專利名稱：新的速效胰島素衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰島素衍生物，它與人類胰島素相比能夠較迅速生效，涉及其制備方法以及其尤其是在藥物制劑中的應(yīng)用以治療糖尿病。
全世界大約1億2千萬人患有糖尿病。其中約1千2百萬人為I型-糖尿病患者，目前對(duì)該型患者的唯一治療方法是應(yīng)用胰島素。按照醫(yī)囑患者應(yīng)終身、一般是每天多次地注射胰島素。雖然約1億II型-糖尿病患者所伴有的胰島素缺乏并非主要原因，但大多數(shù)病例仍采用胰島素治療，據(jù)認(rèn)為這是最佳的或者唯一可能的治療方式。隨著病程的進(jìn)展，許多病人患有所謂的糖尿病晚期并發(fā)癥。主要與微小血管-和大血管的損傷有關(guān)，按照其方式和范圍的不同，其結(jié)果可能是腎功能衰竭、失明、肢體損傷或心臟循環(huán)系統(tǒng)疾病的危險(xiǎn)性增加。
發(fā)病的首要原因是長期慢性的血糖水平升高，因?yàn)榧词乖谝葝u素治療的悉心調(diào)節(jié)下，也不能達(dá)到與生理性調(diào)節(jié)相當(dāng)?shù)恼Ｑ撬?Ward，J.D.(1989年)，大不列顛醫(yī)學(xué)公報(bào)45期，111-126頁；Drury，P.L.等(1989年)，大不列顛醫(yī)學(xué)公報(bào)45期，127-147頁；Kohner，E.M.(1989年)，大不列顛醫(yī)學(xué)公報(bào)45期，148-173頁)。
對(duì)正常人而言，胰島素的分泌與血液中葡萄糖的濃度密切相關(guān)。升高的葡萄糖水平，如餐后所出現(xiàn)的情況，通過增加釋放胰島素而迅速得以代償。在空腹?fàn)顟B(tài)下，血漿胰島素水平降低至基礎(chǔ)值，它足以保障胰島素敏感的器官和組織得到持續(xù)的葡萄糖供應(yīng)?，F(xiàn)今所謂強(qiáng)化胰島素治療的最佳目的在于盡量減小血糖濃度的波動(dòng)，特別是向上偏離(Bolli，G.B.(1989年)，糖尿病研究臨床實(shí)踐，6期，25-32頁)。這樣能夠明顯減少糖尿病晚期損害的出現(xiàn)和發(fā)展(糖尿病控制和并發(fā)癥試驗(yàn)研究組(1993年)，新英國醫(yī)學(xué)雜志，329期，977-986頁)。
由胰島素分泌的生理學(xué)可以推斷為了改進(jìn)的強(qiáng)化胰島素治療，需要應(yīng)用二種不同藥物動(dòng)力學(xué)的胰島素制劑作皮下用藥。為了代償餐后血糖升高，必須能有胰島素迅速流入血循環(huán)，并且允許它作用僅僅幾個(gè)小時(shí)。為了保障基礎(chǔ)供應(yīng)，尤其是夜晚，應(yīng)該有一種制劑既能長時(shí)間地起作用、卻又沒有明顯的高峰，而只是非常緩慢地流入血循環(huán)。
以人類胰島素和動(dòng)物性胰島素為基礎(chǔ)的制劑對(duì)于滿足強(qiáng)化胰島素治療的要求有其局限性。速效胰島素類(舊-胰島素類)在皮下用藥后進(jìn)入血液和到達(dá)作用部位的時(shí)間太慢、并且作用持續(xù)時(shí)間太長。其結(jié)果是，餐后血糖水平太高和餐后幾個(gè)小時(shí)血糖波動(dòng)太大(Kang，S.(1991年)，糖尿病調(diào)養(yǎng)(Diabetes Care)14期，142-148頁；Home，P.J.等(1989年)，大不列顛醫(yī)學(xué)公報(bào)45期，92-110頁；Bolli，G.B.(1989年)，糖尿病研究臨床實(shí)踐，6期，3-16頁)。可應(yīng)用的基礎(chǔ)胰島素，尤其是NPH-胰島素，其作用時(shí)間太短并且高峰太強(qiáng)。
除可以通過蓋倫氏原則影響作用方式以外，現(xiàn)今另一種選擇是借助于基因技術(shù)研制出胰島素衍生物，它們僅僅通過其結(jié)構(gòu)上的特性即可獲得某些特性如作用生效和持續(xù)時(shí)間。因此，通過應(yīng)用合適的胰島素衍生物，可以達(dá)到明顯改善的、非常接近于自然狀態(tài)的血糖調(diào)節(jié)。
EP 0 214 826、EP 0 375 437和EP 0 678 522中說明了速效胰島素衍生物。EP 0 214 826涉及B27和B28的取代作用，但無B3的取代作用。EP0 678 522說明了一些胰島素衍生物，其B29位為各種氨基酸，優(yōu)選為脯氨酸，但不為谷氨酸。EP 0 375 437敘述了B28位上為賴氨酸或精氨酸的胰島素衍生物，它們還能任意在B3位和/或A21位改性。
EP 0 419 504中公開了胰島素衍生物，其天冬酰胺在B3位和至少另外一種氨基酸在A5、A15、A18或A21位被改變，由此使它們避免了化學(xué)改性。于B27、B28或B29位組合改性未見說明。尚無依據(jù)說明這些化合物具有藥物動(dòng)力學(xué)改變和因此具有較快的藥物作用。
WO 92/00321說明了胰島素衍生物，其至少一種氨基酸在B1-B6位被賴氨酸或精氨酸所取代。按照WO 92/00321，這些胰島素類具有較長時(shí)間的作用。但未予以說明有B27、28、29位的組合改性。
本發(fā)明的目的是，制備胰島素衍生物，它們?cè)谟盟幒?，尤其是在皮下用藥后，與人類胰島素相比它具有速效作用。
胰島素衍生物為天然來源的胰島素、即人類胰島素(見SEQ ID NO 1＝人類胰島素的A-鏈；見SEQ ID NO 2＝人類胰島素的B-鏈，序列表)或動(dòng)物性胰島素的衍生物，通過至少一種天然來源的氨基酸殘基被取代，和/或通過至少一種氨基酸殘基和/或有機(jī)殘基被加成，使它們與相應(yīng)的、否則相同的天然來源的胰島素相區(qū)別。
此外本發(fā)明的另外目的還有，提供具有上述特性的胰島素衍生物的制備方法、相應(yīng)的中間產(chǎn)物以及其前體。
達(dá)到本目的的途徑是通過胰島素衍生物或其生理耐受鹽、其中天冬酰胺(Asn)的B-鏈B3位被一個(gè)天然產(chǎn)生的堿性氨基酸所交換，以及至少一個(gè)氨基酸殘基于B-鏈的B27、B28或B29位被另外一種天然產(chǎn)生的氨基酸殘基所交換，其中天冬酰胺(Asn)的A-鏈A21位可有選擇地被天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)或丙氨酸(Ala)所交換，以及苯丙氨酸(Phe)的B-鏈的B1位和B-鏈B30位的氨基酸殘基缺如。
優(yōu)選的胰島素衍生物或者其生理耐受鹽可以用式I表征
其中(A1-A5)為 人類胰島素(見SEQ ID NO 1)或動(dòng)物性胰島素的A-鏈A1至A5位上的氨基酸殘基，(A12-A19)為 人類胰島素(見SEQ ID NO 1)或動(dòng)物性胰島素的A-鏈A12至A19位上的氨基酸殘基，(B8-B18)為 人類胰島素(見SEQ ID NO 2)或動(dòng)物性胰島素的B-鏈B8至B18位上的氨基酸殘基，(B20-B26)為人類胰島素(見SEQ ID NO 2)或動(dòng)物性胰島素的B-鏈B20至B26位上的氨基酸殘基，A8，A9，A10為 人類胰島素(見SEQ ID NO 1)或動(dòng)物性胰島素的A-鏈A8、A9和A10位上的氨基酸殘基，A21為 天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸，B30為 人類胰島素(見SEQ ID NO 2)或動(dòng)物性胰島素的B-鏈B30位上的-OH或氨基酸殘基，B1 一個(gè)苯丙氨酸(Phe)或一個(gè)氫原子，B3 一個(gè)天然產(chǎn)生的堿性氨基酸殘基，B27，B28和B29 人類胰島素(見SEQ ID NO 2)或動(dòng)物性胰島素的B-鏈B27、B28和B29位上的氨基酸殘基，或者分別為另外一個(gè)天然產(chǎn)生的氨基酸殘基，其中至少一個(gè)氨基酸殘基于B-鏈B27、B28和B29位上被另外一個(gè)天然產(chǎn)生的氨基酸殘基所交換。
在20種天然產(chǎn)生的可遺傳學(xué)編碼的氨基酸中，甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、頡氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)被稱為中性氨基酸，精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)被稱為堿性氨基酸，以及天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)被稱為酸性氨基酸。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的胰島素衍生物或其生理耐受鹽為牛胰島素、豬胰島素或人類胰島素的衍生物，也即一種式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，A8為丙氨酸(Ala)，A9為絲氨酸(Ser)，A10為 頡氨酸(Val)和B30為 丙氨酸(Ala)(牛胰島素的A8至A10和B30的氨基酸殘基)，A8為蘇氨酸(Thr)，A9為絲氨酸(Ser)和A10為 異亮氨酸(Ile)(人類或豬胰島素的A8至A10的氨基酸殘基)，其中B30為 丙氨酸(Ala)(豬胰島素的B30氨基酸殘基)或B30為 蘇氨酸(Thr)(人類胰島素的B30氨基酸殘基，見SEQ ID NO 2)。
特別優(yōu)選的是一種式I胰島素衍生物或者其生理耐受鹽，它帶有人類胰島素的A8至A10和B30位的氨基酸殘基，其特征還在于，(A1-A5)為人類胰島素(見SEQ ID NO 1)的A-鏈A1至A5位上的氨基酸殘基，(A12-A19)為 人類胰島素(見SEQ ID NO 1)的A-鏈A12至A19位上的氨基酸殘基，(B8-B18)為 人類胰島素(見SEQ ID NO 2)的B-鏈B8至B18位上的氨基酸殘基和(B20-B26)為 人類胰島素(見SEQ ID NO 2)的B-鏈B20至B26位上的氨基酸殘基。
本發(fā)明的另一些優(yōu)選實(shí)施形式是一種式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈的B1位的氨基酸殘基為苯丙氨酸(Phe)殘基，或者一種式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈的B3位的氨基酸殘基為組氨酸-(His)、賴氨酸-(Lys)或精氨酸(Arg)殘基。
本發(fā)明的另一些優(yōu)選實(shí)施形式是一種式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基被天然產(chǎn)生的氨基酸殘基所替代，后者選自于中性或酸性氨基酸組，一種式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基為一個(gè)天然產(chǎn)生的氨基酸殘基，后者選自酸性異亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)，優(yōu)選其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基被天然產(chǎn)生的氨基酸殘基所替代，后者選自于中性氨基酸組，或者特別優(yōu)選地，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基為異亮氨酸(Ile)殘基，或者一種式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基為一種天然產(chǎn)生的氨基酸殘基，后者選自于酸性氨基酸組，優(yōu)選其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基，優(yōu)選其特征為，于B-鏈的B27或B28位的氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基，或者其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基為谷氨酸(Glu)殘基。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施形式是一種式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B29位的氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基。
另一些優(yōu)選的實(shí)施形式為一種式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27位的氨基酸殘基為谷氨酸(Glu)殘基，式I的一種胰島素衍生物或一種其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B28位的氨基酸殘基為谷氨酸(Glu)殘基，或者式I的一種胰島素衍生物或一種其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B29位的氨基酸殘基為谷氨酸(Glu)殘基。
特別優(yōu)選的是一種胰島素衍生物或一種其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈的順序?yàn)镻he Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr(SEQU ID NO 3)，例如賴氨酸(B3)，谷氨酸(B29)-人類胰島素，或者一種胰島素衍生物或一種其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27位的氨基酸殘基為異亮氨酸(Ile)殘基，優(yōu)選一種胰島素衍生物或一種其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈的順序?yàn)镻he Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr(SEQU ID NO 5)，例如賴氨酸(B3)，異亮氨酸(B27)-人類胰島素，或者式I的一種胰島素衍生物或一種其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B28位的氨基酸殘基為異亮氨酸(Ile)殘基，優(yōu)選一種胰島素衍生物或一種其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈的順序?yàn)镻he Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lle Lys Thr(SEQU ID NO 4)，例如賴氨酸(B3)，異亮氨酸(B28)-人類胰島素。
特別優(yōu)選的還有式I的一種胰島素衍生物或一種其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B28位的氨基酸殘基為異亮氨酸(Ile)殘基和A21位氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基，優(yōu)選其特征為，B-鏈的順序?yàn)镚ly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Tyr Gln Leu GluAsn Tyr Cys Asp(SEQ ID NO.9)和B-鏈的順序?yàn)镻he Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys GlyGlu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr(SEQ ID NO.10)(賴氨酸(B3)，異亮氨酸(B28)，天冬氨酸(A21)-人類胰島素)。
式I胰島素衍生物優(yōu)選用基因技術(shù)制備。
此外還有一種制備式I的胰島素衍生物或其生理耐受鹽的方法可以達(dá)到本文開頭所提出的目的，包括構(gòu)造一種可復(fù)制的表達(dá)媒介物(Expressionsvehikel)，它含有DNA-序列，為胰島素衍生物的前體編碼，其中A-鏈A1位的氨基酸殘基與B-鏈B30位的氨基酸殘基通過式II的肽鏈聯(lián)接，-R1n-精氨酸- II其中，R1n為一個(gè)帶有n個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，n為一個(gè)0至34的整數(shù)，B-鏈于B1位用式III的肽鏈延長，甲硫氨酸-R2m-(精氨酸)p-III其中，R2m為一個(gè)帶有m個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，m為一個(gè)0至40的整數(shù)，優(yōu)選為0至9，p為0、1或2，其中p＝0時(shí)優(yōu)選肽鏈R2m以賴氨酸結(jié)尾，還包括于宿主細(xì)胞中的表達(dá)，以及采用化學(xué)和/或酶學(xué)的方法由其前體釋放胰島素衍生物。
優(yōu)選的是這樣的方法，其特征為，宿主細(xì)胞為一種細(xì)菌，尤其優(yōu)選的特征是，細(xì)菌為曙紅大腸桿菌(E.coli)。
優(yōu)選的是這樣的方法，其特征為，宿主細(xì)胞為酵母菌，尤其優(yōu)選的特征是，酵母菌為藥用酵母。
為了制備具有氨基酸序列SEQ ID NO.9(A-鏈)和SEQ ID NO.10(B-鏈)的胰島素衍生物，該胰島素衍生物的前體優(yōu)選具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly SerHis Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lle LysThr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val GluGln Cys Cys Thr Ser lle Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp(SEQ IDNO.11)，一種賴氨酸(B3)，異亮氨酸(B28)，天冬氨酸(A21)-胰島素前體。
為了制備具有氨基酸序列SEQ IDNO.3的胰島素衍生物，該胰島素衍生物的前體優(yōu)選具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu GlyGly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu GlySer Leu Gln Lys Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr GlnLeu Glu Asn Tyr Cys Asn(Lys(B3)，Glu(B29)-胰島素前體)(SEQ ID NO.6)。
為了制備具有氨基酸序列SEQ ID NO.5的胰島素衍生物，該胰島素衍生物的前體優(yōu)選具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Lys Gln Hls Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu GlyGly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu GlySer Leu Gln Lys ArgGly lle Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr GlnLeu Glu Asn Tyr Cys Asn(Lys(B3)，IIe(B27)-胰島素前體)(SEQ ID NO.8)。
為了制備具有氨基酸序列SEQ ID NO.4的胰島素衍生物，該胰島素衍生物的前體優(yōu)選具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu GlyGly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu GlySer Leu Gln Lys Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr GlnLeu Glu Asn Tyr Cys Asn(Lys(B3)，He(B28)-胰島素前體)(SEQ ID NO.7)。
因此本發(fā)明還涉及所列舉的優(yōu)選胰島素衍生物的前體，即具有序列號(hào)SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的肽類，涉及為所列舉的前體編碼的DNA-序列，涉及含有這些DNA-序列的表達(dá)媒介物，以及隨這些表達(dá)煤介物轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
式I胰島素衍生物的制備主要按照標(biāo)準(zhǔn)方法、采用基因技術(shù)學(xué)原位直接誘變引起突變(site-directed mutagenesis)的方法制備。
為此，構(gòu)造一個(gè)為所希望的式I胰島素衍生物編碼的基因結(jié)構(gòu)，并且使它在宿主細(xì)胞中-優(yōu)選在細(xì)菌如曙紅大腸桿菌或在酵母菌中、尤其優(yōu)選在藥用酵母中-表達(dá)，以及-如果基因結(jié)構(gòu)為融合蛋白編碼-由融合蛋白釋放該式I胰島素衍生物；EP-A-0 211 299、EP-A-0 277 938、EP-A-0 299998、EP-A-0 286 956和DE-專利申請(qǐng)P38 21 159中說明了類似的方法。
融合蛋白成份的分裂也可以在細(xì)胞分裂后采用鹵化氰(見EP-A-0 180920)按照化學(xué)方式進(jìn)行。
在采用按照US 5,358,857借助融合蛋白成份(前序列)的胰島素前體進(jìn)行制備時(shí)，在較遲的階段同時(shí)進(jìn)行融合蛋白成份的分裂和C-肽的分裂。
按照例如R.C.Marshall和A.S.Inglis于“實(shí)用蛋白化學(xué)-手冊(cè)”中(出版商A.Darbre)1986年，49-53頁所說明的方法，對(duì)胰島素前體進(jìn)行氧化性亞硫酸化(oxidativen Sulfitolyse)，接著例如按照G.H.Dixon和A.C.Wardlow于自然(1960年)，721-724頁中所說明的方法，在存在硫醇的情況下，通過形成正確的雙硫橋使之回復(fù)原狀。
也可以對(duì)胰島素衍生物直接進(jìn)行折疊(EP-A-0 600 372；EP-A-0 668292)。
應(yīng)用典型的分裂方法去除C-肽，例如按照Kemmler等J.B.C.(1971年)，6786-6791頁的方法，以及按照現(xiàn)有技術(shù)如色譜層析，例如見EP-A-0 305760和結(jié)晶方法，將式I胰島素衍生物提純。
如果式II中n為0，則典型的分裂作用可使A和B-鏈之間的肽鍵分離。
在這一方法中，B-鏈在C-末端以精氨酸或二個(gè)精氨酸殘基終止?？梢酝ㄟ^羧肽酶B的酶作用將它們?nèi)コ?br> 本發(fā)明胰島素衍生物具有充分的生物學(xué)活性。這一點(diǎn)可以通過給家兔靜脈給藥和由此所引起的血糖降低結(jié)果來顯示(實(shí)施例5和6)。
皮下用藥后較快的藥效可以用在空腹狗身上所進(jìn)行的血糖正常的夾板技術(shù)來顯示(實(shí)施例7)。用藥量為0.3IE/kg。對(duì)照藥劑為人類胰島素。應(yīng)用夾板技術(shù)的過程中，注射胰島素后，在較短的時(shí)間間隔里測量血糖值，所注射的胰島素劑量應(yīng)該正好能代償血糖降低。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是，在動(dòng)物身上不會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗性調(diào)節(jié)，正如在應(yīng)用胰島素后血糖明顯降低所出現(xiàn)的情況那樣。所注射葡萄糖的劑量和時(shí)間分布曲線能表明胰島素的作用特征。賴氨酸(B3)，甘氨酸(B29)-(SEQ ID NO 3)和賴氨酸(B3)，異亮氨酸(B28)-(SEQ ID NO 4)胰島素的作用生效比人類胰島素明顯加快。用人類胰島素在100分鐘后達(dá)到最大作用(葡萄糖輸注率)，相比之下，用賴氨酸(B3)、甘氨酸(B29)-胰島素(SEQ ID NO 3)在80分鐘后達(dá)到最大作用，而用賴氨酸(B3)、異亮氨酸(B28)-胰島素(SEQ ID NO 4)在60分鐘后即已達(dá)到最大作用。因此如果在餐前的短暫時(shí)間內(nèi)注射這些類似物，比人類胰島素應(yīng)能更好地代償餐后血糖升高。
所說明的胰島素衍生物既適合于治療I型糖尿病，又適合于治療II型糖尿病，優(yōu)選合并應(yīng)用基礎(chǔ)胰島素。
因此，本發(fā)明還涉及胰島素衍生物和/或其生理耐受鹽的應(yīng)用，用以制備具有胰島素活性的快速生效的藥物制劑。
作為生理學(xué)上毫無疑慮的和能夠與胰島素衍生物耐受的載體物質(zhì)，合適的有一種無菌的水溶性溶劑，以通常的方式、例如通過甘油、食鹽、葡萄糖使之與血液等滲，此外它還含有常用的貯藏劑，例如酚、間-甲酚或?qū)?羥基苯甲酸酯。載體物質(zhì)也可以含有緩沖物質(zhì)，例如醋酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉。應(yīng)用稀釋酸(典型代表為HCl)和堿液(典型代表為NaOH)以調(diào)節(jié)pH。此外制劑還可以含有鋅離子。
胰島素-衍生物還可以以其生理耐受鹽的形式、作為堿鹽或銨鹽、應(yīng)用于藥物制劑中。一種或多種式I胰島素-衍生物的任一成份、或者一種式I胰島素-衍生物可以在與這類其它胰島素-衍生物的混合物中相互獨(dú)立地分別以溶解的、非晶型的和/或晶狀的形式存在。
有時(shí)較為合適的是，向本發(fā)明的制劑中添加合適劑量的合適穩(wěn)定劑，以防止在溫度-機(jī)械的負(fù)荷下與各種材料接觸時(shí)的蛋白沉淀。例如由EP-A-18609、DE-A 32 40 177或由WO-83/00288已知這樣一些穩(wěn)定劑。
本發(fā)明此外還涉及一種藥物制劑，其特征為，它含有至少一種式I胰島素衍生物和/或一種其生理耐受鹽，優(yōu)選以溶解的、非晶型的和/或晶狀的形式。
本發(fā)明的胰島素衍生物具有作用生效快的特征。在實(shí)際胰島素治療中，可能比較常見的是，將速效胰島素與含有長效佐劑(例如NPH-胰島素)的制劑相混合。按照組成成份的不同而由此產(chǎn)生不同的制劑，倘若單個(gè)成份在混合物中穩(wěn)定并且不會(huì)相互影響，則其作用方式相當(dāng)于疊加的單個(gè)作用方式。當(dāng)胰島素衍生物與人類NPH-胰島素混合時(shí)應(yīng)考慮到，尤其是通過長期貯存，在溶解的衍生物和晶狀的NPH-胰島素之間會(huì)出現(xiàn)交換。長效胰島素和溶解的速效胰島素的藥物動(dòng)力學(xué)都會(huì)因此以事先未能預(yù)見的方式發(fā)生改變。為了避免之，行之有效的方法是，應(yīng)用長效佐劑如NPH-胰島素制備速效衍生物。這種長效形式的胰島素衍生物能夠與溶解的速效形式任意地混合，而一種或另外一種形式的組成不至于隨著貯存時(shí)間的長短由于交換而發(fā)生改變。
雖然本發(fā)明的重點(diǎn)涉及速效胰島素衍生物，但也包括了制備能夠適于以長效形式混合的類似衍生物，在此，優(yōu)選的長效佐劑為精蛋白硫酸鹽，且胰島素衍生物和/或其生理耐受鹽與精蛋白硫酸鹽以共晶狀體的形式存在。
本發(fā)明此外還涉及一種可注射的藥液，它含有以上說明的溶解形式的藥物制劑。
實(shí)施例實(shí)施例1賴氨酸(B3)-前胰島素的構(gòu)造，作為相應(yīng)于實(shí)施例2-4的、與本發(fā)明有關(guān)的質(zhì)體的起始物US 5,358,857中說明了媒介物pINT 90d和PCR引物Tir以及Insu 11。這些成份作為起始物用于質(zhì)體pINT 125d的構(gòu)造，后者可以為所希望的賴氨酸(B3)-前胰島素編碼。
此外還合成了其序列為5′TTT GTG AAG CAG CAC CTG 3′的引物Insu 35，以及序列為
5′CAG GIG CTG CTTCAC AAA 3′的引物Insu 36。
用引物Tir和Insu 36進(jìn)行PCR-反應(yīng)，用引物Insu 11和Insu 35進(jìn)行第二個(gè)反應(yīng)。pINT 90d DNA作為其模板劑劑。
二個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物部分互補(bǔ)，因此如果它們?cè)诘谌齻€(gè)PCR反應(yīng)中與引物Tir和Insu 11整合，則可以產(chǎn)生一個(gè)片斷，它能夠?yàn)樵贐-鏈的位置3含有的賴氨酸前胰島素變異體編碼。為了提純將這個(gè)PCR-片斷，置于乙醇中沉淀、干燥和接著按照生產(chǎn)廠家的說明用限制酶Nco 1和Sal 1消化。將反應(yīng)混合物電泳分離和將所希望的Nco 1/Sal 1-片斷分離出來。
在所引用的專利申請(qǐng)書中說明了質(zhì)體pINT 91d，它為一種微小-前胰島素編碼。如果用Nco 1和Sal 1將為微小-前胰島素編碼的序列分裂出來并分離殘余質(zhì)體-DNA，則可以將這個(gè)殘余質(zhì)體-DNA與所敘述的Nco 1/Sal 1-片斷在T4-連接酶反應(yīng)中反應(yīng)，生成質(zhì)體pINT 125d。將它按照E.coli K12進(jìn)行轉(zhuǎn)化、繁殖和再分離。通過DNA-序列-和限制分析進(jìn)行質(zhì)體結(jié)構(gòu)物的核突作用后，用pINT 125d-DNA作為模板劑-DNA，使在這些前胰島素變異體中發(fā)生其它的突變。實(shí)施例2賴氨酸(B3)谷氨酸(B29)-前胰島素的構(gòu)造為了制備突變蛋白，將序列為5′TTC TAC CAC CCC GAG ACC CGC GGC ATC G-3′的引物329a和序列為
5′GCC GCG GGT CTC GGG TGT GTA GAA GAA GC 3′的引物329b合成。
應(yīng)用pINT 125d的和pINT 91d的DNA作為模板劑。
將引物329a與引物Insu 11在pINT91d模板劑上、且將引物329b與Tir(參見以上實(shí)施例)在pINT125d模板劑上在一種PCR-反應(yīng)中轉(zhuǎn)化。因?yàn)槎NPCR-產(chǎn)物部分互補(bǔ)，所以它們可以在一個(gè)直接的PCR-反應(yīng)中整合且重新與引物Tir和Insu 11反應(yīng)。所形成的DNA-片斷可以為所希望的突變蛋白編碼。該片斷被限制酶Nco 1和Sal 1雙倍消化，將所形成的Nco 1/Sal1-片斷通過T4-連接酶反應(yīng)插入pINT 91d殘余質(zhì)體-DNA中。
所形成的質(zhì)體pINT 329通過限制-和DNA-序列分析在E.coli K12中擴(kuò)大后根據(jù)所希望的結(jié)構(gòu)發(fā)生核突。
由質(zhì)體所編碼的前胰島素衍生物的特征是，它有二個(gè)氨基酸交換和一個(gè)由氨基酸精氨酸所形成的C-連結(jié)鏈。實(shí)施例3賴氨酸(B3)異亮氨酸(B27)-前胰島素的構(gòu)造按照前面的實(shí)施例，用質(zhì)體對(duì)進(jìn)行構(gòu)造。
KB3 JB 27A5′TTC TAC ATC CCC AAG ACC CGC CG 3′和Insu 11以及K B3 J 27B5′CTT GGG GAT GTA GAA GAA GCC TCG 3′和Tir。
質(zhì)體pINT125d的DNA用作為在二個(gè)PCR-反應(yīng)中的模板劑。二個(gè)反應(yīng)的PCR-產(chǎn)物，正如實(shí)施例1中所說明的，在第三個(gè)反應(yīng)中整合，將產(chǎn)物按照該實(shí)施例繁殖。
產(chǎn)生質(zhì)體pINT332。實(shí)施例4賴氨酸(B3)異亮氨酸(B28)-前胰島素的構(gòu)造按照實(shí)施例3用質(zhì)體對(duì)進(jìn)行構(gòu)造KB3 JB 28A5′TAC ACA ATC AAG ACC CGC CGG GAG-3′和Insu 11以及KB J B28B5′GGT CTT GAT TGT GTA GAA GAA GCC TCG-3′
和Tir。
產(chǎn)生質(zhì)體pINT333。
構(gòu)造后的胰島素衍生物的表達(dá)將質(zhì)體pINT 329、332和333例如分別按照E.coli K12 W3110轉(zhuǎn)化。含有質(zhì)體的并對(duì)那些變異體編碼的重組的細(xì)菌按照美國專利號(hào)為5227293的實(shí)施例4發(fā)酵，這樣便產(chǎn)生了所希望的、用于生成相應(yīng)的胰島素衍生物的原料。實(shí)施例5賴氨酸(B3)、異亮氨酸(B28)、天冬氨酸(A21)-前胰島素的構(gòu)造按照實(shí)施例3進(jìn)行構(gòu)造。但是代替pINT125d的是在實(shí)施例4中所構(gòu)造的質(zhì)體pINT333的DANN作為模板劑用于PCR-反應(yīng)。在此應(yīng)用了以下質(zhì)體對(duì)P-pint3655′-TTTTTTGTCGACTATTAGTCGCAGTAGTTCTACCAGCTG-3′和Tir。
產(chǎn)生質(zhì)體pINT365。實(shí)施例6給家兔靜脈注射后，賴氨酸(B3)，谷氨酸(B29)-胰島素的生物活性評(píng)價(jià)
給8只家兔靜脈注射所指定的胰島素(0.2IE/kg)。在以后的4小時(shí)時(shí)間里，在所指定的時(shí)間點(diǎn)上測定血糖濃度，并且計(jì)算出相對(duì)于時(shí)間點(diǎn)0時(shí)起始值的百分?jǐn)?shù)。平均值表明，人類胰島素和賴氨酸(B3)，谷氨酸(B29)-胰島素之間的生物活性沒有明顯差別。實(shí)施例7給家免靜脈注射后，賴氨酸(B3)，異亮氨酸(B27)-和賴氨酸(B3)，異亮氨酸(B28)-胰島素的生物活性評(píng)價(jià)給6只家兔靜脈注射所指定的胰島素(0.2IE/kg)。在以后的4小時(shí)時(shí)間里，在所指定的時(shí)間點(diǎn)上測定血糖濃度，并且計(jì)算出相對(duì)于時(shí)間點(diǎn)0時(shí)起始值的百分?jǐn)?shù)。平均值表明，人類胰島素、賴氨酸(B3)、異亮氨酸(B27)-和賴氨酸(B3)、異亮氨酸(B28)-胰島素之間的生物活性沒有明顯差別。
實(shí)施例8給狗皮下用藥后，賴氨酸(B3)，谷氨酸(B29)-胰島素和賴氨酸(B3)，異亮氨酸(B28)-胰島素的藥物動(dòng)力學(xué)給4條狗分別皮下注射所指定的胰島素(0.3IE/kg)。通過持續(xù)不斷地輸注葡萄糖，使血糖維持在3.7至4毫摩爾/升。下列圖表顯示240分鐘內(nèi)各注射時(shí)間點(diǎn)(t＝0)的平均葡萄糖輸注率±SEM。
用迅速作用的胰島素衍生物在空腹狗進(jìn)行的葡萄糖-夾實(shí)驗(yàn)葡萄糖輸注方式的特征數(shù)據(jù)劑量1×0.3IU/kg s.c.，在時(shí)間點(diǎn)t0(n＝4)
<p>給空腹狗應(yīng)用速效胰島素衍生物的葡萄糖鉗制劑量1×0.3IU/kg s.c.，于t0時(shí)間點(diǎn) (平均值±sem，n＝4
<p>給空腹狗應(yīng)用速效胰島素的葡萄糖鉗制劑量1×0.3IU/1kg s.c.，在t0時(shí)間點(diǎn)(平均值±sem，n＝4)
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH(B)街道-(C)地點(diǎn)梅因河邊的法蘭克福(D)州-(E)國家聯(lián)邦德國(F)郵政編碼65926(G)電話069-305-5307(H)傳真069-35-7175(ii)申請(qǐng)名稱速效的胰島素衍生物(iii)序列數(shù)量8(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)數(shù)據(jù)載體Floppy碟(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，#1.25(EPA)版本(2)關(guān)于SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..21(xi)序列表示SEQ ID NO.1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Tnr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20(2)關(guān)于SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..30(xi)序列表示SEQ ID NO.2Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30(2)關(guān)于SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..30(xi)序列表示SEQ ID NO.3
Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr20 25 30(2)關(guān)于SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..30(xi)序列表示SEQ ID NO.4Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr20 25 30(2)關(guān)于SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..30(xi)序列表示SEQ ID NO.5
Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr20 25 30(2)關(guān)于SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度97個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..97(xi)序列表示SEQ ID NO.6Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro35 40 45Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu50 55 60Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu65 70 75 80Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys85 90 95Asn(2)關(guān)于SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度97個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸
(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..97(xi)序列表示SEQ ID NO.7Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His15 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro35 40 45Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu50 55 60Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu65 70 75 80Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys85 90 95Asn(2)關(guān)于SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度97個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..97(xi)序列表示SEQ ID NO.8
Met Ala Thr Thr Ser Tnr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro35 40 45Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu50 55 60Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu65 70 75 80Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys85 90 95Asn(2)關(guān)于SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..21(xi)序列表示SEQ ID NO.9Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu15 10 15Glu Asn Tyr Cys Asp20(2)關(guān)于SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈
(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..30(xi)序列表示SEQ ID NO.10Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr20 25 30(2)關(guān)于SEQ ID NO.11的信息(i)序列特征(A)長度97個(gè)氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈形式單鏈(D)拓?fù)湫问骄€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)標(biāo)志(A)名稱/鑰匙蛋白質(zhì)(B)位置1..97(xi)序列表示SEQ ID NO.11Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His15 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr ThrIle Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro35 40 45Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu50 55 60Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu65 70 75 80Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys85 90 95Asp
權(quán)利要求
1.胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其中B-鏈的B3位天冬酰胺(Asn)被一個(gè)天然產(chǎn)生的堿性氨基酸殘基所交換，以及于B-鏈的B27、B28或B29位的至少一個(gè)氨基酸殘基被另外一種天然產(chǎn)生的中性或酸性氨基酸殘基所交換，為此任選地天冬酰胺(Asn)在A-鏈A21位可以被天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)或丙氨酸(Ala)交換，且苯丙氨酸(Phe)在B-鏈的B1位和B-鏈B30位的氨基酸殘基缺如。
2.按照權(quán)利要求1的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為式I
其中(A1-A5)為人類胰島素或動(dòng)物性胰島素的A-鏈中A1至A5位上的氨基酸殘基，(A12-A19)為人類胰島素或動(dòng)物性胰島素的A-鏈中A12至A19位上的氨基酸殘基，A21為天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸，(B8-B18)為人類胰島素或動(dòng)物性胰島素的B-鏈中B8至B18位上的氨基酸殘基，(B20-B26)為人類胰島素或動(dòng)物性胰島素的B-鏈中B20至B26位上的氨基酸殘基，A8，A9，A10為人類胰島素或動(dòng)物性胰島素的A-鏈中A8、A9和A10位上的氨基酸殘基，B30為人類胰島素或動(dòng)物性胰島素的B-鏈中B30位上的-OH或氨基酸殘基，B1 一個(gè)苯丙氨酸(Phe)殘基或一個(gè)氫原子，B3 一個(gè)天然產(chǎn)生的堿性氨基酸殘基，B27，B28和B29為人類胰島素或動(dòng)物性胰島素的B-鏈中B27、B28和B29位上的氨基酸殘基，或者分別為另外一個(gè)天然產(chǎn)生的氨基酸殘基，其中于B-鏈B27、B28和B29位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被另外一個(gè)天然產(chǎn)生的氨基酸殘基所交換，后者選自中性或酸性氨基酸。
3.按照權(quán)利要求2的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，A8為丙氨酸(Ala)，A9為絲氨酸(Ser)，A10為纈氨酸(Val)和B30為丙氨酸(Ala)。
4.按照權(quán)利要求2的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，A8為蘇氨酸(Thr)，A9為絲氨酸(Ser)，和A10為異亮氨酸(Ile)。
5.按照權(quán)利要求4的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B30為丙氨酸(Ala)。
6.按照權(quán)利要求4胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B30為蘇氨酸(Thr)。
7.按照權(quán)利要求6胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，(A1-A5)為人類胰島素的A一鏈中A1至A5位上的氨基酸殘基，(A12-A19)為人類胰島素的A-鏈中A12至A19位上的氨基酸殘基，(B8-B18)為人類胰島素的B-鏈中B8至B18位上的氨基酸殘基，和(B20-B26)為人類胰島素的B-鏈中B20至B26位上的氨基酸殘基。
8.按照權(quán)利要求1至7中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B1位上的氨基酸殘基為苯丙氨酸(Phe)殘基。
9.按照權(quán)利要求1至8中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B3位上的氨基酸殘基為一個(gè)組氨酸-(His)、賴氨酸-(Lys)或精氨酸(Arg)殘基。
10.按照權(quán)利要求9的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B3位上的氨基酸殘基為一個(gè)組氨酸(His)殘基。
11.按照權(quán)利要求9的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B3位上的氨基酸殘基為一個(gè)精氨酸(Arg)殘基。
12.按照權(quán)利要求9的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B3位上的氨基酸殘基為一個(gè)賴氨酸(Lys)殘基。
13.按照權(quán)利要求1至12中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基被天然產(chǎn)生的氨基酸殘基所取代，后者選自于異亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。
14.按照權(quán)利要求1至13中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基被天然產(chǎn)生的氨基酸殘基所替代，后者選自于酸性氨基酸。
15.按照權(quán)利要求14的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基。
16.按照權(quán)利要求14的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基為谷氨酸(Glu)殘基。
17.按照權(quán)利要求1至13中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基被天然產(chǎn)生的氨基酸殘基所取代，后者選自于中性氨基酸組。
18.按照權(quán)利要求17的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，于B-鏈的B27、B28和B29位的至少一種氨基酸殘基為異亮氨酸(Ile)殘基。
19.按照權(quán)利要求15的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B27位的氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基。
20.按照權(quán)利要求15的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B28位的氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基。
21.按照權(quán)利要求15的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B29位的氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基。
22.按照權(quán)利要求16的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B27位的氨基酸殘基為谷氨酸(Glu)殘基。
23.按照權(quán)利要求16的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B28位的氨基酸殘基為谷氨酸(Glu)殘基。
24.按照權(quán)利要求16的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B29位的氨基酸殘基為谷氨酸(Glu)殘基。
25.按照權(quán)利要求18的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B28位的氨基酸殘基為異亮氨酸(Ile)殘基。
26.按照權(quán)利要求1至25中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，A-鏈A21位的氨基酸殘基為天冬氨酸(Asp)殘基。
27.按照權(quán)利要求26的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，A-鏈的序列為Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr CysAsp(SEQ ID NO.9)B-鏈的序列為Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys GlyGlu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr(SEQ ID NO.10)
28.按照權(quán)利要求24的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈的序列為Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr(SEQU ID NO 3)。
29.按照權(quán)利要求18的胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈B27位的氨基酸殘基為異亮氨酸(Ile)殘基。
30.按照權(quán)利要求29胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈的序列為Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr(SEQU ID NO 5)。
31.按照權(quán)利要求25胰島素衍生物或其生理耐受鹽，其特征為，B-鏈的序列為Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr(SEQU ID NO 4)。
32.制備按照權(quán)利要求1至30中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物或其生理耐受鹽的方法，包括，構(gòu)造一種可復(fù)制的表達(dá)媒介物(Expressionsvehikel)，它含有一個(gè)為胰島素衍生物的前體編碼的DNA-序列，其中A-鏈A1位的氨基酸殘基與B-鏈B30位的氨基酸殘基通過式II的肽鏈聯(lián)結(jié)，-R1n-精氨酸- II其中，R1n為一個(gè)帶有n個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，n為一個(gè)0至34的整數(shù)，且B一鏈于B1位用式III的肽鏈延長，甲硫氨酸-R2m-(精氨酸)p-III其中，R2m為一個(gè)帶有m個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，m為一個(gè)0至40的整數(shù)，p為0、1或2，于一種宿主細(xì)胞中表達(dá)，并用化學(xué)和/或酶的方法使胰島素衍生物由其前體中釋放。
33.按照權(quán)利要求32的方法，其特征為，宿主細(xì)胞為一種細(xì)菌。
34.按照權(quán)利要求33的方法，其特征為，細(xì)菌為E.coli。
35.按照權(quán)利要求32的方法，其特征為，宿主細(xì)胞為一種酵母菌。
36.按照權(quán)利要求35的方法，其特征為，酵母菌為一種藥用酵母。
37.按照權(quán)利要求32至36之一的方法，用以制備按照權(quán)利要求26的一種胰島素衍生物，其特征為，該胰島素衍生物的前體具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys GlnHis Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu AlaGlu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln LysArg Gly lle Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu TyrGln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp(SEQ ID NO.11)。
38.按照權(quán)利要求32至36之一的方法，用以制備按照權(quán)利要求28的一種胰島素衍生物，其特征為，該胰島素衍生物的前體具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu GlyGly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu GlySer Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr GlnLeu Glu Asn Tyr Cys Asn(SEQ ID NO.6)。
39.按照權(quán)利要求32至36之一的方法，用以制備按照權(quán)利要求30的一種胰島素衍生物，其特征為，該胰島素衍生物的前體具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu GlyGly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu GlySer Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Gys Cys Thr Ser lle Cys Ser Leu Tyr GlnLeu Glu Asn TyrCysAsn(SEQ ID NO.8)。
40.按照權(quán)利要求32至36之一的方法，用以制備按照權(quán)利要求31的一種胰島素衍生物，其特征為，該胰島素衍生物的前體具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgPhe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu GlyGly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu GlySer Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr GlnLeu Glu Asn Tyr Cys Asn(SEQ ID NO.7)。
41.按照權(quán)利要求37的胰島素衍生物的前體。
42.按照權(quán)利要求38的胰島素衍生物的前體。
43.按照權(quán)利要求39的胰島素衍生物的前體。
44.按照權(quán)利要求40的胰島素衍生物的前體。
45.為按照權(quán)利要求41的胰島素衍生物的前體編碼的DNA-序列。
46.為按照權(quán)利要求42的胰島素衍生物的前體編碼的DNA-序列。
47.為按照權(quán)利要求43的胰島素衍生物的前體編碼的DNA-序列。
48.為按照權(quán)利要求44的胰島素衍生物的前體編碼的DNA-序列。
49.含有按照權(quán)利要求45的DNA-序列的表達(dá)媒介物。
50.含有按照權(quán)利要求46的DNA-序列的表達(dá)媒介物。
51.含有按照權(quán)利要求47的DNA-序列的表達(dá)媒介物。
52.含有按照權(quán)利要求48的DNA-序列的表達(dá)媒介物。
53.與按照權(quán)利要求49至52的表達(dá)媒介物轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
54.藥物學(xué)制劑，其特征為，它們含有至少一種按照權(quán)利要求1至30中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物和/或其生理耐受鹽。
55.按照權(quán)利要求54的藥物學(xué)制劑，其特征為，它含有溶解的、非晶型的和/或晶狀體形式的胰島素衍生物和/或其生理耐受鹽。
56.按照權(quán)利要求54的藥物學(xué)制劑，其特征為，它們此外還含有長效佐劑。
57.按照權(quán)利要求56的藥物學(xué)制劑，其特征為，長效佐劑為精蛋白硫酸鹽，其中胰島素衍生物和/或其生理耐受鹽與精蛋白硫酸鹽以共晶狀體的形式存在。
58.具有胰島素活性的可注射的藥液，含有溶解形式的、按照權(quán)利要求54至56的藥物學(xué)制劑。
59.按照權(quán)利要求1至31中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的胰島素衍生物和/或其生理耐受鹽的應(yīng)用，用于制備速效的具有胰島素活性的藥物學(xué)制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及胰島素衍生物,與人類的胰島素相比,它們具有快速作用效果,還涉及其制備方法和應(yīng)用,尤其是在制備治療糖尿病的藥劑中的應(yīng)用。特別地,本發(fā)明涉及胰島素衍生物或其生理耐受鹽,其中B－鏈的B3位天冬酰胺(Asn)被一個(gè)天然產(chǎn)生的堿性氨基酸殘基所交換,以及于B－鏈的B27、B28或B29位的至少一個(gè)氨基酸殘基被另外一種天然產(chǎn)生的中性或酸性氨基酸殘基所交換,為此任選地天冬酰胺(Asn)在A－鏈A21位可以被天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)或丙氨酸(Ala)交換,且苯丙氨酸(Phe)在B－鏈的B1位和B－鏈B30位的氨基酸殘基缺如。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1203238SQ98114950
公開日1998年12月30日 申請(qǐng)日期1998年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月20日
發(fā)明者J·厄特爾, P·哈伯曼, K·蓋森, G·塞普克 申請(qǐng)人:德國赫徹斯特馬里奧羅塞爾有限公司