專利名稱：鱟屬抗lps因子的肽的新免疫學(xué)活性的制作方法
盡管對(duì)革蘭氏陰性膿毒病引起的膿毒性休克(septic shock)的控制有所進(jìn)展，但該疾病繼續(xù)導(dǎo)致外科和醫(yī)療患者死亡。這種患者的死亡通常是由于心血管萎縮和/或者多器官系統(tǒng)衰退。被認(rèn)為在引起膿毒性休克中起重要作用的一種革蘭氏陰性細(xì)菌的主要組分是一種外壁成分，內(nèi)毒素(LPS)。
內(nèi)毒素是高分子復(fù)合物，其與革蘭氏陰性細(xì)菌外膜有關(guān)，靜脈內(nèi)施用后產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)。當(dāng)細(xì)菌死亡和分解時(shí)，內(nèi)毒素從活細(xì)菌上脫落，并且也釋放到環(huán)境中。細(xì)菌內(nèi)毒素是一種由脂，糖和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，以總體上帶負(fù)電荷，熱穩(wěn)定和高分子量為特征。高純度的內(nèi)毒素不含有蛋白質(zhì)，并且是一種脂多糖(LPS)。
人們熟知，細(xì)菌內(nèi)毒素在動(dòng)物和人類中具有及其重要的生物學(xué)作用，并且它存在時(shí)導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題，其癥狀包括引起高燒，補(bǔ)體和細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)的活化以及低血壓。在任何與體液接觸的藥物產(chǎn)物或醫(yī)學(xué)裝置中避免內(nèi)毒素污染是關(guān)鍵性的。在血清中由于細(xì)菌疾病引起的高內(nèi)毒素水平(敗血癥)不容易治療。對(duì)該感染的抗生性治療僅僅是殺死細(xì)菌，從而使內(nèi)毒素從它們的細(xì)胞壁游離出來造成發(fā)熱。
LPS在膿毒性休克的病理中是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)物，并且在美國是增強(qiáng)護(hù)理單位中死亡的主要原因之一。已經(jīng)觀察到在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中在膿毒病期間LPS暴露將刺激免疫應(yīng)答，這將導(dǎo)致在有毒級(jí)聯(lián)中TNF-α和其它促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Morrison和Ulevitch，美國病理學(xué)雜志93:527(1978)。膿毒病內(nèi)皮破壞可能導(dǎo)致持久的和重復(fù)的炎癥結(jié)果。Bane，國際醫(yī)學(xué)年報(bào)115:457(1991)。
已經(jīng)研究出一些蛋白質(zhì)具有結(jié)合與中和LPS的能力，并且在膿毒性休克治療中的潛在利用。最廣泛研究的LPS-結(jié)合蛋白之一是殺細(xì)菌的/提高透性的蛋白質(zhì)(BPI)，其是在多形白細(xì)胞的嗜天青顆粒中所發(fā)現(xiàn)的堿性蛋白質(zhì)。來自人PMN5的BPI蛋白質(zhì)具有一種對(duì)廣譜革蘭氏陰性細(xì)菌的有效殺菌活性。這種抗細(xì)菌活性看來似乎與分離的人類BPI蛋白質(zhì)的氨基端末端區(qū)域(氨基酸殘基1-199)有關(guān)。近來有人指出BPI(rBPI25)的N端片段中和內(nèi)毒素活性，Helene等，免疫與感染62:1185(1994)。除它的殺菌作用之外，BPI顯示出中和它結(jié)合LPS的有毒和細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用。Xoma公司正開發(fā)一種基于BPI蛋白質(zhì)的治療產(chǎn)品。該公司的主要BPI-衍生的產(chǎn)物(Neuprex)用在四種適應(yīng)癥的臨床功效試驗(yàn)中[1]腦膜炎球菌血癥，[2]出血?jiǎng)?chuàng)傷，[3]部分肝切除，[4]嚴(yán)重內(nèi)腹感染。XOMA公司1996年7月30日。
脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)是一種在肝中合成的60kD的糖蛋白，它與BPI顯示重要的結(jié)構(gòu)同源性。Shumann等公開了氨基酸序列以及人和兔的編碼cDNA。如同BPI一樣，LBP具有脂A結(jié)合位點(diǎn)，并且結(jié)合到來自粗糙和光滑形式的細(xì)菌的LPS上。不同于BPI,LBP不具有明顯的殺菌活性，并且它提高(而非阻止)LPS-誘導(dǎo)的TNF的產(chǎn)生。Schumann等，科學(xué)，249:1429(1990)。
一種用于清除細(xì)菌的正常宿主影響機(jī)制包括結(jié)合以及通過中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞的隨后吞噬。作為這種處理的一部分，將細(xì)菌暴露于殺菌和抑菌因子，包括氧自由基，溶酶體酶，乳鐵結(jié)合蛋白和各種陽離子蛋白質(zhì)。LBP調(diào)理含LPS的微粒以及完整的革蘭氏陰性細(xì)菌，介導(dǎo)調(diào)解這些LPB-包被的微粒對(duì)巨噬細(xì)胞的附著。Wright等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志170:1231(1989)。該附著看來似乎通過單核細(xì)胞的CD14受體結(jié)合LPS和LBP的復(fù)合體。Wright等，科學(xué)249:1431(1990)。在LBP存在下，LPS與CD14(在多形核白細(xì)胞以及單核細(xì)胞表面存在)的相互作用已經(jīng)顯示出增加中性白細(xì)胞的粘附活性。Wright等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志173:1281(1991),Worthen等，臨床診斷雜志90:2526(1992)。這樣，盡管BPI顯示出對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞毒性，并且抑制由細(xì)菌刺激產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，但是LBP通過CD14-依賴機(jī)制促進(jìn)單核細(xì)胞的細(xì)菌結(jié)合以及活化。新的生物活性脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)衍生物包括LBP衍生的雜合蛋白，其特征是具有結(jié)合以及中和LPS的能力并且缺乏全LBP的CD14-介導(dǎo)的免疫刺激性質(zhì)。Gazzano-Santoro,WO 95/00641。此外，將與LBP蛋白質(zhì)的殘基91-108對(duì)應(yīng)的肽確定為高親和性地特異性結(jié)合脂。肽抑制LBP與LPS的結(jié)合，抑制顯色鱟屬(Limulus)阿米巴狀細(xì)胞裂解物反應(yīng)，并且在體內(nèi)和體外阻止TNF在LPS攻擊后的釋放，Taylor24等，生物化學(xué)雜志270:17934,。
另一個(gè)能夠結(jié)合和中和內(nèi)毒素的LPS-結(jié)合蛋白已經(jīng)從鱟(如Limuluspolyphemus)分離出以及從Tachypleus tridentafus分離出Tachypleus解脂多糖因子(TALF),Klaczewiak29等，傳染疾病雜志170:490-7(1994)。來自它們的血淋巴(阿米巴細(xì)胞)的細(xì)胞經(jīng)歷一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，導(dǎo)致血塊形成，類以于哺乳動(dòng)物血液凝聚。這一現(xiàn)象已經(jīng)用來開發(fā)了對(duì)很低內(nèi)毒素水平敏感的生物分析。
當(dāng)前，這種類型的生物測定是監(jiān)測藥物制造的方法，并且稱之為鱟屬阿米巴細(xì)胞裂解物(LAL)。
Wainwright等，WO 92/20715涉及關(guān)于內(nèi)毒素結(jié)合/中和蛋白質(zhì)的藥物效用的發(fā)明，并且公開了用于內(nèi)毒素測定的內(nèi)毒素結(jié)合/中和蛋白質(zhì)的用途。該發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在體內(nèi)能夠結(jié)合和中和內(nèi)毒素的藥物組合物，其中包含有至少與一部分從鱟分離的內(nèi)毒素結(jié)合/中和蛋白質(zhì)的內(nèi)毒素結(jié)合和中和結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的一種內(nèi)毒素結(jié)合/中和蛋白質(zhì)。
人們已經(jīng)研究出鱟屬抗LPS因子(LALF)用于膿毒病。Warren等，感染免疫學(xué)60:2506-2513(1992)和Garcia25等，Grit.Care.Med.22:1211。這種蛋白質(zhì)幾乎肯定給出對(duì)于人治療的其它外源蛋白相關(guān)的劣勢，它是免疫原性并且在循環(huán)中僅僅有一個(gè)短的半衰期，這些因子將減少它的臨床潛力。沒有一種這些物質(zhì)已經(jīng)證實(shí)對(duì)于在人類中治療與革蘭氏陰性感染相關(guān)的嚴(yán)重疾病來說是有效的。
對(duì)于上述技術(shù)問題的解決方法是通過提供與緊密結(jié)合LPS的肽相關(guān)的物質(zhì)完成的，因此，在革蘭氏陰性和其它膿毒性疾病的診斷和治療中是有效的。Battafaraono等從這些蛋白質(zhì)預(yù)測的LPS-結(jié)合基元的BPI,LALF,LBP(每種長為27個(gè)氨基酸)合成了三個(gè)肽。所有從BPI,LALF和LBP衍生的小肽保持明顯的體外對(duì)不同革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素中和的和殺菌的活性，Battafaraono26等，外科118:318-24。不久以前，F(xiàn)letcher等設(shè)計(jì)一種新的肽-IgG綴合物，CAP-18(106-138)-IgG，它結(jié)合和中和內(nèi)毒素，并且殺死革蘭氏陰性細(xì)菌，F(xiàn)letche27等，傳染疾病雜志175:621-32。
Hoess等，WO 95/05393涉及一種物質(zhì)，該物質(zhì)高親和性地結(jié)合內(nèi)毒素(脂多糖[LPS])，并且它對(duì)于預(yù)防或治療例如革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌膿毒病來說是有用的，對(duì)于治療細(xì)菌和真菌感染是有用的，以及對(duì)于中和與肝素有關(guān)的作用是有用的。該物質(zhì)是包含一個(gè)LPS-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LPS-結(jié)合肽。已公開包含來自鱟屬抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽。
LALF的晶體結(jié)構(gòu)揭示了一種簡單的三重折疊，它具有一種引人注目的形狀和兩親性。通過正電荷和兩親性并且具有一些暴露的疏水和芳香族殘基，LALF結(jié)構(gòu)中的表面伸展環(huán)(LALF或LALF-環(huán))與多粘菌素B具有類似的特性。此外，通過正電荷和疏水和芳香族殘基的輪流系列來區(qū)別LALF的環(huán)，并且借助伸展的β-構(gòu)象，其指向相反方向，單一對(duì)陽性電荷由于β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象，指向相同方向并且保持兩親性。所說的環(huán)不包含任何負(fù)電荷氨基酸。Hoess已經(jīng)描述對(duì)于具有線型10-聚體肽的內(nèi)毒素和脂質(zhì)A的rLALF來說最小限度的要求。然而，環(huán)肽大概通過模仿所暴露環(huán)的三維特征以高親和性結(jié)合脂質(zhì)A和內(nèi)毒素，Ried28等，生物化學(xué)雜志271:28120-7。在小鼠中進(jìn)行內(nèi)毒素免疫性實(shí)驗(yàn)后，環(huán)肽LALF36-47能夠阻止TNF誘導(dǎo)。前不久已經(jīng)描述了鱟屬抗脂多糖因子(LALF)中和細(xì)菌內(nèi)毒素，并且保護(hù)小鼠使之免受LPS的殺傷，即使在連續(xù)內(nèi)毒素血癥開始發(fā)作后施用LALF時(shí)也是如此，Roth31RI.Su DH.Child AH.Wainwright NR和Levin J.傳染病雜志177(2):388-394,1998。
一個(gè)類似的兩親性環(huán)存在于三個(gè)其它結(jié)合LPS的蛋白質(zhì)中兔和人脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)和人類殺菌/提高通透性蛋白(BPI)。對(duì)LBP和BPI序列的檢查揭示出交替殘基的一種類似模式，它能夠產(chǎn)生一種兩親性環(huán)。
然而，這些發(fā)明沒有表明任何關(guān)于單核細(xì)胞的抗病毒作用和/或活化，以及沒有表明來自鱟的內(nèi)毒素結(jié)合/中和蛋白或者包含來自該蛋白質(zhì)的31-52位氨基酸的肽。在膿毒病和傳染病中其用途或治療效能是與LPS-結(jié)合相關(guān)的。此外，沒有參考文獻(xiàn)公開來自鱟屬抗LPS因子的肽31-52對(duì)于抗病毒治療或者提高免疫應(yīng)答的用途。
人們熟知，病毒是在它的基因組(RNA或DNA)中僅僅含有一種類型的核酸(一般稱為跖分子)的較小的感染病原體。病毒僅僅在活細(xì)胞和人中復(fù)制，它們可以產(chǎn)生不同的疾病。
A．全身疾病，其中該病毒在整個(gè)身體中散布，如天花，黃熱病，登革熱等等。
B．如脊髓灰質(zhì)炎，由腸道病毒(小兒麻痹癥，柯薩奇病毒)造成的無菌腦膜炎，狂犬病，由節(jié)肢動(dòng)物傳輸?shù)哪X炎等等的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
C．皮膚或粘液的疾病皰疹單顯性組合，類型Ⅰ(通常是口)和類型Ⅱ(通常通過生殖)。
D．眼病由于腺病毒的結(jié)膜炎，由于紐卡斯?fàn)柌《镜慕Y(jié)膜炎，流行性出血結(jié)膜炎。
E．肝病類型A肝炎(傳染性肝炎)，類型B肝炎(通過血清的肝炎)等等。
假設(shè)病毒是必需在胞內(nèi)的寄生物，抗病毒劑不用破壞宿主就應(yīng)該能夠有選擇地抑制病毒的功能。有一些以一種特異的方式抑制病毒而不影響細(xì)胞代謝過程的化合物，例如金剛胺，一種抑制流感病毒的合成胺；metisazone，一種許多痘病毒的抑制劑，三氟胸苷已經(jīng)用于成功地治療由于單純皰疹病毒引起的角膜病斑。許多這種充當(dāng)抗代謝物的藥劑具有缺陷，它們對(duì)人類有毒。
在動(dòng)物和人中，由于它們的抗病毒容量和免疫系統(tǒng)刺激的能力，因此也檢驗(yàn)了諸如左旋咪唑和Isoprinosine之類的化合物，這些藥劑不是抗代謝物，但是細(xì)胞免疫性刺激物。
由動(dòng)物和人以及培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生能夠抑制病毒復(fù)制的干擾素(在1957年所發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì))，它作為病毒感染的應(yīng)答或者其它一些誘導(dǎo)體。干擾素在相同物種的細(xì)胞中作為抗病毒物質(zhì)是更有效的。相反，干擾素活性對(duì)特定病毒不具特異性。作為病毒或其它誘導(dǎo)體的應(yīng)答所產(chǎn)生的干擾素有效地抑制各種病毒的復(fù)制。在感染發(fā)生之前將干擾素添加到細(xì)胞中時(shí)，將顯著地抑制病毒的復(fù)制，而細(xì)胞功能仍然保持正常。
在重要的外科手術(shù)(如胃腸道手術(shù))過程中，或者在手術(shù)部位有高危感染(如心血管手術(shù))患者中，人類病毒感染可能導(dǎo)致并發(fā)癥。
在無菌外科手術(shù)(如腹腔或心血管外科)中，所謂的后手術(shù)急性階段反應(yīng)的特征是吞噬細(xì)胞功能的破壞，對(duì)多克隆激活物的淋巴細(xì)胞應(yīng)答的減弱，以及B細(xì)胞功能的改變的功能(D.Berger，內(nèi)毒素研究雜志，4卷，第1期(1997))。這一階段的特征是患者的免疫功能異常。由巨細(xì)胞病毒(CMV)產(chǎn)生的肺炎在有免疫缺損的人中更重要，如利用免疫抑制劑作為器官移植或者惡性過程治療的患者，以及天然免疫缺陷的人，如低丙種球蛋白質(zhì)血癥和削弱慢性過程的患者，由于這些原因由CMV產(chǎn)生的肺炎可能是在任何具有降低的免疫能力的患者中的并發(fā)癥。病毒起源的肺炎對(duì)抗微生物治療沒有反應(yīng)。由流感病毒產(chǎn)生的肺炎一般影響老年人，這些老年人由于經(jīng)受非感染性疾病，例如肺，心血管或腎疾病，因此其是免疫受阻抑的。在所有這些情況之下，十分有用的是依靠具有抗病毒性質(zhì)和/或免疫系統(tǒng)刺激性質(zhì)的制劑。
本發(fā)明的重要性涉及到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在這里所公開的肽的效能涉及抗病毒和抗細(xì)菌作用，此外涉及激活免疫系統(tǒng)并且保護(hù)宿主使之免受細(xì)菌或病毒傳染。因此，來自鱟屬抗LPS因子的肽31-52能夠用于治療和/或預(yù)防病毒和細(xì)菌的傳染病中，以及由于危急外科手術(shù)，損傷，疾病，或有害地影響免疫系統(tǒng)的其它疾病所致高感染風(fēng)險(xiǎn)的患者。這種肽在治療免疫抑制的患者中也是有用的?？傊?，本發(fā)明的肽可以認(rèn)為是具有廣譜治療傳染病能力的新的免疫系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明涉及包含來自鱟屬抗LPS因子蛋白質(zhì)的31-52位氨基酸的肽，該蛋白質(zhì)是從鱟(如Limulus polyphemus)分離的，該肽提高宿主對(duì)感染的免疫的防衛(wèi)機(jī)制，但是不引起炎癥反應(yīng)。
這種肽顯示出具有抗病毒作用，它能夠在體外測定中保護(hù)細(xì)胞使之免受病毒的感染。此外，來自與肽一起培養(yǎng)的人類單核細(xì)胞的上清液含有特定的可溶性調(diào)節(jié)物(如IFN-γ)，它能夠賦予細(xì)胞Hep-2保護(hù)性使之免受到將來病毒的感染。另一方面，這種肽在體內(nèi)阻止直接感染。這些有利的性質(zhì)使本發(fā)明的肽在預(yù)防和治療感染中是有用的，因?yàn)樗鼈儍H僅有選擇地激活那些對(duì)感染的初始應(yīng)答起作用的免疫系統(tǒng)組分，而不刺激特定生化調(diào)節(jié)物的釋放，這些調(diào)節(jié)物可以導(dǎo)致不利的副作用。該肽也沒有許多免疫調(diào)節(jié)物的共有毒性。
利用固相方法可以合成本發(fā)明的肽。在水中用30％乙酸溶液提取粗的肽，凍干然后用RP-HPLC純化。利用裝有FAB注射針的JEOL JMS-HX11OHF兩部分質(zhì)譜儀檢驗(yàn)純化肽的分子量。形成的制劑是非抗原性的，非致熱性的并且對(duì)于動(dòng)物和人類的施用藥學(xué)上是可接受的。
可以將本發(fā)明的包含來自鱟屬抗LPS因子蛋白質(zhì)的31-52位氨基酸的肽用作安全，有效的治療和/或預(yù)防劑，它在人類和動(dòng)物中單獨(dú)地或者作為佐劑提高免疫應(yīng)答。包含本文所公開的氨基酸序列的肽僅僅有選擇地激活那些組分，該組分對(duì)由細(xì)菌或病毒引起的感染的初始應(yīng)答起作用，而不刺激或引導(dǎo)免疫系統(tǒng)釋放特定的生化介質(zhì)(例如TNF，IL-1)，該介質(zhì)可能導(dǎo)致負(fù)作用。因此，在營養(yǎng)不良的患者中，在經(jīng)受外科和骨髓移植的患者、經(jīng)受化療或放療的患者、中性白細(xì)胞減少癥的患者、HIV-感染的患者、創(chuàng)傷患者、燒傷患者、具有慢性或抵抗性感染的患者中，可以將本肽用于預(yù)防或治療由細(xì)菌或者病毒引起的傳染病，所有患者可能已經(jīng)削弱了其免疫系統(tǒng)。一般地，無免疫應(yīng)答患者定義為表現(xiàn)出對(duì)感染病原體攻擊產(chǎn)生正常細(xì)胞和/或體液防御上減弱的或降低的能力的人，所說的感染病原體如病毒，細(xì)菌，真菌以及原生動(dòng)物。一般地，蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的患者定義為血清白蛋白水平低于約每分升3.2克(g/dl)和/或非故意的重量減輕高于正常體重的10％的人。
更具體地說，本發(fā)明的方法可以用于治療性地或預(yù)防性地治療動(dòng)物或者人，由于危急的外科，損傷，疾病，輻射或化療，或者其它嚴(yán)重影響免疫系統(tǒng)的疾病，這些患者正處于感染的高危期。該方法對(duì)于治療具有引起正常代謝免疫應(yīng)答降低或受抑制之疾病或紊亂(如HIV感染(AIDS))的患者是有用的。例如，所說的方法可以在患者中用于預(yù)啟動(dòng)代謝免疫應(yīng)答，該患者正在經(jīng)受化療或放療，或者由于引起降低動(dòng)員身體對(duì)感染的正常代謝反應(yīng)能力之疾病，紊亂或者治療，該患者正處于出現(xiàn)次級(jí)感染或手術(shù)后并發(fā)癥的高危期。用所說肽的治療已經(jīng)顯示出，在動(dòng)員宿主正常免疫防御，從而保護(hù)所治療的宿主免受感染上特別有效。它可以用于由非感染性疾病(如心血管和慢性疾病)喪失免疫力的老年人。人們熟知，這些人對(duì)病毒性肺炎(如流感病毒)是敏感的。它在治療由巨細(xì)胞病毒(DMV)引起的肺炎上也是有效的，每天在免疫缺損患者(如由于器官移植用免疫抑制劑治療的患者)中，它更重要。用這種肽的治療在增強(qiáng)有創(chuàng)傷的患者是特別有吸引力的，或者其可以在所謂的手術(shù)后急相期進(jìn)行施用，在該期間一般與引起嚴(yán)重后果的病毒感染有關(guān)，在該期間患者經(jīng)抗微生物治療沒有好轉(zhuǎn)。如在急性手術(shù)后期間，有創(chuàng)傷的患者的免疫應(yīng)答退化，主要由于巨噬細(xì)胞活性降低和在感染期間它們喪失足夠反應(yīng)的能力(Berger等，臨床醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，1995,239:121-130)。因此，在病毒或細(xì)菌源傳染病中，刺激巨噬細(xì)胞功能的藥劑作為免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)物將是很有治療和預(yù)防價(jià)值的。
利用所說肽治療已經(jīng)顯示，它在動(dòng)員宿主的正常免疫防御，增加宿主對(duì)感染的保護(hù)作用上特別有效。
在其它實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的肽施用給正經(jīng)歷免疫麻痹的患者(Randow等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1995,181:1887-1892)，免疫麻痹定義為單核細(xì)胞MHCⅡ類減少，單核細(xì)胞呈遞抗原活性削弱和它們產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子的能力降低。這種現(xiàn)象稱為補(bǔ)償性抗炎癥反應(yīng)綜合癥。在膿毒病晚期，單核細(xì)胞刺激是有用的，因?yàn)樗姑庖呗楸曰颊呋謴?fù)了單核細(xì)胞缺損的表型與功能。
一般地，將本發(fā)明的肽以足以產(chǎn)生免疫系統(tǒng)增強(qiáng)的量施用給動(dòng)物或人。該肽的施用方式可以是口頭，腸道，腸胃外，靜脈內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)。施用組合物的方式(例如藥片，膠囊，溶液，乳劑)將取決于施用的途徑。施用組合物的量將決定于各自的主要成分，并且至少考慮患者感染或傷害的嚴(yán)重程度，患者狀況或者整個(gè)健康狀況，患者體重以及手術(shù)，化療或其它高危治療之前可利用的時(shí)間。一般來說，單劑優(yōu)選地含有大約每千克體重5-10mg肽。一般來說，在有必要刺激個(gè)體免疫應(yīng)答時(shí)，將本發(fā)明的組合物周期性地施用給個(gè)體。
在施用組合物期間，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠確定時(shí)間的長短和劑量，這將取決于患者的生理?xiàng)l件和所治療的疾病或紊亂。如上所述，該組合物也可以用作預(yù)防性治療以預(yù)啟動(dòng)身體動(dòng)員對(duì)抗感染的正常代謝防御。
所說的肽可以用于預(yù)防和治療由廣譜細(xì)菌，真菌，病毒和原生動(dòng)物病原體引起的感染。在手術(shù)前，手術(shù)期間和/或手術(shù)后，給經(jīng)受手術(shù)的人預(yù)防性地施用肽都將在正常和高?；颊咧袦p少手術(shù)后感染的發(fā)生率和嚴(yán)重性。例如，在將經(jīng)受污染或潛在污染的外科過程的患者中(例如腸胃外科，子宮切除，切開術(shù)，尿道前列腺手術(shù))和在手術(shù)部位存在高危的患者中(例如人假器官形成，心血管外科)，用適當(dāng)抗細(xì)菌劑和本發(fā)明的肽制劑的并行初始治療都將減少感染并發(fā)癥的發(fā)生率和嚴(yán)重性。
在不僅由疾病(例如癌，愛滋病)，而且由化療和/或放療引起免疫抑制的患者中，肽制劑的預(yù)防性施用將減少由廣譜機(jī)會(huì)病原體(包括許多不尋常的細(xì)菌，真菌和病毒)造成感染的發(fā)生率。
在高危患者(例如，超過65歲、糖尿病、癌患者、營養(yǎng)不良、腎病、氣腫、脫水、運(yùn)動(dòng)受阻等等)中，住院治療經(jīng)常與嚴(yán)重醫(yī)院感染的高發(fā)生率相關(guān)。在確定利用呼吸器，導(dǎo)液管，增強(qiáng)護(hù)理單位，延長住院治療等等之前，經(jīng)驗(yàn)性地開始用這種肽制劑進(jìn)行治療來幫助阻止一般與這些過程相聯(lián)系的感染?，F(xiàn)已表明，可以用抗微生物劑和肽制劑并行治療慢性、嚴(yán)重、難控制、復(fù)雜和困難的疾病，以治療感染。
除肽之外，本發(fā)明方法所施用的組合物可以包含也可以不包含其它組分。主要通過施用該組合物的方式確定特定組合物可以包含的其它組分。例如，除肽之外，以藥片形式口頭施用的組合物可以包含填充物(例如乳糖)、粘合劑(例如羧甲基纖維素，膠愈合創(chuàng)木脂，明膠)、佐劑、調(diào)味劑、著色劑以及涂布材料(例如蠟或塑化劑)。以液態(tài)形式施用的組合物包含肽、可以包含也可以不包含乳化劑、調(diào)味劑和/或著色劑?？梢詫⒛c胃外施用的組合物混合，溶解或者乳化在水、無菌鹽水、PBS、葡萄糖或其它生物學(xué)上可接受的載體中。局部施用的組合物可以配制成凝膠、軟膏、洗劑、奶油以及組合物可以涂布到所治療的面(例如創(chuàng)傷位置)上的其它形式。
可以局部施用包含肽制劑的組合物到創(chuàng)傷部位，以刺激和增強(qiáng)創(chuàng)傷的治愈和修復(fù)。其中，由于潰瘍、痤瘡、病毒感染、真菌感染或牙病引起的創(chuàng)傷可以用根據(jù)本發(fā)明的方法治療，以便加速治愈過程。另外，可以將肽制劑注射給創(chuàng)傷或患病區(qū)域。除創(chuàng)傷修復(fù)之外，可以將該組合物用來治療與此或病原體(引起創(chuàng)傷)相聯(lián)系的感染(導(dǎo)致創(chuàng)傷)。局部施用的組合物可以配制成凝膠、軟膏、洗劑、奶油以及組合物可以涂布到所治療的位置(例如創(chuàng)傷部位)上的其它形式。用于創(chuàng)傷的典型劑量將從約5mg到約10mg。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含所論及的肽序列的雜合多肽，其中所說的優(yōu)選的肽序列以某種方式組成更大多肽鏈的N-末端或C-末端，所說的方式保持其提高免疫應(yīng)答的能力，并且賦予雜合多肽這種能力。一種優(yōu)選的雜合多肽包括任何優(yōu)選的肽和IgG重鏈區(qū)的融合體。
本發(fā)明也涉及以某種方式適當(dāng)?shù)乇┞端摷暗碾男蛄械闹Ъ艿鞍?，所說的方式保持其提高免疫應(yīng)答的能力，并且賦予雜合多肽這種能力。
本文所使用的術(shù)語“支架蛋白”意指雜合多肽，該多肽在它們的多肽鏈之內(nèi)以某種方式包含一條或多條所選擇的LALF序列，所說的方式是使所插入的區(qū)段在融合蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)暴露的環(huán)。
利用雜合和支架多肽以及包含優(yōu)選的肽序列的蛋白質(zhì)可以改善體內(nèi)高生命期和其它藥理學(xué)參數(shù)。
同時(shí)，可以將編碼肽或編碼包含所說肽序列的雜合或支架蛋白的DNA序列插入適當(dāng)?shù)拇w內(nèi)表達(dá)的載體中，與合適的載體、稀釋液、佐劑以及穩(wěn)定溶液和化學(xué)品一起用于治療目的。
本文公開的來自鱟屬抗LPS因子肽的新的免疫學(xué)活性提高了哺乳動(dòng)物單核細(xì)胞的非特異性防御力，并且很好地增加了它們對(duì)感染刺激作用反應(yīng)的能力。另一方面，不同于許多報(bào)道的那些防御的非特異刺激物，它不會(huì)導(dǎo)致體溫升高(例如發(fā)熱)。肽制劑的這種關(guān)鍵性優(yōu)點(diǎn)可以出現(xiàn)在調(diào)節(jié)白血細(xì)胞反應(yīng)的自然輪廓方面。已經(jīng)顯示出，本發(fā)明的作用有選擇地激活免疫應(yīng)答，但是不直接刺激或者啟動(dòng)細(xì)胞因子(例如TNF)從單核細(xì)胞中釋放，因此它與其它免疫刺激物明顯不同。
下面用特定實(shí)施例闡述本發(fā)明，其目的在于描述，而不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1．肽在細(xì)胞系HEP-2上的抗病毒作用借助在細(xì)胞系Hep-2上由病毒產(chǎn)生的抑制細(xì)胞致病作用，估價(jià)其抗病毒活性，這是確定干擾素抗病毒活性的普通方法(Famillietti等，1981，酶學(xué)方法．78:387-396)。為了這個(gè)目的，使用96孔塑料培養(yǎng)皿(Nunc，丹麥)。并且在MEM培養(yǎng)基(補(bǔ)充了10％的胎牛血清)中將1×105細(xì)胞培養(yǎng)成單層群系(24H)。第二天，將100μl樣品的系列稀釋液與細(xì)胞一起培養(yǎng)24小時(shí)，該稀釋液包含數(shù)量為14和28μg/ml的來自LPS-結(jié)合蛋白的不同肽鱟屬抗LPS因子31-52(LALF)，脂多糖結(jié)合蛋白86-99(LBP),18kDa的陽離子抗微生物蛋白106-128(CAP-18)和殺菌通透性增加蛋白質(zhì)86-99(BPI)。然后，將細(xì)胞用鹽溶液洗滌，并且用10-7pfu的Mengo病毒感染，該病毒由蘇黎世大學(xué)的分子生物學(xué)研究所提供，該病毒在細(xì)胞系L929鼠成纖維細(xì)胞中增殖。在18小時(shí)后，通過固定和染色(一般用結(jié)晶紫)測量細(xì)胞破壞的程度，利用光度超微分析系統(tǒng)(SUMA)讀出細(xì)胞致病作用。開發(fā)微型機(jī)系統(tǒng)的Pascal UCSD語言編程的計(jì)算機(jī)程序，用于所有的計(jì)算和校正(Ferrero等，1994，生物工程應(yīng)用，第1卷)。在這種情況下，將70000 IU/ml的人類γ-IFN(MRI，凍干的人重組γ-干擾素)的梯度稀釋液用作標(biāo)準(zhǔn)來確定其抗病毒活性單位。由于這個(gè)原因，由肽所顯示的抗病毒保護(hù)作用與γ-IFN的國際單位(IU/ml)相關(guān)聯(lián)。將來自結(jié)合內(nèi)毒素的蛋白質(zhì)的不同的肽用作陰性對(duì)照。將10ng/ml的LPS用作陽性對(duì)照，因?yàn)槿藗兪熘T導(dǎo)IFN的產(chǎn)生(Manthey等，1994，免疫學(xué)雜志，153:2653-2663)。將抗病毒活性的一個(gè)單位定義為能夠產(chǎn)生50％病毒復(fù)制抑制作用的IFN的量。
結(jié)果在表1中顯示。
表1．由不同來自LPS-結(jié)合蛋白的肽顯示的對(duì)細(xì)胞系Hep-2的抗病毒作用
表1顯示，以γ-IFN的國際單位/ml定義時(shí)，僅有肽LALF能夠在細(xì)胞Hep-2中誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)，其它來源于LPS結(jié)合蛋白的肽沒有作用。實(shí)施例2太在細(xì)胞系MDBK上的抗病毒作用本質(zhì)上如實(shí)施例1所描述的，借助于在細(xì)胞系MDBK上由病毒產(chǎn)生的抑制細(xì)胞致病作用測定其抗病毒活性。這種方法所利用的細(xì)胞是MDBK，一種腎正常牛細(xì)胞系[ATCC NO.6071]，它用10-7pfu的牛腸道病毒感染。使用增加量的LALF肽以在細(xì)胞中獲得誘導(dǎo)的保護(hù)性10μM、20μM和40μM。在這種情況下，將人α-IFN 70 000IU(MRI，凍干的參考人重組α干擾素)的連續(xù)稀釋液用作標(biāo)準(zhǔn)來確定其抗病毒活性單位。將一單位的抗病毒活性定義為能夠產(chǎn)生50％病毒復(fù)制抑制作用的IFN的量。圖5顯示了LALF肽在細(xì)胞系MDBK中能夠以劑量依賴性方式誘導(dǎo)其保護(hù)作用。實(shí)施例3．來自用肽鱟屬抗LPS因子31-52(LALF)刺激的人單核細(xì)胞的上清液誘導(dǎo)HEP-2細(xì)胞系的抗病毒作用從健康志愿者中獲得靜脈血液，并且進(jìn)行Ficoll-Hypaque離心，分級(jí)分離單核細(xì)胞。洗滌單核細(xì)胞，并且在無內(nèi)毒素RPMI1640培養(yǎng)基(補(bǔ)充了10％胎牛血清)中重懸浮。將2×106個(gè)細(xì)胞等分在24孔滴定板(Nunc，丹麥)中。然后，在37℃,5％CO2中將這些細(xì)胞與14或28μl/ml不同的肽一起培養(yǎng)18小時(shí)鱟屬抗LPS因子31-52(LALF)，脂多糖結(jié)合蛋白86-99(LBP)和18kDa陽離子抗微生物蛋白106-128(CAP-18)。在3000rpm下將這些細(xì)胞離心5min，然后利用實(shí)施例2所描述的方法分析上清液系列稀釋液和其抗病毒活性。
表2總結(jié)了結(jié)果。僅僅用作人外周血單核細(xì)胞刺激物的LALF肽誘導(dǎo)它們釋放某些能夠賦予Hep-2細(xì)胞抗病毒感染的保護(hù)作用的調(diào)節(jié)物。
表2．來自用肽鱟屬抗LPS因子31-52(LALF)刺激的人單核細(xì)胞上清液能夠誘導(dǎo)HEP-2細(xì)胞系的抗病毒作用
實(shí)施例4來自與肽一起培養(yǎng)的人單核細(xì)胞的TNFα的體外刺激作用的缺乏從健康志愿者中獲得靜脈血液，并且進(jìn)行Ficoll-Hypaque離心，分級(jí)分離單核細(xì)胞。洗滌單核細(xì)胞，并且在無內(nèi)毒素RPMI1640培養(yǎng)基(補(bǔ)充了10％胎牛血清)中重懸浮。將30×106個(gè)細(xì)胞等分在滴定板p-60(Nunc，丹麥)中。在37℃,5％CO2中將這些細(xì)胞與14或28μl/ml LALF一起培養(yǎng)18小時(shí)，然后在3000rpm離心5min。在上清液中由特異性酶連結(jié)免疫吸附劑測定(ELISA)確定TNFα的合成，ELISA由Dr.W.Buurman(Maastrich醫(yī)科大學(xué)，荷蘭)友好提供。
表3結(jié)果了結(jié)果。用作刺激物的LALF肽僅在14-28μl/ml劑量下不誘導(dǎo)超過對(duì)照緩沖液處理的細(xì)胞的增加的TNFα水平。
表3由來自LPS-結(jié)合蛋白的各種肽刺激的人單核細(xì)胞的TNFα的合成
1該值是三個(gè)供體的平均值。實(shí)施例5小鼠中對(duì)感染的體內(nèi)保護(hù)作用開發(fā)小鼠BaIB/c爆發(fā)性革蘭氏陰性腹膜膿毒病模型，以確定在保護(hù)免疫性完整宿主免受嚴(yán)重感染中LALF肽的功效的特征。在進(jìn)行感染攻擊前20小時(shí)，給小鼠腹膜內(nèi)注射LALF肽(14μg/0.1ml)或鹽水(0.1ml)(作為對(duì)照)。為了引起實(shí)驗(yàn)性腹膜炎，使用產(chǎn)生總死亡率約90％的Pseudomona aeruginosa的劑量(2×108個(gè)細(xì)菌/只小鼠)(Browder等，1987，外科學(xué)，102:206-214)。在細(xì)菌攻擊后，在120小時(shí)期間每24小時(shí)計(jì)數(shù)幸存的小鼠。由統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)Kaplan-Meyer分析生存的數(shù)據(jù)，利用遠(yuǎn)程序試驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，表5。在時(shí)間0,20,40,60,90,120,180,240 min下在對(duì)照組和肽處理的小鼠中從眼窩后的竇收集血液供TNF-α定量測定。利用特異性ELISA(由Dr.W.Buurman(Maastrich醫(yī)科大學(xué)，荷蘭)友好提供)測定小鼠血清中TNF-α的濃度。圖4。
表5在革蘭氏陰性腹膜膿毒病的小鼠模型中LALF肽對(duì)存活的預(yù)防作用<
當(dāng)進(jìn)行預(yù)防施用時(shí)，該肽保護(hù)小鼠使之免受致死細(xì)菌攻擊。所觀察到的保護(hù)作用歸因于肽對(duì)宿主免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)活性。這種作用引起圖4的促炎細(xì)胞因子TNF的減少。在膿毒病作為全身性促炎調(diào)節(jié)物釋放的結(jié)果期間，這種能力可以削弱所觀察的致死作用。實(shí)施例6在體內(nèi)LALF肽是無毒的并且不影響TNF-α的水平在6-8齡之間小鼠BalB/c中實(shí)施這種方法。給這種小鼠靜脈注射在0.1ml中的50μg[2.5mg/kg體重]肽或者鹽溶液(作為對(duì)照)。在24小時(shí)期間每4小時(shí)觀察動(dòng)物的行為。存活一周。在時(shí)間0h,6h,24h和48h在對(duì)照組和肽處理的小鼠中從眼窩后的竇收集血液用于TNF-α定量測定。用特異性ELISA(由Dr.W.Buurman(Maastrich醫(yī)科大學(xué)，荷蘭)友好提供)測定小鼠血清中TNF-α的濃度。所有的小鼠[每組10只]幸存超過一周。在體內(nèi)LALF肽是無毒的，并且不刺激TNF-α產(chǎn)生，圖3。實(shí)施例7在激活的腹膜巨噬細(xì)胞中LALF-衍生太對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。
從Balb/c中獲得腹膜來源的細(xì)胞(CENPALAB,Hauana，古巴)。在腹膜內(nèi)注射1ml的4％布魯爾氏thioglicollate肉湯4天后從腹膜溝收集原代小鼠巨噬細(xì)胞。在37℃下5％ CO2/96％空氣中，將細(xì)胞保持在RPMI(補(bǔ)充了10％熱非激活胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，200單位/ml青霉素以及200μg/ml鏈霉素)中。
測定NO2-的分泌(Jin,F29,Nathan,C,Radzioch,D,和Ding,A.細(xì)胞，1997,88:417-426)。將細(xì)胞平板接種在96-孔平板(有200μl培養(yǎng)基)中，并且在37℃下培養(yǎng)2h，然后，用PBS重復(fù)洗滌除去非粘附細(xì)胞。將巨噬細(xì)胞與5μM的LALF肽一起預(yù)培養(yǎng)18小時(shí)，隨后用RPMI培養(yǎng)基洗滌以除去肽。然后，將巨噬細(xì)胞用大腸桿菌0111:B4,Sigma(1μg/ml)的LPS處理72 hr。通過MTT的線粒體依賴性還原成formazan來評(píng)估細(xì)胞生存力(Szabo30,C,Mitchell,JA,Gross,SS,Thiemermann,C.和Vane,JR，藥物實(shí)驗(yàn)治療雜志，1992,265:674-80)。將50μl培養(yǎng)基與等體積的Greiss試劑(1％磺胺，0.1％萘乙烯亞胺二氫氯化物，2.5％H3PO4)混合。在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(SUMA)中以亞硝酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)記錄在540nm處的吸光度(Green26,LC,Wagner,DA,Glogowski,J等，生物化學(xué)分析1982,126:131-8)。扣除同樣培養(yǎng)的無細(xì)胞培養(yǎng)基的亞硝酸鹽含量。
TNF-α測定將細(xì)胞平板接種在96-孔的平板的200μl培養(yǎng)基(2×106個(gè)細(xì)胞/m))中，并且在37℃下培養(yǎng)2h。用PBS進(jìn)行重復(fù)洗滌除去非粘附細(xì)胞。用5μM的LALF肽與巨噬細(xì)胞一起預(yù)培養(yǎng)18小時(shí)，然后用RPMI培養(yǎng)基洗滌以除去肽。然后，用大腸桿菌0111::B4,Sigma(1μg/ml)的LPS處理巨噬細(xì)胞。在培養(yǎng)1h、2h、4h、6h以及24h的細(xì)胞上清液中利用ELISA試劑盒(由Dr.W.Buurman(Maastrich醫(yī)科大學(xué)，荷蘭)友好提供)測定TNF-α。
如圖6所顯示的，在肽處理的巨噬細(xì)胞中，TNF水平是下調(diào)的。相反，NO產(chǎn)生是上調(diào)的，圖7。在測定期間細(xì)胞的生存力沒有影響。從來沒有發(fā)現(xiàn)生存力低于98％。
它似乎是LPS-引起的應(yīng)答的優(yōu)選而特定的調(diào)節(jié)作用。
總之，在宿主中可能肽介導(dǎo)某些與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的相互作用，并導(dǎo)致能夠提高和/或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)施例8用LALF-衍生肽刺激PBMC，利用核糖核酸酶保護(hù)性測定(RPA)分析細(xì)胞因子的基因表達(dá)核糖核酸酶保護(hù)性測定(RPA)用于檢測、定量以及鑒定RNA分子是高度敏感和特異性的方法(Gilman32,M.分子生物學(xué)的當(dāng)前方案，J.Wiley和Sons,紐約，P.4.7.1-4.7.8.1988和Dent 33,A.L.,Shaffer,A.L.,Yu X.,Allman,D.,Staudt,L.M.,1997.細(xì)胞因子表達(dá)和由BcI-2形成生發(fā)中心，科學(xué)，276:589-592)。利用hck-l探針模板組(Cat.No.45031P)通過PharMingensRiboQuantTM多探針核糖核酸酶保護(hù)測定系統(tǒng)分析來自受刺激的和非刺激的人PBMC總RNA樣品的不同的mRNA物種，它包括不同細(xì)胞因子(如IL-5,IL-4,IL-10,IL-15,IL-9,IL-2,IL-13,IFN-γ)的mRNA物種分析。
簡言之，將一種高特異性活性的[32P]-標(biāo)記反義細(xì)胞因子RNA探針組[hck-1,Cat.No.45031P]與樣品靶RNA(來自與5μM肽一起培養(yǎng)18小時(shí)的PBMC)進(jìn)行過分雜交。用RNA酶消化游離探針和其它單鏈RNA分子，而保護(hù)退火的探針靶RNA雙鏈體，使其免受RNA酶消化。純化這些余下的RNA酶保護(hù)的探針，根據(jù)它們的大小在變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離，并且放射自顯影術(shù)進(jìn)行成像。然后，以保護(hù)的探針片段區(qū)帶適當(dāng)大小所給出的信號(hào)強(qiáng)度為基礎(chǔ)，可以在原RNA樣品中確定每個(gè)mRNA物種的特性和數(shù)量。在原樣品中為了確定和定量RNA分子，滲入非保護(hù)的探針組和持家(housekeeping)基因轉(zhuǎn)錄物探針。此外，對(duì)于其它特性，參見Hot-Lines(PharMingen)，第3卷，第1期，第1頁，1997或者PharMingen RiboQuaniTM多探針RNA酶保護(hù)測定系統(tǒng)，使用手冊(cè)，第四版，1997,8。
利用RNA分離的單步方法通過AGPC抽提獲得總RNA(Chomczynski34等，1987，分析生物化學(xué)，162:156-159)。
為了測定LALF肽制劑中內(nèi)毒素污染，表6顯示LALF肽制劑不含有內(nèi)毒素污染物。
如圖8所顯示的，該肽在人PBMC中能夠優(yōu)選地誘導(dǎo)IFN-γ,IL-2和IL-13基因表達(dá)。IFN-γ的表達(dá)和隨后釋放可能是負(fù)責(zé)來自與該肽一起培養(yǎng)的PBMC的上清液觀察到的抗病毒性質(zhì)。此外，這種典型的Th-1應(yīng)答(其特征在于產(chǎn)生IL-2和IFN-γ)在小鼠中P.aeruginosa感染期間可以校正該肽的保護(hù)作用。因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道，在大鼠慢性P.aeruginosa感染中IFN-γ降低了炎癥反應(yīng)(H.K.Johansen 35,H.P.Hougen,J.Rygaard和N.Hoiby.臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)，1996,103:212-218)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用IFN-γ治療影響細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)，并且抗隱球菌病(Joly 36 V,Saint-Julien L,Carbon C,Yeni P,傳染病雜志，1994；170:1331-4)、弓形蟲微生子(Benedetto37N,AuriaultC,Darcy F等，Eur Cytokine Net,1991；2:107-14)和肺炎克氏桿菌(Hagen36TLM,Vianen von W,Bakker-Woudenberg IAJM.傳染病雜志，1995；171:385-92)已體內(nèi)說明治療潛能。我們?cè)谶@里顯示，LALF-衍生的肽能夠產(chǎn)生免疫系統(tǒng)增強(qiáng)作用，并且也可以用于預(yù)防或治療由廣譜病原體引起的傳染病。此外，可以用于免疫系統(tǒng)低下的患者。
統(tǒng)計(jì)方法。將圖和表中所有的值以平均值±SD表示。
通過用Kruskal Wallls試驗(yàn)完成統(tǒng)計(jì)分析，通過Dunn試驗(yàn)確定各組間的不同。將低于0.05的P值假定為是顯著的，BRIEF


圖1顯示用于限定本文所公開的活性的肽LALF的序列。
圖2顯示LALF肽的RP-HPLC層析純化。峰A:98％純度的肽的洗脫峰。
圖3顯示血清TNF水平隨時(shí)間的變化，從靜脈輸注鹽溶液或者50μg的LALF肽的小鼠取得。
圖4在LALF-衍生肽處理的小鼠與對(duì)照小鼠中TNF的全身水平的比較。給8周齡小鼠i.p.注射0.1ml鹽水(含14μg肽或者僅有鹽水)。二十小時(shí)后，給小鼠i.p.注射致死劑量的P.aeruginosa。在攻擊0、20、40、60、90、120、180和240min后，小鼠從后眼窩竇放血，并且測量TNF的血清濃度。
圖5顯示LALF肽在細(xì)胞系MDBK上的抗病毒性質(zhì)。在18小時(shí)期間用增加量的肽處理細(xì)胞。然后，將細(xì)胞用牛腸道病毒攻擊。將抗病毒活性表示為α-IFN的U/ml。
圖6在受刺激的腹膜巨噬細(xì)胞中LALF衍生肽對(duì)TNF-α產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用。在18小時(shí)期間用5μM的LALF預(yù)處理巨噬細(xì)胞處理，然后用1μg大腸桿菌LPS將細(xì)胞活化。在不同的時(shí)間測量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α。
圖7在受刺激的腹膜巨噬細(xì)胞中LALF衍生肽對(duì)NO產(chǎn)生的調(diào)作用。在18小時(shí)期間用5μM的LALF處理該巨噬細(xì)胞，然后用1μg大腸桿菌LPS將細(xì)胞活化72h。利用Greiss方法，在細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中測量NO的水平。
圖8用hck-1探針模板組(Cat.No.45031P)通過PharMingens RiboQuant多探針核糖核酸酶保護(hù)性測定系統(tǒng)，分析用5μM肽刺激18小時(shí)的人類PBMC的總RNA樣品的不同mRNA物種。這種分析的放射自顯影圖顯示作為未保護(hù)的探針組的hck-1(泳道1)。也顯示與下列雜交的對(duì)應(yīng)的RNA酶保護(hù)的探針從非刺激的PBMC分離總RNA(泳道2)和從在18小時(shí)期間用5μM的LALF刺激的PBMC分離的總RNA(泳道3)。參考文獻(xiàn)1．Morrison和Ulevitch，美國病理學(xué)雜志，93:527(1978)。
2．Bone，世界醫(yī)學(xué)年報(bào)，115:457(1991)。
3．Helene等，感染和免疫學(xué)，62:1185(1994)。
4．Schumann等，科學(xué)，249:1429(1990)5．Wright等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，170:1231(1989)。
6．Wright等，科學(xué)，249:1431(1990)。
7．Wright等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，173:1281(1991)。
8．Worthen等，臨床研究雜志20:2526(1992)。
9．Gauano-Santorb,WO 95/00641。
10．Wainwright等，WO 92/20715。
11．Warren等；感染免疫學(xué)，60:2506-2513(1992)。
12．Hoess等，WO 95/05393。
13．Hoess等，The Embo Journal.12:3351-3356(1993)。
14．Randow等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，181:1887-1892(1995)。
15．Famillietti等，酶學(xué)方法，78:387-396(1981)。
16．Ferrero等，Biotecnologia Aplicada,1(1991)。
17．Sheila等，傳染和免疫學(xué)，63:601-608(1995)。
18．Browder等，外科學(xué)，102:206-214(1987)。
19．Berger等，內(nèi)毒素研究雜志，4:17-24(1997)。
20．Berger等，臨床醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，239:121-130(1995)。
21．Capodici C.,Weiss J.免疫學(xué)雜志，156(12):4789-96(1996)。
22．Taylor AH.,Heavner G.,Nedelman M.等，生物化學(xué)雜志，270(30):17934-8(1995)。
23．GarciaC.,Saladino R.,ThompsonC.等Grit.Care.Med.22(8):1211-8(1994)。
24．Banafaraono R.J.,Dahlberg PS.,Ratz C.A.等，外科學(xué)，118(2):318-24(1995)。
25．Fletcher M.A.,Klaczewiak M.A.,傳染病雜志，175(3):621-32(1997)。
26．Ried C.,Wahl C.,Miethke T.等，生物化學(xué)雜志，271(45):28120-7(1996)。
27．Kloczewlak M.,Black K.,M.,Loiselle P.等，傳染病雜志，170(6):1490-7(1994)。
28．Green LC.,Wagner DA.,Glogowski,J.等，生物化學(xué)學(xué)報(bào)，126:131-8(1982)。
29．Jin,F.,Nathan,C,Radzioch,D,和Ding A.細(xì)胞，88:417-428(1997)。
30．Szabo,C,Mitchell,JA,Gross,SS,Thiemermann,C,和Van,JR.J.Pharm.Exp.Therap.,1992,265:674-80)31．Roth RI.Su DH.Child AH.Wainwright NR.和Levin J.傳染病雜志，177(2):388-394,1998。
32．Gilman,M.分子生物學(xué)現(xiàn)代方案，J.Wiley和Sons，紐約P.4.7.1-4.7.8.1988。
33．Dent,A.L.,Shaffer,A.L.,Yu X.,Allman,D.,Staudt,L.M.,1997。
34．Chomczynski等，1987，分析生物化學(xué)，162:156-159。
35．H.K.Johansen,H.P.Hougen,J.Rygaard和N.Hoiby，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)1996,103:212-218,36。
36．VJoly,Saint-Julien L,Carbon C,Yeni P.傳染病雜志1994；170:1331-4。
37．Benedetto N,Auriault C,Darcy F.等，Eur Cytokine Net,1991；2:107-14。
38．Hagen TLM,Vianen von W,Bakker-Woudenberg IAJM.傳染病雜志，1995；171:385-92。
權(quán)利要求
1．一種肽或蛋白質(zhì)的免疫學(xué)活性，該肽或蛋白質(zhì)包含鱟(Limuluspolyphemus)抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸，其特征在于在體內(nèi)和體外增加人或動(dòng)物宿主的抗病毒防衛(wèi)機(jī)制。
2．按照權(quán)利要求1的包含鱟抗LPS蛋白質(zhì)因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽或蛋白質(zhì)的抗病毒活性，其特征在于在人或動(dòng)物中阻止或避免病毒感染。
3．一種具有按照權(quán)利要求1和2的抗病毒性質(zhì)或特征的藥物制劑，其特征在于包含具有鱟抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
4．一種具有按照權(quán)利要求1,2和3的抗病毒性質(zhì)或特征的藥物制劑，其特征在于包含具有在人或動(dòng)物中利用的鱟抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
5．一種用于預(yù)防或治療病毒感染的方法，其特征在于給人或動(dòng)物施用按照權(quán)利要求3和4的藥物制劑。
6．按照權(quán)利要求5的方法，其中所說的人或動(dòng)物由于重要的外科手術(shù)而處于病毒感染風(fēng)險(xiǎn)中。
7．按照權(quán)利要求5的方法，其中所說的人或動(dòng)物是免疫抑制的并且處于病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)中。
8．一種產(chǎn)生具有按照權(quán)利要求1,2和3的抗病毒特征或性質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物或衍生物的上清液的方法，其特征在于施用包含具有鱟抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽或蛋白質(zhì)或者分離的肽或蛋白質(zhì)的制劑。
9．按照權(quán)利要求8的藥物制劑，其特征在于包含具有抗病毒特征或性質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物或其衍生物的上清液。
10．一種按照權(quán)利要求8和9的在人或動(dòng)物中用于預(yù)防或治療病毒感染的方法，其特征在于施用包含具有抗病毒特征或性質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物或其衍生物的上清液的藥物組合物。
11．按照權(quán)利要求1,2或3之任一的肽或蛋白質(zhì)，其中的主鏈已經(jīng)由類似主鏈的有機(jī)實(shí)體取代。
12．按照權(quán)利要求4,5或6之任一的肽或蛋白質(zhì)，其中的主鏈已經(jīng)由類似主鏈的有機(jī)實(shí)體取代。
13．按照權(quán)利要求7,8或9之任一的肽或蛋白質(zhì)，其中的主鏈已經(jīng)由類似主鏈的有機(jī)實(shí)體取代。
14．按照權(quán)利要求1,2,3或4之任一的線型多肽。
15．按照權(quán)利要求5,6或7之任一的線型多肽。
16．按照權(quán)利要求8,9或10之任一的線型多肽。
17．一種具有如權(quán)利要求1,2,3或4所描述的活性的重組載體，該載體包含編碼肽LALF31-52的DNA序列。
18．一種具有如權(quán)利要求5,6或7所描述的活性的重組載體，該載體包含編碼肽LALF31-52的DNA序列。
19．一種具有如權(quán)利要求8,9或10所描述的活性的重組載體，該載體包含編碼肽LALF31-52的DNA序列。
20．按照權(quán)利要求1的藥物組合物在用于治療慢性感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性紊亂的方法中的用途。
21．按照權(quán)利要求8或9的藥物組合物在用于治療慢性感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性紊亂的中的用途。
22．按照權(quán)利要求1,2,3或4的藥物組合物在病毒疫苗中作為佐劑的用途。
23．按照權(quán)利要求5,6或7的藥物組合物在病毒疫苗中作為佐劑的用途。
24．按照權(quán)利要求8,9或10的藥物組合物在病毒疫苗中作為佐劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自鱟屬(Limulus)抗LPS因子蛋白質(zhì)之肽的新免疫學(xué)作用。該免疫學(xué)作用是:(1)在Hep－2和MDBK細(xì)胞系中誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài),(2)借助IFN－γ,來自用肽鱟屬抗LPS因子(LALF)刺激的人單核細(xì)胞上清液能夠誘導(dǎo)Hep－2細(xì)胞系的抗病毒作用,(3)LALF肽能夠在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。本發(fā)明可以用于人類與動(dòng)物的治療性和/或預(yù)防性治療,以提高它們的免疫應(yīng)答,而不刺激某些生化調(diào)節(jié)物(例如TNF－α)的產(chǎn)生,所說的調(diào)節(jié)物可以導(dǎo)致有害作用,如發(fā)熱和發(fā)炎。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1218057SQ98124538
公開日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1998年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者馬里韋爾·格雷拉·巴列斯皮, 曼努埃爾·德赫蘇斯·阿拉納·羅塞恩斯 申請(qǐng)人:遺傳和生物技術(shù)工程中心