專利名稱：含有酰胺和視黃醇或視黃酯的皮膚護(hù)理組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有脂肪酰胺和視黃醇或視黃酯的皮膚護(hù)理組合物，并涉及在皮膚上施用該組合物的方法。
背景技術(shù)：
視黃醇(維生素A)是一種內(nèi)源的化合物，其天然存在于人體內(nèi)，并且對(duì)正常的上皮細(xì)胞分化來說是必要的。天然的和合成的維生素A衍生物已經(jīng)被廣泛地用于治療多種皮膚疾病，也已用作皮膚護(hù)理或再生劑。視黃酸已被用于治療多種皮膚病癥，例如粉刺、皺紋、牛皮癬、老年斑和變色。見例如Vahquist,A.等，皮膚研究雜志，Vol.94,Holland D.B.and Curdiffe,W.J.(1990),496-498頁；Ellis,C.N.等，″皮膚中視黃醇的藥理學(xué)″，Vasel,Karger,Vol.3(1989),249-252頁；Lowe,N.J.等，″皮膚中視黃醇的藥理學(xué)″，Vol.3(1989),240-248頁；PCT專利申請(qǐng)?zhí)朩O93/19743。
人們相信，利用視黃醇或視黃醇酯比用視黃酸更有利。視黃醇天然地存在于人體內(nèi)，并被認(rèn)為比視黃酸安全。視黃醇酯在體內(nèi)水解生成視黃醇。人們相信，視黃醇酯和視黃醇在皮膚內(nèi)按照下述代謝方式轉(zhuǎn)化成視黃酸視黃酯視黃醇↓視黃酸然而，大多數(shù)內(nèi)源性供應(yīng)的(endogenously applied)視黃醇快速地被轉(zhuǎn)化成無活性的脂肪酯，貯存在表皮細(xì)胞(角質(zhì)細(xì)胞)中。視黃醇在細(xì)胞中酯化為無活性的視黃酯的反應(yīng)是通過如下方式完成的在?；o酶A視黃醇轉(zhuǎn)移酶(ARAT)的催化下，從?；o酶A轉(zhuǎn)移脂肪酰基；或在卵磷脂視黃醇?；D(zhuǎn)移酶(LRAT)的催化下，從磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移?；?。這些酯化反應(yīng)在角質(zhì)細(xì)胞中是非常有效的，而細(xì)胞類視色素(retinoid)主要(95％)以脂肪酸視黃酯形式存在。因此，不利地，雖然視黃醇和視黃酯比視黃酸更安全，它們?cè)谑蛊つw受益方面不如視黃酸有效。
本發(fā)明部份地基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即某些N-取代的脂肪酰胺抑制上述酯化反應(yīng)，從而通過提高用于轉(zhuǎn)化為視黃酸的視黃醇的量，加強(qiáng)視黃醇的作用。因此，這些N-取代的脂肪酰胺與視黃醇或視黃酯的混合物模擬視黃酸的作用，而且比用視黃酸更安全。1996年11月13日出版(本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日之后)的較早前提交的歐洲專利申請(qǐng)EP0742005(聯(lián)合利華，優(yōu)先權(quán)日1995年5月8日)，公開了脂肪酰胺與視黃醇或視黃酯的結(jié)合。但是EP′005沒有講授本發(fā)明中特定的N-取代脂肪酰胺，或任何在氮原子上有支鏈含烷氧基取代基的脂肪酰胺。
發(fā)明概述本發(fā)明部份地包括一種皮膚調(diào)理組合物，其含有(a)0.001％到10％的視黃醇或視黃酯；(b)0.0001％到50％的N-取代的式Ⅰ脂肪酰胺

(Ⅰ)其中R1=具有1至10個(gè)碳原子的烷基或烷氧基；R2=具有8至25個(gè)碳原子的烷基或鏈烯基；R3=含有1至5個(gè)碳原子的烷基，或磷酸酯；以及(c)一種美容用賦形劑。
本發(fā)明也提供一種調(diào)理皮膚的美容方法，包括將本發(fā)明的組合物局部地施用在皮膚上。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種模擬視黃酸在皮膚上的作用的美容方法，該方法包括將本發(fā)明的組合物局部地施用在皮膚上。
本文使用的術(shù)語“調(diào)理”是指防止和治療一種或一種以上的如下皮膚病癥皮膚干燥、皮膚的光損傷、出現(xiàn)皺紋、老年斑和/或皮膚老化，增加角質(zhì)層彈性，增加皮膚光澤，控制皮脂分泌和全面地改善皮膚質(zhì)量。
作為本發(fā)明的一部分，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)式Ⅰ的脂肪酰胺在100μM濃度下，優(yōu)選地抑制至少20％的LRAT或RAT催化的視黃醇酯化反應(yīng)。這是通過體外微粒體檢測(cè)法(Microsomal assay，下文描述)測(cè)定的。因此，在本發(fā)明的組合物中存在式Ⅰ的N-取代的脂肪酰胺實(shí)質(zhì)上提高了美容組合物中視黃醇或視黃酯的效能。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述除非另有說明，所有的量都是以最終組合物的重量計(jì)。
本發(fā)明組合物含有作為第一必需成分的選自視黃醇、視黃酯的化合物。術(shù)語“視黃醇”尤其包括視黃醇的下列異構(gòu)體全-反-視黃醇、13-順-視黃醇、11-順-視黃醇、9-順頁-視黃醇、3,4-二脫氫-視黃醇。優(yōu)選的異構(gòu)體是全-反-視黃醇、13-順-視黃醇、3,4-二脫氫-視黃醇、9-順-視黃醇。最優(yōu)選的是全-反-視黃醇，因?yàn)樗袕V泛的商用上易得性。
視黃酯是一種視黃醇的酯。術(shù)語“視黃醇”已在上文定義。適合用于本發(fā)明的視黃酯是視黃醇的C1-C30酯，優(yōu)選C2-C20的酯，并最優(yōu)選C2、C3和C16的酯，因?yàn)樗鼈冚^易得到。視黃酯的例子包括但不限于棕櫚酸視黃酯、甲酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯、丁酸視黃酯、戊酸視黃酯、異戊酸視黃酯、己酸視黃酯、庚酸視黃酯、辛酸視黃酯、壬酸視黃酯、癸酸視黃酯、十一酸視黃酯、十二酸視黃酯、十三酸視黃酯、十四酸視黃酯、十五酸視黃酯、十七酸視黃酯、硬脂酸視黃酯、異硬脂酸視黃酯、十九酸視黃酯、廿酸視黃酯、二十二酸視黃酯、亞油酸視黃酯、油酸視黃酯。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的酯選自棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯和丙酸視黃酯、因?yàn)檫@些是商業(yè)上最易得的，也因此最便宜。亞油酸視黃酯由于其功效也是優(yōu)選的。
本發(fā)明組合物中視黃醇和/或視黃酯的用量為0.001％到10％，優(yōu)選0.01％到1％，最優(yōu)選0.01％到05％。
本發(fā)明組合物的第二必需成分是式Ⅰ的N-取代的脂肪酰胺

(I)其中R1=具有1至10個(gè)碳原子的烷基或烷氧基；R2=具有8至25個(gè)碳原子的烷基或鏈烯基；R3=含有1至5個(gè)碳原子的烷基，或磷酸酯。
優(yōu)選地，R1是含有1至5個(gè)碳原子(最優(yōu)選1或4個(gè)碳原子)的直鏈飽和烷基或烷氧基R2優(yōu)選是含有10至20個(gè)碳原子(最優(yōu)選10至18個(gè)碳原子)的直鏈不飽和鏈烯基。
最適地，R2是亞油酸殘基(C18∶2)。
R3優(yōu)選地是甲基或磷酸酯，最優(yōu)選的是膽堿或乙二醇的磷酸酯。
最優(yōu)選地，N-取代的脂肪酰胺選自下面式A和B化合物


N-取代的脂肪酰胺在本發(fā)明的組合物中的含量是0.0001％至50％，優(yōu)選0.01％至10％，最優(yōu)選0.1％至5％。
式Ⅰ的N-取代的脂肪酰胺優(yōu)選地在100μM濃度下抑制至少20％(由體外微粒體檢測(cè)法測(cè)定)的LRAT或ARAT催化的視黃醇酯化反應(yīng)。
體外微粒體檢按下述文獻(xiàn)所述獲得微粒體J.C.Saari和D.L.Bredberg，“視黃醛色素表皮細(xì)胞中輔酶A和非輔酶A依賴型視黃醇酯化反應(yīng)”，生物化學(xué)雜志，263,8084-90(1988)。
將含有0.1M磷酸鈉pH7緩沖液、5mM二硫蘇糖醇、2mg/ml牛血清白蛋白、40微摩爾棕櫚酰輔酶A、40微摩爾二月桂酰磷脂酰膽堿、10微摩爾視黃醇和受試化合物的溶液或空白溶劑，與分離自牛視黃醛色素表皮細(xì)胞的微粒體級(jí)分一起，在37℃下溫育1小時(shí)。溫育后，加入等體積的乙醇中止反應(yīng)，用己烷抽提出形成的視黃酯(來自LRAT催化反應(yīng)的月桂酸視黃酯和來自ARAT催化反應(yīng)的棕櫚酸視黃酯)。除去己烷層，在氮?dú)庀抡舭l(fā)，用HPLC(3.9×300mmC18反相柱，四氫呋喃流動(dòng)相中含80％甲醇)分析殘余物，用熒光檢測(cè)(325nm激發(fā)，480nm發(fā)射)量化視黃酯。以空白溶劑中形成的酯的量作為100％，用于計(jì)算受試化合物對(duì)酯形成的抑制百分?jǐn)?shù)。將一份微粒體煮沸5分鐘失活，作為對(duì)照，它可產(chǎn)生對(duì)酯形成的至少95％的抑制作用。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所選的N-取代的脂肪酰胺在100μM濃度下，至少抑制40％的LRAT或ARAT催化的視黃醇酯化反應(yīng)。美容用賦形劑本發(fā)明的組合物也包含一種美容用賦形劑，作為視黃醇和/或視黃酯以及N-取代的脂肪酰胺的稀釋劑、分散劑或載體，以促進(jìn)它們?cè)谑┯糜谄つw上時(shí)的分布。
除了水之外，賦形劑還可包括液體或固體潤膚劑、溶劑、保濕劑、增稠劑和粉末。一種特別優(yōu)選的非含水載體是聚二甲基硅氧烷，和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本發(fā)明的硅氧烷可以是在25℃時(shí)粘度范圍在10到10,000,000mm2/s(厘司)中任何一值的硅氧烷。特別優(yōu)選的是低粘度和高粘度硅氧烷的混合物。這些硅氧烷可以從通用電氣公司以商Vicasil,SE和SF獲得，或在Dow Corning公司的200和550系列中獲得?？梢栽诒景l(fā)明的組合物中利用的硅氧烷的用量范圍以組合物重量計(jì)為5％到95％，優(yōu)選25％到90％。
美容用賦形劑的含量以組合物重量計(jì)通常占5％到99.9％，優(yōu)選25％到80％，并且在缺少其他的化妝品助劑時(shí)，可以使組合物達(dá)到足量。優(yōu)選地，以賦形劑的重量計(jì)，賦形劑中最少50重量％，更優(yōu)選最少80％是水。優(yōu)選地，以組合物的重量計(jì)，水最少含50重量％，更優(yōu)選60％到80重量％的本發(fā)明的組合物。可選的對(duì)皮膚有益的材料和化妝品助劑可以采用一種油或油性的材料，以及一種乳化劑，從而主要依據(jù)所用乳化劑的平均親水親脂平衡值(HLB)而提供油包水乳液或水包油乳液。本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含吸光成份(sunscreens。吸光成份包括通常用于阻隔紫外光的材料。例示化合物有對(duì)氨基苯甲酸酯(PABA)、肉桂酸酯和水楊酸酯衍生物。例如，可以用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基-二苯甲酮(也稱氧苯酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基-二苯甲酮都可以分別以商標(biāo)Parsol MCX和二苯甲酮-3購得。用于乳劑中的確切的吸光成份含量會(huì)視乎所需的防紫外光的保護(hù)程度而變化。
另一種優(yōu)選的可選成份選自必需脂肪酸(EFA)，即那些對(duì)形成所有細(xì)胞的細(xì)胞膜所必需的脂肪酸。角質(zhì)細(xì)胞如果缺乏EFA，會(huì)使細(xì)胞增殖過度。補(bǔ)充EFA可以抑制細(xì)胞增殖過度。EFA還會(huì)提高表皮中脂類的生物合成，并且為表皮的阻擋層的形成提供脂類。必需脂肪酸優(yōu)選亞油酸，γ-亞油酸，高-γ-亞油酸(homo-γ-linolenic acid)，咖倫賓(columbinic)酸，二十碳-(n-o,9,13)-三烯酸(trienoicacid)?；ㄉ南┧?，α-亞油酸，二十碳五烯酸，己烯酸(hexaenoicacid)和其混合物。
另一種可選成份選自吡咯類，例如氯咪巴唑、聯(lián)苯芐唑、克霉唑、酮康唑、咪康唑、益康唑、伊曲康唑、氟康唑、特康唑、布康唑、硫康唑、lionazole和其混合物。吡咯在本發(fā)明組合物中的含量是從0.001到50重量％，優(yōu)選從0.001到10重量％，最優(yōu)選從0.1到5％。
潤膚劑常被加進(jìn)本發(fā)明的美容組合物中。如此的潤膚劑的水平自0.5％到50％，優(yōu)選從5％到30％的總組合物重量。潤膚劑可通常分為酯類、脂肪酸類和脂肪醇類、多醇類(polyols)和碳?xì)浠衔镱悺ｕヮ惪梢允菃熙セ蚨??？山邮艿闹径サ睦影憾岫□?，癸二酸二乙酯，二聚二異丙?diisopropyl dimerate)，和丁二酸二辛酯。可接受的支鏈脂肪酯包括十四烷酸2-乙基己酯?？山邮艿娜龎A酸酯包括三亞油酸三異丙酯和檸檬酸三月桂酯?？山邮艿闹辨溨觉グㄗ貦八嵩鹿瘐?，乳酸十四烷酯，oleyl eurcate，和硬脂酰油酸酯。優(yōu)選的酯包括椰子辛酸酯/癸酸酯(coco-caprylate/caprate)(一種椰子辛酸酯(coco-caprylate)和椰子癸酸酯(coco-capmte)的混合物)，丙二醇十四烷基醚醋酸酯，己二酸二異丙酯和辛酸十六烷酯。
合適的脂肪醇和酸包括有10至20個(gè)碳原子的化合物，特別優(yōu)選的化合物有十六烷-，十四烷-，棕櫚-和十八烷醇和酸。
在多醇類中可用作潤膚劑的是直鏈和支鏈烷基多羥基化合物。例如，優(yōu)選丙二醇，山梨醇和丙三醇。也可用聚合的多醇(polyol)如聚-丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也特別優(yōu)選用作滲透增強(qiáng)劑。
可以用作潤膚劑的示例碳?xì)浠衔锸菗碛?2至30個(gè)碳原子的碳?xì)滏?。具體的例子包括礦物油，凡士林，鯊烯和異鏈烷烴。
另一類在本發(fā)明的美容組合物的功能性成分是增稠劑。增稠劑通常用量為組合物重量的0.1到20％，優(yōu)選從0.5％到10％?？梢杂米髟龀韯┑睦邮墙宦?lián)聚丙烯酸酯材料，在B.F.Goodrich公司可以商標(biāo)Carbopol購得?？梢允褂媚z質(zhì)如黃原膠(xanthan)、角叉菜膠(carrageenan)、明膠、梧桐膠、果膠和刺槐豆膠。在某些情況中該增稠功能可以通過一種材料完成，該材料也起到硅氧烷或潤膚劑的作用。例如，粘度超過10厘司的硅氧烷膠質(zhì)與諸如硬脂酸甘油酯的酯均有雙官能度。
可以將粉末加進(jìn)本發(fā)明的美容組合物。這些粉末包括白堊、滑石、漂白土、高嶺土、淀粉、綠土、化學(xué)改性的鎂鋁硅酸鹽、化學(xué)改性的蒙脫土、水化硅酸鋁、熏制二氧化硅、鋁淀粉琥珀酸辛烯酯及其混合物。其他的附助性次要成分也可加進(jìn)美容組合物中。這些成分可以包括著色劑、遮光劑和香水。這些附助性次要成分的用量范圍可以是組合物重量的0.001％到 20％。組合物的應(yīng)用本發(fā)明的組合物主要地用來制成一種局部施用在人類皮膚上的產(chǎn)品，特別地是用作一種皮膚調(diào)理劑和皮膚光滑劑，并且防止或減少皺紋或皮膚衰老的出現(xiàn)。
在應(yīng)用時(shí)，將少量的，例如從1到100ml的本發(fā)明組合物涂在皮膚的暴露部位。該少量的本發(fā)明組合物可以取自一種合適的容器或敷料器，并且如有需要，用手或手指或一種合適的裝置將該組合物涂和/或擦在皮膚之上。產(chǎn)品形式與包裝根據(jù)本發(fā)明的局部皮膚治療的組合物可以適當(dāng)?shù)刂瞥上磩?、霜?jiǎng)┗蚰z。該組合物可以在合適的容器內(nèi)包裝以配合它的黏度和消費(fèi)者所需的應(yīng)用。例如，洗劑或霜?jiǎng)┛梢栽谄孔踊驖L珠敷料器(roll-ball applicator)內(nèi)包裝，或是在一種噴霧裝置內(nèi)包裝或在一種安裝了適用于手指操作的泵的容器內(nèi)包裝。當(dāng)組合物是霜?jiǎng)r(shí)，它可以簡單地儲(chǔ)存在一種不會(huì)變形的瓶子或擠壓容器內(nèi)，例如一種管或有蓋的罐內(nèi)。本發(fā)明的組合物也可包含在膠囊內(nèi)，例如那些在美國專利5063057中所描述的。
本發(fā)明也相應(yīng)地提供一種密封的容器，該容器含有一種在本文中定義的美容組合物。
下列的具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)人類角質(zhì)細(xì)胞，通過胰蛋白酶處理分離自新生的包皮，在用射線照射的3T3老鼠纖維原細(xì)胞存在下，培養(yǎng)于Dulbecco Modification Eagle(DME)HamsF12(1∶1)培養(yǎng)基/10％胎牛血清中，用以確立分裂中的角質(zhì)細(xì)胞集落。該細(xì)胞在上述的條件生長到它們的第二代(second passage)，并且冷凍保存以作未來之用。解凍冷凍的第二代角質(zhì)細(xì)胞，將上述的培養(yǎng)基放進(jìn)平板并培養(yǎng)五日，然后換成Clonetics公司(san Diego,CA)的角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基(KGM)，它是含有0.15mM鈣的無血清的基于MCDB153的培養(yǎng)基，或者GIBCO公司的含有0.09mM鈣的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(KSFM)。到第七日，當(dāng)細(xì)胞80-90％匯合時(shí)，將細(xì)胞用胰蛋白酶處理并置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以用于不同的實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶檢測(cè)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶檢測(cè)與角質(zhì)細(xì)胞分化在表皮內(nèi)末端分化(terminal differentiation)的過程中，一個(gè)15nm厚的蛋白質(zhì)層，稱為角質(zhì)被膜(CE)，形成于細(xì)胞外周的內(nèi)表面。該角質(zhì)被膜由許多不同的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)通過形成Nc-(γ-谷氨酰基)賴氨酸異二肽鍵交聯(lián)在一起，該Nc-(γ-谷氨?；?賴氨酸異二肽鍵的形成是經(jīng)至少兩種不同的在表皮中表達(dá)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGases)催化完成。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)在表皮的已分化層(特別是粒狀層)中大量表達(dá)，卻不存在于未分化的基底皮層。因此TGaseⅠ是一種有用的表皮角質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)記物，TGaseⅠ的水平高時(shí)，表示較高程度的分化狀態(tài)。利用一種基于ELISA、使用TGaseⅠ抗體的TGaseⅠ檢測(cè)方法，評(píng)定下述實(shí)施例中培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞的分化狀態(tài)對(duì)于實(shí)施例1，采用下面的步驟將角質(zhì)細(xì)胞(用如同上述的方法培養(yǎng))置于96孔平板中，密度為每孔200μl培養(yǎng)基中有3000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)了四日以后，將培養(yǎng)基換為含有受試化合物的培養(yǎng)基(每個(gè)測(cè)試用六個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn))。將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)72小時(shí)，然后吸出培養(yǎng)基,并將平板儲(chǔ)存于-70℃。將平板從冷藏箱中取出，并且用PBS洗滌細(xì)胞。加入100μl無菌水，在通過在-70℃冷凍然后溶化使細(xì)胞冷凍破碎。然后用PBs/3％BSA(洗滌緩沖液，牛血清白蛋白)在室溫(R/T)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)一小時(shí)，然后用新鮮的等份洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞。將細(xì)胞與得自BiomedicalIndustries、用洗滌緩沖液以1∶2000比率稀釋的50μl的初級(jí)抗體單克隆抗-人類轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶鼠抗體(IgG)一起溫育，在37℃溫育一小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗滌兩次。然后將細(xì)胞與用洗滌緩沖液以1∶4000比率稀釋的50μl的次級(jí)抗體(Fab片段，從Amersham得到的過氧化物酶偶聯(lián)的抗-鼠IgG)溫育，在37℃達(dá)一小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗滌兩次。將細(xì)胞與底物溶液(4mg鄰-苯二胺和在10ml的0.1MpH5.0檸檬酸緩沖液中的3.3μl30％過氧化氫)溫育，在室溫下，黑暗中(在鋁箔下)溫育五分鐘。加入50μl4N硫酸以中止反應(yīng)。于492nm在平板讀數(shù)器中測(cè)讀試樣的吸光度。在六個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，四個(gè)接受兩種抗體的處理，兩個(gè)只接受次級(jí)抗體的處理(即，測(cè)定與酶偶聯(lián)的抗體的本底結(jié)合)。TGase水平由每個(gè)處理的讀數(shù)減去本底值，并且測(cè)定暴露于兩種抗體的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
對(duì)于實(shí)施例3，采用下面的步驟將角質(zhì)細(xì)胞(用如同上述的方法培養(yǎng))置于96孔平板中，密度為每孔200μl細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中有3000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)了四日以后，將培養(yǎng)基換為含有受試化合物的培養(yǎng)基(每測(cè)試用六個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn))。將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)72小時(shí)，然后吸出培養(yǎng)基，并將平板儲(chǔ)存于-70℃。將平板從冷藏箱取出以后，透過冷凍后解凍進(jìn)一步將細(xì)胞冷凍破碎，然后用PBS洗滌細(xì)胞三次。用PBS/5％BSA緩沖液在室溫(R/T)溫育細(xì)胞達(dá)一小時(shí)。將細(xì)胞以100∶1的比率與由BiomedicalTechnologies Inc.得到的、用TBS/1％BSA緩沖液以1∶2000比率稀釋的單克隆抗-人類轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(IgG)鼠抗體(初級(jí)抗體)溫育，在37℃溫育二小時(shí)，然后用洗滌緩沖液(TBS/1％BSA/0.05％Tween-20)洗滌六次。然后將細(xì)胞與用洗滌緩沖液以1∶4000比率稀釋的100μl的Fab斷片，即從Amersham得到的與過氧化物酶偶聯(lián)的抗-鼠IgG(次級(jí)抗體)一起溫育，在37℃達(dá)二小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗滌三次和用PBS洗滌三次。將細(xì)胞與底物溶液(4mg鄰-苯二胺和在10ml的0.1MpH5.0檸檬酸緩沖液里的3.3μl30％過氧化氫)溫育，在室溫下，黑暗中(在鋁箔下)溫育五分鐘。加入50μl 4N硫酸以中止反應(yīng)。于492nm在平板讀數(shù)器中測(cè)讀試樣的吸光度。在六個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，四個(gè)接受兩種抗體的處理，兩個(gè)只接受次級(jí)抗體的處理(即，測(cè)定與酶偶聯(lián)的抗體的本底結(jié)合)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)水平由每個(gè)處理的讀數(shù)減去本底值，并且測(cè)定暴露于兩種抗體的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。DNA檢測(cè)細(xì)胞處理后測(cè)得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)水平可受細(xì)胞數(shù)目的影響，即，細(xì)胞數(shù)目越大，測(cè)得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)水平越高。將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)水平歸一化為在同一孔內(nèi)細(xì)胞的脫氧核糖核酸含量，從而消除細(xì)胞數(shù)目差異引起的變化。脫氧核糖核酸的量是一個(gè)特別有用的細(xì)胞數(shù)目(包括角質(zhì)細(xì)胞數(shù)目)的指標(biāo)，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞實(shí)際上有相同的基因組，因此有相同的脫氧核糖核酸量。一個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞的總脫氧核糖核酸含量是與那個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目成正比的。脫氧核糖核酸的量可用于將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶數(shù)據(jù)歸一化為細(xì)胞數(shù)目。
將角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在96孔平板中，密度為每孔200μl細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中有3000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)了四日以后，將培養(yǎng)基換為含有受試化合物的培養(yǎng)基(每測(cè)試用六個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn))。將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)72小時(shí)，然后吸出培養(yǎng)基并將平板于-70℃至少儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將平板從冷藏箱取出，并且將細(xì)胞解凍30分鐘。加入100μl/孔的Hoechst染料(最終濃度1μg/ml)，并溫育15分鐘，蓋上蓋后用熒光計(jì)讀數(shù)(ex.360nm,em.460nm)。去掉染料溶液。用PBS洗孔，以準(zhǔn)備TGase檢測(cè)。實(shí)施例1視黃酸在改變角質(zhì)細(xì)胞分化狀態(tài)方面比視黃醇更有效檢測(cè)加入了視黃酸(RA)和加入了視黃醇(ROH)歸一化為細(xì)胞DNA含量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶水平的作用，結(jié)果在表1中顯示。
表1

n=3
所有受測(cè)試的視黃酸濃度，即，2.5×10-7M,2.5×10-8M和2.5×10-9M與乙醇對(duì)照實(shí)驗(yàn)比較，都使角質(zhì)細(xì)胞分化下降，并且與對(duì)應(yīng)的2.5×10-7M,2.5×10-8M和2.5×10-9M視黃醇處理后的相比，角質(zhì)細(xì)胞分化下降得更為顯著。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶水平的下降依賴于視黃酸和視黃醇兩者的劑量。這和視黃酸具有比視黃醇更高的抑制表皮分化的作用是一致的。實(shí)施例2視黃醇的體外微粒體酯化反應(yīng)按下述文獻(xiàn)所述獲得微粒體JC.Saari和D.L.Bredberg，“視黃醛色素表皮細(xì)胞中輔酶A和非輔酶A依賴型視黃醇酯化反應(yīng)”，生物化學(xué)雜志，263,8084-90(1988)。
將含有0.1M磷酸鈉pH7緩沖液、5mM二硫蘇糖醇、2mg/ml牛血清白蛋白、40微摩爾棕櫚酰輔酶A、40微摩爾二月桂酰磷脂酰膽堿、10微摩爾視黃醇和受試化合物的溶液或空白溶劑，與分離自牛視黃醛色素表皮細(xì)胞的微粒體級(jí)分，在37℃下溫育1小時(shí)。溫育后，加入等體積的乙醇中止反應(yīng)，用己烷抽提出形成的視黃酯(來自LRAT催化反應(yīng)的月桂酸視黃酯和來自ARAT催化反應(yīng)的棕櫚酸視黃酯)。除去己烷層，在氮?dú)庀抡舭l(fā)，用HPLC(3.9×300mmC18反相柱，四氫呋喃流動(dòng)相中含80％甲醇)分析殘余物，用熒光檢測(cè)(325nm激發(fā)，480nm發(fā)射)量化視黃酯。以空白溶劑中形成的酯的量作為100％，用于計(jì)算受試化合物對(duì)酯形成的抑制百分?jǐn)?shù)。將一份微粒體煮沸5分鐘失活，作為對(duì)照，它可產(chǎn)生對(duì)酯形成的至少95％的抑制作用。
所得結(jié)果如表2A和2B所示。
表2A中的化合物在100μM的濃度下測(cè)定。表2B中的化合物在10μM的濃度下測(cè)定。
未包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的式C化合物也被測(cè)試。
式C


由表2A和2B的結(jié)果可以看出，N-取代的脂肪酰胺，其中R2具有7個(gè)以上的碳原子(即式A和B)，是LRAT和ARAT催化的視黃醇酯化反應(yīng)的強(qiáng)力抑制劑。實(shí)施例3檢測(cè)了表3所列各化合物和組合對(duì)角質(zhì)細(xì)胞分化的作用。結(jié)果以對(duì)照的百分?jǐn)?shù)表示。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶水平被規(guī)一化為DNA。
表3視黃醇和式A酰胺對(duì)角質(zhì)細(xì)胞TGase/DNA的作用

n=3
2.5×10-7M視黃酸在抑制角質(zhì)細(xì)胞TgaseⅠ水平方面是非常有效的(達(dá)對(duì)照水平的69％)。當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，2.5×10-7M視黃醇和10-4式A化合物在抑制角質(zhì)細(xì)胞TgaseⅠ水平方面不如視黃酸有效。然而，2.5×10-7M視黃醇+10-4式A化合物抑制角質(zhì)細(xì)胞TgaseⅠ水平達(dá)對(duì)照水平的58％。此實(shí)施例也在微粒體檢測(cè)和細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)之間建立了良好的關(guān)聯(lián)。
實(shí)施例4-9例示了本發(fā)明局部組合物。這些組合物可用常規(guī)的方法加工。它們適于化妝用。具體地說，這些組合物適用于皮膚皺紋、粗糙、干燥、脫皮、老化和/或紫外傷害，以改進(jìn)皮膚的外觀和感覺；也可適用于健康的皮膚以防止或延緩傷害。
實(shí)施例4本實(shí)施例例示摻入了本發(fā)明組合物的高內(nèi)相油包水乳液。

*Brij92是聚氧乙烯(2)油醚實(shí)施例55本實(shí)施例例示摻入了本發(fā)明組合物的水包油霜?jiǎng)?br>
*Brij56是十六烷醇POE(10)Alfol16RD是十六烷醇實(shí)施例6本實(shí)施例例示摻入了本發(fā)明組合物的乙醇洗液。

實(shí)施例7本實(shí)施例例示摻入了本發(fā)明組合物的另一種乙醇洗液。

實(shí)施例8本實(shí)施例例示摻入了本發(fā)明組合物的防曬霜

實(shí)施例9本實(shí)施例例示摻入了本發(fā)明結(jié)合物的非水性的皮膚護(hù)理組合物。

1一種二甲基硅氧烷聚合物，分子量至少為50,000,25℃下粘度至少為10,000厘司，可從GEC獲得。2二甲基硅氧烷環(huán)化五聚物，可從Dow Corming公司獲得。3二甲基硅氧烷四聚物，可從Dow Corning公司獲得。
實(shí)施例中的受試化合物可以從以下來源得到化合物 來源視黃醇 Sigma棕櫚酸視黃酯Sigma視黃酸 SigmaN-取代的脂肪酰胺Utrecht大學(xué)，荷蘭
權(quán)利要求
1.一種皮膚調(diào)理組合物，它含有(a)0.001％-10％的選自視黃醇、視黃酯及其混合物的化合物；(b)0.0001％-50％的下式N-取代的脂肪酰胺
其中R1=具有1至10個(gè)碳原子的烷基或烷氧基；R2=具有8至25個(gè)碳原子的烷基或鏈烯基；R3=含有1至5個(gè)碳原子的烷基，或磷酸酯；以及(c)美容用賦形劑。
2．權(quán)利要求1的組合物，其中N-取代的脂肪酰胺在100μM濃度下抑制至少20％的LRAT或ARAT催化的視黃醇酯化反應(yīng)，所述抑制是用體外微粒體檢測(cè)法測(cè)定的。
3．權(quán)利要求2的組合物，其中N-取代的脂肪酰胺在100μM濃度下抑制至少40％的LRAT或ARAT催化的視黃醇酯化反應(yīng)，所述抑制是用體外微粒體檢測(cè)法測(cè)定的。
4．權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項(xiàng)的組合物，其中視黃酯選自棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯及其混合物。
5．權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項(xiàng)的組合物，其中視黃酯是亞油酸視黃酯。
6．權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項(xiàng)的組合物，其中化合物(a)是視黃醇。
7．一種調(diào)理皮膚的美容方法，該方法包括向皮膚局部施用權(quán)利要求1-6中任一權(quán)項(xiàng)的組合物。
8．一種模擬視黃酸對(duì)皮膚作用的美容方法，該方法包括向皮膚施用權(quán)利要求1-6中任一權(quán)項(xiàng)的組合物。
全文摘要
特定結(jié)構(gòu)的N－取代的脂肪酰胺充分地抑制LRAT或ARAT催化的視黃醇轉(zhuǎn)化為無活性的視黃酯的酯化反應(yīng)，因此對(duì)角質(zhì)細(xì)胞具有同視黃酸相同的抑制作用。視黃醇或視黃酯與這些N－取代的脂肪酰胺結(jié)合后的作用與用視黃酸處理后的作用類似。
文檔編號(hào)A61K8/42GK1237898SQ97199921
公開日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1997年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月27日
發(fā)明者S·P·格蘭格, A·V·羅林斯, I·R·斯科特 申請(qǐng)人:尤尼利弗公司