專(zhuān)利名稱(chēng)：治療血栓形成性疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)科學(xué)尤其是用活化的人蛋白C聯(lián)合抗血小板藥物治療血栓形成性疾病。
蛋白C是一種絲氨酸蛋白酶和天然存在的抗凝劑，它通過(guò)使凝血級(jí)聯(lián)中的因子Va和VIIIa失活從而在止血調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。人蛋白C以雙鏈酶原循環(huán)于體內(nèi)，它在體內(nèi)被凝血酶和磷脂表面上的凝血調(diào)節(jié)蛋白活化，從而產(chǎn)生活化的蛋白C(aPC)。
血液凝固是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，受前凝血和抗凝血機(jī)制之間的平衡的調(diào)節(jié)。該平衡決定或者是正常的止血或者是異常病理的血栓形成狀態(tài)，所述病理血栓形成引起諸如中風(fēng)、心肌梗塞和靜脈血栓形成的事件。兩個(gè)主要因素控制該平衡，即纖維蛋白的產(chǎn)生和血小板的激活及其隨后的聚集?？刂埔陨蟽蓚€(gè)過(guò)程的一個(gè)重要因素是凝血酶的產(chǎn)生，凝血酶的產(chǎn)生發(fā)生于凝血級(jí)聯(lián)激活之后。凝血酶是一種前凝血酶，它使血小板聚集并使循環(huán)型纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白，導(dǎo)致形成血凝塊。因?yàn)槟笇⒌鞍證酶原激活成為活化的蛋白C，該活化的蛋白C再抑制凝血酶的產(chǎn)生，所以它也以有效的抗凝劑發(fā)揮作用。因此，aPC通過(guò)反饋調(diào)節(jié)凝血酶的產(chǎn)生，它也可能作為血液凝固最重要的負(fù)調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用，從而產(chǎn)生抗血栓形成的保護(hù)作用。
在雜合型缺陷蛋白C抗性(例如，由常見(jiàn)的因子V Leiden突變引起的)和未治療的純合型蛋白C缺陷的致死性后果中血栓形成速率增高，說(shuō)明了蛋白C在控制止血中的重要作用。在各種靜脈和動(dòng)脈血栓形成動(dòng)物模型中已經(jīng)表明，血漿衍生的人活性蛋白C以及重組人活化蛋白C是有效安全的抗血栓形成藥物。
在目前的臨床實(shí)踐中，許多文獻(xiàn)證明血小板抑制例如使用阿斯匹林(ASP)在預(yù)防和治療血栓形成性疾病中是有效的。此外，在諸如心肌梗塞和中風(fēng)的疾病中，血小板抑制已經(jīng)成為標(biāo)準(zhǔn)治療。然而，使用諸如ASA的抗血小板藥物增加了出血風(fēng)險(xiǎn)，從而限制了該藥物的劑量和治療時(shí)間。為了阻止凝血酶在纖維蛋白形成中的作用，在急性治療處理中，肝素仍然是標(biāo)準(zhǔn)抗凝劑。然而，肝素的治療指數(shù)窄，且與顯著的出血風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，尤其是在聯(lián)合應(yīng)用抗血小板藥物時(shí)。
在犬冠狀動(dòng)脈血栓形成模型中已經(jīng)研究了阿斯匹林和一種合成的凝血酶抑制劑、組織纖溶酶原激活物或單克隆抗血小板糖蛋白IIb/IIIa抗體的聯(lián)合治療[Yasuda等，J Am Coll Cardiol.，16714-22(1990)]。阿斯匹林聯(lián)合這些藥物使出血時(shí)間延長(zhǎng)，而并不能防止冠狀動(dòng)脈的再阻塞。另外，已經(jīng)提出了aPC與諸如組織纖溶酶原激活物、尿激酶或鏈激酶的溶栓劑的聯(lián)合治療[Griffin等，美國(guó)專(zhuān)利第5,350,578號(hào)]。然而，還未證實(shí)這些聯(lián)合治療成功與否。因此，仍然需要鑒定治療血栓形成性疾病的有效治療法。
本發(fā)明是第一個(gè)描述在治療血栓形成中aPC與抗血小板藥物聯(lián)合的發(fā)明。因此，本發(fā)明提供aPC聯(lián)合抗血小板藥物用于治療血栓形成性疾病的應(yīng)用。該聯(lián)合治療使得對(duì)各種血栓形成性疾病的療效提高，所述血栓形成性疾病包括但不限于中風(fēng)、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、血管成形術(shù)或stent放置術(shù)后突發(fā)性血管閉塞以及外周血管手術(shù)引起的血栓形成。此外，aPC與抗血小板藥物的聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同作用，使得允許減少aPC和抗血小板藥物的劑量。聯(lián)合治療中所述藥物劑量的減少又使得諸如出血傾向增高的副作用降低，所述副作用在聯(lián)合抗凝劑/抗血小板治療中常常觀觀察到。
本發(fā)明提供治療需要其治療的病人的血栓形成性疾病的方法，它包括與一種抗血小板藥物聯(lián)合，給予所述病人藥用有效量的活化蛋白C。此外，本發(fā)明提供治療需要其治療病人的血栓形成性疾病的方法，包括給予所述病人藥用有效量的抗血小板藥物和活化蛋白C，從而使得活化蛋白C血漿水平為10ng/ml至低于100ng/ml。
為了本發(fā)明，如本文說(shuō)明書(shū)和權(quán)力要求書(shū)所述，下列術(shù)語(yǔ)定義如下。
無(wú)論是重組還是血漿衍生的aPC或活化蛋白C，aPC包括并最好是人蛋白C，盡管aPC也可以包括其它物種的aPC或具有蛋白C蛋白水解活性、酰胺分解活性、酯解活性以及生物活性(抗凝活性或纖維蛋白原分解活性)的衍生物。Gerlitz等的美國(guó)專(zhuān)利第5,453,373號(hào)和Foster等，美國(guó)專(zhuān)利第5,516,650號(hào)描述了蛋白C衍生物的實(shí)例，所述文獻(xiàn)的全部知識(shí)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
APTT-活化部分凝血致活酶時(shí)間。
HPC-人蛋白C酶原。
r-hPC-在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生的重組人蛋白C酶原。
r-aPC-重組人活化蛋白C，它通過(guò)體外激活r-hPC產(chǎn)生或由原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物直接分泌活化形式的蛋白C[Cottingham，WO97/20043]，包括例如以酶原從人腎293細(xì)胞分泌，然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知、在Yan的美國(guó)專(zhuān)利第4,981,952號(hào)中證實(shí)的技術(shù)純化和活化，所述文獻(xiàn)的全部知識(shí)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
酶原-是指分泌的非活性形式的單鏈或雙鏈蛋白C。
抗血小板藥物-降低血小板聚集能力的單獨(dú)或組合的一種或多種藥物。本領(lǐng)域已知并鑒定的藥物包括在例如Remington，The Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，第II卷，第924-25頁(yè)，Mack PublishingCo.中引用的藥物，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這類(lèi)藥物包括但不限于阿斯匹林(ASA)、clopidogrel、ReoPro(abciximab)、潘生丁、氯芐噻啶和IIb/IIIa拮抗劑。
治療-是指為了防御疾病、病癥或紊亂對(duì)病人的處理及護(hù)理，包括給予本發(fā)明化合物，以防止癥狀或并發(fā)癥的發(fā)生，緩解所述癥狀或并發(fā)癥，或解除疾病、病癥或紊亂。
連續(xù)輸注-特定時(shí)間內(nèi)基本上不間斷地持續(xù)將一種溶液導(dǎo)入靜脈內(nèi)。
大劑量注射-于高達(dá)約120分鐘的時(shí)間內(nèi)注射給定量(稱(chēng)為大劑量)的藥物。
藥用有效量-指本發(fā)明化合物能夠抑制哺乳動(dòng)物血栓形成性疾病的量。當(dāng)然，主治醫(yī)師對(duì)該病例的特定情況包括所給予的化合物、待治療的特定病癥以及類(lèi)似情況的考慮，確定按照本發(fā)明給予的化合物的具體劑量。
血栓形成性疾病-涉及或受血管內(nèi)形成或存在的凝血塊影響的疾病。血栓形成性疾病包括但不限于中風(fēng)、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、血管成形術(shù)或stent放置術(shù)后突發(fā)性血管閉塞以及外周血管手術(shù)引起的血栓形成。
本發(fā)明優(yōu)選涉及用活化蛋白C聯(lián)合抗血小板藥物治療血栓形成性疾病。在這種組合中所用的aPC可以按照已知方法配制，以制備藥學(xué)上有用的組合物。通過(guò)連續(xù)輸注約24小時(shí)至約144小時(shí)注入合適劑量，胃腸外給予所述aPC，以保證將其以有效形式傳遞入血流。
在與抗血小板藥物的聯(lián)合治療中，所給予的aPC量為約4mg/70Kg/24小時(shí)至160mg/70Kg/24小時(shí)，或者等同表示為0.1mg/m2至4mg/m2或者2μg/kg/hr至96μg/kg/hr。所給予的aPC量更優(yōu)選為約4mg/70Kg/24小時(shí)至120mg/70Kg/24小時(shí)，或者等同表示為0.1mg/m2至3mg/m2或者2.4μg/kg/hr至72μg/kg/hr。而所給予的aPC量更優(yōu)選為約4mg/70Kg/24小時(shí)至80mg/70Kg/24小時(shí)，或者等同表示為0.1mg/m2至2mg/m2或者2.4μg/kg/hr至48μg/kg/hr。所給予的aPC的量甚至更優(yōu)選為約4mg/70Kg/24小時(shí)至60mg/70Kg/24小時(shí)，或者等同表示為0.1mg/m2至1.5mg/m2或者2.4μg/kg/hr至36μg/kg/hr。所給予的aPC的量甚至再更優(yōu)選為約10mg/70Kg/24小時(shí)至50mg/70Kg/24小時(shí)，或者等同表示為0.25mg/m2至1.25mg/m2或者6μg/kg/hr至30μg/kg/hr。所給予的aPC的量甚至再更優(yōu)選為約20mg/70Kg/24小時(shí)至40mg/70Kg/24小時(shí)，或者等同表示為0.5mg/m2至1.0mg/m2或者12μg/kg/hr至24μg/kg/hr。所給予aPC的最優(yōu)選量為約40mg/70Kg/24小時(shí)，或者等同表示為1.0mg/m2或者24μg/kg/hr。與抗血小板治療藥物一起給予合適劑量的aPC，將使得或者提高療效或者減少其中之一或者兩種藥物的劑量。
給予上述量aPC所獲得的血漿濃度范圍為2ng/ml至低于100ng/ml。優(yōu)選血漿濃度范圍從約20ng/ml至80ng/ml。最優(yōu)選血漿濃度范圍從約30ng/ml至約60ng/ml，甚至更優(yōu)選約50ng/ml。
或者，所述aPC的給予采取以大劑量注射注入每小時(shí)合適劑量的三分之一，接下來(lái)連續(xù)輸注每小時(shí)劑量的余下三分之二1小時(shí)，之后連續(xù)輸注合適劑量23小時(shí)，這使得24小時(shí)給予合適劑量。
術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合”是指抗小板藥物與aPC同時(shí)、序貫或者組合給予。血小板抑制劑與aPC聯(lián)合給予將提高各種血栓形成性疾病的治療效能，所述疾病包括但不限于中風(fēng)、靜脈血栓形成、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、血管成形術(shù)或stent放置術(shù)后突發(fā)性血管閉塞以及外周血管手術(shù)引起的血栓形成。該協(xié)同作用也使得能夠降低聯(lián)合治療中的藥物劑量，從而使得降低在聯(lián)合抗凝劑/抗血小板治療中常常觀察到的諸如出血傾向增高的副作用。
所用抗血小板藥物和合適的劑量水平是本領(lǐng)域已知并接受的。技術(shù)人員知道每種抗血小板藥物獲得治療血栓形成性疾病的藥用有效量的所用的合適劑量水平。在本發(fā)明中適合應(yīng)用的抗血小板藥物包括但不限于臨床認(rèn)可并有市售的藥物，諸如阿斯匹林(ASA)、clopidogrel、ReoPro(abciximab)、潘生丁、氯芐噻啶和IIb/IIIa拮抗劑。與aPC聯(lián)合給予的抗血小板藥物阿斯匹林(ASA)的量為約10mg-1000mg，一日一次。與aPC聯(lián)合給予的抗血小板藥物氯芐噻啶的量為約50mg-1250mg，一日兩次(B.I.D.)。與aPC聯(lián)合給予的抗血小板藥物潘生丁的量為約15mg-500mg，一日四次。與aPC聯(lián)合給予的抗血小板藥物clopidogrel的量為約40mg-1000mg，一日一次。與aPC聯(lián)合給予的抗血小板藥物ReoPro(abciximab)的量為約0.025μg/kg/min-1μg/kg/min，12小時(shí)靜脈輸注給予?；蛘?，與aPC聯(lián)合給予的ReoPro可以以約0.05mg/kg-1.0mg/kg大劑量注射。此外，與aPC聯(lián)合給予的ReoPro可以以大劑量注射，然后靜脈輸注12小時(shí)。根據(jù)使用的具體藥物，與aPC聯(lián)合使用的IIb/IIIa拮抗劑的量為約0.1mg/kg至約100mg/kg[參見(jiàn)例如Fisher等，美國(guó)專(zhuān)利第5,618,843號(hào)，其全部知識(shí)通過(guò)引用結(jié)合到本文中]。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用以獲得藥用有效量的合適劑量水平。
與抗血小板藥物聯(lián)合使用的aPC提高單獨(dú)的抗血小板藥物的抗血栓形成作用。因此，該聯(lián)合治療可以減少aPC的治療劑量和減少治療性治療血栓形成需要的抗血小板藥物的劑量，由此避免諸如出血傾向的并發(fā)癥、高劑量抗血小板藥物的毒性以及一般副反應(yīng)。
制備1人蛋白C的制備重組人蛋白C(r-hPC)通過(guò)技術(shù)人員熟知的技術(shù)在人腎293細(xì)胞中生產(chǎn)，所述技術(shù)諸如在Yan，美國(guó)專(zhuān)利第4,981,952號(hào)中提出的技術(shù)，該文獻(xiàn)全部知識(shí)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。編碼人蛋白C的基因在Bang等，美國(guó)專(zhuān)利第4,775,624號(hào)中公開(kāi)并要求保護(hù)，該專(zhuān)利全部知識(shí)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。用來(lái)在293細(xì)胞中表達(dá)人蛋白C的質(zhì)粒是在Bang等，美國(guó)專(zhuān)利第4,992,373號(hào)中公開(kāi)的質(zhì)粒pLPC，所述專(zhuān)利的全部知識(shí)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建也描述于歐洲專(zhuān)利公告第0 445 939號(hào)和Grinnell等，1987，Bio/Technology 51189-1192，所述文獻(xiàn)的知識(shí)也通過(guò)引用結(jié)合到本文中。簡(jiǎn)而言之，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，然后鑒定、傳代培養(yǎng)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體并使其在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。發(fā)酵后，通過(guò)微量過(guò)濾獲得無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液。
采用修改的Yan，美國(guó)專(zhuān)利第4,981,952號(hào)的技術(shù)，從培養(yǎng)液分離人蛋白C，所述專(zhuān)利的全部知識(shí)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在澄明培養(yǎng)液吸附到陰離子交換樹(shù)脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)之前制備其4mMEDTA液。用4倍柱體積的20mM Tris，200mM NaCl，pH7.4和2倍柱體積的20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4洗滌后，用20mM Tris，150mMNaCl，10mM CaCl2，pH7.4洗脫結(jié)合的重組人蛋白C酶原。洗脫后按照SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳判定，該洗脫蛋白的純度高于95％。
制備所述蛋白的3M NaCl液，然后吸附到已在20mM Tris，3MNaCl，10mM CaCl2，pH7.4中平衡的疏水作用樹(shù)脂(Toyopearl Phenyl650M，TosoHaas)，從而完成該蛋白的進(jìn)一步純化。用2倍柱體積無(wú)CaCl2的平衡緩沖液洗滌后，用20mM Tris，pH7.4洗脫該重組人蛋白C。
通過(guò)去除殘余鈣制備用于活化的洗脫蛋白。使該重組人蛋白C通過(guò)金屬親合柱(Chelex-100，BioRad)以去除鈣并再結(jié)合到陰離子交換劑(Fast-Flow Q，Pharmacia)。這兩種柱子連續(xù)串聯(lián)排列并用20mM Tris，150mM NaCl，5Mm EDTA，pH6.5平衡。將該蛋白加樣后，用一倍柱體積的相同緩沖液洗滌Chelex-100柱，然后將其中斷串聯(lián)。所述陰離子交換柱用3倍柱體積的平衡緩沖液洗滌，然后用0.4M NaCl，20mMTris-乙酸鹽，pH6.5洗脫該蛋白。分別用UV 280nm消光E0.1％＝1.81或1.85測(cè)定重組人蛋白C和重組活化蛋白C溶液的蛋白濃度。
制備2重組人蛋白C的活化將牛凝血酶在存在50mM HEPES，pH7.5的情況下于4℃偶聯(lián)至活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia)。采用約5000單位凝血酶/ml樹(shù)脂，當(dāng)樹(shù)脂裝入柱中時(shí)進(jìn)行所述偶聯(lián)反應(yīng)。所述凝血酶溶液循環(huán)通過(guò)所述柱子約3小時(shí)，然后加入MEA成為0.6ml/l濃度的循環(huán)液。該含MEA的溶液再循環(huán)10-12小時(shí)，以確保完全封閉所述樹(shù)脂上未反應(yīng)的胺。封閉后，所述凝血酶偶聯(lián)樹(shù)脂用10倍柱體積的1M NaCl，20mM Tris，pH6.5洗滌以去除所有非特異性結(jié)合的蛋白，并在活化緩沖液中平衡后用于活化反應(yīng)。
制備純化r-hPC的5mM EDTA液(以螯合任何殘余鈣)，并用20mMTris，pH7.4或20mM Tris-乙酸鹽，pH6.5稀釋為2mg/ml濃度。將該物質(zhì)通過(guò)于37℃用50mM NaCl和或20mM Tris pH7.4或20mM Tris-乙酸鹽pH6.5平衡的凝血酶柱。調(diào)節(jié)流速以允許該r-hPC與凝血酶樹(shù)脂接觸時(shí)間近20min。收集流出液并立即檢測(cè)酰胺分解活性。假如該物質(zhì)無(wú)相當(dāng)于aPC確立的標(biāo)準(zhǔn)的比活(酰胺分解活性)，則將其再循環(huán)通過(guò)凝血酶柱完全活化所述r-hPC。之后用7.4至6.0之間任何pH(pH ofanywhere between 7.4 or 6.0)(優(yōu)選較低pH以防止自動(dòng)降解)的上述20mM緩沖液1∶1稀釋該物質(zhì)，以保持aPC于較低濃度，而待下一加工步驟使用。
通過(guò)將所述aPC結(jié)合至陰離子交換樹(shù)脂(Fast Flow Q，Pharmacia)，完成從aPC物質(zhì)去除浸提的凝血酶，所述陰離子交換樹(shù)脂已在含150mM NaCl的活化緩沖液(或者為20mM Tris，pH7.4或者優(yōu)選20mMTris-乙酸鹽，pH6.5)中平衡。使凝血酶通過(guò)該柱，并在經(jīng)過(guò)用20mM平衡緩沖液的2-6個(gè)柱體積洗滌期間進(jìn)行洗脫。結(jié)合的aPC用采用0.4M NaCl的或者5mM Tris-乙酸鹽pH6.5或者20mM Tris pH7.4的階式梯度進(jìn)行洗脫。較大體積洗滌液洗滌該柱有助于更徹底去除所述十二肽。從該柱子洗脫的物質(zhì)或者以冷凍液(-20℃)或者作為凍干粉貯藏。
采用Beckman DU-7400二極管矩陣分光光度計(jì)，通過(guò)由購(gòu)自KabiVitrum的合成底物H-D-Phe-Pip-Arg-對(duì)硝基?；桨?S-2238)釋放的p-硝基苯胺，測(cè)定aPC的酰胺分解活性(AU)。一個(gè)單位的活化蛋白C定義為采用于450nm下9620M-1cm-1的對(duì)硝基苯胺的消光系數(shù)，于25℃、pH7.4在1分鐘內(nèi)釋放1μmol對(duì)硝基苯胺所需要的酶量。
通過(guò)檢測(cè)活化部分凝血致活酶時(shí)間(APTT)凝血測(cè)定中凝血時(shí)間的延長(zhǎng)，從而測(cè)定活化蛋白C的抗凝活性。用蛋白C濃度范圍125-1000ng/ml的稀釋緩沖液(1mg/ml放免檢測(cè)級(jí)BSA，20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.02％NaN3)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)在該濃度范圍內(nèi)制備幾個(gè)稀釋度的樣品。于每一樣品池加入50μl冷馬血漿和50μl重建的活化部分凝血致活酶時(shí)間試劑(APTT試劑，Sigma)，并于37℃溫育5分鐘。溫育后，于每一小池加入50μl合適的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。用稀釋緩沖液取代樣品或標(biāo)準(zhǔn)品以確定基礎(chǔ)凝血時(shí)間。在加入50μl 37℃ 30mMCaCl2至每個(gè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品池時(shí)，啟動(dòng)纖維蛋白儀(fibrometer)計(jì)時(shí)器(CoA Screener Hemostasis Analyzer，American Labor)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸公式計(jì)算樣品中的活化蛋白C濃度。本文報(bào)告的凝血時(shí)間是至少三個(gè)復(fù)份的均值，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
制備3活化蛋白C的制劑用包括冷凍干燥溶液的方法制備活化蛋白C的穩(wěn)定凍干制劑，所述溶液含有約2.5mg/ml活化蛋白C、約15mg/ml蔗糖、約20mg/ml NaCl和pH高于5.5但是低于6.5的檸檬酸鈉緩沖液?；罨鞍證的穩(wěn)定凍干配制還包括凍干包含約5mg/ml活化蛋白C、約30mg/ml蔗糖、約38mg/ml NaCl和pH高于5.5但是低于6.5的檸檬酸鹽緩沖液的溶液。
aPC∶鹽∶填充劑的比率(w∶w∶w)是在適合冷凍干燥法的配制中的重要因素。所述比率的變化取決于aPC濃度、鹽的選擇和濃度以及填充劑的選擇和濃度。具體地說(shuō)，優(yōu)選比率為約1份活化蛋白C∶約7.6份鹽∶約6份填充劑。
通過(guò)混合活化蛋白C、NaCl、蔗糖和檸檬酸鈉緩沖液，制備用于適合連續(xù)靜脈輸注給藥的單位劑量活化蛋白C制劑?；旌虾螅瑢?ml該溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè)單位劑量容器，并凍干。密封含有約5mg至約20mg活化蛋白C的單位劑量容器并貯藏備用，所述單位劑量容器含有的活化蛋白適合給予需要其的病人約0.01mg/kg/hr至約0.05mg/kg/hr的劑量。
實(shí)施例1豚鼠動(dòng)靜脈短路的血栓形成模型因?yàn)橐呀?jīng)證明了血小板抑制的臨床效果和aPC在控制止血中起著重要作用，所以在豚鼠動(dòng)脈/靜脈(AV)短路血栓形成模型中檢測(cè)aPC與ASA之間可能的協(xié)同作用。在該血栓形成模型中，已經(jīng)表明aPC是有效的抗血栓形成藥物，導(dǎo)致劑量依賴(lài)性地抑制血栓形成。
為了檢測(cè)aPC和阿斯匹林的作用，用20mg/kg Rompun和125mg/kgKetaset麻醉豚鼠(約500g)，并插入分流管將右側(cè)頸動(dòng)脈和左側(cè)頸靜脈連接起來(lái)。所述分流管含有刺激血栓形成的棉纖維。用大劑量注射加靜脈輸注給藥方案(0.5mg/kg大劑量加3mg/kg/hr)給予aPC以抑制血栓形成。此外，在給予所述給藥方案之前和期間進(jìn)行全血aPTT檢測(cè)，并通過(guò)免疫捕獲酰胺分解測(cè)定法檢測(cè)循環(huán)的aPC血漿水平。以10mg/kg靜脈給予阿斯匹林，而在肝素研究中，采用先給予一劑30單位/kg大劑量，接著靜脈輸注40單位/kg/hr。通過(guò)左側(cè)頸靜脈的插管進(jìn)行大劑量給藥，通過(guò)右側(cè)頸靜脈插管進(jìn)行血樣品采集。于連續(xù)時(shí)間點(diǎn)將血樣品采集到含300mM鹽酸苯甲脒的3.8％檸檬酸鈉(9體積血∶1體積檸檬酸鹽/苯甲脒溶液)中。在動(dòng)物每次采血后用注入等體積鹽水。離心分離血漿并凍藏于-20℃。用免疫捕獲酰胺分解測(cè)定檢測(cè)aPC的血漿濃度。
為了檢測(cè)aPC和抗血小板藥物ASA之間潛在抗血栓形成的協(xié)同作用，通過(guò)抑制血栓烷B2釋放進(jìn)行檢測(cè)，選擇ASA劑量以產(chǎn)生幾乎完全抑制血小板環(huán)加氧酶。如表1所示，10mg/kg ASA的劑量有效抑制血小板環(huán)加氧酶，然而，它對(duì)血栓重量無(wú)明顯影響。采用不影響血栓重量的該ASA劑量，進(jìn)行與aPC聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)。為了可比較的目的，也比較標(biāo)準(zhǔn)臨床抗凝血?jiǎng)└嗡?。如?所示，選擇aPC和肝素的劑量，以使每一種在所述模型中產(chǎn)生大致相同的抗血栓形成效應(yīng)(分別抑制45.9和43.3％)。ASA和aPC的聯(lián)合引起的血栓形成抑制作用顯著強(qiáng)于單獨(dú)用aPC所觀察到的抑制作用(P＝0.01)。相反，抗凝劑肝素和ASA的聯(lián)合顯示，并不明顯強(qiáng)于單獨(dú)用肝素所觀察到的抑制效應(yīng)。這些資料證實(shí)了抗血小板藥物和aPC之間的協(xié)同作用，并提示(a)或者ASA或者其它抗血小板藥物治療的病人通過(guò)與aPC聯(lián)合治療將獲得增高的療效，和(b)在存在抗血小板治療情況下，可以減少aPC的治療劑量。
表1在豚鼠動(dòng)靜脈短路模型中ASA對(duì)血小板血栓烷B2釋放和血栓重量的影響。該資料表明，盡管ASA幾乎最大程度抑制血栓烷B2釋放，但是對(duì)血栓重量無(wú)影響
表2aPC而非肝素和ASA之間抗血栓形成的協(xié)同作用.
*對(duì)照的％實(shí)施例2aPC和IIb/IIIa拮抗劑在豚鼠動(dòng)靜脈短路的血栓形成模型中的作用為了檢測(cè)aPC和典型的合成IIb/IIIa受體抗劑聯(lián)合治療的作用，采用實(shí)施例1中所述豚鼠AV短路的血栓形成模型。采用按Fisher等，美國(guó)專(zhuān)利第5,618,843號(hào)所述制備的2-([6-羧基-n-己基]甲酰胺基(carboxamidyl))-5-脒基苯并呋喃三氟乙酸鹽。aPC和IIb/IIIa拮抗劑的聯(lián)合使得抑制血栓形成顯著強(qiáng)于單獨(dú)用aPC所觀察到的作用(表3)。這些資料證實(shí)了aPC和合成IIb/IIIa拮抗劑之間的協(xié)同作用。
表3aPC和IIb/IIIa拮抗劑之間抗血栓形成的協(xié)同作用。<
對(duì)照的％實(shí)施例3aPC和abciximab在治療血栓形成性疾病中的作用abiciximab(ReoPro)是一種通過(guò)結(jié)合至血小板細(xì)胞表面的IIb/IIIa受體而抑制血小板聚集的藥物。aPC和abciximab的聯(lián)合治療在通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)血液凝固過(guò)程和抑制血小板聚集從而抑制血栓形成中是有效的。Abiciximab以約0.05mg/kg至約1.0mg/kg藥物團(tuán)注射給予，接著以約0.025μg/kg/min至約1μg/kg/min持續(xù)靜脈輸注12小時(shí)。aPC作為藥物團(tuán)注射給予，然后持續(xù)靜脈輸注或者以約2μg/kg/hr至約96μg/kg/hr持續(xù)靜脈輸注約24至約144小時(shí)給予。
所述聯(lián)合治療產(chǎn)生一種協(xié)同作用，該聯(lián)合治療更安全更有效，并減少治療血栓形成性疾病所必需的aPC和abciximab的劑量。
權(quán)利要求
1.一種治療需要其治療的病人的血栓形成性疾病的方法，包括聯(lián)合一種抗血小板藥物給予所述病人藥用有效量的活化蛋白C。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述病人罹患急性血栓形成性中風(fēng)、靜脈血栓形成、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、血管成形術(shù)或stent放置術(shù)后突發(fā)性血管閉塞以及外周血管手術(shù)引起的血栓形成。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中給予的活化蛋白C量為約2μg/kg/hr至約96μg/kg/hr。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述活化蛋白C通過(guò)持續(xù)靜脈輸注約24小時(shí)至約144小時(shí)給予。
5.按照權(quán)利要求3的方法，其中所述抗血小板藥物選自阿斯匹林(ASA)、clopidogrel、abciximab、潘生丁、氯芐噻啶和IIb/IIIa受體拮抗劑或它們的組合物。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是阿斯匹林(ASA)。
7.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是氯芐噻啶。
8.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是clopidogrel。
9.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是abciximab。
10.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是潘生丁。
11.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是IIb/IIIa受體拮抗劑。
12.一種治療需要其治療的病人的血栓形成性疾病的方法，包括給予所述病人藥用有效量的一種抗血小板藥物和活化蛋白C，使得活化蛋白C的血漿水平達(dá)到10ng/ml至低于100ng/ml。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述病人罹患急性血栓形成性中風(fēng)、靜脈血栓形成、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、血管成形術(shù)或stent放置術(shù)后突發(fā)性血管閉塞以及外周血管手術(shù)引起的血栓形成。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述活化蛋白C通過(guò)持續(xù)靜脈輸注約24小時(shí)至約144小時(shí)給予。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述活化蛋白C首先以大劑量注射給予，然后持續(xù)靜脈輸注給予。
16.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是阿斯匹林(ASA)和clopidogrel。
17.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是阿斯匹林(ASA)和氯芐噻啶。
18.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是阿斯匹林(ASA)和潘生丁。
19.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是阿斯匹林(ASA)和abciximab。
20.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述抗血小板藥物是阿斯匹林(ASA)和IIb/IIIa拮抗劑。
21.聯(lián)合一種抗血小板藥物的活化蛋白C，用作治療血栓形成性疾病的一種藥物。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述血栓形成性疾病是急性血栓形成性中風(fēng)、靜脈血栓形成、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、血管成形術(shù)或stent放置術(shù)后突發(fā)性血管閉塞以及外周血管手術(shù)引起的血栓形成。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述活化蛋白C的劑量為約2μg/kg/hr至約96μg/kg/hr。
全文摘要
本發(fā)明提供治療各種血栓形成性疾病患者的方法,所述血栓形成性疾病包括但不限于中風(fēng)、靜脈血栓形成、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、血管成形術(shù)或stent放置術(shù)后突發(fā)性血管閉塞以及外周血管手術(shù)引起的血栓形成。所述治療是一種人aPC和抗血小板藥物的聯(lián)合治療,所述抗血小板藥物包括但不限于阿斯匹林(ASA)、clopidogrel、ReoPro
文檔編號(hào)A61K31/00GK1265598SQ98807818
公開(kāi)日2000年9月6日 申請(qǐng)日期1998年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月5日
發(fā)明者B·W·格林尼爾, J·A·亞庫(kù)波夫斯基 申請(qǐng)人:伊萊利利公司