專利名稱：April－具有生長(zhǎng)效應(yīng)的新的蛋白質(zhì)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及是腫瘤壞死因子家族的成員的新的配體和多肽。新的配體命名為“增殖誘導(dǎo)配體”即April。這些蛋白或它們的受體可具有抗癌和/或免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用。而且，用這些新配體的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可用于基因治療來(lái)治療腫瘤、自身免疫和炎癥疾病或遺傳病并且阻斷這些蛋白的抗體可具有免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用。發(fā)明背景腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的細(xì)胞因子是宿主防御和免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì)。此家族的成員以錨立在膜上的形式存在，通過(guò)細(xì)胞間接觸局部發(fā)揮作用或者作為能擴(kuò)散到更遠(yuǎn)的目標(biāo)的分泌蛋白存在。受體的平行家族標(biāo)志著導(dǎo)致靶組織中細(xì)胞死亡或細(xì)胞的增殖和分化的這些分子的存在。目前，配體和受體的TNF家族至少有13個(gè)可識(shí)別的受體-配體對(duì)，包括TNFTNF-R；LT-αTNF-R；LT-α/βLT-β-R；FasLFas；CD40LCD40；CD30LCD30；CD27LCD27；OX40LOX40和4-1BBL4-1BB；trance/rankLLight and Tweak。即使在最相關(guān)的實(shí)例中，盡管氨基酸的相關(guān)性約是50％，編碼這些配體的DNA序列僅有約25-30％的相同。
此細(xì)胞因子受體家族的明確的特征是通過(guò)兩個(gè)不同的TNF受體的分子克隆首次揭示出的在富含半胱氨酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的i。此基因家族編碼帶有細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、單個(gè)跨膜區(qū)和參與激活細(xì)胞的功能的胞質(zhì)區(qū)的糖蛋白特征的I型跨膜蛋白。富含半胱氨酸的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域展示出依賴特殊的家族成員多次重復(fù)的緊密結(jié)合的二硫鍵連接的核心結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)受體有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，盡管可以少到3個(gè)或者多到6個(gè)。
配體TNF家族中的蛋白的特征是通常含有幾個(gè)認(rèn)為是作為終止轉(zhuǎn)移序列的賴氨酸或精氨酸殘基的一般較短的親水氨基酸的短的N-端序列。下面跟著一個(gè)跨膜區(qū)和不同長(zhǎng)度的將C-端受體接合結(jié)構(gòu)域從膜分開(kāi)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。此結(jié)構(gòu)域有時(shí)被稱為“柄”(特征性高級(jí)結(jié)構(gòu))。C-端結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含蛋白的主體并且經(jīng)常但不總是含有糖基化位點(diǎn)。這些基因缺少經(jīng)典的信號(hào)序列，其特征在于位于細(xì)胞外的帶有C端結(jié)構(gòu)域的I型膜蛋白、II型膜蛋白以及位于胞質(zhì)內(nèi)的短的N-末端。在某些情況下，如TNF和LT-α，在特征性高級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)的裂解在蛋白加工過(guò)程中可提早發(fā)生并且隨后發(fā)現(xiàn)配體主要是分泌形式。然而，大部分配體以膜的形式存在，介異定位信號(hào)。
這些配體的結(jié)構(gòu)已經(jīng)由TNF、LT-α和CD40L的晶體學(xué)分析而充分確定。TNF和淋巴毒素-α(LT-α)都是在帶有“jelly roll”或“Greek key拓樸結(jié)構(gòu)”的兩個(gè)反平行β-折疊的三明治結(jié)構(gòu)中。Cα和β殘基之間的均方根偏差是0.61C，這提示它們?cè)诜肿油負(fù)鋱D上的高度相似性。由CD40L、TNF和LT-α的分子研究呈現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是傾向于聚合成寡聚復(fù)合物。寡聚結(jié)構(gòu)的本質(zhì)是在相鄰亞基的匯合處形成受體結(jié)合位點(diǎn)以產(chǎn)生多價(jià)配體。通過(guò)TNF、CD40L和LT-α的晶體結(jié)構(gòu)分析表明它們的四級(jí)結(jié)構(gòu)是以三聚體的形式存在。在不同的配體之間保守的許多氨基酸位于支架結(jié)構(gòu)β-折疊的序列中。由于這些支架結(jié)構(gòu)的部分在多種家族成員中是保守的，因此在所有這些分子中保留這種基本的三文治結(jié)構(gòu)是可能的。由于亞基構(gòu)象可能保持相似，四級(jí)結(jié)構(gòu)也可維持。
TNF家族成員最好可描述成控制細(xì)胞存活和分化的免疫系統(tǒng)中的總開(kāi)關(guān)。與TNF家族的其它主要的錨定在膜上的成員相反，目前只有TNF和LTα被認(rèn)為是分泌型細(xì)胞因子。盡管TNF的膜形式已被鑒定出并且可能具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，分泌型TNF作為一般警報(bào)信號(hào)從觸發(fā)事件的部位向更遠(yuǎn)的細(xì)胞發(fā)揮作用。因此，TNF分泌可擴(kuò)大事件導(dǎo)致脈管系統(tǒng)內(nèi)壁已充分描述的改變以及細(xì)胞的炎癥狀態(tài)。相反的是，該家族的膜結(jié)合成員通過(guò)TNF型受體僅僅向直接接觸的細(xì)胞發(fā)送信號(hào)。例如T細(xì)胞只向那些通過(guò)同源的TCR相互作用導(dǎo)致直接接觸的B細(xì)胞提供CD40介導(dǎo)的“幫助”。能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的相似的細(xì)胞與細(xì)胞接觸的限制可應(yīng)用于充分研究的Fas系統(tǒng)。
看來(lái)可根據(jù)TNF誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力(表III)，可將TNF配體分為三組。首先，TNF、Fas配體和TRAIL可有效地誘導(dǎo)許多細(xì)胞系的細(xì)胞死亡而且它們的受體大部分可能具有好的典型的死亡結(jié)構(gòu)域。DR-3(TRAMP/WSL-1)的配體也可能屬于此類型。其次是那些僅在少數(shù)細(xì)胞類型中觸發(fā)更弱的死亡信號(hào)的配體并且TWEAK、CD30配體和LTα1β2是這一類型的實(shí)例。這組配體如何在缺乏典型的死亡結(jié)構(gòu)域的情況下觸發(fā)細(xì)胞死亡是個(gè)令人感興趣的問(wèn)題并且這提示有獨(dú)立的更弱的死亡信號(hào)機(jī)制存在。最后是那些不能有效地傳遞死亡信號(hào)的成員?？赡芩薪M配體都對(duì)某些細(xì)胞類型具有抗增殖效應(yīng)并隨后誘導(dǎo)細(xì)胞分化如CD40(Funakoshi等，1994)。
近年來(lái)TNF家族迅速擴(kuò)充，包括參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的至少11種不同的信號(hào)通路。TWEAK和TRAIL的廣泛的表達(dá)模式提示此家族中仍有更多的功能變化應(yīng)揭示。最近這一點(diǎn)在影響勞斯肉瘤病毒和單純皰疹病毒的復(fù)制能力的兩個(gè)受體的發(fā)現(xiàn)中以及TNF具有抗病毒能力和痘病毒編碼引誘物TNF受體的以往的觀察中已特別地強(qiáng)調(diào)(Brojatsh等，1996；Montgomery等，1996；Smith，1994；Vassalli，1992)。TNF是敗血癥休克和惡病質(zhì)的介質(zhì)iii，并且參與造血細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)iv。作為炎癥和抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)感染的介質(zhì)v，TNF發(fā)揮主要作用并且具有抗腫瘤活性vi。TNF還與多種自身免疫疾病有關(guān)vii。TNF可由幾種細(xì)胞產(chǎn)生，包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞viii。TNF與兩種不同的受體結(jié)合，每種都通過(guò)特異的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子起作用，因此形成TNF的不同效應(yīng)ix。TNF可以膜結(jié)合形式存在，也可作為可溶的分泌型細(xì)胞因子存在x。
LT-α具有多種與TNF相同的活性，即與TNF受體結(jié)合x(chóng)i，但是不象TNF，LT-α表現(xiàn)為主要由激活的T細(xì)胞和一些β-類淋巴細(xì)胞腫瘤分泌xii。LT-α和LT-β的異數(shù)復(fù)合物是與LT-β受體結(jié)合的膜結(jié)合復(fù)合物xiii。由于LT-β的遺傳破壞導(dǎo)致脾臟中T和B細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞及淋巴結(jié)的缺失，LT系統(tǒng)(LTs和LT-R)表現(xiàn)為參與周圍淋巴器官的發(fā)育xiv。LT-β系統(tǒng)也參與某些腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞死亡xv。
TNF家族的另一個(gè)成員Fas-L主要在活化的T細(xì)胞上表達(dá)xvi。它通過(guò)所知的程序性細(xì)胞死亡或凋亡的機(jī)制誘導(dǎo)具有其受體的細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞和HIV-感染的細(xì)胞死亡xvii。而且，F(xiàn)as或Fas-L缺陷可引起淋巴增殖紊亂，這證實(shí)了Fas系統(tǒng)在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的作用xviii。Fas系統(tǒng)還參與慢性肝炎感染引起的肝臟損傷xix和HIV感染的病人的自身免疫xx。Fas系統(tǒng)還參與HIV病人的T細(xì)胞破壞xxi。此家族中的另一成員TRAIL也參與不同來(lái)源的多種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的死亡。
TNF家族的另一成員CD40-L在T細(xì)胞上表達(dá)并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)具有CD40的B細(xì)胞xxiii。而且，CD40-L基因的改變引起已知的疾病X-連鎖的高IgM綜合癥xxiv。CD40系統(tǒng)也參與多種自身免疫性疾病xxv并且已知CD40-L具有抗病毒性質(zhì)xxvi。盡管CD40系統(tǒng)參與拯救凋亡的B細(xì)胞xxvii，在非免疫細(xì)胞中它誘導(dǎo)凋亡xxviii。許多其它的TNF家族的淋巴細(xì)胞成員也參與共同刺激xxix。
一般地，TNF家族的成員在控制免疫系統(tǒng)和活化急性宿主防御系統(tǒng)中具有重要調(diào)節(jié)作用?？紤]到目前在操作TNF家族的成員用于治療中獲得了進(jìn)展，此家族的成員可提供控制疾病的獨(dú)特的方法是可能的。該家族的某些配體可直接誘導(dǎo)許多轉(zhuǎn)化的細(xì)胞如LT、TNF、Fas配體和TRAIL(Nagata，1997)的凋亡。Fas和可能的TNF及CD30受體的激活能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能誘導(dǎo)非轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞死亡(Amakawa等，1996；Nagata，1997；Sytwu等，1996；Zheng等1995)。一般而言，死亡是在位于TNF受體胞質(zhì)一側(cè)的死亡結(jié)構(gòu)域聚集之后觸發(fā)的。死亡結(jié)構(gòu)域組織引起Caspase級(jí)聯(lián)激活的多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分集合起來(lái)(Nagata，1997)。一些受體缺少典型的死亡結(jié)構(gòu)域，如LTb受體和CD30(Browning等，1996；Lee等，1996)盡管作用更微弱，但還能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。盡管如在CD30裸鼠上的研究表明胸腺負(fù)選擇中起死亡作用一樣這種情況不清楚，這些受體的主要功能是誘導(dǎo)細(xì)胞分化而且在某些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中死亡是反常的后果是可能的(Amakawa等，1996)。相反地，需要通過(guò)其它通路如CD40的信號(hào)來(lái)維持細(xì)胞存活。因此，需要識(shí)別和鑒定TNF家族成員的其它分子從而提供控制疾病和調(diào)控免疫系統(tǒng)的其它方法。
已表明TNF家族的某些成員可提供治療的抗腫瘤利益，例如與IL-2結(jié)合。(見(jiàn)，例如U.S5,425,940)然而，尚不知道用于癌癥的完全滿意的療法。組合化療普遍應(yīng)用于臨床和研究中，如應(yīng)用抗代謝物、烷化劑、抗生素、一般毒物等。單獨(dú)或聯(lián)合施用這些藥物以獲得對(duì)癌癥的細(xì)胞毒效應(yīng)、和/或減少或消除抗藥細(xì)胞的出現(xiàn)，以及降低副作用。發(fā)明概述因此，本發(fā)明涉及顯著地避免了相關(guān)領(lǐng)域的局限和缺點(diǎn)引起的一個(gè)或多個(gè)問(wèn)題的、被稱為APRIL的新的多肽。發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞因子TNF家族的新成員并且明確了這種蛋白的人和鼠的氨基酸序列以及編碼這些蛋白的DNA序列。申請(qǐng)的發(fā)明可用來(lái)確立用于如下面更為詳細(xì)討論的許多疾病和病癥的新的疹斷和治療以及獲得關(guān)于免疫系統(tǒng)及其過(guò)程的信息并操縱之。另外，本發(fā)明還參與癌中細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將在后面的描述中論及，其中部分從描述中可以看出是明顯的或者可通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐而了解到。通過(guò)所寫(xiě)的描述及其權(quán)利要求以及附圖中特別指出的組合物和方法可認(rèn)識(shí)和獲得本發(fā)明的目標(biāo)和其它優(yōu)點(diǎn)。
因此，為獲取這些或其它優(yōu)點(diǎn)并與本發(fā)明的目的一致，如此處收錄并廣泛描述的，本發(fā)明包括編碼APRIL的DNA序列。具體地，本發(fā)明涉及編碼人APRIL的DNA序列(SEQ.ID.NO.1)。另外，申請(qǐng)專利的發(fā)明涉及這種新的配體的氨基酸序列。人的APRIL氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.2中所示。另外，發(fā)明者在此處顯示了鼠APRIL的DNA和氨基酸序列，分別見(jiàn)SEQ.ID.NOS.3和4中所示。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及當(dāng)與申請(qǐng)專利保護(hù)的DNA序列或其片段雜交時(shí)，與編碼此配體的C端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列具有至少50％同源性的序列和編碼帶有SEQ.ID.NO.1中確定的序列的APRIL或具有相似的生物學(xué)活性的蛋白的序列。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案進(jìn)一步涉及編碼其序列與表達(dá)控制序列可操作連接的APRIL的DNA序列。任何合適的表達(dá)控制序列可用于申請(qǐng)專利的本發(fā)明并且易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇。
本發(fā)明還包括含有編碼APRIL或其片段的序列的重組DNAs以及將穩(wěn)定整合的APRIL序列導(dǎo)入其基因組或具有游離基因元件的宿主。任何合適的宿主可用于本發(fā)明并且易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇而無(wú)需過(guò)多試驗(yàn)。
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括有培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主的步驟的產(chǎn)生基本上純APRIL的方法。又一些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及基本上不含正常有關(guān)的動(dòng)物蛋白的APRIL。
本發(fā)明包括具有SEQ.ID.NO.2中確定的氨基酸序列的APRIL配體和其片段或同系物。在不同的實(shí)施方案中，氨基酸和/或DNA序列可含有如下面進(jìn)一步明確的保守插入、缺失和替換或者含有所述序列的片段。
其它實(shí)施方案中本發(fā)明涉及含有APRIL、可用于直接觸發(fā)APRIL介導(dǎo)的藥理學(xué)事件的可溶的構(gòu)建體。這些事件在刺激生長(zhǎng)、治療癌癥、腫瘤或者用于治療免疫性疾病的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中具有有用的治療學(xué)優(yōu)點(diǎn)。申請(qǐng)專利的配體的可溶形式可再進(jìn)行遺傳工程操作與容易識(shí)別的標(biāo)記結(jié)合，從而有利于鑒定這些配體的受體。
另外，某些實(shí)施方案涉及抗APRIL的抗體以及它們治療癌癥、腫瘤或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以治療免疫性疾病的用途。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及如此處公開(kāi)并申請(qǐng)專利保護(hù)的應(yīng)用APRIL基因的基因治療方法。
本發(fā)明的藥物制劑可選擇地包括藥學(xué)上可接受的載體、佐劑、填充劑或其它藥物組合物而且可以本領(lǐng)域中已知的多種形式或途徑中的任一種給藥。
可理解的是前面的一般描述和后面的詳細(xì)描述都是示范性和說(shuō)明性質(zhì)的并且如申請(qǐng)專利保護(hù)的，打算提供本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明。
為更進(jìn)一步理解本發(fā)明，詳細(xì)說(shuō)明中包括并引用了附圖并且成為其中一部分用來(lái)圖解說(shuō)明本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案，并且與描述一起用來(lái)解釋本發(fā)明的原理。附圖簡(jiǎn)述圖的說(shuō)明

圖1.(A)預(yù)測(cè)的人APRIL氨基酸序列。表示了預(yù)測(cè)的重組的可溶性APRIL(sAPRIL)的跨膜區(qū)(TM，框起來(lái)的)，潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)(星號(hào))和N末端。(B)APRIL的細(xì)胞外蛋白序列和TNF配體家族的某些成員的比較。黑框和陰影框內(nèi)分別表示了相同的和同源的殘基。TNFα，腫瘤壞死因子α，LTα，淋巴毒素α，F(xiàn)asL，F(xiàn)as(CD95)配體，TRANCE，RNAK配體。圖2.APRIL的表達(dá)(A)用APRIL cDNA作為探針的不同的人組織的Northern印跡雜交(每泳道2μg polyA+RNA)。(B)不同腫瘤細(xì)胞系中的APRIL mRNA表達(dá)早幼粒細(xì)胞白血病HL60；Hela細(xì)胞S3；慢性骨髓性白血病K562；成淋巴細(xì)胞白血病Molt-4；伯基特淋巴瘤Raji；結(jié)腸直腸腺癌A459；黑色素瘤G361。(C)四種不同的人腫瘤(T)和正常組織(N)中的APRIL mRNA表達(dá)。18S rRNA帶表示加樣相等。(D)原發(fā)性結(jié)腸癌中的APRIL mRNA表達(dá)。原位雜交顯示與正常結(jié)腸組織相比，人結(jié)腸癌中APRIL信息豐富。結(jié)腸腫瘤組織切片和相鄰的正常結(jié)腸組織與反義APRIL35S-標(biāo)記的cRNA雜交，而且結(jié)腸腫瘤組織還與正義APRIL35S cRNA雜交作為對(duì)照(負(fù)對(duì)照)。上面的圖是暗視野的顯微照片，下面的圖是相對(duì)的亮視野的顯微照片。圖3.APRIL刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。(A)如加入可溶的APRIL24小時(shí)后測(cè)定的Jurkat(人白血病T細(xì)胞)增殖的劑量依賴增長(zhǎng)。對(duì)照組是Fas配體(FasL)、TWEAK及無(wú)配體(空白對(duì)照)(左圖，細(xì)胞生存力；右圖，3H-胸腺嘧啶核苷摻入)。(B)FLAG-標(biāo)記的APRIL對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的免疫耗竭的影響。FLAG-標(biāo)記的APRIL的增殖效應(yīng)被抗-FLAG的抗體中和，但不被抗-myc的抗體中和。(C)APRIL對(duì)Raji(人伯基特淋巴瘤B細(xì)胞)，A20細(xì)胞(小鼠B淋巴瘤)，BJAB(人B淋巴瘤)，COS(犬上皮細(xì)胞)，MCF-7(人乳腺腺癌)，HeLa(人上皮樣癌)和ME260(人黑色素瘤)增殖速度的影響。(D)胎牛血清濃度對(duì)APRIL誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞增殖的影響。圖4.APRIL加速腫瘤生長(zhǎng)。(A)APRIL轉(zhuǎn)染的NIH-3T3克隆的鑒定。應(yīng)用抗-FLAG抗體通過(guò)Western印跡雜交分析不同克隆的FLAG-APRIL水平。非特異檢測(cè)高分子量蛋白，箭頭所指的是APRIL蛋白。(B)表達(dá)APRIL的NIH-3T3克隆比模擬轉(zhuǎn)染的克隆生長(zhǎng)快。(C)表達(dá)APRIL的NIH-3T3克隆的腫瘤生長(zhǎng)增加。給裸鼠皮下注射NIH-3T3細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞)和APRIL(NIH-AP，2個(gè)不同的克隆)轉(zhuǎn)染子(1×106個(gè)細(xì)胞)并監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。圖5.排列人和小鼠APRIL氨基酸序列表明兩種蛋白之間廣泛的一致性。相同的殘基用上面的點(diǎn)標(biāo)記。下劃線的殘基代表潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。開(kāi)始的蛋氨酸被認(rèn)為是可能的起始位點(diǎn)，然而，更上游的閱讀框內(nèi)蛋氨酸可能是實(shí)際起始位點(diǎn)，例如在人的序列中。詳細(xì)描述現(xiàn)在詳細(xì)介紹本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。本發(fā)明涉及編碼人或小鼠APRIL的DNA序列、片段及其同系物以及用它們轉(zhuǎn)化的宿主中那些DNA序列的表達(dá)。本發(fā)明涉及這些DNA序列和他們編碼的多肽的應(yīng)用。另外，本發(fā)明包括APRIL或其片段人和小鼠的氨基酸序列以及含有它們或從它們衍生的藥物組合物。本發(fā)明涉及用APRIL刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，或者，選擇性地，應(yīng)用直接抗APRIL抗體或APRIL受體抑制腫瘤發(fā)生的方法。A.定義此處所用的“同源的”指的是相比較的分子序列之間的序列相似性。當(dāng)相比較的兩個(gè)序列中的某一位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞基占據(jù)時(shí)，如兩個(gè)DNA分子中的某一位置都被腺嘌呤占據(jù)，那么在那一位置分子是同源的。兩序列之間同源性的百分比的函數(shù)是兩序列共有的匹配或同源位置數(shù)目除以相比較的位置數(shù)目再乘以100。例如，如果兩序列中6/10的位置是匹配的或同源的，那么兩序列是60％同源。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC是50％同源。一般地，在兩序列進(jìn)行序列排列對(duì)比給出最大同源性時(shí)進(jìn)行比較。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥”指任何腫瘤疾病，包括如細(xì)胞疾病，例如腎細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、慢性白血病、乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、直腸癌、咽喉癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、肥大細(xì)胞瘤、肺癌、乳房腺癌、咽鱗狀細(xì)胞癌和胃腸或胃癌。優(yōu)選地，癌癥為白血病、肥大細(xì)胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、乳房腺癌和咽鱗狀細(xì)胞癌。
如此處所用的多肽的“純化制劑”或“基本上純化的制劑”指的是從它自然產(chǎn)生時(shí)帶有的其它蛋白質(zhì)、脂類和核酸分離出的多肽。優(yōu)選地，多肽也可從用于純化它的其它物質(zhì)如抗體、基質(zhì)等分離。
此處所用的“轉(zhuǎn)化的宿主”指的是包括帶有導(dǎo)入其基因組的穩(wěn)定整合的序列即編碼APRIL序列的任意宿主。
如此處所用的“治療”包括任意治療學(xué)上的治療，如施用治療劑或物質(zhì)，如藥物。
“基本上純的核酸”，如基本上純的DNA是滿足下面一點(diǎn)或兩點(diǎn)的核酸(1)不與一個(gè)或兩個(gè)序列如在核酸來(lái)源的有機(jī)體的自然出現(xiàn)的基因組中直接鄰接的編碼序列直接鄰接的(即一個(gè)在5’端一個(gè)在3’端)；或者(2)基本上沒(méi)有在核酸來(lái)源的有機(jī)體中出現(xiàn)的核酸序列。此術(shù)語(yǔ)包括，例如整合入載體如自我復(fù)制質(zhì)?；虿《净蛘咴思?xì)胞或真核細(xì)胞的基因組DNA的或者以不依賴于其它DNA序列的獨(dú)立的分子(如PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。基本上純的DNA還包括是編碼APRIL的雜合基因的部分的重組DNA。
在此，術(shù)語(yǔ)“肽”、“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用。
此處所用的“生物學(xué)活性”指可直接或直接表現(xiàn)出的體內(nèi)或體外活性。APRIL的生物學(xué)活性片段可具有，例如與APRIL活性位點(diǎn)70％的氨基酸同源性，更優(yōu)選地至少80％以及最優(yōu)選地至少90％的同源性。與APRIL的一致性或同源性在此定義為候選序列中與SEQ.ID.NOS.2或4中的APRIL殘基一致的氨基酸殘基的百分比。
此處所用的“配體”一般指APRIL。除非另有指出，本發(fā)明的實(shí)踐采用本領(lǐng)域技術(shù)中細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)。這些技術(shù)的描述見(jiàn)文獻(xiàn)。引言在此詳細(xì)描述了TNF家族的新成員APRIL。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，盡管正常組織中APRIL的轉(zhuǎn)錄物是低量的，但在幾種腫瘤細(xì)胞系中以及結(jié)腸癌、轉(zhuǎn)移性淋巴瘤和甲狀腺腫瘤中檢測(cè)到高水平的mRNA。在體外，加入重組APRIL刺激了不同細(xì)胞系的增殖。而且，相比于模擬轉(zhuǎn)染子，將APRIL轉(zhuǎn)染入NIH-3T3細(xì)胞顯著加速了裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)。APRIL在體外和體內(nèi)的表達(dá)和對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激效應(yīng)表明APRIL與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。
由于APRIL在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)并且刺激許多不同腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，因此看來(lái)它在TNF家族成員中是獨(dú)特的?？紤]到APRIL的明顯作用是腫瘤發(fā)生，APRIL的拮抗性抗體或APRIL受體將提供癌癥治療的新方法。
B.本發(fā)明的DNA序列如此處所描述的，本發(fā)明的一方面特征是包括編碼APRIL的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1中描述的DNA和/或這些核酸的等價(jià)物的基本上純的(重組的)核酸。此處所用的術(shù)語(yǔ)核酸可包括片段和等價(jià)物，例如編碼功能上等價(jià)的肽的序列。等價(jià)核苷酸序列可包括由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、添加或缺失如等位基因變異體、突變等而不同的序列以及由于遺傳密碼簡(jiǎn)并而與SEQ.ID.NO1中所示的編碼APRIL的核苷酸不同的序列。
盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解到小鼠的或來(lái)自其它物種的編碼的APRIL與人的具有高度同源性的序列也包含在這里，但對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的一般性描述參考的是人的序列。人的蛋白表現(xiàn)出具有TNF家族的所有特征，即，II型膜蛋白的有機(jī)構(gòu)成和將蛋白折疊成TNF反平行β-折疊結(jié)構(gòu)的序列基序的保守性。
本發(fā)明的序列可用于制備一系列DNA探針，用于篩選多種天然和合成的DNA集合中那些與APRIL或其片段或其衍生物密切相關(guān)的DNA序列的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到此處所介紹的APRIL也指的是其生物學(xué)活性衍生物、片段或同系物。
本發(fā)明的APRIL編碼DNA序列可用于產(chǎn)生在用它們轉(zhuǎn)化的不同的原核和真核宿主中表達(dá)的申請(qǐng)專利的肽。這些肽可用于抗癌和免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用。一般而言，這包括培養(yǎng)用含有編碼APRIL的DNA分子轉(zhuǎn)化宿主的步驟、該分子與表達(dá)控制序列可操作連接。
本發(fā)明的DNA序列和重組DNA分子可用多種宿主/載體組合來(lái)表達(dá)。例如，有用的載體可包括染色體、非染色體或合成DNA序列的區(qū)段。本發(fā)明的表達(dá)載體的特征在于為了控制和調(diào)節(jié)DNA序列的表達(dá)，用至少一種可與插入載體的APRIL DNA序列可操作連接的表達(dá)控制序列。
而且，在每一個(gè)表達(dá)載體內(nèi)，可選擇不同的位點(diǎn)插入本發(fā)明的序列。這些位點(diǎn)通常由切割它們的限制性內(nèi)切酶命名，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員已充分認(rèn)識(shí)了這些位點(diǎn)和內(nèi)切酶。當(dāng)然可理解的是，本發(fā)明中有用的表達(dá)載體不需具有用于插入所需DNA片段的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。而是采用其它方法將片段克隆入載體。表達(dá)載體，特別是其位點(diǎn)是選擇用于插入選擇的DNA片段以及與表達(dá)控制序列與它可操作連接，是由多種因素來(lái)決定的。這些因素包括但不限于，表達(dá)蛋白的大小、目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞酶的蛋白水解降解的易感性、易受特定的內(nèi)切酶作用的位點(diǎn)數(shù)目、被純化過(guò)程中證實(shí)難以去除的宿主蛋白污染或與表達(dá)的蛋白結(jié)合。其它可被考慮的因素包括表達(dá)特征如起始和終止密碼子相對(duì)于載體的位置和其它為本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的因素。關(guān)于申請(qǐng)專利保護(hù)的DNA序列的載體和插入位點(diǎn)的選擇根據(jù)權(quán)衡這些因素而確定，不是所有選擇對(duì)目的應(yīng)用同等有效。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員分析這些參數(shù)并選擇出根據(jù)特殊的應(yīng)用而定的合適系統(tǒng)是常規(guī)工作。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地對(duì)表達(dá)控制序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椧垣@得高水平的蛋白表達(dá)，即通過(guò)替換密碼子或選擇那些被特定的有機(jī)體優(yōu)選利用的特殊氨基酸的密碼子以便使蛋白水解降到最低或者改變糖基化組成。同樣，可將半胱氨酸換成其它氨基酸以使產(chǎn)生、重折疊或穩(wěn)定問(wèn)題簡(jiǎn)單化。
因此，不是所有宿主/表達(dá)載體組合在表達(dá)本發(fā)明的DNA序列中等效發(fā)揮作用。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)宿主/表達(dá)載體組合進(jìn)行具體選擇?？煽紤]的因素包括，例如宿主與載體的相容性，對(duì)DNA序列編碼的蛋白對(duì)宿主的毒性、回收目的蛋白的容易程度、DNA序列和與其可操作連接的表達(dá)控制序列的表達(dá)特征、目的蛋白的生物安全性、耗費(fèi)和折疊、形式或其它必需的表達(dá)后修飾。
由用本發(fā)明的序列轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的APRIL以及根據(jù)本發(fā)明的處理純化的天然APRIL或者從申請(qǐng)專利保護(hù)的氨基酸序列產(chǎn)生的APRIL可用于抗癌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的多種組合物和方法中。它們也可用于在其它疾病的治療和方法中。
本發(fā)明還涉及在此公開(kāi)的DNA序列用于在異常條件下，即基因治療情況下表達(dá)APRIL的用途。另外，在對(duì)于某些應(yīng)用合適的啟動(dòng)子的引導(dǎo)下，APRIL也可在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。這種表達(dá)可增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答或直接影響腫瘤的存活。通過(guò)改變局部免疫應(yīng)答，APRIL還可能影響移植器官的存活。這種情況下，移植物本身或周圍的細(xì)胞可被編碼APRIL的工程基因修飾。
本發(fā)明的另一方面涉及“抗原”療法中編碼任何APRIL的分離的核酸的用途。如此處所用的，“反義”治療是指給予或原位產(chǎn)生在細(xì)胞環(huán)境下，與細(xì)胞mRNA和/或編碼目標(biāo)APRIL序列的DNA特異性雜交的寡核苷酸或其衍生物，以便抑制編碼的蛋白的表達(dá)，即通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯?？赏ㄟ^(guò)經(jīng)典的堿基對(duì)互補(bǔ)性結(jié)合或者例如，就與DNA雙螺旋結(jié)合而言是通過(guò)與雙螺旋大溝間的特異的相互作用。一般地，“反義”療法指本領(lǐng)域普遍采用的一系列技術(shù)并包括依賴于與寡核苷酸序列特異結(jié)合的任何療法。
本發(fā)明的反義構(gòu)建體可作為如表達(dá)質(zhì)粒運(yùn)送，當(dāng)其移入細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生與編碼APRIL的細(xì)胞mRNA的至少一部分互補(bǔ)的RNA。選擇性地，反義構(gòu)建體可以是在體內(nèi)產(chǎn)生的寡核苷酸探針。這些寡核苷酸探針是優(yōu)選修飾的對(duì)內(nèi)源核酸酶有抗性的寡核苷酸，因此在體內(nèi)是穩(wěn)定的。用作反義寡核苷酸的代表性核酸分子是DNA的磷酰胺化合物磷酰胺化合物、磷硫醇鹽和甲基磷酸酯類似物(見(jiàn)如5,176,996；5,264,564；和5,256,775)。另外，反義療法中有用的寡聚體的一般方法已有評(píng)論，具體地在此引用作為參考的有Van Der Krol等，(1988)生物技術(shù)6958-976；和Stein等(1988)癌癥研究482659-2668。
C.APRIL和其氨基酸序列如上面討論的APRIL是TNF家族的成員。APRIL蛋白、片段或其同系物可能具有廣泛的如下文中更詳細(xì)討論的治療和診斷應(yīng)用。
盡管APRIL精確的三維結(jié)構(gòu)不清楚，預(yù)測(cè)其作為T(mén)NF家族的成員，可能具有本家族的其他成員共有的某些結(jié)構(gòu)特征。
申請(qǐng)專利保護(hù)的APRIL序列與人TNF家族的其它成員的對(duì)比揭示了大量的結(jié)構(gòu)相似性。在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，所有蛋白都具有幾個(gè)序列保守區(qū)。APRIL的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的整個(gè)序列的同源性表現(xiàn)出與FasL的同源性最高(21％氨基酸一致)、與TNFα(20％)、與LT-β(18％)、然后是TRAIL、TWEAK和TRANCE(15％)。圖2。
本發(fā)明的新的多肽與一種尚未被鑒定的受體發(fā)生特異性相互作用。然而，在此公開(kāi)的肽和方法使與APRIL或其片段特異地相互作用的受體的鑒定成為可能。
某些實(shí)施方案中申請(qǐng)專利的發(fā)明包括來(lái)源于能與其受體結(jié)合的APRIL?？梢詭追N方法產(chǎn)生APRIL片段如重組、PCR、蛋白水解消化或化學(xué)合成方法。可通過(guò)從編碼多肽的核酸分子的一端或兩端去除一個(gè)或多個(gè)核苷酸產(chǎn)生多肽的內(nèi)部或末端片段。表達(dá)誘變處理的DNA產(chǎn)生多肽片段。
也可采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)如傳統(tǒng)的Merrifield固相f-moc或t-boc化學(xué)合成法合成多肽片段。例如，可將本發(fā)明的肽和DNA序列任意分為沒(méi)有片段重疊的所需長(zhǎng)度的片段或者分為所需長(zhǎng)度的重疊片段。下文中更詳細(xì)地描述了這些方法。
D.產(chǎn)生APRIL的可溶形式APRIL的可溶形式通常能有效地發(fā)出信號(hào)并因此可作為目前模擬天然膜形式的藥物應(yīng)用?？赡艽颂幧暾?qǐng)專利保護(hù)的APRIL天然就是作為可溶的細(xì)胞因子分泌的，然而，如果不是這樣，可對(duì)基因再操作基因來(lái)迫使分泌。為產(chǎn)生APRIL的可溶的分泌形式，可以在DNA水平去除N-末端跨膜區(qū)和特征性高級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)的某部分并且將它們換成允許在選擇的表達(dá)系統(tǒng)中有效地蛋白水解切割的I型或II型前導(dǎo)序列。技術(shù)人員可改變分泌表達(dá)構(gòu)建體中保留的特征性高級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)量以優(yōu)化受體結(jié)合性質(zhì)和分泌效率。例如，可制備含有所有可能的特征性高級(jí)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度的構(gòu)建體即N-端截體以便產(chǎn)生從氨基酸81到139的蛋白質(zhì)。由這種類型分析可產(chǎn)生最理想長(zhǎng)度的特征性高級(jí)結(jié)構(gòu)序列。
E.與APRIL反應(yīng)的抗體的產(chǎn)生發(fā)明還包括與APRIL或其受體特異性反應(yīng)的抗體。可采用常規(guī)方案制備抗蛋白/抗肽的抗血清或單克隆抗體(見(jiàn)例如，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Harlow和Lane編輯(冷泉港出版社1988)。可用肽的免疫原性形式免疫哺乳動(dòng)物如小鼠、倉(cāng)鼠或家兔。將免疫原性賦予蛋白或肽的技術(shù)包括與載體結(jié)合或本領(lǐng)域熟知的其它技術(shù)。
可在存在佐劑的情況下施用APRIL的免疫原性部分或其受體?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)血漿或血清中的抗體效價(jià)來(lái)監(jiān)測(cè)免疫進(jìn)程。將免疫原作為抗原利用常規(guī)的ELLSA或其它免疫分析方法來(lái)評(píng)估抗體的水平。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，本主題抗體對(duì)APRIL的抗原決定簇或其受體，如SEO.ID.NO.2的多肽抗原決定簇或者密切相關(guān)的人或非人哺乳動(dòng)物同系物(如70，80或90％同源的，更優(yōu)選地至少95％同源的)具有免疫特異反應(yīng)性。本發(fā)明的又一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗APRIL或抗APRIL受體抗體與蛋白如與SEQ.ID.NO.2的同源性小于80％；優(yōu)選地小于90％并且最優(yōu)選地小于95％的蛋白沒(méi)有明顯的交叉反應(yīng)(即特異地反應(yīng))?！盁o(wú)明顯交叉反應(yīng)”意味著抗體與非同源蛋白的結(jié)合親和性小于與SEQ.ID.NO.2蛋白的結(jié)合親和性的10％，更優(yōu)選地小于5％以及甚至更優(yōu)選地小于1％。
此處所用的術(shù)語(yǔ)抗體用來(lái)包括也與APRIL或其受體發(fā)生特異反應(yīng)的抗體片段。可采用傳統(tǒng)的技術(shù)使抗體片段化并且按上面所描述的與用于完整抗體相同的方式篩選片段進(jìn)行應(yīng)用。例如，可通過(guò)用胃蛋白酶處理抗體來(lái)產(chǎn)生F(ab’)2片段?？商幚淼玫降腇(ab’)2片段還原二硫鍵產(chǎn)生Fab’片段。本發(fā)明的抗體還包括具有抗APRIL或抗APRIL受體活性的生物特異性和嵌合分子。因此，APRIL和其受體的單克隆和多克隆抗體(Ab)以及抗體片段如Fab’和F(ab’)2可用來(lái)阻斷APRIL和其各自的受體的作用。
也可利用常規(guī)的重組DNA技術(shù)制備多種形式的抗體(具體地在此引用作為參考，Winter和Milstein，自然349293-299(1991))。例如，可將來(lái)自動(dòng)物抗體的抗原結(jié)合區(qū)與人的恒定區(qū)連接來(lái)構(gòu)建嵌合抗體(如Cabilly等，美國(guó)4,816,567，在此引用作為參考)。當(dāng)用于人的臨床治療時(shí)，嵌合抗體可降低由動(dòng)物抗體引發(fā)的所觀察到的免疫原性反應(yīng)。
另外，可合成識(shí)別APRIL或其受體的重組的“人源化抗體”。人源化抗體是含有大部分人IgG序列的插入了負(fù)責(zé)特異抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體。用目的抗原免疫動(dòng)物、分離相應(yīng)的抗體并且去除負(fù)責(zé)特異抗原結(jié)合的可變區(qū)序列。將動(dòng)物來(lái)源的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域克隆入抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被缺失的人抗體基因的合適位置。人源化抗體最大限度地減少了人抗體中異源的(即種間)序列的應(yīng)用，并且，因此引發(fā)受試患者免疫應(yīng)答的可能性小。
也可通過(guò)制備含有從不同類型的免疫球蛋白分離的可變區(qū)和人恒定區(qū)(CH1，CH2，CH3)的嵌合或人源化抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)不同類型的重組抗體的構(gòu)建。例如，可通過(guò)將抗原結(jié)合位點(diǎn)克隆入攜帶人的鏈恒定區(qū)的載體中重組產(chǎn)生具有增加的抗原結(jié)合位點(diǎn)效價(jià)的抗體(Arulanandam等，J.Exp.Med.1771439-1450(1993)，在此引用作為參考)。
另外，可通過(guò)改變抗原結(jié)合位點(diǎn)附近的氨基酸殘基采用常規(guī)的重組DNA技術(shù)改變重組抗體與其抗原的結(jié)合親和性。可通過(guò)以分子模擬為基礎(chǔ)的誘變來(lái)增加人源化抗體的抗原結(jié)合親和性(Queen等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)8610029-33(1989)，在此引用作為參考)。
F.類似物的產(chǎn)生改變的DNA和肽序列的產(chǎn)生APRIL類似物與天然存在的配體在氨基酸序列上有所不同，或者不涉及序列的其它方面有所不同，或者兩者都不相同。非序列修飾包括APRIL在體內(nèi)或體外的化學(xué)衍生作用。非序列修飾包括但不局限于乙?；⒓谆?、磷酸化、羧基化或糖基化改變。
優(yōu)選的類似物包括APRIL或其生物學(xué)活性片段，它的序列通過(guò)一個(gè)或多個(gè)保守的氨基酸替換或者不消除APRIL生物學(xué)活性的一個(gè)或多個(gè)非保守氨基酸替換、缺失或插入而與SEQ.ID.NO.2所給的序列不同。保守替換典型地包括一個(gè)氨基酸被另一個(gè)有相似特征的氨基酸替換，如下面各組替換纈氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
表1保守性氨基酸置換
用于誘變的有用的方法包括下文詳細(xì)描述的PCR誘變和飽和誘變。也可通過(guò)合成一組簡(jiǎn)并寡核苷酸序列產(chǎn)生隨機(jī)的氨基酸序列變異體文庫(kù)。
-PCR誘變PCR誘變中，降低Taq聚合酶保真性可用來(lái)將隨機(jī)突變導(dǎo)入DNA克隆的片段(Leung等，1989，技術(shù)111-15)。這是導(dǎo)入隨機(jī)突變的很有效且相對(duì)迅速的方法。在降低用Taq DNA聚合酶合成DNA的保真性的條件下，如采用比率為5的dGTP/dATP并向PCR反應(yīng)中加入Mn2+，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可擴(kuò)增要誘變的DNA結(jié)構(gòu)域。可將擴(kuò)增的DNA片段集合插入合適的克隆載體以提供隨機(jī)突變體文庫(kù)。
-飽和誘變飽和誘變可使大量單個(gè)堿基替換快速導(dǎo)入克隆的DNA片段(Mayers等，1985，科學(xué)229242)。此技術(shù)包括產(chǎn)生突變?nèi)缤ㄟ^(guò)對(duì)單鏈DNA進(jìn)行化學(xué)處理或照射射線，并合成互補(bǔ)DNA鏈。可通過(guò)調(diào)節(jié)處理的程度來(lái)調(diào)節(jié)突變頻率而且可獲得基本上所有可能的堿基替換。由于此方法不涉及對(duì)突變體片段的遺傳選擇，可獲得中性替換以及通過(guò)DNA隨機(jī)誘變制備的改變蛋白功能的替換。點(diǎn)突變的分布不偏向保守序列元件。
-簡(jiǎn)并寡核苷酸也可從一組簡(jiǎn)并寡核苷酸序列產(chǎn)生同系物文庫(kù)。在DNA自動(dòng)合成儀中進(jìn)行簡(jiǎn)并序列的化學(xué)合成并且隨后將合成的基因與合適的表達(dá)載體連接。本領(lǐng)域已知簡(jiǎn)并寡核苷酸的合成xxx。這些技術(shù)已用于其它蛋白的定向進(jìn)化xxxi。
非隨機(jī)或定向誘變技術(shù)可用來(lái)提供特異結(jié)構(gòu)域中的特異序列或者突變。采用這些技術(shù)產(chǎn)生的變異體包括如蛋白的已知氨基酸序列殘基的缺失、插入或替換?？蓪?duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行個(gè)別或一系列的修飾，如通過(guò)(1)首先用保守氨基酸替換然后根據(jù)取得的結(jié)果用更基本的選擇替換，2)缺失靶殘基，或者3)鄰近所處位點(diǎn)插入相同或不同類型的殘基，或者聯(lián)合1-3項(xiàng)。
-丙氨酸掃描誘變丙氨酸掃描誘變是用來(lái)鑒定目的蛋白的某些殘基或結(jié)構(gòu)域是誘變的優(yōu)選位置或區(qū)域的有用的方法，Cunningham和Wells(科學(xué)2441081-1085，1989)，具體地在此引用作為參考。丙氨酸掃描中，用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)識(shí)別并替換殘基或目標(biāo)殘基的基團(tuán)(如帶電荷的殘基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)。氨基酸替換可影響氨基酸與細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的周圍的水環(huán)境的相互作用。然后通過(guò)在或者為替換位點(diǎn)導(dǎo)入更多的或其它變異體來(lái)精選那些表現(xiàn)出對(duì)替換功能性敏感的結(jié)構(gòu)域。因此，盡管導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)定的，但是突變性質(zhì)本身不需預(yù)定。例如，為優(yōu)化在所給位點(diǎn)突變的表現(xiàn)，可在目標(biāo)密碼子或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變并且篩選表達(dá)的目的蛋白亞基變異體以得到所需活性的最理想的組合。
-寡核苷酸介導(dǎo)的誘變寡核苷酸介導(dǎo)的誘變是制備DNA替換、缺失和插入變異體的有用的方法，見(jiàn)如Adelman等，(DNA 2183，1983)在此引用作為參考。簡(jiǎn)而言之，可通過(guò)將編碼突變的寡核苷酸與含有目的蛋白的未改變或天然DNA序列的質(zhì)粒或噬菌體的單鏈形式的DNA模板雜交改變目標(biāo)DNA。雜交之后，用DNA聚合酶合成與寡核苷酸引物結(jié)合的模板的完整的第二條互補(bǔ)鏈，并在目的蛋白的DNA中編碼所選擇的改變。一般地，應(yīng)用了長(zhǎng)度至少為25個(gè)核苷酸的寡核苷酸。最理想的寡核苷酸含有12-15個(gè)在編碼突變的核苷酸兩側(cè)與模板完全互補(bǔ)的核苷酸。這保證了寡核苷酸將與單鏈DNA模板分子適當(dāng)?shù)仉s交。采用本領(lǐng)域所知的技術(shù)如此處引用作為參考的、Crea等描述的(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)755765)可方便地合成寡核苷酸。
-盒式誘變制備變異體的另外一種方法，盒式誘變，是根據(jù)此處引用作為參考的Wells等(基因，34315)描述的技術(shù)。起始物質(zhì)可以是包含要突變的蛋白亞基DNA的質(zhì)粒(或其它載體)。鑒定要突變的蛋白亞基DNA中的密碼子。在鑒定的突變位點(diǎn)兩側(cè)必須有特殊的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果不存在這種限制性位點(diǎn)，采用上面描述的寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法在目的蛋白亞基DNA的合適位置將其導(dǎo)入來(lái)產(chǎn)生限制性位點(diǎn)。在限制性位點(diǎn)已導(dǎo)入質(zhì)粒之后，在這些位點(diǎn)切割質(zhì)粒并使之線性化。采用常規(guī)方法合成編碼位于限制性位點(diǎn)之間的DNA序列同時(shí)含有所需突變的雙鏈寡核苷酸。分別合成兩條鏈然后用常規(guī)技術(shù)使它們雜交。此雙鏈寡核苷酸被稱為盒。設(shè)計(jì)盒具有與線性化質(zhì)粒的末端類似的3’端和5’端，以便盒能與質(zhì)粒直接連接?，F(xiàn)在該質(zhì)粒含有突變的目的蛋白亞基DNA序列。
-組合誘變也可用組合誘變產(chǎn)生突變體。如，優(yōu)選地為促使最高同源性可能，對(duì)比了一組同系物或其它相關(guān)蛋白的氨基酸序列。可選擇所有在對(duì)比序列的指定位置出現(xiàn)的氨基酸產(chǎn)生一組簡(jiǎn)并組合序列。變異體的多樣化文庫(kù)是在核酸水平通過(guò)組合誘變產(chǎn)生的，而且由多樣化基因文庫(kù)編碼。例如，可將合成的寡核苷酸混合物酶促連接到基因序列中以便這組潛在的簡(jiǎn)并序列表達(dá)為各個(gè)肽或者選擇性地、含有這組簡(jiǎn)并序列的一組更大的融合蛋白。
本領(lǐng)域已知用于篩選產(chǎn)生的突變基因產(chǎn)物的多種技術(shù)。用于篩選大的基因文庫(kù)的技術(shù)通常包括將基因文庫(kù)克隆入可復(fù)制的表達(dá)載體，用得到的載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，在目的活性如，此實(shí)例中是與APRIL或其受體結(jié)合檢測(cè)促使編碼其產(chǎn)物被檢測(cè)的基因的載體相對(duì)容易分離。下文描述的每一種技術(shù)都可接受用于篩選產(chǎn)生的大量序列的高生產(chǎn)率分析，如隨機(jī)誘變技術(shù)。
本發(fā)明還提供申請(qǐng)專利保護(hù)的多肽或它們的受體的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的還原作用，來(lái)產(chǎn)生模擬的如肽或非肽試劑。這些肽模擬物能破壞APRIL與其各自的受體結(jié)合?？设b定參與受體多肽或下游胞內(nèi)蛋白的分子識(shí)別的APRIL關(guān)鍵殘基并用來(lái)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制APRIL與受體結(jié)合的APRIL或其受體來(lái)源的肽模擬物。(見(jiàn)，例如“人乳頭瘤病毒蛋白與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因蛋白結(jié)合的肽抑制劑”歐洲專利申請(qǐng)EP-412,762A和EP-B31,080A)，具體地在此引用作為參考。
通過(guò)制備可獲得的純化和重組APRIL，本發(fā)明提供用來(lái)篩選是正常細(xì)胞功能，此實(shí)例中是APRIL或其受體的激動(dòng)劑或是拮抗劑的候選藥物的分析法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分析評(píng)價(jià)了化合物調(diào)節(jié)APRIL與受體之間的結(jié)合的能力。多種分析形式可滿足需要并且，根據(jù)本發(fā)明，可被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解。
在許多檢驗(yàn)化合物和天然提取物文庫(kù)的藥物篩選程序中，為在給定的時(shí)間期限內(nèi)鑒定的化合物最多需用高生產(chǎn)率分析法。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)如用純化或半純化蛋白衍生的，進(jìn)行的分析常被稱為“初級(jí)”篩選，這是因?yàn)樗鼈兊漠a(chǎn)生使得分子目標(biāo)中由試驗(yàn)化合物介導(dǎo)的變化迅速發(fā)展和相對(duì)容易的檢測(cè)成為可能。而且，在體外系統(tǒng)中，一般可忽略試驗(yàn)化合物的細(xì)胞毒性和/或生物可獲得性，而將分析法主要集中在作為在與其它蛋白的結(jié)合親和性的改變中顯著的藥物對(duì)分子目標(biāo)的作用或者分子目標(biāo)的酶促性質(zhì)的變化上。分離與APRIL結(jié)合的受體TNF家族的配體可用于鑒定和克隆受體。用所描述的APRIL序列，可將組成受體結(jié)合序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的5’端與標(biāo)記序列融合然后加上能使APRIL在許多表達(dá)系統(tǒng)的任一種中都可分泌的前導(dǎo)序列。Browning等(1996)(JBC271，8618-8626)描述了這種技術(shù)的一個(gè)例子，其中的LT-β配體是以這種形式分泌的。VCAM前導(dǎo)序列與帶有LT-β細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的短myc肽標(biāo)記結(jié)合。VCAM序列被用來(lái)迫使正常地與膜結(jié)合的LT-β分子分泌。分泌的蛋白在N-末端保留了myc標(biāo)記這不影響它與受體結(jié)合的能力。這樣的分泌蛋白可在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的Cos細(xì)胞或者相似的系統(tǒng)如EBNA來(lái)源的載體、昆蟲(chóng)細(xì)胞/桿狀病毒、picchia等中表達(dá)。未純化的細(xì)胞上清液可用作已標(biāo)記配體的來(lái)源。
可將表達(dá)受體的細(xì)胞暴露于已標(biāo)記配體中來(lái)進(jìn)行鑒定。在用抗-myc肽抗體(9E10)標(biāo)記myc標(biāo)記隨后用藻紅蛋白標(biāo)記(或類似的標(biāo)記)抗-小鼠免疫球蛋白的FACS實(shí)驗(yàn)中鑒定具有結(jié)合的配體的細(xì)胞?？煞奖愕罔b定出FACS陽(yáng)性細(xì)胞并將其作為編碼受體的RNA來(lái)源。然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)從此RNA制備表達(dá)文庫(kù)并分成集合。將克隆集合轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞并且在給酶標(biāo)抗小鼠Ig試劑如半乳糖苷酶、堿性磷酸酶或螢光素酶標(biāo)記的抗體標(biāo)記上結(jié)合的myc肽標(biāo)簽之后通過(guò)顯微鏡檢查鑒定已標(biāo)記的配體與受體陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。一旦有陽(yáng)性集合鑒定出，降低集合的大小直到鑒定出編碼cDNA的受體。可用小鼠或人APRIL實(shí)施此方法，因?yàn)榭赡芨奖愕禺a(chǎn)生受體。
G.治療方法和藥物組合物。
本發(fā)明用于治療癌癥的方法包括給予患病者優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主如狗、貓或人含有能干擾APRIL與其受體相結(jié)合的阻滯劑的有效量的申請(qǐng)專利保護(hù)的組合物。這些阻滯劑包括但不限于可溶的APRIL、抗APRIL抗體、抗APRIL受體抗體或其生物活性片段。另外，可通過(guò)使APRIL突變同時(shí)維持其阻滯APRIL與其受體結(jié)合的能力來(lái)制備APRIL的抑制形式。阻滯劑可優(yōu)選含有可按照本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建的受體IG融合蛋白。
本發(fā)明的方法可用于治療所有癌癥，包括但不限于細(xì)胞疾病如，例如腎細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、慢性白血病、乳癌、肉瘤、孵巢癌、直腸癌、咽喉癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、胞大細(xì)胞瘤、肺癌、乳房腺癌、咽鱗狀細(xì)胞癌和胃腸或胃癌。另外，這些阻滯劑可用于治療那些不被認(rèn)為是腫瘤的增殖性疾病即細(xì)胞過(guò)度增殖(增殖)如，例如硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的血管翳形成、外科手術(shù)后瘢痕和肺、肝臟和子宮纖維化。
本發(fā)明的藥物組合物可包含治療有效量的APRIL或其受體、或其片段、或其模擬物并且可選擇性地包含藥學(xué)上可接受的載體。因此，通過(guò)施用本發(fā)明藥學(xué)上有效量的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，本發(fā)明提供治療癌癥的方法以及刺激、或某些情況下抑制免疫系統(tǒng)或其部分的方法。當(dāng)然應(yīng)理解的是本發(fā)明的組合物和方法可與其它多種療法聯(lián)合應(yīng)用。
可將組合物制成制劑，用于多種給藥途徑，包括全身、體表或局部給藥。對(duì)于全身給藥，注射給藥是優(yōu)選的，包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下注射，本發(fā)明的組合物可制成液體溶液，優(yōu)選地配制在生理相容性緩沖液如Hank’s液或Ringer’s液。另外，組合物也可制成固體形式并且，選擇性地在使用之前立即再溶解或懸浮。本發(fā)明中也包括凍干形式。
組合物可口服或經(jīng)粘膜或皮膚方式給藥。用經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚給藥時(shí)，制劑中應(yīng)用了適合于要透過(guò)的屏障的滲透劑。本領(lǐng)域所知的這些滲透劑包括，例如用于經(jīng)粘膜給藥的有膽鹽、梭鏈孢酸衍生物和去污劑。經(jīng)粘膜給藥可通過(guò)鼻腔噴霧劑或應(yīng)用栓劑。用于口服給藥，可將組合物制成傳統(tǒng)的口服給藥形式如膠囊、片劑和補(bǔ)藥。用于體表給藥，如本領(lǐng)域已知的，可將本發(fā)明的組合物制成軟膏、油膏、凝膠或乳劑。
給藥劑量和服藥規(guī)則由癌癥類型、患者和患者的病史而定。劑量必須對(duì)癌癥的治療、抑制或改變癌癥進(jìn)程有效。給藥可以單次給藥或多次給藥。如果采用多次給藥，按優(yōu)選的，給藥的頻率取決于，例如宿主和癌癥的類型、所給劑量等。對(duì)于某些類型的癌癥或癌癥譜系，每日給藥是有效的，而對(duì)于其它的，每隔一天或每隔兩天給藥是有效的。一次或整個(gè)治療過(guò)程所給的活性化合物的量取決于許多因素。例如，受治對(duì)象的年齡和大小、所治疾病的嚴(yán)重度和病程、給藥方式和劑型以及治療醫(yī)生的判斷。然而，有效劑量可以為約0.005-約5mg/kg/天，優(yōu)選約0.05-約0.5mg/kg/天。最有效的劑量是引起無(wú)腫瘤外觀或者腫瘤完全退化并且對(duì)患者無(wú)毒的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到同樣有用的更低和更高的劑量。
根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體也可用作基因治療方案的一部分來(lái)運(yùn)送編碼APRIL的對(duì)抗或拮抗形式的核酸。
APRIL的表達(dá)構(gòu)建體可在任何生物學(xué)上有效的載體如能夠在體內(nèi)有效地運(yùn)送APRIL基因給細(xì)胞的任何制劑或組合物中給藥。方法包括將基因插入能直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒載體、或者借助于如脂質(zhì)體或胞內(nèi)載體運(yùn)送質(zhì)粒DNA、以及直接注射基因構(gòu)建體。優(yōu)選病毒載體轉(zhuǎn)化方法。
基因治療構(gòu)建體的藥物制劑可主要含有可接受的稀釋劑中的基因運(yùn)送系統(tǒng)或者可含有基因運(yùn)送載體包埋在其中的緩釋基質(zhì)。選擇性地，在完整的基因運(yùn)送系統(tǒng)可從重組的細(xì)胞完整地產(chǎn)生的地方如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥物制劑可含有產(chǎn)生基因運(yùn)送系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。
除了用于治療，本發(fā)明的寡聚體可用作診斷試劑來(lái)檢測(cè)與它們特異性結(jié)合的目標(biāo)DNA、RNA或氨基酸序列的存在與否。在其它方面，申請(qǐng)專利的本發(fā)明可用來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)個(gè)體與APRIL或其片段相互作用如結(jié)合或物理聯(lián)合的能力。方法包括使化學(xué)個(gè)體與APRIL相互接觸并且評(píng)價(jià)化學(xué)個(gè)體與APRIL相互作用的能力。另外，APRIL可用在評(píng)價(jià)天然產(chǎn)生的APRIL或APRIL受體以及評(píng)價(jià)與APRIL受體聯(lián)合或結(jié)合的化學(xué)個(gè)體的方法中。理想的是，利用標(biāo)記的APRIL版本來(lái)方便與其受體結(jié)合的APRIL或受體陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)，如，例如篩選能阻斷APRIL配體-APRIL受體相互作用的試劑的目的。另外，可利用具有增高的生長(zhǎng)速度的APRIL轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系作用根據(jù)用來(lái)篩選阻斷APRIL活性的分子的驗(yàn)定法。
在某些方面，申請(qǐng)專利的發(fā)明特點(diǎn)是用于評(píng)價(jià)化學(xué)個(gè)體調(diào)節(jié)APRIL和其相應(yīng)的受體之間的相互作用的能力的方法。此方法包括，在兩者能在其中相互作用的條件下結(jié)合APRIL受體和APRIL，加入要評(píng)價(jià)的化學(xué)個(gè)體并檢測(cè)復(fù)合物的形成或溶解?？蛇M(jìn)一步在體外評(píng)價(jià)這些調(diào)節(jié)試劑如在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中檢驗(yàn)其活性并且然后選擇性地給細(xì)胞或動(dòng)物應(yīng)用此化合物并評(píng)價(jià)其作用。
I.實(shí)施例實(shí)施例1APRIL的Northern印跡分析顯示APRIL表達(dá)微弱并且僅在少數(shù)組織表達(dá)(圖2A)。前列腺中發(fā)現(xiàn)2.1Kb和2.4Kb的兩種轉(zhuǎn)錄物，而PBLs顯示出1.8Kb的更短的轉(zhuǎn)錄物。采用Human Multiple Tissue NorthernBlots I和II(Clontech#7760-1和#7759-1)、Human Cancer CellLine MTN Blot(Clontech #7757-1)和Human Tumor Panel BlotV(Invitrogen D3500-01)進(jìn)行Northern印跡分析。于62℃在ExpressHyb雜交液(Clontech #8015-1)中溫育膜至少1小時(shí)。利用APRIL的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)cDNA為模板合成隨機(jī)引物cDNA探針(Boehringer Mannheim)。以1.5×106cpm/ml濃度將熱變性的cDNA探針加入新鮮的ExpressHyb中。膜在62℃雜交12-24小時(shí)，在含有0.05％SDS的2xSSC中洗三次并且于-70℃曝光。APRIL的Northern印跡分析顯示APRIL表達(dá)微弱并且僅限于少數(shù)組織。在前列腺中發(fā)現(xiàn)了2.1Kb和2.4Kb的兩種轉(zhuǎn)錄物，而PBLs顯示出更短的1.8Kb的轉(zhuǎn)錄物。
更長(zhǎng)的曝光時(shí)間顯示出2.1kb的APRIL mRNA在結(jié)腸、脾臟和胰腺中(未顯示資料)。APRIL mRNA的有限分布與目前可獲得的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的cDNA克隆的來(lái)源一致。鑒定的23個(gè)克隆中只有兩個(gè)來(lái)源于正常組織(懷孕子宮、胰島)。值得注意的是，存在于cDNA文庫(kù)中的ETS-克隆的剩余者(21個(gè)克隆，91％)產(chǎn)生于腫瘤或腫瘤來(lái)源的細(xì)胞系(卵巢腫瘤，11個(gè)；前列腺腫瘤3個(gè)；Gessler Wilms腫瘤，1個(gè)；結(jié)腸癌，1個(gè)；子宮內(nèi)膜腫瘤，1個(gè)；甲狀旁腺腫瘤，1個(gè)；胰腺腫瘤，1個(gè)；T細(xì)胞淋巴瘤，1個(gè)；LNCAP腺瘤來(lái)源細(xì)胞系，1個(gè))。這促使我們檢驗(yàn)表達(dá)APRILmRNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(圖2B)而且所有細(xì)胞系的確強(qiáng)烈表達(dá)APRIL的2.1kb轉(zhuǎn)錄物。
在結(jié)腸直腸腺癌SW480、伯基特淋巴瘤Raji和黑色素瘤G361中檢測(cè)到最高的APRIL特異信號(hào)。為證明此發(fā)現(xiàn)，測(cè)定了幾種腫瘤中APRIL mRNA的表達(dá)水平并將其與正常組織相比較。在甲狀腺癌和淋巴瘤中檢測(cè)到大量的APRIL mRNA，而在相應(yīng)的正常組織中，僅發(fā)現(xiàn)微弱的或者無(wú)雜交信號(hào)(圖2C)。在Northern印跡雜交分析的兩種其它腫瘤(腎上腺和腮腺腫瘤)中，APRIL mRNA水平未升高。然而，原位雜交展示了與正常結(jié)腸組織相比，人結(jié)腸腺癌中有大量APRIL信息(圖2D)。
為探討APRIL的可能活性，在293細(xì)胞中表達(dá)了包含氨基酸110-250的APRIL的可溶細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(sAPRIL)的重組形式(9)。應(yīng)用一側(cè)有EcoRI位點(diǎn)的特異5’正向引物(5’-CCAGCCTCATCTCCTTTCTTGC-3’)和一側(cè)有XbaI位點(diǎn)的特異3’反向引物(5’-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3’)從EST-克隆擴(kuò)增全長(zhǎng)APRIL基因。用EcoRI/XbaI剪切擴(kuò)增的片段并將其克隆入pCRIII的修飾版本(Invitrogen)，框內(nèi)帶有N-端Flag肽(15)。用分別含有PstI和XbaI位點(diǎn)的兩個(gè)引物(5’-AAACAGAAGAAGCAGCACTCTG-3’)和(5’-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3’)產(chǎn)生APRIL的可溶形式(sAPRIL)并且隨后將其克隆入含有用于在真核細(xì)胞中進(jìn)行蛋白分泌的HA信號(hào)和N-末端Flag表位的修飾的pCRIII載體(15)。實(shí)施例2腫瘤細(xì)胞和組織中APRIL的廣泛表達(dá)提示APRIL可能與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)，因此將不同的腫瘤細(xì)胞系與純化的重組Flag標(biāo)記的sAPRIL進(jìn)行溫育(10)。人胚胎293T細(xì)胞、人白血病Jurkat T-細(xì)胞、人伯基特淋巴瘤B-細(xì)胞Raji和黑色素瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)如前所述(16，17)。本文中提到的其它細(xì)胞系保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)并由其描述。所有細(xì)胞系在補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
最近描述了人FasL細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(殘基103-281)和TRAIL的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(殘基95-281)的Flag-標(biāo)記的版本(15)。Flag-標(biāo)記的可溶的人TWEAK(殘基141-284)在293細(xì)胞中產(chǎn)生(P.S.準(zhǔn)備中未印刷的原稿)。從Kodak International Biotechnologies獲得抗-Flag抗體M2。當(dāng)根據(jù)加入配體24小時(shí)后活細(xì)胞數(shù)目的增加(近似50％)檢測(cè)時(shí)，觀察到在APRIL存在時(shí)Jurkat T淋巴瘤細(xì)胞增殖的增加呈劑量依賴效應(yīng)(圖3A)。細(xì)胞增殖的測(cè)定是通過(guò)以每孔50,000個(gè)細(xì)胞在100μl的培養(yǎng)基中與指定濃度的重組APRIL、TWEAK、TRAIL、FasL溫育細(xì)胞并且在24hr后按照制造商的說(shuō)明應(yīng)用Celltiter96AQ增殖測(cè)定法(Promega)測(cè)定活細(xì)胞數(shù)目或者用3H-胸腺嘧啶核苷摻入進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)用與瓊脂糖偶聯(lián)的抗-Flag用于免疫耗竭Flag-APRIL。
細(xì)胞增殖的增長(zhǎng)不依賴于共同刺激信號(hào)如抗-CD3抗體或其它細(xì)胞因子。如所預(yù)期的，向Jurkat細(xì)胞中加同樣產(chǎn)生的和純化的FasL減少了活細(xì)胞的數(shù)目，而TWEAK沒(méi)有此效應(yīng)。細(xì)胞數(shù)目增加與APRIL處理的細(xì)胞中3H-胸腺嘧啶核苷摻入的增高(40％)有關(guān)(圖3A)。用抗-FLAG抗體，而不是抗-myc抗體進(jìn)行的FLAG-標(biāo)記的含有APRIL的條件培養(yǎng)基產(chǎn)生的免疫耗竭降低了增殖效應(yīng)(圖3B)，這表明這種增殖效應(yīng)是特異的并且是由于APRIL。增殖速度的增高也可見(jiàn)于某些B淋巴瘤(人Raji、小鼠A20細(xì)胞，但不是人BJAB)和上皮來(lái)源的細(xì)胞系如COS和HeLa以及黑色素瘤(圖3C)。乳腺癌細(xì)胞MCF-7沒(méi)有反應(yīng)。當(dāng)胎牛血清由10％降到1％時(shí)，對(duì)Jurkat細(xì)胞的作用更明顯(圖3D)。
重組sAPRIL的集合物形式可能解釋在相當(dāng)高的濃度才可檢測(cè)到sAPRIL的增殖效應(yīng)。因此，用全長(zhǎng)人APRIL轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞(12)并獲得幾個(gè)APRIL-表達(dá)克隆(圖4A)。用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法和包含全長(zhǎng)FLAG-標(biāo)記的APRIL的pCRIII表達(dá)載體建立了NIH-3T3 APRIL克隆。在還原條件下，有SDS存在時(shí)，在12％聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)每泳道約2×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞蛋白進(jìn)行電泳分離并隨后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5μg/ml的大鼠單克隆抗-Flag抗體M2(KodakInternational Biotechnologies)進(jìn)行Flag-標(biāo)記的APRIL的免疫印跡分析。用親合純化的抗-過(guò)氧化物酶結(jié)合的驢抗-小鼠抗體(Dianova，Hamburg，Germany)、隨后用ECL系統(tǒng)(Amersham)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來(lái)檢測(cè)第一抗體。
令人感興趣的是，APRIL轉(zhuǎn)染子比模擬轉(zhuǎn)染子增殖得快(圖4B)。推論APRIL-轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞也可能具有體內(nèi)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。當(dāng)將野生型或模擬轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞注射給裸鼠時(shí)，5-6周后觀察到小的可觸摸腫瘤(13)。相反，用APRIL穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的兩個(gè)NIH-3T3細(xì)胞克隆都在僅僅3-4周時(shí)誘發(fā)腫瘤。六周后，由于高度的腫瘤負(fù)擔(dān)不得不處死小鼠(圖4C)。將NIH/3T3成纖維細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，rockville，Maryland)和不同的轉(zhuǎn)染子(1×105個(gè))細(xì)胞懸浮于50μlPBS中并將其皮下注射到BALB/c裸鼠(Harlan，Zeist，Netherland)體側(cè)。每三天測(cè)量一次腫瘤大小。小鼠是同齡的(每組3只動(dòng)物)。實(shí)施例3分離與APRIL結(jié)合的受體TNF家族的配體可用來(lái)鑒定和克隆受體。用所需的APRIL序列，可使組成受體結(jié)合序列的APRIL的胞外結(jié)構(gòu)域與標(biāo)記序列融合，并且加上前導(dǎo)序列使得在任意表達(dá)系統(tǒng)中都可分泌APRIL。此技術(shù)的一個(gè)例子由Browning等描述，(1996)(JBC271，8618-8626)，其中LT-β配體以這種方式分泌。VCAM前導(dǎo)序列與后面帶有LT-β的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的短的myc肽標(biāo)記結(jié)合。VCAM序列用于使正常膜結(jié)合LT-β分子分泌。分泌的蛋白保留不影響其與受體結(jié)合的能力的位于N-末端的myc標(biāo)記。這樣的分泌蛋白可在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的Cos細(xì)胞或相似系統(tǒng)如EBNA來(lái)源的載體、昆蟲(chóng)細(xì)胞/桿狀病毒、picchia等中表達(dá)。未純化的細(xì)胞上清液可用作標(biāo)記配體的來(lái)源。
表達(dá)受體的細(xì)胞可通過(guò)將其暴露于標(biāo)記配體而得到鑒定。在FACS實(shí)驗(yàn)中，用抗-myc肽抗體(9E10)來(lái)標(biāo)記myc標(biāo)記然后用藻紅蛋白(或相似標(biāo)記)標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白鑒定帶有結(jié)合配體的細(xì)胞。FACS陽(yáng)性細(xì)胞可方便地得以鑒定并可作為編碼受體的RNA來(lái)源。然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)從此RNA制備表達(dá)文庫(kù)并分成集合。將克隆的集合轉(zhuǎn)染進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞并通過(guò)顯微鏡檢查來(lái)確定標(biāo)記配體與受體陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合，然后用酶標(biāo)抗小鼠Ig試劑即半乳糖苷酶、堿性磷酸酶或熒光素酶標(biāo)記抗體標(biāo)記結(jié)合的myc肽標(biāo)記。一旦鑒定出陽(yáng)性集合，應(yīng)減少集合大小直到鑒定出編碼cDNA的受體。可用小鼠或人APRIL實(shí)行此方法，可更方便地得到受體。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是在不離開(kāi)本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本發(fā)明的APRIL、組合物和方法可進(jìn)行多種修飾和改變。因此，如果這些修飾和改變是在所附的權(quán)利要求書(shū)及它們的等價(jià)物范圍之內(nèi)，則本發(fā)明將包括它們。
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權(quán)利要求
1.編碼APRIL或其片段的DNA序列。
2.編碼APRIL的DNA序列，該序列主要含有SEQ.ID.NO.2所述序列。
3.主要含有SEQ.ID.NO.1的DNA序列，所述DNA編碼多肽，所述多肽主要含有SEQ.ID.NO.2。
4.與至少SEQ.ID.NO.1的片段雜交的DNA序列，所述片段至少包含20個(gè)連續(xù)堿基，所述DNA序列編碼的多肽至少與APRIL的活性位點(diǎn)有30％同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA序列，其中所述序列主要包含帶有保守替換、改變或缺失的SEQ.ID.NO.1。
6.含有編碼APRIL的DNA序列的重組DNA分子，所述序列與表達(dá)控制序列可操作連接。
7.權(quán)利要求6的分子包含SEQ.ID.NO.1。
8.權(quán)利要求6或7的用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主。
9.編碼具有SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列的APRIL的DNA序列。
10.用于產(chǎn)生基本上純的APRIL的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求8的單細(xì)胞宿主的步驟。
11.基本上不含正常結(jié)合的動(dòng)物蛋白的APRIL。
12.權(quán)利要求11的APRIL主要含有SEQ.ID.NO.2。
13.一種藥物組合物，含有治療有效量的APRIL或其活性片段和藥學(xué)上可接受的載體。
14.一種用于預(yù)防或減輕自身免疫疾病嚴(yán)重性的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求13所述的藥物組合物的步驟。
15.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述的APRIL或其活性片段含有SEQ.ID.NO.2或其生物學(xué)活性片段。
16.一種用于預(yù)防或減輕對(duì)移植組織的免疫應(yīng)答嚴(yán)重性的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求13所述的藥物組合物的步驟。
17.用于刺激免疫系統(tǒng)的方法，包括施用權(quán)利要求13所述的組合物。
18.用于抑制免疫系統(tǒng)的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求13所述的藥物組合物的步驟。
19.用于治療癌癥的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求13所述的藥物組合物的步驟。
20.用于鑒定APRIL的受體的方法，包括a.提供APRIL或其片段，b.用可檢測(cè)的標(biāo)記標(biāo)記所述的APRIL或其片段；c.篩選組合物以檢測(cè)與步驟b可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合的受體。
21.權(quán)利要求11的APRIL可溶的生物學(xué)活性片段。
22.含有由選自下列的DNA編碼的氨基酸序列的多肽a.含有SEQ.ID.NO.1的DNA序列；b.與a.中定義的DNA和編碼表達(dá)的與權(quán)利要求12的APRIL至少40％同源的多肽的DNA雜交的DNA序列。
23.與APRIL或其受體或其生物學(xué)活性片段反應(yīng)的抗體制劑。
24.權(quán)利要求23的抗體制劑，包含單克隆抗體。
25.用于產(chǎn)生與APRIL或其受體反應(yīng)的抗體制劑的方法，包括用APRIL或其受體或其抗原片段免疫有機(jī)體的步驟。
26.抗APRIL的反義核酸，包括與至少SEQ.ID.NO.1的一部分雜交的核酸序列。
27.包含權(quán)利要求24所述的抗體制劑的藥物組合物。
28.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)APRIL的方法，包括a.將編碼APRIL的基因?qū)爰?xì)胞；b.使所述的細(xì)胞在一定條件下存活以使所述基因在所述的哺乳動(dòng)物中表達(dá)。
29.治療哺乳動(dòng)物中APRIL相關(guān)疾病的方法a.將治療有效量的含有編碼APRIL的基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞；并且b.在所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述基因。
30.權(quán)利要求29的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述載體是病毒。
32.一種誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，包括施用能夠干擾APRIL與受體結(jié)合的試劑。
33.權(quán)利要求32的方法進(jìn)一步包括施用γ干擾素。
34.一種涉及APRIL和其受體之間的信號(hào)通路的治療、抑制、激活或改變免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予有效量的能干擾APRIL和其受體結(jié)合的阻斷劑的步驟。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述的免疫應(yīng)答涉及人癌細(xì)胞。
36.治療、抑制或改變癌癥進(jìn)程的方法，包括給病人施用有效量的能夠干擾APRIL和受體結(jié)合的阻斷劑。
37.權(quán)利要求36的方法，其中阻斷劑是APRIL或抗-APRIL抗體或其生物學(xué)活性片段的修飾的抑制形式。
38.權(quán)利要求37的方法，其中阻斷劑是抗-APRIL受體的抗體。
39.權(quán)利要求36的方法，其中阻斷劑與至少一種化療劑聯(lián)合施用于病人。
40.權(quán)利要求39的方法進(jìn)一步包括給予所述病人放射治療的步驟。
全文摘要
APRIL,腫瘤壞死因子(TNF)家族的新成員,修飾的APRILs以及包含它們的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1270632SQ98809038
公開(kāi)日2000年10月18日 申請(qǐng)日期1998年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月12日
發(fā)明者J·茨喬普 申請(qǐng)人:阿普泰克R&D公司