專(zhuān)利名稱(chēng)：用于產(chǎn)生cd8t細(xì)胞免疫應(yīng)答的接種方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用不同的引發(fā)和促進(jìn)劑組合物作為CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源，產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
引言疫苗學(xué)中的一個(gè)普遍問(wèn)題是不能通過(guò)免疫反應(yīng)產(chǎn)生高水平的CD8 T細(xì)胞。該問(wèn)題妨礙開(kāi)發(fā)抗包括瘧疾等幾種疾病的疫苗。
惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)瘧疾每年引起數(shù)以?xún)|計(jì)的瘧疾感染者并且導(dǎo)致1-2百萬(wàn)人死亡。因此開(kāi)發(fā)抗瘧疾的有效疫苗是全球公共健康優(yōu)先要考慮的項(xiàng)目。在過(guò)去20多年中，大量的免疫學(xué)研究確認(rèn)了來(lái)自瘧原蟲(chóng)的疫苗抗原和宿主中存在的可能保護(hù)免受感染和患病的免疫學(xué)機(jī)制。然而，盡管有此進(jìn)展，仍沒(méi)有在試驗(yàn)領(lǐng)域中表現(xiàn)為有效的抗瘧疾感染的接種方法。
已被確認(rèn)的主要問(wèn)題是在接種的個(gè)體中為免受感染和患病誘導(dǎo)足夠強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法。因此，盡管已知許多瘧疾抗原可用于抗瘧疾的接種，問(wèn)題是如何傳遞由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識(shí)別的上述抗原或稱(chēng)之為表位的它們的片段，形成誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的特殊類(lèi)型免疫應(yīng)答的方式。
多年來(lái)已知通過(guò)用大劑量照射過(guò)的來(lái)自蚊子叮咬得到的瘧疾子孢子免疫接種，可能對(duì)個(gè)體有保護(hù)作用。盡管這是大量接種不完全實(shí)用的方法，但該方法提供一種模型，用于分析介導(dǎo)子孢子感染保護(hù)性免疫的免疫應(yīng)答(Nardin和Nussenzweig 1993)。
在近10年或更長(zhǎng)的時(shí)間中，大量的研究表明抗惡性瘧原蟲(chóng)疾病早期前紅細(xì)胞階段的主要保護(hù)性免疫應(yīng)答是由CD8+ve型的T淋巴細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)所介導(dǎo)的。在小鼠疾病感染模型中顯示上述細(xì)胞直接介導(dǎo)保護(hù)作用(Nardin和Nussenzweig 1993)。在天然與疾病接觸的個(gè)體和用照射過(guò)的子孢子免疫接種的志愿者中，也已鑒定出了這些細(xì)胞(Hill等，1991；Aidoo等，1995，Wizel等，1995)。還有許多非直接的證據(jù)表明上述CD8+T細(xì)胞在人類(lèi)抗瘧疾感染和患病中起保護(hù)作用(Lalvani等，1994)。
CD8+T細(xì)胞可能有不止一個(gè)方面的功能。眾所周知的功能是殺死或裂解含有MHC I類(lèi)分子肽抗原的靶細(xì)胞。因此這些細(xì)胞常定名為殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)。然而，另一個(gè)功能，也許在瘧疾感染中起更大保護(hù)作用有關(guān)的是CD8+T細(xì)胞能分泌干擾素γ(IFN-γ)。因此分析裂解活性和IFN-γ釋放在測(cè)定CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有雙重價(jià)值。在瘧疾中，產(chǎn)生該疾病的任何癥狀之前，這些CD8+ve細(xì)胞能通過(guò)殺死瘧疾感染早期肝內(nèi)階段的寄生蟲(chóng)而起保護(hù)作用(Seguin等，1994)。
致死性人類(lèi)瘧疾的病因惡性瘧原蟲(chóng)感染有限數(shù)量的宿主物種人類(lèi)、黑猩猩和一些新世界(New World)猴類(lèi)的物種。最好的非人類(lèi)瘧疾模型是黑猩猩，因?yàn)樵撐锓N與人類(lèi)親緣關(guān)系近并且不象猴宿主那樣，它可以連續(xù)觀察肝感染階段(Thomas等，1994)。由于黑猩猩昂貴且來(lái)源有限，大多數(shù)瘧疾研究在小鼠中進(jìn)行，用嚙齒類(lèi)瘧原蟲(chóng)伯氏瘧原蟲(chóng)(P.berghei)或約氏瘧原蟲(chóng)(P.yoelii)。后二種模型已進(jìn)行了徹底的研究，表明在該2種模型中CD8+ve淋巴細(xì)胞在抗子孢子激發(fā)的保護(hù)性免疫中起關(guān)鍵作用。
以前的研究已估計(jì)到各種各樣的方法誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞抗瘧疾的應(yīng)答。幾種這些方法顯示在嚙齒類(lèi)模型中，抗瘧疾感染的某些水平CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和部分保護(hù)作用(如Li等，1993；Sedegah等，1994；Lanar等，1996)。然而，過(guò)去未見(jiàn)對(duì)用亞單位疫苗免疫接種而誘導(dǎo)足夠高水平的CD8+T淋巴細(xì)胞，以有效地保護(hù)對(duì)抗瘧疾子孢子感染的有效方法的描述。
近年來(lái)通過(guò)改變用于傳遞抗原的載體探索對(duì)潛在的疫苗產(chǎn)生的改善免疫應(yīng)答。有證據(jù)顯示用2種不同的載體作為引發(fā)和促進(jìn)劑連續(xù)施用，在某些情況下可改善抗體的應(yīng)答。各種引發(fā)和促進(jìn)的組合已在不同的潛在疫苗方案中進(jìn)行了試驗(yàn)。
Leong等(疫苗1995，327-331)描述首先用表達(dá)流感血細(xì)胞凝集素(HA)抗原的DNA給小鼠免疫接種然后用表達(dá)HA的重組禽痘病毒載體的方法。在后續(xù)的促進(jìn)階段獲得增強(qiáng)的抗體應(yīng)答。
Richmond等(病毒學(xué)1997，230265-274)描述用DNA引發(fā)法和重組痘苗病毒促進(jìn)法企圖提高抗HIV-1 env的中和抗體。用該引發(fā)促進(jìn)方案僅觀察到低水平的抗體應(yīng)答，該結(jié)果令人失望。
Fuller等(疫苗1997，15924-926和免疫細(xì)胞生物學(xué)1997，75389-396)描述了用復(fù)制性重組痘苗病毒作為促進(jìn)劑免疫接種，增強(qiáng)了對(duì)獼猴DNA免疫接種的抗體應(yīng)答。不過(guò)，這不能轉(zhuǎn)變成大大降低病毒負(fù)載的增強(qiáng)保護(hù)效能，也不能在DNA引發(fā)和促進(jìn)的動(dòng)物中看到減少CD4 T細(xì)胞丟失。
Hodge等(疫苗1997，15759-768)描述用在重組的禽痘病毒(ALVAC)中表達(dá)的人癌胚抗原(CEA)、誘導(dǎo)在小鼠模型中對(duì)癌癥的增殖性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。作者用重組CEA能復(fù)制的Wyeth或WR株的痘苗病毒引發(fā)免疫應(yīng)答，然后用重組CEA的ALVAC促進(jìn)該應(yīng)答。這導(dǎo)致T細(xì)胞增殖增加，但如果與3種野生型重組免疫接種(100％保護(hù))相比較不能增強(qiáng)保護(hù)效能，3種重組ALVAC-CEA免疫接種(70％保護(hù))或WR引發(fā)然后2種ALVAC-CEA免疫接種(63％保護(hù))。
因而一些異源性引發(fā)-促進(jìn)組合研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物模型中抗體和淋巴增殖應(yīng)答的某種程度增強(qiáng)，但對(duì)保護(hù)效能沒(méi)有明顯影響。在這些研究中沒(méi)有測(cè)定CD8 T細(xì)胞。有限地增強(qiáng)抗體應(yīng)答可能簡(jiǎn)單地反映如下事實(shí)針對(duì)引發(fā)免疫原的抗體總是降低用相同的免疫原進(jìn)行第2次免疫接種的免疫原性，而用不同的載體促進(jìn)將部分克服該問(wèn)題。預(yù)計(jì)這種機(jī)制不受免疫接種的順序明顯影響。
異源性引發(fā)促進(jìn)免疫接種方案可能影響CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的證據(jù)由Li等(1993)提供。他們描述通過(guò)施用2種活病毒載體，重組復(fù)制流感病毒接著用編碼瘧疾表位的重組復(fù)制痘苗病毒，在小鼠中誘導(dǎo)抗瘧疾子孢子激發(fā)的部分保護(hù)效能。免疫接種的相反順序?qū)е滤斜Ｗo(hù)性效能的喪失，作者認(rèn)為這種痘苗肝細(xì)胞感染有關(guān)，導(dǎo)致CTL在肝中定位以保護(hù)抗瘧疾寄生蟲(chóng)的肝細(xì)胞階段。
Rodrigues等(免疫學(xué)雜志1994，4636-4648)描述用重復(fù)劑量的表達(dá)瘧疾環(huán)孢子(CS)蛋白的顯性免疫B細(xì)胞表位的重組流感病毒免疫接種小鼠，接著用重組痘苗病毒促進(jìn)劑。在促進(jìn)劑中使用野生型痘苗病毒株和減毒但能復(fù)制的痘苗病毒株產(chǎn)生非常相似水平的部分保護(hù)作用。然而減毒但能復(fù)制的病毒株與野生型痘苗病毒株相比較，輕微減少引發(fā)CD8 T細(xì)胞的免疫原性。
Murata等(細(xì)胞免疫學(xué)1996，17396-107)報(bào)道用復(fù)制性重組流感病毒引發(fā)然后用痘苗病毒復(fù)制株促進(jìn)增強(qiáng)了CD8 T細(xì)胞的應(yīng)答，表明在更早期的二項(xiàng)研究中觀察到的部分保護(hù)作用起因于該增強(qiáng)的CD8T細(xì)胞誘導(dǎo)。
因此綜合這三項(xiàng)研究提供了證據(jù)，用復(fù)制性重組痘苗病毒的促進(jìn)劑免疫接種可以增強(qiáng)由復(fù)制性重組流感病毒引發(fā)的某種程度的CD8 T細(xì)胞誘導(dǎo)。然而，從它們潛在的應(yīng)用角度考慮，對(duì)這些發(fā)現(xiàn)有2種限制因素。首先，所誘導(dǎo)的免疫原性?xún)H足以獲得抗瘧疾的部分保護(hù)作用而甚至這依賴(lài)于用不常見(jiàn)的復(fù)制性重組流感病毒引發(fā)的免疫接種的高度免疫原性。其次，因?yàn)橛眠@些復(fù)制性病毒作免疫原的潛在及文獻(xiàn)記載的副作用，這些重組載體不能作為疫苗用于一般人群。
修飾過(guò)的痘苗病毒Ankara(MVA)是一種在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型包括正常人組織中不復(fù)制的痘苗病毒株。MVA由在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中連續(xù)傳代＞500次衍生而來(lái)，該病毒來(lái)源于土耳其Ankara一匹馬中皮疹損傷得到(Mayr等，1975)。研究表明它是復(fù)制受損而仍能誘導(dǎo)抗獸醫(yī)皰疹病毒感染的保護(hù)性免疫(Mayr 1976)。在根除天花戰(zhàn)役的最后階段，MVA被用作人疫苗，通過(guò)皮內(nèi)、皮下和肌內(nèi)途徑在德國(guó)南部給＞120,000的受試者施用。未記錄到明顯的副作用，盡管是故意對(duì)諸如患濕疹的高風(fēng)險(xiǎn)組接種疫苗(Mayr等，1978；Stickl等，1974；Mahnel等，1994；)。MVA的安全性反映了在動(dòng)物模型中病毒的無(wú)毒害性，這些動(dòng)物包括照射過(guò)的小鼠和顱內(nèi)施用后的新生小鼠。MVA的非復(fù)制作用與雞尿囊絨毛膜的增殖性白斑的產(chǎn)生、非鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞的流產(chǎn)性感染和存在總計(jì)大約30kb的6個(gè)基因組缺失有關(guān)(Meyer等，1991)。MVA的無(wú)毒害性部分歸結(jié)于缺失影響宿主范圍基因K1L和C7L，盡管有限的病毒復(fù)制仍在人TK-143細(xì)胞和非洲綠猴CV-1細(xì)胞中發(fā)生(Altenburger等，1989)?；謴?fù)K1L基因僅部分恢復(fù)MVA的宿主范圍(Sutter等，1994)。宿主范圍限制似乎在病毒顆粒成熟過(guò)程中出現(xiàn)，在人HeLa細(xì)胞中用電子顯微鏡僅觀察到未成熟的病毒顆粒(Sutter等，1992)。在病毒復(fù)制中的晚期阻斷不能防止在MVA中重組基因的有效表達(dá)。已證實(shí)表達(dá)流感核蛋白、流感血細(xì)胞凝集素和SIV蛋白的重組MVA在動(dòng)物模型中具有免疫原性并且提供不同程度的保護(hù)作用，盡管這種作用絕不能單獨(dú)歸因于CD8+T淋巴細(xì)胞(Sutter等，1994；Hirsch等，1995；Hirsch等，1996)。因?yàn)榘踩院兔庖咴缘倪@些特性，重組的MVA被認(rèn)為是一種有希望的人疫苗候選者(Moss等，1995)。含有編碼外來(lái)抗原DNA的重組MVA在US5,185,146專(zhuān)利中有描述(Altenburger)。
痘病毒為逃避宿主免疫應(yīng)答進(jìn)化出的策略包括產(chǎn)生起腫瘤壞死因子、IL-1β、干擾素(IFN)-α/β和IFN-γ的可溶性受體作用的分泌蛋白，一般來(lái)說(shuō)這些蛋白具有的序列與細(xì)胞因子受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域相似(Symons等，1995；Alcami等，1995；Alcami等，1992)。最近描述該性質(zhì)的受體是趨化因子受體(Graham等，1997)。這些病毒受體一般抑制或破壞合適的宿主免疫應(yīng)答，并且它們的存在和增加的致病原性相關(guān)。IL-1β受體是一個(gè)例外，它的存在減弱宿主的熱應(yīng)答并增強(qiáng)面對(duì)感染時(shí)的宿主存活率(Alcami等，1996)。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MVA缺乏針對(duì)干擾素γ、干擾素αβ、腫瘤壞死因子和CC趨化因子的功能性細(xì)胞因子受體，可是的確擁有潛在有益的IL-1β受體。MVA是唯一熟知的擁有該細(xì)胞因子受體特征的痘苗病毒株，理論上使其比其他痘病毒更安全和更具免疫原性。另一種熟知的稱(chēng)為NYVAC的復(fù)制損傷和安全的痘苗病毒株在Tartaglia等(病毒學(xué)1992，188217-232)的文章中詳細(xì)描述。
很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)已意識(shí)到活病毒作為重組疫苗的載體擁有某些吸引人的特征，包括對(duì)外來(lái)抗原的高容量和相當(dāng)好的對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫原性(Ellis 1988，制造疫苗的新技術(shù)，選自疫苗一書(shū)。編著者Plotkin SA和Mortimer E A.W B Saunders，Philadelphia，568頁(yè)；Woodrow G C.1977，新產(chǎn)生的疫苗一書(shū)，第二版。編著者Levine M M，Woodrow GC，Kaper J B，Cobon G，33頁(yè))。這導(dǎo)致設(shè)法以各種方式減弱上述活載體的病毒性，包括降低它們的復(fù)制能力(Tartaglia J等，1992病毒學(xué)，188217-232)。然而上述在復(fù)制方面的降低也降低由病毒產(chǎn)生的抗原數(shù)量，因而可預(yù)期降低疫苗免疫原性。確實(shí)以前的研究顯示減弱復(fù)制性痘苗病毒株導(dǎo)致在抗體應(yīng)答方面某種基本降低(Lee M S等，1992病毒學(xué)雜志662617-2630)。相似地，在狂犬病的研究中發(fā)現(xiàn)非復(fù)制性禽痘病毒載體比復(fù)制性野生型痘苗病毒株更少的針對(duì)抗體產(chǎn)生的免疫原性和更少的保護(hù)作用(Taylor J等，1991疫苗9190-193)。
目前已發(fā)現(xiàn)非復(fù)制性和復(fù)制受損的痘病毒株提供的載體能對(duì)引發(fā)的CTL應(yīng)答極其良好的促進(jìn)效應(yīng)。顯然，該效應(yīng)比由野生型痘病毒引起的促進(jìn)效應(yīng)明顯要強(qiáng)。該效應(yīng)可用瘧疾和其他抗原如病毒和腫瘤抗原觀察到，并且其保護(hù)作用在小鼠和非人的靈長(zhǎng)類(lèi)激發(fā)實(shí)驗(yàn)中顯示。用該新型的免疫方案觀察到對(duì)子孢子的激發(fā)完全而不是部分的保護(hù)作用。
本發(fā)明的目的是鑒別一種有效的抗瘧疾免疫方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是鑒別抗CD8+T細(xì)胞應(yīng)答起保護(hù)作用的其他疾病的免疫方法。上述疾病包括但不局限于由HIV病毒、單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、丙肝病毒、乙肝病毒、流感病毒、EB病毒、麻疹病毒、登革病毒和HTLV-1；由細(xì)菌結(jié)核分支桿菌和李斯特菌類(lèi)和由原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)弓形蟲(chóng)和錐蟲(chóng)及某些類(lèi)型的癌癥如黑色素瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌所引起的感染和患病。
我們?cè)诖嗣枋鲆环N新的產(chǎn)生非常高水平CD8+T細(xì)胞的免疫方法并且發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)抗伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子激發(fā)的前所未有的完全保護(hù)作用。在更高等的靈長(zhǎng)類(lèi)中也檢測(cè)了相同的方法，也發(fā)現(xiàn)在該物種中高度的免疫原性，并且發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)抗惡性瘧原蟲(chóng)激發(fā)的部分保護(hù)作用。誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答也在2種另外的病毒感染和癌癥的小鼠模型中說(shuō)明。
我們進(jìn)一步顯示在該描述的新型免疫方案也在產(chǎn)生抗HIV表位的強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答中有效。大量的證據(jù)顯示所產(chǎn)生的上述CD8+T細(xì)胞應(yīng)答預(yù)計(jì)在抗該病毒感染和患病的預(yù)防或治療免疫中具有價(jià)值(Gallimore等1995；Ada 1996)。我們闡明用來(lái)自2種微生物HIV和瘧疾序列的表位串，可產(chǎn)生抗來(lái)自HIV和瘧疾表位的強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。成功產(chǎn)生抗HIV和瘧疾表位并且也抗流感和腫瘤表位的增強(qiáng)免疫原性表明該新型的免疫方案一般對(duì)許多感染性病原性有效，并且對(duì)產(chǎn)生強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答可能具有價(jià)值的非感染性疾病也有效。
本發(fā)明令人驚奇的特征是發(fā)現(xiàn)在引發(fā)和尤其是促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答中的非常高效能的非復(fù)制性藥劑。一般而言，由活的復(fù)制性病毒載體誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞免疫原性過(guò)去發(fā)現(xiàn)比非復(fù)制性藥劑或復(fù)制損傷的載體更高。這可從能在宿主中復(fù)制的藥劑產(chǎn)生更大量的抗原估計(jì)出來(lái)。然而在此我們發(fā)現(xiàn)用非復(fù)制性載體觀察到最大的免疫原性和保護(hù)效能，這是令人吃驚的。后者擁有免疫接種的附加優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈円话惚葟?fù)制性載體更安全地用于人類(lèi)。
本發(fā)明在一個(gè)方面提供一種試劑盒，以產(chǎn)生抗至少一種靶抗原的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，該試劑盒包括(i)一種引發(fā)組合物，包括來(lái)源于一種或多種靶抗原的CD8+T細(xì)胞表位，和藥用可接受的載體一起使用；和(ii)一種促進(jìn)組合物，包括來(lái)源于一種或多種靶抗原的CD8+T細(xì)胞表位，包括至少一種CD8+T細(xì)胞表位與引發(fā)組合物的CD8+T細(xì)胞表位相同，其中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是非復(fù)制性或復(fù)制受損的重組痘病毒載體，和藥用可接受的載體一起使用；條件是如果在(i)中表位的來(lái)源是病毒載體，(ii)中的病毒載體來(lái)源于不同的病毒。
在另一方面本發(fā)明提供一種產(chǎn)生抗至少一種靶抗原的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，該方法包括根據(jù)本發(fā)明施用至少一種劑量的組分(i)，接著施用至少一種劑量的該試劑盒的組分(ii)。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明方法(i)中的CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是一種非病毒載體或非復(fù)制性或復(fù)制損傷的病毒載體，盡管也可用復(fù)制性病毒載體。
優(yōu)選地，在(i)中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源不是一種痘病毒載體，這樣使引發(fā)劑和促進(jìn)劑之間存在極小的交叉反應(yīng)性。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，引發(fā)組合物的CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是一種核酸，可以是DNA或RNA，尤其是重組的DNA質(zhì)粒。DNA或RNA可以包裝在例如溶酶體中，或自由的形式存在。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，引發(fā)組合物中的CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是存在于重組CD8+T細(xì)胞表位串或在靶抗原中的肽、多肽、蛋白、聚蛋白或包括二種或多種CD8+T細(xì)胞表位的顆粒。聚蛋白包括二種或多種可能相同或優(yōu)選地不同連接在一起的蛋白。在本實(shí)施方案中特別優(yōu)選的是重組蛋白顆粒如Ty病毒樣顆粒(VLP)(Burns等，分子生物技術(shù)1994，1137-145)。
優(yōu)選地，促進(jìn)組合物中的CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是諸如MVA或NYVAC的痘苗病毒載體。最優(yōu)選的是修飾過(guò)的ankara病毒(MVA)或衍生于該病毒的痘苗株?？蛇x用的痘苗載體包括禽痘病毒載體如禽痘病毒或金絲雀痘病毒載體。特別適用的禽痘病毒載體是熟知的ALVAC金絲雀痘病毒病毒株(可從Kanapox購(gòu)得)和衍生于此的病毒株。
禽痘病毒攜帶大量的異源遺傳信息。用于痘苗對(duì)病毒載體的其他要求包括良好的免疫原性和安全性。MVA是一種具有良好的安全性記錄的復(fù)制受損的痘苗病毒株。在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型和正常人組織中，MVA不復(fù)制；在少數(shù)的諸如BHK 21細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞類(lèi)型中觀察到MVA的有限復(fù)制。由本發(fā)明描述的目前結(jié)果顯示，當(dāng)用DNA質(zhì)粒、重組Ty-VLP或重組腺病毒引發(fā)后施用促進(jìn)組合物時(shí)，重組的MVA和其他非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒株在產(chǎn)生保護(hù)性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答方面，比常規(guī)的重組痘苗載體驚人地和明顯地好。
很明顯，來(lái)源于MVA的痘苗病毒株或具有MVA特征使MVA特別適合用于疫苗而獨(dú)立開(kāi)發(fā)的病毒株，也將適用于本發(fā)明的用途。
含有插入表位串的MVA(在實(shí)施例中描述的MVA-HM)保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG，英國(guó)，登記號(hào)V97060511，保藏時(shí)間1997年6月5日。
在此所用的術(shù)語(yǔ)“非復(fù)制”或“復(fù)制受損”意味著在大多數(shù)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞或正常人細(xì)胞中不能有任何明顯的復(fù)制延伸。非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒可能天然(即它們可能從天然環(huán)境中分離)或如通過(guò)體外育種或遺傳操作，如缺失對(duì)復(fù)制起關(guān)鍵作用的基因的人工方法得到。一般來(lái)說(shuō)所述的病毒生長(zhǎng)在一種或少數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中，如CEF細(xì)胞適于MVA。
病毒的復(fù)制一般用2種方法測(cè)定1)DNA合成和2)病毒滴度。更準(zhǔn)確而言，在此所用和把其用于痘病毒的術(shù)語(yǔ)“非復(fù)制或復(fù)制受損”意味著病毒符合一種或二種下列的標(biāo)準(zhǔn)1)與痘苗病毒哥本哈根株相比，在MRC與細(xì)胞(人細(xì)胞系)中DNA合成表現(xiàn)為1 log(10倍)的降低；2)與痘苗病毒哥本哈根株相比較，在HELA細(xì)胞(人細(xì)胞系)中病毒滴度表現(xiàn)為2 log的降低。
落入該限定范圍的痘病毒實(shí)施例為MVA、NYVAC和禽痘病毒，而在該限定范圍之外的病毒為減毒的痘苗病毒株M7。
根據(jù)本發(fā)明另外的用于引發(fā)組合物的優(yōu)選病毒載體包括遺傳上殘缺致使非復(fù)制或復(fù)制受損的各種不同的病毒。上述病毒例如包括非復(fù)制的腺病毒如E1缺失突變體。遺傳殘缺的病毒產(chǎn)生非復(fù)制或復(fù)制受損的載體在文獻(xiàn)中已有大量描述(如McLean等，1994)。
其他用于引發(fā)組合物中合適的病毒載體是基于皰疹病毒和Venezuelan馬腦炎病毒(VEE)(Davies等，1996)，用于引發(fā)的合適細(xì)菌載體包括重組BCG和重組沙門(mén)氏苗和用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的沙門(mén)氏菌(Darii A等，1997細(xì)胞91765-775)。
另外的用于引發(fā)組合物的合適非病毒載體包括帶有脂質(zhì)尾的肽如熟知的脂肽，與載體蛋白融合的肽如KLH(要么作為融合蛋白或通過(guò)化學(xué)連接)，含有佐劑的完整抗原和其他相似的系統(tǒng)。諸如QS21或SBAS2的佐劑(Stoute J A等，1997新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志22686-91)可和蛋白、肽或核酸一起使用，以增強(qiáng)誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。這些系統(tǒng)有時(shí)稱(chēng)為“免疫原”而不是“載體”，在本發(fā)明中從它們攜帶相關(guān)的CD8+T細(xì)胞表位的意義上說(shuō)它們是載體。
沒(méi)有理由為什么引發(fā)和促進(jìn)組合物不應(yīng)該一致，因?yàn)樗鼈儍烧呖珊腥缟鲜?i)中定義的CD8+T細(xì)胞表位的引發(fā)來(lái)源物和如上述(ii)中定義的CD8+T細(xì)胞表位的促進(jìn)來(lái)源物。能用作引發(fā)劑和促進(jìn)劑的單一制劑將簡(jiǎn)化施用方法。重要的事情是該引發(fā)劑含有至少上述(i)中定義的表位引發(fā)來(lái)源物和促進(jìn)劑含有至少上述(ii)中定義的表位促進(jìn)來(lái)源物。
存在于引發(fā)和促進(jìn)組合物中或由它們編碼的CD8+T細(xì)胞表位可用各種不同的形式提供，如一個(gè)或二個(gè)或多個(gè)表位的重組串，或天然靶抗原的形式或上述二者的組合。對(duì)許多不同的疾病來(lái)說(shuō)，已經(jīng)鑒定了CD8+T細(xì)胞表位并能在文獻(xiàn)中找到。有可能設(shè)計(jì)表位串，以產(chǎn)生抗任何所選的含有上述表位的抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。有利地，在多個(gè)表位的串中的表位在沒(méi)有間隔序列的情況下連接在一起，結(jié)果能避免非必需的核酸和/或氨基酸材料。除了CD8+T細(xì)胞表位，包括由T輔助細(xì)胞識(shí)別的一個(gè)或多個(gè)表位可能是優(yōu)選的，以增強(qiáng)由表位串產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。特別合適的T輔助細(xì)胞表位是那些在不同的HLA型個(gè)體中活化的種類(lèi)，例如來(lái)源于破傷風(fēng)(大多數(shù)個(gè)體已經(jīng)引發(fā)抗此疾病)的T輔助細(xì)胞表位。3種T輔助細(xì)胞表位的有用組合已用在本發(fā)明描述的實(shí)施例中。包括刺激B細(xì)胞應(yīng)答和抗體產(chǎn)生的B細(xì)胞表位也可能是有用的。
所述的引發(fā)和促進(jìn)組合物可能包括佐劑，這是有利的。尤其是，包括DNA質(zhì)粒載體的引發(fā)組合物也可包括粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)或編碼該因子的質(zhì)粒用作佐劑；以多肽形式使用GM-CSF可觀察到有利的效應(yīng)。
在此所述的組合物可用作治療或預(yù)防的疫苗。是否預(yù)防或治療免疫更合適的方案通常依賴(lài)于疾病的性質(zhì)。例如，可預(yù)期癌癥可以治療免疫而是確診之前使用，而抗瘧疾的疫苗是優(yōu)選的，盡管用作預(yù)防免疫為非必需的。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可經(jīng)各種不同的途徑施用。某些途徑對(duì)某些組合物是有益的，由于導(dǎo)致產(chǎn)生更有效的應(yīng)答，或較少的可能誘導(dǎo)副作用，或施用更容易些。本發(fā)明顯示在金粒上或作為粉末用基因槍輸送是有效的。
進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生抗病原或腫瘤的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用至少一種劑量的編碼一種病原或癌癥的CD8+T細(xì)胞表位或抗原的重組DNA質(zhì)粒，然后施用至少一種劑量的編碼相同表位或抗原的非復(fù)制或復(fù)制受損的重組痘病毒；一種產(chǎn)生抗病原或腫瘤的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用至少一種劑量的包含至少一種病原或癌癥的表位或抗原的重組蛋白或顆粒，然后施用至少一種劑量的編碼相同表位或抗原的重組MVA載體；重組的非復(fù)制或復(fù)制受損的痘病毒載體在制備促進(jìn)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答中的藥物的用途；MVA載體在制備促進(jìn)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的藥物中的用途；一種促進(jìn)抗至少一種靶抗原或表位的引發(fā)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的藥物，包括靶抗原一種或多種CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源，其中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是非復(fù)制或復(fù)制受損的重組痘病毒載體，和藥用可接受的載體一起使用；以及在本發(fā)明中所述的引發(fā)和/或促進(jìn)組合物，特別適于用基因槍輸送的形式出現(xiàn)；和包括通過(guò)基因槍的方法輸送組合物的免疫方法。
由本發(fā)明提供的還有在此描述的表位串，包括包含在表1和表2中所列的氨基酸序列的表位串；編碼該表位串的重組DNA質(zhì)粒；包含表位串的重組Ty-VLPs；編碼惡性瘧原蟲(chóng)抗原TRAP的重組DNA質(zhì)?；蚍菑?fù)制或復(fù)制受損的重組痘病毒；和包含完整或基本完整的蛋白抗原如TRAP及在序列中二個(gè)或多個(gè)表位的串如來(lái)源于瘧疾的CTL表位的重組多肽。
制劑和免疫方法舉例制劑1引發(fā)組合物DNA質(zhì)粒1mg/ml溶在PBS中促進(jìn)組合物重組MVA，108ffu在PBS中方法在0和3周肌內(nèi)施用2個(gè)劑量的1mg引發(fā)組合物，接著在6和9周真皮內(nèi)施用2個(gè)劑量的促進(jìn)劑。
制劑2引發(fā)組合物Ty-VLP 500μg在PBS中促進(jìn)組合物MVA，108ffu在PBS中方法在0和3周肌內(nèi)施用2個(gè)劑量的引發(fā)組合物，然后在6和9周施用2個(gè)劑量的促進(jìn)劑。對(duì)于腫瘤治療，作為最有效的途徑之一MVA靜脈內(nèi)給入。
制劑3引發(fā)組合物蛋白500μg+佐劑(QS-21)促進(jìn)組合物重組MVA，108ffu在PBS中方法在0和3周施用2個(gè)劑量的引發(fā)組合物而在6和9周同上施用2個(gè)劑量的促進(jìn)劑感染量。
制劑4引發(fā)組合物腺病毒載體，109pfu在PBS中促進(jìn)組合物重組MVA，108ffu在PBS中方法在0和3周真皮內(nèi)施用1個(gè)或2個(gè)劑量的引發(fā)組合物以及在6和9周同上施用2個(gè)劑量的促進(jìn)劑感染量。
以上劑量和方法可隨優(yōu)化的保護(hù)作用而變化。所給的劑量如在1-8周的間隔而不是2周間隔。
至此在下列實(shí)施例中將進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法表位串的產(chǎn)生瘧疾表位串制自如表1所示每個(gè)編碼3個(gè)表位的系列盒，具有的限制性酶位點(diǎn)在盒的每一個(gè)末端。從4個(gè)合成的寡核苷酸退火在一起，連接到克隆載體，然后測(cè)序檢查并沒(méi)有錯(cuò)誤導(dǎo)入而構(gòu)建每個(gè)盒。然后單獨(dú)的盒按需要連接在一起。在盒C的3′末端的BamHI位點(diǎn)與盒A的5′末端BglII位點(diǎn)融合，結(jié)果消去2個(gè)限制性酶位點(diǎn)并在2個(gè)盒之間編碼2個(gè)氨基酸間隔子(GS)。然后以同樣的方法把盒B、D和H連接到串上。較長(zhǎng)的含有CABDHFE串也以同樣的方式構(gòu)建。
表1.瘧疾(M)串的CTL表位
表1 包括在瘧疾表位串中的序列。每個(gè)盒由如上所示的表位組成，按順序顯示，在盒中表位之間不具有額外的序列。BglII位點(diǎn)被加在5′末端而B(niǎo)amHI位點(diǎn)加在3′末端，結(jié)果在表位串的盒之間，BamHI/BglII連接編碼GS。所有表位來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)抗原(pb9除外(伯氏瘧原蟲(chóng))，BCG(結(jié)核分支桿菌)和TT(破傷風(fēng)))。在表中所示的氨基酸和DNA序列具有按順序出現(xiàn)的SEQ ID NOS.1～40。


圖1顯示用于表達(dá)具有瘧疾表位盒CABDHFE的Ty-VLP的構(gòu)建體。CTL表位來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)STARP(富含蘇氨酸和天冬酰胺的孢子蛋白)(st)、LSA-1(肝階段抗原1)(1s)、CSP(環(huán)孢子蛋白)(cp)、TRAP(血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)的粘著蛋白)(tr)、LSA-3(肝階段抗原3)(la)和Exp-1(外排蛋白1)(ex)。輔助表位來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白、分支結(jié)核桿菌38kd抗原和破傷風(fēng)類(lèi)毒類(lèi)。NANP是來(lái)自CS的抗體表位而AM來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)TRAP的粘著基序(Muller等，1993)。完整串的長(zhǎng)度如在表1所示為229個(gè)氨基酸，具有的氨基酸序列MINAYLDKLISKYEDEISYIPSAEKIGSKPNDKSLYKPKDELDYKPIVQYDNFGSASKNKEKALIIGIAGGLALLMNPNDPNRNVGSHLGNVKYLVKSLYDEHILLMDCSGSIGSDPNANPNVDPNANPNVQVHFQPLPPAVVKLQFIKANSKFIGITEGSYLNKIQNSLMEKLKELEKATSVLAGLGSNANPNANPNANPNANPDEWSPCSVTCGKGTRSRKREGSGK[SEQ ID NO41]。
HIV表位串也由退火寡核苷酸法合成。最后HIV和瘧疾表位串通過(guò)在HIV表位3′末端的BamHI位點(diǎn)連接到盒CAB 5′末端的BglII位點(diǎn)，融合形成HM串(表2)。表2 HIV/SIV表位串的CTL表位表位 限制性來(lái)源YLKDQQLL A24，B8 HIV-1 gp41ERYLKDQQL B14 HIV-1 gp41EITPIGLAP Mamu-B*01SIV envPPIPVGEIY B35 HIV-1 p24GEIYKRWII B8HIV-1 p24KRWIILGLNK B*2705 HIV-1 p24IILGLNKIVR A33 HIV-1 p24LGLNKIVRMY Bw62 HIV-1 p24YNLTMKCR Mamu-A*02SIV envRGPGRAFVTI A2，H-2Dd HIV-1 gp 120GRAFVTIGK B*2705 HIV-1 gp 120TPYDINQML B53HIV-2 gagCTPYDINQM Mamu-A*01 SIV gagRPQVPLRPMTYB51HIV-1 nefQVPLRPMTYK A*0301，A11 HIV-1 nefVPLRPMTY B35HIV-1 nefAVDLSHFLK A11HIV-1 nefDLSHFLKEK A*0301HIV-1 nefFLKEKGGL B8 HIV-1 nefILKEPVHGV A*0201HIV-1 polILKEPVHGVY Bw62 HIV-1 polHPDIVIYQY B35HIV-1 polVIYQYMDDL A*0201HIV-1 pol表2 來(lái)自HIV或SIV的表位序列含在H表位串中并如圖2所示裝配。在表中的氨基酸擁有按順序出現(xiàn)的SEQ ID NOS42～64。
圖2顯示H、M和HM蛋白的圖解性略圖。在圖中代表多肽蛋白的條形類(lèi)型表示序列的來(lái)源(見(jiàn)表1和2)。各個(gè)表位和它們的MHC限制性的部位已在蛋白的上下標(biāo)明。Pb是唯一來(lái)源于伯氏瘧原蟲(chóng)的蛋白。所有在M蛋白中的其他表位起源于惡性瘧原蟲(chóng)蛋白cs-環(huán)孢子蛋白，st-STARP、Is-LSA-1和tr-TRAP、BCG-結(jié)核分支桿菌的38kDa蛋白；TT-破傷風(fēng)毒素。
對(duì)于抗腫瘤的疫苗，與瘧疾和HIV表位串相似產(chǎn)生了含有CTL表位的表位串。在所公布的該腫瘤表位串中，鼠CTL表位被融合在一起以制造具有下列氨基酸序列的腫瘤表位串MLPYLGWLVF-AQHPNAELL-KHYLFRNL-SPSYVYHQF-IPNPLLGLD[SEQ ID NO65]。在此所示的CTL表位融合在一起。導(dǎo)入了第一個(gè)氨基酸甲硫氨酸以啟動(dòng)翻譯。
Ty病毒樣顆粒(VLPs)含有盒CABDH的表位串導(dǎo)入到酵母表達(dá)載體中，以形成C-末端框內(nèi)與TyA蛋白融合。當(dāng)TyA或TyA融合蛋白從該載體在酵母中表達(dá)中，該蛋白自發(fā)地形成病毒樣顆粒，該顆粒能通過(guò)蔗糖梯度離心從酵母的細(xì)胞質(zhì)中純化。用這種方法制備重組的Ty-VLPs，并針對(duì)PBS透析以在注射前移去蔗糖(參見(jiàn)Layton等，1996)。
腺病毒具有缺失的E1基因復(fù)制缺陷的重組腺病毒被用于本研究中(McGrory等，1988)。該腺病毒在CMV IE啟動(dòng)子的控制下表達(dá)大腸桿菌β-半乳糖苷酶。用于免疫接種，107pfu病毒真皮內(nèi)施用到耳垂內(nèi)。
肽購(gòu)自遺傳學(xué)研究公司(美國(guó))的肽，以10mg/ml溶解在DMSO(Sigma)中并進(jìn)一步用PBS稀釋到1mg/ml。在此所述的用于本實(shí)驗(yàn)含有CTL表位的肽在表3中列出。表3 CTL肽表位的序列序列 抗原MHC限制性LPYLGWLVF P1A腫瘤抗原 LdSYIPSAEKI 伯氏瘧原蟲(chóng)CSP KdRGPGRAFVTI HIV gag DdTRHPARIGL 大腸桿菌β-半乳糖苷酶 LdTYQRTRALV 流感A病毒NP KdSDYEGRLI 流感A病毒NP KkASNENMETM 流感A病毒NP DbINVAFNRFL 惡性瘧原蟲(chóng)TRAP Kb在表3中的氨基酸序列為SEQ ID NOS66～73，在表中它們按順序出現(xiàn)。
質(zhì)粒DNA構(gòu)建體許多不同的載體用于構(gòu)建DNA疫苗。質(zhì)粒pTH含有具有內(nèi)含子A的CMVIE啟動(dòng)子，接著是一個(gè)多連接子，以允許導(dǎo)入抗原編碼序列和牛生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)錄終止序列。該質(zhì)粒攜帶有氨芐青霉素抗性基因并且能在大腸桿菌而不是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。該質(zhì)粒用于制取表達(dá)下列每一種抗原的DNA疫苗伯氏瘧原蟲(chóng)TRAP、伯氏瘧原蟲(chóng)CS、惡性瘧原蟲(chóng)TRAP、惡性瘧原蟲(chóng)LSA-1(僅C-末端的278個(gè)氨基酸)、含有盒CABDH的表位串和HM表位串(HIV表位后接盒CAB)。除了抗生素抗性基因外，質(zhì)粒pSG2和pTH相似。在pSG2中，pTH的氨芐青霉素抗性基因已被卡那霉素抗性基因所取代。用pSG2制取表達(dá)下列抗原的DNA疫苗伯氏瘧原蟲(chóng)PbCSP、小鼠腫瘤表位串、含有盒CABDH的表位串和HM表位串。質(zhì)粒V1J-NP在CMVIE啟動(dòng)子的控制下表達(dá)流感病毒核蛋白。質(zhì)粒CMV-TRAP和CMV-LSA-1與pTH.TRAP和pTH.LSA-1相似，但不含有CMV啟動(dòng)子的內(nèi)含子A。質(zhì)粒RSV.TRAP和RSV.LSA-1含有RSV啟動(dòng)子，SV40轉(zhuǎn)錄終止序列并且是四環(huán)素抗性。為誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶特異的CTL，用質(zhì)粒pcDNA3/His/LacZ(Invitrogen)。所有DNA疫苗用Qiagen質(zhì)粒純化柱從大腸桿菌DH5α株中制備。
重組痘苗病毒的產(chǎn)生首先把抗原序列克隆到具有病毒啟動(dòng)子的穿梭載體如質(zhì)粒pSC11中而制得重組的MVAs(Chakrabarti等，1985；Morrison等，1989)。伯氏瘧原蟲(chóng)CS和惡性瘧原蟲(chóng)TRAP、流感病毒核蛋白及HM和小鼠腫瘤表位多表位串每一個(gè)用P7.5啟動(dòng)子表達(dá)(Mackett等，1984)，而伯氏瘧原蟲(chóng)TRAP用合成的強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)(SSP；Carroll等，1995)。然后用穿梭載體pSC11或pMCO3轉(zhuǎn)化用野生型的MVA感染過(guò)的細(xì)胞，結(jié)果位于啟動(dòng)子側(cè)翼的病毒序列、抗原編碼序列和標(biāo)記基因能和MVA結(jié)合，而產(chǎn)生重組體。重組病毒表達(dá)標(biāo)記基因(β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶)，可以使鑒別含有重組病毒的斑點(diǎn)。在用于免疫前對(duì)重組體重復(fù)進(jìn)行斑點(diǎn)純化。重組的NYVAC-PbCSP痘苗病毒以前已描述(Lanar等，1996)。野生型或編碼PbCSP的重組痘苗病毒西式保存(WR)株前已描述(Satchidanandam等，1991)。
細(xì)胞和培養(yǎng)基鼠細(xì)胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的黑猩猩和獼猴B細(xì)胞(BCL)培養(yǎng)在添加10％熱滅活的胎中血清(FCS)的RPMI中。脾細(xì)胞在含有10％ FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μM 2-巰基乙醇和10mMHepes pH7.2(Gibco，英國(guó))的MEM培養(yǎng)基中，用所示的肽(終濃度1μg/ml)重新刺激。
動(dòng)物所示的6-8周齡的小鼠品系購(gòu)自Harlan Olac(Shaws農(nóng)場(chǎng)，Blackthorn，英國(guó))。在位于荷蘭Rijswick的靈長(zhǎng)類(lèi)生物醫(yī)學(xué)研究中心研究黑猩猩H1和H2。在牛津大學(xué)研究獼猴。
免疫接種質(zhì)粒DNA給小鼠免疫接種在麻醉下把DNA肌內(nèi)免疫接種到脛骨肌中進(jìn)行。有時(shí)小鼠肌肉在免疫接種前5-9天按Davis等(1993)所述的方法，用50μl 1mM的心臟毒素(Latoxan，法國(guó))預(yù)處理，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)上述預(yù)處理組或未預(yù)處理組對(duì)免疫原性或保護(hù)效能有任何明顯的影響。MVA免疫小鼠可通過(guò)肌內(nèi)(i.m.)、靜脈內(nèi)(進(jìn)入尾側(cè)靜脈)(i.v.)、真皮內(nèi)(i.d.)、腹膜內(nèi)(i.p.)或皮下(s.c.)免疫法進(jìn)行。質(zhì)粒DNA和MVA免疫接種黑猩猩H1和H2在麻醉狀態(tài)下由腿肌肉的肌內(nèi)免疫法進(jìn)行。對(duì)這些黑猩猩的免疫接種，質(zhì)粒DNA和作為佐劑的15微克人GM-CSF共同施用。給黑猩猩施用重組MVA按獸醫(yī)管理法肌內(nèi)接種進(jìn)行。重組人GM-CSF購(gòu)自Sandoz(Camberley，英國(guó))。對(duì)于用基因槍進(jìn)行質(zhì)粒DNA免疫，DNA被沉淀到金顆粒上。至于真皮內(nèi)輸送，用了2種不同類(lèi)型的基因槍?zhuān)珹cell和牛津生物科學(xué)裝置(PowerJect藥業(yè)公司，牛津，英國(guó))。
ELISPOT分析用所示的肽表位和由Miyahara等(1993)所述的ELISPOT分析法，沒(méi)有用體外重新刺激的情況下確定在免疫過(guò)的小鼠脾中的CD8+T細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，96孔硝酸纖維素板(Miliscreen MAHA，Millipore，Bedford，英國(guó))用在50μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中的15μg/ml抗小鼠干擾素-γ的單克隆抗體R4(EACC)包被。在4℃溫育過(guò)夜后，包被孔用PBS洗一次，然后在室溫下用100μl含10％FCS的RPMI封閉。來(lái)自免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞被重新懸浮至1×107細(xì)胞/ml，重復(fù)放置到包被抗體的孔中然后系列稀釋。給每孔加入肽至終濃度1μg/ml。沒(méi)有肽的另外孔用作肽依賴(lài)的干擾素-γ分泌的對(duì)照。在37℃ 5％ CO2中溫育12-18小時(shí)后，克隆板用PBS和水洗6次。然后加樣孔在室溫下用在PBS中的1μg/ml生物素化的抗小鼠干擾素-γ單克隆抗體XMG1.2(Pharmingen，CA，美國(guó))溫育3小時(shí)。進(jìn)一步用PBS洗滌后，加50μl1μg/ml的鏈霉親和素堿性磷酸酶聚合體(Sigma)溶液，室溫溫育2小時(shí)。反應(yīng)點(diǎn)加50μl堿性磷酸酶結(jié)合底物溶液(Biorad，Hercules，CA，美國(guó))顯色。出現(xiàn)反應(yīng)點(diǎn)后，用水洗滌終止反應(yīng)。反應(yīng)點(diǎn)的數(shù)目用立體顯微鏡幫助下確定。
對(duì)黑猩猩外周血淋巴細(xì)胞的ELISPOT分析，用非常相似的方法采用開(kāi)發(fā)作檢測(cè)人CD8 T細(xì)胞的分析法和試劑(Mabtech，Stockholm)進(jìn)行。
CTL分析按Allsopp等(1996)所述的顯示和培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞作效應(yīng)器細(xì)胞的方法，用鉻標(biāo)記的靶細(xì)胞法進(jìn)行CTL分析。用黑猩猩或獼猴細(xì)胞的CTL分析按Hill等(1992)所述的檢測(cè)人CTL的方法進(jìn)行，用EBV轉(zhuǎn)化的自身黑猩猩或獼猴B細(xì)胞系作為靶細(xì)胞。
伯氏瘧原蟲(chóng)激發(fā)按所述的靜脈內(nèi)接種法(Lanar等，1996)，用在200μl RPMI中的伯氏瘧原蟲(chóng)ANKA株的2000(BALB/c)或200(C57BL/6)子孢子激發(fā)小鼠。這些子孢子從史氏按蚊的唾液腺中解剖得到，維持在飼喂感染的小鼠后在18℃下20-25天。在激發(fā)后5-12天觀察所取的吉姆沙染色的血液涂片中出現(xiàn)伯氏瘧原蟲(chóng)的環(huán)形，以檢測(cè)血液階段的瘧原蟲(chóng)感染，有感染表明免疫接種失敗。
惡性瘧原蟲(chóng)激發(fā)用解剖自岡比亞按蚊唾液腺的20,000個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)NF54株子孢子，在麻醉狀態(tài)下用靜脈接種法激發(fā)黑猩猩。為了檢測(cè)在外周血中出現(xiàn)低水平的惡性瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)，自激發(fā)后第5天開(kāi)始，用顯微鏡和寄生蟲(chóng)培養(yǎng)法每天檢查來(lái)自這些黑猩猩的血液樣品。
P815腫瘤激發(fā)通過(guò)靜脈內(nèi)接種法，用在200μl PBS中的1×105P815細(xì)胞激發(fā)小鼠。監(jiān)測(cè)這些動(dòng)物的成活率。
流感病毒激發(fā)通過(guò)鼻腔內(nèi)接種，用100血細(xì)胞凝集素單位(HA)的流感病毒A/PR/8/34激發(fā)小鼠。激發(fā)后每天給小鼠稱(chēng)重并監(jiān)測(cè)成活率。
用四聚體確定肽特異的CTL
由Mamu-A*01-重鏈和β2-微球蛋白組成的四聚體復(fù)合物按Ogg等(1998)所描述的方法制得。用5′引物MamuNdel5′-CCTGAC TCA GAC CAT ATG GGC TCT CAC TCC ATG [SEQ ID NO74]和3′引物5′-GTG ATA AGC TTA ACG ATG ATT CCA CACCAT TTT CTG TGC ATC CAG AAT ATG ATG CAG GGA TCC CTCCCA TCT CAG GGT GAG GGG C[SEQ ID NO75]，從cDNA PCR擴(kuò)增出編碼Mamu-A*01 MHC I型重鏈的無(wú)導(dǎo)肽細(xì)胞外部分的DNA。前者引物含有NdeI限制性位點(diǎn)，后者包括HindIII位點(diǎn)和編碼生物素化酶BriA底物肽。PCR產(chǎn)物用NdeI和HindIII消化，然后連接到細(xì)菌表達(dá)載體pGMT7的多連接子的相同位點(diǎn)。編碼無(wú)導(dǎo)肽的β2-微球蛋白的羅猴基因從cDNA克隆用PCR擴(kuò)增得到，所用的引物B2MBACK5′-TCA GAC CAT ATG TCT CGC TCC GTG GCC[SEQ ID NO76]和B2MFOR5′-TCA GAC AAG CTT TTA CATGTC TCG ATC CCA C[SEQ ID NO77]，然后用相似的方法克隆到pGMT7的NdeI和HindIII位點(diǎn)。兩條鏈在大腸桿菌BL-21株中表達(dá)，從包含體中純化，在肽CTPYDINQM[SEQ ID NO54]存在下重新折疊，用BirA酶生物素化(親和性)然后用FPLC和monoQ離子交換柱純化。重新折疊生物素化的MHC-肽復(fù)合體的數(shù)量用ELISA分析法估計(jì)，因此單聚合復(fù)合體首先通過(guò)敏感單克隆抗體W6/32共形成而捕獲，然后用連接有堿性磷酸酶(AP)的鏈霉親和素(Sigma)及針對(duì)AP的化學(xué)比色底物而檢測(cè)到。加連接有藻紅蛋白的鏈霉親和素(ExtrAvidin；Sigma)到重新折疊生物素化的單聚體中，以MHC-肽PE-鏈霉親和素摩爾比4∶1誘導(dǎo)四聚復(fù)合體的形成。復(fù)合體避光貯存在4℃中。這些四聚體用于分析在免疫過(guò)的獼猴外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中Mamu-A*01/gag特異的CD8+T細(xì)胞的頻率。
實(shí)施例2在小鼠中免疫原性的研究誘導(dǎo)抗在伯氏瘧原蟲(chóng)和約氏瘧原蟲(chóng)的環(huán)孢子(CS)蛋白中的表位的CTL的過(guò)去研究顯示，用不同的輸送系統(tǒng)CTL誘導(dǎo)水平有變化。據(jù)報(bào)道用質(zhì)粒DNA(Sedegah等，1994)、由復(fù)制性痘苗病毒促進(jìn)的流感病毒(Li等，1991)、腺病毒(Rodrigues等，1997)和顆粒輸送系統(tǒng)(Schodel等，1994)具有部分保護(hù)作用。用50微克編碼CS蛋白的質(zhì)粒肌內(nèi)免疫小鼠，經(jīng)單次注射后小鼠的脾中產(chǎn)生中度水平的CD8+細(xì)胞和CTL活性(圖3，4)。
作為比較，用全部表達(dá)伯氏瘧原蟲(chóng)CSP的106ffu/pfu的重組痘苗病毒不同株(WR、NYVAC和MVA)靜脈內(nèi)注射BALB/c小鼠組(n＝5)。肽特異的CD8+T細(xì)胞頻率10天后用ELISPOT分析法測(cè)定。WVA.PbCSP誘導(dǎo)181+/-48、而NYVAC 221+/-27和WR 94+/-19(平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差)肽特異CD8+T細(xì)胞。這些結(jié)果表明在引發(fā)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答中，復(fù)制受損的痘苗病毒比復(fù)制性病毒株驚人地優(yōu)越。然后我們?cè)O(shè)法用同源或異源載體及質(zhì)粒DNA或MVA引發(fā)誘導(dǎo)，以促進(jìn)這些中度的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。單獨(dú)用CS重組DNA疫苗、單獨(dú)重組MVA疫苗或重組MVA然后用重組DNA經(jīng)2次免疫后觀察到低水平的CD8+T細(xì)胞(圖3)。用重組MVA促進(jìn)DNA引發(fā)的免疫應(yīng)答，觀察到非常更高水平的CD8+T細(xì)胞。在第2次實(shí)驗(yàn)中每組用10只小鼠，確證了DNA/MVA序列增強(qiáng)免疫原性DNA/MVA 856+/-201；MVA/DNA168+/-72；MVA/MVA 345+/-90；DNA/DNA 92+/-46。因此用編碼CS蛋白的重組質(zhì)粒第一次免疫接著用重組MVA病毒第二次免疫的次序，免疫后產(chǎn)生最高水平的CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
圖3顯示用不同的免疫方案后，瘧疾CD8 T細(xì)胞ELISPOT的數(shù)據(jù)。結(jié)果以每百萬(wàn)脾細(xì)胞的肽特異T細(xì)胞數(shù)表示。如在X軸所示用PbCSP質(zhì)粒DNA或PbCSP-MVA病毒或二者的組合免疫小鼠，以2周間隔為次，對(duì)bp9瘧疾表位特異的脾細(xì)胞數(shù)在最后一次免疫后2周測(cè)定。每一個(gè)代表單個(gè)小鼠中測(cè)定的形成反應(yīng)點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)(SFCs)。用質(zhì)粒DNA引發(fā)和用重組MVA病毒促進(jìn)誘導(dǎo)最高水平的CD8+T細(xì)胞。這比相反的免疫次序(MVA/DNA)、2次DNA免疫(DNA/DNA)或2次MVA免疫(MVA/MVA)更有免疫原性。它也比同時(shí)給DNA和MVA免疫(DNA+MVA 2w)、1次DNA免疫(DNA 4w)或較早或較晚時(shí)間點(diǎn)1次MVA免疫(MVA 2w和MVA 4w)更有免疫原性。
圖4顯示用編碼相同抗原的質(zhì)粒DNA引發(fā)后，基本上通過(guò)重組MVA免疫促進(jìn)的瘧疾CD8 T細(xì)胞ELISPOT和CTL水平。A和C.用γ-干擾素ELISPOT分析法測(cè)定在BALB/c小鼠中的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，該法用來(lái)自伯氏瘧原蟲(chóng)CSP的Kd限制性肽SYIPSAEKI[SEQ ID NO67]和來(lái)自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的Ld限制性肽TPHPARIGL[SEQID NO69]計(jì)數(shù)值用對(duì)數(shù)標(biāo)尺表示。B和D.用常規(guī)51Cr釋放分析法，用相同的肽(1μg/ml)體外重新刺激6天后，在效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞比率為100∶1時(shí)也測(cè)定來(lái)自相同小鼠的脾細(xì)胞。
用表達(dá)伯氏瘧原蟲(chóng)CSP和TRAP、單獨(dú)PbCSP、包括伯氏瘧原蟲(chóng)CTL表位的瘧疾表位盒(標(biāo)記為pTH.M)或β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒DNA免疫小鼠。1次DNA免疫后23天測(cè)定在小鼠中的ELISPOT和CTL水平，結(jié)果分別在A和B顯示。相同的分析用接受額外的1×107ffu表達(dá)相同抗原的重組MVA的動(dòng)物、初次免疫后2周進(jìn)行。在這些動(dòng)物中ELISPOT和CTL水平分別在C和D顯示。每一條表示來(lái)自單個(gè)動(dòng)物的數(shù)據(jù)。
也進(jìn)行研究包含串聯(lián)排列的HIV和瘧疾表位的表位串的免疫原性。用該表位，當(dāng)用DNA疫苗免疫，接著用重組MVA疫苗免疫時(shí)，再次產(chǎn)生最高水平的CD8+T細(xì)胞和CTL(表4，圖5)。表4 用ELISPOT分析法確定不同的DNA/MVA組合的免疫原性第一次免疫 第二次免疫 HIV表位 瘧疾表位DNA-HM DNA-HM 56±264±4MVA-HM MVA-HM 786±334 238±106MVA-HM DNA-HM 306±78 58±18DNA-HM MVA-HM 1000±487 748±446無(wú) DNA-HM 70±60100±10無(wú) MVA-HM 422±128 212±94表4顯示用所示的質(zhì)粒DNA和MVA不同免疫方案后，進(jìn)行ELISPOT分析法測(cè)定針對(duì)HIV和瘧疾表位的特異CD8+T細(xì)胞水平的結(jié)果。數(shù)字為每百萬(wàn)脾細(xì)胞中形成反應(yīng)點(diǎn)的細(xì)胞。HM表位串在圖2說(shuō)明。在所有情況下用BALB/c小鼠。瘧疾表位為pb9，在圖2和3所示。HIV表位是RGPGRAFVTI[SEQ ID NO51]。免疫的劑量為50μg質(zhì)粒DNA或107噬菌斑形成單位的重組MVA。所有免疫在肌內(nèi)進(jìn)行。在所有情況下第1次和第2次免疫的間隔時(shí)間為14～21天。
表5顯示使用質(zhì)粒DNA和重組MVA通過(guò)各種免疫方案，在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)對(duì)瘧疾和HIV表位的CTL應(yīng)答。按表3相應(yīng)所述的方法肌內(nèi)免疫小鼠。對(duì)瘧疾和HIV兩種表位來(lái)說(shuō)，只有用質(zhì)粒DNA引發(fā)和重組MVA促進(jìn)后觀察到高水平的CTL(在效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞之比為25∶1時(shí)特異裂解＞30％)。在本實(shí)驗(yàn)所用的抗原是HIV-瘧疾表位串。重組的MVA標(biāo)記為MVA.HM而表達(dá)該表位串的質(zhì)粒DNA標(biāo)記為pTH.HM。顯示了在各種效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比率的特異裂解水平。這些結(jié)果用2種肽pb9和RGPGRAFVTI[SEQ ID NO51]體外重新刺激脾細(xì)胞5天后測(cè)定。
Allsopp等(1996)報(bào)道比較誘導(dǎo)CTL的多種輸送系統(tǒng)。重組的Ty病毒樣顆粒(Ty-VLPs)和脂質(zhì)尾巴的瘧疾肽兩者給出良好的CTL誘導(dǎo)率，但Ty-VLPs更好因?yàn)閷?duì)于良好的CTL誘導(dǎo)率它們僅需要單一的免疫劑量。然而，正如本發(fā)明所示，甚至2個(gè)劑量的Ty顆粒不能誘導(dǎo)明顯的抗子孢子激發(fā)的保護(hù)作用(表7，第一行)。用編碼伯氏瘧原蟲(chóng)環(huán)孢子蛋白的修飾過(guò)的重組痘苗Ankara病毒免疫也產(chǎn)生良好水平的CTL。然而，通過(guò)用Ty-VLP第1次免疫接著用MVA CS疫苗第2次免疫，可獲得更高水平的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(表5)。表5 由ELISPOT和CTL分析法確定的各種Ty-VLP/MVA組合的免疫原性第1次免疫 第2次免疫 ELISPOT數(shù) ％特異裂解Ty-CABDH Ty-CABDH 75 15MVA.PbCSP MVA.PbCSP 38 35Ty-CABDH MVA.PbCSP 22542Ty-CABDH MVA.HM1930 未做表5 用所示的Ty-VLPs和重組MVA病毒不同免疫方案接種后，進(jìn)行ELISPOT和CTL分析而測(cè)定對(duì)瘧疾表位pb9特異的CD8+T細(xì)胞水平的結(jié)果。CTL和ELISPOT數(shù)據(jù)來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)。根據(jù)未重新刺激的細(xì)胞測(cè)定ELISPOT水平(每百萬(wàn)淋巴細(xì)胞的反應(yīng)點(diǎn)數(shù))，而用pb9肽體外重新刺激5-7天的細(xì)胞，以效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比40∶1測(cè)定CTL活性，結(jié)果以特異裂解表示。2種數(shù)據(jù)代表3只小鼠的平均水平。在所有情況下用BALB/c小鼠。免疫劑量為50μg Ty-VLP或107ffu(轉(zhuǎn)化灶形成單位)的重組MVA。所有免疫接種為肌肉內(nèi)。第1次和第2次免疫的時(shí)間間隔為14-21天。MVA.HM包括盒CAB。
通過(guò)基因槍輸送DNA引發(fā)免疫應(yīng)答和用重組MVA促進(jìn)免疫原性和激發(fā)研究了應(yīng)用基因槍真皮內(nèi)輸送質(zhì)粒DNA，因而引發(fā)免疫應(yīng)答及用重組MVA促進(jìn)。用下列的方案免疫BALB/c小鼠組。
I)以2周間隔用pTH.PbCSP(每次免疫4mg)進(jìn)行3次基因槍免疫II)2次基因槍免疫，接著2周后靜脈注射MVAIII)一次肌內(nèi)DNA免疫，接著2周后靜脈注射MVA3種免疫方案的免疫原性用ELISPOT分析法分析。用2次基因槍免疫接著靜脈注射MVA促進(jìn)和肌內(nèi)DNA注射接著靜脈注射MVA，觀察到最高頻率的特異T細(xì)胞(圖6)。
圖6顯示用不同的免疫方案接種后進(jìn)行ELISPOT分析所測(cè)定的特異CD8+T細(xì)胞水平的結(jié)果。如所示的方法免疫BALB/c小鼠組(n＝3)(g.g.＝基因槍)。所有免疫時(shí)間為14天。最后一次免疫后2周進(jìn)行ELISPOT分析。
在不同小鼠品系中對(duì)相同抗原的CTL誘導(dǎo)為說(shuō)明如上所述用2種CTL表位，來(lái)源于伯氏瘧原蟲(chóng)CSP的SYIPSAEKI[SEQ ID NO67]和來(lái)源于HIV的RGPGRAFVTI[SEQID NO68]在BALB/c小鼠中產(chǎn)生的促進(jìn)效應(yīng)是否普遍現(xiàn)象的問(wèn)題，進(jìn)行了2組實(shí)驗(yàn)。在5種近交的小鼠品系中研究對(duì)流感病毒核蛋白的CTL應(yīng)答。在第一次實(shí)驗(yàn)中研究了3種來(lái)源于流感病毒核蛋白的文獻(xiàn)發(fā)表的鼠CTI表位(見(jiàn)表3)。用3種不同H-2單倍型，BALB/c和DBA/2(H-2d)、C57BL/6和129(H-2b)、CBA/J(H-2k)的小鼠。一組動(dòng)物以2周間隔用編碼流感病毒核蛋白的質(zhì)粒V1J-NP免疫2次。另一組相同的動(dòng)物用V1J-NP引發(fā)，2周后用106ffu表達(dá)流感病毒NP的MVA.NP靜脈內(nèi)促進(jìn)。在單個(gè)小鼠中的CTL水平用51Cr-釋放分析法，用肽重新刺激的脾細(xì)胞測(cè)定。如圖7中所示，在所有分析過(guò)的小鼠品系中，DNA引發(fā)/MVA促進(jìn)免疫方案誘導(dǎo)較高水平的裂解并且超過(guò)2次DNA注射的效果。
圖7顯示在不同的小鼠品系中抗流感病毒NP的CTL應(yīng)答。不同品系的小鼠以2周間隔用編碼流感病毒核蛋白的DNA疫苗V1J-NP免疫2次(空心圓)，或者用相同的DNA疫苗引發(fā)然后2周后用表達(dá)流感病毒核蛋白的重組MVA促進(jìn)(實(shí)心圓)。最后一次免疫后2周，用各種肽(表3)體外重新刺激脾細(xì)胞。CTL活性用標(biāo)準(zhǔn)51Cr-釋放測(cè)定法用MHC I型匹配的靶細(xì)胞測(cè)定。
在不同小鼠品系中對(duì)不同抗原的CTL誘導(dǎo)用不同的抗原和不同的近交小鼠品系，進(jìn)一步研究MVA促進(jìn)對(duì)質(zhì)粒DNA引發(fā)的免疫應(yīng)答的影響。不同品系的小鼠用2種DNA免疫法用不同的抗原免疫并且和DNA/MVA免疫法相比較所用的抗原是大腸桿菌-半乳糖苷酶、瘧疾/HIV表位串、鼠腫瘤表位串和惡性瘧原蟲(chóng)TRAP。與2次DNA免疫相比較，在所有試驗(yàn)的不同小鼠品系和抗原組合中，DNA引發(fā)/MVA促進(jìn)方案誘導(dǎo)更高水平的CTL(圖8)。
圖8顯示在不同近交小鼠品系中誘導(dǎo)的抗不同抗原的CTL應(yīng)答。小鼠以2周間隔用2次DNA疫苗免疫法免疫(空心圓)，或者用DNA疫苗引發(fā)2周后，用表達(dá)相同抗原的重組MVA促進(jìn)(實(shí)心圓)。所用的品系和抗原為在A中，C57BL/6，瘧原蟲(chóng)TRAP；在B中，DBA/2，大腸桿菌β-半乳糖苷酶；在C中，BALB/c，抗瘧疾肽(pb9)CTL活性的HM表位串；在D中，DBA/2，抗pb9 CTL活性的HM表位串；在E中，BALB/c，抗HIV肽CTL活性的HM表位串；在F中，DBA/2，抗HIV肽CTL活性的HM表位串；在G中，BALB/c，抗衍生于P1A的肽CTL活性的腫瘤表位串。肽表位的序列在表3顯示。每一條曲線顯示各個(gè)小鼠的數(shù)據(jù)。
子孢子能有效地引發(fā)能由MVA促進(jìn)的免疫應(yīng)答生活在瘧疾流行區(qū)的人群不斷地接觸瘧原蟲(chóng)的侵入。在這些天然接觸過(guò)的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)低水平的瘧疾特異CTL。為說(shuō)明低水平子孢子誘導(dǎo)CTL應(yīng)答是否能通過(guò)MVA促進(jìn)的問(wèn)題，BALB/c小鼠被照射過(guò)的伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子(預(yù)防瘧疾感染)免疫，然后用MVA促進(jìn)。最后一次免疫后2周，重新刺激脾細(xì)胞，然后測(cè)定裂解活性。用50或300+500個(gè)子孢子2次注射誘導(dǎo)非常低或無(wú)法檢測(cè)的裂解水平。用MVA促進(jìn)誘導(dǎo)高水平的肽特異CTL。單獨(dú)MVA僅誘導(dǎo)中度的裂解水平(圖9)。
圖9顯示子孢子引發(fā)的CTL應(yīng)答基本上被MVA所促進(jìn)。在A中，用2種低劑量(50+50)照射過(guò)的子孢子免疫小鼠。在B中，用2種高劑量(300+500)的子孢子免疫；在D中，低劑量子孢子引發(fā)后用MVA.PbCSP促進(jìn)的小鼠；在E中用高劑量子孢子引發(fā)。在C中顯示用MVA.PbCSP免疫后的CTL應(yīng)答。
重組的腺病毒作為引發(fā)劑用質(zhì)粒DNA和重組Ty-VLP作為引發(fā)劑實(shí)例說(shuō)明引發(fā)-促進(jìn)免疫方案。在此提供用非復(fù)制性腺病毒作為引發(fā)劑的一個(gè)實(shí)施例。用表達(dá)大腸桿菌β-半乳糖苷酶(Adeno-GAL)的復(fù)制缺陷重組腺病毒。BALB/c小鼠組用質(zhì)粒DNA接著用MVA免疫或先用腺病毒接著用MVA免疫。所用的所有輸送系統(tǒng)編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶。用質(zhì)粒DNA或腺病毒引發(fā)然后用MVA促進(jìn)的CTL應(yīng)答誘導(dǎo)相似水平的CTL(圖10)。
圖10顯示用質(zhì)粒DNA或重組腺病毒引發(fā)，然后用MVA促進(jìn)的CTL應(yīng)答。BALB/c小鼠組(n＝3)用質(zhì)粒DNA A或表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組腺病毒B引發(fā)。質(zhì)粒DNA肌內(nèi)施用，MVA靜脈內(nèi)施用而腺病毒真皮內(nèi)施用。最后一次免疫后2周用肽TPHPARIGL[SEQ ID NO69]重新刺激脾細(xì)胞。CTL活性用肽標(biāo)記P815細(xì)胞測(cè)定。
DNA引發(fā)痘苗病毒促進(jìn)方案的免疫原性依賴(lài)于所用的痘苗病毒株的復(fù)制能力用不同的重組痘苗病毒株檢驗(yàn)引發(fā)促進(jìn)策略，以確定其復(fù)制能力有差異的不同病毒株是否在可能促進(jìn)DNA引發(fā)的CTL應(yīng)答有差異。與用相同劑量的能復(fù)制的WR痘苗病毒促發(fā)后的CTL應(yīng)答相比較，用復(fù)制缺陷的重組痘苗病毒如MVA和NYVAC促進(jìn)導(dǎo)致誘導(dǎo)更強(qiáng)的CTL應(yīng)答(圖11)。
圖11顯示在BALB/c小鼠中用質(zhì)粒DNA引發(fā)接著用不同的重組痘苗病毒促進(jìn)的CTL應(yīng)答。所述的動(dòng)物用pTH.PbCSP 50μg/鼠肌內(nèi)注射引發(fā)，2周后用不同的表達(dá)PbCSP的重組痘苗病毒株(每小鼠靜脈內(nèi)注射106pfu)促進(jìn)。不同的重組痘苗病毒株在A為MVA；在B為NYVAC而在C為WR。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)復(fù)制受損的痘苗病毒株比復(fù)制性病毒株的優(yōu)越性。BALB/c小鼠組(n＝6)用50μg/動(dòng)物的pSG2.PbCSP(肌內(nèi)注射)引發(fā)，10天后用106ffu/pfu的表達(dá)PbCSP的重組MVA、NYVAC和WR靜脈內(nèi)注射促進(jìn)。用ELISPOT分析法確定肽特異的CD8+T細(xì)胞的頻率。該頻率為MVA 1103+/-438，NYVAC 826+/-249和WR 468+/-135。因此用CTL和ELISPOT兩種分析法作為CD8 T細(xì)胞免疫原的測(cè)定法，觀察到與能復(fù)制的病毒株相比復(fù)制受損的痘苗病毒株驚奇的基本上較強(qiáng)的免疫原性。
應(yīng)用重組的金絲雀或禽痘病毒促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答用過(guò)去所描述過(guò)的穿梭載體(Taylor等，病毒學(xué)1992，187321-328和Taylor等，疫苗1988，6504-508)，制得重組的金絲雀痘病毒(rCPV)或禽痘病毒(rFVP)。針對(duì)這些穿梭載體的策略是以痘苗病毒特異的啟動(dòng)子在前插入編碼目的蛋白的基因，所述的啟動(dòng)子位于包括來(lái)源于CPV或FPV基因組序列的2個(gè)側(cè)翼之間。選擇這些側(cè)翼序列是為了避免插入到必需的病毒基因中。在允許的鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞系即原代雞胚成纖維細(xì)胞中，通過(guò)體內(nèi)重組產(chǎn)生重組的CPV或FPV。用禽痘病毒或金絲雀痘病毒能表達(dá)任何抗原或表位串的蛋白序列。重組的CPV或FPV的特征為，用抗原特異的抗體或包括進(jìn)入重組基因的抗體表位表達(dá)目的蛋白。重組的病毒生長(zhǎng)在原代CEF中。按材料和方法中所述的方法，用質(zhì)粒DNA引發(fā)免疫應(yīng)答。該質(zhì)粒DNA引發(fā)的免疫應(yīng)答用107ffu/pfu的rCPV或rFPV靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)或肌內(nèi)接種促進(jìn)。監(jiān)測(cè)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答并按本發(fā)明所述的方法進(jìn)行激發(fā)。
實(shí)施例3在小鼠中研究瘧疾激發(fā)為估測(cè)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答水平的保護(hù)性效能，用2000或200個(gè)伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子經(jīng)靜脈內(nèi)注射免疫激發(fā)BALB/c或C57BL/6小鼠。這導(dǎo)致由子孢子對(duì)肝細(xì)胞的感染。然而，在足夠強(qiáng)的抗肝內(nèi)寄生蟲(chóng)的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答存在下，沒(méi)有活的寄生蟲(chóng)能離開(kāi)肝臟并且也檢測(cè)不到血液階段的寄生蟲(chóng)。因此，激發(fā)后5-12天通過(guò)顯微鏡評(píng)價(jià)來(lái)自激發(fā)小鼠血涂片的寄生蟲(chóng)。
用分別編碼伯氏瘧原蟲(chóng)的CS蛋白和TRAP抗原的2種質(zhì)粒DNAs混合物2次免疫過(guò)的BALB/c小鼠，不能保護(hù)抵抗子孢子激發(fā)。用編碼相同的2種抗原的重組MVA病毒混合物2次免疫過(guò)的小鼠不能保護(hù)抵抗子孢子激發(fā)。第一次用2種MVAs和第二次用2種重組質(zhì)粒免疫的小鼠也不能保護(hù)抵抗子孢子激發(fā)。然而，第一次用2種質(zhì)粒DNAs和第二次用2種重組的MVA病毒免疫的全部15只小鼠完全抗子孢子激發(fā)(表6A和B)。
為評(píng)價(jià)所觀察到的保護(hù)作用是否由于對(duì)CS抗原或?qū)RAP或?qū)Χ呖乖拿庖邞?yīng)答，于是各自用每種抗原免疫各組小鼠(表6B)。第一次用CS質(zhì)粒DNA和第2次用CS MVA病毒免疫的所有10只小鼠完全保護(hù)抵抗子孢子激發(fā)。第一次用TRAP質(zhì)粒DNA疫苗和第二次用TRAP MVA病毒免疫的16只小鼠，其中14只保護(hù)抵抗子孢子激發(fā)。因此，當(dāng)采用上述的免疫方案時(shí)，單獨(dú)的CS抗原就有完全保護(hù)性而用相同的方案TRAP抗原基本上有保護(hù)性。
在誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答水平和所觀察到的保護(hù)作用之間的良好相關(guān)性，強(qiáng)烈暗示CD8+應(yīng)答是所觀察到的保護(hù)作用的可靠原因。在以前過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)闡明，抗伯氏瘧原蟲(chóng)CS蛋白中主要CD8+T細(xì)胞表位的CD8+T淋巴細(xì)胞克隆能保護(hù)抵抗子孢子激發(fā)。為確定所誘導(dǎo)的保護(hù)作用是否確實(shí)由針對(duì)該表位的CD8+T細(xì)胞所介導(dǎo)，我們于是采用質(zhì)粒DNA和編碼來(lái)自伯氏瘧原蟲(chóng)僅9個(gè)氨基酸序列作為部分表位串的重組MVA(表6B)。(所有其他表位來(lái)源于不是伯氏瘧原蟲(chóng)的微生物)。第一次用編碼上述表位串的質(zhì)粒和第二次用也編碼具有伯氏瘧原蟲(chóng)CTL表位的表位串的重組MVA免疫的10只小鼠，引起完全免受子孢子激發(fā)的保護(hù)作用。因此，所誘導(dǎo)的保護(hù)免疫應(yīng)答應(yīng)該是CTL應(yīng)答，該應(yīng)答靶向所述的九肽序列。表6 用不同的DNA和MVA疫苗組合得到的小鼠激發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果第1次免疫 第2次免疫 感染數(shù)/激發(fā)數(shù)％保護(hù)作用A. 所用的抗原PbCSP+PbTRAPDNADNA 5/5 0％MVAMVA 9/1010％DNAMVA 0/5 100％MVADNA 5/5 0％用β-半乳糖苷酶免疫的對(duì)照小鼠DNADNA 5/5 0％MVAMVA 5/5 0％DNAMVA 5/5 0％MVADNA 5/5 0％B.DNA(CSP+TRAP) MVA(CSP+TRAP)0/10100％DNA(CSP) MVA(CSP) 0/10100％DNA(TRAP) MVA(TRAP)2/1688％DNA(表位) MVA(表位)0/11100％DNA(β-gal)MVA(β-gal) 6/7 14％無(wú) 無(wú) 9/1010％表6 所示的用質(zhì)粒DNA和MVA的不同免疫方案進(jìn)行2次激發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(A和B)。免疫的劑量為50μg的質(zhì)粒DNA或106ffu的重組MVA。在所有情況下，第1次免疫和第2次免疫的時(shí)間間隔為14～21天。在最后一次免疫后18-29天通過(guò)靜脈注射2000個(gè)伯氏瘧原蟲(chóng)的子孢子進(jìn)行激發(fā)，然后在激發(fā)后5、8和10天評(píng)價(jià)血涂片。CSP和TRAP表示為完全的伯氏瘧原蟲(chóng)抗原而‘表位’表示在表1所示的僅含有單一伯氏瘧原蟲(chóng)Kd-限制性九肽CTL表位的表位盒。注意在實(shí)驗(yàn)B中，單獨(dú)用表位串免疫產(chǎn)生100％保護(hù)作用。
用編碼pb9的重組Ty-VLPs 2次免疫過(guò)的小鼠完全對(duì)感染敏感。相似地，用編碼整個(gè)CS蛋白的重組MVA 2次免疫過(guò)的小鼠完全對(duì)感染敏感。然而，用Ty-VLP免疫一次接著用重組的MVA免疫一次的小鼠，當(dāng)用表達(dá)全長(zhǎng)的CS蛋白的MVA促進(jìn)時(shí)顯示為降低85％的瘧疾發(fā)生率，而當(dāng)用表達(dá)包括pb9的HM表位串的MVA促進(jìn)時(shí)降低95％的瘧疾發(fā)生率(表7)。表7 用Ty-VLPs和MVA的不同免疫方案得到的激發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果第1次免疫 第2次免疫 感染數(shù)/激發(fā)數(shù) ％保護(hù)作用Ty-CABDHFETy-CABDHFE 7/8 13％Ty-CABDH MVA.PbCSP 2/13 85％Ty-CABDHFEMVA-NP 5/5 0％MVA.PbCSP MVA.PbCSP 6/6 0％MVA.HMTy-CABDHFE 14/14 0％Ty-CABDHFEMVA.HM 1/21 95％無(wú)MVA.HM 8/8 0％無(wú)無(wú) 11/12 9％表7 所示的用Ty-VLPs和MVA的不同免疫方案得到的激發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在所有情況下用BALB/c小鼠。靜脈內(nèi)施用50μg Ty-VLP或107ffu的重組MVA進(jìn)行免疫。在所有的情況下，第1次和第2次免疫的時(shí)間間隔為14～21天。最后一次免疫后18-29天通過(guò)靜脈注射2000個(gè)伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后5、8和10天評(píng)價(jià)血涂片。CSP表示完全的伯氏瘧原蟲(chóng)抗原。Ty-VLPs攜帶在表1所述的表位盒CABDH或CABDHFE。MVA.HM包括盒CAB。
為確定所觀察到的用重組MVA促進(jìn)的增強(qiáng)免疫原性和保護(hù)效能是否對(duì)該特殊的痘苗病毒株是唯一的或可由其他重組痘苗病毒承擔(dān)，進(jìn)行了下列的實(shí)驗(yàn)。小鼠用編碼伯氏瘧原蟲(chóng)CS蛋白的DNA疫苗免疫，然后用(i)編碼該抗原的重組MVA；(ii)編碼相同抗原的重組野生型痘苗病毒(西方保存株)(Satchidanandam等，1991)或(iii)編碼相同瘧疾抗原的重組NYVAC(COPAK)病毒(Lanar等，1996)促進(jìn)。用MVA重組體促進(jìn)觀察到最高程度的保護(hù)作用，為80％(表8)。用野生型重組痘苗病毒促進(jìn)觀察到非常低水平的保護(hù)作用(10％)而用NYVAC重組體促進(jìn)觀察到明顯水平的保護(hù)作用，為60％。因此我們所描述的引發(fā)促進(jìn)方案可用任何非復(fù)制性痘苗病毒株誘導(dǎo)保護(hù)效能。MVA重組體和NYVAC兩者比WR株重組體明顯更好(每種均P＜0.05)。表8 用不同的痘苗病毒株重組體促進(jìn)的DNA的激發(fā)數(shù)據(jù)結(jié)果第1次免疫 第2次免疫 感染數(shù)/激發(fā)數(shù) ％保護(hù)作用DNA-βgal. MVA.NP 8/8 0％DNA-CSP MVA-CSP 2/10 80％DNA-CSP WR-CSP 9/10 10％DNA-CSP NYVAC-CSP4/10 60％表8 所示的用質(zhì)粒DNA和各種痘苗病毒重組體的不同免疫方案得到的激發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在所有情況下用BALB/c小鼠。免疫的劑量為50μg質(zhì)粒DNA或106ffu/pfu的重組MVA或104ffu/pfu的重組野生型(WR)痘苗病毒或106ffu/pfu的重組NYVAC。由于WR株能在宿主中復(fù)制而其他病毒株不能，在本實(shí)驗(yàn)中用低劑量的WR。第1次和第2次免疫的間隔時(shí)間為23天。最后一次免疫后28天通過(guò)靜脈注射2000個(gè)伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后7、9和11天評(píng)價(jià)血涂片。pbCSP表示為完全的伯氏瘧原蟲(chóng)抗原而NP表示流感病毒的核蛋白抗原(用作對(duì)照抗原)。用表達(dá)β-半乳糖苷酶而不顯瘧疾抗原的質(zhì)粒DNA載體第1次免疫A組小鼠。
在表8所示的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，小鼠被編碼伯氏瘧原蟲(chóng)CS蛋白的DNA疫苗免疫，然后用(i)編碼該抗原的重組MVA；(ii)編碼相同抗原的重組WR痘苗病毒或(iii)編碼相同瘧疾抗原的重組NYVAC(COPAK)病毒促進(jìn)，所有的劑量為106ffu/pfu。用重組NYVAC(80％)或重組MVA(66％)觀察到高并且統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯程度的保護(hù)作用。用WR重組痘苗病毒促進(jìn)觀察低和不明顯水平的保護(hù)作用(26％)(表9)。MVA和NYVAC每一種促進(jìn)比WR促進(jìn)給出更明顯的保護(hù)作用(分別為P＝0.03和P＝0.001)。這些數(shù)據(jù)重新強(qiáng)調(diào)非復(fù)制的痘病毒株是誘導(dǎo)高水平保護(hù)作用的較好促進(jìn)劑。表9 不同的重組痘苗病毒株對(duì)保護(hù)作用的影響第1次免疫 第2次免疫 感染數(shù)/激發(fā)數(shù)％保護(hù)作用DNACSP MVA.PbCSP 5/15 66CSP NYVAC.PbCSP 2/15 80CSP WR.PbCSP11/15 26β-半乳糖苷酶MVA.NP 8/8 0表9 用質(zhì)粒DNA和作為促進(jìn)免疫的不能復(fù)制的痘苗重組體的不同免疫方案得到的激發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在所有情況下用BALB/c小鼠。免疫的劑量為50μg的質(zhì)粒DNA或106ffu/pfu的重組MVA或重組野生型(WR)痘苗病毒或重組NYVAC。第1次和第2次免疫的間隔時(shí)間為23天。最后一次免疫后28天通過(guò)靜脈注射2000個(gè)伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后7，9和11天評(píng)價(jià)血涂片。PbCSP表示整個(gè)伯氏瘧原蟲(chóng)抗原而NP表示流感病毒的核蛋白抗原(用作對(duì)照抗原)。對(duì)照免疫用表達(dá)β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒DNA載體接著用MVA NP進(jìn)行。
用重組MVA促進(jìn)免疫應(yīng)答的不同途徑重組MVA靜脈內(nèi)注射并不是免疫人類(lèi)的優(yōu)選途徑，并且在大規(guī)模免疫中也不方便。因此用MVA促進(jìn)的不同途徑以檢驗(yàn)其免疫原性和保護(hù)性效能。小鼠用質(zhì)粒DNA肌內(nèi)注射引發(fā)，2周后經(jīng)下經(jīng)途徑靜脈內(nèi)(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、肌肉內(nèi)(i.m.)和真皮內(nèi)(i.d.)，用MVA促進(jìn)它們。該促進(jìn)2周后用ELISPOT測(cè)定法確定肽特異的CD8+T細(xì)胞。誘導(dǎo)該細(xì)胞最高水平的最有效途徑是i.v.和i.d.接種MVA。其它途徑引起中度至弱的應(yīng)答(圖12)。
圖12顯示經(jīng)不同途徑的MVA促進(jìn)后肽特異的CD8+T細(xì)胞的頻率。結(jié)果從每一百萬(wàn)脾細(xì)胞的斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)數(shù)表示。小鼠用質(zhì)粒DNA引發(fā)然后2周后經(jīng)所示的途徑用MVA促進(jìn)。最后一次免疫后2周，用INF-γ-ELISPOT法確定對(duì)SYIPSAEKI[SEQ ID NO67]肽特異的脾細(xì)胞數(shù)。每條代表來(lái)自單獨(dú)分析的3只小鼠的SFCs平均數(shù)。
在一激發(fā)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)靜脈內(nèi)途徑的促進(jìn)與真皮內(nèi)和肌肉內(nèi)途徑進(jìn)行比較。真皮內(nèi)途徑引起高水平的保護(hù)作用(80％保護(hù)作用)。在經(jīng)肌肉內(nèi)途徑促進(jìn)的動(dòng)物組中，50％的動(dòng)物受到保護(hù)。用MVA靜脈內(nèi)施用獲得完全的保護(hù)作用(表10)。表10 MVA施用途徑對(duì)保護(hù)效能的影響第1次免疫作用 第2次免疫作用 感染數(shù)/激發(fā)數(shù) ％保護(hù)作用DNAMVACSP CSP i.v.*0/20 100CSP CSP i.d. 2/10 80CSP CSP i.m. 5/10 50表位表位i.v. 1/10 90NP NP i.v. 10/10 0*來(lái)自2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的累積數(shù)據(jù)表10 用不同途徑的MVA促進(jìn)免疫的激發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。動(dòng)物通過(guò)肌肉內(nèi)注射質(zhì)粒DNA被引發(fā)，2周后用所示的重組MVA(106ffu/小鼠)經(jīng)所示的途徑施用。最后一次免疫后16天，用2000個(gè)伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子激發(fā)小鼠，激發(fā)后第8和第10天篩選血階段的寄生物血癥。
DNA引發(fā)的其他途徑用基因槍引發(fā)肽特異的CD8+T細(xì)胞作為實(shí)例在Eisenbraun等，DNA細(xì)胞生物學(xué)1993，12791-797和Degano等，疫苗1998，16394-398中詳細(xì)描述基因槍輸送法。
到此為止描述的用質(zhì)粒DNA引發(fā)免疫應(yīng)答的小鼠瘧疾激發(fā)實(shí)驗(yàn)用肌肉骨注射質(zhì)粒DNA。用Biolistic裝置真皮內(nèi)輸送DNA是另一種引發(fā)特異的CTL應(yīng)答的途徑。質(zhì)粒DNA被包被到金顆粒上，然后用基因槍真皮內(nèi)輸送。單獨(dú)用基因槍以2周間隔免疫小鼠組(n＝10)3次(4μg/每次免疫)，用基因槍接著用靜脈內(nèi)MVA.PbCSP促進(jìn)免疫2次，或者用50μg pTH.PbCSP肌肉內(nèi)免疫，2周后用MVA.PbCSP靜脈內(nèi)促進(jìn)。最后一次免疫后2周，所述的動(dòng)物被2000個(gè)子孢子激活，以評(píng)價(jià)每種免疫方案的保護(hù)效能。在接受2次基因槍免疫后靜脈內(nèi)MVA促進(jìn)的組中，10只動(dòng)物中有一只出現(xiàn)血液階段寄生物血癥(90％的保護(hù)作用)。用肌肉內(nèi)DNA引發(fā)然后靜脈注射MVA促進(jìn)的組中觀察到完全的保護(hù)作用。用基因槍免疫3次的10只動(dòng)物，其中7只被感染(30％的保護(hù)作用)(表11)。第1次免疫 第2次免疫 第3次免疫 感染數(shù)/％保護(hù)作用DNA 激發(fā)數(shù)基因槍DNA 基因槍DNA 基因槍DNA 7/10 30基因槍DNA 基因槍DNA MVA.PbCSP 1/10 90- DNA i.mMVA.PbCSP 0/10 100首次組 10/100表11 比較不同的DNA引發(fā)途徑(用基因槍真皮內(nèi)輸送相對(duì)于肌肉內(nèi)針頭注射)的激發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按所示的方法免疫BALB/c小鼠組(n＝10)。每次基因槍免疫表真皮內(nèi)輸送4μg的質(zhì)粒DNA。對(duì)于肌肉內(nèi)免疫，注射50μg的質(zhì)粒DNA。最后一次免疫后20天，按以前所描述的方法激發(fā)小鼠。
保護(hù)高度敏感的C57BL/6小鼠C57BL/6小鼠對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子激發(fā)非常敏感。用DNA-MVA引發(fā)促進(jìn)方案及用兩種前紅細(xì)胞抗原PbCSP和PbTRAP免疫C57BL/6小鼠，每只鼠用200或1000個(gè)感染性子孢子激發(fā)(200個(gè)子孢子相當(dāng)于在該品系誘導(dǎo)感染所需的劑量2倍以上)。用200個(gè)子孢子激發(fā)的所有10只小鼠表現(xiàn)為使激發(fā)不起作用的免疫性。甚至用1000個(gè)子孢子激發(fā)的組中，60％的小鼠受到保護(hù)(表12)。所有首次組C57BL/6小鼠激發(fā)后被感染。表12 子孢子激發(fā)C57BL/6小鼠的保護(hù)作用動(dòng)物感染數(shù)/激發(fā)數(shù)％保護(hù)作用1000只子孢子DNA然后用MVA 4/1060首次組 5/5 0200只子孢子DNA然后用MVA 0/10100首次組 5/5 0表12 用C57BL/6小鼠的激發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用DNA接著用MVA引發(fā)促進(jìn)方案及用PbCSP和PbTRAP免疫動(dòng)物。14天后按所示的方法用伯氏瘧原蟲(chóng)子孢子激發(fā)小鼠。
實(shí)施例4在小鼠2種進(jìn)一步的疾病模型中DNA引發(fā)/MVA促進(jìn)方案的保護(hù)效能下列免疫原性研究中，在2種另外的小鼠激發(fā)模型中檢測(cè)到DNA-引發(fā)MVA-促進(jìn)方案的保護(hù)效能。2種激發(fā)模型是P815腫瘤模型和A型流感病毒激發(fā)模型。在2種模型系統(tǒng)中顯示CTL介導(dǎo)保護(hù)作用。
P815腫瘤激發(fā)用DNA接著用表達(dá)腫瘤表位串或HM表位串的MVA的組合免疫DBA/2小鼠組(n＝10)。最后一次免疫后2周靜脈內(nèi)給予105P815細(xì)胞激發(fā)小鼠。該激發(fā)后，定期監(jiān)測(cè)小鼠出現(xiàn)腫瘤相關(guān)的特征和成活率。
圖13顯示2組小鼠的成活率。激發(fā)后60天用腫瘤表位串免疫的組中，10只小鼠其中8只仍成活。在用HM表位串免疫的組中，僅2只動(dòng)物存活。該結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性2/10相對(duì)于8/10卡方＝7.2，P＝0.007。與用HM表位串免疫的組相比較，在用腫瘤表位串免疫的動(dòng)物組中死亡的出現(xiàn)時(shí)間被延遲。
流感病毒激發(fā)BALB/c小鼠被用質(zhì)粒DNA 3次基因槍免疫、2次肌肉內(nèi)質(zhì)粒DNA注射免疫、1次肌肉內(nèi)DNA注射接著1次靜脈內(nèi)MVA.NP促進(jìn)免疫、或2次基因槍免疫接著1次MVA.NP靜脈內(nèi)促進(jìn)。質(zhì)粒DNA和重組的MVA表達(dá)流感病毒核蛋白。最后一次免疫后2周鼻內(nèi)用流感A/PR/8/34病毒100HA激發(fā)小鼠。激發(fā)后每天監(jiān)測(cè)所述動(dòng)物的成活率。
在下列動(dòng)物組中觀察到完全保護(hù)作用·2次基因槍免疫接著1次MVA.NP靜脈內(nèi)促進(jìn)。
·1次肌肉內(nèi)DNA注射接著1次MVA.NP靜脈內(nèi)促進(jìn)·2次肌肉內(nèi)DNA注射。
用基因槍3次免疫的動(dòng)物組中，71％的動(dòng)物成活(5/7)而與對(duì)照組相比該差異值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＞0.05)。在首發(fā)組中25％的動(dòng)物存活(圖14)，該組與完全保護(hù)的2組差異顯著(P＜0.05)。
圖14顯示流感病毒激發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。按所示的方法免疫BALB/c小鼠。GG＝基因槍免疫、im＝肌肉內(nèi)注射、iv＝靜脈內(nèi)注射。激發(fā)后每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物的成活率。
在第二次實(shí)驗(yàn)中以10只為一組的BALB/c小鼠用單獨(dú)MVA.NP靜脈內(nèi)免疫，用基因槍3次免疫，2次用基因槍接著一次MVA.NP靜脈內(nèi)促進(jìn)和2次肌肉內(nèi)注射V1J-NP接著一次MVA.NP促進(jìn)免疫。最后一次免疫后2周，小鼠用100HA單位的流感A/PR/8/34病毒激發(fā)。
在下列動(dòng)物組中觀察到完全和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的保護(hù)作用·2次基因槍免疫接著一次MVA.NP促進(jìn)。
·2次肌肉內(nèi)注射MVA.NP，接著一次MVA.NP促進(jìn)。
在接受一次MVA.NP靜脈內(nèi)注射的組中，30％的動(dòng)物(10只中有3只)存活。通過(guò)基因槍用DNA疫苗免疫3次的組中，70％的動(dòng)物受到保護(hù)，但該保護(hù)作用與首發(fā)組對(duì)照比較沒(méi)有明顯的差異。在本次激發(fā)實(shí)驗(yàn)中，40％(10只中有4只)的首發(fā)組動(dòng)物在激發(fā)后存活。
實(shí)施例5在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中的免疫原性研究在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中引發(fā)促進(jìn)方案的免疫原性和保護(hù)效能為了顯示在小鼠中觀察到的DNA引發(fā)/MVA促進(jìn)方案的強(qiáng)免疫原性轉(zhuǎn)變成在靈長(zhǎng)類(lèi)中的強(qiáng)免疫原性，在獼猴中檢測(cè)了該方案。在質(zhì)粒DNA或MVA中的由來(lái)自HIV和SIV序列(圖2)的CTL表位串組成的疫苗分別稱(chēng)為DNA.H和MVA.H。在多表位串中應(yīng)用限定的CTL表位可允許在獼猴中檢測(cè)對(duì)SIV特異的CTL。由于抗原肽的MHC I型的限制性，選擇的獼猴為MHC I型單位型和Mamu-A*01陽(yáng)性的動(dòng)物，用于所描述的實(shí)驗(yàn)。
用下列的免疫免疫3種動(dòng)物(CYD、DI和DORIS)第0周 DNA(8μg，i.d.，基因槍)第8周 DNA(8μg，i.d.，基因槍)第17周MVA(5×108pfu，i.d.)第22周MVA(5×108pfu，i.d.)在實(shí)驗(yàn)的第0、2、5、8、10、11、17、1 8、19、21、22、23、24和25周抽取每只動(dòng)物的血液。用2種不同的方法監(jiān)測(cè)動(dòng)物中誘導(dǎo)的CTL。分離自每只動(dòng)物血液的PBMC在體外用編碼表位串的肽重新刺激，然后用鉻釋放細(xì)胞毒性分析法檢測(cè)其對(duì)自體負(fù)載肽的靶細(xì)胞的能力。另外，用四聚體法對(duì)新鮮分離的PBMC染色，以測(cè)定抗原特異的CD8+T細(xì)胞。
用四聚體染色法2次基因槍免疫后檢測(cè)到非常低水平的CTL(圖15)。第1次MVA促進(jìn)后2周，通過(guò)四聚體染色法檢測(cè)到所有3種動(dòng)物出現(xiàn)肽特異的CTL(圖15)。這可從體外重新刺激后檢測(cè)到的中度CTL應(yīng)答反映出來(lái)(圖16，第19周)。用MVA.H第2次促進(jìn)誘導(dǎo)非常高水平的特異抗原CD8+T細(xì)胞(圖15)以及也誘導(dǎo)非常高水平的肽特異殺傷性T細(xì)胞(圖16，第23周)。
圖15顯示用四聚體檢測(cè)SIV特異的MHC I型限制性CD8+T細(xì)胞。3只Mamu-A*A01陽(yáng)性獼猴按所示的方法用質(zhì)粒DNA(基因槍)接著用MVA促進(jìn)免疫。經(jīng)FACS分析后確定Mamu-A*A01/CD8雙陽(yáng)性T細(xì)胞的百分率。每一條代表在所示的時(shí)間點(diǎn)對(duì)Mamu-A*01/gag表位特異的CD8+T細(xì)胞的百分率。CD8 T細(xì)胞的百分之一相當(dāng)于大約5000/106外周血淋巴細(xì)胞。因此在這些獼猴的外周血中表位特異CD8 T細(xì)胞的水平，至少與在瘧疾研究中免疫并受到保護(hù)的小鼠脾中所觀察中的水平一樣高。
圖16顯示在獼猴中DNA/MVA免疫后CTL誘導(dǎo)。在第18、19和23周從3種不同的獼猴(CYD、DI和DORIS)分離PBMC，然后用肽CTPYDINQM[SEQ ID NO54]體外重新刺激。用肽CTPYDINQM[SEQ ID NO54]重新刺激2次后，檢測(cè)培養(yǎng)物中對(duì)肽刺激自體靶細(xì)胞的裂解活性。觀察到強(qiáng)CTL活性。
實(shí)施例6在黑猩猩中的免疫原性和激發(fā)研究為了表明用質(zhì)粒DNA初次免疫接著用重組MVA免疫的相似方案能在較高等的靈長(zhǎng)類(lèi)中有效地抗惡性瘧原蟲(chóng)，用2只黑猩猩進(jìn)行免疫和激發(fā)研究。黑猩猩H1接受500μg質(zhì)粒的初次免疫，該質(zhì)粒表達(dá)從CMV啟動(dòng)子開(kāi)始沒(méi)有內(nèi)含子A的惡性瘧原蟲(chóng)TRAP、CMV-TRAP。黑猩猩H2接受相同劑量的CMV-LSA-1，CMV-LSA-1表達(dá)惡性瘧原蟲(chóng)LSA-1基因的C-末端部分。在接下去的2個(gè)月2只黑猩猩接受多于3次的免疫，但每次免疫接種3種質(zhì)粒。H1接受前面所述的CMV-TRAP，加上pTH-TRAP，pTH-TRAP用具有內(nèi)含子A的CMV啟動(dòng)子表達(dá)TRAP，這樣可表達(dá)更高的水平。H1也接受從RSV啟動(dòng)子開(kāi)始表達(dá)LSA-1的C末端部分的RSV-LSA-1。在第2、3和4次免疫時(shí)，H2接受CMV-LSA-1、pTH-LSA-1t RSV-TRAP。所用的劑量始終是每種質(zhì)粒500μg。
接著發(fā)現(xiàn)RSV質(zhì)粒不表達(dá)在其中含有的抗原，因此H1僅用表達(dá)TRAP的質(zhì)粒免疫，而H2用表達(dá)LSA-1的質(zhì)粒免疫。
在這些DNA免疫的之間和之后，在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞免疫應(yīng)答的測(cè)定，在第4次DNA免疫后的3個(gè)月進(jìn)行最后一次測(cè)定，但用ELISPOT分析法或用于CD8+T細(xì)胞的CTL分析法未檢測(cè)到對(duì)瘧疾特異的T細(xì)胞。
接著在6周時(shí)間內(nèi)2只動(dòng)物用3次劑量的108ffu編碼惡性瘧原蟲(chóng)TRAP抗原的重組MVA病毒免疫。在第3次MVA免疫剛開(kāi)始前和之后，用整個(gè)TRAP蛋白結(jié)合到乳膠珠上的ELISPOT分析法，在2只黑猩猩中能檢測(cè)到對(duì)TRAP抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。該分析法檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在2只免疫過(guò)的黑猩猩中用系列的8-11個(gè)氨基酸的短肽尋找特異的CD8+T應(yīng)答。對(duì)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的上述分析顯示僅在黑猩猩H1中能檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞。這些CD8+T淋巴細(xì)胞的靶表位是來(lái)自TRAP，tr57序列KTASCGVWDEW[SEQ ID NO78]的11個(gè)氨基酸肽。這些來(lái)自H1的CD8+T細(xì)胞具有抗用tr57肽激發(fā)的自體靶細(xì)胞和抗受重組PfTRAP-MVA病毒感染的自體靶細(xì)胞的裂解活性。最后一次MVA免疫后2個(gè)月用ELISPOT分析法，在該黑猩猩H1外周血中檢測(cè)到高頻率的這些特異CD8+T細(xì)胞的前體細(xì)胞，大約為500個(gè)淋巴細(xì)胞1個(gè)。很顯然未用表達(dá)TRAP的質(zhì)粒DNA激發(fā)過(guò)的黑猩猩H2中，沒(méi)有檢測(cè)到特異的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
第3次PfTRAP-MVA免疫后2個(gè)月，用20,000個(gè)子孢子對(duì)H1和H2進(jìn)行激發(fā)，以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所用的子孢子數(shù)激發(fā)7天，在黑猩猩中產(chǎn)生可靠的能檢測(cè)的血液階段感染(Thomas等，1994和未發(fā)表的資料)。該激發(fā)用瘧原蟲(chóng)NF54株進(jìn)行。這一點(diǎn)是非常重要的，因?yàn)樵谫|(zhì)粒DNA和重組MVA中的TRAP序列來(lái)源于瘧原蟲(chóng)T9/96株，與NF54TRAP等位基因有大量的氨基酸差異(Robson等，1990)。所以，該子孢子激發(fā)實(shí)驗(yàn)用異源而不是同源的寄生蟲(chóng)株進(jìn)行。在黑猩猩H2中，用體外寄生蟲(chóng)培養(yǎng)檢測(cè)法，如預(yù)期的那樣子孢子激發(fā)后7天在外周血中能檢測(cè)到寄生蟲(chóng)。然而，在H1中，來(lái)自第7天血液樣品的培養(yǎng)物中血液階段寄生蟲(chóng)的出現(xiàn)延遲了3天，這和抗肝階段感染的某種免疫保護(hù)效應(yīng)相一致。在過(guò)去人類(lèi)中候選瘧疾疫苗的研究中，已經(jīng)估計(jì)到在外周血中延遲出現(xiàn)寄生蟲(chóng)與在肝中寄生蟲(chóng)密度的基本降低相一致(Davis等，1989)。因此首先用惡性瘧原蟲(chóng)TRAP質(zhì)粒DNA接著用通過(guò)MVA病毒表達(dá)的相同抗原免疫的黑猩猩H1顯示強(qiáng)CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，為對(duì)異源子孢子激發(fā)某種保護(hù)作用的證據(jù)。
討論這些實(shí)施例說(shuō)明一種新型的抗瘧疾免疫方案，該方案在人瘧疾感染的嚙齒類(lèi)模型中誘導(dǎo)高水平的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞。還說(shuō)明的是用亞單位疫苗抗子孢子激發(fā)的史無(wú)前例的完全保護(hù)作用(在表6中用DNA引發(fā)及含有疫苗的CS表位的MVA促進(jìn)保護(hù)36只小鼠中的36只)。用DNA引發(fā)/MVA促進(jìn)方案誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答在2種另外的病毒性感染流感病毒A模型和癌癥(P815腫瘤模型)的小鼠模型中闡明。對(duì)用于人類(lèi)的疫苗更為重要的是，該免疫方案在靈長(zhǎng)類(lèi)中對(duì)CD8+T細(xì)胞也具有高度免疫原性。用質(zhì)粒DNA和表達(dá)表位串的MVA在3只獼猴中3只誘導(dǎo)強(qiáng)SIV-gag特異CTL。所誘導(dǎo)的水平與SIV感染的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平相比擬。來(lái)自黑猩猩的研究資料顯示，相同的免疫方案能在較高等的靈長(zhǎng)類(lèi)中誘導(dǎo)抗惡性瘧原蟲(chóng)的CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，提供了抗惡性瘧原蟲(chóng)子孢子激發(fā)保護(hù)作用的一些證據(jù)。
過(guò)去報(bào)道Ty-VLPs誘導(dǎo)良好水平的抗伯氏瘧原蟲(chóng)嚙齒類(lèi)瘧原蟲(chóng)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(Allsopp等，1995)，但單獨(dú)該構(gòu)建體沒(méi)有保護(hù)作用?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)用重組MVA繼續(xù)免疫非常明顯地促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答并且產(chǎn)生高水平保護(hù)作用(表7)。
過(guò)去沒(méi)有估測(cè)重組MVA病毒作為瘧疾疫苗的效能。單獨(dú)的重組MVA沒(méi)有明顯的保護(hù)作用，用重組MVA引發(fā)接著用重組質(zhì)粒DNA第2次免疫也沒(méi)有保護(hù)作用。然而，用Ty-VLPs或質(zhì)粒DNA初次免疫后用重組MVA第2次免疫產(chǎn)生令人印象深刻水平的保護(hù)作用。非重組MVA病毒已安全地用于數(shù)千人抗天花的痘苗接種并顯現(xiàn)優(yōu)異的安全性特征。增加該痘苗病毒株的安全性和免疫原性的分子基礎(chǔ)已經(jīng)詳細(xì)的分子研究闡明(Meyer等，1991；Sutter等，1994)。
過(guò)去已試驗(yàn)質(zhì)粒DNA用作對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)嚙齒類(lèi)瘧疾的瘧疾疫苗。在某些品系中看到高水平但不完全的保護(hù)作用，但在小鼠的其他品系中甚至多次免疫后觀察到很小或沒(méi)有保護(hù)作用(Doolan等，1996)。盡管建議把質(zhì)粒DNA用作抗惡性瘧原蟲(chóng)的免疫方法，過(guò)去一直沒(méi)有獲得成功。本發(fā)明提供的證據(jù)是第一次的證據(jù)，表明質(zhì)粒DNA可用于免疫方案中以誘導(dǎo)抗人類(lèi)瘧疾惡性瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)的保護(hù)性免疫。
可預(yù)計(jì)與本發(fā)明闡明的免疫方案相似的免疫方案能在人類(lèi)中誘導(dǎo)抗惡性瘧原蟲(chóng)的保護(hù)性免疫。應(yīng)該注意的是用于這些研究以在嚙齒類(lèi)或黑猩猩中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的5個(gè)疫苗構(gòu)建體含有惡性瘧原蟲(chóng)序列，因而能用于抗惡性瘧原蟲(chóng)的人類(lèi)免疫中。這些構(gòu)建體是1.惡性瘧原蟲(chóng)TRAP質(zhì)粒DNA疫苗，2.惡性瘧原蟲(chóng)TRAP重組MVA病毒，3.編碼多個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)的表位串以及單個(gè)伯氏瘧原蟲(chóng)CTL表位的Ty-VLP，4.編碼與3相同的表位串的質(zhì)粒DNA，5.編碼在3和4中許多瘧疾表位的較長(zhǎng)HM表位串的重組MVA。相似地，編碼針對(duì)人I型分子的HIV表位的質(zhì)粒DNAs和MVA能用于抗HIV感染的預(yù)防性或治療性免疫。
這些研究提供明確的證據(jù)，用非復(fù)制性或復(fù)制受損的痘病毒作促進(jìn)的新型順序免疫方案能誘導(dǎo)抗瘧疾寄生蟲(chóng)的強(qiáng)保護(hù)性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。實(shí)施例明確地說(shuō)明與復(fù)制性痘病毒株相比較令人驚奇的并大量增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和保護(hù)作用。由于沒(méi)有理由相信來(lái)自瘧疾寄生蟲(chóng)CD8+T細(xì)胞表位的免疫原性與其他抗原中CD8+T細(xì)胞表位的免疫原性有基本的差異，可預(yù)期在此所述的免疫方案可證實(shí)產(chǎn)生抗其他疾病的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的有效價(jià)值。本免疫方案的關(guān)鍵步驟是應(yīng)用非復(fù)制或復(fù)制受損的重組痘病毒促進(jìn)預(yù)先存在的CTL應(yīng)答。我們顯示CTL應(yīng)答能用不同的抗原輸送體系如真皮內(nèi)和肌肉內(nèi)輸送DNA疫苗、重組的Ty-VLP，重組的腺病毒和照射過(guò)的子孢子。這由給出的資料支持，產(chǎn)生抗HIV、流感病毒和腫瘤的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。抗CD8+T細(xì)胞應(yīng)答起重要作用的疾病的幾個(gè)熟悉實(shí)施例如下由HIV病毒、單純皰疹病毒、帶狀皰疹、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、EB病毒、麻疹病毒、登革病毒和HTLV-1；由細(xì)菌結(jié)核分支桿菌和李斯特菌類(lèi)；由原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)弓形和錐形蟲(chóng)引起的感染和發(fā)病。誘導(dǎo)抗流感A病毒的保護(hù)性CTL應(yīng)答在圖14說(shuō)明。此外，預(yù)計(jì)在此所描述的免疫方案在抗CD8+T細(xì)胞應(yīng)答起保護(hù)性作用的癌癥類(lèi)型免疫中具有價(jià)值。用DNA引發(fā)MVA促進(jìn)方案抗腫瘤誘導(dǎo)的保護(hù)性CTL應(yīng)答在圖13顯示。在人類(lèi)中具體的實(shí)施例包括黑色素瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌。
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權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生抗至少1種靶抗原的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的試劑盒，該試劑盒包括(i)一種引發(fā)組合物，該組合物包括1種或多種靶抗原的CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源，和藥用可接受的載體一起使用；并且(ii)一種促進(jìn)組合物，該組合物包括1種或多種靶抗原的CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源，包括至少1種與引發(fā)組合物的CD8+T細(xì)胞表位相同的CD8+T細(xì)胞表位，其中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是非復(fù)制或復(fù)制受損的重組痘病毒載體，與藥用可接受的載體一起使用；條件是如果(i)中表位的來(lái)源是一種病毒載體，在(ii)中的病毒載體則來(lái)源于不同的病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中在(i)中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是非病毒載體或非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其中(i)中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源不是痘病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的試劑盒，其中在(i)中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是DNA或RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其中在(i)中表位的來(lái)源是重組DNA質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的試劑盒，進(jìn)一步包括(i)中作為佐劑的GM-CSF。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)的試劑盒，其中在(i)中的CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源編碼或包括靶抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求4～6中任一項(xiàng)的試劑盒，其中在(i)中表位的來(lái)源編碼單個(gè)CD8+T細(xì)胞表位或2個(gè)或多個(gè)CD8+T細(xì)胞表位的重組表位串。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的試劑盒，其中在(i)中表位的來(lái)源是包含2個(gè)或多個(gè)存在于重組的CD8+T細(xì)胞表位串或靶抗原中的CD8+T細(xì)胞表位的肽、多肽、蛋白、聚蛋白或顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑盒，其中在(i)中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是諸如Ty病毒樣顆粒(VLP)的重組蛋白顆粒。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～3中表位，其中(i)中的表位來(lái)源是重組腺病毒載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)的試劑盒，其中在(ii)中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是重組痘苗病毒載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中重組痘苗病毒載體是修飾過(guò)的Ankara病毒的痘苗病毒株(MVA)或衍生于此的病毒株。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中重組痘苗病毒載體是NYVAC株或衍生于此的病毒株。
15.根據(jù)權(quán)利要求1～11中的任一項(xiàng)的試劑盒，其中在(ii)中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是諸如金絲雀痘病毒或禽痘病毒的重組禽痘病毒載體或衍生于此如ALVAC的病毒株。
16.根據(jù)權(quán)利要求1～15中任一項(xiàng)的試劑盒，用于產(chǎn)生抗包括靶抗原的抗原或腫瘤的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒，用于產(chǎn)生抗諸如惡性瘧原蟲(chóng)的瘧疾病原的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其中在(i)中或由(i)編碼的CD8+T細(xì)胞表位包括從表1列出的1種或多種瘧疾表位。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其中在(i)中的CD8+T細(xì)胞表位包括在表1中給出的所有表位。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒，用于產(chǎn)生抗HIV的免疫應(yīng)答。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，其中在(i)中或由(i)編碼的CD8+T細(xì)胞表位包括表2列出的1種或多種HIV表位。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，其中在(i)中或由(i)編碼的CD8+T細(xì)胞表位包括在表2中給出的所有表位。
23.根據(jù)權(quán)利要求1～22中任一項(xiàng)的試劑盒，其中引發(fā)和促進(jìn)組合物都含有(i)的表位來(lái)源和(ii)的表位來(lái)源。
24.根據(jù)權(quán)利要求1～23中任一項(xiàng)的試劑盒，其中引發(fā)組合物和/或促進(jìn)組合物是適于用基因槍法輸送的特殊形式。
25.一種產(chǎn)生抗至少1種靶抗原的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫方法，該方法包括施用組分(i)的至少1個(gè)劑量，然后施用根據(jù)權(quán)利要求1～24中任一項(xiàng)的試劑盒的組合(ii)的至少1個(gè)劑量。
26.一種產(chǎn)生抗病原或腫瘤的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用至少1個(gè)劑量的編碼至少1個(gè)CD8+T細(xì)胞表位或抗原或癌癥抗原的重組DNA質(zhì)粒，接著施用至少1個(gè)劑量的編碼相同表位或抗原的重組非復(fù)制或復(fù)制受損的痘病毒。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中重組痘苗病毒是重組MVA載體。
28.一種產(chǎn)生抗病原或腫瘤的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用至少1個(gè)劑量的包括至少1種病原或癌癥的表位或抗原的重組蛋白或顆粒，接著施用至少1個(gè)劑量的編碼相同表位或抗原的重組MVA載體。
29.根據(jù)權(quán)利要求26～28中任一項(xiàng)的方法，用于產(chǎn)生抗諸如惡性瘧原蟲(chóng)等瘧疾的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
30.根據(jù)權(quán)利要求26～28中任一項(xiàng)的方法，用于產(chǎn)生抗HIV的保護(hù)性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
31.根據(jù)權(quán)利要求25～30中任一項(xiàng)的方法，其中(ii)通過(guò)靜脈內(nèi)、表真皮內(nèi)或真皮內(nèi)輸送。
32.一種促進(jìn)抗至少1種靶抗原的引發(fā)過(guò)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的藥物，包括1個(gè)或多個(gè)靶抗原的CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源和藥用可接受的載體，其中CD8+T細(xì)胞表位的來(lái)源是非復(fù)制或復(fù)制受損的重組痘病毒載體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的藥物，其中所述的載體是痘苗病毒載體如MVA。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的藥物，用于促進(jìn)抗瘧疾的天然引發(fā)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
35.一種促進(jìn)引發(fā)過(guò)的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求32～34中任一項(xiàng)的藥物。
36.重組非復(fù)制或復(fù)制受損的痘病毒載體在制備促進(jìn)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
37.MVA載體在制備促進(jìn)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
38.一種表位串，包括在表1所列出的氨基酸序列。
39.一種用于抗瘧疾的免疫的重組Ty-VLP，包括根據(jù)權(quán)利要求38的表位串。
40.一種編碼權(quán)利要求38的表位串的重組DNA質(zhì)?；蛑亟M非復(fù)制或復(fù)制受損的痘病毒，用于抗瘧疾的免疫。
41.一種編碼惡性瘧原蟲(chóng)抗原TRAP的重組DNA質(zhì)?；蛑亟M非復(fù)制或復(fù)制受損的痘病毒，用于抗瘧疾的免疫。
42.一種根據(jù)權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的重組MVA痘苗病毒株。
43.一種表位串，包括在表2中所列的氨基酸序列。
44.一種重組的多肽，該多肽包括完整或基本上完整的蛋白抗原如TRAP和2個(gè)或多個(gè)表位的串，如來(lái)自瘧疾的CTL表位。
全文摘要
公開(kāi)了產(chǎn)生抗瘧疾和其他抗原諸如病毒和腫瘤抗原的CD8T細(xì)胞免疫應(yīng)答接種的新方法和試劑。也公開(kāi)了新型的接種方案,該方案使用一種引發(fā)組合物和一種促進(jìn)組合物,該促進(jìn)組合物包括攜帶至少一個(gè)也存在于引發(fā)組合物中的CD8T細(xì)胞表位的非復(fù)制或復(fù)制受損傷的痘病毒載體。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1266459SQ9880806
公開(kāi)日2000年9月13日 申請(qǐng)日期1998年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月9日
發(fā)明者A·J·麥克邁克爾, A·V·S·希爾, S·C·吉爾伯特, J·施奈德?tīng)? M·普勒班斯基, T·漢克, G·L·史密斯, T·布蘭查德 申請(qǐng)人:奧克松藥品有限公司