專利名稱：細(xì)菌質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌質(zhì)粒。
質(zhì)粒是染色體外的可獨(dú)立復(fù)制的DNA分子，大多為環(huán)狀，幾乎存在于所有細(xì)菌和部分真核細(xì)胞以及線粒體中。質(zhì)粒的大小在約1.5-300kb之間。
通常，細(xì)菌質(zhì)粒為環(huán)狀、共價、閉合以及超螺旋的。它們常常攜帶針對抗生素或重金屬的抗性基因、用于代謝非典型底物的基因或者一系列種屬特異性特征的基因，如代謝特性或毒力因子。一些質(zhì)?？杀粡囊粋€細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個細(xì)胞。因?yàn)楦鶕?jù)目前的觀點(diǎn)，細(xì)菌的致病性也部分由其質(zhì)粒的性質(zhì)決定，因此日益需要澄清質(zhì)粒DNA的性質(zhì)。
已知腸桿菌科細(xì)菌家族中有14個主要變種合6個其它變種，其可形成不同的特性。典型的例子是埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)。大腸桿菌(E.coli)是細(xì)菌遺傳學(xué)的經(jīng)典對象。只有發(fā)現(xiàn)并表征了大腸桿菌不同的毒力因子，才能發(fā)現(xiàn)該種屬菌株在人和動物病原學(xué)上不同表現(xiàn)的普遍令人滿意的解釋。其中有的菌株為極端性的，從無毒力到高度毒力，如最近傳播的稱為“EHEC”的變種的例子。已經(jīng)有一系列腸道外以及腸道大腸桿菌菌株的毒力因子被描述，其中部分已被很好地表征。對致病性大腸桿菌菌株，已發(fā)現(xiàn)血清型變種O6K5毒力因子例如溶血蛋白和P傘毛粘附等，這些曾認(rèn)為不出現(xiàn)在該血清型變種的非致病性代表菌中。
通常毒力基因在腸桿菌屬的大質(zhì)粒(約60kb)上可見。也有帶小的所謂隱蔽性質(zhì)粒的腸桿菌屬，其功能至今無法方便的測定。
因?yàn)橐阎竽c桿菌的毒力因子也至少部分存在于質(zhì)?；蛏?，因此需要針對腸桿菌屬特別是大腸桿菌中質(zhì)粒的鑒定和表征的進(jìn)一步研究，以改善例如腸桿菌屬感染后疾病的診斷和治療的可能性。質(zhì)?；蚱浼?xì)菌性載體或相應(yīng)的合成DNA可用于治療或預(yù)防疾病，也可用于在微生物分析或診斷中以及營養(yǎng)生理學(xué)或微生態(tài)制劑方面的用途。此外，特別是在大腸桿菌中有的質(zhì)粒已知為遺傳工程中的表達(dá)載體，因此也需要增進(jìn)對這類質(zhì)粒性質(zhì)的了解。
根據(jù)上述目的進(jìn)行了針對大腸桿菌菌株DSM 6601的分子遺傳學(xué)研究。在DNA序列分析的數(shù)據(jù)庫程序幫助下，研究了獲自該菌株的DNA序列，并與已知的其它細(xì)菌DNA序列比較。
菌株DSM6601含有兩個大小分別為3177bp和5552bp的小質(zhì)粒，分別表述為pMUT1和pMUT2。
小質(zhì)粒pMUT1的DNA以線性片段形式被亞克隆至載體pUC18，用HindIII限制性酶切后測定了DNA序列。由

圖1可見。所得DNA序列通過與GenEMBL數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較進(jìn)行檢查；比較結(jié)果示于圖2。
此次比較中，HindIII插入位點(diǎn)固定為位置1。質(zhì)粒pMUT1的DNA位置200至800bp處與其它腸桿菌屬質(zhì)粒的不同復(fù)制起始位置(復(fù)制起點(diǎn))有明顯的同源性，特別是同質(zhì)粒NTP1、NTP16和CloDF13。在位置950bp開始有一個570bp長的質(zhì)粒NTP16同源區(qū)，其最初從鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)中分離出來。此同源區(qū)含有mobA基因，該基因是質(zhì)粒NTP16移動以及轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)(oriT)。此外，從位置1790至1920bp發(fā)現(xiàn)與基因parA和cer明顯同源的區(qū)域，其對于質(zhì)粒分子的穩(wěn)定性、連續(xù)轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分裂過程中的質(zhì)粒分配十分重要。對于剩余DNA區(qū)域未鑒定出明顯同源區(qū)。
此外，將質(zhì)粒pMUT1的DNA序列轉(zhuǎn)錄為氨基酸序列并分析開放閱讀框架的存在。研究了6種不同閱讀框架的可能性?？偣舶l(fā)現(xiàn)5個大小為143、62、56、49和48個氨基酸的開放閱讀框架。分析的圖示結(jié)果示于圖3。
類似地，將較大質(zhì)粒pMUT2用限制性酶SphI線性化后亞克隆至載體pUC18，隨后全部測序。DNA序列示于圖4。在GeneEMBL數(shù)據(jù)庫程序幫助下研究用此法獲得的DNA序列與已知DNA序列的同源性。結(jié)果圖示于圖5。質(zhì)粒pMUT2的DNA與大腸桿菌不同ColE1質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)在位置890至1660bp明顯同源。在3800至4950bp區(qū)也發(fā)現(xiàn)一個與ColE質(zhì)粒的明顯同源區(qū)。在此處認(rèn)為其為ColE1質(zhì)粒移動區(qū)的同源區(qū)。發(fā)現(xiàn)位置3770至4980bp區(qū)與溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)菌株A1同源。在該質(zhì)粒上有在巴斯德氏菌屬中編碼抗微生物抗性蛋白質(zhì)的基因。然而，由于同源區(qū)橫跨屬間區(qū)，所以可能也含有質(zhì)粒移動必須的序列。
鑒定了與其它腸桿菌屬質(zhì)粒明顯同源的兩個區(qū)。由此發(fā)現(xiàn)它含有質(zhì)粒移動必需的復(fù)制區(qū)域起點(diǎn)和移動區(qū)。pMUT2的剩余DNA部分中未鑒定出明顯同源區(qū)。
同樣，隨后將質(zhì)粒pMUT2的DNA序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列，并分析開放閱讀框架的存在。類似地，結(jié)果圖示于圖3。發(fā)現(xiàn)了帶有327、318、264、76和63個氨基酸的5個開放閱讀框架。
不僅質(zhì)粒pMUT1和pMUT2此前未知，其組合也未在任何大腸桿菌菌株或其它腸桿菌屬中發(fā)現(xiàn)。
質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)使菌株DSM6601存在用于代謝和醫(yī)藥和/或營養(yǎng)性生理或微生態(tài)制劑方面用途的可能性。
質(zhì)粒的研究使腸桿菌屬特別是埃希氏菌屬的測定和分析更為精確。而且，這些質(zhì)粒使它們作為可靠的表達(dá)載體用于遺傳工程。
現(xiàn)對本發(fā)明進(jìn)一步以實(shí)施例的方式解釋。實(shí)施例1質(zhì)粒分離根據(jù)Birnboim等人(Birnboim，A.C.和Doly，J.(1979)核酸研究(Nucl.Acids Res.)71513-1523，一種用于篩選重組質(zhì)粒DNA的快速堿提取方法)的方法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的分離。
用一個細(xì)菌菌落接種3毫升LB培養(yǎng)基，37℃下攪拌培養(yǎng)過夜。在Eppendorf管中離心培養(yǎng)液，用吸尖去除培養(yǎng)基沉淀。細(xì)胞沉淀用100微升溶液I(50mM葡萄糖；10mM EDTA，pH8；25mM Tris-HCl，pH8)重懸。室溫下溫育5分鐘后加入200微升溶液II(0.2 N NaOH；1％SDS)，混合至澄清，將Eppendorf管置于冰上5分鐘。然后向其中加入150微升溶液III(3M乙酸鈉，pH4.8)，短暫攪拌直至染色體DNA出現(xiàn)絮狀沉淀，將沉淀再次置于冰上5分鐘。沉淀染色體DNA和細(xì)胞殘片于離心管中離心5分鐘被沉淀，帶有質(zhì)粒DNA的上清液被移至新管中。為純化質(zhì)粒DNA，加入50微升苯酚和150微升氯仿/異丙醇(24∶1)，短暫攪拌后離心2分鐘。水相用吸尖移至新管中。用2倍體積冰冷的乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，離心10分鐘。沉淀用70％乙醇洗滌，在Speedvac中干燥。質(zhì)粒DNA在20微升雙蒸水中重懸，保存于-20℃。實(shí)施例2DNA測序根據(jù)F.Sanger等人(Sanger，F(xiàn).，Nicklen，S.，和Coulson，A.R.(1977)，美國國家科學(xué)院院(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)745463-54-67，用鏈終止抑制劑進(jìn)行DNA測序)的方法進(jìn)行DNA測序。
用Pharmacia LKB公司的T7測序試劑盒進(jìn)行DNA測序。
變性步驟中，8微升(1.5至2微克)質(zhì)粒DNA與2微升2N NaOH混合，短暫離心后室溫下溫育10分鐘。用3微升3M乙酸鈉，pH4.8，并用7微升雙蒸水和60微升無水乙醇在-70℃下15分鐘沉淀DNA。沉淀的DNA離心10分鐘，用70％乙醇洗滌并干燥。
退火反應(yīng)中，變性的DNA重懸于10微升雙蒸水中，于2微升退火液和2微升引物(40ng)混合。沉淀在37℃下溫育20分鐘，以使引物與模板DNA結(jié)合。在室溫下冷卻反應(yīng)物10分鐘，然后立即用于標(biāo)記反應(yīng)或凍存于-20℃。對于標(biāo)記反應(yīng)，用吸尖將3微升標(biāo)記混合物、1微升[α-P32]dATP和2微升T7聚合酶(T7聚合酶用酶稀釋液以1∶5稀釋)加入退火反應(yīng)沉淀中，短暫混合后室溫下溫育5分鐘。同時，已經(jīng)制備好的用于末端終止反應(yīng)的測序混合物(每管中帶有2.5微升“G”、“A”、“T”和“C”混合物)在37℃預(yù)熱。標(biāo)記反應(yīng)完成后，取其中4微升加入四種測序反應(yīng)混合物的各一種，用吸尖短暫混合。末端終止反應(yīng)在37℃下溫育5分鐘。分別加入5微升終止溶液結(jié)束末端終止反應(yīng)。然后將沉淀轉(zhuǎn)移至95℃的溫育器中變性2分鐘，再置于冰上。按“G”、“A”、“T”、“C”的順序?qū)?.5微升每種反應(yīng)混合物加入測序膠[25.2g尿素、22ml雙蒸水、6ml 10xTBE、10ml聚丙烯酰胺(40％)、2ml過硫酸銨(16mg/ml)、60微升TEMED]。在40瓦和1500伏條件下電泳4.5小時。
權(quán)利要求
1.帶有如圖1所示DNA的序列和其等位變異體的質(zhì)粒。
2.帶有如圖4所示DNA的序列和其等位變異體的質(zhì)粒。
3.帶有或衍生自如圖1所示核苷酸序列的DNA序列。
4.帶有或衍生自如圖4所示核苷酸序列的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的質(zhì)粒或DNA序列在微生物分析和/或診斷中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4的質(zhì)粒或DNA序列在醫(yī)藥和/或營養(yǎng)性生理或微生態(tài)制劑中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4的質(zhì)?；駾NA序列作為表達(dá)載體的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及帶有圖1或圖4所示核苷酸序列的質(zhì)粒和DNA序列以及它們的用途。
文檔編號A61P31/00GK1253590SQ98804447
公開日2000年5月17日 申請日期1998年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月2日
發(fā)明者J·哈克, U·索尼伯恩, J·舒爾茨, G·布路姆-奧赫勒, J·馬林卡, H·普羅比特 申請人:制藥中心有限公司