專利名稱：含有具有rgd氨基酸序列的肽表面涂層的骨替代材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于含有具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂層的多孔聚合材料的骨替代材料。
骨替代材料指由于疾病或意外傷害引起的外科手術(shù)后的損傷而被用作替代或再構(gòu)成骨結(jié)構(gòu)的植入物的材料?？商峒暗膶?shí)例為成形植入物，如各種類型的骨修補(bǔ)物、例如髓狀爪、骨螺旋和骨合成板形式的骨連接部件、用于填充骨松質(zhì)缺乏或拔牙后留下的洞以及用于上頜面區(qū)的外形缺陷的整形外科治療中的植入物材料。
被認(rèn)為尤其可用于摻合過(guò)程的植入物材料為具有高生物活性的那些，即被身體接受并整合進(jìn)去的那些。在骨替代材料的情況下，這指與內(nèi)源組織，尤其是與骨的牢固永久性粘著不久即應(yīng)發(fā)生。
業(yè)已知至今最有利的摻入結(jié)果是實(shí)際上僅使用內(nèi)源材料而獲得，也就是說(shuō)使用骨移植物。骨移植物的可獲得性受其性質(zhì)的限制。如果實(shí)際上其能以適宜形狀和數(shù)量獲得，自身移植物，也就是說(shuō)來(lái)自相同個(gè)體的移植物，僅可通過(guò)至少另外一項(xiàng)外科手術(shù)來(lái)取得，這本身在取出部位導(dǎo)致另外的愈合過(guò)程。這原則上也適用于同種移植物，也就是說(shuō)來(lái)自同種供體的移植物。在后一種情況下，還存在仍不能完全排除的相容性甚至被病毒，尤其是如肝炎和HIV病毒感染的危險(xiǎn)的問(wèn)題。而且，捐獻(xiàn)材料在骨庫(kù)中的儲(chǔ)存非常昂貴，并且在最終分析中僅局限于一定的時(shí)間內(nèi)。
取決于它們的性質(zhì)和組成，由與身體無(wú)關(guān)的合成材料或與身體有關(guān)的材料制成的用于骨替代的植入物材料可能顯示從生物惰性至生物活性范圍的特點(diǎn)。然而，目前通過(guò)任何合成植入物材料都沒(méi)有獲得摻入內(nèi)源骨移植物的結(jié)果。
最近的發(fā)現(xiàn)表明植入物材料摻入骨中之前必須進(jìn)行表面的細(xì)胞集群。這之后是胞外基質(zhì)的沉積和新的骨組織的形成。整個(gè)過(guò)程是多因素的，并相當(dāng)大地受骨替代材料的性質(zhì)，基層骨的活力和生物力學(xué)環(huán)境的影響。
業(yè)已知磷酸鈣陶瓷、含有羥基磷灰石的骨粘合劑和尤其是特征在于親水性表面的特定聚合物具有好或非常好的骨傳導(dǎo)性質(zhì)。然而，這些材料良好的骨傳導(dǎo)性質(zhì)通常不能與優(yōu)化的生物力學(xué)性質(zhì)相結(jié)合，以致陶瓷特別脆，并具有低的對(duì)骨的彈性要求的適應(yīng)性。
隨著整合素(細(xì)胞膜中的蛋白)的發(fā)現(xiàn)而找到了刺激細(xì)胞粘著于表面的可能性。整合素識(shí)別結(jié)構(gòu)蛋白中的例如RGD序列的氨基酸序列并與其結(jié)合。這控制著體內(nèi)細(xì)胞的粘著。
業(yè)已知為了加快植入物的摻入，對(duì)植入物表面提供可合成獲得的具有RGD序列的肽。目前公開的植入物幾乎均為金屬修補(bǔ)物，尤其是由鈦或鈦合金制成。然而，仍不能獲得具有可能接近摻入內(nèi)源骨移植物的結(jié)果的具有說(shuō)服力的這種類型的植入物。
因此，本發(fā)明基于提供不僅能產(chǎn)生細(xì)胞粘著，而且能被較快地整合到骨中，從而具有盡可能接近內(nèi)源骨移植物的生物活性的骨替代材料這一難題。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這通過(guò)一種骨替代材料而得以實(shí)現(xiàn)，其中骨替代材料基本上由含有具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂層的多孔聚合物材料組成。
業(yè)已知對(duì)植入物表面提供合成可獲得的具有RGD序列的肽。目前公開和試驗(yàn)的植入物幾乎均為金屬修補(bǔ)物，尤其是由鈦或鈦合金制成的。另外還已知(例如從WO 91-05036)用尤其是可能也具有RGD序列的肽處理表面，如聚合物、金屬或還有陶瓷材料的表面。然而，在這種情況下，這些肽為特異性地共價(jià)結(jié)合。所述表面被適當(dāng)?shù)赜梅磻?yīng)基活化，并使用偶聯(lián)劑與肽反應(yīng)，其中肽為共價(jià)結(jié)合。然而，它不包含將導(dǎo)致根據(jù)本發(fā)明的被填充有(也就是說(shuō)沒(méi)有特定的共價(jià)鍵的形成)刺激植入物表面細(xì)胞粘著的肽的多孔聚合骨替代材料的線索。
因此，本發(fā)明涉及基于含有具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂層的多孔聚合材料的骨替代材料。
本發(fā)明尤其涉及為成形植入物形式的這種類型的骨替代材料。
本發(fā)明還涉及由兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立成分組成的植入試劑盒，其中一種成分包含根據(jù)本發(fā)明的骨替代材料，另一種成分包含具有RGD氨基酸序列的肽的液體制備物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有RGD氨基酸序列的肽在填充用于骨替代的多孔和/或表面具有網(wǎng)紋的聚合材料表面，從而通過(guò)刺激細(xì)胞與該表面的粘著進(jìn)行生物活化中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種通過(guò)刺激細(xì)胞與其表面粘著來(lái)生物活化基于多孔聚合材料的骨替代材料的方法，其特征在于該表面被涂覆有具有RGD氨基酸序列的肽的液體制備物。
聚合材料代表另外的為低生物相容性的材料，雖然其機(jī)械性質(zhì)可適宜于骨的性質(zhì)，但目前它們未被采用作為骨替代物，因?yàn)樗鼈儾慌c骨結(jié)合在一起。
本發(fā)明現(xiàn)在所涉及的是通過(guò)填充RGD肽來(lái)優(yōu)化由于機(jī)械原因而非?？赏鳛楣翘娲锏倪@種低生物相容性的聚合材料，并獲得生物相容性。
本文優(yōu)選的多孔聚合材料基本上為聚丙烯酸酯和/或聚甲基丙烯酸酯、聚甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和/或聚四氟乙烯(PTFE)。當(dāng)然還可以采用所述聚合物相互之間的共聚物和這些聚合物與其它聚合物的共聚物。技術(shù)人員通常已知這些類型的聚合材料的制備，而不需要在這里詳細(xì)描述。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的骨替代材料中，多孔聚合材料本身為成形植入物形式，或在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，它形成成形植入物的表面或表面涂層。
根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選的成形制品為具有部分或完全互連的孔系統(tǒng)的那些?？梢岳珙愃朴趯＠暾?qǐng)?zhí)朎P0705609中描述的方法來(lái)制備具有這種孔系統(tǒng)的聚合物。然而，技術(shù)人員另外還熟知制備多孔聚合材料的一般方法，因此在這里不需要對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步的描述。此外，這種類型的材料還可從市場(chǎng)上購(gòu)得。技術(shù)人員熟知它們的組成和加工它們的方法。
在本文中還優(yōu)選的是尤其是為顆?；蚶w維形式的聚合物和無(wú)機(jī)物或金屬添加劑的聚合物或組合物。
如果聚合材料本身為多孔植入物形式，它可通過(guò)例如上述EP0705609中描述的方法，通過(guò)聚甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)的點(diǎn)熔結(jié)來(lái)制備。該方法基本上通過(guò)將三種不同的成分混合在一起來(lái)進(jìn)行。其第一種成分為由丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的細(xì)粒聚合物(這些聚合物從市場(chǎng)上可購(gòu)得)組成的固體成分，適宜時(shí)還含有其它添加劑，如聚合作用催化劑、X-射線對(duì)比介質(zhì)、填料和染料。第二種成分為由丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯單體組成的液體成分，適宜時(shí)還含有添加劑，如聚合作用促進(jìn)劑和穩(wěn)定劑。第三種成分由最大粒徑為0.5-10mm的生物相容性材料的粗粒子顆粒組成。優(yōu)選的材料基于聚丙烯酸和/或聚甲基丙烯酸、聚烯烴、丙烯酸與苯乙烯和/或丁二烯的共聚物以及環(huán)氧樹脂。將三種主要成分混合在一起。在將成分完全混合后，由于存在的催化劑聚合作用開始；組合物仍為液體或能在幾分鐘時(shí)間內(nèi)發(fā)生塑性形變，此后出現(xiàn)凝固的終產(chǎn)物。因此，以這種方式可從優(yōu)選具有內(nèi)連多孔的骨粘合劑顆粒制備多孔植入物。接著根據(jù)本發(fā)明將這些材料用含有RGD的肽填充。在液體或塑性階段，該多孔骨替代材料可以常規(guī)方式使用作為用于移植骨修補(bǔ)物的骨粘合劑。外科醫(yī)生還能將組合物轉(zhuǎn)化為任何形狀和大小的成形部件，并且在凝固后植入它們用于骨損傷的重構(gòu)或作為局部活性物質(zhì)沉積至待處理的身體區(qū)域。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，多孔聚合材料具有0.05-2.50mm的平均孔寬度，尤其優(yōu)選0.10-1.25mm。
因此，根據(jù)本發(fā)明，成形植入物的表面具有多孔形狀是必需的，其中該形狀可通過(guò)例如提供具有多孔表面涂層或相應(yīng)的粗糙表面的復(fù)合材料或骨粘合劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
如果多孔聚合材料形成成形植入物的表面或表面涂層，它們可由所有已知的常規(guī)植入材料組成，只要它們可被一層多孔聚合物層涂覆?？蓪⒅踩氩牧戏殖梢韵碌念愋蜔o(wú)機(jī)物，尤其是陶瓷材料、生理上可接受的金屬材料、生理上可接受的聚合物材料和所述兩種或多種類型材料的復(fù)合材料。
適宜的無(wú)機(jī)物材料的實(shí)例為基于含鈣物質(zhì)的材料，尤其如碳酸鈣、磷酸鈣和由這些化合物產(chǎn)生的系統(tǒng)。被提及優(yōu)于磷酸鈣的為羥基磷灰石、磷酸三鈣和磷酸四鈣。
然而，只有當(dāng)它們被采用作為陶瓷時(shí)，也就是說(shuō)為在足夠高的溫度下燒結(jié)的材料或加工件的形式時(shí)，基于無(wú)機(jī)物的植入物材料通常才能確保高的機(jī)械穩(wěn)定性。
可在例如專利文件DE3727606，DE3903695，DE4100897和DE4028683中找到關(guān)于骨陶瓷和制備它們的尤其有利的方法的詳細(xì)說(shuō)明。
采用的金屬材料主要為鈦或鈦合金。還尤其感興趣的是其機(jī)械性質(zhì)比純聚合物覆蓋顯著更寬范圍的混合材料。因此，除開使用RGD肽涂覆的聚合物作為骨替代物外，這種類型的材料與其它植入物成分的結(jié)合也是非常重要的。
可提及的這種結(jié)合的實(shí)例為將金屬修補(bǔ)物(例如鈦)與根據(jù)本發(fā)明處理的多孔聚合物混合。為此目的，例如將鈦植入物以本質(zhì)上已知的方式處理以用于與聚合物的混合。這可通過(guò)例如Kevloc方法或Sulicoater方法(描述在DE4225106中)來(lái)進(jìn)行。接著以例如類似于EP0705609中描述的方式將多孔聚合物層加至預(yù)處理的鈦表面。隨后將修補(bǔ)物的聚合物涂覆的部分用RGD肽涂覆。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案由下面的植入材料處理來(lái)代表。代替鈦植入物，將由纖維狀的復(fù)合材料(碳纖維和環(huán)氧樹脂)制成的相應(yīng)的植入物用例如PMMA的多孔層涂覆，此后進(jìn)行肽的涂覆。這種類型的植入具有這一優(yōu)點(diǎn)即適合于骨的彈性，產(chǎn)生無(wú)邊界層的骨植入物界面以及實(shí)現(xiàn)從植入物至骨的最佳力的轉(zhuǎn)移。
臨床上，這避免通過(guò)應(yīng)力保護(hù)的骨吸收，并且修補(bǔ)物被保持更長(zhǎng)的時(shí)間。
加到適宜的植入材料的多孔聚合物層優(yōu)選具有0.2mm-25mm的層厚度，尤其優(yōu)選2.0mm-20mm。
平均孔寬度優(yōu)選為0.05mm-2.50mm，尤其優(yōu)選0.10mm-1.25mm的范圍。
根據(jù)本發(fā)明可采用的具有RGD序列的適宜肽為包含氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的所有肽和具有非肽取代基的它們的化合物，它們能借助于肽和非肽取代基粘著于聚合物表面。
下面列出的優(yōu)選的肽和肽化合物旨在僅作為例證，而不限制其特征，其中使用下面縮寫Asp＝天冬氨酸Gly＝甘氨酸Arg＝精氨酸Tyr＝酪氨酸Ser＝絲氨酸Phe＝苯丙氨酸RGD(Arg-Gly-Asp)、GRGD(Gly-Arg-Gly-Asp)、GRGDY(Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr)、RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)、GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser)、RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe)、GRGDF(Gly-Arg-Gly-Asp-Phe)以及具有脂肪酸的肽化合物或其它丙烯酸取代的RGD肽。肽可為線性或環(huán)狀。
用具有RGD序列的肽化合物或肽涂覆根據(jù)本發(fā)明的骨替代材料本質(zhì)上并不困難。優(yōu)選從適宜肽的適宜液體溶液開始，將要填充的物質(zhì)浸入其中。本文可顯示植入物表面的最終涂覆在一個(gè)寬的范圍內(nèi)相對(duì)獨(dú)立于溶液的濃度。可使用極低濃度通過(guò)適當(dāng)延長(zhǎng)暴露時(shí)間獲得完全的表面填充。
肽溶液的優(yōu)選濃度范圍可為10ng-100ug/ml。暴露時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至24小時(shí)。
具有肽的表面涂層優(yōu)選占自由表面的50％-100％。
而且，不用進(jìn)一步處理，肽物質(zhì)與聚合物表面緊密粘著。用常規(guī)方法，例如通過(guò)γ照射、加熱或環(huán)氧乙烷消毒植入物，接著準(zhǔn)備用于植入。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的骨替代材料為即時(shí)可用的由兩種或多種單獨(dú)的成分組成的植入試劑盒的形式，其中一種成分包含多孔聚合材料，優(yōu)選為成形植入物，另一種成分包括具有RGD序列的肽的液體制備物。這種類型的具體實(shí)施方案尤其有利于有效消除在長(zhǎng)期貯存根據(jù)本發(fā)明制成的骨替代材料中可能產(chǎn)生的穩(wěn)定性問(wèn)題。通過(guò)在外科手術(shù)之前立即或期間，以指定的方式用含有RGD肽的溶液填充多孔聚合植入材料來(lái)使用根據(jù)本發(fā)明的這類植入試劑盒形式的骨替代材料。
因此，根據(jù)具體實(shí)施方案，本發(fā)明的骨替代材料代表同種或自身骨移植的至少等同的替代物，或在對(duì)于其它類型的骨替代的摻入性質(zhì)方面顯著的改善。
由于具有RGD序列的肽在多孔聚合植入物中的固定，根據(jù)本發(fā)明的骨替代材料不僅產(chǎn)生細(xì)胞粘著，而且還可通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨中的這些植入材料的整合比未處理的植入物明顯進(jìn)行得更快。
如已描述的，RGD涂層對(duì)用于骨替代的植入物的摻入性質(zhì)的有利影響可適用于事實(shí)上所有類型的骨替代材料和植入物材料，只要它們具有全部或部分由多孔聚合材料組成，或植入物被這種多孔聚合層涂覆的性質(zhì)或設(shè)計(jì)。該要求還通過(guò)例如其表面具有多孔結(jié)構(gòu)或至少粗糙的植入物來(lái)滿足。
取決于摻入部位的要求和使用目的，根據(jù)本發(fā)明的骨替代材料原則上可不僅為成形植入物形式，而且可為粉末、顆粒、細(xì)粒或纖維形式。
甚至不用進(jìn)一步解釋可設(shè)想技術(shù)人員能在最廣泛的含義上利用上面的描述。因此，優(yōu)選的具體實(shí)施方案被認(rèn)為僅為說(shuō)明性的，而決不限制所公開的內(nèi)容。
下面的實(shí)施例為本發(fā)明的代表性實(shí)例。
所有在上文和下文提到的申請(qǐng)、專利和公開的全部公開內(nèi)容被本申請(qǐng)引作參考。
實(shí)施例1a)多孔聚合成形部件的制備用常規(guī)方法將低粘度的骨粘合劑(組成31g聚甲基甲基丙烯酸酯/聚甲基丙烯酸[sic](94/6)共聚物，6g羥基磷灰石粉末，3g二氧化鋯)與30ml甲基甲基丙烯酸酯單體一起攪拌。成分包括過(guò)氧化二苯甲酰/二甲基對(duì)甲苯胺起動(dòng)系統(tǒng)。將100g純的圓柱形的聚甲基聚丙烯酸顆粒(直徑2mm，長(zhǎng)度3mm)加入到此膏狀物中，并與骨粘合劑膏狀物充分混合。將混合的組合物放入聚丙烯塑模中并讓其凝固約15分鐘。結(jié)果為具有內(nèi)[sic]連孔和孔隙度為20％的部件。
b)用RGD肽填充聚合成形部件將如a)中獲得的成形部件浸入濃度為100ug/ml的四肽GRGD溶液中，暴露時(shí)間約60分鐘以填充該RGD肽，并最終干燥。接著用細(xì)胞粘著試驗(yàn)測(cè)定涂覆的成功率。結(jié)果表明未填充的圓柱體最終未被細(xì)胞集群，而根據(jù)本發(fā)明的材料顯示出擴(kuò)展深入至孔的密集的細(xì)胞集落。
實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)研究種類兔植入物a)多孔PMMA成形部件b)根據(jù)本發(fā)明的涂覆有GRGD的PMMA成形部件通過(guò)γ照射將骨植入物消毒，并植入兔股骨中。
植入部位植入左側(cè)和右側(cè)股骨的髕骨滑動(dòng)軸中。
2周后，用組織學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)新骨形成和礦化。
結(jié)果a)PMMA植入床僅顯示薄的新形成的滲透有結(jié)締組織的小梁骨的圓形環(huán)。沒(méi)有顯示在粘著劑珠上的小梁骨的直接的重疊。
b)PMMA+GRGD在這種情況下可發(fā)現(xiàn)廣泛的新的小梁骨的形成，并覆蓋了四分之三的整個(gè)植入物；在粘合劑珠上小梁骨直接重疊。
權(quán)利要求
1.基于多孔聚合材料的骨替代材料，特征在于它含有具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的骨替代材料，特征在于多孔聚合材料為成形植入物形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的骨替代材料，特征在于多孔聚合材料形成成形植入物的表面或表面涂層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的骨替代材料，特征在于多孔聚合材料形成由無(wú)機(jī)或金屬材料或復(fù)合材料組成的成形植入物的表面或表面涂層。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的骨替代材料，特征在于多孔聚合材料基本上為聚丙烯酸酯和/或聚甲基丙烯酸酯、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯和/或聚四氟乙烯和/或這些聚合物與其它聚合物的共聚物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的骨替代材料，特征在于這些多孔成形部件具有部分或全部?jī)?nèi)連孔系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的骨替代材料，特征在于具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂層占自由表面的50％-100％。
8.由兩種或多種獨(dú)立成分組成的植入試劑盒，其中一種成分包含根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的骨替代材料，另一種成分包含具有RGD氨基酸序列的肽的液體制備物。
9.具有RGD氨基酸序列的肽在填充用于骨替代的多孔和/或表面具有網(wǎng)紋的聚合材料表面中的用途，從而通過(guò)刺激細(xì)胞與該表面的粘著進(jìn)行生物活化。
10.通過(guò)刺激細(xì)胞與其表面粘著來(lái)生物活化基于多孔聚合材料的骨替代材料的方法，其特征在于該表面被具有RGD氨基酸序列的肽的液體制備物涂覆。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于其表面涂覆有具有RGD氨基酸序列的肽的多孔聚合材料的骨替代材料。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1247474SQ98802485
公開日2000年3月15日 申請(qǐng)日期1998年2月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月20日
發(fā)明者B·尼斯 申請(qǐng)人:默克專利股份公司