專利名稱：作為抗病毒劑的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及苯并咪唑核苷同類物和它們作為抗病毒劑的用途。更具體講，本發(fā)明涉及苯并咪唑核苷同類物，其中的糖基基團為來蘇呋喃糖基及其衍生物。本發(fā)明還涉及制備這類苯并咪唑核苷同類物及其衍生物的方法、包這些化合物的組合物，并涉及這些化合物在抗病毒治療中的用途。
在整篇申請中，包含(但不限于)出版物、專利以及發(fā)表的專利說明書的各種參考文獻可通過統(tǒng)一的引證參考。在本專利申請中，將這些公開的參考文獻(例如出版物、專利以及發(fā)表的專利說明書)融入本公開中，可以更全面地說明本發(fā)明所涉及的領域情況。
皰疹病毒家族(Herpesviridae)的成員共有同一種病毒結構。典型的皰疹病毒含有(a)線形的雙股DNA，(b)十二面體的衣殼，直徑大約為100-120nm，其中含有162個殼粒，(c)無定型的，有時是不對稱的物質，其包圍在衣殼之外，被稱作為皮，以及(d)在其表面上含有病毒糖蛋白刺突的包裹物。
皰疹病毒家族中人類致病菌的主要實例包括皰疹單體病毒(HSV)1，2，以及獼猴(Cercopithecine)皰疹病毒1(B-病毒)；水痘-帶狀皰疹(其可以引起水痘和帶狀皰疹)；Epstein-Barr病毒(EBV，其可以引起單核增生)；淋巴隱病毒；人類皰疹病毒6(HHV6)；人類皰疹病毒7(HHV7)以及與卡波濟有關的皰疹病毒(KHV)；或人類皰疹病毒8(HHV8)。人類巨細胞病毒(HCMV)，也叫作人類皰疹病毒在免疫抑制個體(參見Alford，C.A.；Britt，W.J.在Roizman，B.；Whitley，R.J.；Lopez，C.等人主編的人類皰疹病毒一書中所著的“巨細胞病毒”，Raven Press，New York，1993 pp.227-255)以及新生兒(參見Alford，C.A；Stagno，S.；Pass，R.F.；Brit，W.J.所著的“骨髓移植中先天性和產期巨細胞病毒感染”，Rev.Infect.Dis.1990，12，s793-s804以及Gallant，J.E.；Moore，R.D.；Richman，D.D.；Keruly，J.；Chaisson，R，E所著的“用Zidovudine治療的晚期免疫缺損病毒疾病的患者其巨細胞病毒疾病的發(fā)病率及自然病史”，J.Infect.Dis.1992，166，1223-1227)中是一種首要的機會致病菌病原體。
動物病原體包括感染的牛鼻氣管炎病毒，牛乳頭炎病毒，獼猴(Cercopithecine)皰疹病毒1(B-病毒)，它們均為單一病毒；假性狂犬病毒(豬PRV)，馬鼻肺炎以及Coital疹病毒(水痘病毒)；狒狒皰疹病毒，Pongine(黑猩猩)皰疹病毒(淋巴隱病毒)；Marek’病病毒(家禽)，火雞皰疹病毒；皰疹病毒發(fā)育不全以及皰疹病毒saimiri(彈狀病毒)；等等?？梢詤⒁奙urphy等人在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“病毒分類學”，1991，RavenPress，New York，P.9-36；Watson等人所著的基因的分子生物學，第四版，1987，Benjamin/Cummings Publ.Co.，Menlo Park，CA，p.904，933。
皰疹病毒基因組(其通常為120至230kb長)可以編碼50-200個不同的蛋白質。它們包括涉及核酸代謝的酶的大量排列(例如胸腺嘧啶激酶，胸苷酸酯合成酶，dUTP酶，核糖核苷酸還原酶等)，以及DNA合成酶(例如DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶)。
在皰疹病毒中，線性的基因組以重復的序列為特征，在各種類型的皰疹病毒中，它們在數(shù)量、長度以及序列上進行變化。例如在Epstein-Barr病毒中，基因組的末端具有大量的已鑒定序列的短的(500個堿對)重復以及由3-kb序列的半打重復組成的內部序列。在皰疹單體病毒1和2以及HCMV中，來自兩個終端的序列部分以顛倒的方向重復，并且在內部并列排列，將基因組分成兩個組分，每個組分中含有其側面連接有顛倒的重復序列的唯一序列。在這種情況下，這兩個組分(長的L臂以及短的S臂)可以彼此轉換。從病毒或受感染細胞中提取的DNA由四個等摩爾的群體組成，兩個組分的相對方向有所不同?？梢詤⒁奧atson等人，1987，p935；Roiaman在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“皰疹病毒概述”，1991，Raven Press，New York，P.841-847；Roiaman等人在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“皰疹單體病毒及其復制”，199 1，Raven Press，New York，P.849-895。
為了引發(fā)感染，病毒需要首先附著在宿主細胞受體上，附著后病毒的包圍層與漿膜快速融合。脫包裹的殼粒轉移至細胞核的核心，在那里DNA釋放到核中并迅速分布。下一步在嚴格的調控下，開始進行皰疹病毒基因的轉錄和翻譯。有三類基因是已知的，稱為α、β和γ(或稱為立即，早或晚)。誘導β基因的表達需要α基因的表達；β基因的表達可以誘導γ基因的表達并使α基因的表達停止；γ基因的表達又使β基因的表達停止。因此在復制過程中，皰疹病毒基因的表達有三個明顯的波。令人感興趣的是，上述過程似乎是循環(huán)的，感染后不久，至少需要一個病毒蛋白(γ基因產物)去誘導基因的表達。此產物攜帶病毒進入并幫助開始進入循環(huán)。見Watson等人，1987，p935-936；Roiaman在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“皰疹單體病毒及其復制”，1991，Raven Press，New York，P.849-895。
一些皰疹病毒，例如HSV-1和HSV-2具有很寬的宿主細胞范圍，有效地復合并迅速地破壞被感染的細胞。其它皰疹病毒(例如EBV，HHV6)的宿主細胞范圍較窄，或者對于HCMV來說，復制得很慢?？梢詤⒁奟oiaman在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“皰疹單體病毒及其復制”，1991，Raven Press，New York，P.849-895。
皰疹病毒在細胞核中進行復制，其中的核被取代、解聚并變成碎片，宿主染色體的結構上出現(xiàn)空白，其將導致染色體的破壞。宿主蛋白的合成降低得非常迅速(對于大多數(shù)皰疹病毒來說，但HCMV是個例外)，宿主核糖體RNA的合成也有所降低，宿主蛋白的糖基化作用停止。子代的生成不可改變地伴隨著受感染細胞不可逆的破壞?？梢詤⒁奟oiaman在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“皰疹單體病毒及其復制”，1991，Raven Press，New York，P.849-895。
皰疹病毒可以引起各種疾病癥狀和復雜的臨床癥狀。對于第一次感染的成年人來說，其癥狀一般非常嚴重。皰疹病毒可以引起復發(fā)感染，與這些復發(fā)感染有關的能力喪失即是很明顯的健康問題。最常見的皰疹疾病的復發(fā)表現(xiàn)在口面部以及生殖器區(qū)域，在美國，復發(fā)的皰疹角膜炎是引起失明的首要原因。伴有高幾率的復發(fā)發(fā)作的皰疹生殖器感染，因其頻繁地被識別以及其與顯著的發(fā)病率有關而引起人們的關注。Cohen等人，美國專利申請No.4,709,011,1987年11月24日批準。
在研究由HSV誘導的疾病的分子基礎時，研究目標的終點—疾病—與中樞神經系統(tǒng)(CNS)的破壞是同義的。然而，為了能在靶器官上廣泛分布，病毒首先在外周部位進行繁殖。在實驗系統(tǒng)中，產生HSV表現(xiàn)型的疾病的模型下，神經毒力是以下因素的結果(i)外周繁殖；(ii)CNS的入侵；(iii)CNS的生長。病毒毒力的位點可以歸因于HSV基因組上的幾個部位，但特別位于tk基因范圍內或包圍在其周圍，并位于L部分的一端。然而，幾乎任何HSV基因組的突變或缺失都將導致病毒毒力的降低。可以參見Roiaman在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“皰疹單體病毒及其復制”，1991，RavenPress，New York，P.849-895。
在EBV和HCMV的情況下，急性皰疹病毒通常與感染的單核增生有關。在HCMV感染的潛伏狀態(tài)下，單細胞是受牽連細胞的主要候選者，感染的單核增生可以通過輸血從血清陽性的個體轉移到血清陰性的個體上。血清陰性的個體也可以通過血清陽性供給者所提供的細胞或器官的移植受到感染?？梢詤⒁夾hmed等人在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“病毒持續(xù)性”，1991，Raven Press，NewYork，P.241-265；Stinski在Fields等人所主編的基礎病毒學一書中所著的“巨細胞病毒及其復制”，1991，Raven Press，New York，P.929-950。
在畜牧業(yè)中，具有經濟重要性的皰疹病毒是牛皰疹病毒-1(BHV-1)，其與各種臨床疾病的表現(xiàn)有關，包括鼻氣管炎，外陰陰道炎，流產，結膜炎，腦炎以及一般性的系統(tǒng)感染。參見Gibbs等人，1977，牛皰疹病毒I牛皰疹病毒-I。Vet.Bull.(London)47317-343。
假性狂犬皰疹病毒(PRV)，又稱為Aujeszky’s疾病病毒(ADV)是一種除了馬之外所有家養(yǎng)動物的主要疾病，其可以引起嚴重的損害，尤其是對豬和牲畜。豬是ADV的天然宿主。動物通過鼻途徑感染，最初的病毒在上呼吸道和消化道的粘膜處進行繁殖后，其通過神經向腦擴散。感染由急性發(fā)展到亞臨床性，這主要取決于病毒的毒力以及豬的年齡。象其它皰疹病毒一樣，PRV可以誘導潛伏的感染，也就是指神經組織的感染?？梢詤⒁夿erns等人，美國專利申請No.4,680,176，1987年7月14日批準。
目前，用于治療HCMV的藥物中，只有三個通過了FDA更昔洛韋(參見Crumpacker，C.S.更昔洛韋，New England J.Med.1996，335，721-729)，膦甲酸鈉(參見Chrisp，P；Clissold，S.P.在藥物雜志中所著的“膦甲酸鈉，其抗病毒活性綜述，在患有巨細胞病毒視網膜炎的免疫損害患者體內的藥代動力學及治療用途”，1991，41，104-129)，cidofivir(參見Hitchcock，M.J.；Jaffe，H.S.；Martin，J.C.；Stagg，R.J.在Antiviral Chem.&Chemother中所著的“一種具有強抗皰疹病毒活性的新制劑”，1996，7115-127。(b)Lalezari，，J.P.；Drew，W.L.；Glutzer，E.；James，C.；Miner，D.；Flaherty，J.；Fisher，P.E.；Cundy，K.；Hannigan J.；Martin，J.C.；Jaffe，H.S.在J.infect.Dis.中所著的(S)-1-[3-羥基-2-(膦?；籽趸?丙基]胞嘧啶(Cidofivir)“新穎抗病毒核苷酸同類物的I/II期研究結果”，1995，171，788-796)。所有這些藥物均可產生副作用，例如腎動能失調(膦甲酸鈉和cidofivir)以及粒細胞減少(更昔洛韋)。另外，由于其較強的耐藥性以及較差的口服利用率，需要尋找更有效且更具選擇性的藥物(參見Field A.K.；Biron K.K.在Clin.Microbiol.Rev.中所著的“修改的“無辜的結尾”皰疹病毒對抗病毒藥物的耐藥性”，1994，7，1-13)。
尋找新的抗皰疹病毒藥物的發(fā)明者們的近來研究集中在鹵代苯并咪唑核苷同類物上。1954年，第一篇有關這類化合物的合成和抗病毒評價的報告(參見Tamm，I.；Folkers，K.；Shunk，C.H.；Horsfall，F(xiàn).L.Jr在J.Exp.Med.中所著的“苯并咪唑N-甙類對流感病毒繁殖的抑制，1954，99，227-250)報道了5，6-二氯-1-(β-D-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(DRB)，將其作為這一系列中最具活性的抗病毒化合物。不幸的是，隨后發(fā)現(xiàn)DRB影響多數(shù)細胞過程，因此其活性很難與之細胞毒性相分開(參見Bucknall，R.A.在J.Gen.Virol.一書中所著的“取代苯并咪唑對病毒生長和宿主細胞核酸代謝的作用”，1967，1，89-99。(b)Tamm，I.；Sehgal P.B.在Adv.Virus Res.一書中所著的“鹵代苯并咪唑核苷及細胞和病毒的RNA合成”，1978；22187-258)。
“DRB”1-(β-D-核糖呋喃糖基)-5，6-二氯苯并咪唑
在雜環(huán)上帶有修飾的幾種DRB的合成已有報道(參見Townsend，L.B.；Revankar，G.R.在Chem Reviews，1970；70389-438中所著的“苯并咪唑核苷，核苷酸及有關的衍生物”，)。已發(fā)現(xiàn)在這些化合物中，2-取代-5，6-二氯-苯并咪唑核糖核苷的作用是最強的(參見Townsend，L.B.；Devivar，R.V.；Turk，S.T.；Nassiri，MR.；Drach，J.C.在J.Med.Chem.，1995，38，4098-4105中所著的“一些2，5，6-三氯-1-(β-D-核糖呋喃糖基)苯并咪唑的設計、合成以及抗病毒活性”；Zou，R.；Ayres K.R.；Drach，J.C.；Townsend，在J.Med.Chem.，1996，39，3477-3482中所著的“某些二取代的苯并咪唑核糖核苷的合成和抗病毒活性”；Zou R.；Drach，J.C.；Townsend，L.B.，在J.Med.Chem.，1997，40，811-818中所著的“作為治療人類巨細胞病毒感染有效制劑的2-氯-5，6-二鹵代-1-β-D-核糖呋喃糖基苯并咪唑的設計、合成和抗病毒活性評價”；Zou R；Drach，J.C.；Townsend，L.B.在J.Med.Chem.，1997，40，802-810中所著的“作為治療人類巨細胞病毒感染有效制劑的2-取代-4，5-二氯-和4，6-二氯-1-β-D-核糖呋喃糖基苯并咪唑的設計、合成和抗病毒活性評價”)。例如，已證明2，5，6-三氯-1-(β-D-核糖呋喃糖基)苯并咪唑(TCRB)以及2-溴-5，6-二氯-1-(β-D-核糖呋喃糖基)苯并咪唑(BDCRB)是HCMV的有效抑制劑，此活性與之毒性幾乎沒有聯(lián)系(參見Townsend，L.B.；Devivar，R.V.；Turk，S.T.；Nassiri，M.R.；Drach，J.C.在J.Med.Chem.，1995，38，4098-4105中所著的“一些2，5，6-三氯-1-(β-D-核糖呋喃糖基)苯并咪唑的設計、合成以及抗病毒活性”)。
1-(β-D-核糖呋喃糖基)-2，5，6-三氯苯并咪唑
“BDCRB”1-(β-D-核糖呋喃糖基)-2-溴-5，6-二氯苯并咪唑
另外，已經制備了幾種2-烷硫基及2-芐硫基同類物(參見Devivar，R.V.；Kawashima，E；Revankar，G.R.；Breitenbach，J.M.；Kreske，E.D.；Drach，J.C.；Townsend，L.B.在J.Med.Chem.，1994，37，2942-2948中所著的“一些2-(烷硫基)-以及2-(芐硫基)-5，6-二氯-(β-D-核糖呋喃糖基)苯并咪唑的設計、合成以及抗病毒活性”)。
除了這些D-碳水合物衍生物外，已經對幾種碳環(huán)化合物(參見Townsend，L.B.；Drach，J.C.；Good，S.S.；Daluge，S.M.；Martin，M.C.發(fā)表于7/9/96美國專利申請5,534,535中的“治療用核苷”)和L-碳水合物(參見Koszalka，G.W.；Chamberlain，SD；Daluge，S.M.；Boyd，F(xiàn).L.；Tidwell，J.H.；Martin，M.T.；Harvey，R.J.；Frick，L.W.；Perkins，D.G.；Wang，L.H.；Drach，J.C.；Townsend，L.B.；Biron，K.K.在XII國際圓桌會議核苷、和核苷酸以它們的生物應用，La Jolla，CA，1996年9月上發(fā)表的“用于治療人類巨細胞病毒感染的苯并咪唑”)衍生物進行了合成和評價。
1-(B-L-核糖呋喃糖基)-2-異丙氨基-5，6-二氯苯并咪唑
本發(fā)明涉及一類新的苯并咪唑核苷同類物，其中的糖基為來蘇呋喃糖基及其衍生物。
本發(fā)明的一個方面涉及D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。在一種實施方案中，本發(fā)明涉及D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物，它們的異頭和光學異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物，它們選自具有下列通式的化合物組
其中R2，R4，R5，R6和R7各自獨立，可以相同或不同，它們獨立的選自-H，-F，-Cl，-Bt，-I，-NO2，-N(R8)2，-OR8，-SR12，以及-CF3，其中R8獨立地為-H或具有1-6個碳原子的烷基(包括甲基、乙基、丙基、異丙基以及環(huán)丙基)，且R12獨立地為-H或具有1-10個碳原子的烴基基團(包括脂肪、脂環(huán)和芳香基團，包括烷基、芳基、芳烷基、烷芳基基團)；R9，R10和R11各自獨立，可以相同或不同，為H或保護的羥基基團(例如?；?。
在一種實施方案中，本發(fā)明涉及D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物，它們的異頭和光學異構體；它們的化學保護形式；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物，其中R2選自-H，-F，-Cl，-Br，-I，-N(R8)2；R4和R7各均為-H；R5和R6各自獨立，可以相同或不同，選自-H，-F，-Cl，-Br和-I。
在一種實施方案中，本發(fā)明涉及α-D-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。在一種實施方案中，本發(fā)明涉及β-D-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。在一種實施方案中，本發(fā)明涉及α-L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。在一種實施方案中，本發(fā)明涉及β-L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。
在一種實施方案中，本發(fā)明涉及D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物，它們選自1-(來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-溴-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-甲基氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-異丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-環(huán)丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-硫代-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-芐硫基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-甲硫基-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；它們的化學保護形式；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
本發(fā)明不包括的化合物有1-(5’-脫氧-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯-苯并咪唑，1-(5’-脫氧-來蘇呋喃糖基)-2-溴-5，6-二氯-苯并咪唑，以及1-(5’-脫氧-來蘇呋喃糖基)-2-異丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑。
本發(fā)明的另一個方面涉及含有生理上可接受的載體以及D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物的組合物。在一個方面中，載體可以是本領域內所定義的制藥學上可接受的載體。
本發(fā)明的另一個方面涉及通過使病毒與本發(fā)明D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物進行接觸，來抑制病毒的復制和繁殖。
本發(fā)明的另一個方面涉及治療和/或預防病毒感染的方法，其包括單獨或與制藥學上可接受的載體一起給予被感染的宿主治療有效劑量的本發(fā)明抗病毒來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物。
本發(fā)明的另一個方面涉及治療和/或預防肝炎病毒感染的方法，例如肝炎B和肝炎C，其包括使病毒與有效劑量的單獨的或與制藥學上可接受的載體在一起的本發(fā)明抗病毒來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物進行接觸。
本發(fā)明的另一個方面涉及D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物在制備用于治療病毒感染藥物方面的用途。
本發(fā)明的另一個方面涉及制備D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物的方法。
將可以看到，本發(fā)明一個方面優(yōu)選的特征和特性也適用于本發(fā)明的其它任意方面。A、本發(fā)明的抗病毒化合物總的來說，本發(fā)明抗病毒化合物為苯并咪唑核苷同類物，其包括經1-位與糖基基團Q相連的苯并咪唑基團
這里的術語“糖基基團”指以環(huán)狀形式存在的糖基基團，例如那些衍生自呋喃糖(5-元環(huán))的基團。糖基基團的例子包括蘇型呋喃糖基(來自蘇糖，四碳糖)；核糖呋喃糖基(來自核糖，五碳糖)；阿拉伯糖呋喃糖基(來自阿拉伯糖，五碳糖)；木糖呋喃糖基(來自木糖，五碳糖)以及來蘇糖呋喃糖基(來自來蘇糖，五碳糖)。下列結構式將說明這些糖的例子。
β-D-蘇-呋喃糖基
β-D-核糖呋喃糖基
β-D-阿拉伯糖呋喃糖基
β-D-木糖呋喃糖基
β-D-來蘇糖呋喃糖基
更具體講，本發(fā)明化合物包括經1-位與來蘇呋喃糖基基團(或其衍生物)的1’-位相連的苯并咪唑基團。來蘇呋喃糖基的特征是2’-OH，3’-OH以及4’-CH2OH位于呋喃糖基平面的同側。在這種情況下，由于化合物對在4’-碳上的構型不同，來蘇呋喃糖基和核糖呋喃糖基通常歸屬于4’-差向異構體，。
如下所述，這里的術語“苯并咪唑”涉及可被R2，R4，R5，R6和R7取代基分別在2-，4-，5-，6-，7-位上進行一或多個取代的苯并咪唑-1-基基團。
苯并咪唑取代基R2，R4，R5，R6和R7的實例包含-H，鹵素，例如-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-NR2，其中的R為-H或具有1-6個碳原子的烷基基團，-SR，其中的R為-H或具有1-10個碳原子的烴基基團，以及-CF3。
苯并咪唑基團的實例包括鹵代苯并咪唑，例如鹵代-，二鹵代-，三鹵代-，四鹵代-以及五鹵代苯并咪唑，其包括(但不限于)2，5，6-三鹵代苯并咪唑(例如，2，5，6-三氯苯并咪唑，2-溴-5，6-二氯苯并咪唑)，2，4，6-三鹵代苯并咪唑(例如，2，4，6-三氯苯并咪唑，2-溴-4，6-二氯苯并咪唑)，2，4，5，6-四鹵代苯并咪唑(例如，2，4，5，6-四氯苯并咪唑，2-溴-4，5，6-三氯苯并咪唑)。其它苯并咪唑基團的實例包含2-取代-4，5-二鹵代苯并咪唑(例如2-氨基-4，5-二氯苯并咪唑，2-異丙氨基-4，5-二氯苯并咪唑，2-甲氧基-4，5-二氯苯并咪唑，2-三氟甲基-4，5-二氯苯并咪唑)。一些苯并咪唑化合物以及它們的制備方法在本領域內是已知的，例如參見美國專利中請No.5,248,672和5,360,795。
在本發(fā)明的一個實施方案中，苯并咪唑基團為5，6-二氯苯并咪唑基團。在本發(fā)明的另一個實施方案中，苯并咪唑基團為2，5，6-三氯苯并咪唑基團。在本發(fā)明的另一個實施方案中，苯并咪唑基團為2-取代-5，6-二氯苯并咪唑基團，其中的2-取代基為氨基基團(即-NH2)，取代的氨基(例如-NHR，-N(R)2，其中的R為具有1-6個碳原子的烷基基團)，鹵素基團(例如-F，-Cl，-Br，-I)，巰基基團(即-SH)，或硫醚基團(即-SR，其中的R為具有1-10個碳原子的烴基基團)。
在本發(fā)明化合物的實例包括下列化合物、它們的異頭物(即α-和β-)和光學(即D-和L-)異構體以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
1-(來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-溴-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-甲基氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-異丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-環(huán)丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-硫代-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-芐硫基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-甲硫基-5，6-二氯-苯并咪唑；這里所用的“制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物”涉及任意制藥學上可以接受的鹽、酯、醚、酯的鹽類、溶劑化物，例如乙醇化物或本發(fā)明化合物的其它衍生物，它們在給予患者后，可以提供(直接或間接)本發(fā)明化合物或者是其活性代謝物或殘基。特別優(yōu)選的衍生物和前藥是這樣一些化合物，它們在給予哺乳動物后(例如通過口服給予化合物更容易吸收入血)可以增加本發(fā)明化合物的生物利用度，或可以提高母體化合物向生物空間(例如大腦或淋巴系統(tǒng))的轉運。
本發(fā)明化合物的鹽類衍生自無機或有機酸和堿。實例包括有鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸，磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、甲苯-對-磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸以及苯磺酸。其它酸，例如草酸，盡管其本身是制藥學上不可接受的，但可以用于鹽類的制備，這些鹽類是獲得本發(fā)明化合物及其制藥學上可接受的酸加成鹽時有用的中間體。堿的實例包括堿金屬(例如鈉)氫氧化物，堿土金屬(例如鎂)氫氧化物，氨以及式NW4+(其中W為C1-4烷基)的化合物。
鹽類的實例包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天門冬酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽、環(huán)戊丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、氟庚酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，草酸鹽，棕櫚酸鹽，果膠酸鹽，過硫酸鹽，苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，硫代氰酸鹽，甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。鹽的其它例子包括本發(fā)明化合物陰離子與合適陽離子如Na+，NH4+和NW4+(W為C1-4烷基)所成的鹽。
本發(fā)明化合物的酯包括對2’，3’-和/或5’-羥基基團進行酯化后得到的羧酸酯(即-O-C(＝O)R)，其中的R選自(1)直鏈或支鏈烷基(例如正丙基、叔丁基或正丁基)，烷氧烷基(例如甲氧烷基)，芳烷基(例如芐基)，芳氧烷基(例如苯氧甲基)，芳基(例如被鹵素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基任意取代的苯基)；(2)磺酸酯，例如烷基磺酸酯(例如甲磺酸酯)或芳烷基磺酸酯；(3)氨基酸酯(例如L-頡氨酸酯或L-異亮氨酸酯)；(4)磷酸酯以及(5)單-，二-或三-磷酸酯。采用C1-20醇或其反應性衍生物，或用2，3-二(C6-24)酰基甘油，可以使磷酸酯進一步酯化。在這類酯中，除非另有說明，任何存在的烷基優(yōu)選含有1-18個碳原子，尤其是1-16個碳原子，更特定地是含有1-4個碳原子。這類酯中存在的任何環(huán)烷基基團優(yōu)選含有3-6個碳原子。這類酯中存在的任何芳基基團優(yōu)選含有苯基基團。本發(fā)明中來蘇呋喃糖基前藥衍生物的實例包括那些被化學保護的羥基基團(例如用O-乙?；鶊F)，例如2’-O-乙?；鶃硖K呋喃糖基；3’-O-乙酰基來蘇呋喃糖基；5’-O-乙?；鶃硖K呋喃糖基；2’，3’-二-O-乙酰基來蘇呋喃糖基以及2’，3’，5’-三-O-乙?；鶃硖K呋喃糖基。
本發(fā)明化合物的酯包括甲酯，乙酯、丙酯、丁酯、異丁酯以及仲丁酯。B、使用本發(fā)明抗病毒化合物的方法本發(fā)明的一個方面涉及通過使病毒與有效劑量的可以抑制病毒復制和/或繁殖的化合物進行接觸，在體外、或體內抑制病毒復制和/或繁殖的方法。當這一接觸是在體外進行時，這些化合物可以用于篩選其它抗病毒化合物，這些化合物既可以單獨使用，也可以與本發(fā)明中所公開的化合物聯(lián)合使用。通過給予被感染的宿主治療有效量的本發(fā)明來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物，其也可以用來治療和/或預防病毒感染。在一種實施方案中，這類方法包括給予受感染的宿主制藥學上可接受的載體和治療有效劑量的本發(fā)明抗病毒來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物組成的組合物。
術語“治療有效劑量”包括預防有效劑量，并且是指當采用單獨治療或與其它制劑一起聯(lián)合使用時，該劑量在治療或預防患者病毒感染方面是有效的。這里所用的術語“治療”是指緩解患者某種具體的失調癥狀或指改善與具體失調有關的可確定的測定(指標)，或降低宿主中病毒的效價。當宿主接受治療后，通過觀察病毒載量的降低或與病毒感染有關的癥狀緩解，本領域內的專家即可以決定(劑量合適與否)。術語“預防有效劑量”是指該劑量對于預防宿主病毒感染是有效的。在這里使用的術語“宿主”是指哺乳動物，例如小鼠、牛、大鼠或人類患者。
術語“生理上可接受的載體”是指可以與本發(fā)明化合物一起給予患者的載體或輔助劑，且其不破壞化合物的藥理學活性，而且當以足夠運載有效劑量的抗病毒化合物的量給予患者時，它是無毒的。合適的載體的實例包括液相載體，例如無菌或水溶液以及下文中所描述的那些液體。
如下所述，本發(fā)明化合物是一種強的抗病毒藥物，其對于抵抗DNA病毒，例如皰疹型病毒(如HCMV，HBV以及HSV-1)特別有效，當與載體合用時，其可以提供抑制在體外或體內抑制病毒復制和繁殖的組合物。然而應該明白，盡管沒有明確地說明，本發(fā)明化合物對于其它病毒，例如HHV-6和HIV也具有抑制作用。測定抵抗這些病毒效力的方法將在下文中提供。另外，本發(fā)明化合物對于RNA病毒也有抑制作用。
本發(fā)明化合物可以與其它用于抑制上述病毒復制和繁殖以及有關病癥的治療劑一起使用。根據(jù)本發(fā)明，聯(lián)合治療包括給予至少一種本發(fā)明化合物以及至少一種其它制藥學上的活性成分。活性成分以及制藥學上的活性制劑可以同時給予，它們或存在于同一個藥物組合物中，或存在于不同的藥物組合物中，或者也可以以任意順序先后進行給藥。為了獲得所需的聯(lián)合治療效果，可以對活性成分和制藥學上活性制劑的量以及給藥的相對時間進行選擇。優(yōu)選的聯(lián)合治療包括給予一種本發(fā)明化合物以及下文中提到的試劑之一。術語“可操作的結合”包括本發(fā)明化合物與本發(fā)明其它化合物或本發(fā)明之外的其它化合物(例如更昔洛韋，AZT以及膦甲酸)任何化學上可配伍的結合，只要該結合不消除本發(fā)明化合的抗病毒活性。
其它活性成分的實例包括可以有效治療病毒感染和有關病癥的制劑，它們有(1-α，2-β，3-α)-9-[2，3-雙(羥甲基)環(huán)丁基]胍[(-)BHCG，SQ-34514]，氧雜環(huán)丁酰(oxetanocin)-G(3，4-雙(羥甲基)-2-氧雜環(huán)丁?；鵠胍)，無環(huán)核苷(例如阿昔洛維，伐昔洛韋，泛昔洛韋，更昔洛韋，噴昔洛韋)，無環(huán)核苷磷酸酯(例如，(S)-1-(3-羥基-2-膦?；籽醣?胞嘧啶(HPMPC)，核糖核酸還原酶抑制劑，例如2-乙酰基吡啶5-[(氯代苯胺基)硫代羰基]硫代碳腙(thiocarbonohydrazone)，3’-疊氮基-3’-脫氧胸腺嘧啶，其它2’，3’-二脫氧核苷，例如2’，3’-二脫氧胞苷，2’，3’-二脫氧腺苷，2’，3’-二脫氧肌苷，2’，3’-二脫氫胸腺嘧啶，蛋白酶抑制劑，例如瑞頭那韋(ritonovir)，印地那韋(indinavir)，141W94，那夫那韋(nelfinavir)，塞醌那韋(sanquinavir)，以及3S--[3R*(1S*，2R*)]-[3-[[(4-氨基苯基)磺?；鵠(2-甲基丙基)-氨基]-2-羥基-1-苯基甲基)丙基]氨甲酸，四氫-3-呋喃基醚(141W94)，氧硫雜雙戊烷核苷同類物，例如(-)-順-1-(2-羥基甲基)-1，3-氧硫雜雙戊烷5-基)-胞嘧啶(拉米夫定)或順-1-(2-羥基甲基)-1，3-氧硫雜雙戊烷5-基)-5-氟胞嘧啶(FTC)，3’-脫氧-3’-氟胸腺嘧啶，，5-氯-2’，3’-二脫氧3-’氟尿苷，(-)-順-4-[2-氨基-6-(環(huán)丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-環(huán)戊烷-1-甲醇，利巴韋林，9-[4-羥基-2-(羥甲基)丁-1-基]-胍(H2G)，tat抑制劑，例如7-氯-5-(2-吡啶基)-3H-1，4-苯并二氮雜草-2-(H)酮(Ro5-3335)，7-氯-1，3-二氫-5-(1H-吡咯-2-基)-3H-1，4-苯并二氮雜草-2-胺(Ro24-7429)，干擾素，例如(α-干擾素)，腎分泌抑制劑，例如丙磺舒，核苷轉運抑制劑，例如雙嘧啶氨醇(潘生丁)；己酮可可堿，N-乙?；腚装彼?NAC)，前半胱氨酸，α-天花粉蛋白，膦酰甲酸，以及免疫調節(jié)劑，例如白介素II或胸腺素，粒細胞巨噬細胞菌落刺激因素，促紅細胞生成素，可溶性CD4以及它們的基因工程衍生物，或非核苷反轉轉錄抑制劑，例如奈韋拉平(BI-RG-587)，洛韋胺(α-APA)，地拉夫定(delavuridine)(BHAP)以及膦酰甲酸。
本發(fā)明化合物也可以用于治療已經接受抗病毒藥物齊多夫定(AZT)和/或3TC治療的AIDS患者的HCMV以及HSV-1感染。與更昔洛韋和AZT的合用相比，本發(fā)明化合物與AZT的合用具有毒性較小的優(yōu)勢。在培養(yǎng)的人類細胞中，本發(fā)明化合物與AZT合用比起兩個藥物單獨使用可以產生較小的細胞毒性(即拮抗作用)。相反，在培養(yǎng)的人類細胞中，更昔洛韋與AZT合用比起兩個藥物單獨使用可以產生更大的細胞毒性。
本發(fā)明還提供了通過使細胞或細胞群在合適的條件下與有效劑量的本發(fā)明化合物進行接觸，降低或抑制在被病毒感染的細胞或細胞群中病毒復制和繁殖的方法，從而使得病毒的復制和繁殖被抑制。當病毒復制和繁殖被降低或抑制時，通過觀察病毒滴度的降低或將接受處理的感染細胞與未接受處理的感染細胞相比較其存活率提高時，本領域內專家可以容易地測定得到結果。分析病毒滴度的方法對于本領域內的專家來說是已知的，并將在下文中舉例說明。應該很容易理解，通過抑制和降低病毒的復制和繁殖，病毒的感染性也隨之受到抑制和降低，細胞更適合于進行抗病毒感染處理。有關的病理因素也得到治療。在一種實施方案中，對皰疹型病毒，例如HCMV，肝炎病毒(例如肝炎B病毒(HBV)，或HSV-1感染)進行了治療和預防。
為了達到本發(fā)明的目的，“細胞”包括(但不限于)哺乳動物的細胞，例如小鼠細胞、牛細胞、大鼠細胞、北美土撥鼠細胞、猴細胞或人類細胞?？捎帽景l(fā)明化合物、組合物以及本發(fā)明方法有效治療的病毒包括DNA和RNA病毒，尤其是皰疹型病毒。皰疹型病毒或皰疹病毒家族的實例為單一皰疹病毒1(HSV-1)，單一皰疹病毒2(HSV-2)，水痘-帶狀皰疹(VZV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，人類巨細胞病毒(HCMV)，人類皰疹病毒6(HHV-6)；人類皰疹病毒7(HHV-7)以及人類皰疹病毒8(HHV8)。本發(fā)明化合物特別適合于治療HCMV和HSV-1感染以及有關的病理特征(如再狹窄)。它們還適合于與失調(例如肝細胞癌)有關的肝炎的治療(參見美國專利No.5,679,342)。
本領域內專家可以容易地決定有效劑量，劑量可以根據(jù)受感染的細胞、病毒以及治療的目的進行變化。例如在細胞培養(yǎng)中使用這些藥物時，很重要的一點是藥物的用量對細胞不產生毒性。
“合適的條件”包括體外或體內。當在體外實施這種方法時，用有效抗病毒劑量的化合物培養(yǎng)細胞，進行接觸，可以有效地抑制細胞或細胞培養(yǎng)中的病毒復制和繁殖?；衔锟梢灾苯蛹尤肱囵B(yǎng)介質或在加入細胞之前與載體混合。在體外，該方法對于抑制實驗室細胞培養(yǎng)狀態(tài)下的病毒復制、繁殖以及由此帶來的感染特別有用。體內在病毒再次侵入患者之前，這些化合物可以抑制血液和血漿中病毒的復制和繁殖。
在體外，上述化合物和方法的使用還提供了一種有效的篩選新穎藥物或化合物的生物分析法，這些藥物或化合物可以提供相似的或更強的抗病毒活性。使用下面所提供的方法，在與測試本發(fā)明化合物相同的條件下對這些藥物進行測試。可以將受試藥物的抗病毒活性和細胞毒性與本發(fā)明組中的化合物進行比較。
盡管如下所示，化合物對于HCMV和HSV-1的抗病毒作用特別顯著，通過使用這里所描述的方法以及其它本領域內專家所熟知的方法，這些化合物也可以有效地抑制其它病毒，這亦在本發(fā)明的范圍之內。其它象這里所定義的可被治療的且包括在本發(fā)明范圍之內的病毒包括皰疹家族的全部成員，以及人類免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒，例如肝炎B病毒(HBV)。測定本發(fā)明中任意化合物抵抗HBV效力的方法對于本領域內的專家來說是熟知的；例如可以參見Daluge在美國專利No.5,399,580中所示的方法。
可以象這里所定義的可被治療的肝炎病毒家族中另一個成員是肝炎C病毒(HCV)。Houghton等人在美國專利No.5,679,342中所發(fā)表的文章詳細地描述了應用被HCV感染的外體細胞系統(tǒng)篩選最具活性的抗HCV化合物的方法。簡而言之，該方法包括(a)提供含有本發(fā)明受試化合物的組合物；(b)提供能夠被HCV感染的外體細胞系統(tǒng)；(c)提供含有感染HCV的生物樣品；(d)在缺乏(a)、允許細胞系統(tǒng)中的HCV感染的條件下，將組合物(a)和(c)與細胞系統(tǒng)一起培養(yǎng)；且(e)在培養(yǎng)后檢測對病毒感染的抑制。正如美國專利No.5,679,342中所公開的，優(yōu)選的細胞系統(tǒng)包括肝細胞，巨噬細胞，更優(yōu)選的是Kupffer巨噬細胞和B淋巴細胞。衍生自肝原始器官的細胞系也適合用于上述分析。我們也可以采用上述說明的分析方法測試化合物對病毒復制的抑制，即在缺乏(a)、允許細胞系中的HCV復制的條件下，將組合物(a)和(b)一起培養(yǎng)，并在培養(yǎng)后檢測對病毒復制的抑制。
本領域內另一個熟知的測試化合物抵抗HCV病毒的方法是解旋酶抑制分析法，例如Lain等人(1991)在核酸研究，691720-1726中以及Kim等人(1995)在Biochem.Biophys.，Res.Comm.160-166中所描述的。
當在體內(例如人類患者)應用該方法時，可以將化合物加到制藥學上可接受的載體中去，系統(tǒng)地或局部地給予患者，例如人類患者或哺乳動物，如小鼠、大鼠、北美土撥鼠或猴。
組合物也可以給予對病毒感染(例如HCMV、HSV-1或皰疹病毒感染)敏感或處于其危險之中的對象和個體。因此，本發(fā)明還提供了抑制患者體內病毒復制、繁殖和/或病毒感染的預防性措施，即在合適的條件下給予患者預防有效劑量的化合物或組合物，使得病毒的復制、繁殖或感染得到抑制?！邦A防有效劑量”是指能夠抑制受到病毒入侵的患者體內的病毒感染、復制和繁殖，并且不對接受治療的細胞和患者產生毒性的量。
應該明白，通過預防或抑制患者或個體體內病毒的繁殖、感染和復制，本發(fā)明組合物和方法還提供了治療、預防或減輕與病毒感染有關的癥狀或失調的方法，例如疾病包括失明，單核增生，再狹窄(HCMV)；水痘，帶狀皰疹(水痘-帶狀皰疹病毒)；感染的單核增生，腺，感冒以及Burkittis Lymphoma(Epstein-Barr病毒)；感冒瘡(皰疹單一病毒1)；生殖器皰疹(皰疹單一病毒2)；嬰兒薔薇疹(人類皰疹病毒6，人類皰疹病毒7)；卡波濟肉瘤(人類皰疹病毒8)。因此本發(fā)明還提供了減輕、預防或治療與病毒感染有關的失調或癥狀的方法，例如HCMV、HSV-1和皰疹病毒感染，例如再狹窄，機會致病菌感染(例如視網膜感染，胃腸道感染，肺炎，CNS感染或肝損傷)以及子宮感染，其方法是在合適的條件下給予患者預防有效劑量的本發(fā)明化合物，使得失調或癥狀有所減輕、得到預防或治療。
再狹窄是指血管狹窄，其可以發(fā)生在血管壁損傷后，例如由氣球血管成形術或其它外科手術引起的損傷，其特點是在受損血管壁上，平滑肌細胞過度繁殖。血管成形術后的再狹窄(RFA)發(fā)生在用氣球血管成形術治療冠狀動脈疾病的患者身上。
通常認為，在許多患有RFA的病人中，患者的病毒感染，尤其是CMV和/或HHV-6感染在所治療的冠狀血管平滑肌細胞的繁殖中起著關鍵性作用。
在一系列外科手術后可以發(fā)生再狹窄，例如移植手術、靜脈移植、冠狀分流移植術等，最常見的是在下列血管成形術之后。
血管成形術是一種外科技術，其中外周出現(xiàn)動脈粥樣硬化狹窄，用壓縮和/或撕扯血管壁上的斑、典型的是借助于壓縮氣球導管等方法，將腎和冠狀脈管系統(tǒng)打開。不幸的是，在20-50％的病例中，特別是在那些涉及冠狀脈管系統(tǒng)的病例中，在幾個月之內，被治療的血管出現(xiàn)了再狹窄，因此不得不重新進行手術。除了氣球導管方法之外，為了降低或預防血管成形術之后的再狹窄，人們還發(fā)展了象脈沖激光和旋轉切割等方法，但很少獲得成功。此外，人們還嘗試了一些藥物(包括抗凝劑和血管舒張藥)，但也都以失望而告終或得到類似的結果。
無論是體內還是體外的研究工作結果均提供了強有力的證據(jù)，其表明再狹窄是一種多因素綜合作用的過程。幾種細胞激動劑和生長因子一起作用，刺激血管平滑肌細胞(SMC)的遷移和復制以及外細胞基質物質的生成。另外，生長抑制劑可以抑制SMC’s的繁殖以及外細胞基質物質的生成。因此，本發(fā)明化合物可以用于預防或治療敏感對象或患者的再狹窄。
在整個治療過程中，體內給藥可以以單劑量連續(xù)或間隔地進行給藥。確定最有效的手段和給藥劑量的方法對于那些本領域內的專家來說是已知的，其可以根據(jù)所采用的組合物、目標病毒、治療目的、接受治療的靶細胞以及接受治療對象而變化。根據(jù)劑量水平以及主治醫(yī)生所選擇的方式，可以進行單或多次給藥。在下文中可以發(fā)現(xiàn)合適的劑量組合物和給予化合物的方法。
本發(fā)明化合物均顯示出抵抗HCMV、皰疹病毒感染以及HSV-1病毒的活性，并帶有可以接受的細胞毒性?？梢韵胍姡@示出相對高的抗病毒活性/細胞毒性(即較好的選擇性)的本發(fā)明化合物是優(yōu)選的。另外，本發(fā)明的抗病毒治療所包括病毒感染治療以及在某些情況下需要的預防性治療，例如對于免疫損傷的患者，如骨髓和器官移植患者以及對HCMV、皰疹病毒或HSV-1感染特別敏感的HIV隱性攜帶患者。
本發(fā)明化合物和組合物可以用于藥物的制備，并可以按照常規(guī)的方法，通過給藥用于人類和其它動物的抗病毒治療，例如給予藥物組合物中活性成分。
藥物組合物可經局部，口服，鼻內，非腸道或吸入治療進行給藥，可以采取片劑，錠劑，顆粒劑，膠囊，丸劑，安瓿，栓劑或氣溶膠等劑型。也可以采用處于水性或非水稀釋劑、糖漿劑、顆粒或粉末中的活性成分的軟膏劑，凝膠劑，膏劑，霜劑，噴霧劑，洗劑，懸浮劑，溶液和乳劑等劑型。除了本發(fā)明化合物之外，藥物組合物還可含有其它藥物活性化合物或多種本發(fā)明化合物。
更具體講，本發(fā)明通式的化合物在這里被指定為活性成分并可以通過任何合適的途徑給藥用于治療，包括口服，直腸，鼻腔，局部(包括透皮，氣溶膠，頰以及舌下)，陰道，非腸道(包括皮下，肌內，靜脈內以及皮內)和肺部給藥。比較可取的是，根據(jù)患者的情況和年齡以及所治療病毒的類型和感染的性質來選擇給藥途徑。
通常，用于上述病毒感染(例如HCMV和HSV-1)的合適的劑量范圍為約0.1-250mg/kg患者體重/天，優(yōu)選的范圍為約1-100mg/kg患者體重/天，最優(yōu)選的范圍為約5-20mg/kg患者體重/天。除非另有說明，所有活性成分的重量均以具有本發(fā)明通式的母體化合物的鹽或酯來計算，重量將成比例的增加。優(yōu)選的是，在一天當中，將所需劑量分成2，3，4，5，6或更多的亞劑量，以適當?shù)臅r間間隔進行給藥。這些亞劑量可以單位劑型進行給藥，例如每個單位劑型中含有約10-1000mg活性成分，優(yōu)選的是含有約20-500mg活性成分，最優(yōu)選的是含有約100-400mg活性成分。比較可取的是，可以根據(jù)病毒感染的類型和嚴重程度來選擇合適的本發(fā)明化合物和組合物的劑量，在患者與患者之間也可以有所不同。在決定合適的劑量時，需要兼顧本發(fā)明抗病毒治療中的治療作用和任何危險的或具有破壞性的副作用之間的關系。
理想地，給予活性成分后應獲得約2μM-100μM活性化合物的血漿濃度峰值，優(yōu)選的是約5μM-70μM，最優(yōu)選的是約1μM-50μM。例如通過靜脈注射約0.1-5％活性成分的溶液(選擇地溶于鹽水)或經口服給藥(例如含有約0.1-250mg/kg活性成分的片劑、膠囊或糖漿劑)可以獲得上述結果。通過持續(xù)地輸液提供約0.01-5.0mg/kg/小時的活性成分，或通過間歇性地按照約0.4-15mg/kg的量輸入活性成分，可以保持所需的血液水平。
人們期待這種有效的合用能夠提供治療上的聯(lián)合，與治療化合物或藥物單獨使用時相比，其所要求的每一種抗病毒劑的總量很低，因此降低了副作用，例如細胞毒性。
雖然活性成分可以單獨給予，優(yōu)選的還是以藥物組合物進行給藥，組合物中含有至少一種如上所述的活性成分以及一或多種制藥學上可以接受的載體和選擇的其它治療劑。每一種載體必須是“可以接受的”，其含義是可與組合物中的其它成分合用，并且不對患者產生損害。
組合物包括那些適合口服、直腸、鼻腔，局部(包括皮透、頰和舌下)、陰道、非腸道(包括皮下、肌內、靜脈和皮內)以及肺部給藥的劑型。組合物可以方便地以單位劑量的形式提供，并可以用制藥領域內任何已知的方法來制備。這類方法包括將活性成分與含有一或多種附加成分的載體進行混合的步驟。通常，通過統(tǒng)一并適宜地將活性成分與液體載體或細分的固體載體或兩者一起進行混合來制備組合物，如有所需，可以使產品成型。
適合于口腔給藥的本發(fā)明組合物可以獨立的單位提供，例如膠囊劑、扁囊劑或片劑，其中每一個含有預定量的活性成分；還有粉末劑或顆粒劑；處于水性或非水性液體中的溶液或懸浮液；或水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。活性成分還可以團快、(干)藥糖劑或膏劑形式提供。
通過任意地與一種或多種附加成分進行壓片或模制可以制備片劑。使處于自由流動狀態(tài)(例如粉末或顆粒)下的活性成分任意地與粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑進行混合，在合適的機器中壓片，可以制備得到壓縮的片劑。將粉末狀的化合物用惰性液體稀釋劑進行濕潤，在一個合適的機器中模制，可以制備得到模制的片劑。片劑可以任意地進行包衣或刻痕，并可以使用各種比例的羥丙基甲基纖維素進行組合物，使得其中的活性成分可以慢速或控制釋放，從而提供所需的釋放模型?？梢匀我獾靥峁┎捎媚c包衣形式的片劑，其在腸道部分釋放而不是在胃中。
適合口腔局部給藥的組合物包括活性成分處于調香基質(通常是蔗糖和金合歡或黃耆膠)中的錠劑、活性成分處于惰性基質(例如明膠和甘油，或蔗糖和金合歡)中的錠劑；還包括活性成分處于合適的液體載體中的口腔洗劑。
本發(fā)明中用于局部給藥的藥物組合物可以配制成軟膏劑、霜劑、懸浮劑、洗劑、粉末劑、溶液、膏劑、凝膠劑、噴霧劑、氣溶膠或油劑。另外，組合物也可以包括貼劑或敷料，例如繃帶或浸漬有活性成分和選擇性的一或多種賦形劑或稀釋劑的粘著膏劑。
對于眼部或其它外部組織(例如嘴和皮膚)的感染，組合物優(yōu)選的是采用含有活性成分的局部軟膏或霜劑，活性成分的量約為0.075-20％w/w，優(yōu)選的是約為0.2-25％w/w，更約為0.5-10％w/w。當組合物為軟膏劑時，活性成分可與石蠟或可與水混溶的軟膏基質一起使用。另外也可以將活性成分與水包油性的霜劑基質一起配成霜劑。
如有所需，霜劑基質的水相可以包括至少約30％(w/w)的多羥基醇，即具有兩或多個羥基基團的醇，例如丙二醇，丁-1，3-二醇，甘露醇，山梨醇，甘油以及聚乙二醇和它們的混合物。局部組合物可以根據(jù)需要包括可以增加活性成分通過皮膚或其它受作用區(qū)域吸收或滲透的化合物。這類皮透增強劑的實例包括二甲基亞砜以及有關的同類物。
本發(fā)明乳劑的油相可以用已知的方法并用已知的成分構成。盡管此相可以僅僅含有乳化劑(也被稱為凈化劑)，根據(jù)需要，其也可以包含至少一種乳化劑與脂肪或油或脂肪和油兩者均有的混合物。優(yōu)選地，其中既包含親水性的乳化劑中也包含親脂性的乳化劑，后者用作穩(wěn)定劑。該乳劑較好的是既包括油又包括脂肪?？傊瑤в谢虿粠в蟹€(wěn)定劑的乳化劑構成了所謂的乳化蠟，該蠟與油和/或脂肪構成了所謂的乳化劑軟膏基質，其形成了霜劑組合物的油性分散相。
適合用于本發(fā)明組合物凈化劑和乳劑穩(wěn)定劑包括Tween60，鯨蠟硬脂醇，肉豆蔻醇，單硬脂酸甘油酯以及十二烷基硫酸鈉。
由于活性化合物在大多數(shù)可用于藥物乳劑組合物的油狀物中的溶解度都非常低，因此用于本發(fā)明組合物的油或脂肪的選擇是基于能夠獲得所需的化妝性質。因此優(yōu)選的霜劑應該是一種非油脂，非染色并可以洗掉的產品，其具有合適的稠度，可以避免與管或其它容器分開?？梢圆捎弥辨溁蛑ф湥瑔?或二元烷基酯，例如二異己二酸酯，硬脂酸異鯨蠟酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，肉豆蔻酸異丙酯，油酸癸酯，棕櫚酸異丙酯，，硬脂酸丁酯，棕櫚酸2-乙基己酯或支鏈酯的混合物(被稱為Crodamol CAP)。最后三個是優(yōu)選的酯。根據(jù)所需的性質，這些酯可以單獨使用也可以合并使用。另外，也可以使用高熔點的液體(例如白軟石蠟和/或液體石蠟)或其它礦物油。
適合于眼部局部給藥的組合物還包括眼滴劑，其中的活性成分溶于或懸浮于合適的載體中，尤其是活性成分的水性溶液劑。優(yōu)選地，這類組合物中的活性成分的濃度約為0.5至20％，優(yōu)選地是約0.5-10％，特別優(yōu)選的是約1.5％(w/w)。
適合于陰道給藥的組合物可以以含有除活性成分之外的本領域內合適載體的陰道栓、塞子、霜劑、凝膠、膏劑、泡沫劑或噴霧劑組合物的形式提供。
適合于鼻腔給藥的組合物(其中的載體為固體)包括顆粒直徑范圍約為20-500微米的粗顆粒粉末，其采用鼻吸劑的形式給藥，即從一個緊緊地罩住鼻子的裝有粉末的容器中通過鼻通道迅速地吸入。合適用于給藥的組合物(其中的載體為液體)包括活性成分的水或油性溶液，例如鼻噴霧劑，鼻滴劑或通過噴霧器給藥的氣溶膠劑。
適合于非腸道給藥的組合物包括水性或非水性的等滲無菌注射溶液，其可以含有抗氧劑，緩沖劑，制菌劑以及溶質，它們使得組合物與接受治療的患者的血液等滲；該組合物還包括水性或非水性的無菌懸浮液(其中包含懸浮劑和增稠劑)以及脂質體或其它微粒系統(tǒng)(化合物進攻的靶子為血液成分或一或多個器官)。組合物可以密封容器的單位劑量或多劑量形式提供，例如安瓿或小瓶，并可以儲存于冷凍干燥的(冷凍干燥)條件下，僅需要在使用前加入無菌液體載體，例如注射用水即可。從前面詳細描述的無菌粉末、顆粒和片劑可以制備得到臨時注射溶液和懸浮液。
如上述例舉的，優(yōu)選的單位劑量組合物是那些含有活性成分的每日劑量或單位，每日亞劑量或其合適部分的組合物。
應該明白的是，除了上述特別提及的成分之外，根據(jù)所需組合物的類型，本發(fā)明的組合物還可以包含其它本領域內常規(guī)的試劑，例如那些適合于口服給藥的制劑進一步包括甜味劑、增稠劑以及芳香劑。
具本發(fā)明通式的化合物可以獸用組合物的形式提供，例如它們可以通過本領域內常規(guī)的方法來制備。C、制備本發(fā)明抗病毒化合物的方法已有顯示，采用修飾的Vorbruggen方法，從1，2，3，5，-四-O-乙?；?糖苷可以制得2，3，5-O-吡喃葡糖基核苷化合物。(參見Vorbruggen，H；Krolikiewicz，K；Bennua，B在Chem.Ber.1981，1141234-55中所著的“用甲基甲硅烷基三氟甲酸鹽和作為催化劑的高氯酸鹽合成核苷”)。在大多數(shù)情況下，1’-雜環(huán)基團和2’-O-乙?；鶊F的主要異頭構型是反式(參見Baker，B.R.；Joseph，J.P.；Schaub，R.E.；Williams，J.H.在J.Org.Chem.1954，19，1786-1792中所著的“嘌呤霉素合成研究，V.6-二甲基氨基-9-(2’-乙酰氨基-β-L-吡喃葡糖基)嘌呤”)。按照這種方法，在類似的縮合反應中，可以合成四-O-乙酰-D-來蘇呋喃糖基(化合物2b)和四-O-乙酰-L-來蘇呋喃糖基(化合物2a)作為糖基供給體。
從市場上購得的D-木糖起始，采用Guthrie和Smith所提供的方法，分三步可以制得四-O-乙酰-D-來蘇呋喃糖基(化合物2b)(參見Koszalka，G.W.；Chamberlain，SD；Daluge，S.M.；Boyd，F(xiàn).L.；Tidwell，J.H.；Martin，M.T.；Harvey，R.J.；Frick，L.W.；Perkins，D.G.；Wang，L.H.；Drach，J.C.；Townsend，L.B.；Biron，K.K.在XII國際圓桌會議核苷、和核苷酸以它們的生物應用，La Jolla，CA，1996年9月上發(fā)表的“用于治療人類巨細胞病毒感染的苯并咪唑”)。在按照所報道的方法實施此合成后，經1H-NMR測定相應地得到3∶1的呋喃糖和吡喃糖異構體混合物。為了優(yōu)化條件，使能夠獲得更多的呋喃糖異構體，在此方法的第一步中可以使用Dowex-50酸性離子交換樹脂和酰氯代替硫酸。經1H-NMR測定，在三步反應中使用這些新的條件替代原有的條件，可以獲得呋喃糖/吡喃糖混合物的比例為1.5∶1(dowex)以及5∶1(酰氯)。由于在任何情況下均形成吡喃糖，采用硫酸或酰氯條件就可以了。在進行硅膠層析之后，大約可以獲得總產率為50％化合物2b的異頭物混合物。
采用制備TCRB同樣的方法(參見Townsend，L.B.；Devivar，R.V.；Turk，S.T.；Nassiri，MR.；Drach，J.C.在J.Med.Chem.，1995，38，4098-4105中所著的“某些2，5，6-三氯-1-(β-D-核糖呋喃糖基)苯并咪唑的設計、合成以及抗病毒活性”以及Kawashima，E.；Gopata，P.K.；Devivar，R.V.；Townsend，L.B.在核酸化學；第四部分；Townsend，L.B.；Tipson，R.S.；Eds，；John Wiley和SonNew York，1991，P24-26中所著的“2，5，6-三氯-苯并咪唑”)，在干燥的乙腈中，可以用雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA，參見Vorbruggen，H；Hofle，在Chem.Bet.1981，114，1256-1268中所著的“關于核苷合成的機制”)對2，5，6-三氯-苯并咪唑(TCB，化合物1，參見Kawashima，E.；Gopata，P.K.；Devivar，R.v.；Townsend，L.B.在核酸化學；第四部分；Townsend，L.B.；Tipson，R.S.；Eds，；John Wiley和SonNew York，1991，P24-26中所著的“2，5，6-三氯-苯并咪唑”)進行甲硅烷基化。然后在三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯(TMSOTf)的存在下，用化合物2b進行糖基化，得到化合物3b，1-(2’，3’，5’-三-O-乙?；?α-D-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯苯并咪唑。用同樣的方法，可以制備得到化合物3a，1-(2’，3’，5’-三-O-乙?；?α-L-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯苯并咪唑。
在堿性條件下，化合物3b的去保護得到了1-(α-D-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯-苯并咪唑(化合物4b)。相似地，化合物3a的去保護得到了1-(α-L-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯-苯并咪唑(化合物4a)
正如先前所報道的(參見Harrison，D.；Ralph，J.T.在J.Chem.Soc.1965，236-239中所著的“2-氯代苯并咪唑的親核取代反應，第一部分，苯并咪唑啉-2-酮以及2-烷氧基苯并咪唑的形成”)，1-取代-2，5，6-三氯苯并咪唑的2-氯取代基可以方便地被各種親核試劑所取代。按照這種方法，在二氯甲烷中用無水溴化氫處理化合物3b，然后在堿性條件下進行去保護，得到2-溴-5，6-二氯-1-(α-D-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(化合物5b)。相似地，對化合物3a進行處理，可以得到2-溴-5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(化合物5a)。
另外，在密封的容器中用33％甲基胺/乙醇對化合物3b進行處理，可以一步得到甲氨基衍生物，1-(α-D-來蘇呋喃糖基-)-2-甲基氨基-5，6-二氯-苯并咪唑(化合物6b)。用同樣的方法，可從3a得到化合物6a，1-(α-L-來蘇呋喃糖基-)-2-甲基氨基-5，6-二氯-苯并咪唑。
在乙醇中，用合適的伯胺對去保護的核苷化合物4b進行處理，可以很方便地制備得到異丙氨基衍生物，1-(α-D-來蘇呋喃糖基-)-2-異丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑(化合物7b)以及環(huán)丙氨基衍生物，1-(α-D-來蘇呋喃糖基-)-2-環(huán)丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑(化合物8b)。用同樣的方式，從化合物4a可以制備得到1-(α-L-來蘇呋喃糖基-)-2-異丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑(化合物7a)及1-(α-L-來蘇呋喃糖基-)-2-環(huán)丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑(化合物8a)。
另外，在乙醇/硫脲混合物中將化合物4b加熱回流19小時，可以制備得到2-硫代衍生物，1-(α-D-來蘇呋喃糖基-)-2-硫代-5，6-二氯-苯并咪唑(化合物9b)。用相似的方式，可以制備得到1-(α-L-來蘇呋喃糖基-)-2-硫代-5，6-二氯-苯并咪唑(化合物9a)。
從市場上購得的5，6-二氯苯并咪唑-2-硫酮(化合物10)開始也可以制備得到化合物9b(參見Devivar，R.V.；Kawashima，E；Revankar，G.R.；Breitenbach，J.M.；Kreske，E.D.；Drach，J.C.；Townsend，L.B.在J.Med.Chem.，1994，37，2942-2948中所著的“某些2-(烷硫基)-以及2-(芐硫基)-5，6-二氯-(β-D-核糖呋喃糖基)苯并咪唑的設計、合成以及抗病毒活性”)，在干燥的乙腈中，用BSA對上述起始物進行甲硅烷化，然后在TMSOTf存在下，用化合物2b進行糖基化，去保護后得到化合物9b。這一結果肯定地說明，糖基化的部位發(fā)生在N-1位，而不是在2-位硫代基團上。用相似的方式可以制備得到化合物9a。
最后，在乙腈/水中，用NH4OH處理化合物9b，接著用溴芐或碘甲烷進行烷基化，相應地可以得到2-芐硫基-5，6-二氯1-(α-D-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(化合物11b)以及5，6-二氯1-(α-D-來蘇呋喃糖基)-2-(甲硫基)苯并咪唑(化合物12b)。用相似的方式，從化合物9a可以制備得到2-芐硫基-5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(化合物11a)以及5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)-2-(甲硫基)苯并咪唑(化合物12a)。
在另一個方法中，可按照下法制備β-L-同類物，首先用水合肼、吡啶和乙酸形成2，5，6-三氯-1-(3’，5’-二-O-苯甲?；?β-L-木糖呋喃糖基)苯并咪唑(化合物13)。然后使化合物13與無水三氟甲磺酸和吡啶在二氯甲烷中進行反應，得到2，3’-O-環(huán)-5，6-二氯-1-(β-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(化合物14)。隨后，在乙醇中使化合物14與異丙胺進行反應，得到2-異丙氨基-5，6-二氯-1-(β-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(化合物15)。
根據(jù)Baker’s規(guī)則，指定每個化合物的異頭構型(參見Baker，B.R.；Joseph，J.P.；Schaub，R.E.；Williams，J.H.在J.Org.Chem.1954，19，1786-1792中所著的“嘌呤霉素合成研究，V.6-二甲基氨基-9-(2’-乙酰氨基-β-L-葡糖吡喃糖基)嘌呤”)，并可用NOE實驗進行證實(參見Rosemeyer，H.；Toth，G.；Seela，F(xiàn).在核苷，核苷酸，1989，8，587，597中所著的“借助NOE差異光譜學所進行的D-核-、阿-、2’-脫氧核-以及2，3-二脫氧核糖核苷酸的異頭指定”)。
于是，在一實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明中D-或L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物的制備方法，所述的方法包括以下步驟(a)使式(II)化合物與式(II I)化合物進行反應，
其中R2選自-Cl，-Br和＝S，且R9，R10或R11各自獨立，可以相同或不同，并且為-H或羥基保護基團；且，(b)隨后進行一或多個下列步驟(i)從產品(a)上去除一或多個羥基保護基團，如果存在；(ii)使產品(a)與HX進行反應，其中X選自-Cl，-Br，-F和-I；(iii)使產品(a)與R8NH2進行反應，其中的為-H或具有1-6個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基基團；(iv)使產品(a)與H2NCSNH2進行反應；(v)使產品(a)與C6H5CH2X進行反應，其中X選自-Cl，-Br，-F和-I；(vi)使產品(b)(iv)與C6H5CH2X進行反應，其中X選自-Cl，-Br，-F和-I；(vii)使產品(a)與CH3I進行反應；并且(viii)使產品(b)(iv)與CH3I進行反應。
通用化學方法熔點用Thomas-Hoover儀器測定，末校正。色譜使用硅膠，SilicAR40-63微米，230-400目(Mallinckrodt)。薄層層析(TCL)在預制的SilicAR7GF板上進行(Analtech，Newark，DE)。TCL板在下列溶劑系統(tǒng)中展開系統(tǒng)1(2％MeOH/CHCl3，v/v)，系統(tǒng)2(10％MeOH/CHCl3，v/v)，系統(tǒng)3(35％EtOAc/己烷，v/v)，系統(tǒng)4(25％EtOAc/己烷，v/v)，系統(tǒng)5(5％MeOH/CHCl3，v/v)，系統(tǒng)6(15％MeOH/CHCl3，v/v)，系統(tǒng)7(20％EtOAc/己烷，v/v)，系統(tǒng)8(50％EtOAc/己烷，v/v)?；衔镉肬V光(254nm)進行照射使之可見化，或用10％的甲磺酸進行處理，接著再于一個熱板上炭化。除非另有說明，蒸發(fā)在減壓條件下進行(水抽吸器)，浴溫不超過45℃。1H-NMR光譜用Bruker200、300、360或500MHz的儀器記錄?；瘜W位移用相對于標準化合物的位移，每百萬中所占部分來表示，溶劑為DMSO-d6(d＝2.50)。除了化合物6a，所有的1H-NMR的測定結果是通過同核去偶聯(lián)實驗得到的，其被指定為COSY實驗。除非另有說明，微量分析結果(總結于表I)由Michigan大學化學系提供，它們?yōu)槔碚撝档摹?.4％。除非另有說明，所有的原料均由市場上購得。
實施例下列實施例中描述了本發(fā)明中的幾個抗病毒化合物，其目的在于說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
化合物3a1-(2，3，5-三-O-乙酰基-α-L-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯苯并咪唑將500ml配備有克萊森接管和攪拌器的圓底燒瓶排空，并用氬氣進行沖洗。將2，5，6-三氯苯并咪唑(參見Kawashima，E.；Gupta，P.K.；Devivar，R.V.；Townsend，L.B.2，5，6-三氯苯并咪唑。在核酸化學第四部分中；Townsend，L.B.，Tipson，R.S.，Eds.John Wiley和SonsNew York，1991，p24-26)(化合物1，1.74g，7.85mmol)懸浮于無水CH3CN(100ml)中，經注射器向其中滴加雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(1.94mL，8.84mmol)，在此階段，雜環(huán)溶解成為溶液。在攪拌下，將溶于CH3CN(50ml)中的1，2，3，5-四-O-乙?；?L-木糖呋喃糖(參見Kam，B.L.；Barascut，J.-L.；lmbach，J.-L.四-O-乙?；?D-戊醛呋喃糖的合成和分離的通用方法及其N.M.R.分光鏡研究，碳氫化合物研究，1979，69，135-142)(化合物2a，3.25g，10.2mmol)加入上述溶液中，然后立即加入TMSOTf(1.8mL，9.3mmol)。20小時后，減壓蒸除溶劑，得到黃色殘余物。將此殘余物溶于乙酸乙酯(100ml)中，依次用水，碳酸氫鈉(飽和)以及鹽水(1×75ml)洗滌。有機層用硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，得到黃色油狀物。此油狀物用柱層析(3×25cm，溶劑系統(tǒng)3)進行層析，合并合適的組分，得到2.59g(67％)化合物3a，其為黃色玻璃狀物。此玻璃狀物無需純化即可用于隨后的反應。Rf＝0.80(溶劑系統(tǒng)1)。1H NMR(DMSO-d6)δ8.19(s，1H)，8.00(s，1H)，6.28(d，1H，J＝7.9Hz)，5.97(m，1H)，5.74(m，1H)，5.17(m，1H)，4.26(m，2H)，2.19(s，3H)，2.03(s，3H)，1.96(s，3H).CHN的理論HRMS值M+，478.0101。實測值478.0098(M+)。
化合物3b1-(2，3，5-三-O-乙?；?α-D-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯苯并咪唑操作方法與化合物3a中所述方法一致，除了用化合物2b替代化合物2a。TCL(在溶劑系統(tǒng)3中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物3a中得到的一致。產量3.40g(88％)，其為黃色玻璃狀物。CHN的理論HRMS值M+，478.0101。實測值478.0085(M+)。
化合物4a1-(α-L-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯苯并咪唑將化合物3a(303mg，0.65mmol)加到100ml的圓底燒瓶中，然后將其溶于50mL乙醇和水的等摩爾(v/v)混合物中。攪拌下，向其中加入無水碳酸鈉(212mg，2.0mmol)，混合物于室溫下再攪拌3小時。加入乙酸(2ml)，減壓蒸除溶劑。將生成的固體溶于乙酸乙酯中，依次用水，碳酸氫鈉(飽和)以及鹽水(均為1×50ml)洗滌。收集有機層，硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，真空干燥下得到205mg(89％)化合物4a，其為白色泡沫狀物。Rf＝0.30(溶劑系統(tǒng)2)。MP184-185℃。1H NMR(DMSO-d6)δ7.98(s，1H)，7.92(s，1H)，5.64(d，1H，J＝9.3Hz)，5.49(d，1H，J＝3.2Hz，D2O可變的)，5.40(d，1H，J＝3.8Hz，D2O可變的)，5.27(d，1H，J＝6.5Hz，D2O可變的)，4.25(m，1H)，4.02(d，1H，J＝11.6Hz)，3.92(m，1H)，3.79(d，1H，J＝12.4Hz)，3.71(m，1H).C12H11O4N2Cl3的理論HRMS值M+，351.9784。實測值351.9782(M+)。元素分析(C12H11O4N2Cl3)C，H，N。
化合物4b1-(α-D-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯苯并咪唑操作方法與化合物4a中所述方法一致，除了用化合物3b(632mg，1.07mmol)，替代化合物3a。TCL(在溶劑系統(tǒng)1和2中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物4a中得到的一致。產率175mg(76％)，其為白色泡沫狀物。MP175-176℃。C12H11O4N2Cl3的理論HRMS值M+，351.9784。實測值351.9773(M+)。元素分析(C12H11O4N2Cl3.H2O)C，H，N。
化合物5a2-溴-5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑將化合物3a(460mg，0.96mmol)和二氯甲烷(50ml)加到一個三頸圓底燒瓶中。室溫攪拌下，使無水溴化氫慢慢通入到溶液中，維持40分鐘。然后停止通氣90分鐘，繼續(xù)進行通氣，此時有白色結晶形成。135分鐘后再次停止通氣，混合物繼續(xù)攪拌3小時。這時慢慢加入碳酸氫鈉(飽和，50ml)，鹽水(50ml)，硫酸鎂干燥。蒸除溶劑，減壓下與乙醚共蒸發(fā)，得到一黃色玻璃狀物。Rf＝0.80(溶劑系統(tǒng)1)。1H NMR(DMSO-d6)δ8.18(s，1H)，8.01(s，1H)，6.25(d，1H，J＝7.8Hz)，5.97(m，1H)，5.74(m，1H)，5.17(m，1H)，4.26(m，2H)，2.19(s，3H)，2.03(s，3H)，1.97(s，3H).攪拌下將此黃色玻璃狀物溶于乙醇、甲醇和水的混合物(1∶1∶1)(50ml)中。向其中加入碳酸鈉(380mg，3.6mmol)。100分鐘后，加入冰乙酸(0.5ml)，減壓蒸除醇類物質。再加25ml冷水，過濾混合物。生成的固體用甲醇/水進行重結晶，減壓下，于78℃進行干燥2天，得到194mg(64％)化合物5a，其為白色結晶。Rf＝0.06(溶劑系統(tǒng)5)。Rf＝0.30(溶劑系統(tǒng)1)。MP178-179℃。1H NMR(DMSO-d6)δ8.00(s，1H)，7.91(s，1H)，5.96(d，1H，J＝8.1Hz)，5.58(d，1H，J＝6.6Hz，D2O可變的)，5.29(d，1H，J＝4.3Hz，D2O可變的)，4.71(m，2H)，4.59(m，1H)，4.19(m，1H)，3.65(m，2H).C12H11O4N2Cl2Br的理論HRMS值M+，395.9279。實測值395.9273(M+)。元素分析(C12H11O4N2Cl2Br)C，H，N。
化合物5b2-溴-5，6-二氯-1-(α-D-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑操作方法與化合物5a中所述方法一致，除了用化合物3b替代化合物3a。TCL(在溶劑系統(tǒng)1中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物5a中得到的一致。產率255mg(84％，兩步)，其為白色結晶。MP177-179℃。C12H11O4N2Cl3的理論HRMS值M+，395.9279。實測值395.9261(M+)。元素分析(C12H11O4N2Cl2Br)C，H，N。
化合物6a5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)-2-(甲氨基)苯并咪唑將化合物3a(480mg，1.00mmol)和33％的甲胺/無水乙醇(25ml)加到一個250ml的壓力瓶中。密封容器，室溫下將混合物攪拌16小時。蒸除溶劑，減壓下與己烷及乙醚共蒸發(fā)。殘留的固體用甲醇和水的混合物重結晶兩次，減壓下于78℃干燥，得到259mg(72％)化合物6a，其為白色固體。Rf＝0.09(溶劑系統(tǒng)1)。MP131-132℃。1HNMR(DMSO-d6)δ7.40(s，1H)，7.36(s，1H)，6.81(m，1H，D2O可變的)，5.73(d，1H，J＝8.1Hz)，5.27(d，1H，J＝4.4Hz，D2O可變的able)，5.24(d，1H，J＝4.3Hz，D2O可變的)，4.66(t，1H，J＝5.6，D2O可變的)，4.57(m，1H)，4.44(m，1H)，4.16(m，1H)，3.63(m，2H)，2.88(d，3H，J＝4.40Hz).元素分析(C13H15O4N3Cl2)C，H，N。
化合物6b5，6-二氯-1-(α-D-來蘇呋喃糖基)-2-(甲氨基)苯并咪唑操作方法與化合物6a中所述方法一致，除了用化合物3b替代化合物3a。TCL(在溶劑系統(tǒng)1中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物6a中得到的一致。產量223mg(62％)，其為白色固體。MP126-128℃。元素分析(C13H15O4N3Cl2)C，H，N。
化合物7a5，6-二氯-2-異丙氨基-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑將1-(α-L-來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯苯并咪唑(化合物4a，300mg，0.85mmol)溶于乙醇(5ml)中，然后加入異丙胺(10ml)。密封燒瓶，混合物于70℃下攪拌兩天。減壓下蒸發(fā)混合物，進行硅膠層析(3×25cm)，用溶劑系統(tǒng)5進行洗脫。減壓下蒸發(fā)溶劑后，生成的固體在10ml苯中攪拌12小時，過濾收集。減壓下于78℃干燥固體兩天，得到202mg(63％)分析純化合物7a。MP198-201℃。1H NMR(DMSO-d6)δ7.40(s，1H)，7.32(5，1H)，6.57(bs，1H，D2O可變的)，5.79(m，1H)，5.28(m，1H，D2O可變的)，5.21(m，1H，D2O可變的)，4.67(bs，2H，D2O可變的)，4.54(m，1H)，4.42(m，1H)，4.17(m，1H)，4.03(m，1H)，3.68和3.59(m，2H)，1.21(b5，6H).元素分析(C15H19O4N3Cl2)C，H，N。
化合物7b5，6-二氯-2-異丙氨基-1-(α-D-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑操作方法與化合物7a中所述方法一致，除了用化合物4b(274mg，0.77mmol)替代化合物4a。TCL(在溶劑系統(tǒng)1中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物7a中得到的一致。產量205mg(64％)，其為白色固體。MP201-202℃。元素分析(C15H19O4N3Cl2)C，H，N。
化合物8a2-環(huán)丙氨基-5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑操作方法與化合物7a中所述方法一致，除了用環(huán)丙胺替代異丙胺，并采用化合物4a(300mg，0.80mmol)。產量299mg(65％)，其為白色固體。MP184-186℃。1HNMR(DMSO-d6)δ7.47(s，1H)，7.36(s，1H)，7.05(bs，1H，D2O可變的)，5.72(m，1H)，5.24(m，1H，D2O可變的)，5.17(m，1H，D2O可變的)，4.65(bs，2H，D2O可變的)，4.53(m，1H)，4.42(m，1H)，4.15(m，1H)，3.66和3.57(m，2H)，0.86(m，2H)，0.57(m，1H)，0.50(m，1H).元素分析(C15H17O4N3Cl2)C，H，N。
化合物8b2-環(huán)丙氨基-5，6-二氯-1-(α-D-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑操作方法與化合物7a中所述方法一致，除了用環(huán)丙胺替代異丙胺，并采用化合物4b(248mg。0.66mmol)替代化合物4a。TCL(在溶劑系統(tǒng)1中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物8a中得到的一致。產量247mg(67％)，其為白色固體。MP183-185℃。元素分析(C15H17O4N3Cl2)C，H，N。
化合物9a5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑-2-硫酮方法A將500ml配備有克萊森接管和攪拌器的圓底燒瓶排空，并用氬氣進行沖洗。將無水5，6-二氯苯并咪唑-2-硫酮(化合物10，1.53g，7.0mmol)懸浮于CH3CN(80ml)中。經注射器向其中滴加雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(1.95mL，7.9mmol)，加熱混合物直至雜環(huán)溶解(30-40C)。攪拌下，將溶于CH3CN(40ml)中的化合物2a(參見Kam，B.L.；Barascut，J.-L.；lmbach，J.-L.四-O-乙?；?D-戊醛呋喃糖的合成和分離的通用方法及其N.M.R.分光鏡研究，碳氫化合物研究，1979，69，135-142)(2.5g，7.9mmol)加入到上述溶液中，然后立即加入TMSOTf(1.5mL，7.9mmol)。24小時后，減壓蒸除溶劑，殘余物進行硅膠層析(3×25cm)，先用溶劑系統(tǒng)4洗脫，然后再用溶劑系統(tǒng)3洗脫。分別得到化合物10(40mg)以及保護的核苷(2.84g，87％，以消耗的雜環(huán)計算)。Rf＝0.45(化合物10，溶劑系統(tǒng)3)。1H NMR(DMSO-d6)δ13.33(bs，1H)，7.93(s，1H)，7.41(s，1H)，6.75(d，1H，J＝8.3Hz)，6.13(m，1H)，5.74(m，1H)，5.13(m，1H)，4.23(m，2H)，2.19(s，3H)，2.03(s，3H)，1.94(s，3H).
將保護的核苷(2.75g，5.66mmol)加到200ml的圓底燒瓶中，然后將其溶于50mL92％的乙醇/水(v/v)混合物中。攪拌下，向其中加入無水碳酸鈉(4.0g，37mmol)，混合物于室溫下再攪拌24小時。加入乙酸(2ml)，減壓蒸除乙醇。將生成的混合物用275ml冷水溶解，并用EtOAc(15×50ml)提取。減壓蒸除溶劑，生成的固體用甲醇重結晶，78℃下減壓干燥兩天，得到1.48g(74％)化合物9a，其為白色結晶。Rf＝0.27(溶劑系統(tǒng)2)。MP235-236℃。1H NMR(DMSO-d6)δ13.15(bs，1H，D2O可變的，NH)，7.62(s，1H，H7或H4)，7.40(s，1H，H4或H7)，6.46(d，1H，J＝8.2Hz，H1′)，5.31(d，1H，J＝6.7Hz，D2O可變的，2′-OH)，5.15(d，1H，J＝3.8Hz，D2O可變的，3′-OH)，4.81(m，1H，H2′)，4.67(t，1 H.J＝4.1，5′-OH)，4.67(m，1H，H4′)，4.50(m，1H，H3′)，3.61(m，2H，H5′a和H5′b).元素分析(C12H12O4N2Cl2S)C，H，N。
方法B將化合物4a(42mg，0.12mmol)，硫脲(36mg，0.48mmol)以及無水乙醇(2ml)加到10ml圓底燒瓶中。室溫下混合物加熱回流19小時，減壓蒸發(fā)溶劑，生成的殘余物用5ml水研磨。放置3小時后，濾集固體，6O℃下減壓干燥48小時，得到30mg(71％)白色產品。TCL(在溶劑系統(tǒng)2中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物9a中得到的一致(方法A)。MP234-236℃。
化合物9b5，6-二氯-1-(α-D-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑-2-硫酮操作方法與化合物9a中所述方法(方法A)一致，除了用化合物2b(參見Kam，B.L.；Barascut，J.-L.；lmbach，J.-L.四-O-乙?；?D-戊醛呋喃糖的合成和分離的通用方法及其N.M.R.分光鏡研究，碳氫化合物研究，1979，69，135-142)替代化合物2a。TCL(在溶劑系統(tǒng)2中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物9a中(方法A和B)得到的一致。第一步的產率91％(以消耗的雜環(huán)計算)，第二步的產量為20g。如9a一樣用甲醇重結晶并干燥制備分析樣品。MP234-236℃。元素分析(C12H12O4N2Cl2S)C，H，N。
化合物11a2-芐硫基-5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑將化合物9a(351mg，1.0mmol)，水(25ml)以及CH3CN(15ml)加到100ml圓底燒瓶中。向此懸浮液中滴加12滴濃氨水。加入溴芐(0.12ml，1.0mmol)，混合物于室溫下攪拌16小時，減壓蒸除過量的乙腈，水層用EtOAc(2×40ml)提取。合并有機提取物，硫酸鎂干燥，蒸發(fā)溶劑，得到410mg(93％)白色固體。接著用甲醇/水重結晶，78℃下減壓干燥兩天，得到361mg(82％)化合物11a，其為白色結晶。MP210-212℃。1H NMR(DMSO-d6)δ7.89(s，1H)，7.78(s，1H)，7.37(m，5H)，5.80(d，1H，J＝7.9Hz)，5.51(d，1H，J＝7.3Hz，D2O可變的)，5.26(d，1H，J＝4.2Hz，D2O可變的)，4.67(t，1H，J＝5.7)，4.62(m，3H)，4.50(m，1H)，4.15(m，1H)，3.60(m，2H).元素分析(C19H18O4N2Cl2S)C，H，N。
化合物11b2-芐硫基-5，6-二氯-1-(α-D-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑操作方法與化合物11a中所述方法一致，除了用化合物9b替代化合物9a。TCL(在溶劑系統(tǒng)1和2中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物11a中得到的一致。產量207mg(47％)，其為白色結晶。MP196-198℃。元素分析(C19H18O4N2Cl2S)C，H，N。
化合物12a5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)-2-(甲硫基)苯并咪唑操作方法與化合物11a中所述方法一致，除了用碘甲烷(0.06ml，1.0mmol)替代溴芐。產量305mg(84％)化合物12a，其為白色結晶。MP210-212℃。1H NMR(DMSO-d6)δ7.86(s，1H)，7.77(s，1H)，5.80(d，1H，J＝8.1Hz)，5.52(d，1H，J＝7.1Hz，D2O可變的)，5.28(d，1H，J＝3.6Hz，D2O可變的)，4.70(t，1H，J＝5.6，D2O可變的)，4.63(m，1H，H3′)，4.52(m，1H)，4.17(m，1H)，3.63(m，2H).元素分析(C13H14O4N2Cl2S)C，H，N。
化合物12b5，6-二氯-1-(α-D-來蘇呋喃糖基)-2-(甲硫基)苯并咪唑操作方法與化合物11b中所述方法一致，除了用碘甲烷(0.06ml，1.0mmol)替代溴芐。TCL(在溶劑系統(tǒng)1中有共同的斑點)以及質子光譜與化合物12a中得到的一致。產量142mg(39％)，其為白色結晶。MP204-206℃。元素分析(C13H14O4N2Cl2S)C，H，N。
化合物142，3’-O-環(huán)-5，6-5氯-1-(β-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑將三氟甲磺酸酐(三氟甲磺酸酐，0.37ml，2.2mmol)的二氯甲烷溶液(4.5ml)加到2，5，6-三氯-1-(3’，5’-二-O-苯甲?；?β-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(化合物13，820mg，1.5mmol)的二氯甲烷(7.5ml)和吡啶(0.75ml)的混合溶液中。反應混合物于0℃下攪拌，并用TLC檢測。30分鐘后，加水(1.5ml)，使混合物的溫度上升至40℃。再攪拌15小時，用二氯甲烷(10ml)和水(10ml)稀釋。有機提取物用水(5ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸發(fā)至于。殘余物進行硅膠層析純化(2.5×15cm，洗脫液甲醇(0-2％)/二氯甲烷梯度溶液)，得到一主要的化合物(Rf0.40，590mg)，其為泡沫狀。1H NMR(DMSO-d6)δ7.9-7.5(m，12H，苯基，H-4和H-7)，6.61(d，1H，H-1′，J＝5.4Hz)，6.27(t，1H，H-2′，J＝5.5Hz)，5.88(t，1H，H-3′，J＝5.5Hz)，4.9(m，1H，H-4′)，4.6-4.5(m，1H，H-5′)，4.3-4.2(m，1H，H-5″).
將此泡沫狀物溶于乙醇和水(9∶1，v/v，20ml)中，加入碳酸鈉(0.45g，4.2mmol)?；旌衔飻嚢?天，加入乙酸(1ml)，混合物蒸發(fā)至干。向殘渣中加入水(10ml)和乙酸乙酯(20ml)。有機提取物用水(2×5ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸發(fā)至干。將殘余物懸浮于沸騰的二氯甲烷(10ml)中，加入甲醇，直至殘余物完全溶解。由此溶液中結晶得到化合物14(200mg，43％)。MP255-257℃(分解)。Rf0.18。1H NMR(DMSO-d6)δ7.96和7.62(2s，2H，H-4和H-7)，6.36(d，1H，OH-2′，J＝2.9Hz)，6.18(d，1H，H-1′，J＝4.0Hz)，5.04(t，1H，H-3′，J＝2.9Hz)，5.01(t，1H，OH-5′)，J＝5.4Hz)，4.7(m，1H，H-2′)，4.4(m，1H，H-4′)，3.5-3.4(m，1H，H-5′)，3.4-3.3(m，1H，H-5″).元素分析(C12H10Cl2N2O4)C，H，N。
化合物152-異丙基氨基-5，6-二氯-1-(β-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑將化合物14(150mg，0.47mmol)溶于乙醇(3.3ml)中。加入異丙胺(2.0ml，24mmol)，密封燒瓶，混合物于70℃下攪拌1周。然后用TCL檢查反應情況。由于僅有部分發(fā)生了反應，在80℃下再攪拌1周。將混合物蒸發(fā)至干，殘余物溶于乙酸乙酯(20ml)和水(5ml)中。有機提取物用水(2×5ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸發(fā)至干。殘余物進行硅膠層析純化(2.5×15cm，洗脫液甲醇(6％)/二氯甲烷)。將含有主要斑點(Rf0.24)的組分蒸發(fā)至干。將生成的固體懸浮于沸騰的二氯甲烷(5ml)中，加入甲醇，直至殘余物完全溶解。由此溶液中結晶得到化合物15(127mg，71％)。Rf0.24。MP197-199℃。1H NMR(DMSO-d6)δ7.60和7.31(2s，2H，H-4和H-7)，7.21(d，1H，NH，J＝7.1Hz)，6.02(d，1H，H-1′，J＝6.6Hz)，5.84(bs，1H，OH-3′，J＝2.9Hz)，5.32(d，1H，OH-2′)，J＝5.9Hz)，4.85(t，1H，OH-5′，J＝4.9Hz)，4.4(m，1H，H-2′)，4.2(bs，1H，H-3′)，4.0-3.9(m，1H，CH(CH3)2)，3.7-3.7(m，3H，H-4′，H-5′和H-5″)，1.18(d，6H，CH(CH(CH3)2，J＝6.4Hz).元素分析(C15H19Cl2N3O4)C，H，N
<p>D、抗病毒活性和細胞毒性分析細胞培養(yǎng)方法KB、BSC-1以及HFF細胞的常規(guī)生長和培養(yǎng)在單層培養(yǎng)基中進行，其使用帶有Hanks鹽[MEM(H)]或Earle鹽[MEM(E)]的最低限度的必需介質(MEM)，上述兩種鹽由10％的小牛血清或10％胎兒牛血清(HFF細胞)來補充。碳酸氫鈉的濃度是可以變化的，以滿足緩沖容量的需要。按照常規(guī)的方法，采用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA/HEPES緩沖鹽溶液，使細胞在1∶2至1∶10的稀釋液中進行培養(yǎng)。(參見Shipman，C.，Jr.；Smith，S.H.；Carlson，R.H.；Drach，J.C.在Antimicrob.Agents Chemother.1976，9，120-127中所著的“阿糖呋喃基腺嘌呤和阿糖呋喃基次黃嘌呤在皰疹單一病毒感染的KB細胞中的抗病毒活性，I，在同步懸浮培養(yǎng)基中對病毒DNA合成的選擇性抑制”)。
病毒學方法按照前述方法，采用感染的HFF細胞，按照多重性感染(m.o.i.)＜0.01斑形成單位(p.f.u.)/細胞的水平，制備備用HCMV(參見Turk，S.R.；Shipman，C.，Jr.；Nassiri，M.R.；Genzingler，G.；Krawczyk，，S.H.；Towmsend，L.B.；Drach，J.C.在Antimicrob.Agents Chemother.1987，31，544-550中所著的“作為人類巨細胞病毒抑制劑的吡咯[2，3-d]嘧啶核苷”)。按照前述方法，采用感染的KB細胞(ATCC)，按照m.o.i.＜0.1的水平，制備高效價的HSV-1儲備液(參見Turk，S.R.；Shipman，C.，Jr.；Nassiri，M.R.；Genzingler，G.；Krawczyk，S.H.；Towmsend，L.B.；Drach，J.C.在Antimicrob.Agents Chemother.1987，31，544-550中所著的“作為人類巨細胞病毒抑制劑的吡咯[2，3-d]嘧啶核苷”)。按照如前所述方法，用HFF細胞單層培養(yǎng)基(用于HCMV的)和BSC-1細胞單層培養(yǎng)基(用于HSV-1的)測定病毒的效價(參見Prichard，M.N.；Turk，S.R.；Coleman，L.A.；Engelhardt，S.L.；Shipman，C.，Jr.；Drach，J.C.在J.Virol.Methods 1990，28，101-106中所著的“用于評價抗人類巨細胞病毒和皰疹單一病毒化合物的微效價病毒產量降低分析”)。簡而言之，按照前述方法，在96-池組(cluster)的培養(yǎng)皿中接種HFF或BSC-1細胞，并在37℃下培養(yǎng)過夜。次日接種HCMV或HSV-1，并將96-池培養(yǎng)皿的其余11列進行連續(xù)稀釋(1∶3)。病毒吸收后，用新鮮介質代替接種物，接種HCMV的培養(yǎng)皿培養(yǎng)7天，接種HSV-1的培養(yǎng)皿培養(yǎng)2-3天。在放大20倍的情況下，于具有5-20個斑/池稀釋程度的池中，進行斑計數(shù)。根據(jù)下列公式計算病毒的效價效價(p.f.u./ml)＝斑數(shù)目×5×3n；其中的n代表用于感染的病毒的第n次稀釋，其中池中的斑是計數(shù)的池的。
HCMV斑降低分析按照如前所述方法，用大約100p.f.u.HCMV/cm2細胞薄層感染24-池組(cluster)的培養(yǎng)皿中的HFF細胞。病毒吸收后，選擇4-8個濃度，將溶于生長介質中的化合物加到雙份的池中。培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)7-10天，將細胞薄層固定，用結晶紫染色，并用前述方法，借助顯微鏡進行斑計數(shù)。以各種藥物濃度存在下斑數(shù)量降低的百分比與沒有藥物存在下的斑數(shù)量進行比較，來計算藥物的作用。
HCMV產量分析按照如前所述方法，將HFF細胞接種于96-池組(cluster)的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，移出介質，如其它文獻中所報道的，在培養(yǎng)皿中用HCMV(m.o.i.0.5-1 p.f.u./細胞)進行接種(參見Pri chard，M.N.；Turk，S.R.；Coleman，L.A.；Engelhardt，S.L.；Shipman，C.，Jr.；Drach，J.C.在J.Virol.Methods 1990，28，101-106中所著的“用于評價抗人類巨細胞病毒和皰疹單一病毒化合物的微效價病毒產量降低分析”)。病毒吸收后，用0.2ml含有化合物的新鮮介質代替接種物。留出最前排的12個池不動，作為病毒對照。在第二排中的每個池中加入0.1ml含有受試化合物的介質，其中受試化合物的濃度是所需最終濃度的3倍。通過反復地移液操作將這12個池中的內容物進行混合，然后沿其余池按1∶3的比例連續(xù)進行稀釋。以這種方式，在一個培養(yǎng)皿上可以測定6個濃度為100mm至0.14mM的化合物(各兩份)。培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)7天，經歷一次冷凍和解凍的循環(huán)；將取自指定列8個池中的等分試樣轉移到一個新鮮的HFF細胞96-池單層培養(yǎng)皿的第一列中。將內容物進行混合，然后按照1∶3的比例在第二個培養(yǎng)皿的其余11列中連續(xù)進行稀釋。用這種方式，將原有的初級培養(yǎng)皿的每一列在另外一個培養(yǎng)皿上進行稀釋。對培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)和斑計數(shù)，并按照前述方法計算效價。
HSV-1 ELISA采用ELISA來檢查HSV-1(參見Prichard，M.N.；Shipman，C.，Jr.在抗病毒研究，1990，14，181-206中所著的“分析藥物與藥物相互作用的三維模型”)。在每池中含有200μl MEM(E)+10％小牛血清的96-池組的培養(yǎng)皿中按照10,000BSC-1/每池的數(shù)量進行接種。37℃培養(yǎng)過夜后，選擇藥物濃度(各四份)，加入濃度為100p.f.u./池的HSV-1。37℃下培養(yǎng)3天后，移去介質，阻斷培養(yǎng)，淋洗，加入與兔子抗-HSV-1抗體結合的馬蘿匐過氧化酶。在除去含有溶液的抗體之后，淋洗培養(yǎng)基，每個池中加入150μl四甲基聯(lián)苯胺作為底物。用硫酸終止反應，在450和570nm處讀取吸收。以各種藥物濃度存在下吸收降低的百分比與沒有藥物存在下得到的病毒吸收進行比較，來計算藥物的作用。
HHV-6(ELISA)在共價胺培養(yǎng)皿中(Costar，Cambridge，MA)進行酶聯(lián)免疫吸附劑分析(ELISA)。加入高雙功能(homobifunctional)交聯(lián)劑—雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸酯活化培養(yǎng)皿，然后用PBS進行洗滌。用HHV-6感染由150μl HSB2細胞懸浮液組成的樣品，在另一個培養(yǎng)皿上事先與藥物一起進行培養(yǎng)后溶于Triton X-100的包衣緩沖液中。將培養(yǎng)皿罩住，在37℃并5％CO2下培養(yǎng)1小時。這些結合條件使得抗原與交聯(lián)劑的游離末端的共價接合更為方便。共價結合后，傾析出抗原溶液，在HEPES緩沖鹽水(參見Shipman，C.，Jr.在Proc.Soc.Exp.Biol.1969，130，305-310中所著的“對作為組織培養(yǎng)緩沖劑的4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)的評價”)中，用0.05％Tween 20(HBS-T)將培養(yǎng)皿洗滌6次，每次洗滌浸泡3分鐘。阻斷培養(yǎng)皿上未結合的部位，傾析出阻斷劑，加入稀釋的初級單克隆抗體，尤其是針對HHV-6(GS)的。將培養(yǎng)皿罩住，在37℃下培養(yǎng)1小時。再次洗滌培養(yǎng)皿，再次加入阻斷劑，向每個池中加入馬蘿匐過氧化酶標記的兔子抗小鼠抗體。培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)1小時。如前所述，再次進行洗滌，在室溫下用TMB-Turbo(Pierce，Rockford，IL)培養(yǎng)30分鐘。用2M的硫酸終止反應。在450/570nm處測定每池中的吸收。
HIV-1該實驗測定在由RT活性量的HIV-1 IIIB菌株感染的CEM細胞(ATCC)上清液中HIV的存在。逆轉錄酶(RT)用作HIV-1的標記物。細胞在幾個濃度(一半log10稀釋)且以1或100μM起始的受試化合物存在下生長，感染和培養(yǎng)。操作和RT分析可以按照Kucera，L.S.，Lyer.，N.，Puckett，S.H.，Buckheit，R.W.，Jr.，Weatbrook，L.，Toyer，B.R.，White，E.L.，Germany-Decker，J.M.，Shannon，W.M.，Chen，R.C.S.，Nassiri，M.R.S.，Shipmen，C.Jr.，Townsend，L.B.，Drach，J.C.在AIDSRes.Human Retroviruses 1993，9，307-314中所著的“Triciribine和Triciribine-5’-單磷酸酯抵抗1型和2型人類免疫缺損病毒的活性”；以及White，E.L.，Buckheit，R.W.，Jr.，Ross，L.J.，Germany，J，M.，Andries，K.，Pauwels，R.，Janssen，P.A.J.，Shannon，W.M.，Chirigosm，M.A.，在抗病毒研究1991，16，257-266中所著的“TIBO衍生物，R82913是帶有雜多聚體模板的HIV-1反轉轉錄酶的強抑制劑”中所述的方法來進行。
細胞毒性分析采用兩種不同的分析進行常規(guī)的細胞毒性實驗。(i)通過細胞(未被斑分析中的病毒感染的)顯微鏡檢查可以測定靜態(tài)HFF細胞所產生的細胞毒性(參見Turk，S.R.；Shipman，C.，Jr.；Nassiri，M.R.；Genzingler，G.；Krawczyk，，S.H.；Towmsend，L.B.；Drach，J.C.在Antimicrob.Agents Chemother.1987，31，544-550中所著的“作為人類巨細胞病毒抑制劑的吡咯[2，3-d]嘧啶核苷”)。(ii)按照前述的方法，通過用結晶紫染色和分光光度測定法對洗脫自染色細胞的染料進行定量測定，可以測定得到在KB細胞兩次細胞數(shù)量翻倍之間化合物的作用(參見Prichard，M.N.；Prichard，L.E.；Baguley，W A；Nassiri，M.R.；Shipman，C.，Jr.在抗病毒研究，1991，35，1060-1065中所著的“Ganciclovir和Zidovudine的協(xié)同細胞毒性的三維分析”)。簡而言之，在96-池組(cluster)的培養(yǎng)皿中接種KB細胞，每池中含有3000-5000個細胞。37℃培養(yǎng)過夜后，在6-8個濃度下，加入受試化合物，共4份。培養(yǎng)皿在37℃下的CO2培養(yǎng)器中培養(yǎng)48小時，淋洗，用95％的乙醇固定，用0.1％的結晶紫染色。加入酸化的乙醇，在分光光度計(為96-池ELISA分析培養(yǎng)皿設計)中570nm下讀取培養(yǎng)皿的讀數(shù)。
數(shù)據(jù)分析通過對得自前一部分的百分抑制參數(shù)相對于藥物濃度的對數(shù)進行線性回歸建立劑量-反應關系。從回歸直線上計算出50％抑制濃度(IC50’s)或IC90’s。在所有的實驗中，均采用含有陽性對照的樣品(用于HSV-1的阿昔洛維、用于HCMV的更昔洛韋、以及用于細胞毒性的2-乙?；拎ち虼肟ò碗?。記錄眾多合成化合物用于HCMV(斑和產量)和HSV-1(ELISA)的抗病毒活性數(shù)據(jù)及其細胞毒性數(shù)據(jù)(可見和生長)。數(shù)據(jù)歸納于表2。并記錄眾多合成化合物用于另一個HCMV株(AD169)的抗病毒活性數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)歸納于表3。
a斑和產量降低分析按照文中所述方法采用雙份平行樣品進行。表2中給出了Towne染色的數(shù)據(jù)。斑分析的結果用IC50來表示，產量降低實驗的結果用IC90來表示。
b斑分析實驗用來測定DHPG抗HSV-1的活性；用ELISA分析測試所有其它化合物(每個樣品在四個池中實驗)。
c在進行HCMV斑計數(shù)時，用HFF細胞進行可見細胞毒性的評分。
給出的是雙份平行樣品實驗的結果。按照文中所述的方法，測定KB細胞生長的抑制情況(做四份平行樣品)。結果用IC50來表示。
d來自2-4個實驗的平均值。
e＞100表示IC50或IC90值大于標注的(最高的)受試濃度。
f來自15個實驗的平均值±標準差。
g分別為來自108，33和3個實驗的平均值±標準差。
a斑和產量降低分析按照文中所述方法采用雙份進行。表2中還給出了Towne株的數(shù)據(jù)。斑分析的結果用IC50來表示，產量降低實驗的結果用IC90來表示。
b來自2-3個實驗的平均值。
化合物抗肝炎B病毒(HBV)的活性可以按照Jansen，R.等人在抗微生物制劑和化療，Vol.37，No.3，pp.441-447，1993中所述的方法進行。在兩個獨立的實驗中，2-溴-5，6-二氯-1-(α-L-來蘇呋喃糖基)苯并咪唑(化合物5a)的IC50值為8.8μM和16μM。
盡管已對本發(fā)明作了詳細的描述并例舉了一些具體的實施方案，但是對于本領域內的專家來說，很明顯，在不違背本發(fā)明精神和范圍的前提下，可以進行各種變化和修飾。
權利要求
1.D-和L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物，它們選自具有下列通式的化合物組
其中R2，R4，R5，R6和R7各自獨立，可以相同或不同，它們獨立的選自-H，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-N(R8)2，-OR8，-SR12，以及-CF3，其中R8獨立地為-H或具有1-6個碳原子的烷基，且R12獨立地為-H或具有1-10個碳原子的烴基基團；并且，R9，R10和R11各自獨立，可以相同或不同，為H或保護的羥基基團。
2.權利要求1中所述的D-或L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其中R2選自-H，-F，-Cl，-Br，-I和-N(R8)2；R4和R7均為-H；R5和R6獨立地選自-H，-F，-Cl，-Br和-I。
3.權利要求1或2中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其中所述的化合物為α-D-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。
4.權利要求1或2中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其中所述的化合物為β-D-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。
5.權利要求1或2中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其中所述的化合物為α-L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。
6.權利要求1或2中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其中所述的化合物為β-L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物。
7.權利要求1或2中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-溴-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-甲基氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-異丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-環(huán)丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-硫代-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-芐硫基-5，6-二氯-苯并咪唑；1-(來蘇呋喃糖基-)-2-甲硫基-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
8.權利要求1中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基)-2，5，6-三氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
9.權利要求1中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基-)-2-溴-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
10.權利要求1中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基-)-2-甲基氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
11.權利要求1中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基-)-2-異丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
12.權利要求1中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基-)-2-環(huán)丙氨基-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
13.權利要求1中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基-)-2-硫代-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
14.權利要求1中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基-)-2-芐硫基-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
15.權利要求1中所述的來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物，其選自下列化合物1-(來蘇呋喃糖基-)-2-甲硫基-5，6-二氯-苯并咪唑；它們的異頭、光學和構型異構體；以及它們制藥學上可以接受的鹽類和前藥衍生物。
16.包含生物上可接受載體以及權利要求1-15中所述的任意一個D-或L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物的組合物。
17.在被病毒感染的細胞中預防或抑制病毒繁殖和/或復制的方法，其包括使細胞與有效劑量的權利要求1-15中所述的任意一個D-或L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物進行接觸，預防或抑制病毒在細胞中繁殖和/或復制。
18.預防細胞中病毒感染的方法，其包括使細胞與預防有效劑量的權利要求1-15中所述的任意一個D-或L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物進行接觸。
19.治療病毒感染的方法，其包括給予被感染的宿主治療有效劑量的權利要求1-15中所述的任意一個D-或L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物。
20.預防宿主病毒感染的方法，其包括給予宿主預防有效劑量的權利要求1-15中所述的任意一個D-或L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物進行接觸。
21.權利要求17-20任意一項中所述的方法，其中的病毒感染是指HCMV，HSV以及肝炎病毒感染。
22.權利要求17-20任意一項中所述的方法，其中的病毒感染是指肝炎病毒感染。
23.制備權利要求1中D-或L-來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物的方法，所述的方法包括以下步驟(a)使式(II)化合物與式(III)化合物進行反應，
其中R2選自-Cl，-Br和＝S，且R9，R10或R11各自獨立，可以相同或不同，并且為-H或羥基保護基團；且，(b)隨后進行一或多個下列步驟(i)從產品(a)上去除一或多個羥基保護基團，如果存在；(ii)使產品(a)與HX進行反應，其中X選自-Cl，-Br，-F和-I；(iii)使產品(a)與R8NH2進行反應，其中的為-H或具有1-6個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基基團；(iv)使產品(a)與H2NCSNH2進行反應；(v)使產品(a)與C6H5CH2X進行反應，其中X選自-Cl，-Br，-F和-I；(vi)使產品(b)(iv)與C6H5CH2X進行反應，其中X選自-Cl，-Br，-F和-I；(vii)使產品(a)與CH3I進行反應；并且(viii)使產品(b)(iv)與CH3I進行反應。
全文摘要
本發(fā)明涉及D－和L－來蘇呋喃糖基苯并咪唑類化合物。在一個實施方案中,本發(fā)明涉及D－和L－來蘇呋喃糖基苯并咪唑化合物,它們選自具有下列通式的化合物組:(β－D),(β－L),(α－L)以及(α－D),其中R
文檔編號A61P31/12GK1272113SQ98808517
公開日2000年11月1日 申請日期1998年7月29日 優(yōu)先權日1997年7月30日
發(fā)明者L·B·托恩森德, J·C·德拉克, K·K·比羅恩, F·L·小伯伊德 申請人:密歇根大學董事會, 格拉克索集團有限公司