專利名稱：白細(xì)胞介素－18結(jié)合蛋白質(zhì)及其制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合IL-18的白細(xì)胞介素-18(IL-18)結(jié)合蛋白質(zhì)，以下簡(jiǎn)稱IL-18BP。這一發(fā)明涉及從體液中獲得的可溶性IL-18BP，涉及宿主細(xì)胞中通過(guò)適當(dāng)?shù)腄NA載體表達(dá)得到的可溶性IL-18BP，涉及宿主細(xì)胞中通過(guò)適當(dāng)DNA載體表達(dá)可得的IL-18BP的病毒編碼的同系物，涉及用于在人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)IL-18BP的載體，涉及抗IL-18BP的抗體，涉及所述的IL-18BP通過(guò)調(diào)節(jié)和/或封閉IL-18活性的治療用途，涉及所述的表達(dá)載體在調(diào)節(jié)和/或封閉IL-18活性中的治療用途和涉及抗體的用途。
背景技術(shù)：
在1989年，公開(kāi)了從小鼠脾細(xì)胞中獲得的誘導(dǎo)干擾素γ(IFN-γ)的外毒素誘導(dǎo)的血清活性(27)。這一血清活性的功能不是IFN-γ的直接誘導(dǎo)物而是與IL-2或促分裂原一起的共同刺激物。從外毒素處理后的對(duì)小鼠的血清活性的純化嘗試表明顯然同源的50～55千道爾頓(kDa)蛋白質(zhì)(26)。因?yàn)槠渌?xì)胞因子可以作為IFN-γ產(chǎn)生的共刺激物，IL-1，IL-4，IL-5，IL-6或TNF的中和抗體中及血清活性的失敗表明它是不同的因子。在1995年，同樣這些科學(xué)家證明IFN-γ產(chǎn)生的外毒素誘導(dǎo)的共刺激物存在于利用P.acnes(31)預(yù)處理的小鼠的肝提取物。在這一實(shí)例中，肝巨嗜細(xì)胞群體(Kupffer細(xì)胞)擴(kuò)展并且在這些小鼠中，在非預(yù)處理小鼠中非致命的低劑量細(xì)菌脂多糖(LPS)變成致命的。從1,200克P.acnes處理的小鼠肝將命名為IFN-γ-誘導(dǎo)的因子(IGIF)和后來(lái)命名為白細(xì)胞介素-18(IL-18)純化成勻漿物。利用起源于純化的IL-18的氨基酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸克隆小鼠IL-18cDNA(31)。IL-18是157個(gè)氨基酸的18～19千道爾頓蛋白質(zhì)，它與數(shù)據(jù)庫(kù)中的任何肽沒(méi)有明顯的相似性。在Kupffer細(xì)胞和活化的巨嗜細(xì)胞中是容易檢測(cè)到IL-18和白細(xì)胞介素-12(IL-12)的信使RNA。重組IL-18顯然通過(guò)獨(dú)立的途徑比IL-12更具潛力地誘導(dǎo)IFN-γ(31)。與外毒素誘導(dǎo)的血清活性相似，IL-18本身不誘導(dǎo)IFN-γ，但初級(jí)功能是與促分裂原或IL-2一起作為共刺激物。IL-18顯然通過(guò)IL-2獨(dú)立途徑增強(qiáng)T細(xì)胞增殖，并且增強(qiáng)Th1細(xì)胞因子的體外產(chǎn)生并且當(dāng)將IL-12與增強(qiáng)的IFN-γ產(chǎn)生結(jié)合時(shí)顯示了協(xié)同作用(24)。
小鼠IL-18的中和抗體顯示了能夠在P.acnes預(yù)處理的小鼠中預(yù)防低劑量LPS的致死。在預(yù)處理的小鼠中其它人已經(jīng)報(bào)道了IFN-γ作為L(zhǎng)PS致死的介導(dǎo)物的重要性。例如，中和抗IFN-γ抗體保護(hù)小鼠不會(huì)Shwartzman狀休克(16)，并且IFN-γ受體缺陷的半乳糖胺處理的小鼠是抗LPS誘導(dǎo)的死亡的(7)。所以，不能預(yù)期小鼠IL-18的中和抗體保護(hù)P.acnes預(yù)處理小鼠抵抗致死LPS(31)。抗小鼠IL-18處理也保護(hù)生存的小鼠抵抗嚴(yán)重的肝細(xì)胞毒性。
在克隆小鼠形成后，在1996年報(bào)道了IL-18的人cDNA序列(38)。重組的人IL-18顯示了天然的IL-18活性(38)。人重組IL-18在人T細(xì)胞上沒(méi)有直接的IFN-γ誘導(dǎo)活性，但作用是生產(chǎn)IFN-γ和其它T輔助細(xì)胞-1(Th1)細(xì)胞因子的共刺激物(38)。到目前為止，認(rèn)為IL-18可初步作為Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生(IFN-γ，IL-2和粒細(xì)胞巨嗜細(xì)胞菌落刺激因子)的共刺激物(20)，并且也作為小鼠天然殺死細(xì)胞克隆的FAS配體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的共刺激物(37)。
通過(guò)克隆來(lái)自受感染組織的IL-18和研究IL-18基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了這一細(xì)胞因子與自身免疫疾病緊密相關(guān)。非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠自發(fā)發(fā)展了自身免疫胰島炎和糖尿病，這兩種病在單獨(dú)注射了環(huán)磷酰胺時(shí)得到加速和同步。在早期胰島炎過(guò)程中，在NOD小鼠胰腺中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR證明了IL-18mRNA。在環(huán)磷酰胺處理后快速增加了IL-18mRNA的水平并且在此之前，IFN-γmRNA升高了，隨后發(fā)展成糖尿病。有趣的是，這些動(dòng)力學(xué)模仿了導(dǎo)致與單個(gè)mRNA水平緊密聯(lián)系的IL-12-p40mRNA。在測(cè)序之后從胰腺RNA克隆IL-18cDNA表明從Kupffer細(xì)胞克隆的IL-18序列和體內(nèi)預(yù)活化巨嗜細(xì)胞的同一性。當(dāng)沒(méi)有平行處理來(lái)自Balb/c的巨嗜細(xì)胞，同樣NOD小鼠巨嗜細(xì)胞通過(guò)IL-18基因表達(dá)應(yīng)答環(huán)磷酰胺。所以，在自身免疫NOD小鼠中IL-18表達(dá)非正常地調(diào)節(jié)，并且與糖尿病發(fā)展緊密相關(guān)(32)。
通過(guò)增大Th1細(xì)胞上Fas配體的功能活性，IL-18在免疫調(diào)節(jié)或炎癥中起潛在作用。在腎上腺皮層中也表達(dá)了IL-18，所以可以是分泌的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)物，在壓力實(shí)驗(yàn)之后orchestrating免疫系統(tǒng)中起重要作用(9)。
在體內(nèi)，通過(guò)裂解pro-IL-18形成了IL-18，它的內(nèi)源活性似乎是依賴于P.acnes中的IFN-γ的產(chǎn)生和由LPS介導(dǎo)的致死。因?yàn)樗幕钚裕谌思膊≈蟹忾]IL-18的生物學(xué)活性是許多疾病的治療方案。利用可溶性受體或封閉細(xì)胞結(jié)合IL-18受體的抗體可以達(dá)到這一目的。
細(xì)胞因子結(jié)合蛋白質(zhì)(可溶性細(xì)胞因子受體)對(duì)應(yīng)于它們各自的細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)。與細(xì)胞表面受體相同，通過(guò)前mRNA的可替代拼接或通過(guò)細(xì)胞表面受體的蛋白水解的裂解可以派生它們。這樣的可溶性受體在過(guò)去已經(jīng)敘述過(guò)，包括其它的可溶性IL-6受體和IFN-γ(30)，TNF(11，12)，IL-1和IL-4(21)，IFN-α/β(28，29)和其它。命名為骨原素(OPG，已知是破骨細(xì)胞抑制因子-OCIF)的一個(gè)細(xì)胞因子結(jié)合蛋白質(zhì)，TNFR/Fas家族的成員似乎是只作為分泌蛋白質(zhì)存在的可溶性受體的第一個(gè)例子(1，34，39)。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)(IL-18BP)和病毒編碼的IL-18BP同系物(以下簡(jiǎn)稱病毒IL-18BP)，和融合蛋白質(zhì)，突變蛋白，功能衍生物，活性片斷和其循環(huán)的完全變化的衍生物，這些物質(zhì)能夠結(jié)合IL-18。本發(fā)明也提供了從人體液分離IL-18BP的方法，通過(guò)重組手段獲得它們的方法。本發(fā)明還提供了適于在人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)IL-18BP的IL-18BP的表達(dá)載體。本發(fā)明的特定的IL-18BP，病毒編碼的IL-18BP同系物，融合蛋白質(zhì)，突變蛋白，功能衍生物，活性片斷和循環(huán)變化的衍生物可用于調(diào)節(jié)和/或封閉IL-18的生物活性。
同時(shí)提供了含有適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)各種IL-18BP的DNA的可復(fù)制表達(dá)載體，本發(fā)明轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和這樣的宿主表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有適當(dāng)載體和IL-18BP或病毒IL-18BP或在人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)它們的載體的藥物組合物，用于治療需要調(diào)節(jié)或封閉IL-18活性的疾病或癥狀。
本發(fā)明進(jìn)一步提供適于親和純化和免疫測(cè)試它們的IL-18BP和病毒IL-18BP的抗體。
附圖的說(shuō)明
圖1顯示了配體親和純化IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)。將粗尿蛋白質(zhì)(通過(guò)超濾500升正常人尿濃縮)加載到IL-18瓊脂糖柱上。洗滌，在pH2.2洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。中和洗脫的部分，通過(guò)在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分析，并且銀染。這些道是1粗尿蛋白質(zhì)(1.5微克，加載到凝膠上)；2～9分別來(lái)自IL-18瓊脂糖柱的洗脫物1～8；10分子量標(biāo)記，千道爾頓，正如右邊的表明。箭頭表明對(duì)應(yīng)于IL-18BP的帶。
圖2顯示了含有125I-IL-18(表觀分子量19千道爾頓)的復(fù)合物的SDS-PAGE(7.5％丙烯酰胺)的放射自顯影，這些復(fù)合物與可溶性的IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)的制劑交聯(lián)道1IL-18親和柱的洗滌物。道2IL-18親和柱的洗脫物2。道3IL-18親和柱的洗脫物3。分子量標(biāo)記表明在右邊(千道爾頓)。箭頭表示交聯(lián)產(chǎn)物(58千道爾頓)。
圖3A～圖3E顯示了IL-18BP抑制IL-18誘導(dǎo)的IFN-γ的產(chǎn)生。
圖3A在直接加入，或在與尿IL-18BP預(yù)混合(1小時(shí)，37℃)后，利用標(biāo)明的LPS(1微克/毫升)和人IL-18(5納克/毫升)刺激(24小時(shí)，37℃)小鼠脾細(xì)胞。在24小時(shí)后確定培養(yǎng)物中muIFN-γ的水平。
圖3B將小鼠脾細(xì)胞與LPS(1微克/毫升)以及與濃度增加的人IL-18BP預(yù)混合(1小時(shí)，37℃)的小鼠IL-18(10納克/毫升)溫育24小時(shí)。
圖3C將小鼠脾細(xì)胞與LPS(10微克/毫升)以及濃度增加的人IL-18BP一起溫育(24小時(shí))。
圖3D將小鼠脾細(xì)胞與Con A(1微克/毫升)以及濃度增加的人IL-18BP一起溫育(24小時(shí))。
圖3E利用單獨(dú)加入或在與尿IL-18BP預(yù)混合(1小時(shí)，37℃)后的TNF-α(20納克/毫升)和huIL-18(25納克/毫升)刺激人KG-1細(xì)胞。
圖4和圖4A顯示了人IL-18BPa cDNA和蛋白質(zhì)的序列，信號(hào)肽下面已劃線。
圖5和圖5A顯示了人IL-18BPb cDNA和蛋白質(zhì)的序列，信號(hào)肽下面已劃線。
圖6，圖6A～圖6E顯示了人IL-18BPc cDNA和蛋白質(zhì)的序列。信號(hào)肽下面已劃線。
圖7和圖7A顯示了人IL-18BPd cDNA和蛋白質(zhì)的序列。信號(hào)肽下面已劃線。
圖8，圖8A～圖8F顯示了人IL-18BP基因的序列。確定了人基因組克隆(7.1kb)的序列并且與從3個(gè)cDNA文庫(kù)分離的各種cDNA克隆比較。共同的翻譯起始密碼子是核苷酸683～685。將NuMA1基因定位于負(fù)鏈，從核苷酸3578到末端。
圖9A～圖9D顯示了重組IL-18BP對(duì)人和小鼠IL-18活性的影響。
在COS7細(xì)胞中短暫表達(dá)了His6-標(biāo)記的IL-18BPa，并且純化。
圖9A將人IL-18(5納克/毫升)與His6-標(biāo)記-IL-18BPa或RPMI預(yù)混合，并且與LPS(1微克/毫升)一起加入小鼠脾細(xì)胞。在24小時(shí)后測(cè)量IFN-γ產(chǎn)生。
圖9B將小鼠IL-18(10納克/毫升)與His6-標(biāo)記-IL-18BPa或RPMI預(yù)混合，并且與LPS(1微克/毫升)一起加入小鼠脾細(xì)胞。在24小時(shí)后測(cè)量IFN-γ產(chǎn)生。
圖9C將人IL-18(25納克/毫升)與COS7-IL-18BPa或RPMI一起預(yù)混合，并且加入存在IL-12(10納克/毫升)的人PBMC。
圖9D將人IL-18(25納克/毫升)與COS7-IL-18BPa或RPMI預(yù)混合，并且在存在TNF-α(20納克/毫升)時(shí)加入人KG-1細(xì)胞。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明涉及結(jié)合IL-18的各種IL-18BP和病毒IL-18BP。這樣的IL-18BP能夠調(diào)節(jié)和/或封閉IL-18的生物活性。術(shù)語(yǔ)“IL-18BP和病毒IL-18BP”包括成熟蛋白質(zhì)(沒(méi)有信號(hào)序列)，含有信號(hào)序列的蛋白質(zhì)，IL-18BP的突變蛋白和病毒IL-18BP，IL-18BP的衍生物和病毒IL-18BP和IL-18BP的截短形式和病毒IL-18BP及其鹽。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及適于在宿主細(xì)胞和宿主細(xì)菌中表達(dá)各種IL-18BP或病毒IL-18BP的可復(fù)制表達(dá)載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及適于在人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)各種IL-18BP或病毒IL-18BP的表達(dá)載體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼各種IL-18BP，病毒IL-18BP，突變蛋白，融合蛋白質(zhì)，功能衍生物，活性部分及其混合物的DNA。所述的DNA可以是基因組DNA，cDNA合成DNA，PCR產(chǎn)物或其聯(lián)合。根據(jù)本發(fā)明這些DNA可以插入可復(fù)制的表達(dá)載體用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)各種IL-18BP和病毒IL-18BP。在本發(fā)明中同時(shí)包括了在嚴(yán)格條件下與上面的DNA雜交的和編碼的蛋白質(zhì)或多肽的DNA。
一個(gè)這樣的DNA編碼包括SEQ ID NO10的氨基酸序列并且在它3’末端提供終止密碼子的IL-18BP。
適于在人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)各種IL-18BP或病毒IL-18BP用于基因治療的表達(dá)載體可以是以在人或其它哺乳動(dòng)物中能夠有效表達(dá)IL-18BP或病毒IL-18BP的方式插入編碼病毒IL-18BP的IL-18BP基因或IL-18BP cDNA或DNA的病毒載體或其它類型的載體。本發(fā)明也包括了在嚴(yán)格條件下與上面的DNA雜交和編碼能夠結(jié)合IL-18的蛋白質(zhì)或多肽的DNA分子。
根據(jù)本發(fā)明，例如通過(guò)人體液，如尿或血清，通過(guò)IL-18偶聯(lián)的層析柱，并且然后洗脫結(jié)合的IL-18BP可以進(jìn)行IL-18BP的分離。
通過(guò)重組手段，即，在適當(dāng)宿主中，允許正確方向表達(dá)，適于特別宿主利用的可操作連接的啟動(dòng)子，表達(dá)增強(qiáng)子，調(diào)節(jié)序列等的IL-18BP表達(dá)可以制備各種IL-18BP和病毒IL-18BP。
在治療和減輕IL-18參與或過(guò)量外源給藥或外源產(chǎn)生的IL-18引起的疾病中可以利用在人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)IL-18BP的各種IL-18BP和病毒IL-18BP和載體。這樣的病癥可以是自身免疫疾病，I型糖尿病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，移植排斥，腸炎疾病，膿毒，多發(fā)性硬化，局部缺血性心臟病(包括心臟病發(fā)作)，局部缺血性腦損傷，慢性肝炎，牛皮癬，慢性胰腺炎，急性胰腺炎等。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)一個(gè)層析步驟從正常人尿分離IL-18BP。將從500升正常人尿濃縮的粗人尿蛋白質(zhì)制劑加載到含有結(jié)合瓊脂糖的人IL-18的柱。洗滌，在低pH洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。中和洗脫的部分，在非還原條件下通過(guò)SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分析等分試樣和銀染。在洗脫部分特異地獲得了約40千道爾頓的蛋白質(zhì)帶(圖1)。
如IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)，通過(guò)它與125I-IL-18特異地交聯(lián)的能力鑒定在第一步中獲得的約40千道爾頓蛋白質(zhì)(圖2)。通過(guò)N末端蛋白質(zhì)序列分析進(jìn)一步鑒定了約40千道爾頓蛋白質(zhì)。將來(lái)自洗脫蛋白質(zhì)的等分試樣進(jìn)行SDS-PAGE，電印到PVDF膜上，進(jìn)行蛋白質(zhì)微序列分析。同樣，將來(lái)自洗脫蛋白質(zhì)的等分試樣進(jìn)行直接的蛋白質(zhì)微序列分析。在兩種情況中，獲得了兩個(gè)多肽序列。大序列和小序列，后者對(duì)應(yīng)于人防衛(wèi)素(登記號(hào)p11398)的片斷，在氨基酸65開(kāi)始。減去已知的防衛(wèi)素序列提供了下面的序列T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A1··· 5· ···10··
其中x代表仍未確定的氨基酸。
為了獲得更長(zhǎng)或更準(zhǔn)確的序列，和為了鑒定潛在的半胱氨酸殘基，在變性條件下利用DTT還原洗脫部分的等分試樣，與4-乙烯吡啶反應(yīng)，通過(guò)微超濾裝置脫鹽(Ultrafree，截止分子量10,000 Da，Millipore)并且進(jìn)行蛋白質(zhì)微序列分析。在序列循環(huán)1號(hào)后，將殘留的蛋白質(zhì)與鄰苯二醛反應(yīng)以便封閉所有N未端多肽而不是Pro并且然后恢復(fù)測(cè)序。在這一方法中，獲得了下面的單個(gè)蛋白質(zhì)序列TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT1 10 20 30 40(T＝Thr；P＝Pro；V＝Val；S＝Ser；Q＝Gln；X＝未知；A＝Ala；R＝Arg；K＝Lys；D＝Asp；C＝Cys；F＝Phe；L＝Leu；E＝Glu)正如研究蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)確定的，得到的序列明顯不同于任何其它已知蛋白質(zhì)。但是，通過(guò)tblastn研究程序基因組研究所(TIGR)(HTTP//www.ncbi.nlm.nih.gov)的數(shù)據(jù)庫(kù)研究提供了指示為THC123801的cDNA文檔，當(dāng)翻譯時(shí)，它的開(kāi)放讀碼框架(218個(gè)密碼子)含有與IL-18BP的N末端序列高度同源的序列。下面顯示了同源性1.......TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVT... 40| | | ||||||||||||||||||||||||||||||||51 VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE 100[上面的序列(1～40)是本發(fā)明分離的IL-18BP；下面的序列(51～100)是TIGR文檔THC123801的cDNA翻譯推斷的]。
但是，鑒定為THC123801的cDNA序列僅僅是EST(表達(dá)序列標(biāo)記)，即隨機(jī)選擇的cDNA克隆。還從來(lái)沒(méi)有分析這一EST是否含有開(kāi)放讀碼框架，蛋白質(zhì)是否從對(duì)應(yīng)于EST的基因表達(dá)或從EST本身表達(dá)，甚至也沒(méi)有鑒定的THC123801編碼的蛋白質(zhì)的任何功能。完全沒(méi)有得到THC123801含有編碼IL-18BP的開(kāi)放讀碼框架的信息。
形成了保留結(jié)合它的標(biāo)記配體(125I-IL-18)，接著共價(jià)交聯(lián)分子量為58千道爾頓的復(fù)合物的能力的親和純化尿IL-18BP。這一復(fù)合物的分子量對(duì)應(yīng)于1∶1的約40千道爾頓IL-18BP和19千道爾頓的IL-18(圖2)。
親和純化的尿IL-18BP封閉了人以及小鼠IL-18的生物活性。所以，當(dāng)在人或小鼠IL-18中加入IL-18BP時(shí)，它封閉了IL-18當(dāng)與脂多糖(LPS)一起加入培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)干擾素γ的生產(chǎn)的能力(圖3)。
為了本發(fā)明敘述的目的，表達(dá)“IL-18的生物活性”特別指至少下面的生物特性的一個(gè)(i)在各種細(xì)胞類型如單核細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞，人周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞，人KG-1細(xì)胞系和T細(xì)胞中誘導(dǎo)初步作為與促分裂原，IL-1，IL-12，TNF-α，LPS的共刺激物的IFN-γ，(ii)增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖，(iii)增強(qiáng)初步作為共刺激物體外Th-1細(xì)胞因子的產(chǎn)生，(iv)IL-12與增強(qiáng)IFN-γ產(chǎn)生的協(xié)同作用，IFN-γ和其它T輔助細(xì)胞-1細(xì)胞因子的產(chǎn)生的共刺激作用，(v)小鼠天然殺死細(xì)胞系的FAS配體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的共刺激作用，(vi)在人KG-1細(xì)胞中，可能通過(guò)誘導(dǎo)50NF-κB同型二聚體和p65/p50NF-κB異型二聚體的形成，誘導(dǎo)NF-κB的活化，
(vii)誘導(dǎo)IL-8。
正如本發(fā)明所用，“結(jié)合IL-18”的表達(dá)指當(dāng)如本發(fā)明實(shí)施例2親和純化時(shí)，正如它結(jié)合標(biāo)記的IL-18表明的，IL-18BP結(jié)合IL-18的能力。
正如本發(fā)明所用，“調(diào)節(jié)IL-18的活性”的表達(dá)指IL-18BP調(diào)節(jié)任何IL-18活性而不是封閉的能力，如部分抑制，增強(qiáng)或諸如此類。
正如本發(fā)明所用，“封閉IL-18的活性”的表達(dá)指IL-18BP封閉至少上面舉出的IL-18的生物活性的至少一個(gè)的活性。IL-18BP封閉小鼠脾細(xì)胞中與IFN-γ的表達(dá)相關(guān)的IL-18的能力是IL-18封閉IL-18BP的活性的例子。正如下面將詳細(xì)顯示的，調(diào)節(jié)或封閉IL-18BP的活性部分是由于IL-18BP通過(guò)IL-18抑制NF-κB的活性的事實(shí)。另外，IL-18BP至少封閉一個(gè)下面的IL-18的活性，即在人和小鼠細(xì)胞中IFN-γ的誘導(dǎo)，IL-8的誘導(dǎo)和NF-κB的活化。
通過(guò)利用特定的有意義和反義引物，和來(lái)自人Jurkat T細(xì)胞的RNA以及來(lái)自TIGR序列的引物的逆轉(zhuǎn)錄PCR制備篩選cDNA文庫(kù)的DNA探針。通過(guò)DNA序列分析證實(shí)了得到的PCR產(chǎn)物。利用32[P]標(biāo)記PCR產(chǎn)物，并且用作篩選起源于周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞，Jurkat T細(xì)胞系，PBMC和人脾臟的四個(gè)人cDNA文庫(kù)的探針。各種獨(dú)立的cDNA克隆對(duì)應(yīng)于四個(gè)IL-18BP拼接突變體(SEQ ID NO1，3，5和7)。所有拼接突變體編碼推定的可溶性分泌蛋白質(zhì)。大多數(shù)富余的一個(gè)(IL-18BPa)具有編碼信號(hào)肽的192個(gè)密碼子的開(kāi)放讀碼框架，本發(fā)明有時(shí)稱為28個(gè)氨基酸殘基的“引導(dǎo)序列”，接著成熟的推斷的IL-18BPa，該結(jié)合蛋白質(zhì)的開(kāi)始40個(gè)殘基完美地匹配了尿IL-18BP的N末端蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO2)。半胱氨酸殘基的位置表明了這一多肽屬于免疫球蛋白(lg)超家族。有趣的是，在成熟IL-18BPa內(nèi)的四個(gè)Gln殘基的每個(gè)都是一個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)。三個(gè)其它的IL-18BP突變體沒(méi)有IL-18BPa豐富。它們包括編碼接著85個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白質(zhì)的28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽的更短的1kb IL-18BPb cDNA(SEQ ID NO4)。編碼接著169個(gè)氨基酸殘基的成熟IL-18BP的28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽的2.3kbcDNA表示的是第三個(gè)突變體，IL-18BPc(SEQ ID NO6)。第四個(gè)IL-18BPd，是編碼接著133個(gè)氨基酸殘基的成熟IL-18BP的28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽(SEQ ID NO8)。
為了進(jìn)一步研究可能存在另外的IL-18BP拼接突變體，利用對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)IL-18BP cDNA的探針篩選人基因組文庫(kù)。在這一文庫(kù)中鑒定了在長(zhǎng)度上有區(qū)別的5個(gè)基因組克隆。就這些克隆利用外部和內(nèi)部引物進(jìn)行DNA序列分析。同時(shí)，從這些克隆組裝了7.8kb序列(SEQ ID NO9)。在7.8kb序列內(nèi)沒(méi)有鑒定跨膜(TM)受體的外顯子編碼。所有突變體共享共同的翻譯起始位點(diǎn)，編碼相同的28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和大小變化的可溶性成熟蛋白質(zhì)和C末端序列。IL-18BP基因座含有編碼定位于負(fù)鏈的核有絲分裂器蛋白質(zhì)1(NUMA1)的其它基因。這一發(fā)現(xiàn)將IL-18BP基因定位于人染色體11q13(36)。
利用IL-18BPa的完整蛋白質(zhì)序列和GenPept數(shù)據(jù)庫(kù)(HTTP//www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源性研究，其中利用了Smith Watermann算法。發(fā)現(xiàn)在幾個(gè)痘病毒中作為前面未知功能的分泌蛋白質(zhì)表達(dá)的IL-18BP同系物。前面已經(jīng)報(bào)道這些病毒編碼各種細(xì)胞因子受體，并且這樣的病毒編碼的分子的作用是通過(guò)中和其相應(yīng)的細(xì)胞因子抑制免疫應(yīng)答的引誘受體(Spriggs，MK，1994，當(dāng)前免疫學(xué)評(píng)論，6526～529)。所以，本發(fā)明另外涉及了可以作為IL-18的生物活性封閉物或調(diào)節(jié)物的病毒編碼的IL-18BP的同系物。表1提供了病毒編碼的IL-18BP的同系物的實(shí)施例。
根據(jù)本發(fā)明，在原核生物或真核生物宿主中可以表達(dá)病毒編碼的IL-18BP的同系物。正如本發(fā)明所用，“病毒編碼的IL-18BP同系物”的表達(dá)指至少70％的氨基酸殘基的序列中至少有50％的相似性。更優(yōu)選地，在100個(gè)氨基酸殘基的序列中它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或最優(yōu)選地至少90％的相似性。
表1病毒編碼的蛋白質(zhì)顯示了與人IL-18BP高度同源GenPept序列 病毒類型MCU60315_54 U60315觸染性軟疣病毒亞型1MCU60315_53 U60315觸染性軟疣病毒亞型1SWPHLSB_12 L22013天鵝痘病毒CV41KBPL_14 母牛痘病毒VVCGAA_5天花病毒U01161_3174 缺肢病毒(小鼠痘病毒)VVU18340_6 天花病毒VVU18338_7 天花病毒VVU18337_7 天花病毒VARCG7_173 天花主要病毒MCU60315_51 觸染性軟疣病毒HNABV_1 新型肝炎非A，非B相關(guān)病毒在猴COS7細(xì)胞中表達(dá)了IL-18BPa。為了這一目的，在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEF-BOS中插入了IL-18BPa的cDNA。為了簡(jiǎn)化重組蛋白質(zhì)的純化，在框架內(nèi)的IL-18BP ORF的3’末端加入編碼(His)6序列的盒子。利用表達(dá)載體短暫轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，并且通過(guò)金屬螯合層析濃縮和純化這些細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基(150毫升)。在還原和非還原條件下在銀染，的SDS-PAGE上IL-18BPa作為單一的帶，并且具有與尿IL-18BP相同的表觀分子量。這一制劑的蛋白質(zhì)序列分析表明與尿IL-18BP相同的N末端序列。利用抗尿IL-18BP的抗體免疫影印分析IL-18BPa表明與尿蛋白質(zhì)相同的分子量帶。另外，利用免疫沉淀接著利用SDS-PAGE和放射自顯影，IL-18BPa能夠取代125I-IL-18BP，與抗體結(jié)合。所以，IL-18BPa結(jié)構(gòu)上對(duì)應(yīng)于從尿中分離的IL-18BP。
測(cè)試粗和純化的IL-18BPa的抑制IL-18的生物活性的能力。在小鼠脾細(xì)胞，PBMC和人KG-1細(xì)胞系中IL-18BPa抑制人和小鼠IL-18的活性(圖9)。這些結(jié)果證實(shí)了作為編碼生物活性IL-18BP的IL-18BPa cDNA的特征。
本發(fā)明還涉及突變蛋白質(zhì)和IL-18BP的片斷，和病毒IL-18BP，涉及含有與其它多肽或蛋白質(zhì)融合的野生型IL-18BP的融合蛋白質(zhì)和病毒IL-18BP或它們的突變蛋白或它們的片斷并且能夠結(jié)合IL-18或它的同系物的融合蛋白質(zhì)。
正如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”指其中不同的氨基酸殘基替代了天然IL-18BP或病毒IL-18BP的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，或在IL-18BP，或病毒IL-18BP的天然序列中加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，而與野生型IL-18BP或病毒IL-18BP相比，在得到的產(chǎn)物結(jié)合IL-18的能力的IL-18BP的類似物或病毒IL-18BP的類似物上沒(méi)有相當(dāng)大地改變。通過(guò)已知的合成和/或定位誘變技術(shù)，或任何適當(dāng)?shù)囊阎夹g(shù)可以制備這些突變蛋白。
任何這樣的突變蛋白質(zhì)優(yōu)選地具有足夠復(fù)制IL-18BP或足夠復(fù)制病毒IL-18BP的氨基酸序列，以致具有與IL-18BP基本相似的活性。IL-18BP的一個(gè)活性是它結(jié)合IL-18的能力。只要突變蛋白具有IL-18的基本結(jié)合活性，它就可以用于例如通過(guò)親和層析對(duì)IL-18進(jìn)行純化，所以可以認(rèn)為基本具有IL-18BP的相似的活性。所以，通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段包括將這樣的突變蛋白例如進(jìn)行簡(jiǎn)單的三明治競(jìng)爭(zhēng)測(cè)試確定是否任何給定的突變蛋白基本具有與IL-18BP相同的活性，以便如放射性免疫測(cè)試或ELISA測(cè)試確定它是否結(jié)合適當(dāng)標(biāo)記的IL-18。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，任何這樣的突變蛋白與IL-18BP或病毒編碼的IL-18BP同系物的序列至少具有40％的同一性或同源性。更優(yōu)選地，它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或最優(yōu)選地至少90％的同一性或同源性。
根據(jù)本發(fā)明可以利用的IL-18BP多肽的突變蛋白或病毒IL-18BP的突變蛋白，或編碼它們的核酸包括沒(méi)有根據(jù)本發(fā)明表示的指導(dǎo)和說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常規(guī)獲得的基本對(duì)應(yīng)于替代肽或多肽的有限套序列。對(duì)于蛋白質(zhì)化學(xué)和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)說(shuō)明，參見(jiàn)Schulz，G.E.等人，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的原理，Springer-Verlag，紐約，1978；Creighton，T.E.，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性，W.H.Freeman和Co，舊金山，1983，將它引入本發(fā)明作為參考。對(duì)于核苷酸序列替代的表示如密碼子優(yōu)先，參見(jiàn)Ausubel等人，出處同上，在A.1.1～A.1.24，和Sambrook等人，出處同上，在附錄C和D中。
本發(fā)明的優(yōu)選的突變蛋白的變化是已知為“保守”的替代。保守的IL-18BP多肽或蛋白質(zhì)或病毒IL-18BP的氨基酸替代可以在具有足夠相似的物理化學(xué)特性的基團(tuán)內(nèi)包括同義氨基酸，以致基團(tuán)的成員之間的替代將保留分子的生物學(xué)功能，Grantham，科學(xué)，185卷，862～864(1974)。清楚的是在上面確定的序列中沒(méi)有改變它們的功能，特別是如果插入或缺失僅僅包括幾個(gè)氨基酸，例如30個(gè)以下，和優(yōu)選地10個(gè)以下，并且沒(méi)有除去或替代功能構(gòu)型的關(guān)鍵氨基酸，例如，半胱氨酸殘基，可以進(jìn)行氨基酸的插入和缺失，Anfinsen，“控制蛋白質(zhì)鏈的折疊的原理”，科學(xué)， 181卷，223～230(1973)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)出現(xiàn)了這樣的缺失和/或插入產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白。
但是，如果為了避免形成可以引起IL-18BP的活性的減弱的不必要的分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，利用其它殘基可以替代生物活性不需要的半胱氨酸。
優(yōu)選地，同義氨基酸基團(tuán)已在表I中確定。優(yōu)選地，同義氨基酸基團(tuán)已在表II中確定；最優(yōu)選地同義氨基酸基團(tuán)已在表III中確定。表I 同義氨基酸的優(yōu)選基團(tuán)氨基酸 同義基團(tuán)Ser Ser，Thr，Gly，AsnArg Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，LeuPro Gly，Ala，Thr，ProThr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAla Gly，Thr，Pro，AlaVal Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly Ala，Thr，Pro，Ser，GlyIle Met，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePhe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCys Ser，Thr，CysHis Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsn Gln，Asp，Ser，AsnLys Glu，Gln，His，Arg，LysAsp Glu，Asn，AspGlu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMet Phe，Ile，Val，Leu，MetTrp Trp表II 同義氨基酸的更優(yōu)選的基團(tuán)氨基酸 同義基團(tuán)Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，MetPro Ala，ProThr ThrAla Pro，AlaVal Val，Met，IleGly GlyIle Ile，Met，Phe，Val，LeuPhe Met，Tyr，Ile，Leu，PheTyr Phe，TyrCys Cys，SerHis His，Gln，ArgGln Glu，Gln，HisAsn Asp，AsnLys Lys，ArgAsp Asp，AsnGlu Glu，GlnMet Met，Phe，Ile，Val，LeuTrp Trp表III 同義氨基酸的最優(yōu)選的基團(tuán)氨基酸 同義基團(tuán)Ser SerArg ArgLeu Leu，Ile，MetPro ProThr ThrAla AlaVal ValGly GlyIle Ile，Met，LeuPhe PheTyr TyrCys Cys，SerHis HisGln GlnAsn AsnLys LysAsp AspGlu GluMet Met，Ile，LeuTrp Met
可以用于獲得用于本發(fā)明的IL-18BP多肽或蛋白質(zhì)的突變蛋白或病毒IL-18BP的產(chǎn)生突變蛋白的蛋白質(zhì)氨基酸取代的實(shí)施例包括任何已知的方法步驟，如授予Mark等人的美國(guó)專利RE33,653，4,959,314，4,588,585和4,737,462；授予Koths等人的5,116,943；授予Namen等人的4,965,195；授予Chong等人的4,879,111；和授予Lee等人的5,017,691；和美國(guó)專利第4,904,584號(hào)中表示的賴氨酸取代蛋白質(zhì)(Shaw等人)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例中，IL-18BP或病毒IL-18BP的突變蛋白具有基本對(duì)應(yīng)于IL-18BP或病毒IL-18BP的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“基本對(duì)應(yīng)于”可理解為具有與天然蛋白質(zhì)的序列變化最小的蛋白質(zhì)，最小變化不影響特別是它們結(jié)合IL-18的能力范圍內(nèi)的天然蛋白質(zhì)的基本特征。通常認(rèn)為在“基本對(duì)應(yīng)于”范圍內(nèi)的該類型的變化是來(lái)自編碼這些蛋白質(zhì)的DNA的常規(guī)誘變技術(shù)，導(dǎo)致幾個(gè)小的修飾，并且以上面討論的方式篩選需要的活性。除了結(jié)合IL-18，突變蛋白也可以調(diào)節(jié)和/或封閉IL-18活性。
本發(fā)明的突變蛋白包括在嚴(yán)格條件下根據(jù)本發(fā)明與編碼IL-18BP或編碼病毒IL-18BP的DNA或RNA雜交的核酸如DNA或RNA編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括這樣的核酸，它可以在需要的核酸的鑒定和純化中用作探針。另外，這樣的核酸將是確定是否它編碼保留本發(fā)明的IL-18BP的功能活性的多肽的引物候選物。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員稱為“嚴(yán)格”的雜交和隨后的洗滌條件。參見(jiàn)Ausubel等人，分子生物學(xué)中的當(dāng)前方案，出處同上，Interscience，紐約，6.3和6.4章(1987，1992)，和Sambrook等人，出處同上。沒(méi)有限制地，嚴(yán)格條件的例子包括低于研究的雜交的計(jì)算Tm12～20℃，例如，2×SSC和0.5％SDS5分鐘，2×SSC和0.1％SDS15分鐘；0.1×SSC和0.5％SDS，在37℃30～60分鐘，然后，0.1×SSC和0.5％SDS在68℃30～60分鐘的洗滌條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的那些嚴(yán)格條件也取決于DNA序列，寡核苷酸探針(如10～40堿基)或混合的寡核苷酸探針的長(zhǎng)度。如果使用的是混合探針，優(yōu)選地利用四甲基氯化胺(TMAC)而不是SSC。參見(jiàn)Ausubel，出處同上。
本發(fā)明進(jìn)一步包括編碼本發(fā)明的IL-18BP，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在密碼子序列中有區(qū)別的核酸。在嚴(yán)格條件下與圖4到圖7顯示的DNA序列可能不雜交，但能夠編碼本發(fā)明的IL-18BP的DNA也包括在本發(fā)明中。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白質(zhì)”指含有與在體液中具有延長(zhǎng)的殘留時(shí)間的另一個(gè)蛋白質(zhì)融合的IL-18BP或病毒IL-18BP或其突變蛋白的多肽。所以，IL-18BP或病毒IL-18BP可以與另一個(gè)蛋白質(zhì)，多肽或諸如此類，例如免疫球蛋白或其片斷融合。它也可以與聚乙二醇(PEG)融合以便延長(zhǎng)殘留時(shí)間。
本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“鹽”指IL-18BP，病毒IL-18BP，突變蛋白或其融合蛋白質(zhì)的羧基基團(tuán)的鹽和氨基基團(tuán)的酸加入鹽。羧基基團(tuán)的鹽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的手段形成，并且包括無(wú)機(jī)鹽例如，鈉，鈣，銨，鐵或鋅鹽等，和正如與胺如三乙醇胺，精氨酸，或賴氨酸，哌啶，普魯卡因和諸如此類形成的那些有機(jī)堿的鹽。酸加入鹽包括例如與例如鹽酸，或硫酸的礦物質(zhì)酸形成的鹽，和含有例如乙酸或草酸有機(jī)酸的鹽。當(dāng)然，任何這樣的鹽必須基本具有與IL-18BP相似的活性。
如本發(fā)明所用的“功能衍生物”覆蓋了可以通過(guò)本領(lǐng)域的已知手段從作為殘基或N或C末端基團(tuán)上的側(cè)鏈存在的功能基團(tuán)制備，和只要它們保留藥物可接受即它們不破壞與IL-18BP或病毒IL-18BP的活性基本相似的蛋白質(zhì)的活性，并且不給予含有它的組合物毒性的特點(diǎn)就包括在本發(fā)明的IL-18BP，或病毒IL-18BP或它們的突變蛋白質(zhì)和融合蛋白的衍生物。這些衍生物可以例如包括聚乙二醇側(cè)鏈，該側(cè)鏈可以模擬抗原位點(diǎn)和在體液中延長(zhǎng)IL-18BP或病毒IL-18BP的殘留。其它衍生物包括羧基的脂肪族酯，通過(guò)與胺或與初級(jí)或次級(jí)胺反應(yīng)形成羧基的酰胺，與酰基成份(例如，阿爾卡諾或碳環(huán)芳香基團(tuán))形成的氨基酸殘基的無(wú)氨基基團(tuán)的N?；苌锘蚺c?；煞菪纬傻挠坞x羥基(例如，絲氨?；蛱K氨酰殘基)的O-?；苌铩?br>
關(guān)于IL-18BP，突變蛋白和融合蛋白質(zhì)的“活性部分”，假如所述部分基本保留了結(jié)合IL-18的能力，本發(fā)明覆蓋了蛋白質(zhì)分子單獨(dú)或與相關(guān)分子或其連接的殘基，例如，糖或磷酸殘基，或蛋白質(zhì)分子或糖殘基本身的聚集體的多肽鏈的融合片斷或前體。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)變化的衍生物”指其中末端已經(jīng)直接或通過(guò)接頭連接在一起以便產(chǎn)生環(huán)狀分子的線性分子，然后環(huán)狀分子在另一個(gè)位置打開(kāi)以便產(chǎn)生新的線性分子，其末端不同于原始分子的末端。環(huán)狀變化包括那些結(jié)構(gòu)等同于已經(jīng)環(huán)化和然后打開(kāi)的分子的分子。所以，可以重新作為線性分子合成環(huán)狀變化分子，并且從不進(jìn)行環(huán)化和打開(kāi)步驟。WO95/27732中公開(kāi)了環(huán)狀變化衍生物的制備。
各種重組細(xì)胞如原核細(xì)胞例如大腸桿菌，或其它真核細(xì)胞如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-18BP或病毒IL-18BP。為了產(chǎn)生重組IL-18BP或病毒IL-18BP，構(gòu)建攜帶編碼IL-18BP并且適于轉(zhuǎn)染(例如，大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞)或感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的DNA的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如，Ausubel等人，“分子生物學(xué)中的當(dāng)前方案”當(dāng)前方案，1993，和Sambrook等人，“分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”第二版，科爾德斯普林港出版社，1989。
為了表達(dá)IL-18BP蛋白質(zhì)或病毒IL-18BP，將編碼IL-18BP或病毒IL-18BP，它們的片斷，突變蛋白或融合蛋白質(zhì)和可操作地連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號(hào)的DNA插入能夠在宿主細(xì)胞染色體中整合需要的基因序列的載體中。為了能夠選擇已經(jīng)在它們的染色體中穩(wěn)定整合導(dǎo)入的DNA的細(xì)胞，利用了允許選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記。該標(biāo)記可以提供營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主原養(yǎng)型殺生物抗性，例如抗生素，或重金屬抗性例如銅或諸如此類。可選擇標(biāo)記基因可以直接與表達(dá)的DNA基因序列連接或通過(guò)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入同樣的細(xì)胞。其它元素也是單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)mRNA的最佳合成所需要的。這些元素可以包括拼接信號(hào)，以及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止信號(hào)。
優(yōu)選地將導(dǎo)入選擇的細(xì)胞的所述的DNA分子摻入能夠在受體宿主中自我復(fù)制的質(zhì)粒或病毒載體中。優(yōu)選的原核質(zhì)粒是pBr322的衍生物。優(yōu)選的真核載體包括BPV，疫苗，SV40，2-微米環(huán)等，或它們的衍生物。這樣的質(zhì)粒和載體是本領(lǐng)域已知的(2～5，22)。一旦已經(jīng)制備了用于表達(dá)的含有構(gòu)建體的載體或DNA序列，可以將表達(dá)載體通過(guò)任何種類的適當(dāng)手段，如轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染，共軛，原生質(zhì)體融合，電穿孔，磷酸鈣沉淀，直接微注射等導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。
在本發(fā)明中所利用的宿主細(xì)胞可以是原核或真核的。優(yōu)選的原核宿主包括細(xì)菌如大腸桿菌，芽胞桿菌，鏈霉菌，假單胞菌，沙門氏菌，沙雷氏菌等。最優(yōu)選地宿主是大腸桿菌。特別有利的細(xì)菌宿主包括大腸桿菌K12菌株294(ATCC 31446)，大腸桿菌X1776(ATCC 31537)，大腸桿菌W3110(F-，λ-，向光性(ATCC27325)。在這樣的條件下，蛋白質(zhì)將不糖基化。原核宿主必須與復(fù)制子和表達(dá)質(zhì)粒中的控制序列相容。
但是，因?yàn)樘烊籌L-18BP是糖基化蛋白質(zhì)，真核宿主比原核宿主優(yōu)選。優(yōu)選的真核宿主是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，人，猴，小鼠，和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兲峁┑鞍踪|(zhì)分子翻譯后修飾，包括正確的折疊，正確的二硫鍵形成，以及在正確的位點(diǎn)糖基化。同樣酵母細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞可以進(jìn)行翻譯后肽修飾包括高甘露糖糖基化。
存在許多重組DNA方案，它們利用了強(qiáng)啟動(dòng)子序列和高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，它們可以用于在酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生需要的蛋白質(zhì)。酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞識(shí)別了克隆的哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物上的引導(dǎo)序列和分泌成熟的IL-18BP。在導(dǎo)入載體后，在選擇含有載體的細(xì)胞的生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng)基中可以生長(zhǎng)宿主細(xì)胞。克隆的基因序列的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生了IL-18BP，病毒IL-18BP，融合蛋白質(zhì)，或其突變蛋白或片斷。在下面的實(shí)施例中詳細(xì)敘述了上面提到的克隆，克隆分離，鑒定，定性和測(cè)序方法。
然后通過(guò)任何常規(guī)方法包括提取，沉淀，親和層析，電泳或諸如此類或通過(guò)利用例如固定在柱內(nèi)包含的凝膠基質(zhì)上的抗IL-18BP單克隆抗體的親和層析分離和純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。含有所述的重組IL-18BP的粗制劑通過(guò)柱，因此IL-18BP將通過(guò)特異的抗體結(jié)合柱，而不純物質(zhì)通過(guò)柱。在洗滌后，在通常用于該目的的條件下，即在高或低pH，例如pH11或pH2從凝膠洗脫蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于在哺乳動(dòng)物，和更具體地說(shuō)在人中，表達(dá)IL-18BP或病毒IL-18或它們的衍生物的載體。在哺乳動(dòng)物中短期和長(zhǎng)期表達(dá)基因的載體在文獻(xiàn)中已有記載。研究已經(jīng)表明將基因釋放到例如，骨骼肌肉，血管平滑肌和肝導(dǎo)致的治療的蛋白質(zhì)在系統(tǒng)水平。骨骼肌肉是有用的靶，因?yàn)樗拇筚|(zhì)量，血管供應(yīng)和易接近性。但是，已經(jīng)成功地利用了其它靶和特定地免疫細(xì)胞的骨髓前體。例如在肌肉中表達(dá)蛋白質(zhì)的目前可得載體包括質(zhì)粒DNA，脂質(zhì)體，蛋白質(zhì)-DNA共軛物和基于腺病毒，腺相關(guān)病毒和肝炎病毒的載體。在這些之間，關(guān)于基因表達(dá)的時(shí)間和水平和出于安全性考慮，基于腺相關(guān)的病毒(AAV)的載體已經(jīng)是最成功的(Kessler，P.D.1996，美國(guó)科學(xué)院院刊，93，14082～4087)。
在Snyder等人，1996，人遺傳學(xué)中的當(dāng)前方案，12.1.1～12.1.17章，John Wiley和Sons中詳細(xì)敘述了AAV基礎(chǔ)的載體的構(gòu)建方法，并且引入本發(fā)明中。簡(jiǎn)要地說(shuō)，利用限制酶Xba I裂解含有野生型AAV基因組的質(zhì)粒psub201，并且與含有有效的真核生物啟動(dòng)子，例如，巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，Kozak同感序列，編碼IL-18BP或病毒IL-18BP的DNA序列，或它們的突變蛋白或融合蛋白質(zhì)或其片斷，適當(dāng)?shù)?’未翻譯區(qū)和多聚腺苷酸化信號(hào)，例如，猴病毒40的多聚腺苷酸化信號(hào)的構(gòu)建體連接。利用輔助AAV質(zhì)粒，例如pAAV/Ad將得到的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人T293細(xì)胞。然后，利用腺病毒作為輔助病毒感染培養(yǎng)物，并且在48～60小時(shí)后收集培養(yǎng)上清液。通過(guò)硫酸銨沉淀分級(jí)分離上清液，在CsCl密度梯度上純化，透析，然后在56℃加熱以便破壞任何腺病毒，而得到能夠表達(dá)IL-18BP或病毒IL-18BP或它們的突變蛋白或融合蛋白質(zhì)的重組AAV在這一步驟保持穩(wěn)定。
迄今為止，還沒(méi)有確立可溶性細(xì)胞因子的受體的生理作用?？扇苄允荏w結(jié)合它們的特異的配體，并且在大多數(shù)情況中抑制它們的生物活性，正如TNF系統(tǒng)中顯示的(11，12)。在很少的情況中，例如IL-6，可溶性受體增強(qiáng)生物活性。在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)重組可溶性TNF受體也已知為TBP(TNF結(jié)合蛋白質(zhì))能夠預(yù)防敗血性休克，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-1受體的可溶性形式對(duì)小鼠異嫁接受體中體內(nèi)同種異體反應(yīng)性的發(fā)展具有深遠(yuǎn)的抑制效果。
同樣，可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的IL-18BP和病毒IL-18BP在I型糖尿病中，在膿毒血癥，在自身免疫疾病，在移植排斥，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，腸炎疾病，膿毒血癥，多發(fā)性硬化，局部缺血性心臟病，包括急性心臟病發(fā)作，局部缺血性腦損傷，慢性肝炎，牛皮癬，慢性肝炎和急性肝炎中用作調(diào)節(jié)IL-18活性的調(diào)節(jié)物。所以，它們可以用于任何疾病，其中內(nèi)源產(chǎn)生或外源給藥IL-18誘導(dǎo)疾病或惡化病人的情況。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有藥物可接受載體和本發(fā)明的IL-18BP或病毒IL-18BP或它們的活性突變蛋白，融合蛋白質(zhì)及其鹽，功能衍生物或其活性部分的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有藥物可接受載體和例如，病毒載體如任何一個(gè)所述的基于AAV的病毒載體或表達(dá)IL-18BP或病毒IL-18BP或它們的突變蛋白，其片斷或融合蛋白質(zhì)和適于為了表達(dá)體內(nèi)本發(fā)明的IL-18BP和病毒IL-18BP或它們的突變蛋白片斷或融合蛋白質(zhì)，對(duì)人和其它哺乳動(dòng)物給藥，用于基因治療的另一個(gè)載體的藥物組合物。
通過(guò)將IL-18BP，或病毒IL-18BP或它們的衍生物，或表達(dá)它們的載體與生理可接受載體，和/或穩(wěn)定劑和/或賦形劑混合，并且通過(guò)在劑量小瓶中凍干制備成劑量形式制備用于給藥的本發(fā)明的藥物組合物。給藥的方法可以是通過(guò)相似試劑的給藥的任何可接受方式，并且將取決于待治療的病癥，例如，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，通過(guò)局部注射或局部應(yīng)用，或連續(xù)輸入等。給藥的活性化合物的量將取決于給藥的途徑，待治療的疾病和病人的癥狀。例如局部注射將在體重基礎(chǔ)上比靜脈內(nèi)輸入需要的蛋白質(zhì)的量更低。
因此，表明IL-18BP，或病毒IL-18BP或體內(nèi)表達(dá)它們的載體用于治療自身免疫疾病，I型糖尿病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，移植排斥，腸炎疾病，膿毒血癥，多發(fā)性硬化，局部缺血性心臟病包括急性心臟病發(fā)作，局部缺血性腦損傷，慢性肝炎，牛皮癬，慢性胰腺炎，急性胰腺炎，和相似的疾病，其中存在IL-18的異常表達(dá)，導(dǎo)致過(guò)量的IL-18或由于外源給藥IL-18引起的并發(fā)癥的情況。
本發(fā)明也包括抗IL-18BP或病毒IL-18BP，以及抗它們的突變蛋白，融合蛋白質(zhì)，鹽，功能衍生物和活性部分的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”指包括在可溶或結(jié)合形式中可以標(biāo)記的多克隆抗體，單克隆抗體(MAbs)，嵌合抗體，抗獨(dú)特型(抗Id)抗體的抗體，以及任何現(xiàn)有技術(shù)如并不限于酶裂解，肽合成或重組技術(shù)提供的人化抗體及其片斷。
多克隆抗體是起源于利用抗原免疫的動(dòng)物的血清的抗體分子的異源群體。單克隆抗體基本含有特異于抗原的抗體的同源群體，該群體基本含有相似的表位結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法可以獲得MAbs。參見(jiàn)例如，Kohler和Milstein，自然，256495～497(1975)；美國(guó)專利第4,376,110號(hào)；Ausubel等人，出處同上，編輯，Harlow和Lane，抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，科爾德斯普林港實(shí)驗(yàn)室，(1988)；和Colligan等人編輯，在免疫學(xué)中的當(dāng)前方案，Greene出版協(xié)會(huì)，和WileyInterscience紐約(1992，1993)，將這些參考文獻(xiàn)的內(nèi)容全部引入本發(fā)明作為參考。這樣的抗體可以是任何免疫球蛋白的類別包括IgG，IgM，IgE，IgA，GILD和其任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明的MAb的雜交瘤可以在體外，原位或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)或與原位產(chǎn)生高效價(jià)的Mab使這成為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
嵌合抗體是不同部分起源于不同動(dòng)物種類，如具有起源于小鼠MAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。將嵌合抗體初步用于減弱應(yīng)用中的免疫原性，和增強(qiáng)生產(chǎn)的產(chǎn)量，例如小鼠Mab在雜交瘤中有較高的產(chǎn)量，但在人中具有更高的免疫原性，以致利用了人/小鼠嵌合MAb。嵌合抗體和它們生產(chǎn)的方法是本領(lǐng)域公知的(Cabilly等人，美國(guó)科學(xué)院院刊，813273～3277(1984)；Morrison等人，美國(guó)科學(xué)院院刊，816851～6855(1984)；Boulianne等人，自然，312643～646(1984)；Cabilly等人，歐洲專利申請(qǐng)125023(1984年11月14日公開(kāi))；Neuberger等人，自然，314268～270(1985)；Taniguchi等人，歐洲專利申請(qǐng)171496(1985年2月19日公開(kāi))；Morrison等人，歐洲專利申請(qǐng)173494(1986年3月5日公開(kāi))；Neuberger等人，PCT申請(qǐng)WO8601533(1986年3月13日公開(kāi))；Kudo等人，歐洲專利申請(qǐng)184187(1986年6月11日公開(kāi))；Morrison等人，歐洲專利申請(qǐng)173494(1986年3月5日公開(kāi))；Sahagan等人，免疫學(xué)雜志，1371066～1074(1986)；Robinson等人，國(guó)際專利申請(qǐng)WO9702671(1987年5月7日公開(kāi))；Liu等人，美國(guó)科學(xué)院院刊，843439～3443(1987)；Sun等人，美國(guó)科學(xué)院院刊84214～218(1987)；Better等人，科學(xué)，2401041～1043(1988)；和Harlow和Lane，抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，出處同上。這些參考完全引入本發(fā)明。
抗獨(dú)特型(抗Id)抗體是識(shí)別通常與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的獨(dú)特的決定簇的抗體。通過(guò)利用抗Id正在制備的MAb免疫作為MAb來(lái)源的相同種類的動(dòng)物和基因型(例如，小鼠菌株)可以制備Id抗體。免疫的動(dòng)物通過(guò)產(chǎn)生抗這些獨(dú)特型決定簇的抗體(抗Id抗體)識(shí)別和應(yīng)答免疫抗體的獨(dú)特型決定簇。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利第4,699,880號(hào)，將它全部引入本發(fā)明。
抗Id抗體也可以用作“免疫原”以便在產(chǎn)生所謂抗-抗Id抗體的另一個(gè)動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答?？?抗Id的表位相同于誘導(dǎo)抗-Id的原始MAb。所以，通過(guò)來(lái)源于MAb的獨(dú)特型決定簇的抗體，有可能鑒定表達(dá)相同特異性的抗體的其它克隆。
因此，可以利用抗IL-18BP產(chǎn)生的MAb和本發(fā)明的相關(guān)蛋白質(zhì)在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物中，例如BALB/c小鼠中誘導(dǎo)抗-Id抗體。將來(lái)自這樣的免疫小鼠的脾細(xì)胞用于產(chǎn)生分泌抗-Id MAb的抗-Id雜交瘤。另外，抗Id Mab可以與載體如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，并且用于免疫其它BALB/c小鼠。來(lái)自這些小鼠的血清將含有具有特異于IL-18BP表位或病毒IL-18BP的表位的原始MAb的結(jié)合特性的抗-抗Id抗體。
所以，抗-Id MAb具有它們自己的獨(dú)特型表位，或結(jié)構(gòu)相似于評(píng)估的表位如IL-18BP或病毒IL-18BP的“獨(dú)特性”。
術(shù)語(yǔ)“人化抗體”指包括例如，通過(guò)基因工程方法操作小鼠抗體獲得的抗體，以便與人體更相容。這樣的人化抗體在人中具有減弱的免疫原性和提高的藥物動(dòng)力學(xué)。通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)，例如在分子免疫學(xué)30卷，16號(hào)，1443～1453，1993對(duì)于人化抗TNF抗體敘述的可以制備它們。
術(shù)語(yǔ)“抗體”也指包括能夠結(jié)合抗原的完整分子及其片斷如Fab和F(ab’)2。Fab和F(ab’)2片斷缺乏顯然更快速循環(huán)的完整抗體的Fc片斷，并且可以比完整抗體具有更少的非特異組織結(jié)合[Wahl等人，核酸方法雜志，24316～325(1983)]。令人滿意的是用于本發(fā)明的抗體的Fab和F(ab’)2和其它片斷可以根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的完整抗體分子的方法檢測(cè)和定量IL-18BP或病毒IL-18BP。這樣的片斷通常是通過(guò)利用酶如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片斷)或胰蛋白酶[產(chǎn)生F(ab’)2片斷]裂解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的。
如果能夠與分子特異反應(yīng)而將分子結(jié)合于抗體，就認(rèn)為抗體“能夠結(jié)合”分子。術(shù)語(yǔ)“表位”指能夠通過(guò)也被那個(gè)抗體識(shí)別的抗體結(jié)合的任何分子的部分。表位或“抗原決定簇”通常含有分子如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面基團(tuán)并且具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征以及特異的電荷特征。
“抗原”是能夠通過(guò)抗體結(jié)合的分子或分子的部分，該抗體另外能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生能夠結(jié)合抗原的表位的抗體?？乖梢跃哂幸粋€(gè)或一個(gè)以上的表位。特異的反應(yīng)在上面表示抗原將以高度選擇性的方式與它對(duì)應(yīng)的抗體反應(yīng)而不與大量的其它抗原引起的其它抗體反應(yīng)。
抗體，包括抗體的片斷可用于本發(fā)明的定量或定性檢測(cè)樣品中的IL-18BP或病毒IL-18BP或相關(guān)蛋白質(zhì)，或檢測(cè)表達(dá)這樣的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞的存在。通過(guò)利用與光顯微鏡的，流式細(xì)胞計(jì)或熒光計(jì)的檢測(cè)偶聯(lián)的熒光標(biāo)記的抗體(參見(jiàn)下面)的免疫熒光技術(shù)可以完成這一檢測(cè)。
用于本發(fā)明的抗體(或其片斷)可以在組織學(xué)上如在免疫熒光或免疫電子顯微鏡中用于本發(fā)明的IL-18BP或病毒IL-18BP和相關(guān)蛋白質(zhì)的原位檢測(cè)。通過(guò)從病人中移取組織樣品，并且給這樣的樣品提供本發(fā)明的標(biāo)記抗體可以完成原位檢測(cè)。通過(guò)在生物學(xué)樣品中應(yīng)用或覆蓋標(biāo)記抗體(或片斷)優(yōu)選地提供了抗體(或片斷)。通過(guò)利用這樣的方法，不僅確定IL-18BP或病毒IL-18BP或相關(guān)蛋白質(zhì)的存在，而且也可確定它在檢測(cè)的組織上的分布。利用本發(fā)明，那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地發(fā)現(xiàn)，為了完成這樣的原位檢測(cè)可以修飾任何種類的組織學(xué)方法(如染色方法)。
本發(fā)明的IL-18BP或病毒IL-18BP，或相關(guān)蛋白質(zhì)的這樣的測(cè)試通常包括在存在能夠鑒定IL-18BP或相關(guān)蛋白質(zhì)的可檢測(cè)標(biāo)記抗體時(shí)，溫育生物學(xué)樣品如生物液體，組織提取物，新鮮收集的細(xì)胞如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞，或已經(jīng)在組織培養(yǎng)中溫育的細(xì)胞，和通過(guò)任何的許多本領(lǐng)域公知的技術(shù)檢測(cè)抗體。
利用固相支持物或載體如纖維素，或其它固體支持物或能夠固定細(xì)胞的載體，細(xì)胞顆?；蚩扇苄缘鞍踪|(zhì)可以處理生物樣品。然后利用適當(dāng)?shù)木彌_液可以洗滌支持物或載體，接著利用本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)記的抗體處理。然后第二次利用緩沖液洗滌固相支持物或載體以便除去未結(jié)合的抗體。然后，通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)所述的固體支持物或載體上結(jié)合標(biāo)記的量。
通過(guò)“固相支持物”，“固相載體”，“固體支持物”，“固體載體”，“支持物”或“載體”是指能夠結(jié)合抗原或抗體的任何支持物或載體。公知的支持物或載體包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龍淀粉酶，天然和修飾的纖維素，聚丙烯酰胺，輝長(zhǎng)巖和磁鐵礦(magnetite)。載體的特性可以是為了本發(fā)明的目的溶解到一定程度或不溶。事實(shí)上，支持物質(zhì)可以具有任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要偶聯(lián)的分子能夠結(jié)合抗原或抗體。所以，支持物或載體構(gòu)型正如在小珠中或圓筒中，正如在測(cè)試管的內(nèi)部表面，或棒的外部表面可以是球形。可替代地，表面可以是平的，正如紙，測(cè)試條等。優(yōu)選的支持物或載體包括聚苯乙烯小珠。那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將知道許多結(jié)合抗體或抗原的其它適當(dāng)載體，或?qū)⒛軌蛲ㄟ^(guò)利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定它們。
根據(jù)公知的方法可以確定本發(fā)明的給定的許多抗體的結(jié)合活性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠通過(guò)利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定每個(gè)測(cè)試的可操作和最佳測(cè)試條件。
正如特定的條件下所常用或需要的，在測(cè)試中可以增加其它的這樣的步驟如洗滌，攪拌，振搖，過(guò)濾等。
可檢測(cè)地標(biāo)記本發(fā)明的抗體的一個(gè)方法是將它與酶連接，并且用于酶免疫測(cè)試(EIA)中。當(dāng)后來(lái)與適當(dāng)?shù)牡孜锝佑|時(shí)，該酶依次以這樣的方式與底物反應(yīng)以致產(chǎn)生可以通過(guò)分光光度計(jì)，熒光計(jì)或通過(guò)肉眼可見(jiàn)的方法檢測(cè)的化學(xué)成份?？梢杂糜诳蓹z測(cè)地標(biāo)記抗體的酶包括但不限于蘋(píng)果酸脫氫酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-類固醇異構(gòu)酶，酵母乙醇脫氫酶，α-甘油磷酸脫氫酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，觸酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，葡糖淀粉酶和乙酰膽堿脂酶。通過(guò)利用酶的色原底物的比色計(jì)方法可以完成檢測(cè)。在與相似的制備標(biāo)準(zhǔn)的比較中，通過(guò)肉眼比較底物的酶反應(yīng)程度也可以完成檢測(cè)。
通過(guò)任何的其它免疫測(cè)試可以完成檢測(cè)。例如，通過(guò)放射性標(biāo)記抗體或抗體片斷，能夠通過(guò)利用放射性免疫測(cè)試(RIA)檢測(cè)IL-18BP或病毒IL-18BP。在分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和生物化學(xué)，Work，T.S.等人，北荷蘭出版公司，紐約(1978)，特定的參考章節(jié)的標(biāo)題是“放射性免疫測(cè)試和相關(guān)技術(shù)的介紹”Chard，T.，(引入本發(fā)明作為參考)中可以發(fā)現(xiàn)對(duì)RIA的很好的敘述。當(dāng)利用γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過(guò)放射自顯影這些手段可以檢測(cè)放射性的同位素。
利用熒光化合物標(biāo)記本發(fā)明的抗體也是可能的。當(dāng)熒光標(biāo)記抗體與適當(dāng)波長(zhǎng)的光接觸時(shí)，然后由于熒光可以檢測(cè)它的存在。最通常利用的熒光標(biāo)記化合物是，異硫氰酸熒光素，羅丹明，藻紅蛋白，藻藍(lán)蛋白，別藻藍(lán)蛋白，鄰苯二醛和熒光胺。
利用熒光輻射金屬如152Eu，或鑭系其它物質(zhì)也可檢測(cè)地標(biāo)記抗體。利用如二亞乙基三胺五乙酸(ETPA)的金屬螯合基團(tuán)，可以將這些金屬附著于抗體上。
通過(guò)將它與生物素偶聯(lián)也可以檢測(cè)性地標(biāo)記抗體。然后，通過(guò)與熒光化合物或如過(guò)氧化物酶的酶或放射性同位素和諸如此類偶聯(lián)的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素可以檢測(cè)生物素化的抗體。
通過(guò)將它與化學(xué)熒光化合物偶聯(lián)也可以可檢測(cè)地標(biāo)記抗體。然后通過(guò)檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的熒光的存在確定化學(xué)熒光標(biāo)記的抗體的存在。特定的利用的化學(xué)熒光標(biāo)記化合物的例子是魯米諾，異魯米諾，熱吖啶酯，咪唑，吖啶鹽和草酸酯。
同樣，生物熒光化合物也可以用于標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物熒光是在催化蛋白質(zhì)增強(qiáng)化學(xué)熒光反應(yīng)的效率的生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)熒光的類型。通過(guò)檢測(cè)熒光的存在確定了生物熒光蛋白質(zhì)的存在。標(biāo)記的重要生物熒光化合物是熒光素，熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。
本發(fā)明的抗體分子可以適用于在immunometric測(cè)試，也已知為“2位點(diǎn)”或“三明治”測(cè)試中利用。在典型的immunometric測(cè)試中，將一定量的未標(biāo)記的抗體(或抗體片斷)結(jié)合于固體支持物或載體，并且加入一定量的可檢測(cè)的標(biāo)記可溶抗體允許檢測(cè)和/或定量在固相抗體，抗原和標(biāo)記的抗體之間形成的三元復(fù)合物。
通常，并且優(yōu)選的，immunometric測(cè)試包括“正向”測(cè)試，其中將結(jié)合固相上的抗體首先與待測(cè)試的樣品接觸，以便通過(guò)形成二元固相抗體-抗原復(fù)合物從樣品中提取抗原。在適當(dāng)溫育期后，洗滌固體支持物或載體以便除去液體樣品的殘基包括如果有任何未反應(yīng)的抗原，然后與含有未知量的標(biāo)記抗體(作用是“受體分子”)的溶液接觸。在允許標(biāo)記抗體與通過(guò)未標(biāo)記抗體結(jié)合于固體支持物或載體的抗原的復(fù)合物第二個(gè)溫育時(shí)期后，第二次洗滌固體支持物或載體以便除去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。
在也可以用于本發(fā)明的抗原的另一類型的“三明治”測(cè)試中，利用了所謂的“同時(shí)”和“反相”測(cè)試?！巴瑫r(shí)”測(cè)試包括單一的溫育步驟，因?yàn)榭贵w結(jié)合于同時(shí)在待測(cè)試的樣品中加入的固相支持物或載體和標(biāo)記的抗體。在溫育完成后，洗滌固體支持物或載體以便除去液體樣品的殘基和未復(fù)合的標(biāo)記抗體。然后，正如它是在常規(guī)的“正向”三明治測(cè)試，確定了與固體支持物或載體結(jié)合的標(biāo)記抗體的存在。
在“反相”測(cè)試中，在利用了適當(dāng)?shù)臏赜谥?，首先在液體樣品中逐步加入標(biāo)記抗體的溶液，接著加入結(jié)合于固體支持物或載體上的未標(biāo)記抗體。在第二次溫育之后，以常規(guī)方式洗滌固相使它脫離待測(cè)試的樣品的殘基和未反應(yīng)的標(biāo)記抗體溶液。然后正如在“同時(shí)”和“正向”測(cè)試中確定結(jié)合固體支持物或載體的標(biāo)記抗體的測(cè)試。
正如上面確定的，本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明的任何蛋白質(zhì)的DNA分子，含有任何這樣的DNA分子的可復(fù)制表達(dá)載體，利用任何這樣的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包括原核生物、真核生物和宿主細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞。本發(fā)明也包括為了在人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)的目的，產(chǎn)生編碼本發(fā)明的任何蛋白質(zhì)的表達(dá)載體的方法。
本發(fā)明也包括通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，和回收DNA分子和在這樣的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生本發(fā)明的任何蛋白質(zhì)的方法。
除了在調(diào)節(jié)IL-18的活性中利用IL-18BP或病毒IL-18BP，當(dāng)然它們也可以用于純化IL-18BP本身。為了這一目的，將IL-18BP或病毒IL-18BP與親和柱偶聯(lián)，并且通過(guò)粗IL-18。然后，通過(guò)例如在低pH洗脫從柱回收IL-18。
通過(guò)下面的非限制性實(shí)施例可以說(shuō)明本發(fā)明
實(shí)施例1分離IL-18結(jié)合蛋白根據(jù)制造商的說(shuō)明，將大腸桿菌IL-18(2.5毫升，Peprotech，NJ)與親和凝膠-10(0.5毫升，BioRad)偶聯(lián)，填充進(jìn)入柱中。以流速0.25毫升/分鐘，將粗尿蛋白質(zhì)(100倍濃縮，500毫升)加載到柱上。利用250毫升磷酸緩沖液(PBS)中的0.5摩爾/升的NaCl洗滌柱。然后立即用1摩爾/升Na2CO3中和的25毫摩爾/升檸檬酸，pH2.2和苯甲脒(1毫摩爾/升)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集1摩爾/升的部分。通過(guò)SDS-PAGE分析各部分，并且銀染。在組份2～8中，IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)作為約40,000道爾頓蛋白質(zhì)洗脫(圖1)。對(duì)應(yīng)于IL-18BP的約40千道爾頓的帶在銀染時(shí)展示明顯的黃色。通過(guò)正如實(shí)施例2中所述與125I-IL-18交聯(lián)，SDS-PAGE和放射自顯影分析各種部分。在組份2～8發(fā)現(xiàn)IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)，從IL-18瓊脂糖柱洗脫(圖2)。
實(shí)施例2親和純化的IL-18BP與標(biāo)記的IL-18的交聯(lián)將來(lái)自親和純化步驟的IL-18BP的樣品(40微升)與125I-IL-18(5,000,000cpm)一起溫育(70分鐘，4℃)。然后加入溶解于二甲基亞砜(Me2SO，20毫摩爾/升)的disuccinimidylsuberate(DSS)到最后濃度為2毫摩爾/升，并且將混合物在4℃保留20分鐘。通過(guò)加入pH7.5的1摩爾/升Tris-HCl和1摩爾/升NaCl到最后濃度為100毫摩爾/升終止反應(yīng)。加入含有二硫蘇糖醇(DTT，25毫摩爾/升最后)的樣品緩沖液，通過(guò)SDS-PAGE(7.5丙烯酰胺)接著放射自顯影分析混合物(圖2)。
在從IL-18親和柱(道2和3)洗脫的部分，但不是在含有所有其它粗尿蛋白質(zhì)的柱洗液(道1)中觀察到了可能含有與約20千道爾頓125I-IL-18交聯(lián)的約40千道爾頓蛋白質(zhì)的分子量為58千道爾頓的特異帶。
實(shí)施例3蛋白質(zhì)序列分析在非還原條件下，通過(guò)SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分辨實(shí)施例1的親和柱洗脫的各部分，在PVDF膜(Pro-Blot，應(yīng)用生物系統(tǒng)，USA)上電影印。利用考馬斯藍(lán)染色膜，切出約40千道爾頓的帶，通過(guò)Procise微序列儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)，USA)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析。獲得下面大的序列T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A1··· 5 ···10 ··其中x代表尚未確定的氨基酸。
另外，獲得了小的序列A-x-Y-x-R-I-P-A-x-A-I-A1 ··· 5 ····10··因?yàn)檫@一雙倍體序列，不可能獲得更長(zhǎng)的序列數(shù)據(jù)。鑒定了小序列為人防衛(wèi)素的片斷(登記號(hào)p11398)，開(kāi)始在防衛(wèi)素的氨基酸65。大序列不能與任何其它已知的蛋白質(zhì)結(jié)合，正如通過(guò)blastp和tblastn研究程序研究NCBI和TIGR中所有可得數(shù)據(jù)庫(kù)確定的。
為了獲得更長(zhǎng)和更精確的序列，和為了鑒定潛在的半胱氨酸殘基，在6摩爾/升鹽酸胍中利用DTT還原從IL-18瓊脂糖柱洗脫的組份的另一個(gè)等分試樣，與4丙烯吡啶反應(yīng)，通過(guò)微超濾裝置(Ultrafree，截止分子量10,000道爾頓，Millipore)脫鹽，進(jìn)行蛋白質(zhì)微序列的分析。在測(cè)序的1號(hào)循環(huán)后，將濾紙與鄰苯二醛反應(yīng)封閉N末端多肽而不是Pro。以這一方式，僅獲得如下大序列TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT1 10 20 30 40(T＝Thr；P＝Pro；V＝Val；S＝Ser；Q＝Gln；X＝未知；A＝Ala；R＝Arg；K＝Lys；D＝Asp；C＝Cys；F＝Phe；L＝Leu；E＝Glu)在循環(huán)6，7，8和11中，獲得了低水平的Thr信號(hào)。因?yàn)檫@一低水平，我們認(rèn)為在所述的循環(huán)中不指派特定的氨基酸殘基是更加謹(jǐn)慎的。
正如研究蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)確定的，得到的序列明顯不同于任何其它已知蛋白質(zhì)。但是，通過(guò)tblastn研究程序研究TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)提供了cDNA文檔，稱為THC123801，它的開(kāi)放讀碼框架(218個(gè)密碼子)當(dāng)翻譯時(shí)，含有與IL-18BP的N末端序列高度同源的序列。下面顯示了同源性1.......TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVT... 40| | | ||||||||||||||||||||||||||||||||51 VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE 100[上面的序列(1～40)是本發(fā)明分離的IL-18BP；下面的序列(51～100)是通過(guò)TIGR文檔THC123801的cDNA的翻譯推斷的]。
在IL-18BP的殘基2和4，翻譯文檔THC123801獲得的推定的蛋白質(zhì)序列是模糊的。它證明了IL-18BP的氨基酸殘基6，7和8作為Thr的特征，并且似乎對(duì)殘基11也一樣。
實(shí)施例4IL-18BP是糖蛋白通過(guò)在Superose12柱(1×30厘米，Pharmacia，瑞典)上排斥大小層析進(jìn)一步純化實(shí)施例1中洗脫組份的等分試樣(0.3毫升)。預(yù)平衡柱，并且利用磷酸緩沖液和疊氮化鈉(0.02％)流速0.5毫升/分鐘洗脫。1分鐘收集組份。正如SDS-PAGE和銀染確定的，在組份20～25作為約40,000道爾頓的蛋白質(zhì)洗脫IL-18BP結(jié)合蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，將含有約40,000道爾頓的蛋白質(zhì)的樣品(23，50微升組份，約50納克蛋白質(zhì))與N糖苷酶F(PNGase F，Biolab)反應(yīng)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)在5％SDS煮沸10分鐘，10×G7緩沖液(2.5微升)，10％NP-40(2.5微升)，和PNGase F(1微升)在37℃1小時(shí)變性等分試樣。在非還原條件下通過(guò)SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分析樣品，并且與來(lái)自相同的Superose12柱的未消化的IL-18BP比較。發(fā)現(xiàn)在PNGase-處理的部分，約40千道爾頓的IL-18BP帶消失了。獲得了新的對(duì)應(yīng)于30千道爾頓(正如在PNGase帶上面)和20千道爾頓的帶。約40千道爾頓的帶的消失表明該帶是N糖基化蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5通過(guò)IL-18BP封閉IL-18的生物活性通過(guò)測(cè)量在單核細(xì)胞中IL-18誘導(dǎo)的IFN-γ的產(chǎn)生確定從尿中分離的IL-18BP封閉IL-18活性的能力。當(dāng)與低濃度的LPS，IL-12，IL-2或其它刺激物一起加入時(shí)，IL-18誘導(dǎo)IFN-γ。在小鼠脾細(xì)胞，在人周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)和在人KG-1細(xì)胞系中測(cè)試IL-18的活性。從健康的小鼠制備脾細(xì)胞，洗滌和在補(bǔ)充了10％胎牛血清的RPMI1640中以5×106細(xì)胞/毫升懸浮。利用LPS(0.5微克/毫升或1微克/毫升)以及重組人或小鼠IL-18(0.5納克/毫升或5納克/毫升)刺激1.0毫升培養(yǎng)物。在加入脾細(xì)胞之前，在重組IL-18中加入人IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)(0，5或50納克/毫升)。在培養(yǎng)24小時(shí)后，將脾細(xì)胞進(jìn)行三次冷凍(-70℃)和解凍(室溫)循環(huán)，通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片，對(duì)于小鼠IFN-γ(內(nèi)源)，利用ELISA試劑盒測(cè)試上清液的IFN-γ。正如圖3A所示，IL-18BP以依賴劑量的方式，封閉小鼠脾細(xì)胞中的huIL-18的活性。相反，作為對(duì)照，可溶性的干擾素-α/B受體沒(méi)有效果。重組小鼠IL-18的活性相似地受到人IL-18BP的抑制，表明人IL-18BP識(shí)別小鼠IL-18(圖3B)。通過(guò)高濃度的LPS在小鼠脾細(xì)胞中誘導(dǎo)內(nèi)源的IL-18，導(dǎo)致IFN-γ的產(chǎn)生。實(shí)際上，尿IL-18BP也抑制LPS(10微克/毫升)誘導(dǎo)IFN-γ(圖3C)。伴刀豆球蛋白A(con A)活化T細(xì)胞以便在缺乏IL-18時(shí)產(chǎn)生IFN-γ(13)。確實(shí)，IL-18BP甚至在高濃度不抑制Con A誘導(dǎo)IFN-γ(圖3D)。這一觀察證明了IL-18BP是IL-18生物活性的特異抑制劑而不是IFN-γ產(chǎn)生的非特異抑制劑。IL-18BP也抑制了IL-18和TNF-α的聯(lián)合誘導(dǎo)的人KG-1細(xì)胞中人IL-18的活性(圖3E)。
正如在人和小鼠單核細(xì)胞中IFN-γ的共誘導(dǎo)確定的，上面的數(shù)據(jù)證明了尿IL-18BP抑制人以及小鼠IL-18的活性。減弱IL-18活性＞90％的IL-18BP的濃度是可以與IL-18本身比較的，表明在這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的高親和相互作用。
實(shí)施例6編碼IL-18BP的cDNA克隆的分離利用SuperScript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco-BRL)和隨機(jī)引物(Promega，麥迪生WI)逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自Jurkat T細(xì)胞(CRL 8163，美國(guó)類型培養(yǎng)物收藏中心)的總RNA。然后，通過(guò)PCR，利用TaqDNA聚合酶(西格瑪)和對(duì)應(yīng)于TIGR克隆THC123801核苷酸24～44(有意義)和500～481(反義)的引物擴(kuò)增得到的cDNA片斷。在30個(gè)退火(55℃，2分鐘)和擴(kuò)展(70℃，1分鐘)循環(huán)中進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)瓊脂糖(1％)凝膠電泳分辨PCR產(chǎn)物，洗脫和克隆進(jìn)入pGEM-Teasy TA克隆載體(Promega)。利用T7和SP6引物測(cè)序來(lái)自單個(gè)克隆的DNA。
通過(guò)隨機(jī)引導(dǎo)32P標(biāo)記得到的477bp片斷。將這一探針用于篩選各種人cDNA和基因組文庫(kù)。取出復(fù)制的硝酸纖維素濾紙，并且與探針在60℃，在含有6×SSC，10×Denhardt’s溶液，0.1％SDS和100微克/毫升鮭精DNA的緩沖液中雜交。洗滌濾紙和在-80℃過(guò)夜曝光到Kodak XAR膠片上。菌斑純化雙倍陽(yáng)性克隆。從λpCEV9克隆切出質(zhì)粒，并且自身連接。根據(jù)制造商的說(shuō)明分離來(lái)自其它文庫(kù)的cDNA克隆。利用有意義和反義引物和373A和377序列儀(應(yīng)用生物系統(tǒng))進(jìn)行分離的克隆的自動(dòng)DNA序列分析(33)。這些克隆程序使用標(biāo)準(zhǔn)方案。
篩選下面的文庫(kù)T.Miki友好提供的，λpCEV9克隆載體(15)中構(gòu)建的人單核細(xì)胞cDNA文庫(kù)；人Jurkat白血病T細(xì)胞cDNA文庫(kù)，人周邊血液白細(xì)胞cDNA文庫(kù)，和人脾cDNA文庫(kù)，所有來(lái)自Clontech(Palo Alto，CA)。在λFIXlI載體中的人胎盤(pán)基因組文庫(kù)是來(lái)自Stratagene(La Jolla，CA)。
獲得和鑒定了對(duì)應(yīng)于四個(gè)不同的IL-18BP拼接變異體的所有cDNA克隆。所有拼接的變異體編碼推定的可溶性分泌蛋白質(zhì)。最豐富的一個(gè)(IL-18BPa)具有192個(gè)密碼子的開(kāi)放讀碼框架，編碼了28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，接著成熟的推定的IL-18BPa，它的開(kāi)始40個(gè)殘基(SEQ ID NO10)完美地匹配了尿IL-18BP(SEQ ID NO2)的N末端蛋白質(zhì)序列。半胱氨酸殘基的位置表明了這一多肽屬于免疫球蛋白(lg)超家族。在成熟IL-18BPa內(nèi)的四個(gè)Gln殘基的每一個(gè)都是潛在的N糖基化位點(diǎn)。IL-18BP的其它三個(gè)拼接變異體明顯更不豐富。
另一個(gè)1kb IL-18BPb cDNA編碼85個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白質(zhì)(SEQ ID NO4)。編碼169個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO6)的成熟IL-18BP的2.3kb cDNA表示第三個(gè)變異體IL-18BPc.第四個(gè)變異體，IL-18BPd編碼133個(gè)氨基酸殘基的成熟IL-18BP(SEQ ID NO8)。外顯子內(nèi)的拼接存在于沿著前mRNA的兩個(gè)位點(diǎn)。這些事件和在IL-18BPd中的另外的5’外顯子在各種cDNA克隆中產(chǎn)生3個(gè)不同的5’UTR。所以，應(yīng)答不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)有可能產(chǎn)生不同的IL-18BP變異體。
迄今為止，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)編碼含有跨膜區(qū)的受體的cDNA。
實(shí)施例7哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建，重組IL-18BP的產(chǎn)生和重組IL-18BP的生物活性的評(píng)估通過(guò)PCR，利用有意義引物5’TATATCTAGAGCCACCATGAGACACAACTGGACACCA和反義引物5’ATATCTAGATTAATGATGATGATGATGATGACCCTGCTGCTGTGGACTGC擴(kuò)增IL-18BPa cDNA的編碼區(qū)。利用Xba I裂解PCR產(chǎn)物，克隆進(jìn)入pEF-BOS表達(dá)載體(25)的Xba I位點(diǎn)以便產(chǎn)生pEF-BOS-IL-18BPa。通過(guò)DNA測(cè)序證明了構(gòu)建體。
在室溫下，如所述(35)溫育含有pEF-BOS-IL-18BPa質(zhì)粒DNA(10微克)和DEAE-葡聚糖(120微克)的1.4毫升TD緩沖液中的6×107個(gè)COS7細(xì)胞30分鐘。然后，利用DMEM-10％FBS洗滌細(xì)胞，在DMEM-10中涂布4小時(shí)，洗滌和在無(wú)血清的DMEM中溫育3～5天。收集培養(yǎng)基，通過(guò)超濾(10千道爾頓截止分子量)濃縮6倍并且在Talon柱(Clontech)上。利用咪唑作為洗脫劑，根據(jù)制造商的說(shuō)明分離IL-18BP-His6。
如下評(píng)估尿和COS7表達(dá)的IL-18BP的免疫交聯(lián)反應(yīng)性將利用125I通過(guò)氯胺T方法標(biāo)記尿IL-18BP(5微克)。將COS7細(xì)胞的上清液(250微升)與尿IL-18BP的抗體混合(1小時(shí)，室溫，最后體積500微升)，在磷酸緩沖鹽(PBS)，0.05％吐溫20和0.5％牛血清白蛋白(洗滌緩沖液)中稀釋1∶1000。然后加入125I標(biāo)記的尿IL-18BP(106cpm)，在1小時(shí)后，加入蛋白質(zhì)G-瓊脂糖(20微升)。將混合物懸浮(1.5小時(shí)，4℃)，然后分離小珠，在3×洗滌緩沖液中洗滌，再次利用PBS洗滌。然后利用樣品緩沖液洗脫小珠，通過(guò)SDS-PAGE分辨(10％丙烯酰胺，在還原條件下，接著放射自顯影)。
在還原條件下和非還原條件下利用銀染，IL-18BP跑成單一的帶，并且具有如尿IL-18BP相同表觀分子量(數(shù)據(jù)未顯示)。這一制劑的蛋白質(zhì)序列分析表明如尿IL-18BP相同的N末端的序列，表明后者不在N末端降解。
利用抗尿IL-18BP的抗體免疫影印分析IL-18BPa表明與尿蛋白質(zhì)具有相同的分子量。另外，利用免疫沉淀，接著SDS-PAGE和放射自顯影，IL-18BPa能夠替代尿125I-IL-18BP結(jié)合抗體。所以，IL-18BPa在結(jié)構(gòu)上對(duì)應(yīng)于尿IL-18BP。
測(cè)試粗和純化的IL-18BPa抑制IL-18的生物活性的能力。IL-18BPa以依賴劑量的方式抑制IFN-γ在小鼠脾細(xì)胞，PBMC和人KG-1細(xì)胞系中誘導(dǎo)人和小鼠IL-18的活性(圖9)。
各種生物測(cè)試以及遷移變換測(cè)試的結(jié)果(實(shí)施例8)證實(shí)抑制IL-18活性的是克隆的IL-18BP，不是尿IL-18BP的任何附帶不純物質(zhì)，如共洗脫的防衛(wèi)素片斷的內(nèi)在特性。
實(shí)施例8電泳遷移變換測(cè)試同時(shí)研究了尿和重組IL-18BP對(duì)在人KG-1細(xì)胞中IL-18誘導(dǎo)的NF-κB的活性的影響。利用huIL-18(10納克/毫升)或與IL-18BP預(yù)混合的huIL-18刺激人KG-1細(xì)胞(4×106，在1毫升RMPI中)(20分鐘，室溫)。在37℃20分鐘后，利用冰冷的PBS洗滌三次，立即在液氮中冷凍。將細(xì)胞碎片再懸浮在緩沖液A[20毫摩爾/升Tris pH7.6，0.4摩爾/升NaCl，0.2毫摩爾/升EDTA，甘油(20％體積)，1.5毫摩爾/升MgCl2，2毫摩爾/升二硫蘇糖醇(DTT)，0.4毫摩爾/升PMSF，1毫摩爾/升Na3VO4，2微克/毫升每種亮抑酶肽，抑胃酶肽，和抑酶肽]中的3倍緊密細(xì)胞體積中。通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片(15,000×g，15分鐘)。在液氮中冷凍上清液的等分試樣，并且儲(chǔ)藏在-80℃。利用小牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)Bradford測(cè)試(Bio-Rad)確定蛋白質(zhì)濃度。利用[32P]dCTP(300居里/毫摩爾)和T4聚核苷酸激酶(新英格蘭實(shí)驗(yàn)室)標(biāo)記對(duì)應(yīng)于NF-κB結(jié)合元素的雙鏈寡核苷酸(10皮摩爾，普魯美格)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)柱除去游離的核苷酸。將利用IL-18或IL-18+IL-18BP處理的細(xì)胞的提取物(10微克蛋白質(zhì))與標(biāo)記探針(3×104cpm)以及聚dl.dC(500納克，Pharmacia)一起溫育(15分鐘，室溫)并且在20微升含有HEPES(pH7.5，10毫摩爾/升)，60毫摩爾/升KCl，1毫摩爾/升MgCl2，2毫摩爾/升EDTA，1毫摩爾/升DTT和甘油(5％體積)的緩沖液中變性鮭精DNA(100納克，西格瑪)。然后，在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上加載混合物。在185V，在0.5×TBE(40毫摩爾/升Tris HCl，45毫摩爾/升硼酸，和2.5毫摩爾/升EDTA)中進(jìn)行電泳。真空干燥凝膠并且在-80℃過(guò)夜放射自顯影。發(fā)現(xiàn)IL-18誘導(dǎo)p50-NF-κB同源二聚體和p65/p50 NF-κB異源二聚體的形成。正如利用結(jié)合對(duì)應(yīng)于NF-κB同感序列的放射性標(biāo)記的寡核苷酸的KG-1細(xì)胞提取物的電泳遷移變換測(cè)試確定的，尿以及重組IL-18BP通過(guò)IL-18抑制NF-κB的活化。
實(shí)施例9在大腸桿菌，酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)IL-18BP通過(guò)其它重組細(xì)胞如原核生物細(xì)胞例如大腸桿菌或其它真核生物細(xì)胞如酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞也可以產(chǎn)生IL-18BP。構(gòu)建適當(dāng)?shù)臄y帶編碼IL-18BP的DNA和適于轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母細(xì)胞或感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的載體以便產(chǎn)生重組IL-18BP的已知方法是可得的。為了在酵母細(xì)胞中表達(dá)，切出編碼IL-18BP的DNA(實(shí)施例6)并且插入適于轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞的表達(dá)載體。為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，將編碼IL-18BP的DNA插入桿狀病毒，并且利用所述的重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞。為了在大腸桿菌中表達(dá)，將編碼IL-18BP的DNA利用適當(dāng)?shù)墓押塑账徇M(jìn)行定位誘變，以致將起始的ATG密碼子剛剛插入在成熟的IL-18BP的第一個(gè)密碼子之前?？商娲兀ㄟ^(guò)PCR，利用適當(dāng)?shù)挠幸饬x和反義引物可以制備這樣的DNA。然后，將得到的cDNA構(gòu)建體通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)插入在適當(dāng)構(gòu)建的原核表達(dá)載體(23)。
實(shí)施例10構(gòu)建體內(nèi)表達(dá)IL-18BPa的腺結(jié)合表達(dá)載體根據(jù)質(zhì)粒pcDNA3構(gòu)建編碼IL-18BPa的功能基因(Invitrogen，圣迭戈，CA)。將在5’末端含有Kozak同感序列的IL-18BP cDNA以破壞限制位點(diǎn)的方式連接進(jìn)入pcDNA3的Xba I位點(diǎn)。在新霉素盒(原始pcDNA3序列的堿基2151)之前和在SV40多聚腺苷酸化信號(hào)(原始pcDNA3序列的堿基3372)之后，通過(guò)定位誘變插入新的Xba I位點(diǎn)。然后利用Xba I裂解構(gòu)建體，并且將得到的4.7kb小基因如上所述插入在質(zhì)粒psub201的Xba I位點(diǎn)(Snyder等人，1996，人遺傳學(xué)中的當(dāng)前方案，12.1.1～12.1.17章，John Wiley和Sons)。利用輔助AAV質(zhì)粒pAAV/Ad將得到的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入人T293細(xì)胞。然后，利用腺病毒作為輔助病毒感染培養(yǎng)物，在溫育48～60小時(shí)后收集細(xì)胞。將細(xì)胞進(jìn)行3個(gè)冷凍-解凍循環(huán)，通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片，利用硫酸銨將上清液飽和33％。然后離心混合物，通過(guò)將硫酸銨飽和50％從上清液中沉淀rAAV。通過(guò)CsCl進(jìn)一步純化該病毒，在56℃最后加熱15分鐘以便破壞任何腺病毒。
實(shí)施例11構(gòu)建IL-18BP的重組融合蛋白質(zhì)如下可以進(jìn)行含有與IgG2重鏈的恒定區(qū)融合的IL-18BP的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)利用適當(dāng)?shù)墓押塑账釋L-18BP的DNA進(jìn)行定位誘變，以致在編碼序列之前和之后立即導(dǎo)入獨(dú)特的限制位點(diǎn)。將含有IgG2重鏈的恒定區(qū)的質(zhì)粒，例如pRKCO42Fcl(6)進(jìn)行相同的定位誘變以便在盡可能接近IgG1重鏈的Asp 216處以允許在融合蛋白質(zhì)的時(shí)期中翻譯的方式導(dǎo)入相同的獨(dú)特位點(diǎn)。通過(guò)在獨(dú)特的限制位點(diǎn)消化，或可替代地通過(guò)利用適當(dāng)設(shè)計(jì)的引物的PCR可以制備含有5’非翻譯序列和編碼IL-18BP的dsDNA片斷。相似地消化突變的pRKCD42Fc1產(chǎn)生含有質(zhì)粒和IgG1序列的大片斷。然后，將兩個(gè)片斷連接產(chǎn)生編碼含有IL-18BP和IgG重鏈的約227個(gè)C末端氨基酸(鉸鏈區(qū)和CH2和CH3區(qū))的多肽的前體的新質(zhì)粒?？梢岳眠m當(dāng)?shù)南拗泼竿ㄟ^(guò)消化從質(zhì)粒中分離編碼融合蛋白質(zhì)的DNA，然后插入有效的原核或真核表達(dá)載體。
實(shí)施例12生產(chǎn)化學(xué)修飾的IL-18BP為了增強(qiáng)質(zhì)粒中IL-18BP的半衰期，可以制造利用聚乙二醇(PEG)化學(xué)修飾的IL-18BP。通過(guò)將PEG與IL-18BP分子的半胱氨酸殘基交聯(lián)可以進(jìn)行修飾。可以構(gòu)建含有IL-18BP的氨基末端的外半胱氨酸殘基，糖基化位點(diǎn)，羧基末端的突變體IL-18BP。通過(guò)利用含有需要的突變的寡核苷酸的PCR可以進(jìn)行誘變。以本領(lǐng)域公知的常用方法表達(dá)這些突變蛋白質(zhì)。將進(jìn)行這些蛋白質(zhì)的Pegylation并且將評(píng)估活性。
實(shí)施例13制備抗IL-18BP的多克隆抗體利用在完全Freund佐劑中乳化的5微克尿IL-18BP的純凈制劑皮下開(kāi)始皮下注射兔。3星期后，利用5微克在不完全Freund佐劑中的IL-18BP制劑皮下再次注射它們。在10天的間隔給予另外兩次注射正如在PBS中的溶液的IL-18BP。在最后免疫后10天取兔血。在發(fā)展抗體水平后進(jìn)行放射免疫測(cè)試。將125I-標(biāo)記的IL-18BP(166,000cpm)與各種稀釋度(1∶50，1∶500，1∶5,000和1∶50,000)的兔血清混合。在總體積200微升中加入蛋白質(zhì)-G瓊脂糖小珠的懸浮液(20微升，Pharmacia)。在室溫保留混合物1小時(shí)，然后洗滌小珠三次，計(jì)數(shù)結(jié)合的放射活性。將人Ieptin的兔抗血清用作陰性對(duì)照。IL-18R的抗血清的效價(jià)是在1∶500和1∶5,000之間，而陰性對(duì)照的效價(jià)小于1∶50。
實(shí)施例14制備IL-18BP的單克隆抗體首先利用在完全Freund佐劑的乳液中的2微克純化的IL-18BP注射雌性Balb/C小鼠(3個(gè)月大)，并且3個(gè)星期后，在不完全Freund佐劑中皮下注射。在10天的間隔，在PBS中皮下給予另外三次注射。在融合之前4和3天給予正如IRIA(參見(jiàn)如下)確定的顯示最高結(jié)合效價(jià)的小鼠腹膜內(nèi)最后加強(qiáng)免疫。利用NSO/1黑色素瘤細(xì)胞系和作為融合參與者的從動(dòng)物的脾和淋巴結(jié)制備的淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合。在微培養(yǎng)平板中分配融合細(xì)胞，在補(bǔ)充HAT和15％馬血清的DMEM中選擇雜交瘤。將發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-18BP的抗體的雜交瘤通過(guò)限制稀釋亞克隆，并且注射進(jìn)入已經(jīng)利用降植烷引導(dǎo)產(chǎn)生腹水的Balb/C小鼠。利用市場(chǎng)可得的ELISA試劑盒確定抗體的同型(Amersham，英國(guó))。
如下進(jìn)行產(chǎn)生抗IL-18BP的單克隆抗體的雜交瘤的篩選通過(guò)反向固相放射性免疫測(cè)試(IRIA)測(cè)試雜交瘤上清液中抗IL-18BP抗體的存在。利用Talon-純化的IL-18BPa-His6(10微克/毫升，100微升/孔)包衣ELISA平板(Dynatech實(shí)驗(yàn)室，Alexandria，VA)。在4℃溫育過(guò)夜后，利用含有BSA(0.5％)和吐溫20(0.05％)的PBS洗滌平板兩次，在洗滌溶液中在37℃封閉至少2小時(shí)。加入雜交瘤培養(yǎng)上清液(100微升/孔)并且在37℃溫育平板4小時(shí)。洗滌平板三次，在室溫下在2小時(shí)加入山羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶共軛物(HRP，Jackson實(shí)驗(yàn)室，1∶10,000，100微升/孔)。洗滌平板四次，通過(guò)作為底物的含有H2O2的ABTS[2’，2’-連氮基-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸，西格瑪)]展色。通過(guò)自動(dòng)ELISA讀數(shù)器對(duì)平板讀數(shù)。認(rèn)為至少比陰性對(duì)照的值高5倍的讀數(shù)的樣品是陽(yáng)性的。
實(shí)施例15利用單克隆抗體親和層析IL-18BP通過(guò)親和層析將抗IL-18BP的抗體用于IL-18BP的純化。在50％飽和度沉淀硫酸銨，接著對(duì)PBS擴(kuò)展透析純化雜交瘤分泌的含有單克隆抗體的腹水液體。正如制造商特指的，將約10毫克免疫球蛋白結(jié)合于1毫升親和凝膠10(BioRad USA)。
在4℃，流速0.25毫升/分鐘在0.5毫升抗IL-18BP抗體柱上加載250毫升人尿蛋白質(zhì)(相當(dāng)于250升粗尿)。利用PBS洗滌柱直到在洗液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)。利用25毫摩爾/升檸檬酸緩沖液，pH2.2(8×1柱體積部分)洗脫IL-18BP，通過(guò)1摩爾/升Na2CO3立即中和。通過(guò)大小排除層析獲得這一制劑的進(jìn)一步的純化。
實(shí)施例16ELISA測(cè)試?yán)每笽L-18BP單克隆抗體(無(wú)血清雜交瘤上清液或腹水免疫球蛋白)在4℃過(guò)夜包衣微滴平板(Dynatech或Maxisorb，Nunc)。利用含有BSA(0.5％)和吐溫20(0.05％)的PBS洗滌平板，在37℃在同樣的溶液中至少封閉2小時(shí)。在封閉溶液中稀釋測(cè)試樣品，在37℃加入孔中(100微升/孔)4小時(shí)。然后，利用含有吐溫20(0.05％)的PBS洗滌平板三次，接著加入兔抗IL-18BP血清(1∶1,000，100微升/孔)在4℃進(jìn)一步溫育過(guò)夜。洗滌平板三次，并且在室溫，在2小時(shí)加入山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶的共軛物(HRP，Jackson實(shí)驗(yàn)室，1∶10,000，100微升/孔)。洗滌平板四次，通過(guò)含有H2O2的作為底物的ABTS[2’，2’-連氮基-雙(3-乙基苯噻唑-6磺酸，西格瑪)]展色。通過(guò)自動(dòng)ELISA讀數(shù)器對(duì)平板讀數(shù)。
實(shí)施例17非糖基化人IL-18BP是具有生物活性的測(cè)試純化的重組IL-18BPa的抑制IL-18的生物活性的能力。IL-18BPa以依賴于劑量的方式抑制在小鼠脾細(xì)胞，PBMC和人KG-1細(xì)胞系中IFN-γ誘導(dǎo)人和小鼠IL-18的活性。
將在C末端具有His6標(biāo)記的純化IL-18BPa(1.5微克，50微升)的pH調(diào)節(jié)到7.5，并且與N糖苷酶F(3微升，500,000單位/毫升，PNGase F，新英格蘭實(shí)驗(yàn)室)混合。在37℃，在非變性條件下溫育混合物24小時(shí)。通過(guò)在非還原條件下，SDS-PAGE，接著利用IL-18BP的抗體免疫影印分析來(lái)自樣品和來(lái)自未消化IL-18BP-His6的等分試樣。發(fā)現(xiàn)IL-18BP-His6的約40千道爾頓的帶在PNGase處理的組份中消失，獲得了新的約20千道爾頓的帶。PNGase F的產(chǎn)物的分子量和特異性表明IL-18BP-His6完全糖基化。
在Talon小珠上分別吸收緩沖液中的PNGase處理的組份，未消化的IL-18BP-His6和含有PNGase的對(duì)照樣品，利用磷酸緩沖液洗滌，利用咪唑(100毫摩爾/升)洗脫。利用人IL-18(20納克/毫升)，LPS(2微克/毫升)和小鼠脾細(xì)胞將洗脫組份進(jìn)行生物測(cè)試。在下面的表中顯示了結(jié)果<
>所以，結(jié)論是糖基化的IL-18BP作為IL-18活性的調(diào)節(jié)物是具有生物活性的。
前面的特異實(shí)施例的敘述表明本發(fā)明的一般特性，以致通過(guò)應(yīng)用當(dāng)前的知識(shí)，其它人可以容易地修飾和/或采用各種應(yīng)用，如不脫離一般概念的特異實(shí)施例，并且，這樣的采用過(guò)程和修飾應(yīng)該可理解為在本實(shí)施例的等當(dāng)實(shí)施例的一樣和范圍內(nèi)。需要理解的是本發(fā)明利用的表達(dá)方式或術(shù)語(yǔ)是用于敘述而不是限制。
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Met Trp Gly Gly Lys Gly Gly Leu180 185 190Cys Gln Ser Ser Leu195<210>7<211>1360<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7gcggccgcgt cgaccacgca gctaaacaca gctaacttga gtcttggagc tcctaaaggg 60aagcttctgg aaaggaaggc tcttcaggac ctcttaggag ccaaagaaga ggacgttgtc 120acagataaag agccaggctc accagctcct gacgcatgca tcatgaccat gagacacaac 180tggacaccag acctcagccc tttgtgggtc ctgctcctgt gtgcccacgt cgtcactctc 240ctggtcagag ccacacctgt ctcgcagacc accacagctg ccactgcctc agttagaagc 300acaaaggacc cctgcccctc ccagccccca gtgttcccag cagctaagca gtgtccagca 360ttggaagtga cctggccaga ggtggaagtg ccactgaatg gaacgctgag cttatcctgt 420gtggcctgca gccgcttccc caacttcagc atcctctact ggctgggcaa tggttccttc 480attgagcacc tcccaggccg actgtgggag gggagcacca gccgggaacg tgggagcaca 540ggctgggctg agggcaacct tgccccccac ccaagaagcc ctgccctcca gccacagcag 600tccacagcag cagggttaag actcagcaca gggccagcag cagcacaacc ttgaccagag 660cttgggtcct acctgtctac ctggagtgaa cagtccctga ctgcctgtag gctgcgtgga 720tgcgcaacac accccctcct tctctgcttt gggtcccttc tctcaccaaa 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Pro Val Phe Pro Ala Ala Lys Gln Cys Pro Ala50 55 60Leu Glu Val Thr Trp Pro Glu Val Glu Val Pro Leu Asn Gly Thr Leu65 70 75 80Ser Leu Ser Cys Val Ala Cys Ser Arg Phe Pro Asn Phe Ser Ile Leu85 90 95Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser Phe Ile Glu His Leu Pro Gly Arg Leu100 105 110Trp Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr Gly Trp Ala Glu115 120 125Gly Asn Leu Ala Pro His Pro Arg Ser Pro Ala Leu Gln Pro Gln Gln130 135 140Ser Thr Ala Ala Gly Leu Arg Leu Ser Thr Gly Pro Ala Ala Ala Gln145 150 155 160Pro<210>9<211>7812<212>DNA<213>Homo sapiens<400>9gtcgacggta cccccgggaa agatttaata cgactcacta tagggcggga cagaattgat 60ctgtgagaga ctcatctagt tcatacccta ggtgaccctg ggggtggcat gggggtagat 120tagagatccc agtctggtat cctctggaga gtaggagtcc caggagctga aggtttctgg 180ccactgaact ttggctaaag cagaggtgtc acagctgctc aagattccct ggttaaaaag 240tgaaagtgaa atagagggtc ggggcagtgc tttcccagaa ggattgctcg gcatcctgcc 300cttcccagaa gcagctctgg tgctgaagag agcactgcct ccctgtgtga ctgggtgagt 360ccatattctc tctttgggtc tcaattttgc 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權(quán)利要求
1.包括SEQ ID NO10的氨基酸序列，突變蛋白，融合蛋白質(zhì)，功能衍生物，活性部分，環(huán)變化衍生物及其混合物的IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)(IL-18BP)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-18BP，至少具有下面的功能之一(i)結(jié)合IL-18，(ii)調(diào)節(jié)IL-18的活性，(iii)封閉IL-18的活性。
3.選自包括下面物質(zhì)的基團(tuán)的IL-18BP(a)含有SEQ ID NO2，4，6或8的氨基酸序列的任何一個(gè)的多肽；(b)如(a)中確定沒(méi)有引導(dǎo)序列的多肽；(c)如(a)或(b)中定義的多肽的突變蛋白，融合蛋白質(zhì)，功能衍生物，活性部分，環(huán)變化衍生物及其混合物；和(d)如(a)或(b)中定義的多肽的病毒同系物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的IL-18BP，至少具有下面的一個(gè)生物特性(i)結(jié)合IL-18，(ii)調(diào)節(jié)IL-18的活性，(iii)封閉IL-18的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中的任一項(xiàng)所述的IL-18BP是非病毒蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的IL-18BP，是人蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的IL-18BP，具有約40千道爾頓的分子量。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的IL-18BP，是融合蛋白質(zhì)。
9.包括根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的可溶性形式。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的IL-18BP，是非糖基化IL-18BP。
12.在嚴(yán)格條件下，能夠或在嚴(yán)格條件下但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性至少與SEQ ID NO1，3，5或7的一個(gè)DNA序列雜交的DNA，所述的DNA能夠編碼權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP。
13.編碼根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的DNA，包括SEQ ID NO10的氨基酸序列。
14.編碼根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的DNA，包括在3’末端提供終止密碼子的氨基酸序列SEQ IDNO10。
15.在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求13所述的DNA雜交或由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性在嚴(yán)格條件下雜交的DNA，能夠編碼根據(jù)權(quán)利要求1～11中所述的任一項(xiàng)IL-18BP。
16.根據(jù)權(quán)利要求12～15中任一項(xiàng)所述的DNA可操作地連接簡(jiǎn)化表達(dá)的其它DNA序列，如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子等。
17.根據(jù)權(quán)利要求12～16中任一項(xiàng)所述的DNA是基因組DNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求12～17中任一項(xiàng)所述的DNA，是cDNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的cDNA，包括選自SEQ ID NO1，3，5和7的DNA序列的基團(tuán)的cDNA序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的cDNA，適于在細(xì)菌宿主中表達(dá)。
21.包括根據(jù)權(quán)利要求12～20中任一項(xiàng)所述的DNA的可復(fù)制表達(dá)載體。
22.含有根據(jù)權(quán)利要求21所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞是真核生物細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的生產(chǎn)的過(guò)程，包括在適于表達(dá)所述的IL-18BP和分離所述的IL-18BP的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求21～23中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體是多克隆抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體是單克隆抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體是抗獨(dú)特型抗體。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體是嵌合抗體。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體是人化抗體。
32.根據(jù)權(quán)利要求3所述IL-18BP的分離的方法，包括(a)將人液體通過(guò)偶聯(lián)IL-18的層析柱，(b)洗脫能夠結(jié)合IL-18的蛋白質(zhì)，和(c)純化所述的蛋白質(zhì)。
33.含有根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的藥物組合物。
34.含有根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的病毒編碼同系物的藥物組合物。
35.含有編碼根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述IL-18BP的DNA的藥物組合物。
36.在藥物組合物的制劑中根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP的用途，用于治療需要給藥IL-18BP的病癥。
37.在藥物組合物制劑中編碼根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP病毒編碼的同系物的用途，用于治療需要給藥IL-18BP的病癥。
38.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP用于純化IL-18。
39.根據(jù)權(quán)利要求26～31中任一項(xiàng)所述的抗體用于對(duì)IL-18BP的檢測(cè)。
40.編碼根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP或所述的IL-18BP的病毒編碼的同系物的DNA用于基因治療。
41.根據(jù)權(quán)利要求12～20中任一項(xiàng)所述的DNA用于制造根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的IL-18BP。
全文摘要
提供了能夠結(jié)合IL－18和/或調(diào)節(jié)和/或封閉IL－18的活性的白細(xì)胞介素－18結(jié)合蛋白質(zhì)。也提供了它們分離和重組產(chǎn)生的方法,編碼它們的DNA,表達(dá)它們的DNA載體,用于在人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)它們的載體,抗它們的抗體。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1267307SQ98808134
公開(kāi)日2000年9月20日 申請(qǐng)日期1998年8月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月14日
發(fā)明者達(dá)妮埃拉·諾維克, 查爾斯·迪納雷羅, 梅納赫姆·魯賓斯坦, 金修鉉 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究發(fā)展有限公司