專利名稱：青藤堿的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于青藤堿的新制藥用途，具體說是青藤堿在制備具有清除自由基及抗脂類過氧化作用的藥物中的應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。
青藤堿(Sinomenine)是從防已科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)R.etWils.的莖和根中提取的生物堿之一，是一種已知的藥用物質(zhì)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，青藤堿具有多種藥理作用。概括起來講，目前已經(jīng)知道的青藤堿的主要藥理作用如下抗炎、降壓、抑制中樞、抗心律失常等作用；對機體非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫均有抑制作用，尤其是對T淋巴細(xì)胞的功能有較強的抑制作用[彭慧敏，等，青藤堿的免疫抑制作用，中國藥理學(xué)報1988,9(4)377-380]；青藤堿又是一種組織胺釋放劑(馮經(jīng)義，等，青藤堿的藥理作用Ⅶ.對胃腸活動的影響及其機制，藥學(xué)學(xué)報1965；12:492)；臨床上用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效顯著(張欣，等，陜西中醫(yī)，1980,5:13；湖南省淑浦縣中醫(yī)院科研組，赤肢醫(yī)生雜志，1975,12:612)；有人還對青藤堿治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制進行了研究[李嗣英，等，青藤堿對小鼠免疫功能的影響，中草藥，1992,23(2):81-83]。到目前為止，還沒有有關(guān)青藤堿具清除自由基和抗脂類過氧化作用的報道。
本發(fā)明人經(jīng)過實驗研究證實了上述藥理作用，完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明目的是提供青藤堿在制備具有消除自由基及抗脂類過氧化作用的藥物中的應(yīng)用。
經(jīng)過我們的實驗研究表明，青藤堿，特別是鹽酸青藤堿，具有抑制脂類過氧化，保護抗氧化酶活性和消除自由基的作用。
青藤堿作為一種治療藥物，已經(jīng)有產(chǎn)品出售，例如，湖南黔陽地區(qū)制藥廠生產(chǎn)的青藤堿(sinomenine,SIN)，武漢市中聯(lián)制藥廠生產(chǎn)的鹽酸青藤堿粉劑，等。
因此，青藤堿作為清除自由基和抗脂類過氧化的藥物，按照常規(guī)的制劑方法，可以制備成適合于臨床上使用的任何藥物劑型，例如，片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、口服液、乳劑、混懸劑、注射劑、栓劑、膏劑，等。
除了本發(fā)明所說的青藤堿之外，青藤堿的藥物學(xué)上可接受的鹽，例如鹽酸青藤堿，同樣具有清除自由基和抗脂類過氧化的作用，因此，青藤堿及其藥物上可接受的鹽用于制備清除自由基和抗脂類過氧化的藥物，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在用于制備清除自由基和抗脂類過氧化的藥物時，可以添加藥物學(xué)上常用的賦性劑，如，粘合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、增溶劑、防腐劑、調(diào)味劑、溶劑、乳化劑，等。
青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在用于制備具有清除自由基和抗脂類過氧化作用的藥物時，也可以和其他相容的治療藥物一起制成藥劑。
實施例1鹽酸青藤堿粉劑2500mg，購自武漢市中聯(lián)制藥廠，藥用淀粉250g，酒精適量造粒，干燥，進壓片機壓片，制成1000片，每片片重為275mg，含鹽酸青藤堿25mg。
實施例2青藤堿20000mg，淀粉180g，二者充分混合，裝膠囊，制成2000粒膠囊，每粒0.1g重，含鹽酸青藤堿10mg。
實驗例青藤堿清除自由基及抗脂類過氧化作用的藥理實驗研究一、材料與方法1、試劑與動物四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxy propane TEP)購自FIuka公司；鄰聯(lián)二茴香胺(O-dianisidine)購自華美公司；還原型谷胱甘肽(GSH glutathione)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，谷胱甘肽還原酶(glutathione reduetase)及疊氮鈉(NaNs)均購自Sigma公司。余試劑均為國產(chǎn)分析純。鹽酸青藤堿為北醫(yī)大仿生與天然藥物國家重點實驗室純化提供。
實驗動物系本院動物部提供的Wistar純系大鼠，雄性，體重約150g，健康無眼病。利用免視網(wǎng)膜S抗原誘發(fā)動物自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)膜型大鼠在不同觀察時間點，斷頸處死后，立即取出眼球，冰浴下剝脫其整個視網(wǎng)膜組織，制備組織勻漿或者置-80℃冰箱內(nèi)保存待用。
(一)視網(wǎng)膜組織共軛二烯的測定參考Buege等方法稍加改良。在顯微鏡下仔細(xì)分離視網(wǎng)膜組織，用冰冷的0.05mol/L磷酸緩沖液pH7.2(含0.5mmol/L的EDTA)，用玻璃勻漿器制備成10％(W/V)的交漿，備用。將3ml氯仿甲醇(1∶2V/V)混合液內(nèi)加入0.2ml勻漿液，振蕩2分鐘，再加入氯仿甲醇混合液1毫升，振蕩1分鐘。加入1ml酸化水(雙蒸水用0.1N鹽酸調(diào)至pH2.5)，再振蕩1分鐘，離心2000轉(zhuǎn)/分，10分鐘；將下層液1ml取出，通入氮氣吹干，加入1ml乙醇，搖勻后，在233nm處測OD值，磷酸緩沖液做空白對照。
(二)丙二醛含量測定取上述勻漿液0.2ml，加入8.1％SDS溶液0.2ml，20％醋酸溶液1.5ml及0.8％硫代巴比妥酸溶液1.5ml，振蕩搖勻5分鐘后，置于95℃水浴中，1小時后取出，放入冰浴中終止反應(yīng)；冷卻后離心2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，加入正丁醇吡啶5ml，振蕩抽提2分鐘，離心2000轉(zhuǎn)/分，15分鐘分層；吸取正丁醇吡啶層，在螢光光度計上測定螢光強度，激發(fā)光波長(Ex)為515nm，發(fā)射光波長(Em)為553nm。同時以四乙氧基丙烷1nmoL/L溶液做為標(biāo)準(zhǔn)。計算丙二醛含量。Bradford法測定蛋白含量(下同)。
(三)螢光色脂類(fluorascent chromolipid)含量的測定。
取0.2ml勻漿液，加入甲醇氯仿混合液(1∶2V/V)3.5ml，振蕩5分鐘，再加入2ml酸化水(同前)。振蕩5分鐘；離心2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘。分層后將甲醇水相層取出。測定螢光強度，激發(fā)光波長(Ex)為360nm，發(fā)射光波長(Ex)為430nm。同時用硫酸奎寧溶液(1ug/ml溶于0.1N H2SO4中)做標(biāo)準(zhǔn)計算色脂類含量。
(四)脂類氫過氯化物(lipid hydroperoxldes)的測定，參考peter A.ward等方法。
取0.5ml勻漿液，加入3.5ml甲醇氯仿混合液(1∶2V/V)，振蕩2分鐘，離心2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘；分層后吸取下層液2ml，通氮氣吹干然后加入醋酸氯仿混合液(3∶2/V/V)1.0ml，避光條件下，加入12.8％碘化鉀溶液0.05ml，振蕩5分鐘后，加入0.5％乙酸鎘3.0ml，振蕩1分鐘；離心1000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，取上層液，在353nm測定吸光值。
(五)髓過氧化物酶活性的測定用50mmol/L，pH6.0的磷酸鉀緩沖液(含0.5％溴化十六烷基三甲銨)，在玻璃勻漿液器中，將視網(wǎng)膜組織制成10％(W/V)的勻漿，冰浴下超聲破碎10秒鐘。反復(fù)冰融3次后，再次超聲破碎10秒。離心4000g，4℃，15分鐘。取0.2ml上清液，加入2.8ml磷酸緩沖液(含0.167mg/ml鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸鹽及0.005％過氧化氫，搖勻后即在460nm處連續(xù)監(jiān)測。髓過氧化物酶活性25℃條件下，每分鐘消耗1umol過氧化氫為1個活性單位。
(六)超氧化物歧化酶活性的測定參考鄧碧玉等的方法。取上述勻漿液，離心4000轉(zhuǎn)/分，20分鐘，取上清做提取液，取適量的提取液，加入4.5ml 50mmol/L，PH8.30K2HPO4緩沖液，10ul 50mmol/L連苯三酚溶液(用10mmol/L HCI新鮮配制)迅速混勻，連續(xù)測量325nm處吸光度的改變。反應(yīng)以加入連苯三酚溶液開始計時，反應(yīng)溫度25℃，總反應(yīng)體積4.6ml。1個單位酶活性定義為在25℃條件下，每毫升反應(yīng)液每分鐘抑制連苯三酚自氧化率達50％的酶量。
(七)過氧化酶活性測定原理過氧化氫酶能催化過氧化分解，使體系中過氧化氫含量不斷減少，過氧化氫在240nm處吸光值隨之逐漸下降，利用此原理可測定過氧化氫酶的活性。樣品分析液中含0.05mol/L Tris-HCI緩沖液，pH7.4，加入一定量過氧化氫及適量的酶提取液，反應(yīng)體積為1ml，以加入提取液為反應(yīng)開始計時，連續(xù)觀察240nm處吸光度的變化。1個單位酶活性定義為在37℃條件下，每分鐘催化1u mol作用物所需的酶量。
(八)谷胱甘肽過氧化物酶活性的測定參考paglia等的偶聯(lián)谷胱甘肽還原酶的方法。樣品分析液中含0.05mol/L磷酸緩沖液(含3mmol/L EDTA)，pH7.2，10mmol/L還原型谷胱甘肽，0.3mmol/L還原型輔酶Ⅱ.1mmol/L疊氮鈉，1單位的谷胱甘肽還原酶及適量酶量提取液?；靹蚝?0℃保溫，加入過氧化物丁烷至終濃度為1mmol/L，反應(yīng)總體積1ml。反應(yīng)以加入過氧化特丁烷開始計時，測定340nm處吸收光度的變化。1個單位酶活性定義為在30℃條件下，每分鐘氧化1umol的還原型輔酶Ⅱ所需的酶量。
二、結(jié)果(一)青藤堿治療EAU大鼠對其視網(wǎng)膜脂類過氧化產(chǎn)物水平的影響。
1、共軛二烯結(jié)果如表1-1所示，經(jīng)S抗原免疫后第九天，視網(wǎng)膜中共軛二烯水平明顯增高，約為正常大鼠的4.2倍，第十四天時約為正常大鼠的4.8倍，到二十一天時，共軛二烯水平增至正常大鼠的6.8倍。由此看出，其水平在觀察期內(nèi)，呈上升趨勢，與正常組比較均有極顯著性差異，P＜0.01；經(jīng)青藤堿治療后，視網(wǎng)膜共軛二烯的水平比對照組有所下降，第九天時下降了約8.9％，第十四天時下降了約12.8％，但與對照組比較，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異，治療后第二十一天，共軛二烯水平下降更為明顯，約為19.8％，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異，P＜0.05。以上結(jié)果表明，在大鼠EAU病變中，視網(wǎng)膜共軛二烯水平升高，青藤堿治療可以抑制EAU大鼠視網(wǎng)膜菜軛二烯水平的升高。
2、丙二醛從表1-2可以看出，EAU大鼠視網(wǎng)膜丙二醛(MDA)水平變化與共軛二烯相同步，均呈升高趨勢。第9天時，為正常組的2.27倍，第14天時，為正常組的3.28倍，到第21天時，升高至正常組的3.93倍。與正常組比較，統(tǒng)計學(xué)上均有極顯著性差異，P＜0.01。經(jīng)青藤堿治療后，視網(wǎng)膜MDA水平較對照組不同程度下降。第9天時，下降了約8.4％，第14天時，下降了約41.2％，第21天時，下降了約45.8％。治療組與對照組比較的結(jié)果，除第9天組外，其它二組均在統(tǒng)計學(xué)上有極顯著性差異，P均＜0.01。以上結(jié)果表明，在大鼠EAU病變中，視網(wǎng)膜丙二醛水平升高，青藤堿治療能夠抑制EAU大鼠視網(wǎng)膜丙二醛水平升高的程度。
3、螢光色脂類螢光色脂類含量變化如表1-3所示，從中可以看出，EAU大鼠視網(wǎng)膜螢光色脂類含量的升高，從時間上滯后于共軛二烯及MDA的變化，在第9天和第14天時，對照組雖比正常組有所升高，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異，P＞0.05。在EAU的第21天時，其含量明顯升高，約為正常組的7.3倍，兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計學(xué)上有極顯著性差異，p＜0.01。經(jīng)青藤堿治療后，EAU大鼠視網(wǎng)膜螢光色脂類較對照組，不同程度地下降，分別為12％(第9天)、6.3％(第14天)和51.0％(第21天)。兩者比較的結(jié)果，第9天和第14天組，統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異，P＞0.05，第21天組在統(tǒng)計學(xué)上有極顯著差異，P＜0.01。以上結(jié)果表明，在大鼠EAU病變中，開始2周視網(wǎng)膜螢光色脂類無明顯變化，之后才明顯升高，青藤堿治療可以抑制EAU大鼠視網(wǎng)膜螢光色脂類含量的升高。
4、脂類氫過氧化物脂類氫過氧化物水平的改變，不同于前三種產(chǎn)物，從表1-4中可以看出，第9天時，其水平明顯升高，約為正常的2.49倍，在第14天及第21天時，分別為正常組的2.03和1.84倍，兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性差異，P＞0.05。經(jīng)青藤堿治療后，各時間組的脂類氫過氧化物水平有一定程度下降，分別為19.7％(第9天)、25.2％(第14天)和5.3％(第21天)，但統(tǒng)計學(xué)上均無顯著性差異，P＜0.05。以上結(jié)果表明在大鼠EAU病變中，視網(wǎng)膜脂類氫過氧化物水平升高，青藤堿治療后EAU大鼠視網(wǎng)膜脂類氫過氧化物水平升高程度減低，但統(tǒng)計學(xué)上有無顯著性差異。
(二)青藤堿治療EAU大鼠對其視網(wǎng)膜相關(guān)酶水平的影響1、髓過氧化物酶從表1-5中可以看出，在免疫后14天內(nèi)，EAU大鼠視網(wǎng)膜髓過氧化物酶活性不斷增高，其中第二周內(nèi)增高最為顯著，之后又逐漸下降。經(jīng)青藤堿治療后，髓過氧化物酶活性較對照組不同程度下降，其中第9天下降了9.7％，第14天下降了36.5％，第21天下降了17.1％。兩者比較的結(jié)果，第14天組，統(tǒng)計學(xué)上有極顯著性差異，P＜0.01，其余兩組均未達到統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異的程度，P＞0.05。以上結(jié)果表明，在大鼠EAU病變過程中，視網(wǎng)膜髓過氧化物酶活性升高，第14天時為高峰，青藤堿治療能夠減少其酶活性的增高程度。
2、超氧化物歧化酶EAU大鼠視網(wǎng)膜超氧化物歧化酶SDD活性變化見表1-6。在免疫后的第9天，超氧化物歧化酶的活性增高，約為正常的1.29倍。之后下降，在第14天時降低最顯著，活性只有正常值的46.2％。第21天時較前略有升高，活性只有正常值的69.5％。經(jīng)青藤堿治療后，在第9天時，與對照組比較無明顯變化。在第14天及第21天時明顯高于對照組，兩者比較的結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異，P均＜0.05。結(jié)果表明，在大鼠EAU病變過程中，視網(wǎng)膜超氧化物歧化酶活性先短暫升高，之后下降，青藤堿治療后2至3周，其酶活性的下降程度得到抑制。
3、過氧化氫酶結(jié)果見表1-7。從中可以看出，EAU大鼠視網(wǎng)膜過氧化氫酶活性隨時間呈漸降趨勢，與正常組比較，分別下降了22.4％(第9天)、45.6％(第14天)及52.0％(第21天)。各時間點中對照組與治療組比較的結(jié)果，后者的過氧化氫酶活性均高于前者，其中第14天及第21天時，兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性差異，p＜0.01及p＜0.05。上述結(jié)果表明，在大鼠EAU病變過程中，視網(wǎng)膜過氧化氫酶活性下降。青藤堿治療能夠減少其酶活性下降的程度。
4、谷胱甘肽過氧化物酶。
EAU大鼠視網(wǎng)膜谷胱甘肽過氧化物酶活性的變化見表1-8。與過氧化氫酶活性變化不同的是，在觀察早期(第9天及第14天)其活性與正常對照組比較變化不大，至第21天時其變化方較明顯，比正常對照組下降了約為20.9％，但兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計學(xué)差異尚未達到顯著的程度，p＞0.05。青藤堿治療組的谷胱甘肽過氧化物酶活性的變化趨勢相似于未治療組。雖然其各時間點的酶活性稍高于未治療組，統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異，p＞0.05。實驗結(jié)果表明，EAU大鼠視網(wǎng)膜谷胱甘肽過氧化物酶的活性，在觀察早期無明顯變化，第三周時有所下降。青藤堿治療組與末治療組之間無顯著差異。
表1-1青藤堿治療組和未治療組EAU大鼠視網(wǎng)膜中共軛二烯的變化CD X±SD(nmol/mg蛋白)組 別 n 未治療組 治療組第9 天 86.19±0.52 5.63±0.95第14天 87.10±0.40 6.19±1.25第21天 810.04±3.10 8.06±1.15*正常組(4):1.47±0.36*:p＜0.05表1-2青藤堿治療組和未治療組EAU大鼠視網(wǎng)膜中MDA的變化MDA X±SD(nmol/mg蛋白)組 別 n 未治療組 治療組第9 天 80.427±0.035 0.391±0.042第14天 80.617±0.102 0.361±0.033**第21天 80.738±0.105 0.400±0.065**正常組(4):0.188±0.013**:p＜0.01表1-3青藤堿治療組和未治療組EAU大鼠視網(wǎng)膜中熒火色脂類的變化FL X±SD(ug/mg蛋白)組 別n 未治療組 治療組第9 天80.025±0.007 0.022±0.006第14天80.016±0.005 0.015±0.005第21天80.102±0.035 0.050±0.013**正常組(4):0.014±0.004**:p＜0.01表1-4青藤堿治療組和未治療組EAU大鼠視網(wǎng)膜中脂類氫過氧化物的變化LH X±SD(nmol/mg蛋白)組 別 n 未治療組 治療組第9 天 4 0.386±0.100 0.310±0.120第14天 4 0.314±0.140 0.235±0.085第21天 4 0.285±0.084 0.270±0.064正常組(4):0.155±0.046表1-5青藤堿治療組EAU大鼠視網(wǎng)膜中髓過氧化物酶活性髓過氧化物酶活性 (u/mg蛋白)組 別 n 未治療組 治療組第9 天 6 0.031±0.0060.028±0.005第14天 6 0.115±0.0150.073±0.007**第21天 6 0.041±0.0040.034±0.004**:p＜0.01表1-6青藤堿治療組和未治療組EAU大鼠視網(wǎng)膜中SOD活性SOD活性 (u/mg蛋白)(X±SD)組 別 n 未治療組治療組第9 天 79.92±0.829.80±0.74第14天 73.56±0.934.83±0.77*第21天 75.36±1.696.27±1.54*正常組(4):7.71±0.25*:p＜0.05表1-7青藤堿治療組和未治療組EAU大鼠視網(wǎng)膜中過氧化氫酶活性過氧化氫酶 (u/mg蛋白)(X±SD)組 別n未治療組治療組第9 天8 0.097±0.027 0.109±0.014第14天8 0.068±0.006 0.099±0.016**第21天8 0.060±0.006 0.076±0.006*正常組(4):0.125±0.016*:p＜0.05**:p＜0.01表1-8青藤堿治療組和未治療組EAU大鼠視網(wǎng)膜中谷胱甘肽過氧化物酶活性谷胱甘肽過氧化物酶活性 (u/mg蛋白)(X±SD)組別 n 未治療組治療組第9天 40.315±0.0310.324±0.030第14天40.307±0.0140.314±0.050第21天40.261±0.0410.274±0.039正常組(4):0.330±0.041三、討論在本實驗中，我們所觀察的共軛二烯、丙二醛、脂類氫過氧化物及螢光色脂類，被認(rèn)為是脂類過氧化過程中不同階段的產(chǎn)物。
在脂類過氧化的初始階段，自由基從不飽和脂肪酸中奪走氫，使之形成共軛二烯(其在233nm處有特征性吸收峰)，隨之后者與氧發(fā)生反應(yīng)，形成脂類過氧化物，進一步轉(zhuǎn)變?yōu)轭愘|(zhì)內(nèi)過氧化物。脂類內(nèi)過氧化物可與多種化合物(包括羥類)反應(yīng)形成烷基自由基及脂類氫過氧化物，或形成丙醛及丙二醛，后者與磷脂及芳香苯胺的氨基，以及蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合可形成共軛席夫堿，該物質(zhì)具有特殊的螢光。另外，氫過氧化物可反應(yīng)生成丙二醛。
我們的實驗結(jié)果表明，在S抗原誘發(fā)的EAU大鼠視網(wǎng)膜中，多種脂類過氧化產(chǎn)物均不同程度的增高，反映出在EAU的病程中，自由基介導(dǎo)的脂類過氧化的過程加劇，其產(chǎn)生的損傷作用也隨之加重。
對于EAU的病理損傷機制之研究發(fā)現(xiàn)，盡管T細(xì)胞是病變的介導(dǎo)因素，但是視網(wǎng)膜的氧化損傷則是多形核白細(xì)胞(PMN8)所致。視網(wǎng)膜感光細(xì)胞內(nèi)有比其它任何器官組織含量都高的多不飽和脂肪酸(PUFA8)，因而最易受到自由基介導(dǎo)的脂類過氧化的損傷。在EAU的急性期，PMN8聚積至炎癥部位，同時被激活，隨之發(fā)生以氧消耗增加，戊糖旁路激活及活性氧產(chǎn)物釋放為特征的呼吸爆發(fā)(Reapiratory burst)過程。其中活性氧產(chǎn)物主要是超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基經(jīng)歧化過程可產(chǎn)生H2O2，隨之通過Haber-Weiss反應(yīng)及Featon反應(yīng)，產(chǎn)生毒性更強的羥自由基(.OH)。這些活性氧在組織內(nèi)增多，可造成脂類過氧化、蛋白質(zhì)及DNA等的損傷。
近年來在EAU動物模型誘發(fā)時，普遍應(yīng)用卡介苗及百日咳桿菌或百日咳桿菌毒素作為雙佐劑與抗原一起來免疫動物。實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)雙佐劑免疫后的動物模型，其P MNs浸潤程度增加，視網(wǎng)膜脂類過氧化損傷加劇。利用化學(xué)反光的方法發(fā)現(xiàn)EAU的高峰期超氧陰離子自由基及羥自由基明顯增高。由此認(rèn)為不論在EAU的初始期，還是持續(xù)期，氧自由基在視網(wǎng)膜氧化損傷中起主要作用，并最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性。
本實驗的結(jié)果表明，EAU大鼠視網(wǎng)膜共軛二烯及丙二醛水平的增高，在時間上基本同步，而螢光色脂類水平的增高滯后于前兩者，在第二周后才顯著增高。脂類氫過氧化物水平的增高在第一周未便達到高峰，之后雖明顯高于正常對照，但卻呈不斷下降趨勢。
從脂類過氧化的過程推測，由于螢光色脂類是由丙二醛與磷脂、芳香苯胺及蛋白質(zhì)氨基反應(yīng)后生成的產(chǎn)物，可能該反應(yīng)的速率相對遲緩，加之組織中對醛類的活性代謝，均可能成為螢光色脂類滯后的原因。
在脂類過氧化的引發(fā)階段所產(chǎn)生脂類氫過氧化物(LHOOH)，可發(fā)生裂解(fragmentation)，產(chǎn)生烷氧基自由基(.LHO)及羥自由基(.OH):。在脂類過氧化的擴展階段，二價鐵離子(Ee++)可催化LHOOH反應(yīng)生成烷氧基自由基。由此我們推測，在EAU病變的某一階段LHOOH的分解大于生成，可能導(dǎo)致其總含量在第一周后逐漸下降。
經(jīng)過青藤堿治療以后，EAU大鼠視網(wǎng)膜脂類過氧化物的生成受到不同程度的抑制，同時病理檢查證實多形核白細(xì)胞的浸潤程度也減輕。從我們前面體外實驗中發(fā)現(xiàn)，青藤堿本身就能清除超氧陰離子自由基及羥自由基，并有抗脂類過氧化的作用。以往的實驗業(yè)已證明，細(xì)胞膜的氧化損傷，可能導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，激活磷脂酶，引起游離的花生四烯酸生成增加，后者可以進一步轉(zhuǎn)化成前列腺素，另外脂類氫過氧化物也能夠?qū)е禄ㄉ南┧岬难趸?，在這兩種反應(yīng)過程中，均可促成炎性細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生，加重局部炎性浸潤程度。因此，我們認(rèn)為青藤堿減輕EAU炎癥反應(yīng)的作用與其清除自由基抗脂類過氧化，從而抑制炎性趨化因子產(chǎn)生有關(guān)。
髓過氧化物酶(MPO)在中性白細(xì)胞的嗜苯胺顆粒中濃度非常高，一直被作為中性白細(xì)胞的標(biāo)志酶。在本實驗的觀察中，EAU大鼠的視網(wǎng)膜MPO活性在免疫后第9天便已升高，第14天時達到高峰，之后下降，在第21天時仍高于第9天。這種結(jié)果相似于Goto.H等的實驗觀察。
眾所周知，在正常眼組織中存在著三種抗氧化損傷的保護機制一是抗氧化酶系統(tǒng)，能夠防止活性氧產(chǎn)生；二是自由基清除劑；三是氧化損傷的修復(fù)機制。三種機制中，首當(dāng)其沖的是抗氧化酶系統(tǒng)，它主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶及過氧化物酶系。
SOD被認(rèn)為是抗氧酶系的首要成份，它能夠?qū)Ｒ恍缘厍宄蹶庪x子自由基(.O2)。過氧化氫酶不僅可以清除過氧化氫(H2O2)，而且能夠減少羥自由基的生成，谷胱甘肽過氧化物酶是一個含硒酶，可催化谷胱甘肽與過氧化氫及過氧化物起反應(yīng)，以消除過氧化物的毒性作用。
在本實驗中，我們觀察了SOD、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性的變化。實驗結(jié)果表明，SOD的活性在動物免疫后第9天首先升高，之后隨病程迅速下降，在炎癥的高峰期(第14天)活性降至最低點，以后有所回升。有實驗證明，視網(wǎng)膜SOD主要定位于感光細(xì)胞的內(nèi)段及視網(wǎng)膜色素上皮，這些部位也恰是EAU炎癥主要侵及的眼組織，而且視網(wǎng)膜SOD的活性遠大于晶狀體。因此我們推測，在EAU病變初期，視網(wǎng)膜SOD活性反應(yīng)性升高，以消除不斷增多的O2，當(dāng)O2的產(chǎn)生超過SOD清除能力時，SOD活性明顯下降。另外有研究發(fā)現(xiàn)，組織中過多的過氧化氫產(chǎn)生會造成Cu-Zn SOD的重要輔基Cu++的還原，從而抑制SOD的活性。
我們對EAU大鼠視網(wǎng)膜過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性測定的結(jié)果表明，二者活性變化不同于SOD，在觀察期內(nèi)一直呈下降趨勢，其過氧化氫酶活性下降的更為明顯。二者活性的下降，勢必導(dǎo)致組織中過多的H2O2及過氧化物不能效清除。這不僅可以直接帶來組織的損傷，而且更重要的是過多的H2O2可反應(yīng)生成毒性更強的羥自由基，從而激活脂類過氧化過程，加重組織損傷。
利用青藤堿治療以后，反映組織中中性白細(xì)胞浸潤程度的髓過氧化物酶活性的升高得到了抑制，SOD及過氧化氫酶活性下降程度明顯減輕。眾所周知，正常機體內(nèi)氧化與抗氧機制維持著動態(tài)平衡。抗氧化系統(tǒng)中，抗氧化酶系具有反應(yīng)迅速、活性高的特點，因此成為抗氧化機制中主要的成份。從我們前面對EAU大鼠視網(wǎng)膜脂類過氧化產(chǎn)物的觀察結(jié)果可以看出，在EAU過程中視網(wǎng)膜脂類過氧化過程加劇。這種自由基介導(dǎo)的脂類過氧化是一鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，有不斷增強的趨勢，其損傷作用會不斷加重，只有通過抗氧化機制去打斷反應(yīng)鏈，才能中止或減輕其損傷。因此我們認(rèn)為，在EAU中，保護體內(nèi)抗氧化酶的活性及從體外給予抗氧化劑或抗氧化酶，是減輕EAU脂類過氧化損傷的有效方法。
總而言之，在EAU的病程中視網(wǎng)膜脂類過氧化反應(yīng)增強，同時抗氧化酶系的活性下降。青藤堿治療，對抑制脂類過氧化、減少炎癥浸潤、保護抗氧化酶活性是有效的實施例1鹽酸青藤堿粉劑25000mg，購自武漢市中聯(lián)制藥廠，藥用淀粉250g，酒精適量造粒，干燥，進壓片機壓片，制成1000片，每片片重為275mg，含鹽酸青藤堿25mg。
實施例2青藤堿20000mg，淀粉180g，二者充分混合，裝膠囊，制成2000粒膠囊，每粒0.1g重，含鹽酸青藤堿10mg。
權(quán)利要求
1.青藤堿及其藥用鹽的藥物新用途，其特征在于青藤堿及其藥用鹽在制備具有清除自由基作用的藥物中的應(yīng)用。
2.青藤堿及其藥用鹽的藥物新用途，其特征在于青藤堿及其藥用鹽在制備具有抗脂類過氧化的藥物中的應(yīng)用。
3.青藤堿及其藥用鹽的藥物新用途，其特征在于青藤堿及其藥用鹽在制備具有保護抗氧化酶活性作用的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了青藤堿及其藥用鹽的新制藥用途,即青藤堿在制備具有清除自由基、抗脂類過氧化和保護抗氧化酶活性作用的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P39/00GK1216701SQ98120549
公開日1999年5月19日 申請日期1998年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月22日
發(fā)明者孫旭光, 黃宇明, 仇萍 申請人:湖南正清制藥集團股份有限公司