專利名稱：5位和6位修飾的促性腺素釋放激素拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及一類肽，它們是人促性腺素釋放激素(GnRH)的拮抗劑并且具有有利的物理、化學(xué)和生物特性。更具體地，本發(fā)明涉及十肽，它可抑制性腺功能和類固醇激素孕酮和睪酮的長期釋放，還涉及出于此目的而施用含有該十肽的藥物組合物，尤其是為了抑制性腺類固醇的分泌過多。
背景技術(shù)：
卵泡刺激激素(FSH)和黃體激素(LH)有時被稱為促性腺素或促性腺激素，它們是由通過莖而與下丘腦相連的垂體所釋放的。
垂體前葉釋放激素，通常需要先釋放由下丘腦產(chǎn)生的激素，例如GnRH十肽。
已經(jīng)通過施用對GnRH正常功能有拮抗作用的GnRH拮抗劑，來抑制通常哺乳動物中促性腺激素的分泌并且抑制或延遲排卵。
對GnRH拮抗劑的研究已經(jīng)導(dǎo)致制造出安替德(Antide)，即[Ac-D-2Nal1，D-4ClPhe2，D-3Pal3，Lys(Nic)5，D-Lys(Nic)6，ILys8，D-Ala10]-GnRH；和西曲利斯(Cetrorelix)，即[Ac-D-2Nal1，D-4ClPhe2，D-3Pal3，D-Cit6，D-Ala10]-GnRH。美國專利No.5,516,887描述了據(jù)說比安替德更有效抑制血漿睪酮的GnRH拮抗劑，例如被稱為安他利斯(Antarelix)的[Ac-D-2Nal1，D-4ClPhe2，D-3Pal3，D-N′-氨基甲?；?Lys6，ILys8，D-Ala10]-GnRH。
1994年3月22日授權(quán)的美國專利No.5,296,468公開了許多GnRH拮抗劑的設(shè)計和合成，這些拮抗劑中選定殘基的側(cè)鏈被反應(yīng)以形成氰胍基(cyanoguanidino)部分。其中某些氰胍基隨后自發(fā)地轉(zhuǎn)變成所需的雜環(huán)，即3-氨基-1，2，4-三唑(atz)。這些氰胍基部分是在氨基酸側(cè)鏈的ω-氨基上形成的，例如賴氨酸、鳥氨酸、4-氨基苯丙氨酸(4Aph)或其鏈延伸形式如4-氨基高苯丙氨酸(homophenylalanine)(4Ahp)側(cè)鏈的ω-氨基上。在5位和6位具有重大修飾或非天然氨基酸的GnRH拮抗劑表現(xiàn)出良好的生物效能，而且那些建立在Aph之上的種類通常被認(rèn)為是優(yōu)選的。一種特別優(yōu)選的是Azaline B，即[Ac-D-2Nal1，D-4ClPhe2，D-3Pal3，4Aph(atz)5，D-4Aph(atz)6，ILys8，D-Ala10]-GnRH。美國專利No.5,506,207公開了有生物效力的GnRH拮抗劑，其中在5位和6位殘基的氨基取代的苯丙氨酸側(cè)鏈?zhǔn)酋；模灰环N特別有效的十肽是阿西林(Acyline)，即[Ac-D-2Nal1，D-4ClPhe2，D-3Pal3，4Aph(Ac)5，D-4Aph(Ac)6，ILys8，D-Ala10]-GnRH。
盡管這組GnRH拮抗劑有誘人的性能，但是對于性能更提高的GnRH拮抗劑的研究仍在繼續(xù)，特別是具有長時間生物作用的種類。對于短期和長期的治療癥狀，肽類似物應(yīng)具有相對LH而言的長期活性，這常常是至關(guān)重要的，而這種特性可通過肽在體內(nèi)抗蛋白水解酶降解的抗性而得以提高。此外，為了便于將這些化合物施用于哺乳動物(尤其是人)而沒有明顯的膠凝現(xiàn)象，使這些GnRH拮抗劑十肽在正常生理pH(例如約pH5-pH7.4)下在水中有高溶解性被認(rèn)為是十分有利的。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在這一亞類GnRH拮抗劑(包括西曲利斯，安他利斯，阿西林，安替德等)中，對5-位殘基，或?qū)?位和6位殘基的某些其他修飾，出乎意料地形成了一類化合物，它們在皮下(sc)給藥時具有特別有利的長期生物活性。這些修飾是對4-氨基Phe或其相當(dāng)?shù)?Ahp殘基，或者對4-氨基甲基苯丙氨酸(4Amf)進行的，其中伯胺基與連于4位或?qū)ξ坏募谆噫I合。在這種修飾中，側(cè)鏈的氨基與異氰酸酯反應(yīng)形成脲基，或者與雜環(huán)羧酸反應(yīng)，而該羧酸含有至少2個排列成可形成脲基的氮原子。優(yōu)選的雜環(huán)反應(yīng)劑是D-或L-氫乳清酸(hydroorotic acid)(Hor)(C4N2H5(O)2COOH)和D-或L-2-咪唑酮-4-羧酸(Imz)(C3N2H5(O)COOH)。
通常，具有下式的GnRH拮抗劑十肽和其緊密相關(guān)的類似物以及藥學(xué)上可接受的鹽，被發(fā)現(xiàn)具有更佳的藥理性能，尤其是長期的生物活性X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10其中X是7個碳原子之內(nèi)的酰基或Q，而Q是-CO-NHR，而R是H或低級烷基；A是4Cl、4F、4Br、4NO2、4CH3、4OCH3、3，4Cl2或CαMe4Cl；Xaa5是Aph(Q1)或Amf(Q1)，而Q1是
Xaa6是D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、D-Lys(Nic)、D-Cit、D-Hci或D-Pal，而Q2是For、Ac、3-氨基-1，2，4-三唑、Q或Q1；
Xaa8是Lys(ipr)、Arg、Har、Arg(Et2)或Har(Et2)；和Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol、Ala-ol、NHCH2CH3、Gly-NH2、AzaGly-NH2、Ala-NH2、Agl-NH2、D-Agl-NH2、Agl(Me)-NH2、或D-Agl(Me)-NH2，條件是Xaa5的α-氨基可任選地被甲基化。
或者，當(dāng)Xaa6含有D-或L-Hor、或D-或L-Imz時，Xaa5可具有Ac、For或3-氨基-1，2，4-三唑作為Q1，而當(dāng)Xaa6含有Q時，Xaa5也可含有Q。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種體內(nèi)和體外診斷GnRH所導(dǎo)致的過度激素分泌或腫瘤生長的病癥，該方法包括施用上述類型的GnRH拮抗劑肽，并且監(jiān)測激素的分泌或腫瘤細(xì)胞的增殖。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備GnRH拮抗劑肽的下式中間體X1-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X2)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5其中X1是α-氨基保護基團；A是4Cl或4F；X2是H或羥基保護基團；Xaa5是Aph(Q1)或Amf(Q1)，而Q1是下式任一基團的D-異構(gòu)體、L-異構(gòu)體或D/L異構(gòu)體混合物
Xaa6是D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、或D-Pal，而Q2是Ac、Q1、氨基甲?；⒒蚣谆被柞；籜4是酸不穩(wěn)定的氨基保護基團；和X5是D-Ala-、Gly-、Ala-、Agl-、D-Agl-、Agl(Me)-、或D-Agl(Me)-樹脂載體；N(Et)-樹脂載體；D-Ala、Gly、或Ala的酰胺；乙酰胺、AzaGly-NH2；或OH，條件是Xaa5的α-氨基可任選地被甲基化。
這些拮抗劑特別適用于抑制促性腺素的分泌，并且可作為人的生育調(diào)節(jié)劑，因為它們具有長時間的活性，即可持續(xù)地充分抑制LH分泌至少約4天。它們在生理pH的水性緩沖液中有更好的溶解性，并且在刺激組胺釋放方面具有可接受的副作用，即它優(yōu)于目前臨床使用的GnRH拮抗劑。它們還表現(xiàn)出以有效濃度皮下注射時最低的膠凝現(xiàn)象。這些GnRH拮抗劑還在類過敏測試中表現(xiàn)優(yōu)良，只形成相對較小的疹塊。因此，這些肽特別適用于作為生育調(diào)節(jié)劑而施用于哺乳動物(尤其是人)，以及用于治療許多病癥，如早熟青春期、激素依賴性腫瘤和上述的其他短期和長期病癥。它們還可用于診斷。
因為這些GnRH拮抗劑可輕易地溶解于pH約5-7.4的生理pH范圍，因此它們可以被配制成濃縮形式并施用，尤其在pH約5-7。因為它們的極性特性，它們特別適合在基于已知共聚物的緩釋制劑中使用。因為這些GnRH拮抗劑可有效地長期抑制LH和FSH，因此它們還可特別有效地對雄性哺乳動物(可以施用或不施用睪酮)進行避孕處理以及用于治療類固醇依賴性腫瘤。
優(yōu)選例的詳述過去10-12年中，GnRH序列的10個殘基中每個殘基的特性，已經(jīng)從創(chuàng)制有效拮抗劑的角度進行了深入的研究。作為這些研究的結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)有各種不同的等價殘基可被選擇，而且用這些等價殘基中的一個去替換另一個時不會導(dǎo)致十肽GnRH拮抗劑的生物效能大幅下降?？梢栽诒景l(fā)明的GnRH拮抗劑中進行這些等價取代。
例如，廣為接受的是，在2位上引入對位取代的D-Phe或2，4-二氯取代的D-Phe或D-CαMe4ClPhe或D-五甲基(Me5)Phe殘基，會顯著提高GnRH拮抗劑的活性；然而，當(dāng)環(huán)取代基選自下組時，其具體種類就較不重要了氯、氟、溴、硝基、甲基和烷氧基。因此，這些在2位的殘基被認(rèn)為與常用于2位的D-4ClPhe是等價的。Phe7被認(rèn)為與Leu7等價。N末端優(yōu)選是N-酰基化的，更佳地是乙?；?Ac)化，但也可用其他7個碳原子之內(nèi)的酰基?；?，如甲?；?For)、烯丙?；?Acr)、正丙酰基(Pn)、丁?；?By)、戊?；?Vl)、乙烯乙?；?Vac)和苯甲酰基(Bz)；或者，可以被取代的或未取代的氨基甲?；揎?。其他更長的?；徽J(rèn)為是等價的，但是優(yōu)選度較差。在5位殘基上的α-氨基可任選地被甲基化(如美國專利No.5,110,904中所公開的那樣)，以便提高在水中的溶解度，但是這種修飾會導(dǎo)致對LH抑制時間的縮短而且可能導(dǎo)致釋放更多的組胺。C末端宜為D-Ala-NH2、D-Ala-ol或Ala-ol；然而，Gly-NH2、NHCH2CH3、AzaGly-NH2、Ala-NH2、Agl-NH2、D-Agl-NH2、Agl(Me)-NH2、和D-Agl(Me)-NH2也可替代使用，因為它們被認(rèn)為是等價的。
如上所述，本發(fā)明提供了一組由下式表示的GnRH拮抗劑及其藥學(xué)上可接受的鹽X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10其中X是For、Ac、Acr、Pn、By、Vl、Vac、Bz或Q，而Q是-CO-NHR，而R是H或低級烷基；A是4Cl、4F、4Br、4NO2、4CH3、4OCH3、3，4Cl2或CαMe4Cl；Xaa5是Aph(Q1)或Amf(Q1)，而Q1是
Xaa6是D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、D-Lys(Nic)、D-Cit、D-Hci或D-Pal，而Q2是For、Ac、3-氨基-1，2，4-三唑、Q或Q1；Xaa8是Lys(ipr)、Arg、Har、Arg(Et2)或Har(Et2)；和Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol、Ala-ol、NHCH2CH3、Gly-NH2、AzaGly-NH2、Ala-NH2、Agl-NH2、D-Agl-NH2、Agl(Me)-NH2、或D-Agl(Me)-NH2，條件是Xaa5的α-氨基可任選地被甲基化。
在一組緊密相關(guān)的GnRH拮抗劑中，當(dāng)Xaa6含有的Q2是D-或L-Hor、或D-或L-Imz時，Xaa5所含的Q1可以是Ac、For或3-氨基-1，2，4-三唑。
在另一組緊密相關(guān)的GnRH拮抗劑中，當(dāng)Xaa6含有Q時，Xaa5也可含有Q。
“D-Nal”指在β-碳原子上被萘基所取代的丙氨酸的D-異構(gòu)體，它也被稱為β-D-Nal或3-D-Nal。較佳地，采用D-2Nal，其中萘被連于環(huán)結(jié)構(gòu)的2位上；然而，也可使用D-1Nal。D-Cpa表示氯代-D-Phe，而優(yōu)選的是D-4ClPhe，即D-4Cpa。D-Pal指在β-碳原子上被吡啶基所取代的丙氨酸的D-異構(gòu)體；較佳地，連接是連于吡啶環(huán)的3位，即D-3Pal(β-3-吡啶基-D-Ala)，盡管D-2Pal(β-2-吡啶基-D-Ala)也可替代使用。4Aph指4NH2Phe，其中在苯基環(huán)上的氨基取代基位于4位；3NH2Phe(3Aph)被認(rèn)為在這些類似物中與其是等價的。此外，從生物效能方面考慮，2NH2Phe也是等價的。4Amf指4NH2CH2Phe，其中有個亞甲基連于側(cè)鏈氨基；3NH2CH2Phe(3Amf)被認(rèn)為是等價的。Hor或L-Hor指L-氫乳清酰(基)，而Imz或L-Imz指L-2-咪唑酮-4-羰基，其中任一種都可以D-異構(gòu)體或D/L混合物形式使用。atz指3-氨基-1，2，4-三唑。aph(atz)的已知的更精確的化學(xué)名稱是4-(3′-氨基-1H-1′，2′，4′-三唑基-5′-基)氨基苯丙氨酸。Lys(Nic)指N′-煙酰賴氨酸，即賴氨酸的ε-氨基用3-羧基吡啶進行?；?。D-Cit指瓜氨酸的D-異構(gòu)體，而D-Hci指高瓜氨酸(homocitrulline)的D-異構(gòu)體，它是D-Nε-氨基甲?；嚢彼?。ILys或Lys(ipr)指Nε-異丙基賴氨酸，其中賴氨酸的ε-氨基被烷基化。Ala-ol指2-氨基-1-丙醇，即CH3CH(NH2)CH2OH，而AzaGly-NH2指NHNHCONH2。Har指高精氨酸。Agl指α-氨基甘氨酸。Cbm指氨基甲?；?，MeCbm指甲基氨基甲?；?CONHCH3。低級烷基指C1-C5，較佳地C1-C3，更佳地C1或C2烷基，即甲基(Me)或乙基(Et)。
盡管摻入這些GnRH拮抗劑6位上的優(yōu)選D-異構(gòu)體已被具體地公開，然而應(yīng)理解作為過去20多年在該領(lǐng)域中廣泛研究的結(jié)果，存在許多已知的等價D-異構(gòu)體。這些現(xiàn)有技術(shù)中的D-異構(gòu)體取代與此處所公開的具體5-位取代是相容的，并且無損于所得到的生物效能，因此它們可以被任選地采用。
一小組GnRH拮抗劑具有下式及其藥學(xué)上可接受的鹽X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa10其中X是For、Ac、Acr、Pn、By、Vl、Vac、Bz或Q，而Q是-CO-NHR，而R是H或低級烷基；A是4Cl或4F；Xaa5是Aph(Q1)或Amf(Q1)，而Q1是
Xaa6是D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、D-Cit、D-Lys(Nic)或D-Pal，而Q2是For、Ac、Q或Q1；Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol、Ala-ol、NHCH2CH3或Gly-NH2。
另一小組優(yōu)選的GnRH拮抗劑具有下式，及其藥學(xué)上可接受的鹽X-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa10其中X是Ac或Q，而Q是-CO-NHR，而R是H或甲基；Xaa5是Aph(Q1)或Amf(Q1)，而Q1是
Xaa6是D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、或D-Pal，而Q2是Ac、Q或Q1；和Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol或Ala-ol。
另一小組優(yōu)選的GnRH拮抗劑具有下式，及其藥學(xué)上可接受的鹽MeCbm-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Xaa6-Leu-ILys-Pro-Xaa10其中D-Xaa6是D-4Amf(Q1)、D-4Aph(Q1)、或D-3Pal，而Q1是D-Hor或-CO-NHR，而R是H或低級烷基，較佳地是H或甲基；和Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol或Ala-ol。
本發(fā)明的化合物可以用經(jīng)典的肽溶液合成法進行合成，而且這種合成宜用于大規(guī)模生產(chǎn)。為了獲得有限數(shù)量(如小于1千克)，可以優(yōu)選用固相技術(shù)進行合成。側(cè)鏈保護基團是本領(lǐng)域中眾所周知的，當(dāng)任何具有特別有效或不穩(wěn)定側(cè)鏈的氨基酸被偶聯(lián)于樹脂上的肽鏈時，宜包含這些保護基團作為氨基酸的一部分。這樣的合成可提供全保護的中間體肽-樹脂，例如X1-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X2)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5。
一種可以用來合成GnRH拮抗劑(它在5位和6位具有所需的含氫乳清酰等基團的殘基)的化學(xué)中間體例子，可用下式表示X1-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser(X2)-Aph(X3)-D-Aph(X3)-Leu-ILys(X4)-Pro-X5。在合成該式的肽中間體及其類似物時，采用下文所述的基團X1-X5。
X1是在多肽分步合成領(lǐng)域中已知可以使用的α-氨基保護基團種類，而且當(dāng)X1在所需的肽成分中是一具體的酰基時，該基團可用作保護基團。在X1所覆蓋的α-氨基保護基團種類中，有(1)酰基型保護基團，例如甲?；?For)、三氟乙?；?、鄰苯二甲?；?、對-甲苯磺酰基(Tos)、苯甲?；?Bz)、苯磺?；?、二硫代琥珀?；?dithiasuccinoyl)(Dts)、鄰-硝基苯基亞磺?；?Nps)、三苯甲基亞磺?；?、鄰-硝基苯氧基乙?；⑾┍；?Acr)、氯乙?；?、乙?；?Ac)和γ-氯代丁?；?；(2)芳族氨基甲酸酯型保護基團，例如芐氧基羰基(Z)、芴基甲氧基羰基(Fmoc)和取代的芐氧基羰基如對-氯芐氧基羰基(ClZ)、對-硝基芐氧基羰基、對-溴芐氧基羰基和對-甲氧基芐氧基羰基；(3)脂族氨基甲酸酯型保護基團，如叔丁氧基羰基(Boc)、二異丙基甲氧基羰基、異丙氧基羰基、乙氧基羰基和烯丙氧基羰基；(4)環(huán)烷基氨基甲酸酯型保護基團，如環(huán)戊氧基羰基、金剛烷氧基羰基和環(huán)己氧基羰基；(5)硫代氨基甲酸酯型保護基團，如苯基硫代羰基；(6)烷基型保護基團，如烯丙基(Aly)、三苯基甲基(三苯甲基)和芐基(Bzl)；(7)三烷基硅烷基團，如三甲基硅烷。優(yōu)選的α-氨基保護基團是Boc。
X2是用于絲氨酸的羥基側(cè)鏈的保護基團，如Ac、Bz、三苯甲基、2，6-二氯芐基(DCB)或芐基醚(Bzl)。較佳地是Bzl。
X3是側(cè)鏈氨基的保護基團，該側(cè)鏈氨基在α-氨基保護基團或其他的氨基保護基團被去除時并不被去除。代表性的例子包括(1)堿不穩(wěn)定基團，如Fmoc或其他一些弱酸穩(wěn)定型、芳族氨基甲酸酯型保護基團；(2)硫醇不穩(wěn)定基團，如二硫代琥珀?；?Dts)，它可通過硫解而去除或切除；(3)肼不穩(wěn)定基團，如鄰苯二甲?；?Pht)，它可通過肼解作用(hydrazinolysis)而切除；(4)親核試劑不穩(wěn)定基團，如鄰-硝基苯基亞磺酰基(Nps)等，它們可通過硫代乙酰胺或通過弱酸或其鹽而被切除；(5)光不穩(wěn)定基團，它們可通過光解而被切除；和(6)可通過還原而選擇性切除的基團，如Dts。對于Boc SPPS策略，F(xiàn)moc是優(yōu)選的。
X4是伯胺或仲胺側(cè)鏈基團的酸不穩(wěn)定性保護基團，如Z或2ClZ。
X5是D-Ala-、Gly-、Ala-、Agl-、D-Agl-、Agl(Me)-或D-Agl(Me)-NH-[樹脂載體]、或N(Et)-[樹脂載體]；X5還可以是Gly或Ala或D-Ala的酰胺，直接連于Pro的低級烷基取代的酰胺，AzaGly-NH2、或-OH(游離酸)。當(dāng)X5是游離酸時，中間體是九肽片段，它被設(shè)計成可偶聯(lián)于D-或L-2-氨基-1-丙醇以形成在C端為醇的十肽。
選擇側(cè)鏈保護基團X2-X4的標(biāo)準(zhǔn)是，在每步合成步驟中，保護基團在選定的去除α-氨基保護基團(較佳地是Boc)的反應(yīng)條件下應(yīng)總體是穩(wěn)定的。這些保護基團通常在偶聯(lián)條件下是不發(fā)生斷裂，但是在所需的氨基酸序列合成結(jié)束之后，可以在不改變肽鏈的反應(yīng)條件下被去除。正如下文所解釋的那樣，在從樹脂上切下最終的肽之前，最初用于5位和6位殘基的保護基團宜被去除，并且進行選擇性反應(yīng)。如果十肽中間體是如上所述合成的，那么X3保護基團可單獨去除是有利的。
當(dāng)X5基團是D-Ala-NH-[樹脂載體]時，用酰胺鍵將D-Ala連于BHA樹脂或MBHA樹脂；這也同樣適用于當(dāng)Agl或D-Agl被用于C末端時的情況。當(dāng)X5是N(Et)-[樹脂載體]時，用乙酰胺鍵將Pro連于N-烷基氨基甲基樹脂(NAAM)。
當(dāng)N-末端需乙?；瘯r，例如可以用乙?；鳛?位上β-D-Nal的α-氨基的X1保護基團，即通過在氨基酸被偶聯(lián)于肽鏈之前將其加至氨基酸；然而，反應(yīng)最好用固定于樹脂上的肽中間體進行。在將α-氨基去保護之后而所需的側(cè)鏈基團仍被保護時，乙?；磻?yīng)宜用乙酸酐進行，或者反應(yīng)可以在二異丙基或二環(huán)己基碳化二亞胺(DIC或DCC)存在下用乙酸進行，或者通過本領(lǐng)域中已知的其他合適的?；磻?yīng)。當(dāng)在N末端需要氨基甲酰基或取代的氨基甲?；鶗r，可用類似的程序。當(dāng)去保護的側(cè)鏈氨基被修飾而殘基是肽鏈的一部分時，反應(yīng)可在合適的堿(如N，N-二異丙基乙胺(DIEA))存在下用合適的異氰酸酯進行，盡管使用堿是任選的。當(dāng)在最終產(chǎn)物中需要未取代的氨基甲?；鶗r，可將去保護的氨基側(cè)鏈與異氰酸芐酯、對-甲苯磺酰異氰酸酯、異氰酸三甲基甲硅烷酯或異氰酸叔丁酯反應(yīng)，其中異氰酸叔丁酯是優(yōu)選的。使用這種策略，叔丁基部分可在從樹脂上切除過程中被去除，留下氨基甲酰基。
本發(fā)明還提供了一種制備這些具有例如下式的GnRH拮抗劑的新方法Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2，該方法包括(a)形成具有下式的中間體肽Boc-D-4Aph(X3)-Leu-ILys(X4)-Pro-X5，其中X3是用于氨基的堿不穩(wěn)定的、肼不穩(wěn)定的或其他合適的不穩(wěn)定的保護基團；X4是用于氨基側(cè)鏈的酸不穩(wěn)定的保護基團；而X5是D-Ala-NH[樹脂載體]；(b)將X3從D-4Aph上去除，以使中間體肽的該氨基酸殘基的側(cè)鏈伯胺基團去保護；(c)將該去保護的側(cè)鏈伯胺與乙酸酐反應(yīng)；(d)完成鏈的延長，形成中間體X1-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(X2)-4Aph(X3)-D-4Aph(Ac)-Leu-Ilys(X4)-Pro-X5，其中X1是氫或α-氨基保護基團，而X2是氫或絲氨酸羥基的保護基團；(e)對N末端的α-氨基進行去保護，然后進行乙?；?；(f)將X3從4Aph上去除，并將去保護的伯胺基團與氫乳清酸反應(yīng)；以及(g)將余下的保護基團去除和/或從X5中所包括的樹脂載體上切下。
肽的最終純化用色譜法，較佳地用RP-HPLC實現(xiàn)，這是本領(lǐng)域中已知的，參見J.Rivier等人，J.Chromatography，288，303-328(1984)以及C.Miller和J.Rivier，Biopolymers(Peptide Science)，40，265-317(1996)。
當(dāng)在發(fā)情前期當(dāng)天的中午左右時皮下施用時，本發(fā)明的GnRH拮抗劑被認(rèn)為在低于100微克/千克體重的水平下，可有效地阻止雌性大鼠的排卵。對于長時間抑制排卵，可能需要施用的劑量水平約為0.1-2.5毫克/千克體重。當(dāng)按常規(guī)基礎(chǔ)給雄性哺乳動物施用時，該拮抗劑還可有效的阻止精子形成，因此它可用作避孕劑。因為這些化合物會降低睪酮的水平和由此引起性欲(在正常的、性欲有效的男性中有不良后果)，因此可一起施用替換劑量的睪酮和GnRH拮抗劑來使精子缺乏同時維持性欲。這些拮抗劑還可用于調(diào)節(jié)促性腺素和性類固醇的產(chǎn)生，以及用于上述的其他長期或短期病癥。它們還可在獸醫(yī)上用作寵物的避孕劑。
本發(fā)明所提供的肽在生理pH下特別易溶，因而可制成較濃的溶液以供施用，尤其是用于皮下注射。當(dāng)以有效濃度皮下施用時，這些肽在體內(nèi)有良好的忍受性，并且不會膠凝。通常，包含這類肽和合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物，可通過iv、ip、皮下等方式施用，施用水平約為0.001毫克-約2.5毫克/千克體重/每天，通常0.5毫克/千克/天就足夠了。
合適地保護的含D-或L-氫乳清?；?、含氨基甲?；?或含D-或L-咪唑酮羰基的氨基酸，可以被合成，然后用于鏈延伸式肽合成中。然而，通過先將合適保護的Aph、D-Aph/Amf或D-Amf殘基摻入肽中間體中的所需位置，也可同樣有效地進行合成。而這是在最初僅需要少量的情況下所選擇的實驗室方法。這后一種方法的實現(xiàn)可通過隨后使特定殘基去保護(或者立刻去保護或者隨后在合成過程中去保護)，然后將去保護的側(cè)鏈氨基與所需試劑反應(yīng)。
結(jié)合下面的實施例進一步地描述本發(fā)明。
實施例1已發(fā)現(xiàn)，下式的肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-Lys(Nic)-D-Lys(Nic)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2(安替德)，具有非常優(yōu)良的作為GnRH拮抗劑的生物活性，而目前被稱為阿西林的肽也有此活性并且與安替德的區(qū)別僅在5位和6位。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，用這些分子作為起點并且通過在5位和6位，或者十肽阿西林的5位上進行其他的取代，可獲得體內(nèi)生物活性持續(xù)時間更長的GnRH拮抗劑。對于1-4位以及7-10位而言，應(yīng)注意，安替德、阿西林和Azaline都是完全相同的。
通過固相合成法，合成下列十肽[4Aph(Hor)5，D-4Aph(Cbm)6]-安替德或[Ac-D-2Nal1，D-4Cpa2，D-3Pal3，4Aph(Hor)5，D-4Aph(Cbm)6，Ilys8，D-Ala10]-GnRH。該肽具有下式Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Aph(氨基甲酰基)-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。
最初使用約0.50克(0.54mmol/g)MBHA樹脂(Bachem)，然后用約0.65毫摩爾Boc衍生物和二異丙基碳化二亞胺(DIC)和無水1-羥基苯并三唑(HOBt)作為活化劑或偶聯(lián)劑，在二甲基甲酰胺(DMF)/CH2Cl2中反應(yīng)2小時而將受Boc-保護的D-Ala偶聯(lián)于樹脂。D-Ala殘基通過酰胺鍵連于MBHA樹脂。
在偶聯(lián)上每個氨基酸殘基之后，按下列手工合成程序，對約0.5-1克起始樹脂進行洗滌、去保護然后再偶聯(lián)下一個氨基酸殘基
在第一個氨基酸被固定之后，將上述程序用于本發(fā)明肽的每個氨基酸的偶聯(lián)。在整個合成過程中，對每個偶聯(lián)的氨基酸進行NαBoc保護。NαBoc-β-D-2Nal是用本領(lǐng)域中已知的方法制備的，例如根據(jù)美國專利No.4,234,571中詳細(xì)描述的方法；它也從SyntheTech，Oregon，USA購得。在5位的4Aph或6位的D-4Aph中的側(cè)鏈伯胺基團是用Fmoc保護。芐基醚(Bzl)優(yōu)選用作絲氨酸羥基的側(cè)鏈保護基團；然而，絲氨酸也可在沒有側(cè)鏈保護的情況下偶聯(lián)。NαBoc-Lys(ipr，Z)被用于8位殘基。
以NαBoc-D-4Aph(Fmoc)形式添加了6位殘基的D-4Aph之后，存在下列中間體Boc-D-4Aph(Fmoc)-Leu-Lys(ipr，Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA樹脂載體]。然后，在6位殘基上的側(cè)鏈氨基，在先去除側(cè)鏈保護之后被修飾。Fmoc保護基團是通過用25％哌啶的DMF(10毫升)溶液逐次地各處理15分鐘而去除的。在用DMF洗滌肽-樹脂后，將新的游離氨基用20倍過量的異氰酸叔丁酯的DMF溶液在室溫下處理約12小時，或者直至反應(yīng)完成(用水合茚三酮測試檢測)。接著，對肽-樹脂進行標(biāo)準(zhǔn)洗滌，然后去除Boc以便添加下一個殘基。
然后，以NαBoc-4Aph(Fmoc)形式添加5位殘基。接著，如前對其側(cè)鏈進行去保護，反應(yīng)的進行是用0.10克(0.66mmol)L-氫乳清酸、90毫克(0.66mmol)HOBt和0.66mmol DIC在3毫升DMF中，于室溫下反應(yīng)約8小時，或者直至用標(biāo)準(zhǔn)水合茚三酮測試反應(yīng)結(jié)束。在洗滌和去除NαBoc之后，通過依次與NαBoc-Ser(Bzl)、NαBoc-D-3Pal、NαBoc-4Cpa、和NαBoc-D-2Nal的反應(yīng)而完成十肽的合成。
在用三氟乙酸(TFA)對N末端的α-氨基去保護之后，用在二氯甲烷(DCM)中大為過量的乙酸酐處理30分鐘而實現(xiàn)乙?；??；蛘?，在完成了N末端的乙?；?，才對4Aph去除Fmoc保護，之后進行與L-氫乳清酸的反應(yīng)。
肽-樹脂被干燥，隨后加入苯甲醚(0.5毫升)作為清除劑，而將肽從樹脂上切下以及絲氨酸和賴氨酸側(cè)鏈的去保護是在約0℃，用15毫升HF處理約1.5小時，并除去殘留的叔丁基部分。在真空下去除了HF之后，用100毫升二乙醚洗滌樹脂2次。切下的肽用在25％CH3CN/H2O中的0.2％TFA萃取，重復(fù)該程序并且每次用100毫升。萃取液被合并和凍干，它們提供了約600毫克肽粗產(chǎn)物粉末。
接著，通過制備性的反相高效液相色譜(RP-HPLC)實現(xiàn)對肽的純化。RP-HPLC是本領(lǐng)域中已知的，并且在Rivier等人，J.Chromatography，288，303-328(1984)中有詳細(xì)描述。第一次制備性RP-HPLC分離用TEAP(磷酸三乙基銨)緩沖體系，最后的分離是用0.1％TFA(三氟乙酸)梯度進行(這在J.Chromatography文章中都有詳細(xì)描述)。
用毛細(xì)管區(qū)電泳(CZE)對該肽(約30毫克)(下文簡稱為肽No.1)進行評判，發(fā)現(xiàn)基本上是均質(zhì)的，而且估算出純度約為98％。對純化的肽進行的氨基酸分析與所欲制備的結(jié)構(gòu)式子是相符的。用液相次級離子質(zhì)譜(LSIMS)測定的分子量為1631.9Da，這與該肽的預(yù)計分子量1631.8Da是一致的。
用RP-HPLC通過測量保留時間來測試親水性，其中用40％緩沖液B至70％緩沖液的梯度30分鐘，而緩沖液A是TEAP(pH7.0)而緩沖液B是70％CH3CN和30％緩沖液A。肽No.1比阿西林更親水，比阿西林更早洗脫下來。其在pH約5-7的水性緩沖液中的溶解性，抗體內(nèi)膠凝，以及長時間的抑制循環(huán)LH水平的生物效能(如下所述)，使得該肽與其他總體具有相近生物效力的其他化合物相比，特別適用于通過皮下注射進行給藥。
對該肽進行體內(nèi)測試，以確定它在大鼠中抑制LH分泌的效力。按C.Rivier等人，Biol.Reproduc.1983，29，374-378中所述的方法，對用肽皮下處理過的閹割雄性Sprague-Dawley大鼠中的循環(huán)LH水平進行測量。先將肽以1.0或10毫克/毫升的濃度溶解于抑菌水中，然后在含0.1％BSA的0.04M磷酸鹽緩沖液中進一步稀釋。隨后的稀釋液在磷酸鹽緩沖液中制備。將肽皮下注射入5只大鼠，在METOTANE麻醉下采集血液樣品(300微升)。用NIDDK的National Pituitary andHormone Distribution Program所提供的試劑測試血清(50微升)的LH水平，一式兩份。測試表明，在注射后的96小時整個期間內(nèi)，劑量為50微克肽/大鼠可抑制LH分泌，降至遠(yuǎn)低于50％對照水平。此外，在96小時后測得的水平僅為用50微克劑量阿西林類似注射過的大鼠中LH水平的30％。肽No.1被認(rèn)為是非常長效的。大鼠試驗表明，該肽有非常好的耐受性，而且在注射部位沒有可檢測的明顯膠凝現(xiàn)象。
對大量GnRH拮抗劑的測試所獲得的經(jīng)驗表明，表現(xiàn)出這種長期的對LH抑制作用的肽，如果在成熟的雌性Sprague-Dawley大鼠中進行體內(nèi)測試的話，會在2.5毫克的劑量下完全阻止排卵。
實施例1A重復(fù)實施例1中所述的合成過程，并用NαBoc-D-4Amf(Fmoc)替換NαBoc-D-4Aph(Fmoc)。在對D-4Amf側(cè)鏈去保護之后，如前進行與異氰酸叔丁酯的反應(yīng)。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-Amf(氨基甲?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2，然后加以評估發(fā)現(xiàn)基本均質(zhì)，其估算的純度大于99％。MS分析表明分子量為1645.9Da，這與預(yù)計的分子量1645.8Da很相近。根據(jù)HPLC結(jié)果，可以看出該肽比阿西林更親水。
在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠LH抑制測試中對該肽的測試表明，在50微克劑量下，在1、2、和3天可與阿西林同樣有效地抑制LH水平。在96小時時，LH水平僅為用阿西林注射過的大鼠中的約25％。肽No.1A被認(rèn)為是非常長效的。
實施例1B
為了形成類似物[4Aph(Hor)5]-阿西林，重復(fù)實施例1中所述的合成過程，并在與去保護的6位側(cè)鏈反應(yīng)時用乙酸酐替換異氰酸叔丁酯。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Aph(乙?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)該肽基本均質(zhì)，其估算的純度大于99％。MS分析表明分子量為1630.6Da，這與計算的分子量1630.8Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在1-4天與阿西林幾乎同樣有效。對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是非常長效的。
實施例1C重復(fù)實施例1B中所述的合成過程，并用D/L氫乳清酸替換L-氫乳清酸以形成異構(gòu)體十肽。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-氫乳清酰)-D-4Aph(乙?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)是兩種化合物的均勻混合物而沒有其他雜質(zhì)。MS分析表明分子量為1630.6Da，這與計算的分子量1630.8Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在1-4天與阿西林幾乎同樣有效。對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是長效的。
實施例1D重復(fù)實施例1B中所述的合成過程，并用D-氫乳清酸替換L-氫乳清酸以形成異構(gòu)體十肽。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-氫乳清酰)-D-4Aph(乙?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)其基本上是均質(zhì)的。MS分析表明分子量為1630.8Da，這與計算的分子量1630.8Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽在1-4天具有與阿西林幾乎相同有效的長期抑制LH的生物活性。
實施例1E重復(fù)實施例1B中所述的合成過程，并用NαBoc-D-4FPhe替換NαBoc-D-4ClPhe以形成十肽[D-4FPhe2，4Aph(Hor)5]-阿西林。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Fpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Aph(乙酰基)-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的。MS分析表明分子量為1615.1Da，這與計算的分子量1614.8Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在1-4天與阿西林幾乎同樣有效。對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是長效的。
實施例1F重復(fù)實施例1B中所述的合成過程，并用NαBoc-4Amf(Fmoc)替換NαBoc-4Aph(Fmoc)以形成十肽[4Amf(Hor)5]-阿西林。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-氫乳清酰)-D-4Aph(乙?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的，估計純度大于98％。MS分析表明分子量為1644.7Da，這與計算的分子量1644.8Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在1-4天與阿西林幾乎同樣有效。對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是長效的。
實施例1G重復(fù)實施例1中所述的合成過程；然而不將D-4Aph的側(cè)鏈氨基與異氰酸叔丁酯反應(yīng)，而是將其和4Aph殘基同時與氫乳清酸反應(yīng)，從而形成十肽[4Aph(Hor)5，D-4Aph(Hor)6]-安替德。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Aph(L-氫乳清酰)-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的，估計純度大于99％。MS分析表明分子量為1728.4Da，這與計算的分子量1728.8Da是相符的。HPLC結(jié)果表明，該肽比Azaline B更親水，而Azaline B又比阿西林更親水。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在1-4天與阿西林幾乎同樣有效。對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是長效的。
重復(fù)該合成過程，并用NαBoc-D-4Amf(Fmoc)替換NαBoc-D-4Aph(Fmoc)，從而形成十肽[4Aph(Hor)5，D-Amf(Hor)6]-安替德。該肽在抑制LH分泌方面總體上有生物效力。
實施例1H重復(fù)實施例1中所述的合成過程；然而不將D-4Aph的側(cè)鏈氨基與異氰酸叔丁酯反應(yīng)，而是將其與D-氫乳清酸反應(yīng)，從而形成十肽[4Aph(Hor)5，D-4Aph(D-Hor)6]-安替德。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Aph(D-氫乳清酰)-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的，估計純度大于98％。MS分析表明分子量為1728.7Da，這與計算的分子量1728.8Da是相符的。HPLC結(jié)果表明，該肽比Azaline B更親水，而Azaline B又比阿西林更親水。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在1-3天與阿西林幾乎同樣有效。在第4天時，它明顯比阿西林更有效，因而對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是非常長效的。
實施例1J十肽[MeCbm-D-2Nal1，4Aph(Hor)5]-阿西林的合成基本上按實施例1B中所述的程序進行；然而，不同點在于不是將Fmoc-保護基團在添加了NαBoc-4Apb(Fmoc)之后立刻去除，而是在樹脂上完成十肽的合成。然后，使N末端去保護之后，與異氰酸甲酯(而不是與乙酸酐)進行反應(yīng)，從而在N末端形成甲基氨基甲?；?。接著，去除Fmoc，與實施例1B相同將4Aph的側(cè)鏈氨基與L-氫乳清酸反應(yīng)。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽甲基氨基甲?；?D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Aph(乙酰基)-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的，估計純度大于99％。MS分析表明分子量為1645.7Da，這與計算的分子量1645.8Da是相符的。HPLC結(jié)果表明，該肽比Azaline B更親水，而Azaline B又比阿西林更親水。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在1-3天與阿西林幾乎同樣有效，在96小時后效力高50％。對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是非常長效的。
實施例1K重復(fù)實施例1中所述的合成過程，并用NαBoc-D-3Pal替換NαBoc-D-4Aph(Fmoc)而且省略了隨后與異氰酸叔丁酯的反應(yīng)，從而形成十肽[4Aph(Hor)5，D-3Pal6]-安替德。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽乙?；?D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-3Pal-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的，估計純度大于99％。MS分析表明分子量為1574.7Da，這與計算的分子量1574.7Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在3天中與阿西林幾乎同樣有效；然而在96小時后，它表現(xiàn)出將LH水平抑制至阿西林的約35％。因而對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是非常長效的。
實施例1L重復(fù)實施例1G中所述的合成過程；并用異氰酸叔丁酯替換氫乳清酸，從而形成十肽[4Aph(Cbm)5，D-4Aph(Cbm)6]-安替德。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(氨基甲?；?-D-4Aph(氨基甲?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的，估計純度大于99％。MS分析表明分子量為1534.9Da，這與計算的分子量1534.7Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且在4天內(nèi)與阿西林幾乎同樣有效。對于抑制LH而言，該肽被認(rèn)為是長效的。
實施例1M重復(fù)實施例1G中所述的合成過程；并用異氰酸甲酯替換氫乳清酸，從而形成十肽[4Aph(MeCbm)5，D-4Aph(MeCbm)6]-安替德。如實施例1所述，將肽從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(甲基氨基甲?；?-D-4Aph(甲基氨基甲?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的，估計純度大于99％。MS分析表明分子量為1562.8Da，這與計算的分子量1562.8Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽是有生物活性的并且對于抑制LH而言在2天內(nèi)與阿西林幾乎同樣有效，然而開始有所下降。
實施例2肽[4Aph(Hor)5，D-Cit6]-安替德是肽西曲利斯的類似物，它具有下式Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。它基本上是用實施例1的合成方法合成的。用NαBoc-D-Cit代替NαBoc-D-4Aph而偶聯(lián)于6位?；蛘撸瑢αBoc-D-Orn(Fmoc)偶聯(lián)于6位，然后在獲得了下式的肽中間體后暫時中止鏈的延伸Boc-D-Orn(Fmoc)-Leu-Lys(ipr，Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA樹脂載體]。如實施例1將Fmoc保護去除，從而使Orn殘基上的氨基酸側(cè)鏈去保護。將中間體用過量的異氰酸叔丁酯的DMF溶液室溫處理約6小時，從而與Orn殘基的側(cè)鏈反應(yīng)。然而，如實施例1完成十肽中間體的合成。
接著如實施例1所述，對肽-樹脂進行洗滌、切下和去保護，然后純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它基本上是均質(zhì)的，估計純度大于99％。LSIMS分析表明測量的分子量為1583.7Da，這與該肽的計算分子量1583.8Da是相符的。
該肽比西曲利斯更親水，而且當(dāng)如實施例1在體內(nèi)測試對LH分泌的抑制時，表現(xiàn)出與西曲利斯同樣長效的生物活性。在3天時該肽的抑制性稍好，而在96小時時明顯更好。
實施例2A肽安替德的一種類似物，即[4Aph(Hor)5]-安替德，是基本上按照美國專利No.5,169,935的實施例1中所述的合成法合成的。將NαBoc-D-Lys(Frnoc)偶聯(lián)于6位之后，在去保護后將其與過量煙酸的DMF溶液反應(yīng)。然后，將NαBoc-Aph(Fmoc)偶聯(lián)于5位，再如實施例1那樣對Aph殘基上的氨基側(cè)鏈去保護。將中間體與DMF中的L-氫乳清酸反應(yīng)，按實施例1那樣完成十肽中間體的合成。
在標(biāo)準(zhǔn)洗滌之后，如實施例1所述，從樹脂上切下、去保護，然后純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-Lys(Nic)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。該肽被認(rèn)為比西曲利斯更親水，而且表現(xiàn)出與西曲利斯同樣長效的抑制LH分泌的生物活性。
實施例3基本上按實施例1B的方法，合成類似物[4Aph(D/L-Imz)5]-阿西林，不同點在于用D/L-Imz替換L-Hor。因此，在對5位的4Aph去保護后，用過量的D/L-2-咪唑酮-4-羧酸、約90mg HOBt和約0.66mmol DIC的DMF溶液在室溫下處理中間體約6小時。然后如實施例1那樣完成十肽中間體的合成。
如實施例1所述，對肽-樹脂進行洗滌、切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-咪唑酮-4-羰基)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它是兩種化合物的均相混合物而沒有其他雜質(zhì)。LSIMS分析表明分子量為1602.7Da，這與該肽的計算分子量1602.8Da是相符的。
如實施例1在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試中對該肽進行測試。結(jié)果表明，在50微克劑量下，該肽表現(xiàn)出可長時間抑制LH分泌。在3天和96小時時，其抑制作用稍優(yōu)于阿西林。
實施例3A重復(fù)實施例3的合成過程，并用過量的L-2-咪唑酮-4-羧酸替換D/L-Imz。形成的肽經(jīng)評估是基本均質(zhì)的，而且估計純度約為99％。LSIMS分析表明分子量為1602.5Da，這與該肽的計算分子量1602.8Da是相符的。該肽比阿西林更易溶于水。
如實施例1進行測試。在50微克劑量下，該肽表現(xiàn)出可長時間抑制LH分泌，在96小時期間與阿西林幾乎等效。
實施例3B重復(fù)實施例3的合成過程，并用過量的D-2-咪唑酮-4-羧酸替換D/L-Imz。獲得所形成的肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-Imz)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。LSIMS分析表明分子量為1602.6Da，這與該肽的計算分子量1602.8Da是相符的。該肽比阿西林更易溶于水。
如實施例1進行測試。該肽有生物活性，并且在50微克劑量下，該肽表現(xiàn)出抑制LH分泌。
實施例3C用實施例1A的方法(引入D-4Amf(Cbm)6)和實施例3A的方法(引入4Aph(Imz)5)的組合方法，合成肽[4Aph(Imz)5，D-4Amf(Cbm)6]-阿西林。通過RP-HPLC純化，獲得肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Imz)-D-4Amf(氨基甲酰基)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。經(jīng)評估它是基本均質(zhì)的，而且估計純度大于98％。LSIMS分析表明分子量為1617.6Da，這與該肽的計算分子量1617.8Da是相符的。如實施例1對該肽進行測試。在50微克劑量下，該肽表現(xiàn)出可長時間抑制LH分泌。在3天內(nèi)它與阿西林基本等效，在96小時時具有稍更好的抑制作用。
實施例4基本上按實施例1A的合成方法，合成肽[4Aph(Hor)5，D-4Amf(MeCbm)6]-安替德，該肽具有下式Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。不將6位上的D-4Amf與過量異氰酸叔丁酯的DMF溶液反應(yīng)，而是將其與異氰酸甲酯反應(yīng)。然后如實施例1A那樣完成十肽中間體的合成。
如實施例1所述，對肽-樹脂進行洗滌、切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它是基本均質(zhì)的，估計純度大于99％。LSIMS分析表明分子量為1659.8Da，這與該肽的計算分子量1659.8Da是相符的。
用標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試法對該肽進行分析表明，在50微克劑量下，該肽No.4表現(xiàn)出優(yōu)于阿西林的對LH分泌的抑制作用，因而被認(rèn)為具有非常長效的生物活性。
實施例4A重復(fù)實施例4的合成過程，并用乙酸酐替換異氰酸甲酯，從而形成肽[4Aph(Hor)5，D-4Amf(Ac)6]-安替德。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳清酰)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。經(jīng)評估分析它是基本均質(zhì)的，而且估計純度大于99％。LSIMS分析表明分子量為1644.5Da，這與該肽的計算分子量1644.8Da是相符的。
如實施例1在50微克劑量下對該肽進行測試。它表現(xiàn)出長時間的生物活性。在抑制LH分泌方面，在3天內(nèi)它與阿西林等效而在96小時時稍好于阿西林。
實施例4B制備一種在實施例1A中制備和測試過的十肽的修飾形式，它在C末端具有D-2-氨基-1-丙醇(D-alaninol)而不是丙氨酰胺(alanylamide)。首先，基本上按實施例1A中所述的合成法(但是使用Merrifield樹脂(氯甲基化的交聯(lián)聚苯乙烯)，例如可從Bachem，Inc.獲得的樹脂)合成九肽片段，它在C末端具有作為游離氨基酸的脯氨酸。在切割、去保護和純化后，獲得下列九肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH。將0.15mmol完全去保護和經(jīng)HPLC純化的九肽溶解于3毫升無水DMF和3.0mmol D-2-氨基-1-丙醇(LancasterChemical)。接著，加入偶聯(lián)劑0.60mmol PyBOP(Novabiochem)(固體)，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘。通過加入200毫升水而使反應(yīng)終止，形成一乳狀液。通過用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至2.5而使其轉(zhuǎn)變?yōu)槌吻迦芤?。形成的十肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol，用制備性RP-HPLC純化，其中用TEAP(pH2.3)作為緩沖液，然后再用0.1％TFA作為緩沖液再次純化。形成的肽經(jīng)評估發(fā)現(xiàn)基本均質(zhì)，其估算純度約為99％。MS分析表明分子量為1632.9Da，這與預(yù)計的分子量1632.8Da很相近。
如實施例1，在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠LH抑制測試中對該肽的測試表明，在50微克劑量下，該肽有生物活性而且這種生物活性持續(xù)至少96小時。該肽被認(rèn)為是非常長效的。
實施例4C重復(fù)實施例4B的合成過程，并用3.0毫摩爾L-2-氨基-1-丙醇(AldridgeChemical)替換混合物中的D-2-氨基-1-丙醇。形成的肽如實施例4B進行純化，并經(jīng)評估發(fā)現(xiàn)基本均質(zhì)，其估算純度大于約98％。MS分析表明分子量為1632.9Da，這與預(yù)計的分子量1632.8Da很相近。
如實施例1，在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠LH抑制測試中對該肽的測試表明，在50微克劑量下，該肽有生物活性而且這種生物活性持續(xù)至少96小時。該肽被認(rèn)為是非常長效的。
實施例4D制備一種在實施例1中制備和測試過的十肽的修飾形式，它在C末端具有D-2-氨基-1-丙醇而不是丙氨酰胺?；旧习磳嵤├?A中所述的合成法(但是使用Merrifield樹脂上的SPPS)合成九肽片段，它在C末端具有作為游離氨基酸的脯氨酸。在切割、去保護和純化后，獲得下列九肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH。再如實施例4B將純化的九肽與D-2-氨基-1-丙醇反應(yīng)，然后如實施例4B用制備性RP-HPLC純化形成的十肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol，不同點在于使用pH6.5的TEAP替換pH2.3的TEAP。形成的肽經(jīng)評估發(fā)現(xiàn)基本均質(zhì)，其估算純度大于約99％。MS分析表明分子量為1618.9Da，這與預(yù)計的分子量1618.8Da相符。體內(nèi)分析該肽表明，它具有生物活性。
實施例4E重復(fù)實施例4D的合成過程，并用L-2-氨基-1-丙醇替換D-2-氨基-l-丙醇。如實施例4D用制備性RP-HPLC純化形成的十肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-Ala-ol。形成的肽經(jīng)評估發(fā)現(xiàn)基本均質(zhì)，其估算純度大于99％。MS分析表明分子量為1618.9Da，這與計算的分子量1618.8Da相符。體內(nèi)分析該肽表明，它具有生物活性。
實施例5基本上按實施例1A的合成方法，合成肽[4Aph(D-Hor)5，D-4Amf(Cbm)6]-安替德，該肽具有下式Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-氫乳清酰)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。不將5位上的4Aph與L-氫乳清酸反應(yīng)，而是將側(cè)鏈與D-氫乳清酸反應(yīng)。然后如實施例1A那樣完成十肽中間體的合成。
對肽-樹脂進行標(biāo)準(zhǔn)洗滌，然后如實施例1所述從樹脂上切下和去保護，隨后進行純化。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-氫乳清酰)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。評估后發(fā)現(xiàn)它是基本均質(zhì)的，估計純度大于98％。LSIMS分析表明分子量為1645.8Da，這與該肽的計算分子量1645.8Da是相符的。
用標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)大鼠測試法對該肽進行分析表明，在50微克劑量下，該肽表現(xiàn)對LH分泌的長期抑制作用，在2天內(nèi)與阿西林幾乎等效，而在72小時和96小時時繼續(xù)發(fā)揮稍低的抑制作用。
實施例5A重復(fù)實施例5的合成過程，不同點在于用乙酸酐替換異氰酸甲酯與4Amf的去保護側(cè)鏈反應(yīng)。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-氫乳清酰)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。經(jīng)評估分析它是基本均質(zhì)的，而且估計純度大于99％。LSIMS分析表明分子量為1644.7Da，這與該肽的計算分子量1644.8Da是相符的。
如實施例1對該肽進行測試。在50微克劑量下，該肽在3天內(nèi)表現(xiàn)出與阿西林基本等效的對LH分泌的抑制作用；而在96小時時，表現(xiàn)出優(yōu)于阿西林的對LH分泌的抑制作用。
實施例6基本上重復(fù)實施例1F的合成過程，不同點在于對于6位殘基用NαBoc-D-4Amf(Fmoc)代替NαBoc-D-4Aph(Fmoc)，從而形成十肽[4Amf(Hor)5，D-4Amf(Ac)6]-安替德。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-氫乳清酰)-D-4Amf(乙酰基)-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。經(jīng)評估分析它是基本均質(zhì)的，而且估計純度大于99％。MS分析表明分子量為1658.7Da，這與計算分子量1658.8Da是相符的。
如實施例1對該肽進行測試。在50微克劑量下，發(fā)現(xiàn)該肽可長時間抑制LH分泌。在最先2天內(nèi)它與阿西林基本等效，而在3天或4天時表現(xiàn)出與阿西林幾乎相同的生物效能。
實施例6A重復(fù)實施例6的合成過程，不同點在于D-4Amf的去保護側(cè)鏈不與乙酸酐反應(yīng)，而是將其如實施例1那樣與異氰酸叔丁酯反應(yīng)，從而形成肽[4Amf(Hor)5，D-4Amf(Cbm)6]-安替德。在RP-HPLC純化中獲得了十肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-氫乳清酰)-D-4Aph(氨基甲?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。經(jīng)評估分析它是基本均質(zhì)的，而且估計純度約為99％。MS分析表明分子量為1659.6Da，這與計算分子量1659.8Da是相符的。
如實施例1對該肽進行測試。在50微克劑量下，發(fā)現(xiàn)該肽在1天后與阿西林同樣有效地抑制LH分泌，在2天后也幾乎同樣有效。該肽在3天后活性稍低，但是在4天后表現(xiàn)出與阿西林幾乎相同的活性。
實施例6B
重復(fù)實施例6A的合成過程，不同點在于用異氰酸甲酯代替異氰酸叔丁酯進行反應(yīng)，從而形成肽[4Amf(Hor)5，D-4Amf(MeCbm)6]-安替德。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-氫乳清酰)-D-4Aph(甲基氨基甲?；?-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。經(jīng)評估分析它是基本均質(zhì)的，而且估計純度約為99％。MS分析表明分子量為1673.6Da，這與計算分子量1673.8Da是相符的。
如實施例1對該肽進行測試。在50微克劑量下，該肽在1天后與阿西林同樣有效地抑制LH分泌，在2天后也幾乎同樣有效。該肽在3天和4天后繼續(xù)表現(xiàn)出明顯比阿西林低的對LH分泌的抑制程度。
實施例6C重復(fù)實施例6的合成過程，并用D-氫乳清酸代替L-氫乳清酸，從而形成肽[4Amf(D-Hor)5，D-4Amf(Ac)6]-安替德。在RP-HPLC純化中獲得了肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(D-氫乳清酰)-D-4Amf(乙酰基)-Leu-Lys(異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。經(jīng)評估分析它是基本均質(zhì)的，而且估計純度大于99％。MS分析表明分子量為1658.7Da，這與計算分子量1658.8Da是相符的。
如實施例1對該肽進行測試。在50微克劑量下，該肽在1天和2天后與阿西林基本上等效。該肽在3天后效力比阿西林稍低，之后生物效力繼續(xù)明顯下降。
實施例7用實施例1-5所述的程序，還制備了下列GnRH拮抗劑肽[4Aph(Hor)5，D-4Amf(Cbm)6，Pro9NHCH2CH3]-安替德[4Aph(Hor)5，D-4Aph(Cbm)6，Pro9NHCH2CH3]-安替德[Acr-D-2Nal1，4FD-Phe2，4Aph(Hor)5]-阿西林[Bz-D-2Nal1，4NO2D-Phe2，4Aph(Hor)5，D-4Aph(Hor)6]-安替德[For-D-2Nal1，4OCH3D-Phe2，4Amf(Hor)5，D-4Aph(D-Hor)6]-安替德[Acr-D-2Nal1，4BrD-Phe2，4Aph(Imz)5，D-4Aph(Imz)6]-安替德[Pn-D-2Nal1，4CH3D-Phe2，3Aph(D-Inz)5，D-4Aph(D-Hor)6]-安替德[By-D-2Nal1，3，4Cl2D-Phe2，4Aph(Hor)5，D-4Aph(Hor)6]-安替德[Vl-D-2Nal1，4NO2D-Phe2，4Aph(Hor)5，D-3Aph(Cbm)6]-安替德[Vac-D-2Nal1，CaMe4ClD-Phe2，4Aph(Hor)5，Gly10]-阿西林-安替德[Acr-D-2Nal1，4Aph(Hor)5，Arg(Et2)8，D-Agl(Me)10]-阿西林[MeCbm-D-2Nal1，4Aph(Hor)5，Arg8，Agl(Me)10]-阿西林[Cbm-D-2Nal1，3Amf(Imz)5，Ala10]-阿西林[EtCbm-D-2Nal1，4Amf(Hor)5，Pro9NHCH2CH3]-阿西林[Acr-D-2Nal1，4Aph(Imz)5，D-4Amf(Cbm)6，Arg8]-安替德[Cbm-D-2Nal1，4Aph(MeCbm)5，D-4Amf(MeCbm)6，Arg(Et2)8]-安替德[4Ahp(Hor)5，D-4Ahp(Imz)6，D-Agl10]-安替德[Ac-D-1Nal1，4Amf(Hor)5，D-4Amf(D-Hor)6，Arg8]-安替德[PrCbm-D-2Nal1，4Amf(Imz)5，D-4Ahp(EtCbm)6，Pro9NHCH2CH3]-安替德[4Amf(Hor)5，D-Lys(Nic)6，AzaGly10]-安替德[4Amf(Hor)5，D-Cit6，Har(Et2)8]-安替德[4Aph(Hor)5，D-Lys(Nic)6，D-Agl10]-安替德[4Aph(Hor)5，D-Hci6，Agl(Me)10]-安替德[4Aph(Hor)5，D-3Pal6，Har8，Agl10]-安替德[4Aph(Hor)5，D-4Aph(For)6，D-Agl(Me)10]-安替德[4Aph(Hor)5，D-4Aph(atz)6，Har(Et2)8]-安替德[4Aph(Hor)5，D-4Aph(iprCbm)6，D-Agl10]-安替德[For-D-1Nal1，4Amf(Hor)5，D-4Amf(atz)6，Gly10]-安替德[4Aph(D-Hor)5，D-4Aph(Cbm)6，Ala10-ol]-安替德這些肽有抑制LH分泌的生物效能。
實施例8用實施例1-5和美國專利No.5,491,217中所述的程序，還制備了下列GnRH拮抗劑肽[NαMe4Aph(Hor)5，D-4Aph(Cbm)6]-安替德[NαMe4Aph(Hor)5，D-4Amf(Cbm)6-安替德[NαMe4Aph(Hor)5]-阿西林[NαMe4Aph(D-Hor)5]-阿西林[D-4Fphe2，NαMe4Aph(Hor)5]-阿西林[NαMe4Amf(Hor)5]-阿西林[NαMe4Aph(Hor)5，D-4Aph(Hor)6]-安替德[NαMe4Aph(Hor)5，D-4Aph(D-Hor)6]-安替德[MeCbm-D-2Nal1，NαMe4Aph(Hor)5]-阿西林[NαMe4Aph(Hor)5，D-3Pal6]-安替德-安替德[NαMe4Aph(MeCbm)5，D-4Aph(MeCbm)6]-安替德[NαMe4Aph(Hor)，D-4Amf(Cbm)6，Ala10-ol]-安替德[NαMe4Aph(Hor)，D-4Aph(Cbm)6，D-Ala10-ol]-安替德[NαMe4Aph(Hor)，D-4Aph(Cbm)6，Ala10-ol]-安替德[NαMe4Aph(Hor)5，D-Cit6]-安替德[NαMe4Aph(Hor)5，D-Lys(Nic)6]-安替德[NαMe4Aph(D/L-Imz)5]-阿西林[NαMe4Aph(L-Imz)5]-阿西林[NαMe4Aph(D-Imz)5]-阿西林[NαMe4Aph(L-Imz)5]，D-4Amf(Cbm)6]-阿西林[NαMe4Aph(Hor)5]，D-4Amf(MeCbm)6]-安替德[NαMe4Aph(Hor)5]，D-4Amf(Ac)6]-安替德[NαMe4Aph(Hor)5]，D-4Amf(Cbm)6，D-Ala10-ol]-安替德[NαMe4Aph(D-Hor)5]，D-4Amf(Cbm)6]-安替德[NαMe4Aph(D-Hor)5]，D-4Amf(Ac)6]-安替德[NαMe4Amf(Hor)5]，D-4Amf(Ac)6]-安替德[NαMe4Amf(Hor)5]，D-4Amf(Cbm)6]-安替德[NαMe4Amf(Hor)5]，D-4Amf(MeCbm)6]-安替德[NαMe4Amf(D-Hor)5]，D-4Amf(Ac)6]-安替德這些肽在抑制LH分泌方面是有生物效力的，并且在生理pH下在水中有非常好的溶解性。
上述被測試過化合物表現(xiàn)出的抑制LH的生物效能與相應(yīng)的GnRH拮抗劑肽安替德至少基本相當(dāng)，它們可認(rèn)為是安替德的類似物。作為數(shù)十年中該領(lǐng)域中廣泛測試的結(jié)果，在這種廣為接受的測量對LH抑制作用的測試中被確定有生物效能，就可作為證據(jù)表明該化合物能夠抑制促性腺素分泌，因而具有有用的抗性腺抗排卵效力。根據(jù)優(yōu)異的溶解性、不易在體內(nèi)膠凝、長時間的生物活性以及其他特性，這些化合物被認(rèn)為通?？捎米骺剐韵賱﹣硪种拼傩韵偎氐姆置?，并可作為(例如)抗排卵藥物來抑制性腺釋放類固醇。
本發(fā)明的化合物通常可以藥學(xué)上可接受的、無毒性的鹽(如酸加成鹽)形式或金屬配合物形式給藥；乙酸鹽和雙羥水楊酸鹽(與雙羥水楊酸形成的鹽)可以是優(yōu)選的。如果活性成分以片劑形式給藥，那么片劑可含藥學(xué)上可接受的無毒賦形劑，其中包括粘合劑(如西黃蓍膠、玉米淀粉或明膠)；崩解劑如海藻酸；和潤滑劑如硬脂酸鎂。也可溶于等滲鹽水、磷酸鹽緩沖溶液等中進行靜脈內(nèi)給藥。
藥物組合物通常含有有效量的肽和常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。通常，當(dāng)靜脈內(nèi)給藥時，劑量約為10微克-約2.5毫克肽/每千克宿主體重。這些化合物的特性使其可有效地口服給藥；然而口服劑量可以更高些?？傮w上，用這些肽治療對象時，通常是以臨床上用其他GnRH拮抗劑進行治療的相同方式進行，使用溶解有該化合物的合適載體并且施用的劑量足以有效抑制病人中LH和FSH水平。
還可能需要長時間地輸送GnRH拮抗劑，例如通過一次給藥而在一周至一年內(nèi)輸送GnRH拮抗劑，因而可以利用緩釋、儲存或植入劑型。
這些化合物可以通過靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、口服、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)或陰道內(nèi)方式而施用于哺乳動物，從而實現(xiàn)對生育力的抑制和/或控制，還可用于需要可逆地抑制性腺活性的場合，例如對付早熟青春期或者在放射性治療或化療過程中。它們還可用于治療類固醇依賴性腫瘤。有效劑量會隨給藥形式和待治療的哺乳動物具體種類而變化。這些化合物中的一些的溶解度高達(dá)50mg/ml，它們可以5-10毫克/毫升的溶液形式(pH5.4)使用。一種典型的劑型例子是pH約6的含該類肽的抑菌水溶液，該溶液可以腸胃外形式給藥以提供范圍在約0.1-2.5毫克/千克體重/每天的劑量。這些化合物被認(rèn)為在體內(nèi)有良好的耐受性并且抗膠凝；因此，它們被認(rèn)為特別適合于皮下注射，其形式是濃度合適的pH約4.9、含約5％甘露醇的抑菌水溶液，濃度可以高于0.75毫克/毫升，甚至高于約1.0毫克/毫升而不會在注射部位有膠凝的危險。
這些GnRH拮抗劑肽還可用于體內(nèi)和體外診斷?？蓪⑦@些肽注入體內(nèi)，然后分析病人的血流，以確定激素分泌(例如LH分泌)的下降程度。還可進行體外分析，以確定某些腫瘤細(xì)胞是否對GnRH敏感。在這些分析中，用GnRH拮抗劑肽處理腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，然后監(jiān)測激素分泌和細(xì)胞增殖情況。
盡管本發(fā)明是根據(jù)優(yōu)選實施例進行描述的，但應(yīng)理解對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，很明顯可以在所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)進行各種改變和變動。盡管N末端可以不被取代或可以使用其他等價的?；鶊F，但乙?；蛘呷〈蛭慈〈陌被柞；莾?yōu)選的。作為Aph或D-Aph的替代形式，可以在5位和6位分別使用Ahp或D-Ahp。作為替換Aph(Ac)，可以如美國專利No.5,506,207所公開的那樣用其他?；噭┨幚戆被奖彼峄鶊F，例如用甲酸、β-Ala(atz)和γ-氨基丁酸(atz)，這些同樣會形成長效的GnRH拮抗劑。因此，這些形成的殘基被認(rèn)為是與D-和L-4Aph(Ac)等價的。Lys(Bu)和Lys(Et2)被認(rèn)為與ILys等價；然而ILys是最優(yōu)選的。其他疏水氨基酸殘基也可用于1位和6位(如上所述)，較佳地是D-異構(gòu)體形式，它們被認(rèn)為與那些具體例舉的氨基酸殘基是等價的。
權(quán)利要求
1.一種具有下式的GnRH拮抗劑肽及其藥學(xué)上可接受的鹽X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10其中X是7個碳原子之內(nèi)的酰基或Q，而Q是-CO-NHR，而R是H或低級烷基；A是4Cl、4F、4Br、4NO2、4CH3、4OCH3，3，4Cl2或CαMe4Cl；Xaa5是Aph(Q1)或Amf(Q1)，而Q1是Q或
Xaa6是D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、D-Lys(Nic)、D-Cit、D-Hci或D-Pal，而Q2是For、Ac、3-氨基-1，2，4-三唑、Q或Q1；Xaa8是Lys(ipr)、Arg、Har、Arg(Et2)或Har(Et2)；和Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol、Ala-ol、NHCH2CH3、Gly-NH2、Ala-NH2、AzaGly-NH2、Agl-NH2、D-Agl-NH2、Agl(Me)-NH2、或D-Agl(Me)-NH2，條件是當(dāng)Xaa5含Q時Xaa6也含Q，而且Xaa5的α-氨基可任選地被甲基化。
2.如權(quán)利要求1所述的GnRH拮抗劑肽，其特征在于，X、A和Xaa8如權(quán)利要求1所述；Q是氨基甲?；蚣谆被柞；?；D-Pal是D-3Pal；Xaa5是4Aph(Q1)或4Amf(Q1)，而Q1是Q、
Xaa6是D-4Aph(Q2)、D-4Amf(Q2)，而Q2是Q、或D-或L-Hor、或D-或L-Imz；條件是當(dāng)Q1是Q時Q2也是Q；以及Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol、或Ala-ol。
3.如權(quán)利要求1或2所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，Q1是L-Hor或D-Hor。
4.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，X是Ac，Xaa8是Lys(ipr)而Xaa10是D-Ala-NH2。
5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，Xaa5是4Aph(L-或D-Hor)，而Xaa6是D-4Aph(Ac)、D-4Aph(atz)或D-3Pal。
6.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，Xaa5是4Aph(L-或D-Hor)，而Q2是Q，而R是H或甲基。
7.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，Xaa5是4Aph(L-或D-Hor)，而Xaa6是D-Cit或D-Hci。
8.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，Xaa6是D-4Aph(D-Hor)。
9.如權(quán)利要求1所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，其中X是For、Ac、Acr、Pn、By、Vl、Vac、Bz或Q，而Q如權(quán)利要求1所定義；A是4Cl或4F；D-Pal是D-3Pal；Xaa5是Aph(Q1)或Amf(Q1)，而Q1是Hor或Imz的D-異構(gòu)體、L-異構(gòu)體或D/L-異構(gòu)體混合物；Xaa6是D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、D-Cit、D-Lys(Nic)或D-Pal，而Q2是For、Ac、Q或Q1；Xaa8是Lys(ipr)；和Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol、Ala-ol、NHCH2CH3或Gly-NH2。
10.如權(quán)利要求9所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，Q1是L-或D-Hor，而Xaa6是D-4Amf(Q)，且R是H或甲基。
11.如權(quán)利要求9所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，X是Ac或Q；R是H或甲基；Xaa6是D-4Aph(Q2)、D-4Amf(Q2)或D-3Pal，且Q2是Ac、Q或Q1；以及Xaa10是D-Ala-NH2。
12.如權(quán)利要求1所述的GnRH拮抗劑，其特征在于，它具有下式Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa10，其中Xaa6是D-4Aph(Ac)、D-3Pal、D-4Aph(氨基甲?；?、D-4Amf(氨基甲?；?、D-4Amf(甲基氨基甲?；?或D-4Aph(D-Hor)而Xaa10是D-Ala-NH2、D-Ala-ol或Ala-ol。
13.一種抑制哺乳動物中促性腺素分泌的藥物組合物，其特征在于，它含有有效量的如權(quán)利要求1-12中任一權(quán)利要求所述的GnRH拮抗劑作為活性成分，以及無毒性的稀釋劑。
14.一種體內(nèi)或體外診斷病癥的方法，在該病癥中GnRH導(dǎo)致激素過量分泌或腫瘤生長，其特征在于，該方法包括施用上述任一權(quán)利要求所述的GnRH拮抗劑肽，以及監(jiān)測激素的分泌或腫瘤細(xì)胞的增殖。
15.一種抑制哺乳動物中促性腺素分泌的方法，其特征在于，它包括施用權(quán)利要求13所述的藥物組合物，實現(xiàn)LH和FSH水平的顯著下降。
16.一種制備GnRH拮抗劑肽的中間體，其特征在于，它具有下式X1-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X2)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5其中X1是α-氨基保護基團；A是4Cl或4F；X2是H或羥基保護基團；Xaa5是Aph(Q1)或Amf(Q1)，而Q1是下式任一基團的D-異構(gòu)體、L-異構(gòu)體或D/L異構(gòu)體混合物
Xaa6是D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、或D-Pal，而Q2是Ac、Q1、氨基甲?；?、或甲基氨基甲?；?；X4是酸不穩(wěn)定的氨基保護基團；和X5是D-Ala-、Gly-、Ala-、Agl-、D-Agl-、Agl(Me)-、或D-Agl(Me)-樹脂載體；N(Et)-樹脂載體；D-Ala、Gly、或Ala的酰胺；乙酰胺、AzaGly-NH2；或OH，條件是Xaa5的α-氨基可任選地被甲基化。
全文摘要
提供了具有更長效的GnRH拮抗劑特性的肽。這些拮抗劑可用于調(diào)節(jié)生育力和治療類固醇依賴性腫瘤以及其他短期和長期的治療病癥。這些拮抗劑在5－位或5－位和6－位上具有氨基苯丙氨酸衍生基團或等價基團。該衍生物還可被修飾而含有氨基甲?；螂s環(huán)(包括側(cè)鏈上的脲基)。特別有效的、在注射后96小時仍很明顯抑制LH分泌的十肽具有下式:Ac－D－2Nal－D－4Cpa－D－3Pal－Ser－4Aph(L－氫乳清酰)－D－4Aph(乙?；?－Leu－Lys(異丙基)－Pro－D－Ala－NH
文檔編號A61K38/00GK1259959SQ98806033
公開日2000年7月12日 申請日期1998年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月11日
發(fā)明者G·森普爾, 姜廣成 申請人:凡林有限公司