專利名稱：基于β－連環(huán)蛋白/轉(zhuǎn)錄因子相互作用診斷/治療疾病的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及人類疾病領(lǐng)域，更具體地涉及以影響β-連環(huán)蛋白與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用的物質(zhì)成分的鑒定為基礎(chǔ)，治療和診斷涉及不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病。
一段時(shí)間以來，已知多種癌癥至少部分是由某些被稱為“原癌基因”的正?；虻耐蛔円鸬?。原癌基因參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，目前才逐漸明白其調(diào)節(jié)的方式為分子水平。如果不能及時(shí)地檢測(cè)和治療癌癥，突變的原癌基因或被稱為“癌基因”的致癌基因會(huì)破壞正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致生物體死亡。在正常細(xì)胞或癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中，原癌基因或癌基因分別通過調(diào)節(jié)或試著調(diào)節(jié)正常細(xì)胞或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白來相抗衡。這種蛋白質(zhì)被稱為“腫瘤抑制蛋白”，它包括BRCA1，p53，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(Rb)，腺癌結(jié)腸息肉病蛋白(APC)，Wilm腫瘤1蛋白(WT1)，神經(jīng)纖維瘤1型蛋白(NF1)和神經(jīng)纖維瘤2型蛋白(NF2)。腫瘤抑制蛋白與細(xì)胞中調(diào)節(jié)其活性的其它蛋白質(zhì)的相互作用是生物醫(yī)學(xué)深入研究的領(lǐng)域。
不斷有證據(jù)表明b-連環(huán)蛋白與某些類型的癌癥相關(guān)，并且是非洲爪蟾屬(Xenopus)和果蠅屬(Drosophila)發(fā)育中重要的信號(hào)蛋白(1)。關(guān)于后者，建議的途徑由wnt-1/無翼受體起始，該途徑包括β-連環(huán)蛋白的翻譯后穩(wěn)定化，導(dǎo)致其在胞質(zhì)和核中積累。據(jù)認(rèn)為，b-連環(huán)蛋白在核中與LEF/TCF家族轉(zhuǎn)錄因子相互作用，因此直接調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)(2)。wnt-1原癌基因也使哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中的b-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化，當(dāng)在小鼠乳腺組織中表達(dá)時(shí)還可促進(jìn)腫瘤形成(3)。
當(dāng)在含有缺損APC的結(jié)腸癌細(xì)胞中異位表達(dá)時(shí)，APC腫瘤抑制基因可下調(diào)過量的細(xì)胞內(nèi)b-連環(huán)蛋白，這一觀察結(jié)果支持癌癥中b-連環(huán)蛋白信號(hào)傳遞的潛在作用(4)。b-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)機(jī)制需要蛋白質(zhì)的氨基末端區(qū)域。此序列的缺失，或其中4個(gè)絲氨酸/蘇氨酸殘基的突變導(dǎo)致b-連環(huán)蛋白的積累，因而激活其在信號(hào)傳遞中的作用(5，6，7)。然后，可以想象使b-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化的突變可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生時(shí)失去細(xì)胞生長(zhǎng)控制。目前還不知道這些突變的鑒定，也不知道穩(wěn)定化的β-連環(huán)蛋白如何影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是描述編碼穩(wěn)定化的β-連環(huán)蛋白的分離的相關(guān)核酸序列的家族。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是描述由β-連環(huán)蛋白和某些轉(zhuǎn)錄因子組成的基本上純的蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述復(fù)合物可影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是描述由β-連環(huán)蛋白和某些轉(zhuǎn)錄因子組成的基本上純的蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為L(zhǎng)ef/Tcf家族的轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是描述由β-連環(huán)蛋白和某些轉(zhuǎn)錄因子組成的復(fù)合物，所述轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為L(zhǎng)ef/Tcf家族的轉(zhuǎn)錄因子的Lef，所述復(fù)合物可影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是描述影響β-連環(huán)蛋白與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用的物質(zhì)成分的鑒定方法，所述轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為L(zhǎng)ef/Tcf家族的轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是描述使用影響β-連環(huán)蛋白與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用的物質(zhì)成分來診斷或治療疾病的方法，所述疾病優(yōu)選為涉及不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病，包括癌癥，所述轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為L(zhǎng)ef/Tcf家族的轉(zhuǎn)錄因子。
通過閱讀下列說明書中本發(fā)明各個(gè)方面的描述，本發(fā)明的這些和其它目的對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。下文的圖，詳細(xì)描述和實(shí)施例將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明的上述和其它方面。


圖1.分析黑素瘤細(xì)胞系中的b-連環(huán)蛋白和APC。(A)對(duì)得自所示細(xì)胞系的蛋白質(zhì)-等量的總細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和免疫印跡(13)。水平切下印跡，用抗-APC2(頂端)或抗-b-連環(huán)蛋白(底端)顯色印跡。用125I-A蛋白顯色b-連環(huán)蛋白印跡，每個(gè)泳道下面示出每個(gè)b-連環(huán)蛋白帶的每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)。(B)從蛋白質(zhì)-等量的細(xì)胞裂解物中免疫沉淀APC，通過SDS-PAGE和免疫印跡分析沉淀物中的APC和b-連環(huán)蛋白(13)。左邊的值表示蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的位置和以千道爾頓計(jì)的分子量，NHEM表示正常的新生兒黑素細(xì)胞。所有其它細(xì)胞系得自人黑素瘤(16)。(C)對(duì)得自各個(gè)裂解物的大約800mg的總蛋白質(zhì)進(jìn)行大小排阻層析，通過SDS-PAGE和免疫印跡分析級(jí)分中的b-連環(huán)蛋白。頂端示出總裂解物(L)和柱級(jí)分(FRX.)的數(shù)目，箭頭表示蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的洗脫位置。為具有較低水平的總b-連環(huán)蛋白的細(xì)胞系提供較長(zhǎng)時(shí)間的暴露。
圖2.通過WT APC的異位表達(dá)下調(diào)b-連環(huán)蛋白。用編碼人WT APC的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染928mel和888mel細(xì)胞，48小時(shí)后，固定細(xì)胞，并用抗-APC(左)和抗-b-連環(huán)蛋白(右)共顯色(18)。
圖3.b-連環(huán)蛋白的脈沖追蹤分析。(A)用35S-甲硫氨酸脈沖-標(biāo)記黑素瘤細(xì)胞，在所示時(shí)間內(nèi)用未標(biāo)記的甲硫氨酸追蹤上述細(xì)胞，然后裂解該細(xì)胞(20)。免疫沉淀β-連環(huán)蛋白，通過SDS-PAGE和熒光顯影術(shù)分析該蛋白。在各組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的左邊b-連環(huán)蛋白帶的位置處示出細(xì)胞系，DN表示1088mel細(xì)胞中氨基末端截短形式的b-連環(huán)蛋白的位置。(B)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)野生型b-連環(huán)蛋白(wt)或ser37ala突變體(S37A)的ATT20細(xì)胞系進(jìn)行脈沖追蹤分析(20)。(C)用編碼APC羧基末端(APC3)或中心(APC25)片斷和b-連環(huán)蛋白WT或ser37ala突變體的質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞(20)。APC25下調(diào)b-連環(huán)蛋白，而APC3不下調(diào)b-連環(huán)蛋白(4)。
圖4.LEF1與b-連環(huán)蛋白的共免疫沉淀。從約600mg所示細(xì)胞裂解物的總蛋白質(zhì)中免疫沉淀β-連環(huán)蛋白。通過SDS-PAGE和免疫印跡分析沉淀物中的b-連環(huán)蛋白和LEF1(13)。
本說明書中提及的所有文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)都列入本文作為參考，它們被引用的程度相同，就好象每篇文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和單獨(dú)地列入本文作為參考一樣。
定義一開始就應(yīng)指出，除非另有定義，本文所用的所有科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的含義相同。本文所用的命名和下文所述的實(shí)驗(yàn)室方法是本領(lǐng)域眾所周知的和常用的。重組核酸方法，多核苷酸合成和微生物培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化(如電穿孔，脂轉(zhuǎn)染法)中使用的是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一般根據(jù)廠商的具體說明進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化步驟。一般根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和貫穿本文提供的多種一般性的參考文獻(xiàn)(一般參見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，列入本文作為參考)進(jìn)行技術(shù)和方法。本文所用的命名和下文所述的分析化學(xué)，有機(jī)合成化學(xué)和藥物配制實(shí)驗(yàn)室方法是本領(lǐng)域眾所周知的和常用的?；瘜W(xué)合成，化學(xué)分析，藥物配制和傳遞以及患者的治療使用的是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在描述本發(fā)明β-連環(huán)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子選定的具體實(shí)施方案的式中，盡管經(jīng)常未特別地顯示出氨基和羧基末端基團(tuán)，但應(yīng)理解除非另有特別說明，它們應(yīng)呈現(xiàn)在生理pH值下所采取的形式。因此，應(yīng)理解生理pH下的N末端H2+和C末端O-是存在的，但在具體實(shí)施例或通式中不必特別地指出和顯示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法和常規(guī)，在本文所用的多肽標(biāo)志中，分子的左手端是氨基末端，右手端是羧基末端。當(dāng)然，本發(fā)明的化合物中也包括堿和酸加成鹽，包括那些在非生理pH值下形成的鹽。本文所述的氨基酸殘基優(yōu)選為“L”異構(gòu)形式，20個(gè)常規(guī)氨基酸，非天然氨基酸，如a，a-分布的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸和其它非常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)也是本發(fā)明多肽的適當(dāng)組分，只要多肽能維持所需的功能特性即可。對(duì)于所示的肽而言，適當(dāng)時(shí)每個(gè)編碼的殘基由3個(gè)字母的名稱表示，相當(dāng)于常規(guī)氨基酸的俗名，以與標(biāo)準(zhǔn)的多肽命名保持一致(描述于生物化學(xué)雜志，2433552-59(1969)，37 CFR§1.822(b)(2)中采用)。
也可以通過例如可改變化合物的溶解性而不會(huì)影響其活性的酰胺化，酰化或其它取代來修飾被稱為非干擾取代基的自由官能團(tuán)，包括那些羧基或氨基末端的基團(tuán)。
應(yīng)理解，除非另有說明，貫穿本文所用的下列術(shù)語具有下列含義本文所用術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”指的是來源于eDNA，重組RNA或合成或它們的一些聯(lián)合的蛋白質(zhì)，“分離的蛋白質(zhì)”憑借其來源(1)基本上與天然蛋白質(zhì)不相關(guān)，(2)基本上不含相同來源的其它蛋白質(zhì)，如不含人蛋白質(zhì)，(3)可以由不同種的細(xì)胞表達(dá)，或(4)不會(huì)天然出現(xiàn)。
本文對(duì)某物質(zhì)所用術(shù)語“天然”指的是在自然界中可發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)這一事實(shí)。例如，在可分離自自然界的生物體(包括病毒)中存在的，未在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)人有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。
本文所用術(shù)語“多核苷酸”指的是長(zhǎng)度至少為10個(gè)堿基的聚合物形式的核苷酸，它或者是核糖核苷酸，或者是脫氧核苷酸，或者是任一種核苷酸的經(jīng)修飾形式。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
本文所用術(shù)語“寡核苷酸”包括通過天然和非天然寡核苷酸連鍵連接在一起的天然和經(jīng)修飾的核苷酸。寡核苷酸是長(zhǎng)度為200個(gè)堿基或更少堿基的多核苷酸子集。優(yōu)選寡核苷酸的長(zhǎng)度為10至60個(gè)堿基，最優(yōu)選長(zhǎng)度為12，13，14，15，16，17，18，19或20至40個(gè)堿基。寡核苷酸通常為單鏈，如對(duì)探針而言；但寡核苷酸也可以是雙鏈，如用于構(gòu)建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義的或反義的寡核苷酸。本文所用術(shù)語“天然核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文所用術(shù)語“修飾的核苷酸”包括具有經(jīng)修飾的或取代的糖基等的核苷酸。本文所用術(shù)語“寡核苷酸連鍵”包括如硫代磷酸酯鍵，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)，二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)，phosphoroani lothioate，phosphoraniladate，氨基磷酸酯等寡核苷酸連鍵。必要時(shí)，寡核苷酸可包括檢測(cè)用的標(biāo)記物。
本文所用術(shù)語“序列同源性”描述了兩個(gè)核酸序列之間堿基配對(duì)的比例或兩個(gè)氨基酸序列之間氨基酸配對(duì)的比例。當(dāng)序列同源性以百分比，如50％表示時(shí)，百分比表示與一些其它序列相比，β-連環(huán)蛋白或Lef序列整個(gè)長(zhǎng)度配對(duì)的比例。缺口(兩個(gè)序列中的任一個(gè)中)是允許的，這樣可使配對(duì)最大化；通常使用的缺口長(zhǎng)度為15個(gè)堿基或更少堿基，優(yōu)選使用的長(zhǎng)度為6個(gè)堿基或更少堿基，更優(yōu)選2個(gè)堿基或更少堿基。當(dāng)將寡核苷酸用作探針或用于治療時(shí)，靶核酸和寡核苷酸序列之間的序列同源性一般為20個(gè)可能的寡核苷酸堿基對(duì)配對(duì)中有不少于17個(gè)靶堿基配對(duì)(85％)；優(yōu)選10個(gè)可能的堿基對(duì)配對(duì)中有不少于9個(gè)靶堿基配對(duì)(90％)，最優(yōu)選20個(gè)可能的堿基對(duì)配對(duì)中有不少于19個(gè)靶堿基配對(duì)(95％)。
如果兩個(gè)氨基酸序列之間具有部分或完全的同一性，則它們的序列是同源的。例如，85％的同源性指的是當(dāng)排列兩個(gè)序列以最大程度地配對(duì)時(shí)，85％的氨基酸相同。缺口(配對(duì)的兩個(gè)序列中的任一個(gè)中)是允許的，這樣可使配對(duì)最大化；優(yōu)選缺口長(zhǎng)度為5個(gè)或更少堿基，更優(yōu)選為2個(gè)或更少堿基?？商娲睾蛢?yōu)選地，由于同源這一術(shù)語已在本文中使用，如果使用具有突變數(shù)據(jù)基元的程序ALIGN，測(cè)得排列評(píng)分大于5(標(biāo)準(zhǔn)偏差單位)，缺口罰分為6或更高，則兩個(gè)蛋白質(zhì)序列(或衍生自蛋白質(zhì)序列的長(zhǎng)度至少為30個(gè)氨基酸的多肽序列)是同源的。見Dayhoff.M.O.，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖表集，1972，第5卷，國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，p101-110和此卷的增刊2，p1-10。當(dāng)使用ALIGN程序最佳排列時(shí)，如果兩個(gè)氨基酸序列或其部分的氨基酸大于或等于50％相同，這兩個(gè)序列或其部分則更優(yōu)選是同源的。
本文所用“基本上純的”指的是所需的物質(zhì)種類是存在的占優(yōu)勢(shì)的種類(即在分子基礎(chǔ)上，它比組合物中任何其它大分子的單個(gè)種類更豐富)，優(yōu)選基本上純的組分是其中所需物質(zhì)種類占存在的所有大分子種類的至少約50％(在分子基礎(chǔ)上)的成分。一般而言，基本上純的成分占組合物中存在的所有大分子種類的大約80％以上，更優(yōu)選約85％，90％，95％和99％以上。最優(yōu)選所需物質(zhì)種類被純化至實(shí)質(zhì)上為均質(zhì)(通過常規(guī)檢測(cè)法不能檢測(cè)出成分中雜質(zhì))，其中成分實(shí)質(zhì)上由單個(gè)大分子種類組成。
術(shù)語“穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白”指的是包括下文所述和討論的那些物質(zhì)成分。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在很多場(chǎng)合下，當(dāng)提及“穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白”時(shí)，特別是在檢測(cè)形式的上下文中，野生型β-連環(huán)蛋白可被取代。實(shí)際上，在大多數(shù)的為鑒定影響b-連環(huán)蛋白/Lef復(fù)合物或其形成的物質(zhì)成分的b-連環(huán)蛋白/Lef檢測(cè)中，野生型β-連環(huán)蛋白可取代“穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白”。
根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)用法使用本文的化學(xué)術(shù)語，例如可參見McGraw-Hill化學(xué)術(shù)語詞典(Parker，S編，1985)，McGraw-Hill，SanFrancisco(列入本文作為參考)。
通過基因工程由克隆的基因生產(chǎn)蛋白質(zhì)是眾所周知的，例見Bell等人的美國(guó)專利4,761,371，第6欄第3行至第9欄第65行(本文提及的所有專利文獻(xiàn)的內(nèi)容都列入本文作為參考)。因此，下列討論只是對(duì)此領(lǐng)域的總的看法，而不想反映本領(lǐng)域的全貌。
當(dāng)DNA區(qū)域在功能上互相相關(guān)時(shí)，將它們可操作地相連。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，即將它與編碼序列可操作地相連；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的定位允許進(jìn)行翻譯，即將它與編碼序列可操作地相連。一般而言，可操作相連意味著鄰接的，和在前導(dǎo)序列的情況下為鄰接的和在閱讀框內(nèi)的。
適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括原核細(xì)胞，酵母細(xì)胞或較高等的真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌(E.coli)或芽孢桿菌。較高等的真核細(xì)胞包括下文所述的已確立的哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞系。例舉的宿主細(xì)胞是DH5α，大腸桿菌W3110(ATCC 27，325)，大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATCC31，537)和大腸桿菌294(ATCC31，446)。假單胞菌的種，芽孢桿菌的種和粘質(zhì)沙雷氏菌也是合適的。
在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)可用作表達(dá)外源基因的載體(例見Smith等，1983，病毒學(xué)雜志，46584；Smith，美國(guó)專利4,215,051)。Sf9昆蟲細(xì)胞可被表達(dá)經(jīng)glu-glu表位標(biāo)記的β-連環(huán)蛋白構(gòu)建體的桿狀病毒載體感染，例見Rubinfeld等，生物化學(xué)雜志，第270卷，第10期，p5549-5555(1995)。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它表位標(biāo)記物，包括6×組氨酸標(biāo)記物，myc或EE-標(biāo)記物(即Glu-Glu-標(biāo)記物)?！癊”指的是氨基酸谷氨酰胺。
大量適當(dāng)?shù)奈⑸镙d體也是適用的。微生物載體一般含有可被預(yù)期宿主識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)，在宿主中起作用的啟動(dòng)子和表型選擇基因，如編碼賦予抗生素抗性或提供自養(yǎng)需求的蛋白質(zhì)的基因。可為其它宿主制備類似的構(gòu)建體。一般使用pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌，例見Bolivar等，基因，295(1977)。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因此提供了鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法。表達(dá)載體應(yīng)含有被宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子。這一般意味著啟動(dòng)子得自預(yù)期的宿主。最常用于重組微生物表達(dá)載體的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等，自然，275615(1978)；和Goeddel等，核酸研究，84057(1980)和EPO申請(qǐng)公開號(hào)36,776)和tac啟動(dòng)子(H.De Boer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，21(1983))。盡管這些啟動(dòng)子是常用的，但其它微生物啟動(dòng)子也是適用的。很多啟動(dòng)子核苷酸序列的有關(guān)細(xì)節(jié)已經(jīng)公開，使得熟練技術(shù)人員可將它們與編碼β-連環(huán)蛋白的DNA可操作地連接于質(zhì)粒或病毒載體中(Siebenlist等，細(xì)胞，20269，1980)。啟動(dòng)子與Shine-Dalgarno(SD)序列(用于原核宿主表達(dá))與編碼β-連環(huán)蛋白的DNA可操作地連接，即它們的定位可促進(jìn)β-連環(huán)蛋白DNA轉(zhuǎn)錄為信使RNA。據(jù)認(rèn)為通過SD序列與大腸桿菌16SrRNA3’末端之間的堿基配對(duì)，SD序列可促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合(Steitz等(1979)，生物調(diào)節(jié)和發(fā)育基因表達(dá)(R.F.Goldberger編))。為了表達(dá)具有弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的真核基因和原核基因，可參見Sambrook等(1989)，“克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)”，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。另外，細(xì)菌啟動(dòng)子可包括非細(xì)菌來源的天然啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力。非細(xì)菌來源的天然啟動(dòng)子也可以與相容的RNA聚合酶偶聯(lián)以在原核生物中高水平表達(dá)一些基因。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)是一例偶聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Studier等(1986)，分子生物學(xué)雜志，189113；Tabor等(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.821074)。另外，雜合的啟動(dòng)子也可以由噬菌體啟動(dòng)子和大腸桿菌操縱基因區(qū)域組成(EPO公開號(hào)267,851)。
可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定化的β-連環(huán)蛋白或野生型的β-連環(huán)蛋白。啟動(dòng)子序列可直接與β-連環(huán)蛋白基因或其片段相連，在這種情況下，N末端的第一個(gè)氨基酸總是由ATG起始密碼子編碼的甲硫氨酸。必要時(shí)，通過在體外與溴化氰保溫或通過在體內(nèi)或體外與細(xì)菌甲硫氨酸N末端的肽酶保溫可將N末端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上裂解下來(EPO公開號(hào)219,237)。
可用適當(dāng)?shù)摩?連環(huán)蛋白載體轉(zhuǎn)化真核微生物，如酵母培養(yǎng)物，例見美國(guó)專利4,745,057。在較低等的真核宿主微生物中，最常用的是釀酒酵母，但通常也可使用大量其它菌株。酵母載體可含有2微米酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列(ARS)，啟動(dòng)子，編碼β-連環(huán)蛋白的DNA，聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的序列，和選擇基因。
酵母載體中適當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)序列包括下列物質(zhì)的啟動(dòng)子，如金屬硫蛋白，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，生物化學(xué)雜志，2552073(1980)或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7,149(1968)；和Holland等，生物化學(xué)，174900(1978))，如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，果糖磷酸激酶，葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，葡糖磷酸異構(gòu)酶和葡糖激酶。用于酵母表達(dá)的適當(dāng)載體和啟動(dòng)子還描述于R.Hitzman等，EPO公開號(hào)73,657。
得自多細(xì)胞生物體的細(xì)胞培養(yǎng)物是用于合成重組β-連環(huán)蛋白的合乎需要的宿主。大體上，不論得自脊椎動(dòng)物還是非脊椎動(dòng)物的培養(yǎng)物，任何較高等的真核細(xì)胞培養(yǎng)物都是可以使用的。然而，如實(shí)施例中所述，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這種細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中的增殖已成為常規(guī)技術(shù)，見組織培養(yǎng)，Academic出版社，Kruse和Paterson編(1973)。
用于轉(zhuǎn)化脊椎動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列經(jīng)常由病毒來源提供。例如，常用的啟動(dòng)子得自CMV，多瘤病毒，腺病毒2和猴病毒40(SV40)，例見美國(guó)專利4,599,308。
可通過構(gòu)建載體以包括外源起點(diǎn)，如衍生自SV40或其它病毒來源(如多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)的起點(diǎn)來提供復(fù)制起點(diǎn)，或者通過宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供復(fù)制起點(diǎn)。如果載體被整合至宿主細(xì)胞染色體，后者即足夠了。
穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白的鑒定以前，在888mel細(xì)胞系中將含有ser37...phe37取代的b-連環(huán)蛋白突變體形式鑒定為由腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞識(shí)別的黑素瘤-特異性抗原(8)。由于此突變可能會(huì)增加b-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性，因此我們測(cè)定了這些細(xì)胞和25個(gè)其它黑素瘤細(xì)胞系中的b-連環(huán)蛋白水平。相對(duì)于正常新生兒黑素細(xì)胞(NHEM)而言，包括888mel細(xì)胞的7個(gè)細(xì)胞系含有增加量的b-連環(huán)蛋白(圖1A)。7個(gè)中有2個(gè)似乎也具有APC變化1335mel細(xì)胞含有截短的APC，928mel細(xì)胞沒有可測(cè)的APC。特異于APC羧基端序列的抗體不能免疫沉淀截短的APC，這說明截短是類似于在結(jié)腸癌中觀察到的羧基端的截短(圖1B)。
具有高水平b-連環(huán)蛋白的5個(gè)其它細(xì)胞系中，大量b-連環(huán)蛋白與野生型(WT)APC共同免疫沉淀。b-連環(huán)蛋白在WT APC上的積累是b-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化的特征，用b-連環(huán)蛋白氨基末端缺失的突變體可特別地觀察到這一點(diǎn)(5)。1088mel細(xì)胞似乎含有在APC蛋白上積累的截短的b-連環(huán)蛋白。穩(wěn)定化b-連環(huán)蛋白的另一個(gè)特征是其通過大小分級(jí)分離層析在單體庫中遷移(5，9，10)。b-連環(huán)蛋白水平增加的所有黑素瘤細(xì)胞表現(xiàn)出單體b-連環(huán)蛋白大庫(圖1C)。另外，具有正常b-連環(huán)蛋白水平的兩個(gè)細(xì)胞系，1280和1300mel也含有一些單體b-連環(huán)蛋白。
928和1335mel細(xì)胞系中b-連環(huán)蛋白的上調(diào)可能是由WT APC的損失引起的，這一點(diǎn)已對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞提出(4)。為了檢驗(yàn)這一假說，我們?cè)?28mel細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)了WT APC，并用特異于APC和b-連環(huán)蛋白的抗體與它們共染色。異位表達(dá)的APC為陽性的928mel細(xì)胞中含有的b-連環(huán)蛋白水平比表現(xiàn)出過量核和胞質(zhì)染色的未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞低(圖2)。928mel細(xì)胞中APC下調(diào)b-連環(huán)蛋白的能力暗示它們含有WTb-連環(huán)蛋白。與之形成對(duì)照的是，在888mel細(xì)胞中異位表達(dá)WT APC不會(huì)下調(diào)內(nèi)源性突變的b-連環(huán)蛋白，但會(huì)導(dǎo)致b-連環(huán)蛋白在WT APC上積累。
wnt-1原癌基因通過降低b-連環(huán)蛋白降解的速率來激活b-連環(huán)蛋白信號(hào)傳遞(3)，而APC腫瘤抑制基因可提高此速率(4)。為了檢查黑素瘤細(xì)胞中高穩(wěn)態(tài)水平的b-連環(huán)蛋白是否是轉(zhuǎn)換速率降低所致，我們對(duì)有代表性的細(xì)胞系進(jìn)行了b-連環(huán)蛋白脈沖追蹤分析。含有WT APC和正常水平b-連環(huán)蛋白的SK23mel細(xì)胞系中的b-連環(huán)蛋白半壽期(t1/2)小于30分鐘(圖3A)。與之相比，含有ser37phe突變的888mel細(xì)胞中的b-連環(huán)蛋白t1/2為4.5小時(shí)以上。在缺乏WT APC的928mel細(xì)胞和含有突變的b-連環(huán)蛋白的624mel細(xì)胞中(表1)，b-連環(huán)蛋白也具有增加的t1/2。888mel細(xì)胞含有野生型和突變b-連環(huán)蛋白的mRNA(8)，但它們的產(chǎn)物對(duì)半壽期分析的相對(duì)貢獻(xiàn)仍是未知的。結(jié)果表明WT b-連環(huán)蛋白只占總蛋白質(zhì)中很少的部分，或突變體形式占優(yōu)勢(shì)地干擾WT蛋白的轉(zhuǎn)換。1088mel細(xì)胞含有全長(zhǎng)b-連環(huán)蛋白和截短的b-連環(huán)蛋白，前者具有約為2小時(shí)的中間t1/2，后者具有大于4.5小時(shí)的增加的半壽期。
為了確保ser37取代負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換速率的降低，我們用編碼經(jīng)表位標(biāo)記的ser37...ala37或WT b-連環(huán)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表現(xiàn)出內(nèi)源性b-連環(huán)蛋白快速轉(zhuǎn)換的鼠垂體ATT20細(xì)胞(5)。外源性WT b-連環(huán)蛋白的t1/2約為40分鐘，而ser37...ala37b-連環(huán)蛋白的t1/2大于4小時(shí)(圖3B)。為了確定ser37...ala37b-連環(huán)蛋白是否對(duì)依賴于APC的轉(zhuǎn)換敏感，我們?cè)趦H含有截短APC的SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞中將其與APC25 cDNA共同表達(dá)。APC25片段下調(diào)b-連環(huán)蛋白，而對(duì)照APC3片段卻不能下調(diào)b-連環(huán)蛋白(4)。回收經(jīng)表位標(biāo)記的b-連環(huán)蛋白，結(jié)果表明WT，而不是ser37...ala37b-連環(huán)蛋白對(duì)共同表達(dá)的APC25片段作出反應(yīng)而被降解(圖3C)。這些結(jié)果闡明單個(gè)點(diǎn)突變對(duì)b-連環(huán)蛋白的t1/2具有顯著的影響。
對(duì)積累b-連環(huán)蛋白的其它黑素瘤細(xì)胞系的b-連環(huán)蛋白cDNA進(jìn)行測(cè)序，揭示出3個(gè)影響絲氨酸殘基的其它點(diǎn)突變(表1)。
表1.黑素瘤細(xì)胞系中的β-連環(huán)蛋白突變細(xì)胞系 核苷酸 蛋白質(zhì)501melTCT至TTT ser37phe1088mel mRNA del.外顯子2和3del.a.a.1-871mRNA del.外顯子2，3和4 del.a.a.1-17311241mel TCT至TTT ser37phe-1335mel2野生型 野生型624melTCT至TAT ser45tyr888melTCT至TTT ser37phe928mel2N.D.31290mel TCT至TTT ser37phe1基于在下一個(gè)最近的甲硫氨酸密碼子處再起始的氨基酸序列最少缺失。2這些細(xì)胞缺乏野生型APC蛋白。3未測(cè)定。
與888mel細(xì)胞相同，在501和1241mel細(xì)胞中鑒定的突變是產(chǎn)生S37F取代的C至T的轉(zhuǎn)換。有趣的是，C至T的轉(zhuǎn)換在黑素瘤p53基因中也是常見的，可能是紫外光照射的結(jié)果(11)。624mel中的突變預(yù)示著ser45...tyr45取代，對(duì)此細(xì)胞的脈沖追蹤分析表明該突變可延長(zhǎng)b-連環(huán)蛋白的t1/2(圖3)。另外，S45Y b-連環(huán)蛋白與APC25的共同表達(dá)表明它對(duì)SW480細(xì)胞中依賴于APC的轉(zhuǎn)換不起作用(12)。絲氨酸37和45可能是重要的磷酸化位點(diǎn)，因?yàn)镾er33，ser37，thr41和ser45四顯性組合取代顯著降低了非洲爪蟾屬b-連環(huán)蛋白的磷酸化(7)。在1088mel細(xì)胞中鑒定了兩個(gè)新的b-連環(huán)蛋白mRNA，一個(gè)缺乏外顯子2和3，另一個(gè)缺乏外顯子2，3和4。一般在外顯子2的密碼子1處起始，然而，在密碼子88，外顯子4的第一個(gè)ATG處起始會(huì)產(chǎn)生截短的b-連環(huán)蛋白，其大小與在1088mel細(xì)胞中測(cè)得的大體相同(圖1A)。尚未檢測(cè)到預(yù)測(cè)從其它可替換的mRNA外顯子5的密碼子174處起始的截短得更厲害的b-連環(huán)蛋白。仍不清楚此細(xì)胞中的b-連環(huán)蛋白mRNA同種型是突變所致還是mRNA異常加工所致。其它黑素瘤細(xì)胞中無一含有這些mRNA。對(duì)APC-缺損的1335和928mel細(xì)胞的b-連環(huán)蛋白cDNA進(jìn)行測(cè)序，僅鑒定出野生型序列，對(duì)1280mel，1300mel，SK23mel和NHEM細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)序，也只鑒定出野生型序列。
穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用最近，當(dāng)b-連環(huán)蛋白在非洲爪蟾屬卵母細(xì)胞中過量表達(dá)時(shí)，顯示出與LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子功能性地相互作用(2)。為了測(cè)定這種相互作用是否在黑素瘤細(xì)胞系中發(fā)生，我們免疫沉淀了一些細(xì)胞系中的b-連環(huán)蛋白，并檢查了LEF1的沉淀物。LEF1優(yōu)先被含有穩(wěn)定化b-連環(huán)蛋白的細(xì)胞中的抗-b-連環(huán)蛋白共免疫沉淀(圖4)。這表明在這些細(xì)胞中，組成型b-連環(huán)蛋白-LEF/TCF復(fù)合物導(dǎo)致迄今為止未被鑒定的靶基因的持久反式激活，導(dǎo)致不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)或癌癥。
在被檢查的26個(gè)黑素瘤細(xì)胞系中，8個(gè)因b-連環(huán)蛋白突變，b-連環(huán)蛋白mRNA異常剪接或APC的失活而在b-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)方面有缺陷。我們假定腫瘤進(jìn)程中選擇了這些突變。888mel細(xì)胞系的突變不象是通過體外培養(yǎng)產(chǎn)生的，因?yàn)樵撏蛔円泊嬖谟诘米跃徍?年后相同患者的新腫瘤的1290mel細(xì)胞系中(8)。另外，在衍生得到1290mel的未培養(yǎng)的腫瘤材料中也鑒定出突變。b-連環(huán)蛋白中穩(wěn)定化的突變也與結(jié)腸癌中提出的APC功能-致。WT，而不是突變的APC在結(jié)腸癌細(xì)胞中下調(diào)b-連環(huán)蛋白的能力支持本文所述的工作，即b-連環(huán)蛋白的上調(diào)對(duì)癌癥進(jìn)程作出貢獻(xiàn)(4)。在黑素瘤細(xì)胞中，在表達(dá)WT APC的細(xì)胞中鑒定出b-連環(huán)蛋白突變，而在表達(dá)突變APC的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高水平的WT b-連環(huán)蛋白。因此，b-連環(huán)蛋白的上調(diào)是腫瘤發(fā)生的共有特征，它受到APC或b-連環(huán)蛋白基因或在此途徑中起作用的其它基因突變的影響。
調(diào)制穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白表達(dá)或活性的化合物的篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)下列試驗(yàn)以鑒定與穩(wěn)定化的β-連環(huán)蛋白或Lef相互作用(如結(jié)合)的化合物，影響穩(wěn)定化的β-連環(huán)蛋白與Lef結(jié)合的化合物，與同穩(wěn)定化的β-連環(huán)蛋白和/或Lef相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用(如結(jié)合)的化合物，干擾穩(wěn)定化的β-連環(huán)蛋白與Lef或與介導(dǎo)β-連環(huán)蛋白活性的其它轉(zhuǎn)錄因子的相互作用的化合物，和調(diào)制穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白基因的活性(即調(diào)制穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的水平)或調(diào)制穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白水平的化合物。還可采用這些試驗(yàn)，它們鑒定與穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白基因調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子序列)結(jié)合并可調(diào)制穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的化合物，例見Platt，K.A.，1994，生物化學(xué)雜志，26928558-28562，全文列入本文作為參考。
根據(jù)本發(fā)明可篩選的化合物包括但不限于與穩(wěn)定化的β-連環(huán)蛋白或Lef結(jié)合并模擬由天然配體(即激動(dòng)劑)引發(fā)的活性或抑制由天然配體(即拮抗劑)引發(fā)的活性的肽，抗體及其片段，前列腺素，脂質(zhì)和其它有機(jī)化合物(如萜品，肽模擬物)；以及模擬穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白或Lef(或其部分)的肽，抗體或其片段，和其它有機(jī)化合物。
這種化合物可包括但不限于肽，例如可溶性的肽，包括但不限于隨機(jī)肽文庫(例見Lam，K.S等，1991，自然，35482-84；Houghten，R等，1991，自然，35484-86)的成員，和由D-和/或L-構(gòu)型氨基酸構(gòu)成的組合化學(xué)-衍生的分子文庫肽的成員，磷酸肽(包括但不限于隨機(jī)或部分筒并，定向磷酸肽文庫的成員，例見Songyang，Z等，1993，細(xì)胞，72767-778)；抗體(包括但不限于多克隆，單克隆，人源化，抗-獨(dú)特型，嵌合或單鏈抗體，和FAb，F(xiàn)(ab)2和FAb表達(dá)文庫片段，及其表位結(jié)合片段)；和小的有機(jī)或無機(jī)分子。
可根據(jù)本發(fā)明篩選的其它化合物包括但不限于小的有機(jī)分子，該分子能進(jìn)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞并影響穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白基因或參與穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一些其它基因的表達(dá)(例如通過與參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子相互作用)；或化合物，所述化合物通過例如抑制或增強(qiáng)穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白與Lef的結(jié)合或穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白與參與穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一些其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來影響穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白的活性。
計(jì)算機(jī)模型制作和檢索技術(shù)可以鑒定化合物，或改良已鑒定的化合物，所述化合物可調(diào)制穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白或Lef表達(dá)或活性。鑒定出這種化合物或成分之后，即可鑒定出結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)域。這種結(jié)合位點(diǎn)一般是結(jié)合伙伴位點(diǎn)，例如Lef與穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白自身的相互作用區(qū)域。使用本領(lǐng)域已知的方法可鑒定結(jié)合位點(diǎn)，所述方法包括例如由肽的氨基酸序列，核酸的核苷酸序列，或由相關(guān)化合物或成分與其天然配體的復(fù)合物的研究鑒定結(jié)合位點(diǎn)。在后一種情況下，可使用化學(xué)或X射線晶體學(xué)方法通過尋找在因子的何處可找到復(fù)合的配體以找到結(jié)合位點(diǎn)。
接著，測(cè)定結(jié)合位點(diǎn)的三維幾何結(jié)構(gòu)。通過可測(cè)定完整分子結(jié)構(gòu)的已知方法，包括X射線晶體學(xué)可做到這一點(diǎn)。另一方面，也可使用固相或液相NMR測(cè)定某些分子內(nèi)的距離。也可使用任何其它的結(jié)構(gòu)測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法得到部分或完整的幾何結(jié)構(gòu)。用可增加所測(cè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性的天然或人工復(fù)合配體可測(cè)定幾何結(jié)構(gòu)。
如果測(cè)定的結(jié)構(gòu)不完整或不夠準(zhǔn)確，可使用基于計(jì)算機(jī)的數(shù)字模型制作方法完成結(jié)構(gòu)測(cè)定或改善其準(zhǔn)確性?？墒褂萌魏喂哪Ｐ椭谱鞣椒?，包括特異于特定生物聚合物，如蛋白質(zhì)或核酸的參數(shù)化模型，基于計(jì)算分子運(yùn)動(dòng)的分子動(dòng)力學(xué)模型，基于熱系綜的統(tǒng)計(jì)力學(xué)模型，或組合模型。對(duì)大多數(shù)類型的模型而言，描述組成原子和基團(tuán)之間的力的標(biāo)準(zhǔn)分子力場(chǎng)是必需的，該分子力場(chǎng)可選自物理化學(xué)中已知的力場(chǎng)。不完整或較不準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)可約束由這些模型制作方法計(jì)算出的完整和更準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)。
最后，通過制作模型實(shí)驗(yàn)性地或通過聯(lián)合模型測(cè)定β-連環(huán)蛋白或Lef的結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)之后，可通過檢索含有化合物及其分子結(jié)構(gòu)信息的數(shù)據(jù)庫來鑒定候選的調(diào)制化合物。這種檢索尋找的是具有與測(cè)定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)相匹配并與限定此位點(diǎn)的基團(tuán)相互作用的結(jié)構(gòu)的化合物。這種檢索可以是人工的，但優(yōu)選在計(jì)算機(jī)的輔助下進(jìn)行。由這種檢索找到的化合物是潛在的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白調(diào)制化合物。
或者，可使用這些方法從已知的調(diào)制化合物或配體中鑒定改良的調(diào)制化合物?？尚揎椧阎衔锏慕M成，并使用上文所述應(yīng)用于新成分的實(shí)驗(yàn)性和計(jì)算機(jī)模型制作方法測(cè)定修飾的結(jié)構(gòu)效應(yīng)。然后比較改變的結(jié)構(gòu)與化合物的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)以確定是否導(dǎo)致改善的適合或相互作用。以此方法，可快速評(píng)價(jià)成分中通過例如改變側(cè)鏈基團(tuán)所致的系統(tǒng)性變異以得到特異性或活性有所改善的經(jīng)修飾的調(diào)制化合物或配體。
可用于基于鑒定與Lef和相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子相互作用的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)來鑒定調(diào)制化合物的其它實(shí)驗(yàn)性和計(jì)算機(jī)模型制作方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
分子模型制作系統(tǒng)的例子是CHARMm和QUANTA程序(Polygen公司，Waltham，MA)。CHARMm行使能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA行使分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，圖的模型制作和分析的功能。QUANTA可以相互作用地構(gòu)建，修飾，觀察和分析分子互相之間的表現(xiàn)。
大量文章回顧了與特定蛋白質(zhì)相互作用的藥物的計(jì)算機(jī)模型制作，如Rotivinen等，1988，Acta Pharmaceutical Fennica 97159-166；Ripka，New Scientist 54-57(1988-6-16)；McKinaly和Rossmann，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol，29111-122；Perry和Davies，OSAR藥物設(shè)計(jì)中結(jié)構(gòu)-活性的量的關(guān)系，p189-193(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis和Dean，1989，Proc.R.Soc.Lond.236125-140和141-162；和有關(guān)核酸成分的模型受體，參見Askew等，1989，J.Am.Chem.Soc.1111082-1090。篩選和圖示化合物的其它計(jì)算機(jī)程序可得自下列公司，如βioDesign公司(Pasadena，CA)，Allelix公司(Mississauga，Ontario，加拿大)和Hypercube公司(Cambridge，Ontario)。盡管這些都是最初設(shè)計(jì)用于特異于特定蛋白質(zhì)的藥物的，但它們也適用于設(shè)計(jì)特異于DNA或RNA區(qū)域的藥物(一旦已鑒定出該區(qū)域)。
盡管上文描述了有關(guān)設(shè)計(jì)和產(chǎn)生可改變結(jié)合的化合物的內(nèi)容，但也可以在已知化合物的文庫中篩選可用作抑制劑或激活劑的化合物，所述已知化合物包括天然產(chǎn)物或合成化合物，和包括蛋白質(zhì)的生物活性物質(zhì)。
通過本文所述的那些測(cè)定法鑒定的化合物可用于例如發(fā)揮穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白基因產(chǎn)物的生物功能，和改善造血譜系細(xì)胞激活障礙。下文將討論檢測(cè)通過本文所述技術(shù)鑒定的化合物的效力的試驗(yàn)。
結(jié)合β-連環(huán)蛋白的化合物的體外篩選試驗(yàn)可設(shè)計(jì)體外系統(tǒng)以鑒定能與穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白和/或結(jié)合β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，優(yōu)選Lef相互作用(如結(jié)合)的化合物。鑒定的化合物可用于例如調(diào)制野生型和/或突變的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白基因產(chǎn)物的活性；可用于鑒定破壞正常的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白/Lef相互作用的化合物的篩選試驗(yàn)；或其自身即可破壞這種相互作用。
用于鑒定與穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白結(jié)合的化合物的試驗(yàn)原理包括在足以使兩種成分相互作用和結(jié)合的條件下和時(shí)間內(nèi)制備穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白和受試化合物的反應(yīng)混合物，因此形成在反應(yīng)混合物中可被除去和/或檢測(cè)的復(fù)合物。所用的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白的種類隨篩選試驗(yàn)?zāi)康牡牟煌煌?。例如，可使用全長(zhǎng)的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白，或含有與蛋白質(zhì)或多肽融合的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白的融合蛋白，所述蛋白質(zhì)或多肽可為檢測(cè)系統(tǒng)提供便利(如標(biāo)記，分離所得的復(fù)合物等)。
可以多種方式進(jìn)行篩選試驗(yàn)，例如，進(jìn)行此試驗(yàn)的一種方法包括將穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白蛋白質(zhì)，多肽，肽或融合蛋白或檢測(cè)物質(zhì)錨著于固相上，反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)錨著于固相上的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白/受試化合物復(fù)合物。在此方法的一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白反應(yīng)物可錨著于固體表面，可直接或間接地標(biāo)記未錨著的受試化合物。在此方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，用經(jīng)標(biāo)記的Lef復(fù)合錨著于固相的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白。然后，檢測(cè)受試化合物破壞穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白/Lef復(fù)合物的結(jié)合的能力。
實(shí)踐中，微滴板可方便地用作固相?？赏ㄟ^非共價(jià)或共價(jià)吸附來固定錨著的成分。簡(jiǎn)單地用蛋白質(zhì)溶液包被固體表面并干燥即可實(shí)現(xiàn)非共價(jià)吸附?；蛘?，可使用特異于被固定的蛋白質(zhì)的固定化抗體，優(yōu)選為單克隆抗體將蛋白質(zhì)錨著于固體表面。可提前制備表面并儲(chǔ)存。
為了進(jìn)行檢測(cè)，在含有錨著成分的經(jīng)包被表面上加入非固定化成分。反應(yīng)完成后，在所形成的任何復(fù)合物仍固定于固體表面的條件下除去(如通過洗滌)未反應(yīng)的成分?？梢远喾N方法檢測(cè)錨著于固體表面的復(fù)合物。當(dāng)預(yù)先標(biāo)記了以前未固定的成分時(shí)，固定于表面的標(biāo)記物的檢測(cè)顯示形成了復(fù)合物。當(dāng)未預(yù)先標(biāo)記以前未固定的成分時(shí)，可使用間接的標(biāo)記物檢測(cè)錨著于表面的復(fù)合物，如使用特異于先前未固定的成分的經(jīng)標(biāo)記抗體(抗體反過來可被經(jīng)標(biāo)記的抗-Ig抗體直接標(biāo)記或間接標(biāo)記)。
或者，可在液相中進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的成分分離，使用例如特異于穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白蛋白質(zhì)，多肽，肽或融合蛋白，或Lef蛋白或融合蛋白的固定化抗體，或能錨著溶液中形成的任何復(fù)合物的受試化合物檢測(cè)復(fù)合物，和使用特異于可能的復(fù)合物中的其它成分的經(jīng)標(biāo)記抗體檢測(cè)錨著的復(fù)合物。
有效劑量可通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測(cè)定這類化合物的毒性和治療效力，例如測(cè)定LD50(使50％群體致死的劑量)和ED50(對(duì)50％群體治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，可將該指數(shù)表示為L(zhǎng)D50/ED50的比值。優(yōu)選表現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物。盡管可使用表現(xiàn)出毒副作用的化合物，但應(yīng)精心設(shè)計(jì)出可將這類化合物靶向受影響的組織位點(diǎn)的傳遞系統(tǒng)，以使其對(duì)未受影響的細(xì)胞的潛在損害最小化，從而降低副作用。
由細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究得到的數(shù)據(jù)可用于配制適用于人的劑量范圍。優(yōu)選這類化合物的劑量處于包括具有很低毒性或無毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。依據(jù)所用的劑量形式和給藥途徑，劑量可在此范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明方法中所用的任何化合物而言，最初可從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中估計(jì)治療有效劑量?？稍趧?dòng)物模型中配制劑量以達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50(即使一半的癥狀達(dá)到最大抑制的受試化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。該信息可被用于更精確地測(cè)定人的有用劑量。通過例如高效液相層析可測(cè)定血漿中的水平。
配制和使用可使用一種或多種生理可接受的載體或賦形劑，按常規(guī)方法配制本發(fā)明所用的藥物組合物。
因此，化合物及其生理可接受的鹽和溶劑化物可被配制成經(jīng)吸入或吹入(通過口或鼻)給藥，或口，頰，非腸道或直腸給藥。
為了口服給藥，藥物組合物可采取例如使用藥物可接受的賦形劑通過常規(guī)方法制備得到的片劑或膠囊的形式，所述賦形劑如結(jié)合劑(如預(yù)明膠化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(如乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂，滑石或硅石)；崩解劑(如土豆淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)；或濕潤(rùn)劑(如十二烷基硫酸鈉)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方法包被片劑?？诜囊后w制品可采取例如溶液，糖漿或懸浮液的形式，或以干產(chǎn)物的形式提供，使用前再用水或其它適當(dāng)載體配制。使用藥物可接受的添加劑，通過常規(guī)方法可制備這種液體制劑，所述添加劑如懸浮劑(如山梨糖醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)；不含水的載體(如杏仁油，油狀酯，乙基醇或分級(jí)分離的植物油)；和防腐劑(如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。適當(dāng)時(shí)，制劑中也可含有緩沖的鹽，調(diào)味劑，著色劑和甜味劑。
口服制劑可適當(dāng)?shù)嘏渲瞥煽蒯屝问降幕钚曰衔铩?br> 頰內(nèi)施用的組合物可采取以常規(guī)方法配制的片劑或錠劑形式。
為了通過吸入給藥，可使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它適當(dāng)氣體，由加壓的容器或噴霧器以氣溶膠噴霧形式方便地傳遞根據(jù)本發(fā)明使用的化合物。對(duì)加壓氣溶膠而言，通過提供閥來傳遞按規(guī)定供給的量可以測(cè)定劑量單位。可配制用于吸入劑或吹入劑的例如明膠膠囊和藥筒配，它們含有化合物和適當(dāng)粉末主劑(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可配制通過注射而非腸道給藥的化合物，如巨丸劑注射或連續(xù)灌注?？梢詥挝粍┝啃问教峁┳⑸溆玫闹苿缰糜谔砑佑蟹栏瘎┑陌碴称炕蚨鄤┝咳萜髦?。組合物可采取例如油狀或含水載體中的懸浮液，溶液或乳劑的形式，可含有配劑，如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是使用前用例如無菌無熱原水這樣的適當(dāng)載體配制的粉末形式。
也可將化合物配制成直腸用組合物，如含有常規(guī)栓劑主劑(如可可脂或其它甘油酯)的栓劑或保留灌腸劑。
除了上述制劑外，也可將化合物配制成緩釋制劑。通過植入(例如皮下或肌內(nèi))或肌內(nèi)注射可施用這種長(zhǎng)期作用的制劑。因此，例如，可用適當(dāng)?shù)木酆衔锘蚴杷晕镔|(zhì)配制化合物(例如配制成可接受油中的乳劑)，或用離子交換樹脂配制化合物，或?qū)⒒衔锱渲瞥缮匀苄匝苌?，例如稍溶性鹽的形式。
必要時(shí)，可以用可含有一個(gè)或多個(gè)含活性成分的單位劑量形式的包裝或分配器裝置來提供組合物。例如，包裝可含有金屬或塑料箔，如泡罩包裝。包裝或分配器裝置中附有給藥說明。
診斷應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道，檢測(cè)穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白(β-連環(huán)蛋白蛋白質(zhì)或核酸)的任何方法都可用作診斷不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)，包括癌癥的方法。這類方法包括基于抗體或核酸的試驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)上述說明書全文參照下列參考文獻(xiàn)和注解。1.B.M.Gumbiner，細(xì)胞生物學(xué)最新見解(Curr.Opin.Cell Biol)，7，634(1995)；M.Peifer，細(xì)胞生物學(xué)趨勢(shì)(Trends Cell Biol)，5，224(1995)；J.Klingensmith和R.Nusse，Dev.Biol.166，396(1994)。2.J.Behrens等，自然(Nature)382，638(1996)；M.Molenaar等，細(xì)胞(Cell)86，391(1996)；Huber等，Mech.Dev.59，3(1996)。3.R.S.Bradley，P.Cowin，A.M.C.Brown，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol)123，1857(1993)；L.Hinck，W.J.Nelson，J.Papkoff，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol)124，729(1994)；A.S.Tsukamoto，R.Grosschedl，R.C.Guzman，T.Parslow，H.E.Varmus，細(xì)胞(Cell)55，619(1988)。4.S.Munemitsu，I.Albert，B.Souza，B.Rubinfeld，P.Polakis，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)92，3046(1995)。5.S.Munemitsu，I.Albert，B.Rubinfeld，P.Polakis，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol)16，4088(1996)。6.N.Funayama，F(xiàn).Fagotto，P.McCrea，B.M.Gumbiner，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol)128，959(1995)；S.Orsulic，M.Peifer，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol)134，1283(1996)。7.C.Yost等，Genes Dev 10，1443(1996)。8.P.F.Robbins等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med)183，1185(1996)。9.J.Papkoff，B.Rubinfeld，B.Schryver，P.Polakis，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol)16，2128(1996)。10.此單體庫代表未結(jié)合的b-連環(huán)蛋白，但未反映出b-連環(huán)蛋白未與其結(jié)合蛋白結(jié)合。例如，具有此過量b-連環(huán)蛋白庫的細(xì)胞中與APC結(jié)合的b-連環(huán)蛋白的量一般比沒有過量b-連環(huán)蛋白庫的細(xì)胞中的高。在大多數(shù)細(xì)胞中b-連環(huán)蛋白比APC過量100至1000倍，因此，用b-連環(huán)蛋白飽和APC不會(huì)顯著耗竭單體b-連環(huán)蛋白庫。11.D.E.Brash等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)88，10124(1991)。12.B.Rubinfeld，P.Polakis，未公開的結(jié)果。13.在Triton X-100裂解緩沖液[20mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0％TritonX-100，140mM NaCl；10％甘油，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，1mM釩酸鈉，50mM NaF，1mM Pefabloc，10mg/ml各種抑蛋白酶肽，抑胃酶肽和亮抑蛋白酶肽]中裂解細(xì)胞沉淀物，離心后將上清液調(diào)節(jié)為2mg/ml總蛋白質(zhì)。將25ml各樣品上樣于6％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上以通過免疫印跡分析總的b-連環(huán)蛋白和APC。為了進(jìn)行免疫沉淀，將400ml各裂解物與2mg經(jīng)親和純化的多克隆b-連環(huán)蛋白抗體或2mg經(jīng)親和純化的多克隆APC3抗體(14)一起保溫。使用A蛋白Sepharose回收抗體，各用1ml緩沖液B[20mM Tris-Hcl(pH8.0)，150mM NaCl，0.5％NP-40]將珠洗滌3次，最后用SDS-PAGE樣品緩沖液洗脫。為了進(jìn)行免疫印跡，將濃度為0.2mg/ml的經(jīng)親和純化的針對(duì)APC中心區(qū)域(APC2)，全長(zhǎng)b-連環(huán)蛋白或全長(zhǎng)LEF1(15)的兔多克隆抗體與印跡保溫。使用ECL系統(tǒng)(Amersham)顯色印跡，或?qū)τ趫D1A中的b-連環(huán)蛋白印跡使用0.5mCi/ml的125I-A蛋白(Amersham)。14.B.Rubinfeld等，科學(xué)(Science)262，1731(1993)。15.M.G.Prieve，K.L.Guttridge，J.E.Munguia，M.L.Waterman，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)271，7654(1996)。16.除SK23 mel外(21)，黑素瘤細(xì)胞系由轉(zhuǎn)移損害產(chǎn)生(17)。888和1290mel細(xì)胞系得自相同患者的兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)移腫瘤，所有其它細(xì)胞系得自不同的患者。SW480細(xì)胞系得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC登記號(hào)為CCL228)，它是人結(jié)腸癌細(xì)胞系。ATT20(ATCC登記號(hào)為CCL89)是鼠垂體腫瘤細(xì)胞。按(5)中所述的方法產(chǎn)生表達(dá)b-連環(huán)蛋白的適當(dāng)ATT20克隆。17.S.Topalian，D.Solomon，S.Rosenberg，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)142，3714(1989)。18.使用脂轉(zhuǎn)染胺試劑(BRL)用編碼人WT APC的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染928mel細(xì)胞(4)。48小時(shí)后固定細(xì)胞，并染色以進(jìn)行免疫熒光顯微術(shù)(19)。為了檢測(cè)APC，首先將細(xì)胞與羧基末端特異性的APC3抗體(14)-起保溫，然后與針對(duì)兔免疫球蛋白G(IgG)(Sigma)的FITC-綴合的山羊抗體一起保溫。用小鼠抗b-連環(huán)蛋白Mab(Transduction Laboratories，Lexington，KT)和針對(duì)小鼠IgG(Cappel，Durham，NC)的德克薩斯紅-綴合的驢抗體檢測(cè)β-連環(huán)蛋白。19.S.Munemitsu等，癌癥研究(Cancer Res.)54，3676(1994)。20.將細(xì)胞脈沖標(biāo)記(4)30分鐘，然后與含有未標(biāo)記的甲硫氨酸的培養(yǎng)基保溫給定的時(shí)間，再在培養(yǎng)皿上進(jìn)行裂解。離心裂解物之后，用抗-b-連環(huán)蛋白免疫沉淀黑素瘤細(xì)胞上清液中的b-連環(huán)蛋白，用與G蛋白Sepharose共價(jià)連接的抗myc抗體免疫沉淀ATT20或SW480上清液中的b-連環(huán)蛋白。電泳免疫沉淀物并在8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行熒光顯影。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(4)中，50％以上的SW480細(xì)胞表達(dá)異位的cDNA。APC25構(gòu)建體編碼APC氨基酸1034至2130，APC3編碼氨基酸2130至2843。為了分離b-連環(huán)蛋白cDNA，首先使用寡-dT和隨機(jī)引物的混合物，通過逆轉(zhuǎn)錄總mRNA(RNeasy試劑盒，Qiagen)得到cDNA庫。然后，使用6個(gè)特異于b-連環(huán)蛋白cDNA的不同引物套對(duì)cDNA庫進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物克隆至pCR2.1(Invitrogen)中，并在大腸桿菌中增殖。通過對(duì)用多引物套得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析可證實(shí)β-連環(huán)蛋白突變。21.M.Waterman提供抗LEF1的抗體，T.Boon提供SK23 mel細(xì)胞。
本發(fā)明并不局限于本文所述具體實(shí)施方案的范圍，所述實(shí)施方案只是想闡明本發(fā)明的各個(gè)方面，功能上等同的方法和成分也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)際上，除了本文所示和所述的以外，對(duì)本發(fā)明的多種修飾對(duì)于看過上文說明書和附圖的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的。這種修飾包括在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.分離的基本上純的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白或其片斷。
2.編碼基本上純的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白的分離的DNA或其片斷。
3.編碼基本上純的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白的分離的DNA或其片斷，其中所述分離的DNA是cDNA。
4.分離的基本上純的蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述復(fù)合物含有純化的穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白或其片斷和轉(zhuǎn)錄因子。
5.權(quán)利要求4所述的分離的基本上純的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是Lef/Tcf家族的成員。
6.診斷基于不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病的方法，所述方法包括測(cè)定所述細(xì)胞中穩(wěn)定化β-連環(huán)蛋白的存在。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述癌癥是黑素瘤。
9.鑒定抑制不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物的方法，所述方法包括檢測(cè)防止含有β-連環(huán)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物的形成的化合物。
10.權(quán)利要求9所述的鑒定抑制不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是Lef/Tcf家族的成員。
11.權(quán)利要求10所述的鑒定抑制不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是Lef。
全文摘要
本發(fā)明用于涉及診斷和/或治療由不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)引起的疾病(優(yōu)選癌癥)的方法和組合物,包括診斷細(xì)胞中穩(wěn)定化B－連環(huán)蛋白,或用破壞或改變由β－連環(huán)蛋白/轉(zhuǎn)錄因子組成的復(fù)合物的形成的化合物處理細(xì)胞,其中轉(zhuǎn)錄因子是Lef/Tcf家族的成員。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1253586SQ9880366
公開日2000年5月17日 申請(qǐng)日期1998年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月24日
發(fā)明者P·波拉凱斯, B·魯賓菲爾德 申請(qǐng)人:昂尼克斯藥物公司