物酶。也用下列抗鼠抗體對(duì)脾切片進(jìn)行染色大鼠抗邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞(ER-TR9)，大鼠抗嗜金屬巨噬細(xì)胞(MOMA-1)；大鼠抗MAdCAM-1(MECA:367)和大鼠抗FDC(FDC-M1)，然后使用鼠抗大鼠Ig過(guò)氧化物酶。用生物素化的商陸凝集素(PNA-生物素)然后用鏈親和素過(guò)氧化物酶對(duì)另一套冷凍切片染色以檢測(cè)生發(fā)中心。每項(xiàng)觀察在每組至少3只動(dòng)物的切片上進(jìn)行。
*觀察染色強(qiáng)度用肉眼正常染色+++，染色減弱++，染色弱+，以及無(wú)色-。未處理動(dòng)物和以LFA-3-Ig處理動(dòng)物的切片的染色強(qiáng)度作為正常染色參照。
§每張脾切片中生發(fā)中心的數(shù)目記錄如下＞10+++；5-10++；1-5+；沒(méi)有-。
≠未接受SRBC的動(dòng)物。
ND未做。表2:LTβ-R-Ig對(duì)MOMA-1,MAdCAM-1,CR1,FDC-M1和FDC-M2染色影響的精確計(jì)時(shí)單一注射LTβ-R-Ig后的天數(shù)0 1 3 5 7 10 14MOMA-1*++++++++++++ ++ ++ +MAdCAM-1*++++/-- - - --CR1*+++++++- ++ ++ ++ +FDC-M1*++++/-- - ---FDC-M2*++++/-- - - --Balb/c小鼠，5-6周接受1劑腹膜內(nèi)注射的100ug LTβ-R-Ig或人Ig。每組的小鼠在第0,1,3,5,7,10和14天被處死。冷凍脾切片以下列抗體染色大鼠抗小鼠嗜金屬巨噬細(xì)胞(MOMA-1)，大鼠抗小鼠MAdCAM-1(MECA 367)，大鼠抗小鼠FDC(FDC-M1)，大鼠抗小鼠FDC(FDC-M2)以及生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠CR1，然后用小鼠抗大鼠Ig-過(guò)氧化物酶(MOMA-1,MAdCAM-1,FDC-M1和FDC-M2)或過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素(CR1)。
*用肉眼觀察染色強(qiáng)度正常染色；+++，染色減弱++，染色弱+，以及無(wú)染色-。未處理動(dòng)物和以人Ig處理動(dòng)物的切片染色強(qiáng)度作為正常染色參照。分析了每組至少兩只動(dòng)物的切片。
注射后，每天處死接受了單一腹膜內(nèi)注射LTβ-R-Ig的Balb/c小鼠，進(jìn)行14天，移取并冷凍它們的脾。用MOMA-1，抗MAdCAM-1(MECA-367，以及FDC特異的試劑FDC-M1,FDC-M2和抗CR1抗體對(duì)冷凍脾切片染色。LTβ-R-Ig注射后一天，用抗MAdCAM-1,FDC-M1和FDC-M2試劑進(jìn)行的染色大幅度減弱(表2)。與表1中描述的結(jié)果相比，這個(gè)實(shí)驗(yàn)中FDC-M1染色的快速抑制可能是由于經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物中FDC-M1染色比較強(qiáng)的原因。第14天時(shí)還可檢測(cè)到對(duì)CR1的染色，表明LTβ-R-Ig處理后3天FDC仍存在而FDC-M1和FDC-M2所檢測(cè)的標(biāo)記則不再表達(dá)。由此LTβ-R-Ig處理改變了FDC表型。最后，MOMA-1染色減弱但在第14天仍可檢測(cè)到。
多次LTβ-R-Ig處理抑制了淋巴結(jié)中地址素的表達(dá)我們檢測(cè)了定時(shí)受孕的Balb/c小鼠子代淋巴結(jié)中地址素的表達(dá)，這些受孕小鼠在懷孕的第14天和第17天靜脈注射了200ug受體-Ig蛋白。出生后，子代小鼠未被處理或每周通過(guò)腹膜內(nèi)注射100ug LTβ-R-Ig,TNF-R.55-Ig；或LFA-3-Ig。ELISA檢測(cè)表明在整個(gè)生命過(guò)程中，融合蛋白水平保持在或高于10ug/mL(數(shù)據(jù)未顯示)。用MECA 367和MECA 79進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色表明整個(gè)生命過(guò)程中以LTβ-R-Ig處理的小鼠的腸系膜淋巴結(jié)中完全沒(méi)有MAdCAM-1和外周淋巴結(jié)地址素(圖4A,B)。這些小鼠的骶淋巴結(jié)缺乏所有地址素的表達(dá)，頸和髂淋巴結(jié)不顯示周?chē)窠?jīng)節(jié)(PHAD染色)(數(shù)據(jù)未顯示)。地址素表達(dá)下調(diào)是可逆的，因?yàn)橹辉谧訉m內(nèi)經(jīng)處理的動(dòng)物的表達(dá)可恢復(fù)到正常水平(圖4G,H)。在整個(gè)生命過(guò)程中以100ug/周TNF-R-55-Ig或LFA-3-Ig處理的小鼠的淋巴結(jié)中地址素表達(dá)與未處理小鼠相近(圖4C,D,E,F)。
LTβ-R-Ig處理小鼠的淋巴結(jié)中B淋巴結(jié)定位和巨噬細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)被改變與LN被膜下淋巴竇(類(lèi)似于脾邊緣區(qū))中巨噬細(xì)胞群標(biāo)記結(jié)合的抗體被用于對(duì)小鼠的LN進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，這些小鼠經(jīng)上這述圖4描述的方法在懷孕期間和出生后以LTβ-R-Ig,TNF-R55-Ig，或LFA-3-Ig連續(xù)處理。用圖像分析軟件對(duì)熒光圖象進(jìn)行分析。唾酸粘附素的表達(dá)在以可溶性LTβ-R-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)減弱(圖5B)，而在以下TNF-R55-Ig或LFA-3-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)中沒(méi)有減弱(圖5E,H)。在以LTβ-R-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)中仍可檢測(cè)到MOMA-1在被膜下淋巴竇內(nèi)巨噬細(xì)胞上的表達(dá)(圖5C)。
也評(píng)介了連續(xù)的LTβ-R-Ig處理對(duì)淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞組織的影響。以B細(xì)胞標(biāo)記B220和T細(xì)胞標(biāo)記CD4特異的單克隆抗體對(duì)LN切片進(jìn)行染色。圖像分析用以確定T和B細(xì)胞區(qū)的交叉。以LTβ-R-Ig處理可導(dǎo)致B細(xì)胞濾泡溶解從而使B細(xì)胞以彌散的帶呈現(xiàn)出T細(xì)胞區(qū)外圍(圖5A)。盡管B細(xì)胞濾泡結(jié)構(gòu)溶解了，B細(xì)胞不出現(xiàn)于淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)內(nèi)，相反，它們出現(xiàn)于正常情況下沒(méi)有淋巴細(xì)胞的區(qū)域。在小鼠的整個(gè)生命過(guò)程中在以100ug/周TNF-R55-Ig而非LFA-3-Ig處理的小鼠中可觀察到相似的T和B細(xì)胞染色模式(圖5D)。B細(xì)胞濾泡再次被破壞并且B細(xì)胞出現(xiàn)于淋巴結(jié)中通常情況下不包含淋巴細(xì)胞的區(qū)域。未觀察到B細(xì)胞與T細(xì)胞的重疊。
LTβ-R-Ig處理小鼠抑制了IgM和IgG抗體應(yīng)答用LTβ-R-Ig多次處理的小鼠經(jīng)SRBC引發(fā)后不能形成生發(fā)中心(如圖3中)，表明這些小鼠的體液免疫應(yīng)答發(fā)生了改變。為了直接驗(yàn)檢這一點(diǎn)，成年小鼠接受六次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig注射，每周一次，然后以SRBC引發(fā)。在免疫后的第7天和第14天對(duì)小鼠采血，用血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)分析血清中SRBC特異的IgM和IgG的存在情況。與經(jīng)人Ig或PBS處理的小鼠相比，用LTβ-R-Ig處理的小鼠經(jīng)SRBC免疫后的第7天，IgM的滴度正常而IgG應(yīng)答降低較多(圖6A)。與經(jīng)人Ig或PBS處理的小鼠相比，LTβ-R-Ig處理的小鼠血清中仍檢測(cè)不到SRBC特異的IgG，而且這些小鼠中SRBC特異的IgM的滴度也降低了一半多(圖6A)。
SRBC引發(fā)10天后，可在以LTβ-R-Ig處理一次或兩次的小鼠脾中檢測(cè)到GC，然而與對(duì)照相比，GC的數(shù)量減少很多(表1)。當(dāng)小鼠接受兩次LTβ-R-Ig注射，第一次在SRBC引發(fā)前一周，第二次注射在SRBC注射的當(dāng)天，在第7天和第14天時(shí)，檢測(cè)到的針對(duì)SRBC的IgM和IgG抑制情況(圖6B)與當(dāng)小鼠接受多次LTβ-R-Ig注射時(shí)檢測(cè)到的相似(圖6A)。在免疫后第30天，檢測(cè)不到SRBC特異的IgG，與對(duì)照相比IgM的水平降低了80％(圖6B)。因此，與對(duì)照相比，LTβ-R-Ig處理方法導(dǎo)致IgG應(yīng)答全部受抑制，IgM應(yīng)答減弱/減小。
若小鼠在SRBC引發(fā)的當(dāng)天只接受一次LTβ-R-Ig注射，第7天時(shí)針對(duì)SRBC的IgG和IgM應(yīng)答水平與對(duì)照組的相似(圖6C)。然而，在免疫后的第24天，IgM和IgG的滴度都降低了30％。在SRBC引發(fā)后第34天，與對(duì)照組相比SRBC特異的IgM滴度降低了50％而檢測(cè)不到SRBC特異的IgG(圖6C)。這些數(shù)據(jù)表明LTβ-R-Ig處理方法可導(dǎo)致已存在的IgM和IgG應(yīng)答水平的減弱/減小，即LTβ-R-Ig處理可抑制已啟動(dòng)的體液應(yīng)答。
抗體介導(dǎo)的疾病許多器官特異的多系統(tǒng)自身免疫狀況涉及了病理性的抗體應(yīng)答。這樣的狀況包括重癥肌無(wú)力，自身免疫性溶血性貧血，南美洲錐蟲(chóng)病，突眼性甲狀腺腫，自發(fā)性血小板減少紫癜(ITP)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，以及快速進(jìn)行性新月形腎小球性腎炎。(來(lái)自Benjamini等，免疫學(xué)，簡(jiǎn)易教程，(Wiley-Liss,New York第3版，(1996))。
盡管還未確定SLE的病原學(xué)，對(duì)于產(chǎn)生這種病理現(xiàn)象的免疫學(xué)機(jī)制有相當(dāng)?shù)牧私狻Ｓ捎谖粗脑?，SLE患者產(chǎn)生針對(duì)身體核組分的抗體(抗核抗體，NAA)，值得注意的是針對(duì)天然雙鏈DNA。臨床上，這些抗體的出現(xiàn)與SLE中腎牽連的病理有較大的相關(guān)性。這些包含DNA抗體復(fù)合物顯然來(lái)自正常組織的降解，與任何免疫聚集病疾，這樣的復(fù)合物被捕捉于腎小球基底膜上，微動(dòng)脈壁上和關(guān)節(jié)滑液空間內(nèi)形成沉積。這些復(fù)合物活化補(bǔ)體級(jí)聯(lián)從而吸引粒細(xì)胞。隨后的炎癥反應(yīng)特征是腎小球性腎炎，伴隨的腎破壞可導(dǎo)致蛋白尿和血尿。
已通過(guò)鼠模型對(duì)狼瘡性腎炎進(jìn)行了幾十年的研究。最近，在這樣的一個(gè)模型中評(píng)價(jià)了針對(duì)鼠CD40配體的具治療效果的試劑(Mohan等，免疫學(xué)雜志，154，第1470-1480頁(yè)(1995))，使用阻斷CD40/CD40配體相互作用的單克抗體可抑制由于體內(nèi)轉(zhuǎn)移了誘導(dǎo)致病性抗體產(chǎn)生的細(xì)胞導(dǎo)致的狼瘡加速。而且，用抗體CD40配體抗體短期治療狼瘡小鼠，在抗體被系統(tǒng)清除后的很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)自發(fā)疾病有持續(xù)且有利的影響。實(shí)驗(yàn)表明甚至在治療后9個(gè)月后，病理性B細(xì)胞不能產(chǎn)生抗體，暗示存在可導(dǎo)致長(zhǎng)期治療效益的自身免疫記憶B細(xì)胞擴(kuò)展的延遲。正如我們所表明的，體內(nèi)阻斷LTα/β/LTβ-R相互作用抑制抗體應(yīng)答的產(chǎn)生，改變FDC表型及參與優(yōu)化B細(xì)胞記憶的生發(fā)中心的形成，本發(fā)明的LTα/B/LTβ-R封閉劑可用于治療或預(yù)防SLE。
針對(duì)某些致病性感染因子的正常免疫應(yīng)答也誘發(fā)過(guò)分的自身抗體應(yīng)答從而造成醫(yī)學(xué)問(wèn)題。一個(gè)例子是南美洲錐蟲(chóng)病，在人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展為伴隨慢性克氏錐蟲(chóng)感染的炎性心肌病。在參與人Chagas心肌炎的所有可能機(jī)制中，心臟特異的自身免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)最近得到了大量實(shí)驗(yàn)的支持。最近的研究(Tibbetts等，免疫學(xué)雜志，152，第1493-1499頁(yè)(1994))明確在T.Cruzi感染的患心臟疾病的C57B1/6小鼠中產(chǎn)生了心臟抗原特異的抗體。一旦被克氏錐蟲(chóng)Brazil株感染，C57B1/6小鼠發(fā)展為組織學(xué)上與慢性感染的人相似的心肌炎。這些小鼠的抗血清與三種心臟抗原反應(yīng)，而感染了克氏錐蟲(chóng)Guayas株的C57B1/6小鼠不發(fā)展為心肌炎也不產(chǎn)生這樣的抗體。這些數(shù)據(jù)表明這些抗體是心肌炎特有的標(biāo)記。因此可在這樣的嚙齒動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)LTβ-R封閉劑抑制自身抗體介導(dǎo)的破壞的能力。
由某些感染疾病或其它未知原因產(chǎn)生的自身抗體導(dǎo)致的細(xì)胞破壞的另一例子是自發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)。在這種情況下，針對(duì)血小板的抗體導(dǎo)致了血小板破壞(由補(bǔ)體或具Fc或C3b受體的吞噬細(xì)胞)可導(dǎo)致出血。體內(nèi)抑制這樣的抗體介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)的治療方法，如本發(fā)明的LT-β-R封閉劑-抑制抗體的產(chǎn)生-也可用于治療或預(yù)防這些自身免疫疾病。
針對(duì)某些致病性感染因子的正常免疫應(yīng)答也誘發(fā)過(guò)分的超敏反應(yīng)從而其本身成為醫(yī)學(xué)問(wèn)題。Ⅰ型超敏反應(yīng)最多的例子是變態(tài)反應(yīng)。它們是由通過(guò)Fc部分與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的受體結(jié)合的IgE抗體介導(dǎo)以引發(fā)釋放介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的藥學(xué)活性因子。有時(shí)認(rèn)為ITP和古德帕斯徹綜合癥是Ⅱ型反應(yīng)，Ⅱ型反應(yīng)是當(dāng)IgM或IgG抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合然后活化補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)反生的。粒細(xì)胞被吸引到活化位點(diǎn)，其顆粒體中釋放的分解酶導(dǎo)致的破壞使細(xì)胞破壞。據(jù)認(rèn)為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是Ⅲ型超敏反應(yīng)的結(jié)果，Ⅲ型超敏反應(yīng)是由與正常IgG的Fc部分結(jié)合的抗原(在這種情況是風(fēng)濕因子，IgM自身抗體)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的。這些免疫復(fù)合物參與了關(guān)節(jié)的炎癥及此病特有的損壞。因?yàn)檫@些病理部分是由抗體介導(dǎo)的，抑制抗體產(chǎn)生的治療方法，如本發(fā)明的LT-β-R封閉劑-也可用于治療或預(yù)防這類(lèi)疾病。
用LTβ-R封閉劑治療將以有效劑量使用本發(fā)明的組合物治療談到的特定臨床狀況。確定給定應(yīng)用的優(yōu)選藥物制劑和治療有效劑量屬于本領(lǐng)域的技術(shù)，例如，要考慮病人的狀態(tài)和體積，希望的治療程度以及病人對(duì)此治療的耐受性。
期望可溶性LTβ-R以1mg/kg劑量適合作為優(yōu)化治療劑量的起點(diǎn)。
可通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)確定治療有效劑量，這種實(shí)驗(yàn)測(cè)定包被靶細(xì)胞(LTβ-R或LT配體陽(yáng)性細(xì)胞，依封閉劑而定)1-14天所需的LTβ-R封閉劑的濃度。在以往的于1995年7月21日提交的申請(qǐng)人共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/505,606描述的受體配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)可用于監(jiān)控細(xì)胞包被反應(yīng)。用FACS可以活化的淋巴細(xì)胞群中分離LTβ-R或LT配體陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可選擇適合的LTβ-R封閉劑濃度范圍在動(dòng)物中檢驗(yàn)。
本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子、抗LT配體和抗LTβ-R的抗體包括分離純化形式的抗體或復(fù)合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，單獨(dú)或聯(lián)合使用可通過(guò)傳統(tǒng)已接受的施用具有免疫抑制活性的因子的方式來(lái)完成。
在這些治療方法中施用的藥物組合物可以各種形式存在，包括例如固體、半固體和液體劑量形式如片劑，丸劑，粉劑，液體溶液或懸液，栓劑；以及可注射和可灌注的溶液。優(yōu)選的方式依賴(lài)于預(yù)期的施用方式和治療應(yīng)用。施用方式可包括口腔，腸胃外，皮下，靜脈內(nèi)，病灶內(nèi)或局部施用。
本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體可以，例如，單獨(dú)或與促進(jìn)吸收或穩(wěn)定性的輔因子放入無(wú)菌的等滲制劑中。優(yōu)選地，制劑是液體，或是干燥的粉末。例如，本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體可用包含5.0mg/ml檸檬酸-水合物，2.7mg/mL檸檬酸三鈉，41mg/mL甘露醇，1mg/ml甘氨酸和1mg/ml多聚山梨酸酯20的制劑緩沖液稀釋。這種溶液也被干燥；貯存于冷凍條件下，在使用前重新溶于無(wú)菌注射用水(USP)。
優(yōu)選地，組合物也可包含本領(lǐng)域眾所周知的傳統(tǒng)的藥學(xué)上可接受的載體(見(jiàn)例如Remington藥物科學(xué)，第16版，1980,Mac PublishingCompany)。這樣的藥學(xué)可接受載體包括其它藥用劑，載體，基因載體，佐劑，賦形劑等，如人血清白蛋白或血漿制品。優(yōu)選地，此組合物以單位劑量形式且通常一天使用一次或多次。
本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)微球體，脂質(zhì)體，其它微顆粒運(yùn)送系統(tǒng)使用或?qū)⒅苿┲糜谑軗p組織或血流內(nèi)、附近或以某種方式使它們相聯(lián)系從而使組合物持續(xù)釋放。合適的持續(xù)釋放載體包括以有形物品如栓劑或微膠囊形式出現(xiàn)的半透性多聚體基質(zhì)。植入性-或微膠囊性持續(xù)釋放基質(zhì)包括polyactides(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,773,319；EP58,481)L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸共聚體(Sidman等，生物多聚體，22，第547-56頁(yè)(1985))；多聚(2-羥乙基-異丁烯酸)或ethyleme Vinyl acetate(Lanager等，生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志，15，第167-277頁(yè)(1981)；Langer，化學(xué)技術(shù)，12，第98-105頁(yè)(1982))。
可用眾所周知的方法(見(jiàn)如，DE3,218,121；Epstein等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，82，第3688-92頁(yè)(1985)；Hwang等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，77，第4030-34頁(yè)(1980)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,485,045和4,544,545)，制備包含本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體的脂質(zhì)體。通常，脂質(zhì)體是小的(約200-800A)單層，其中脂含類(lèi)高于30mol％膽固醇。選擇膽固醇的比例以控制可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體的最佳釋放速度。
本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體可與包含其它LTβ-R封閉劑，免疫抑制劑或細(xì)胞因子的脂質(zhì)體相連以調(diào)節(jié)LTβ-R封閉活性。可用任何已知的交聯(lián)劑如廣泛用于將毒素或化療劑與抗體偶聯(lián)從而定向運(yùn)送的異雙功能交聯(lián)劑將LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體與脂質(zhì)體相連。運(yùn)用糖類(lèi)定向的交聯(lián)劑4-(4-馬來(lái)酰苯)丁酸肼(MPBH)可完成與脂質(zhì)體的偶聯(lián)(Duzgunes等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，摘要，增補(bǔ)；16E77(1992))。
包含LTβ-R封閉劑的治療組合物的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的LTβ-R封閉劑能選擇性地抑制免疫效應(yīng)物機(jī)制?？贵w介導(dǎo)的免疫抑制受多種機(jī)制抑制，包括通過(guò)影響FDC功能調(diào)節(jié)GC形成。通過(guò)調(diào)節(jié)地址素表達(dá)從而影響淋巴細(xì)胞運(yùn)輸，抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫都部分受到抑制。因而，LTβ-R封閉劑可用于治療由于抗體活性或地址素異常表達(dá)惡化的狀況。選擇性抑制這樣的免疫介導(dǎo)的反應(yīng)的能力可用以治療包括各種自身免疫和慢性炎癥狀況在內(nèi)的異常。如上文所討論的，運(yùn)用對(duì)于多種細(xì)胞和免疫應(yīng)答具多重效應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑治療這樣的由免疫介導(dǎo)的病理狀況。通常，非特異性的免疫抑制劑需要量很大，常常是導(dǎo)致副作用的細(xì)胞毒性劑量。
試劑的抑制抗體應(yīng)答以減輕病理性免疫應(yīng)答的能力得到最近的對(duì)于小鼠狼瘡性腎炎的研究的支持。在后一個(gè)研究中，使用阻斷CD40/CD40L通路的抗體可抑制由于體內(nèi)轉(zhuǎn)移了誘導(dǎo)致病性抗體產(chǎn)生細(xì)胞導(dǎo)致的狼瘡性腎炎的加速，在抗體被系統(tǒng)清除后的很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)自發(fā)疾病有持續(xù)且有利的影響。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的LTβ-R封閉劑通過(guò)抑制導(dǎo)致抗體應(yīng)答產(chǎn)生的過(guò)程可用于抑制組織移和器官移植中的細(xì)胞排斥。
根據(jù)受治療的狀況，異?；蚣膊。景l(fā)明組合物和方法中的LTβ-R封閉劑可被修飾以得到希望的LTβ-R信號(hào)傳導(dǎo)水平?？梢灶A(yù)想，通過(guò)控制LTβ-R封閉劑針對(duì)其各自的分子靶所需的濃度和親和力使LTβ-R信號(hào)傳導(dǎo)的絕對(duì)水平得到精細(xì)調(diào)節(jié)。
例如，本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施方案中，將包含可溶性LTβ-R分子的組合物運(yùn)用于受試對(duì)象?？扇苄缘腖Tβ受體可有效地與細(xì)胞表面LTβ受體競(jìng)爭(zhēng)表面LT配體。與表面LT配體競(jìng)爭(zhēng)的能力依賴(lài)于可溶性和細(xì)胞表面LTβ-R分子的相對(duì)濃度，以及它們對(duì)于配體結(jié)合的相對(duì)親和力。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，可產(chǎn)生具有突變的可溶性LTβ-R分子，從而提高或降低突變的可溶性LTβ-R與表面LT配體的結(jié)合親和力。用常規(guī)實(shí)驗(yàn)和在此所述的技術(shù)，檢測(cè)大量的具定點(diǎn)或隨機(jī)突變分子作為L(zhǎng)Tβ-R封閉劑的能力。
相似地，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，針對(duì)LTβ受體或LT配體一個(gè)或多個(gè)亞基的抗體可作為L(zhǎng)Tβ-R封閉劑。突變，化學(xué)修飾或通過(guò)其它能改變對(duì)受試對(duì)象所用抗體有效濃度和活性的方法修飾這些抗體封閉LTβ受體信號(hào)傳導(dǎo)的能力。
減弱而不完全抑制LTβ-R信號(hào)傳導(dǎo)的能力對(duì)于建立或維持降低了的信號(hào)傳導(dǎo)的水平，它可支持正常免疫功能而抑制夸大的或不正常的抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。
小鼠LTα基因的破壞導(dǎo)致外周淋巴器官發(fā)育異常(De Togni等，科學(xué)，264，第703-707頁(yè)(1994))。這樣的小鼠缺乏淋巴結(jié)和脾濾泡中的T和B細(xì)胞豐富區(qū)之間缺乏清析的界限。我們認(rèn)為這種表型與表面LT誘導(dǎo)的LTβ-R信號(hào)傳導(dǎo)的丟失相關(guān)，因?yàn)檎{(diào)節(jié)TNF-α活性觀察不到相似的表型。選擇性地或特異阻斷LTβ-R通路的能力可用于治療由與LTβ-R通路中信號(hào)的誤表達(dá)或過(guò)表達(dá)相關(guān)的慢性炎癥引起的淋巴樣結(jié)構(gòu)的異常發(fā)育。
抗體在針對(duì)致病因子的免疫反應(yīng)中是關(guān)鍵介導(dǎo)者。因此，在某些情況下并不希望完全抑制抗體應(yīng)答。例如，抵抗細(xì)胞外細(xì)菌如肺炎球菌和嗜血桿菌感染需要由抗體介導(dǎo)。
阻斷LTβ-R信號(hào)傳導(dǎo)影響抗體產(chǎn)生水平的能力于對(duì)用本發(fā)明的LTβ-R封閉劑治療時(shí)有益效果達(dá)到最大是重要的。
本發(fā)明的治療方法涉及選擇性地抑制全部或部分依賴(lài)于LT-β通路的應(yīng)答。本權(quán)利要求的發(fā)明的特定治療作用依賴(lài)于抑制病原機(jī)制，還是促進(jìn)醫(yī)學(xué)上希望的過(guò)程，這一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。因此在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及使用治療有效量的LT-β-R或LT-β封閉劑。這些方法所用的蛋白可以是全長(zhǎng)蛋白，蛋白片段或融合片段。在其它實(shí)施方案中，此方法涉及使用可溶性片段，如可溶性β-淋巴毒素受體。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，此權(quán)利要求的發(fā)明涉及使用針對(duì)LT-β-R或LT-β的抗體。本發(fā)明的封閉劑可與治療有效量的產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上希望效果的第二種復(fù)合物同時(shí)使用。
例如，在某些治療艾滋病和/或HIV的方法中，人們喜歡同時(shí)使用本領(lǐng)域熟悉的另外的抗病毒物質(zhì)。例如，AZT或蛋白酶抑制劑。特別優(yōu)選的本發(fā)明封閉劑，更優(yōu)選地，LTβ-R/IgG融合蛋白可與艾滋病“雞尾酒”治療方案聯(lián)合使用。藥物“雞尾酒”涉及給病人多種藥物以降低病人系統(tǒng)中病毒的數(shù)量。
按照標(biāo)準(zhǔn)操作，本發(fā)明的組合物可制成制劑，如制備于載體中。術(shù)語(yǔ)藥學(xué)上可接受的載體指一種或多種有機(jī)或無(wú)機(jī)成分，天然的或合成的，它可促進(jìn)病人使用本發(fā)明封閉劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知合適的載體。
可用醫(yī)學(xué)上可接受的方式使用本發(fā)明的任一組合物。這包括注射，非腸道途徑如靜脈內(nèi)，血管內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，皮下，肌肉，腫瘤內(nèi)，腹膜內(nèi)，intraentriculare，硬膜內(nèi)或其它的方式，以及口的，鼻的，眼的，直腸的或局部途徑。本發(fā)明也特別包括通過(guò)貯存注射或植入產(chǎn)生的持續(xù)釋放用藥。也可采用局部運(yùn)送。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定用藥方式。
用于此申請(qǐng)專(zhuān)利的發(fā)明中的LT通路的抑制劑欲包括在此申請(qǐng)專(zhuān)利的可溶性LT-β-R，抗體的功能衍生物。功能衍生物包括分子片段，變異體，類(lèi)似物或化學(xué)衍生物。分子片段，如本發(fā)明任何抗原起源與分子的任何多肽。這樣分子的變異體指與全長(zhǎng)分子或其片段基本相似的天然分子。分子類(lèi)似物指與全長(zhǎng)分子或其片段基本相似的非天然分子。
本發(fā)明封閉劑的變異體與天然因子的區(qū)別在于氨基酸序列，或不涉及序列的方式，或兩者皆具備。當(dāng)天然分子的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被不同的天然氨基酸，氨基酸衍生物或非天然氨基酸替代時(shí)，產(chǎn)生了氨基酸序列變異體。特別優(yōu)選的變異體包括天然蛋白，或天然蛋白的生物活性片段，其序列與野生型序列的區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸的替代。這樣的替代為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，典型地對(duì)封閉劑的次級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性有最小的影響。
在其它實(shí)施方案中，具保守性差的氨基酸替代的變異體可產(chǎn)生希望的衍生物，如通過(guò)導(dǎo)致電荷，構(gòu)象和其它生物特征的變化。這樣的替代包括，例如，用親水殘基代替疏水殘基，用半胱氨酸或脯氨酸替代另一個(gè)殘基，用具小側(cè)鏈的殘基替代具大側(cè)鏈的殘基，或用具凈正電荷的殘基替代具凈負(fù)電荷的殘基。當(dāng)不能確定預(yù)測(cè)給定替代的結(jié)果時(shí)，可用此處公開(kāi)的方法確定希望特征的存在或缺失以測(cè)定此衍生物。
本發(fā)明范圍內(nèi)的變異體包括與本發(fā)明的封閉劑的氨基酸有至8％同源性的蛋白質(zhì)和多肽。更優(yōu)選地，序列同源性至少為90％，或至少95％。為了測(cè)定同源性，比較序列的長(zhǎng)度一般至少為8個(gè)氨基酸序列，通常至少20個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明范圍內(nèi)的變異體包括任何封閉劑，它1)具有與封閉劑序列有至少40％同源性的氨基酸序列，也包括2)與本發(fā)明封閉劑序列以最佳排列放在一起時(shí)，其80％的半胱氨酸與本發(fā)明封閉劑的半胱氨酸排列。
與本發(fā)明的封閉劑特異結(jié)合的本發(fā)明內(nèi)的因子包括配體和抗體。
下面說(shuō)明本發(fā)明的LTβ受體，抗LT配體和抗LTβ-R抗體的例子和確定它們的方法。這些例子不應(yīng)有限制性這些例子是起說(shuō)明作用而且本發(fā)明只由權(quán)利要求書(shū)定義。
實(shí)施例1制備與免疫球蛋白Fc形成融合蛋白的可溶性人LTβ受體從人12p轉(zhuǎn)錄序列庫(kù)中分離的來(lái)自體細(xì)胞雜種人cDNA克隆的序列(Baens等，基因組，16，第214-18頁(yè)(1993)，被輸入基因文庫(kù)，后來(lái)被確定為編碼人LTβ-R的序列。從1992年，全長(zhǎng)人LTβ-R cDNA克隆序列可以得到，其基因庫(kù)進(jìn)入號(hào)為L(zhǎng)O 4270。
用5’端和3’端分別有NotⅠ和SalⅠ限制性酶位點(diǎn)的引物擴(kuò)增至穿膜區(qū)LTβ-R的胞外區(qū)(圖1)(Browning等，免疫學(xué)雜志，154，第33-46頁(yè)(1995))。用NotⅠ和SalⅠ切割擴(kuò)增片段，純化并將之與用編碼人IgG1 Fc區(qū)的SalⅠ-NotⅠ片段連接到經(jīng)NotⅠ線型化的載體PMDR 901中。最終的載體包含由各自啟動(dòng)子推動(dòng)的二氫葉酸還原酶基因和LTβR-Ig融合蛋白。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法，將載體電轉(zhuǎn)入CHO dhfr細(xì)胞并分離具氨甲蝶呤抗性的克隆。LTβ-R-Ig被分泌到培養(yǎng)基中，用ELISA實(shí)驗(yàn)篩選合成受體融合蛋白水平最高的細(xì)胞系。將合成水平的高細(xì)胞大量培養(yǎng)并收集條件培養(yǎng)基。用蛋白A瓊脂糖快流速親和層析(pharmaria)分離純的LTβ受體融合蛋白。
實(shí)施例2制備與免疫球蛋白Fc形成融合蛋白的可溶性鼠LTβ受體。
將來(lái)自兩個(gè)部分cDNA分離物的5’NotⅠ/ApalⅠ和3’ApalⅠ/NotⅠ片段連接到PCDNA 3的NotⅠ位點(diǎn)(Invitrogen,San Diego,CA)以制備鼠LTβ-R的全cDNA克隆。此cDNA克隆的序列可通過(guò)基因庫(kù)進(jìn)入號(hào)U29173得到。與已輸入的基因庫(kù)進(jìn)入號(hào)L38423的另一鼠LTβ-R序列比較，未發(fā)現(xiàn)編碼序列的差異。
以全長(zhǎng)的m LTβ-R cDNA克隆作為模板，用引物5’AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC3’和5’GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG 3’通過(guò)PCR擴(kuò)增合成可溶性鼠LTβ-R/人IgG1融合蛋白。純化并以NotⅠ和SalⅠ切割擴(kuò)增片段后與人IgG1 Fc的SalⅠ/NotⅠ片段一起連接到NotⅠ線性化并經(jīng)磷酸酶處理的SAB 132以形成JLB122。為了穩(wěn)定表達(dá)，將包含鼠LTβ-R-Ig片段的Not盒轉(zhuǎn)到PMDR 901的NotⅠ位點(diǎn)從而形成PSH 001，按照(Browning等，免疫學(xué)雜志，154，第33-46頁(yè)(1995))所述的方法，將此載體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。用ELISA分析鑒定分泌鼠LTβ-R-Ig的細(xì)胞克隆。用蛋白A瓊脂糖快流速層析(pharmacia)從CHO細(xì)胞上清中分離純的受體融合蛋白以用于下述的實(shí)施例中。
實(shí)施例3以LTβ-R-Ig多次注射小鼠后對(duì)脾進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析4-5周齡的小鼠接受6次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig注射(100ug，腹膜內(nèi))，每周一次，在第6次注射融合蛋白的當(dāng)天用SRBC免疫這些小鼠。以SRBC攻擊后的第4天；再注射一次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig。在SRBC攻擊后的第10天處死小鼠并收集器官以分析其結(jié)構(gòu)。圖2中的左列代表來(lái)自LFA-3-Ig處理動(dòng)物的脾切片(A,C,E,G,I)；右列代表來(lái)自LTβ-R-Ig處理動(dòng)物的脾切片(B,D,F,H,J)。以生物素化的抗鼠B220標(biāo)記的和抗小鼠CD40抗體雙染丙酮固定的冷凍脾切片(A和B)，然后分別用相應(yīng)的堿性磷酸標(biāo)記的鏈親和素(紫藍(lán)，暗染色)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗大鼠Ig(淺棕染色)進(jìn)行第二次染色。用抗體ER-TR-9(檢測(cè)M2M,C和D),MOMA-1(檢測(cè)嗜金屬噬細(xì)胞，E和F),MECA-367(針對(duì)MAdCAM-1,G和H)，以及ER-TR-7(染網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞，I和J)對(duì)另一套冰凍切片染色，然后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗大鼠Ig進(jìn)行第二次染色(棕色染色)。這些圖片代表了最少6只動(dòng)物的切片染色。放大倍數(shù)10×。
實(shí)施例4LTβ-R-Ig和抗CD40配體對(duì)GC形成和FDC染色的影響按實(shí)施例3所述的方法，以LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig處理動(dòng)物，以MR1(抗小鼠CD40配體，250ug/注射，腹膜內(nèi))在第-1天，第1天和第三天處理另一組動(dòng)物，在第0天接受SRBC，第10天處死動(dòng)物，用生物素標(biāo)記的商陸凝集素(PNA，上排，A,B和C)或FDC M1(下排，D,E和F)對(duì)用LFA-3-Ig(圖3左列；A和D)，或LTβ-R-Ig(中列；B和E)；或MR1(右列，C和F)處理動(dòng)物的丙酮固定的脾切片進(jìn)行染色，然后分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗大鼠Ig進(jìn)行第二次染色(棕色染色)。用箭頭指示A和C中的邊緣區(qū)的PNA染色。用白星指示A中GC的形成；黑箭頭指示D和F中FDC染色。這些圖片代表了至少4只動(dòng)物的切片染色。放大倍數(shù)10×。
實(shí)施例5子宮內(nèi)和出生后連續(xù)用LTβ-R-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)中地址素的表達(dá)這些實(shí)驗(yàn)使用了定時(shí)受孕Balb/c小鼠的子代，在懷孕的第14天和第17天靜脈注射200ug受體-Ig蛋白。出生后，每周腹膜內(nèi)注射一次100ugLTβ-R-Ig,TNF-R 55-Ig或LFA-3-Ig。ELISA測(cè)定的表明在整個(gè)生命過(guò)程中，融合蛋白的水平保持或高于10ug/ml(數(shù)據(jù)未顯示)。圖4系列A,B,G,H是對(duì)以LTβ-R-Ig處理小鼠的淋巴結(jié)染色。系列C,D是對(duì)以LFA-3-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)的染色。系列E,F是對(duì)以TNF-R55-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)的染色。系列A,C,E,G是用抗體MECA 367對(duì)腸系膜淋巴結(jié)染色以檢測(cè)粘膜地址素；MAdCAM-1。系列B,D,F,H是用針對(duì)外周淋巴結(jié)地址素(PNAdS)的抗體MECA9進(jìn)行染色。系列G,H是只在子宮內(nèi)經(jīng)LTβ-R-Ig處理的6周齡小鼠淋巴結(jié)，所有圖象的放大倍數(shù)為50×。
實(shí)施例6
子宮內(nèi)和出生后經(jīng)LTβ-R-Ig連續(xù)處理小鼠的淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞的定位及巨噬細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。按實(shí)施例5所述，以LTβ-R-Ig,TNF-R55-Ig，或LFA-3-Ig在子宮內(nèi)和出生后連續(xù)處理小鼠。用針對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記的抗體或針對(duì)B細(xì)胞標(biāo)記B220及T細(xì)胞標(biāo)記CD4的單克隆抗體對(duì)LN切片進(jìn)行染色。用圖象分析鑒定T和B細(xì)胞區(qū)的重疊。圖5系列A,D,G分別是用B220/CD4對(duì)經(jīng)LTβ-R-Ig,LFA-3-Ig和TNF-R 55-Ig處理小鼠的淋巴結(jié)進(jìn)行染色。用圖象分析軟件分析熒光圖象。系統(tǒng)B,E,H對(duì)唾酸粘附素進(jìn)行染色，系列C,F,I是對(duì)MOMA-1進(jìn)行染色。
實(shí)施例7LTβ-R-Ig處理對(duì)針對(duì)SRBC的抗體應(yīng)答的影響，按下面所述以LTβ-R-Ig，人Ig或PBS注射Balb/c小鼠圖6A小鼠接受如圖2，實(shí)施例所述的六次注射。在SRBC免疫后第7天(黑棒)和第14天(條形棒)給動(dòng)物放血。6B動(dòng)物在第-7天和第0天接受融合蛋白。SRBC在第0天給予；在第7天(黑棒)，第14天(條形棒)和第30天(白棒)給動(dòng)物放血。6C動(dòng)物在第0天接受一次融合蛋白，與SRBC免疫的時(shí)間相同。在第7天(黑棒)，第14天(條形棒)和第34天(灰棒)收集血。
以血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)分析血清中SRBC特異的IgM和IgG的滴度。滴度定義為可檢測(cè)到血細(xì)胞凝集的血清最后稀釋度的倒數(shù)并用底數(shù)為2的對(duì)數(shù)代表(1=血清稀釋15倍)。結(jié)果以每組4只不同動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)方差平均數(shù)代表。
權(quán)利要求
1．一種改變動(dòng)物體液免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟a)使用包含治療有效量的LT-β-R封閉劑的藥物組合物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中LT-β-R封閉劑選自由可溶性β-淋巴毒素受體、針對(duì)LT-β受體產(chǎn)生的抗體和針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
5．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括具有能選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)的可溶性β-淋巴毒素受體。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中可溶性β-淋巴毒素受體包括人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
7．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對(duì)LT-β受體產(chǎn)生的單克隆抗體。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中組合物以足夠覆蓋LT-β-受體陽(yáng)性細(xì)胞的量施用1-14天。
9．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括抗人LT-β-R的單克隆抗體BDA8。
10．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的單克隆抗體。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中組合物以足夠覆蓋表面LT配體陽(yáng)性細(xì)胞的量施用1-14天。
12．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中抗體是針對(duì)LT配體的亞基產(chǎn)生的。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括抗人LT-β的單克隆抗體B9。
14．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對(duì)鼠表面LT配體產(chǎn)生的單克隆抗體。
15．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體或佐劑。
16．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中體液免疫應(yīng)答受到抑制。
17．一種藥物組合物，包含治療有效量的LT-β-R封閉劑和藥學(xué)上可接受的載體。
18．根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物；其中LT-β-R封閉劑選自由可溶性β-淋巴毒素受體、針對(duì)LT-β受體產(chǎn)生的抗體和針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
19．一種抑制LT-β-R信號(hào)傳導(dǎo)但不抑制TNF-R信號(hào)傳導(dǎo)的方法，包括對(duì)處理對(duì)象施用有效量的LT封閉劑的步驟。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中LT-β-R封閉劑選自由可溶性β-淋巴毒素受體、針對(duì)LT-β受體產(chǎn)生的抗體和針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
21．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中處理對(duì)象包括哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。
22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
23．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括具有能選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)的可溶性β-淋巴毒素受體。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中可溶性β-淋巴毒素受體進(jìn)一步包含人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
25．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對(duì)LT-β-受體產(chǎn)生的單克隆抗體。
26．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括抗人LT-β-R的單克隆抗體BDA8。
27．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的單克隆抗體。
28．一種改變病人免疫復(fù)合物和B細(xì)胞濾泡結(jié)合的方法，包括給該病人施用一定量的LT-β-R封閉劑。
29．權(quán)利要求28的方法，其中所述的病人感染了人免疫缺損病毒。
30．權(quán)利要求28的方法，其中所述的封閉劑選自由可溶性LT-β-R，針對(duì)LT-β-R產(chǎn)生的抗體，針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
31．權(quán)利要求30的方法，其中所述的可溶性LT-β-R具有可選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)。
32．權(quán)利要求31的方法，其中所述的可溶性受體包含人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
33．權(quán)利要求28的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對(duì)LT-β-R產(chǎn)生的單克隆抗體。
34．權(quán)利要求33的方法，其中所述的抗體是抗人LT-β-R的單克隆抗體BDA8。
35．權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體或佐劑。
36．一種治療、預(yù)防或清除哺乳動(dòng)物中人免疫缺損病毒的方法，包括施用含有治療有效量的LT-β-R封閉劑和藥學(xué)上有效的載體的藥物組合物這一步驟。
37．權(quán)利要求36的方法，其中LT-β-R封閉劑選自由可溶性β-淋巴毒素受體、針對(duì)LT-β-R產(chǎn)生的抗體和針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
38．權(quán)利要求37的方法，其中封閉劑包括具有能選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)的可溶性β-淋巴毒素受體。
39．權(quán)利要求38的方法，其中可溶性受體包含人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
40．權(quán)利要求36的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對(duì)LT-β-R產(chǎn)生的單克隆抗體。
41．權(quán)利要求40的方法，其中封閉劑包括抗人LT-β-R的單克隆抗體BDA8。
42．權(quán)利要求36的方法，其中封閉劑包括針對(duì)表面LT配體產(chǎn)生的單克隆抗體。
43．權(quán)利要求36的方法，進(jìn)一步包括同時(shí)施用其它抗病毒劑。
44．權(quán)利要求28的方法，其中B細(xì)胞是小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞。
45．一種治療移植排斥的藥物組合物，包含治療有效量的LT-β-R封閉劑和治療有效量的CD40L封閉劑。
46．權(quán)利要求45的組合物，其中LT-β-R封閉劑是LT-β-R/IgG，而CD40L封閉劑是抗CD40L的化合物。
47．一種治療AIDS或HIV的藥物組合物，包含AZT、蛋白酶抑制劑和LT-β-R封閉劑。
48．權(quán)利要求47的組合物，其中封閉劑是LT-β-R/IgG融合蛋白。
49．權(quán)利要求46的組合物，其中抗CD40L的化合物是單克隆抗體。
50．權(quán)利要求49的組合物，其中抗體是5c8。
全文摘要
包含阻斷β－淋巴毒素受體信號(hào)傳導(dǎo)的“β－淋巴毒素受體封閉劑”并用于改變免疫學(xué)疾病，尤其是抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1237910SQ9719990
公開(kāi)日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1997年10月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月25日
發(fā)明者J·布朗寧, P·S·霍克曼, P·D·倫納特, F·麥凱 申請(qǐng)人:拜奧根有限公司