專利名稱：抗凍蛋白、dna及其表達(dá)體系的制作方法
在本專利申請中，完整地引用和采用了下列專利英國專利臨時申請?zhí)?112774.69(1991年6月13日提出申請)，美國申請?zhí)?8/060,425(1993年5月11日提出申請)，美國申請?zhí)?8/419,061(1995年4月10日提出申請)，美國申請?zhí)?8/485,647(1995年6月10日提出申請)，加拿大專利申請?zhí)?,110,510(1992年6月12日提出申請)，歐洲專利申請?zhí)?2911435.3(1992年6月12日提出申請)，PCT申請?zhí)朠CT/CA92/00255(1992年6月12日提出申請)，以及美國專利申請?zhí)?8/903,872。本專利申請要求基于美國專利申請?zhí)?8/903,872的優(yōu)先權(quán)。
本發(fā)明的范圍本發(fā)明涉及植物抗凍蛋白、肽和多肽(下文又稱為“AFP”)，它們凝固在冰的晶體上，阻止冰重結(jié)晶，并且保護(hù)在低溫狀況下的脂質(zhì)體、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)、細(xì)胞和有機(jī)體。
本發(fā)明還涉及以幾丁質(zhì)酶和抗凍活性給蛋白質(zhì)編碼的DNA序列，以及在細(xì)菌、酵母、植物和動物中的DNA序列的表達(dá)方法，以便生產(chǎn)有抗凍活性的幾丁質(zhì)酶。
本發(fā)明的背景對于農(nóng)作物的生產(chǎn)，低溫是一種主要的環(huán)境限制因素。例如，暮春的霜凍延誤了種子的萌芽，初秋的霜凍降低了農(nóng)作物收成的質(zhì)量和產(chǎn)量，冬季的低溫降低了越冬作物(例如谷物和果樹)的存活機(jī)會。然而，有些植物能夠長期，耐受住低于冰點的溫度。通過認(rèn)出和分離在這些植物中的有助于形成耐霜凍能力的蛋白質(zhì)，以及相應(yīng)的基因，可以把對霜凍敏感的農(nóng)作物改造成耐霜凍的農(nóng)作物，并延長作物的生產(chǎn)期，。
GUY等人(I-5.1)分析對冷馴化的菠菜組織中的蛋白質(zhì)總含量與在溫暖地區(qū)生長的植物組織中的蛋白質(zhì)總含量進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與植物對寒冷的耐受能力有關(guān)。在冷馴化的葉的提取物中發(fā)現(xiàn)的，分子量為110，82，66，55和13 KD的蛋白質(zhì)，沒有出現(xiàn)在溫暖地區(qū)生長的葉的提取物中。GUY等人(I-5.2)還檢查了冷馴化的菠菜葉中的蛋白質(zhì)總含量，并且觀察了高分子量的蛋白質(zhì)(110，90和79KD)的積聚。對于GUY等人(I-5.1)，在植物內(nèi)部，這些蛋白質(zhì)的位置和功能仍然是未知的。
然而，我們已經(jīng)知道，許多生物有機(jī)體通過避開冰的形成而能夠在低于冰點的溫度條件下存活下來。這個策略要求合成抗凍蛋白(AFP)，這種蛋白質(zhì)又稱為“熱滯后蛋白質(zhì)”(THP)。各種AFP凍結(jié)在冰晶體的表面，防止冰晶的進(jìn)一步生成。各種AFP的存在是由下列研究確定的1)在冰晶形成的過程中，考察冰晶的形狀(III-19、III-35、III-22)，2)測量熱滯后性，這種滯后性是溶液中的冰晶熔化溫度和凍結(jié)溫度的差值(III-19)，以及3)測量對冰晶的重結(jié)晶的抑制能力。
在魚中認(rèn)出出四種不同的AFP類型(II-4)，并且在昆蟲中認(rèn)出出一些不同的THP(III-12)。這些先前的發(fā)現(xiàn)提示了，這種適應(yīng)機(jī)制已經(jīng)在不同的有機(jī)體中獨立的形成，而且這種機(jī)制是在防止在有機(jī)體內(nèi)部生成任何結(jié)冰方面起著作用的。人們通常認(rèn)為，各種AFP不存在于植物當(dāng)中，因為能在低于冰點的溫度條件下長期，存活下來的大多數(shù)植物在它們的組織中實際上有冰形成，通常是在胞間空隙中，以及在木質(zhì)部導(dǎo)管中。KURKELA和FRANCK(I-9.1)報道過，一種在低溫條件下顯示的植物基因給一種蛋白質(zhì)編碼，類似于DAVUS和GEW所報道過的在氨基酸中給比目魚的各種抗凍蛋白編碼的情形(II-4)。KURKELA和FRANCK(I-9.1)未能有足夠數(shù)量的編碼蛋白質(zhì)來確定是否呈現(xiàn)抗凍活性。CUTLER等人(I-1.1)CUTLER等人(I-1.1)指出，被注入了比目魚抗凍蛋白的植物組織顯示出其抗凍活性有輕微的提高。GEORGES等人(I-3.1)使用比目魚抗凍蛋白的一種合成基因來改造谷物的原生質(zhì)體，試圖改善植物的抗凍活性。結(jié)果生成了一種蛋白質(zhì)，但它未能有效地分泌，而且未能檢測出抗凍活性。
盡管從魚類和昆蟲中分離出來的抗凍蛋白已經(jīng)被用于開發(fā)適用于儲存在低溫和低冰點的溫度條件下的食品和生物物質(zhì)的新的添加劑，但這些蛋白質(zhì)仍然未有進(jìn)入市場，因為它們被消費者認(rèn)為是不合適的。例如，把一種魚抗凍蛋白添加到冰琪琳中被認(rèn)為是不可接受的，而把一種植物抗凍蛋白添加到冰琪琳中則被認(rèn)為是可以接受的。從植物中分離出來的AF可望能比那些已經(jīng)被定性為來自動物的抗凍蛋白在市場中有更廣泛的應(yīng)用。
附圖的簡要說明本發(fā)明的首選實施方案將結(jié)合附圖來加說明。這些附圖包括I.植物的寒冷耐受能力

圖1描述了取自生長在不同溫度條件下的冬裸麥葉的細(xì)胞間蛋白質(zhì)的濃度。
圖2描述了分離自生長在不同溫度條件下的冬裸麥葉的胞外蛋白質(zhì)的多肽的“SDS-PAGE”。第一道分子量標(biāo)記；第二道分離自生長在20/16攝氏度(晝/夜)(白天占16小時)的溫度條件下的裸麥作物的胞外多肽；第三道分離自生長在5/2攝氏度(晝/夜)(白天占16小時)的溫度條件下的裸麥作物的胞外多肽；第四道分離自生長在5/2攝氏度(晝/夜)(白天占8小時)的溫度條件下的裸麥作物的胞外多肽。
圖3描述了分離自生長在白天占8個小時的，在不同生長階段的冷馴化冬裸麥葉的胞外蛋白質(zhì)的多肽的“SDS-PAGE”。第一道分子量標(biāo)記；第二道分離自生長在20/16攝氏度(晝/夜)(白天占16小時)溫度條件下生長7天的裸麥作物的胞外多肽；第三道分離自首先生長在20/16攝氏度的溫度條件下生長7天，然后移植到5/2攝氏度(晝/夜)，白天占8個小時的光照體制下再生長28天的裸麥作物的胞外多肽；第四道分離自移植到5/2攝氏度的溫度條件下生長43天的溫度條件下的裸麥作物的胞外多肽；第五道分離自移植到5/2攝氏度的溫度條件下生長50天的溫度條件下的裸麥作物的胞外多肽；第六道分離自移植到5/2攝氏度的溫度條件下生長71天的溫度條件下的裸麥作物的胞外多肽；第七道分離自移植到5/2攝氏度的溫度條件下生長95天的溫度條件下的裸麥作物的胞外多肽。
圖4描述了分離自馴化冬裸麥葉的胞外蛋白質(zhì)的多肽的“SDS-PAGE”。第一道分子量標(biāo)記；第二道分離自首先生長在20/16攝氏度的溫度條件下生長7天，然后移植到5/2攝氏度(晝/夜)，白天占8個小時的光照體制下再生長42天的裸麥作物的胞外多肽；第三、四和五道分別是分離自首先經(jīng)過第二道所描述的生長過程，然后再移植到20/16攝氏度，白天所占的時間為16個小時的光照體制下分別再生長4天、6天和8天的裸麥作物的胞外多肽；圖5描述了分離自生長在各種不同溫度條件下的裸麥葉的，經(jīng)過高度精密過濾的胞外提取物的冰晶形成能力。
圖6說明了在冷馴化的冬裸麥葉的胞外提取物中的抗凍活性?？箖龌钚允峭ㄟ^利用一臺毫微米滲壓計(生產(chǎn)廠家美國紐約州哈特福特市CLIFTON技術(shù)物理公司，II-5)觀察冰晶的形態(tài)來測定的。在C、D、E和F中的冰晶取向A軸線表示沿著基本平面生長，而C軸線則表示垂直于基本平面生長。
圖7說明了利用柱型色層分離法來分離自冷馴化的裸麥葉的胞外提取物的組分。
圖8說明了分離自冷馴化冬裸麥的葉的部分提純和濃縮的抗凍蛋白的冰晶形態(tài)。A如圖6所描述的晶體的取向。B、C和D在溫度下降的過程中，冰晶的生長順序。B不完全的雙錐形；C雙錐形；D針狀晶體。
圖9與在圖8中所示的每個280毫微米峰值的柱上分級相關(guān)的多肽“SDS-PAGE”。
圖10描述了利用三羥基麥黃酮緩沖液(TRIS-TRICNEBUFFERS)通過“SDS-PAGE”從冷馴化的冬裸麥葉分離出來的胞外多肽。多肽被從凝膠體中洗提出來，被用于檢驗抗凍活性。分子量為161，93到99，33，31，27，23，15和11 KD的多肽全部顯示出抗凍活性。
圖11說明了分離自A沒有經(jīng)過馴化的冬裸麥葉，B經(jīng)過冷馴化的裸麥葉的胞外提取物。多肽被“SDS-PAGE”溶解并且分離出來，然后使用抗幾丁質(zhì)酶抗血清作為主要抗體對其進(jìn)行測試。分子量標(biāo)準(zhǔn)(以kD為單位)在C列中給出。
圖12說明了從冷馴化冬裸麥的葉中提取的一個胞外提取物的一種免疫印跡分析。多肽被“SDS-PAGE”分離出來，印跡到硝化纖維上，然后使用抗幾丁質(zhì)酶抗血清作為主要抗體進(jìn)行測試。
圖13說明了使用從冷馴化的冬裸麥作物上分離得到的胞外提取物對重結(jié)晶進(jìn)行抑制。當(dāng)稀釋到1∶10,000時，蛋白質(zhì)的濃度大約為每公升28微克。當(dāng)冷卻至-20攝氏度，然后在-8攝氏度下6個小時后，形成片條。(備注讓片條在-8攝氏度的溫度下“退火”6個小時，以觀察冰晶的重結(jié)晶。這里的照片是由美國國家大氣研究中心CHARLES KNIGHT博士提供的。)圖14說明了在非馴化的葉中(σ)、在經(jīng)過冷馴化的葉中(λ)、以及為了養(yǎng)活胞外蛋白質(zhì)含量而在凍結(jié)之前被抽提的經(jīng)過冷馴化的葉中(υ)的冷凍傷害的程度，以泄漏來度量。這些葉被放進(jìn)水中，冷卻至發(fā)生結(jié)冰的溫度，然后在這個溫度下維持22分鐘。在此之后，從冷凍浴中把葉取出來，放到冰上慢慢解凍。離子泄漏可以計算為葉被凍結(jié)之后的溶液導(dǎo)電率除以煮沸后的溶液的總導(dǎo)電率。得到的數(shù)據(jù)用未經(jīng)凍結(jié)的樣品的離子泄漏進(jìn)行矯正，然后以平均值±SE的形式給出，這里N等于3。致命的傷害發(fā)生在組織出現(xiàn)在50％或更大的離子泄漏時。II.冷馴化草本植物的抗凍活性圖15說明了非馴化(NA)和冷馴化(CA)的植物的葉中的抗凍活性。每種植物葉的胞外提出物中的抗凍活性是通過觀察在溶液中生長的冰晶的形態(tài)來測定的。在所有非馴化的葉的提出物中沒有觀察到抗凍活性。經(jīng)冷馴化的羽衣甘藍(lán)葉和冬canola葉的提出物，以及經(jīng)過冷馴化的冬裸麥和春季裸麥、冬小麥和春季小麥、冬大麥和春季燕麥的葉的提出物都顯示出抗凍活性。所有照片都是以相同的放大倍數(shù)拍攝的。放大條表示17微米。
圖16在下列各種作物經(jīng)受冷馴化期間.在其葉中的胞外蛋白質(zhì)積聚——A冬裸麥、冬大麥和冬小麥；B春季裸麥、春季小麥、春季燕麥和玉米；C菠菜、冬canola和羽衣甘藍(lán)；D春季canola和煙草。植物在非馴化的條件下生長(0時間點)，然后轉(zhuǎn)移到進(jìn)行冷馴化的條件下(5/2攝氏度)經(jīng)歷1至7個星期，。蛋白質(zhì)濃度以平均值±SE的形式表示出來，這里N等于3。
圖17冬裸麥cv Voima中的胞外多肽的積聚和抗凍蛋白的免疫檢測。A從生長期為3星期的非馴化(NA)的裸麥(第一道)分離出濃縮的胞外提出物，并各自從生長期分別為一星期，(第二道)、兩星期，(第三道)、四星期，(第四道)、七星期，(第五道)和九星期，(第六道)，溫度條件為5/2攝氏度(晝/夜)的，經(jīng)過冷馴化的(CA)麥分離出濃縮的胞外提取物，然后通過SDS-PAGE從這些濃縮胞外提出物中分離出等量的多肽(每道5微克)。把裝載有等量(每道一微克)的濃縮胞外提取物SDS-聚丙烯酰胺凝膠體印跡出來，然后使用B進(jìn)行測試。B為參照冬裸麥32kD類似葡聚糖酶的蛋白質(zhì)制備的抗類似葡聚糖酶的蛋白質(zhì)抗血清(稀釋比為1∶10000)；C為參照冬裸麥35kD抗類幾丁質(zhì)酶蛋白制備的抗類幾丁質(zhì)酶蛋白抗血清(稀釋比為1∶10000)；而D為參照冬裸麥25kD的類似西非竹芋精的蛋白質(zhì)制備的抗類似西非竹芋精的蛋白質(zhì)抗血清(稀釋比為1∶10000)。相應(yīng)的每種多肽的明確的檢測在右邊指示出來。左邊數(shù)字是指Bio-Rad低分子量標(biāo)志。CLP，類幾丁質(zhì)酶蛋白；GLP，類葡聚糖酶蛋白；TLP，類西非竹芋精的蛋白質(zhì)。
圖18說明了在非馴化(NA)的和經(jīng)過完全冷馴化(CA)的谷物中的胞外多肽的積聚。在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠體中分離出等量的胞外多肽(每道1微克)。A一種染上bio-Rad銀跡的凝膠體。這種凝膠體被使用B、C和D來印跡和測試。B為抗類似葡聚糖酶的蛋白質(zhì)抗血清(稀釋比為1∶10000)；C為抗類幾丁質(zhì)酶蛋白抗血清(稀釋比為1∶10000)；而D為抗類西非竹芋精蛋白抗血清(稀釋比為1∶10000)。相應(yīng)的每種多肽的明確的檢測在右邊指示出來。左邊數(shù)字是指Bio-Rad低分子量標(biāo)示物。
圖19說明了在非馴化(NA)的和經(jīng)過完全冷馴化(CA)的谷物中的胞外多肽的積聚。在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠體中分離出等量的胞外多肽(每道1微克)。A一種染上Bio-Rad銀色的凝膠體。在轉(zhuǎn)移之后，使用B、C和D來對免疫印跡進(jìn)行測試。B為抗類似葡聚糖酶的蛋白質(zhì)抗血清(稀釋比為1∶10000)；C為抗類幾丁質(zhì)酶蛋白抗血清(稀釋比為1∶10000)；而D為抗類西非竹芋精蛋白抗血清(稀釋比為1∶10000)。相應(yīng)的每種多肽的明確的檢測在右邊指示出來。左邊數(shù)字是指Bio-Rad低分子量標(biāo)示物的分離。
圖20說明了在分離自非馴化的(白色帶條)和經(jīng)過冷馴化的(有陰影的帶條)的單子葉植物(A)和雙子葉植物(B)中存在的總糖量。利用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)來把糖的濃度計算為毫克/克FW，并且表示為平均值+SE，其中n等于3。III.對具有抗凍活性的類幾丁質(zhì)酶蛋白的DNA分離和蛋白質(zhì)序列圖21描述了一種具有抗凍活性的類幾丁質(zhì)酶蛋白的DNA和蛋白質(zhì)序列。ACH-9全長DNA和氨基酸序列；BCH-9 DNA和氨基酸序列(缺少預(yù)測的信號肽編碼區(qū))；CCH-9，包括一個由20種氨基酸組成的前置序列，這個序列從植物細(xì)胞中被除去(最后提純得到的，具有幾丁質(zhì)酶和抗凍活性的蛋白質(zhì)缺少這個前置序列)；DCH-9氨基酸序列，缺少由20種氨基酸組成的一個假定的信號序列。
圖22描述了一種具有抗凍活性的類幾丁質(zhì)酶蛋白的DNA和蛋白質(zhì)序列。ACH-46 DNA和氨基酸序列(被除去的未翻譯的序列和假定的前置序列)；BCH-46 DNA和氨基酸序列(被除去的未翻譯的序列)；CCH-46序列(被除去的未翻譯的序列)；DCH-46(被除去的未翻譯的序列)。
圖23是一個由分離自不同植物的幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列組成的多重隊列。1是分離自裸麥種子的幾丁質(zhì)酶-a的氨基酸序列(蛋白質(zhì)信息源登記號JC 2071)，rye(裸麥)是分離自裸麥種子的幾丁質(zhì)酶-c(蛋白質(zhì)信息源登記號JN 0884、pCHT 9和pCHT 46是兩種具有抗凍活性的冬裸麥類幾丁質(zhì)酶蛋白的預(yù)測的氨基酸序列)。編碼類幾丁質(zhì)酶蛋白的DNA序列的表達(dá)法圖24說明了在大腸桿菌中的DNA序列和類幾丁質(zhì)酶蛋白的表達(dá)法。全部細(xì)胞提取物是使用未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞(第1道和第31道)和IPTG-誘導(dǎo)細(xì)胞(第2道和第4道)制備出來的，采用SDS-PAGE分離，并且經(jīng)過免疫印跡。一種由抗類幾丁質(zhì)酶蛋白抗血清認(rèn)出的，分子量為32 kD的蛋白質(zhì)，很明顯存在于誘導(dǎo)細(xì)胞中(第2道和第4道)。圖中還說明了用經(jīng)過冷馴化的冬裸麥(M)提純得到的類幾丁質(zhì)酶蛋白。
圖25A說明了在酵母中的DNA序列和類幾丁質(zhì)酶蛋白的表達(dá)法。酵母細(xì)胞在YPD介質(zhì)中分別生長了24個小時(第1道)，和48小時(第2道)。細(xì)胞經(jīng)過離心處理，上層清液在與樣品緩沖液混合之后，多肽被SDS-PAGE分離出來。在兩道中，都存在一種分子量為32kD的多肽。
圖25B說明了對帶有抗類幾丁質(zhì)酶蛋白抗血清的上層清液和細(xì)胞切片進(jìn)行一種免疫印跡分析。取自上層清液(第3道和第4道)和細(xì)胞切片(第1道和第2道)的蛋白質(zhì)被溶解，然后采用SDS-PAGE分離，并且經(jīng)過免疫印跡。大多數(shù)蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)存在于上層清液(第3道和第4道)中。圖中還說明了用經(jīng)過冷馴化的冬裸麥提純得到的類幾丁質(zhì)酶蛋白。
圖26說明了采用SDS-PAGE分離得到的熱穩(wěn)定的抗凍蛋白。從經(jīng)過冷馴化的冬裸麥葉分離出來的胞外提取物分別被加熱到60攝氏度，歷時30分鐘(A道)，和加熱到100攝氏度，歷時10分鐘。C道顯示出BioRad范圍寬廣的分子量標(biāo)示物(207，121，81，51.2，33.6，28.6，21.1和7.5kD)。GLP類葡聚糖酶蛋白；TLP類西非竹芋精蛋白。
本發(fā)明的小結(jié)過去，人們一般認(rèn)為，與植物的抗凍活性相關(guān)的機(jī)制存在于細(xì)胞的內(nèi)部，因而應(yīng)當(dāng)保護(hù)細(xì)胞，使之不會從內(nèi)部形成冰晶。沒有人曾經(jīng)想到過，在植物內(nèi)部有存在抗凍蛋白和有形成冰晶核能力的蛋白質(zhì)的可能性。此外，沒有人曾經(jīng)想到過存在這樣的可能性這些蛋白質(zhì)能夠定位在細(xì)胞的外側(cè)，為保護(hù)植物免受霜凍之害執(zhí)行著一種完全不同的機(jī)制。令人十分驚奇的是，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，有一組多肽積聚在細(xì)胞的外面，并且顯示出形成冰晶的能力和抗凍活性，從而能夠控制在細(xì)胞之間的空間和木質(zhì)部中的冰晶生長。在它們的天然的形式中，這些蛋白質(zhì)也呈現(xiàn)出酶活性，例如葡聚糖和幾丁質(zhì)酶的水解，這種水解作用分改變植物的細(xì)胞壁，并且/或者抑制低溫病原體的生長。這些胞外多肽位于植物的非原質(zhì)體的可提取部分，這個部分包括血漿膜的外表面、血漿膜和細(xì)胞壁之間的區(qū)域、細(xì)胞壁、細(xì)胞中層、胞間空隙、以及木質(zhì)部的管胞和導(dǎo)管。應(yīng)當(dāng)指出，在本專利說明書的全部內(nèi)容中，術(shù)語“胞外”均具有上述含義。
冬裸麥?zhǔn)且环N能夠在低于-20攝氏度的溫度條件下存活下來的，越冬的一年生草本植物。當(dāng)冬裸麥的葉凍結(jié)時，冰在葉肉內(nèi)部的胞間空隙中和在木質(zhì)部導(dǎo)管中生長(III-40)。凍結(jié)的植物組織能否存活取決于能否阻止由于細(xì)胞間的冰晶的生長導(dǎo)致細(xì)胞損壞。在冷馴化期間積聚在冬裸麥葉的非原質(zhì)體中的各種抗凍蛋白(植物抗凍蛋白、肽和多肽)有能力改變冰晶在凍結(jié)的組織中生長的狀況(III-35和III-22)，而且相關(guān)于冬裸麥葉所具有的較強(qiáng)的耐受凍結(jié)的能力(III-35)。除此之外，如免疫定位所示，抗凍蛋白是與表皮相關(guān)的，并且是與經(jīng)過冷馴化的冬裸麥的葉的胞間空隙周圍的葉肉細(xì)胞相關(guān)的(III-2)。這些位置相當(dāng)于在葉表面上的，以及在葉肉內(nèi)部的胞間空隙中的已知的生成冰的地方(III-40和III-41)，并且提示抗凍蛋白還能夠阻止細(xì)胞的接種凍結(jié)(III-41)。
其分子量從16到35kD的六種抗凍蛋白已經(jīng)從經(jīng)過馴化的冬裸麥的葉的葉肉中分離出來(III-22)。它們與三類與發(fā)病機(jī)理有關(guān)的(PR)蛋白質(zhì)的成員相類似有兩種抗凍蛋白是類似于幾丁質(zhì)酶的蛋白質(zhì)(CLPs)，有兩種抗凍蛋白是類似于β-1，3-葡聚糖酶的蛋白質(zhì)(TLPs，III-23)。一種類幾丁質(zhì)酶蛋白從經(jīng)過冷馴化的冬裸麥葉中提純?yōu)橥|(zhì)，并且顯示出同時具有抗凍活性和幾丁質(zhì)酶活性(III-23)。因為這；些低溫裸麥蛋白質(zhì)顯示出兩種活性，它們可以在抵抗不明確的疾病方面起作用(幾丁質(zhì)酶活性)，也可以在增強(qiáng)耐受霜凍的能力方面起作用(抗凍活性，III-48)。
如果改變在非原質(zhì)體中的冰晶的生長的狀況的能力是抗凍活性的一個重要的組成部分，那么，它可能是在植物當(dāng)中一種十分普遍的機(jī)制。對各種越冬植物的考察結(jié)果已經(jīng)表明，在從許多植物的組織中榨出的樹液當(dāng)中，存在抗凍活性，這些植物包括21種雙子葉植物和9種單子葉植物(III-19，III-17，III-52，III-11，III-12)。一種蛋白質(zhì)已經(jīng)從白英(Solanum dulcamara，一種又苦又甜的茄屬蔓生木本植物)(III-10)。茄屬植物的抗凍蛋白是一種大分子量(67kD)的糖基化蛋白質(zhì)，通常具有較高的甘氨酸含量(大約24％)，并且具有一種獨特的N-端氨基酸序列(III-1)。
從植物來源分離出來的抗凍蛋白是那些涉及改變冰晶的生長狀況、減少在低溫條件下由微生物引起的疾病、腐爛和損壞，以及改善曝露于低溫所造成的后果，包括生產(chǎn)和儲存冷凍食品，以及生物物質(zhì)的低溫儲存。給抗凍蛋白編碼的基因在為生產(chǎn)更多用作添加劑的抗凍蛋白的表達(dá)系統(tǒng)方面是十分重要的，在為增加抗凍蛋白的合成以促進(jìn)存活和養(yǎng)活在寒冷環(huán)境中的傷害和疾病方面也是十分重要的。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，我們制備了抗凍能力強(qiáng)的植物所共有的一些抗凍蛋白。這些蛋白質(zhì)位于胞外面，以控制冰晶在植物內(nèi)部的木質(zhì)部和胞間空隙中的生長。具有抗凍活性的多肽是從分別具有如下近似表觀分子量的一組多肽中選擇出來的大約5到9kD、大約9到11kD、大約11到15kD、大約21到23kD、大約24到27kD、大約30到31kD、大約31到33kD、大約32到36kD、大約60到68kD、大約89到100kD，以及大約161kD，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，我們還提供了具有上述分子量，和分離自對霜凍具有耐受能力的植物的多肽。在這些多肽中，有一些是冰晶的成核劑，它們植物的組織的胞外空間中啟動冰晶生長的過程。有一些多肽是酶，它們能夠改變植物的細(xì)胞壁和/或抑制植物胞間空隙中的病原體的生長。
根據(jù)本發(fā)明的各個不同的方面，多肽所顯示的特征是它們的表觀分子量它們的表觀分子量是與它們在SDS-PAGE凝膠體中相對于已知的分子量標(biāo)示物的遷移的相關(guān)的。可以理解為，本發(fā)明的各種多肽在不同類型的凝膠體中可以發(fā)生不同的遷移，特別是當(dāng)凝膠體在的丙烯酰胺的濃度不同時，或還原條件不同時，或所使用的操作緩沖液不同時，情形更是這樣。因此，本發(fā)明的分子量特征打算被用于代替等量的多肽，因為等量的多肽在不同的凝膠體中的分子量會略有差異。除此之外，胞外多肽被發(fā)現(xiàn)存在于分離自植物的組織的，含有全部可溶性蛋白質(zhì)的提取物中。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，我們制備了分離自單子葉草本植物和雙子葉草本植物的抗凍蛋白?？箖龌钚院腿康鞍踪|(zhì)積聚被發(fā)現(xiàn)于分離自生長在低溫環(huán)境中的8種草本植物的葉細(xì)胞外提取物中，其中包括單子葉草本植物(冬裸麥和春季裸麥、冬小麥和春季小麥Triticum aestivum L.、冬大麥Hordeum vulgare l.、春季燕麥Avena sativaL.)和雙子葉草本植物(冬canola Brassica napul L.和羽衣甘藍(lán)Brassicaoleracea L.)。能夠改變冰晶生長狀況的胞外蛋白質(zhì)的分泌物是這些單子葉草本植物和雙子葉草本植物能夠越冬存活的機(jī)制的一個方面。除此之外，蛋白質(zhì)分泌物進(jìn)入非原質(zhì)體內(nèi)，并伴隨著抗凍活性的增強(qiáng)，是所有生長在寒冷環(huán)境中的禾本科的所有植物的共同響應(yīng)。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種具有抗凍活性的被分離出來的多肽，選取自由禾本科成員和十字花科成員構(gòu)成一組植物中。在一個優(yōu)先考慮的實施方案中，禾本科植物選自由大麥、小麥和裸麥、春季裸麥、冬裸麥、春季小麥、冬小麥、冬大麥和春季燕麥構(gòu)成的一組植物中，而十字花科植物則選自羽衣甘藍(lán)和冬canola。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，某些單子葉植物，在經(jīng)過誘導(dǎo)或馴化之后，會產(chǎn)生一系列與發(fā)病機(jī)理相關(guān)的蛋白質(zhì)有關(guān)的抗凍蛋白，如經(jīng)過冷誘導(dǎo)的的蛋白質(zhì)和免疫印跡的N端序列所示。我們從禾本科植物制備了相關(guān)的植物，包括裸麥、小麥、和大麥，在冷馴化期間積聚了類似于與發(fā)病機(jī)理相關(guān)的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明還涉及冷誘導(dǎo)的與發(fā)病機(jī)理相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們是從一種單子葉草本植物中分離出來的，并且是具有抗凍活性的。單子葉草本植物優(yōu)先從禾本科中選取。在一種優(yōu)選的實施方案中，單子葉草本植物選自由大麥、燕麥和裸麥、春季裸麥、冬裸麥、春季小麥、冬小麥、和冬大麥。本發(fā)明還包括每種多肽的一種擬態(tài)。在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的各種多肽可以選取自由類幾丁質(zhì)酶蛋白、類西非竹芋精蛋白、以及葡糖酶構(gòu)成的一組蛋白質(zhì)。這些多肽可以用于產(chǎn)生抗凍蛋白，用以增強(qiáng)植物和微生物中的抗凍活性，抑制生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中的冰晶的重結(jié)晶，減少在生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中由于微生物在低溫條件下的活性而引起的疾病、腐爛或損壞，細(xì)胞的超低溫冷藏，細(xì)胞的超低溫保護(hù)，人體血小板的冷保護(hù)，以及殺死腫瘤細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，可能會形成對上述多肽的一個或多個抗體，例如在免疫測定中被選擇適用于測定抗凍蛋白的水平，或用于確定類似的抗凍蛋白是否會由其它植物產(chǎn)生。有三種胞外抗凍蛋白從冬裸麥中分離現(xiàn)來，它們相當(dāng)于一種32-kD的類似葡聚糖酶的蛋白質(zhì)、一種32-kD的類似幾丁質(zhì)酶的蛋白質(zhì)、以及一種25-kD的西非竹芋精的蛋白質(zhì)，它們被提純出來，并且相對于它們當(dāng)中的每一種培養(yǎng)出抗血清。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，在冷凍食品的制備過程中，可以加入一種或多種上述的多肽。具體地說，在冰琪琳和水果制品中加入了一種或多種多肽，以便獲得具有微小晶體結(jié)構(gòu)的上乘的產(chǎn)品。此外，在生產(chǎn)組織的冷藏保護(hù)、各種組織的冷藏、以及種質(zhì)的冷藏方面，多肽也是很有用的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，我們確定了多種糖存在于經(jīng)過冷馴化的胞外提取物中，并且改變了胞外冰晶的生長狀況，同時抑制了冰晶的重結(jié)晶。這些糖增強(qiáng)了抗凍蛋白的活性。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，兩種分離自冬裸麥的類幾丁質(zhì)酶蛋白被利用分子生物技術(shù)復(fù)制出來，并且同時用細(xì)菌系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)表達(dá)出來。被表達(dá)的蛋白質(zhì)同時顯示出幾丁質(zhì)酶活性和抗凍活性。本發(fā)明包括類幾丁質(zhì)酶蛋白的DNA和蛋白質(zhì)序列、對上述序列的任何修正、這些序列的表達(dá)法、以及它們在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用。本發(fā)明是從一種單子葉植物中分離出來的一種核酸分子，給一種抗凍蛋白編碼。在一個優(yōu)選的實施方案中，分子具有在圖21.a.、圖21.b、或圖22.a、或圖22.B中的DNA序列。本發(fā)明還包括一種這樣的分子，其序列與在圖21.a.、圖21.b、或圖22.a、或圖22.b中的DNA序列的全部或部分大體上是相同的(下面將參照序列特征的數(shù)量對這種同一性進(jìn)行討論)這種分子可以從由mRNA、cDNA、有義鏈(sense)DNA、反義鏈(anti-sense)DNA、單鏈DNA、以及雙鏈DNA構(gòu)成的一組核酸中選取。本發(fā)明還涉及由核酸分子編碼的一種多肽，以及一種提純和分離得到的多肽的擬態(tài)。在一個優(yōu)選的實施方案中，多肽具有在圖21.a.、圖21.b、圖21.c、圖21.d、圖22.a、圖22.B、圖22.c、或圖22.d中所示的氨基酸序列。在另一個實施方案中，多肽可以大體上與在圖21.a.、圖21.b、圖21.c、圖21.d、圖22.a、圖22.B、圖22.c、或圖22.d中所示的氨基酸序列的全部相同或部分相同。
本發(fā)明還涉及給多肽信號序列編碼的DNA序列，這種多肽信號序列讓分泌物離開細(xì)胞。本發(fā)明包括一種分子，其序列大體上與在圖21.a.、圖21.c、圖21.d、圖22.B、或圖22.d中所示的DNA序列的全部相同。這種分子可以從由mRNA、cDNA、有義鏈DNA、反義鏈DNA、單鏈DNA、以及雙鏈DNA構(gòu)成的一組核酸中選取。本發(fā)明還涉及由核酸分子編碼的一種多肽，以及一種提純和分離得到的多肽的擬態(tài)。在一個優(yōu)選的實施方案中，多肽具有在圖21.a.、圖21.c、圖21.d、圖22.B、或圖22.d中所示的氨基酸序列。在另一個實施方案中，多肽可以大體上與在圖21.a.、圖21.c、圖21.d、圖22.B、或圖22.d中所示的氨基酸序列的全部相同或部分相同。這種目標(biāo)序列可以用于把蛋白質(zhì)分泌物導(dǎo)入一個轉(zhuǎn)基因有機(jī)體內(nèi)或表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)。表達(dá)的主體可以是植物、植物細(xì)胞、海藻細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、真菌類、動物、以及動物細(xì)胞。
本發(fā)明還包括一個給類幾丁質(zhì)酶蛋白編碼的基因表達(dá)系統(tǒng)，包括一個表達(dá)矢量和嵌入在這個表達(dá)矢量內(nèi)的類幾丁質(zhì)酶蛋白的cDNA。在一個優(yōu)選的實施方案中，表達(dá)矢量是大腸桿菌質(zhì)體pET 12a。在另一個實施方案中，這個系統(tǒng)由Pichia矢量pGAPZαA構(gòu)成。在一個優(yōu)選的實施方案中，這個系統(tǒng)包括在圖21.a.、圖21.b、圖22.a、或圖22.b中所示的類似幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列。本發(fā)明還包括由系統(tǒng)改造的一種植物、植物細(xì)胞、動物、動物細(xì)胞、細(xì)菌、真菌類、或酵母。本發(fā)明的另個方面包括一種表達(dá)類幾丁質(zhì)酶蛋白的方法，這種方法由改造一種帶有類幾丁質(zhì)酶蛋白DNA表達(dá)矢量的表達(dá)主體和培養(yǎng)表達(dá)主體構(gòu)成。這種表達(dá)主體可以是一種植物、植物細(xì)胞、海藻細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、真菌類、動物、以及動物細(xì)胞。表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物可以用于產(chǎn)生抗凍蛋白，增強(qiáng)植物、動物、微生物體的耐嚴(yán)寒能力和抵抗低溫度引起的疾病的能力，抑制生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中的冰晶的重結(jié)晶，細(xì)胞的超低溫冷藏，細(xì)胞的超低溫保護(hù)，人體血小板的冷保護(hù)，以及殺死腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及給經(jīng)過冷誘導(dǎo)的內(nèi)幾丁質(zhì)酶編碼的DNA序列，這種內(nèi)幾丁質(zhì)酶是從單子葉植物和/或禾本科植物的所有成員在分離得到的，其用法與在這項專利申請中對冬裸麥序列的用法的描述相同。
本發(fā)明還涉及被抗凍蛋白DNA序列改造的有機(jī)體(植物、動物和微生物)，以促進(jìn)在冷凍儲存期間的存活能力，越冬的存活能力和/和在轉(zhuǎn)基因的有機(jī)體中的抗凍活性。有機(jī)體可以被改造用于過度地生產(chǎn)蛋白質(zhì)，而抗凍蛋白也允許有機(jī)體本身在接近零攝氏度或在低于攝氏零度的溫度條件下儲存，而允許繼續(xù)對它們進(jìn)行工作。因為許多細(xì)菌1動物、植物和酵母細(xì)胞譜系對霜凍和寒冷是十分敏感的。
本發(fā)明是從一種單子葉植物中分離出來的一種核酸分子，給一種抗凍蛋白編碼。在一個實施方案中，核酸分子具有在圖21.a.、圖21.b、或圖22.a、或圖22.b中的DNA序列。核酸分子可以省略掉在圖21或圖22中所示的目標(biāo)序列。這種分子最好有40％的序列與在圖21.a.、圖21.b、或圖22.a、或圖22.b中的DNA序列的全部相同或部分相同。這種分子最好選取自由mRNA、cDNA、有義鏈DNA、反義鏈DNA、單鏈DNA、以及雙鏈DNA構(gòu)成的一組核酸中選取。本發(fā)明還包括這樣的一些核酸分子，它們?nèi)鐖D21和圖22中的核酸分子那樣給同樣的氨基酸序列編碼。本發(fā)明還包括這樣的一種核酸分子，這種分子給一種類似幾丁質(zhì)酶的防凍多肽編碼，這種多肽與圖22(a)中的340至744各個位置的編碼鏈核酸分子雜交，其過程在一種嚴(yán)格由0.2×SSC到2×SSC，0.1％的SDS(十二烷基磺酸鈉)組成的洗提液中，在溫度為42攝氏度的溫度條件下進(jìn)行。本發(fā)明的另一個實施方案還包括一種這樣的核酸分子，這種分子給一種類似幾丁質(zhì)酶的抗凍蛋白編碼，這種蛋白質(zhì)與圖21(a)中的541至745各個位置的編碼鏈核酸分子雜交，其過程在一種嚴(yán)格由0.2×SSC到2×SSC，0.1％的SDS組成的洗提液中，在溫度為42攝氏度的溫度條件下進(jìn)行。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種由本發(fā)明的一種核酸分子編碼的多肽，正如在前一段所描述的那樣。本發(fā)明還包括經(jīng)過提純和分離得到的多肽的一種擬態(tài)。這種多肽最好包括在圖21(a)、圖21(b)、圖21(c)、圖21(d)、圖22(a)、圖22(b)、圖22(c)、或圖22(d)中所示的氨基酸序列。在另一個實施方案中，這種多肽包括有至少40％的序列與在圖21(a)、圖21(b)、圖21(c)、圖21(d)、圖22(a)、圖22(b)、圖22(c)、或圖22(d)中所示的氨基酸序列全部相同或部分相同。
本發(fā)明和一種變異包括分離自一種單子葉植物的，經(jīng)過冷誘導(dǎo)的一種防凍多肽，或分離自一種單子葉植物的，經(jīng)過冷誘導(dǎo)的一種與發(fā)病機(jī)理相關(guān)的蛋白質(zhì)。這種單子葉植物最好選自禾本科。這種單子葉植物最好選自由大麥、小麥和裸麥、春季裸麥、春季小麥、冬小麥、冬大麥、和春季燕麥組成的一組禾本科植物。本發(fā)明還包括這些多肽的擬態(tài)。
本發(fā)明包括一種具有抗凍活性的被分離出來的多肽，選取自由大麥、小麥和裸麥、春季裸麥、春季小麥、冬小麥和冬大麥、冬canola、春季燕麥和羽衣甘藍(lán)組成的一組植物。這種多肽最好選取自由幾丁質(zhì)酶、西非竹芋精、和葡聚糖酶組成的一組酶。這種多肽對于生產(chǎn)抗凍蛋白、增強(qiáng)植物和微有機(jī)體對嚴(yán)寒的耐受能力、增強(qiáng)處在低于零攝氏度的溫度條件下的植物、動物和微生物在野外的存活能力和產(chǎn)量，抑制在生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中的冰晶的重結(jié)晶，細(xì)胞的冷藏，細(xì)胞的低溫保護(hù)，人體血小板的冷保護(hù)，以及殺死腫瘤細(xì)胞是十分有用的。
本發(fā)明還包括一種NDA重組體，這種重組體包括本發(fā)明的一種DNA分子和一個促進(jìn)劑區(qū)，它們在功能上是互相鏈接的，從而能使促進(jìn)劑增強(qiáng)在宿主細(xì)胞中的上述DNA的分子的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還包括表達(dá)一種幾丁質(zhì)酶基因的一個系統(tǒng)，這個系統(tǒng)包括一種表達(dá)矢量和嵌入在這個表達(dá)矢量中的幾丁質(zhì)酶cDNA。這種表達(dá)矢量最好包括一個質(zhì)體，例如大腸桿菌矢量(例如pET 12a)。這個表達(dá)矢量也可以是Pichia矢量(例如pGAPZαA)。在這個表達(dá)系統(tǒng)中，幾丁質(zhì)酶DNA最后包括在圖21(a)、圖21(b)、或圖22(a)、或圖22(b)中的DNA序列的全部或部分。本發(fā)明還包括被這個系統(tǒng)改造的一種植物、植物細(xì)胞、動物、動物細(xì)胞、細(xì)菌、和酵母。
在另一個實施方案中，本發(fā)明是一個表達(dá)幾丁質(zhì)酶的方法。這個方法包括把一種帶有一個幾丁質(zhì)酶DNA矢量的表達(dá)宿主加以改造，并且培養(yǎng)這個表達(dá)宿主。在這個方法中，表達(dá)宿主最好選取自由一種植物、植物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、真菌類、原生動物、海藻、動物、和動物細(xì)胞組成的一組生物。這個表達(dá)系統(tǒng)對于下列工作是特別有用的生產(chǎn)抗凍蛋白、增強(qiáng)植物、和微生物體對嚴(yán)寒的耐受能力、增強(qiáng)處在低于零攝氏度的溫度條件下的植物、動物和微生物在野外的存活能力和產(chǎn)量，抑制在生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中的冰晶的重結(jié)晶，細(xì)胞的冷藏，細(xì)胞的低溫保護(hù)，人體血小板的冷保護(hù)，以及殺死腫瘤細(xì)胞等。
本發(fā)明還包括一種核苷序列，這種序列以由編碼鏈的目標(biāo)序列或其補(bǔ)足物所構(gòu)成的植物中的蛋白質(zhì)分泌物為目標(biāo)，如圖21(a)，位置1到60位所示。這種以植物中的蛋白質(zhì)分泌物為目標(biāo)的核苷序列最好包括編碼鏈及其補(bǔ)足物，如圖22(a)，位置1到60位所示。
本發(fā)明一種增強(qiáng)抗凍活性的方法，這種方法包括把防凍多肽結(jié)合起來，以提高防凍多肽的活性，從而抑制冰晶的重結(jié)晶，并且改變冰晶的正常生長狀況。本發(fā)明包括一種由一種或多種抗凍蛋白與一種或多種糖結(jié)合所構(gòu)成的一種組份。本發(fā)明的這些多肽可以與一種糖結(jié)合起來使用，例如可以用來產(chǎn)生抗凍蛋白，增強(qiáng)處在低于零攝氏度的溫度條件下的植物、動物、微生物體在野外的存活能力和產(chǎn)量，抑制生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中的冰晶的重結(jié)晶，細(xì)胞的超低溫冷藏，細(xì)胞的超低溫保護(hù)，人體血小板的冷保護(hù)，以及殺死腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的這些多肽可以用于抑制在某種植物、某種冷凍食品或任何冷藏生物物質(zhì)中，由某種低溫病原體引起的疾病的發(fā)生和發(fā)展，以及損壞。本發(fā)明還包括一個從植物材料或重組體表達(dá)系統(tǒng)分離出抗凍蛋白的方法，這種方法包括把可溶性的提取物到最少大約60攝氏度的溫度，然后離心脫水或過濾，除去變性的蛋白質(zhì)和可溶性物料。本發(fā)明還涉及到一種給一種分離自一種單子葉植物的防凍多肽編碼的cDNA。這種單子葉植物最好選取自禾本科或小麥屬植物(最好選取冬裸麥)。這種cDNA最好還給多肽易位的一個信號序列編碼。本發(fā)明還涉及給分離自禾本科或小麥屬的某種單子葉植物的經(jīng)過冷誘導(dǎo)的內(nèi)幾丁質(zhì)酶編碼的核酸分子。本發(fā)明還涉及從核酸分子產(chǎn)生出來的多肽。本發(fā)明還涉及到這些核蛋白質(zhì)的用途，其用法與在這項專利申請中對冬裸麥和其它防凍多肽的描述相同。
本發(fā)明包括一種分離出來的，包括一種從這樣一組物質(zhì)選取的核苷序列。這組物質(zhì)包括如圖21或圖22所示的一種核酸分子，或其補(bǔ)足物；一個與上述(a)的核苷序列在中等嚴(yán)格或高度嚴(yán)格的條件下雜交的核苷序列，例如在這項專利申請中所描述的條件，且該序列給一種防凍多肽編碼；一種防凍核酸分子，與上述(a)的核苷序列具有分別至少為40％、至少為60％、至少為80％、至少為90％、至少為95％、97％、98％、或99％的序列同一性，而且這種防凍核酸分子給一種防凍多肽編碼；一種如(a)的核苷序列那樣給同樣的氨基酸序列編碼的核苷序列；以及一種如(b)的核苷序列那樣給同樣的氨基酸序列編碼的核苷序列。
本發(fā)明還涉及一種分離出來的核酸分子，這種分子能夠在中等嚴(yán)格或高度嚴(yán)格的條件下，與單子葉植物中的一種核苷序列雜交，這種序列給具有抗凍活性的某種多肽編碼，而且在此當(dāng)中，DNA分子能夠在中等嚴(yán)格或高度嚴(yán)格的條件下，與圖21或圖22所示的一種核苷序列雜交。
“中等嚴(yán)格”的條件被用于例25、25.1和25.2.6。而某種“高度嚴(yán)格”的條件也可以使用，例如，在例25.2.2中，通過把溫度增加到55攝氏度，并且使用在例26.1中所描述的用于CHT 46的基因?qū)Ｓ锰结槨Ｗ畛Ｊ褂玫膰?yán)格條件(0.2×SSC，0.1％ SDS，30分鐘，42攝氏度)，也就是我們?yōu)槲覀兊碾s交探針提出權(quán)利要求的那種條件，在F.Ausubel等人著，1995年由John Wiley and Sons出版公司于1995年出版的《分子生物學(xué)中的簡要協(xié)議》一書的第25頁，第4章中，被定義為中等嚴(yán)格條件。
本發(fā)明還涉及一種從冬裸麥復(fù)制出來的CH 9或CH 46核酸分子，和一種包括核酸分子的表達(dá)矢量，以及一種控制分子表達(dá)的促進(jìn)劑。本發(fā)明還包括核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及一種防凍核酸分子或從一種禾本科單子葉植物(最好采用冬裸麥)復(fù)制出來的基因。
本發(fā)明還涉及在一個樣品中，通過下面的步驟檢測出CH 46、CH9或一種給抗凍蛋白編碼的核酸分子的存在的一種方法A)從在圖21或圖22中在的核酸序列中選擇一種探針；B)把這種探針與生物樣品雜交；以及C)檢測由探針與CH 46、CH 9或樣品中的防凍核酸分子雜交所生成的一種雜交復(fù)合體，在這當(dāng)中，復(fù)合體的存在指示出在樣品中存在CH 46、CH 9或防凍核酸分子。這種核酸可以是DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)。這種探針最好至少75％補(bǔ)足在這項專利申請中所披露的一種探針中存在的10個鄰接的分子的一個核苷序列。對在這項專利申請中所描述的探針進(jìn)行補(bǔ)足的序列也是很有用的。
本發(fā)明還涉及一種能夠耐受寒冷的植物，已經(jīng)在其基因群中嵌入了一個依次包含如下內(nèi)容的一個重組體，雙鏈DNA分子·A)一個促進(jìn)劑區(qū)，它在植物中的作用是導(dǎo)致產(chǎn)生一個RNA序列，這個序列在功能上與B)鏈接；·B)能夠?qū)е庐a(chǎn)生RNA序列的一種DNA序列，這種RNA序列可以給具有在圖21或圖22中的序列的一種防凍多肽編碼，這種多肽是一種變體，或在生物功能上等效的多肽。
在本發(fā)明的另一個專利技術(shù)實施方案中，DNA序列在功能上與至少與一個信號序列及一個未翻譯的序列鏈接。促進(jìn)劑最好是相對于DNA序列異種的，并且能夠在植物的細(xì)胞或組織中引起足夠的抗凍蛋白的表達(dá)，以增強(qiáng)以這種基因改造過的某種植物對寒冷的耐受能力。
本發(fā)明的核酸分子可以通過一個方法用于改造一種宿主細(xì)胞，經(jīng)過采用一種表達(dá)包含核酸分子的矢量加以改造，這種宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生防凍多肽。本發(fā)明還涉及一個可用于通過利用一種包含本發(fā)明的一種核酸分子，并表示由核酸分子的多肽的表達(dá)矢量來改造某種宿主細(xì)胞來改變某種細(xì)胞中的防凍多肽的含量(過度表達(dá)防凍多肽)。這種表達(dá)矢量最好包括一種防凍核酸分子和一個促進(jìn)劑區(qū)，它們在功能上是互相鏈接的，從而使促進(jìn)劑能夠增強(qiáng)所述DNA分子在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還包括一種用于產(chǎn)生一種在遺傳學(xué)上經(jīng)過改造的植物的方法，這種植物表達(dá)抗凍蛋白。這種方法包括下面幾個步驟1)把一個重組體，雙鏈DNA分子嵌入一種宿主植物細(xì)胞的基因組內(nèi)，這種雙鏈DNA分子含有一種促進(jìn)劑，其功能是在植物細(xì)胞中增強(qiáng)一個相鄰的DNA編碼序列的轉(zhuǎn)錄；2)本發(fā)明的一個防凍DNA分子被鏈接到該促進(jìn)劑，然后從該宿主植物細(xì)胞中，再生出一種在遺傳學(xué)上經(jīng)過改造的植物。這種DNA分子最好包括一個獨立的DNA分子，它是CH 9或CH 46，或如圖21或圖22所示的一種具有CH 9或CH 46核苷序列的DNA分子，一種變體，或在中等嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下，在生物學(xué)功能上等效的分子。本發(fā)明還包括使用這一方法產(chǎn)生的植物。
本發(fā)明還涉及一種改變某種植物中的防凍多肽的含量的方法。這一方法包括如下步驟·把DNA傳遞到一個植物細(xì)胞，植物從這里開始再生，其中，DNA包括一個獨立的DNA分子，它是CH 9或CH 46，或者與如圖21或22所示的，具有CH 9或CH 46核苷序列雜交，一種變體，或是在中等嚴(yán)格或高度嚴(yán)格的條件下在生物功能上等效的分子，在此當(dāng)中，該DNA給一個防凍多肽編碼；·然后從這個植物細(xì)胞再生這種植物，以便讓這種植物表達(dá)該DNA。
在這個方法的一個優(yōu)先選擇的具體實施方案中，這種DNA是一種核酸分子，分離自禾本科的一種單子葉植物，最好是冬裸麥。這種分子也可以分離自某種雙子葉植物。這種優(yōu)選的DNA改變了內(nèi)生的防凍多肽的含量，從而使這種植物的耐受寒冷的能力相對于這種植物種屬的正常情況發(fā)生了改變。
本發(fā)明還包括一種通過利用本發(fā)明的核酸分子和通過表達(dá)基因來改造某種細(xì)胞或植物，讓細(xì)胞或植物獲得抵抗低溫疾病的能力(最好是抵抗真菌疾病的能力)的方法。這一方法還包括應(yīng)用一種組份，這種組份包含本發(fā)明的多肽和一個在農(nóng)業(yè)上可被接受的載體。各種幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、和西非竹芋精都是抗真菌的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的各種多肽展示出幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、和西非竹芋精的活性。即使當(dāng)多肽獲得抗凍活性時，這種活性仍然存在。有許多疾病是由在低溫環(huán)境中能夠正常生長的微生物引起的。冷凍只能阻延，而不能阻止微生物的生長，而在食品或生物物質(zhì)中的任何微生物在解凍期間都可以快速生長。
本發(fā)明還涉及一種為植物提供耐受寒冷的能力的組份，這種組份包括防凍多肽和一種在農(nóng)業(yè)上可被接受的載體。本發(fā)明還包括一種適宜于添加到食物產(chǎn)品中的組份，包含一種防凍多肽和一種適宜于人體消耗的載體。對本發(fā)明的詳細(xì)說明抗凍蛋白有很多有趣的性質(zhì)，包括對冰晶生長的約束和抑制，通過抑制冰的再結(jié)晶而對脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞的保護(hù)(更詳細(xì)的說明見III-21，III-17)。因此，這些蛋白質(zhì)在食品工業(yè)中將得到廣泛的應(yīng)用，通過抑制冰的再結(jié)晶來改善在冷凍狀態(tài)下食用或以冷凍方式儲存的糧食、蔬菜、水果、肉類以及很多其它食品的質(zhì)地、質(zhì)量和增加其貨架期，減少由微生物引起的損失。此外，這些蛋白質(zhì)可用于細(xì)胞、膜、卵母細(xì)胞、組織(III-4)的低溫貯藏，以及細(xì)胞和組織的低溫保護(hù)(III-44)?？箖龅鞍?AFP)還有某些最新用途，包括對人類血小板的冷保護(hù)(III-49)。更為令人關(guān)注的是，AFP調(diào)節(jié)冰晶生長的特性具有其它生物醫(yī)藥用途，可殺死某些細(xì)胞例如癌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)基因植物中，當(dāng)植物表達(dá)AFP時，這些AFP能夠改善植物的抗凍能力和增強(qiáng)植物對低溫病原體的抵抗力。植物對寒冷的耐受我們發(fā)現(xiàn)的與植物耐寒性有關(guān)的奇異蛋白質(zhì)有三類i)冰晶成核蛋白ii)抗凍蛋白(AFP)iii)對植物和真菌細(xì)胞壁進(jìn)行酶修飾的多肽在植物體內(nèi)水分凍結(jié)的過程中，如果允許水在受控制的條件下凍結(jié)，植物組織中的水分就穿過細(xì)胞壁進(jìn)入胞間空隙，導(dǎo)致胞間冰晶的形成。冰晶成核蛋白的作用是引發(fā)冰晶在細(xì)胞外的植物組織胞間空隙中形成。AFP同樣存在于細(xì)胞外，以約束和調(diào)控冰晶在胞間空隙中的生長，從而阻止細(xì)胞膜的破裂。存在于細(xì)胞外空間中的酶起修飾細(xì)胞壁物質(zhì)的作用，增加細(xì)胞壁物質(zhì)的彈性，以增強(qiáng)植物組織在凍結(jié)和解凍時是生存能力。這些酶還可以降解低溫病原體的細(xì)胞壁物質(zhì)，從而提供對低溫病原體的某些抵抗力。
人們相信，植物在暴露于低溫冰凍環(huán)境的過程中，與抗凍有關(guān)的蛋白質(zhì)由植物細(xì)胞產(chǎn)生于體內(nèi)，透過原生質(zhì)膜分泌到胞間空隙中產(chǎn)生作用，調(diào)控冰晶的形成。耐凍蛋白的形成可以理解為包含一條或多條特定的多肽。這些多肽中的多條聯(lián)結(jié)在一起，提供了蛋白質(zhì)的一種特定結(jié)構(gòu)，使之具有冰晶成核、抗凍結(jié)或酶作用等顯著的耐霜凍特性中的一種或多種特性。
我們發(fā)現(xiàn)，在溫暖的環(huán)境如20℃下，植物細(xì)胞產(chǎn)生與耐凍有關(guān)的多肽的能力下降。當(dāng)植物處于早春或晚秋的霜凍氣候條件下時，這些多肽的產(chǎn)生就顯著增加。據(jù)我們所知，這就是抗霜凍誘導(dǎo)多肽在植物組織中最初的發(fā)現(xiàn)。由我們在植物的胞間空隙中發(fā)現(xiàn)這些多肽的這一角度出發(fā)，我們在這些部位中提取了這些多肽(I-16和II-12)。一般來說，采用如下的兩步提取法i)將植物的葉切碎或剪碎，用最好含20mM氯化鈣和10mM抗壞血酸鹽的緩沖劑進(jìn)行真空抽提ii)抽提液從植物組織中提取，而細(xì)胞未受到破壞獲得的提取液具有冰晶成核活性、葡聚糖酶活性和幾丁質(zhì)酶活性以及抗凍結(jié)活性。冰晶成核活性更適宜于用小滴凍結(jié)測試來測量。在討論的實例中，當(dāng)加入象二硫蘇糖醇和巰基乙醇這樣的巰基還原劑時，冰晶成核活性就降低。提取液的抗凍活性通過觀察安裝在光學(xué)顯微鏡上的冷凍臺中的冰晶形成過程來確定。這樣的結(jié)構(gòu)同從其它來源如海烏魚中提取(II-4)的其它類型的抗凍蛋白質(zhì)類似。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入蛋白酶時，提取液的抗凍活性消失，從而證實了AFP的存在。葡聚糖酶活性是通過對從可溶性昆布多糖(多聚β-1，3-葡萄糖)中酶性釋放葡萄糖等價物的測量來測量。葡聚糖酶在鈣的存在下更為活躍。幾丁質(zhì)酶活性是通過對從膠體幾丁質(zhì)中(外源幾丁質(zhì)酶)和從幾丁質(zhì)寡聚體中(內(nèi)源幾丁質(zhì)酶)中酶促釋放氨基葡萄糖的測量來測定(I-10.1)。
可以理解，為了從胞間空隙中抽取抽提液而不破壞植物細(xì)胞，可以采取不同的分離技術(shù)。這些技術(shù)包括在離心管中放置一個漏斗或錐形體使植物葉垂直定向以避免葉片的彎折。然后將葉片離心，從而在不破壞細(xì)胞的情況下獲取抽提液。其它技術(shù)可用于多肽的提取。例如，可通過灌注適當(dāng)?shù)某樘崛芤簛沓樘崛~片。當(dāng)植物組織均質(zhì)化時，細(xì)胞外的多肽是水溶性的，將分布于整個可溶性組分中。
當(dāng)冰凍發(fā)生時，引起對霜凍耐受性的多肽對任何類型的植物都是有益的。任何植物都可以通過不同的方式使用或本身含有這些多肽，而這些多肽可以調(diào)節(jié)冰晶的生長。植物如果含有這些蛋白，就能在寒冷或冰凍的氣溫中耐受更長時間的暴露，就能在更嚴(yán)酷的氣候中生存，就能有更長的生長季節(jié)，因為春秋季的霜凍對它們的影響會更小。
此外，個別蛋白的使用為暴露于零度以下溫度中的植物選擇了另一種生存機(jī)制。例如，有些植物通過完全阻止冰的形成來避免凍傷。這種過冷的策略要求不存在冰晶核原，或者存在鈍化冰晶核原的物質(zhì)。AFP表現(xiàn)出抑制冰晶核形成的特性(II-13)。因此，任何植物組織都可以通過不同的方式馴化產(chǎn)生或從外部給予AFP，以阻止冰晶核形成和促進(jìn)植物體液的過冷化。
正如所說明的那樣，本發(fā)明提供的與冰凍耐受性有關(guān)的蛋白質(zhì)具有多種用途。一個重要的用途就是用于檢測植物在抗凍方面的特性。針對這些多肽，制備了多種抗體。憑借這些抗體，可以通過免疫測定的方法來確定其它植物中類似多肽的存在，以判斷它們產(chǎn)生冷誘導(dǎo)AFP、冰晶核和酶的能力，并測定它們耐冰凍能力的強(qiáng)弱。同樣可以理解，植物能夠被編碼了上述多肽的遺傳信息所轉(zhuǎn)化，從而在其它類型的植物中改進(jìn)或提供耐霜凍能力。本發(fā)明中的多肽同樣可應(yīng)用于工廠化操作，但必須實用適當(dāng)?shù)妮d體以加速植物、水果、糧食或其它生物材料對這些多肽的吸收。AFP必須存在于水溶液中，以影響冰的形成。為促進(jìn)吸收，我們使用一些物理方法，如真空抽提、灌注、混合、攪拌，以及在研磨或非研磨情況下的浸泡。在蔬菜、水果的種植中，當(dāng)周圍溫度驟降到零度以下時，可以用噴灑的方式施用這些多肽，以防止霜凍造成的破壞。此外，這些多肽在生物組織的低溫貯藏中得到應(yīng)用。這些多肽還廣泛應(yīng)用于所有冷凍食品的質(zhì)量，特別是冰淇淋和其它在冷凍狀態(tài)下食用的食物。這些多肽的應(yīng)用，使得冰晶的結(jié)構(gòu)變得微小并減少了再結(jié)晶，從而產(chǎn)生更高質(zhì)量的產(chǎn)品。原則上，只要哪里需要抑制冰晶的再結(jié)晶，本發(fā)明中的多肽就可以得到應(yīng)用。這種對再結(jié)晶的抑制保持了冰晶顆粒的微小，防止了對細(xì)胞壁和膜的損傷，從而維持了冷藏細(xì)胞和組織的生存。通過以下的詳細(xì)討論和例證，可以使本發(fā)明得到更進(jìn)一步的理解。
實施例1細(xì)胞外蛋白質(zhì)的提取和量化將冬裸麥(Secale cereale L.cv.Musketeer)種子播種到裝有粗蛭石的15cm塑料罐中，在20∶16℃(晝∶夜)下發(fā)芽一周，期間每天的晝長為16小時。植物轉(zhuǎn)移到5∶2℃(晝∶夜)的環(huán)境，光照體制為16∶8小時(晝∶夜)，經(jīng)過這種處理的植物稱為冷馴化裸麥(RH)。植物生長于5∶2℃(晝∶夜)環(huán)境下，但光照體制為8∶16小時(晝∶夜)，經(jīng)過這種處理的植物稱作短晝型冷馴化裸麥(RH-SD)。余下的塑料罐留在20℃的生長室中再生長三周，作為對照，或稱非馴化裸麥(RNH)。裸麥在5∶2℃(晝∶夜)(8小時晝∶16小時夜)條件下生長整整七周然后轉(zhuǎn)移到20℃生長室中生長四天，這一過程稱作脫馴化(Deacc)。所有的植株用經(jīng)修飾的Hoagland營養(yǎng)液(Huner和Macdowall配方，見1-6)澆灌。
分別從RNH，RH，RH-SD和Deacc植株中提取細(xì)胞外蛋白質(zhì)。在每次提取中，都用5mM EDTA，10mM抗壞血酸，10mM巰基乙醇，1mM苯基甲基磺酰氟，2mM己酸和2mM苯甲脒，以真空抽提法制備胞外提取液。該真空抽提的程序是按照Mauch和Staehelin(I-16)的描述進(jìn)行的。經(jīng)處理的葉片垂直塞入一漏斗后放入離心管中，以避免葉片的彎折。離心以分離胞外抽提液，并收集于離心管中。該提取液是在不破壞葉細(xì)胞的情況下獲得的。
分別從RNH，RH，RH-SD和Deacc葉片中提取胞外蛋白，正如前文“蛋白質(zhì)提取”中略述的那樣。提取液的蛋白質(zhì)濃度用Bio-Rad方法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)測定，測定時至少作四次獨立的重復(fù)。從胞間空隙中提取的蛋白質(zhì)的量因植物生長條件的不同而不同。非馴化植物葉片中的胞外蛋白含量平均為0.034毫克蛋白/克鮮重。在5℃條件下分別于16小時和8小時晝長下生長的葉片，其胞外蛋白含量分別平均為0.149毫克蛋白/克鮮重和0.307毫克蛋白/克鮮重?？梢姡诘蜏睾投虝儣l件下生長的裸麥，其胞外蛋白含量增加了九倍。而當(dāng)它們被轉(zhuǎn)移到20℃條件下馴化時，這些蛋白質(zhì)水平下降(圖1)。實施例2胞外蛋白的電泳對如圖2、圖3和圖4顯示的結(jié)果而言，為電泳的需要，胞外提取液中加入1.5倍量的1％乙酸的甲醇溶液，在-20℃下保溫過夜，以使胞外蛋白從胞外提取液中沉淀下來。蛋白質(zhì)沉淀分別用100％乙醇和70％乙醇在5℃下洗滌，然后在干燥器中干燥。蛋白質(zhì)用Laemmli(I-10)樣品緩沖液[60mM Tris-HCl，pH6.8；10％甘油；2％十二烷基磺酸鈉(SDS)；5％巰基乙醇]再懸浮，以Biorad無染色標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行電泳分離，采用10％丙烯酰胺凝膠，對堆積膠用90V電壓，對分離膠用110V電壓(I-10)。用考馬斯藍(lán)對凝膠染色。對圖9展示的結(jié)果而言，存在于胞外提取物的柱組分中的蛋白質(zhì)直接溶解于Laemmli樣品緩沖液(I-10)，以Biorad預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行電泳分離，采用13.5％丙烯酰胺凝膠，200V電壓。凝膠用氨銀染色。
在不同類型的植物葉之間，胞外提取液中的蛋白質(zhì)形態(tài)表現(xiàn)出顯著的不同。SDS-PAGE(10％丙烯酰胺凝膠)顯示在胞外提取液中至少存在12種多肽。其中兩種多肽的分子量分別為77和73kD，被考馬斯藍(lán)染成紅色，它們僅在冷馴化的葉中發(fā)現(xiàn)(圖2；第3和第4道)。在經(jīng)馴化的葉中，分子量分別為36、33、30、25、21、15、14和13kD的多肽被檢測到含量的增加(圖2)。分子量分別為23和20kD的兩種多肽僅在短晝冷馴化的葉這才檢測到增加。實施例3冷馴化期間多肽的積聚為進(jìn)一步研究胞間空隙中多肽的特性，進(jìn)行了時程實驗，其目的是了解這些多肽的出現(xiàn)與冰凍耐受性的發(fā)展之間的關(guān)系。檢測發(fā)現(xiàn)，在非馴化葉中，大多數(shù)胞間多肽的含量很低(圖3，第2道)。在冷馴化的第35、50、57和78天，測定到多肽的持續(xù)積累(圖3，第3、4、5和第6道)。在第78天，短晝冷馴化裸麥葉的冰凍耐受性達(dá)到最高值(LT50＝-30℃)，同時展示出最高的胞外多肽含量并出現(xiàn)一種分子量為109kD的新多肽。在冷馴化102天以后，109kD、77kD和73kD的多肽不復(fù)存在，同時植物葉的冰凍耐受性降低，推測可能是因為植株已春化的緣故(圖3，第7道)。這一發(fā)現(xiàn)表明，這13種胞外多肽中大多數(shù)的存在，與植株的冰凍耐受性和春化作用有關(guān)。在脫馴化過程中，即將冷馴化的植株從最嚴(yán)酷的環(huán)境中轉(zhuǎn)移到20℃的環(huán)境中經(jīng)歷不同長度的時間段，同時也檢測胞外蛋白的形態(tài)。如圖4所示，12種多肽中大多數(shù)多肽(第2道，最高程度的冷馴化)的含量在此后4天的脫馴化(第3道)中大大降低，并在此后6天和8天的脫馴化中(第4和第5道)持續(xù)降低。圖中左手的一欄是分子量刻度尺，藉此可估測第1道中多肽的分子量。在第1道和第2道之間的分子量刻度尺相信是更為精確的。實施例4胞外多肽的冰晶成核活性用通過Amicon小體(I-13)超濾的方法將葉的胞外蛋白濃縮十倍。在給定的溫度范圍內(nèi)，將濃縮液用小滴凍結(jié)技術(shù)確定活性冰晶核的光譜。在冷凍期間(圖5)，冷馴化裸麥葉的胞外提取液在-9℃下生長短光周期的成核冰晶，在10℃下則生長長光周期的成核冰晶。非馴化和脫馴化葉的提取液則在最低的溫度下(-13℃)才開始結(jié)冰。非馴化和冷馴化的葉提取液冰晶成核活性的不同(圖5)，可能是因為馴化葉的胞間空隙中保持了更高的蛋白質(zhì)含量(圖1)。用超濾的方法獲得相同蛋白質(zhì)含量的非馴化和冷馴化葉提取液來測定蛋白質(zhì)濃度的影響。當(dāng)用小滴凍結(jié)法對兩種提取液的冰晶成核活性進(jìn)行測定和計算時，在冷馴化葉中發(fā)現(xiàn)每克鮮重的冰晶核累積數(shù)呈統(tǒng)計學(xué)上的顯著增加(p＝0.01)。在-15℃下，非馴化葉的胞外提取液中每克鮮重的冰晶核數(shù)(平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝4)是2269±292，而長晝冷馴化裸麥葉的胞外提取液中每克鮮重的冰晶核數(shù)為7048±917。低的冰晶核形成起始溫度表明，存在于提取液中的冰晶引發(fā)物不是完整的冰晶形成點。實施例5胞外提取液的抗凍活性對用前文提及的技術(shù)制備的胞外提取物在抗凍發(fā)明的活性進(jìn)行評價。抗凍活性的測定，是通過用納升滲壓計觀測提取液中形成的冰晶的形態(tài)來實現(xiàn)的(Clifton Technical Physics，Hartford，N.Y.，U.S.A，II-3，II-5)。在純水中，冰晶的正常生長與晶格的基面平行(a-軸方向)而很少垂直于基面(c-軸方向)生長，因此冰晶的外觀平而圓(II-5)(圖6A)。相反地，低濃度(nM)的AFP優(yōu)先抑制冰晶沿a-軸方向的生長，因而冰晶呈現(xiàn)出六棱柱面(II-6)(圖6G)。在更高濃度的AFP中，冰晶主要沿c-軸方向生長，形成雙六棱錐形(II-6)(圖8C)。
在這一實驗中，非馴化裸麥葉提取液的凍結(jié)就象蒸餾水一樣，亦即，只觀測到薄而圓的冰晶(圖6B)。相反地，所有從冷馴化冬裸麥葉的的胞間空隙中提取的粗提取液在冷凍時都產(chǎn)生六邊形的冰晶(圖6C至6G)。當(dāng)溫度降低時，冰晶首先沿c-軸擴(kuò)展，形成不完整的雙六棱錐形(圖6D)，然后沿a-軸生長，形成六棱柱(圖6D)和更大的六邊形冰晶(圖6E至6G)。六棱形冰晶的形成和冰晶沿c-軸的生長，表明這些冬裸麥的粗提取液中存在抗凍活性(II-3，5)。此外，當(dāng)冷馴化裸麥葉胞外提取液加入5％(w/v)Streptomyces griseus蛋白酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，U.S.A.)在22℃下孵化一小時，提取液對冰晶形態(tài)的影響就消失，這一事實說明抗凍活性與蛋白質(zhì)有關(guān)。實施例6胞外蛋白對再結(jié)晶的抑制AFP在耐凍性植物和生物體中的作用之一是阻止冰的再結(jié)晶(II-10)。盡管冰最初是形成小的冰晶，然而如果沒有AFP的存在，隨著時間的推移，這些冰晶會融合形成大的冰晶，從而對生物組織造成機(jī)械損傷。用“條形物實驗”對再結(jié)晶進(jìn)行測定。把少量胞外提取液滴加到-20℃的表面上，形成一薄層小冰晶。然后將這一條形物在-8℃下退火6小時。用光學(xué)顯微鏡和偏振光觀察退火后冰晶的大小，并將本發(fā)明的胞外提取物與蒸餾水進(jìn)行對照，以確定提取物是否具有抑制水中冰的再結(jié)晶的作用(圖13)。所有稀釋度的提取液中的冰晶都明顯比純水退火后觀察到的冰晶小。當(dāng)胞外提取液按1∶10,000稀釋，即稀釋到每升含大約28微克蛋白質(zhì)時，仍然表現(xiàn)出顯著的抑制再結(jié)晶作用。實施例7胞外提取液中蛋白質(zhì)的分級分離將胞外提取液濃縮五倍，用超濾交換到50mM的NH4HCO3(Centriprep-10，Amicon Canada Ltd.，Oakville，ON，Canada)中，并以50mM NH4HCO3為介質(zhì)，采用Sephacryi 200(Pharmacial LKBBiotechnology，Uppsala，Sweden)柱(0.5×32cm)。洗出液用紫外吸收法在280nm(O--O)和230nm(v-v)下監(jiān)測。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)被分別洗出以估測蛋白質(zhì)的大小。鐵蛋白，440kD，在第9.5ml洗出；醛縮酶，158kD，在第11.5ml洗出；牛血清白蛋白，67kD，在第13.5ml洗出；以及胰蛋白酶原，24kD，在第16.5ml洗出。如圖7所示，監(jiān)測到四個明顯的大分子峰305kD(峰1)，5kD(峰2)，2kD(峰3)和＜1kD(峰4)。在測試每一組分的抗凍結(jié)特性時，只有與峰2相關(guān)的組分形成六邊形和雙棱錐形冰晶。
如圖7所示，用SDS-PAGE(13.5％丙烯酰胺，銀染色凝膠，如圖9所示)對與280nm下每個峰的柱分相關(guān)的多肽進(jìn)行估測。第1道包含預(yù)染色的標(biāo)準(zhǔn)大分子；第2道包含原胞外提取物；第3道包含在第8ml洗出的多肽(峰1)；第4道包含在第18ml洗出的多肽(峰2的肩)；第5道包含在第22ml洗出的多肽(峰2)；第6道包含在第26ml洗出的多肽(峰2的肩)；第7道包含在第31ml洗出的多肽(峰3)；第8道包含在第35ml洗出的多肽(峰4)。從峰2得到的柱分(圖7)包含幾條主要的多肽，其大小從5kD到36kD(圖9，第4道，以及表I和表II)。該柱分具有抗凍結(jié)活性。實施例8經(jīng)分級分離的胞外多肽的冰晶成核活性蛋白質(zhì)經(jīng)Sephacryl柱洗出后，從峰1和峰4監(jiān)測出低的冰晶成核活性，如圖4所示。而峰3則顯示出較高的冰晶成核活性。SDS-PAGE分離出兩種分子量分別為60和68kD的多肽。冰晶成核蛋白可以是兩者之一，也可以是兩者的結(jié)合。這兩種多肽在圖2、圖3和圖4中分別識別為77kD和73kD的多肽，因為60和68kD多肽被考馬斯藍(lán)染色。實施例9經(jīng)分級分離的胞外多肽的熱滯后現(xiàn)象AFP通過阻止冰晶的形成和抑制冰晶的生長依質(zhì)性地降低溶液的冰點，而這些蛋白質(zhì)對熔點的改變則僅靠依數(shù)效應(yīng)(II-5)。這一熱滯后現(xiàn)象(冰點和熔點不相同的現(xiàn)象)通過觀察溫度對單個冰晶生長的影響來測定。熔解在冰晶變圓時開始發(fā)生；凍結(jié)在冰晶沿c-軸延伸時發(fā)生(II-5)。
為證明熱滯后現(xiàn)象的存在，我們將280nm吸收和具有抗凍活性的柱分(峰2)合并，凍干后在蒸餾水中再溶解，用于觀測熱滯后現(xiàn)象。在這一更高的蛋白質(zhì)濃度下，沿a-軸方向的冰晶生長被抑制(圖8B至8D)。此外，五個冰晶沿c-軸方向排列，其平均凍結(jié)溫度為-1.10℃。它們的平均熔解溫度是-0.78℃，因而熱滯后溫度被計量為0.33±0.06℃(平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝5)。因此，冬裸麥葉產(chǎn)生了AFP。這種(這些)AFP具有修飾冰晶生長的正常模式和依質(zhì)性地降低溶液冰點的能力。冬裸麥AFP表現(xiàn)出來的熱滯后效應(yīng)比從極地魚中發(fā)現(xiàn)的AFP(大約0.6℃，II-7)和在昆蟲這發(fā)現(xiàn)AFP(5℃，II-7，II-8)小。這可能是因為冬裸麥AFP沒有完全純化，或者是因為結(jié)構(gòu)及功能上的差異。實施例10胞外多肽中至少11種多肽的抗凍活性用20mM CaCl2和10mM抗壞血酸從冬裸麥葉中提取胞外多肽，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳分離時使用無還原劑(不含二硫蘇糖醇)的Tris-tricine緩沖系和大(16×18×0.15cm)12％丙烯酰胺凝膠。在冰溫的0.25M KCl中保溫10分鐘后，多肽在凝膠中顯色。凝膠經(jīng)蒸餾水洗后，將各波段切開，用0.1％SDS和50mM Tris-HCl將多肽從凝膠中洗出。然后用80％丙酮在-20℃將多肽從洗脫緩沖液中析出，沉淀并風(fēng)干。將多肽用0.1M NH4HCO3再溶解，分別用觀察冰晶形態(tài)變化的方法測定各種多肽的抗凍活性。如圖10所示，有8種多肽，分子量從111kD到161kD，可以改變正常類型的冰晶生長而形成六邊形冰晶。93kD的多肽實際上代表一組具有抗凍活性的多肽，它們在Tris-tricine凝膠系統(tǒng)中分離為分子量從93kD到99kD不等的一組。這些多肽依據(jù)其被考馬斯亮藍(lán)染成紅紫色來識別。在早期實驗中，多肽用Tris-glycine緩沖系和12.5％膠或梯度膠來分離，因此這些多肽的大小在本系統(tǒng)中的表現(xiàn)與在早期的凝膠中相比有所不同。實施例11對AFP所含氨基酸的分析對具有抗凍活性的多肽的氨基酸成分分析表明，它們相對富含甘氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸，以及絲氨酸(見表III對所有多肽的展示)，但不含氨基己糖(監(jiān)測條件將每種多肽15皮摩爾水解4小時后進(jìn)行氨基酸分析)。沒有任何多肽展示抗凍糖蛋白和I型AFP的高丙氨酸含量特性(II-10)。相反，裸麥多肽顯示出高的親水氨基酸含量，就象在海烏魚和大西洋鮭中檢測到的那樣(II-4)；同時也具有高含量的甘氨酸，正如在某些昆蟲AFP中檢測到的那樣(II-7，表III)。實施例12用免疫吸附法對胞外提取液中的類幾丁質(zhì)酶蛋白進(jìn)行鑒定用SDS-PAGE分離胞外多肽，并將其電吸附到硝化纖維上。印跡用對幾丁質(zhì)酶的初級抗體探針。初級抗體來源Dr.Michel Legrand，Laboratoire de Virologie，Institut de Biologie Moleculaire et Celluire de laRecherche Scientifique，15，rue Descartes，67000 Strasbourg，F(xiàn)rance(I-10.1)。為顯影的需要，用次級抗體(抗兔1gG抗體與堿性磷酸酶結(jié)合)對印跡進(jìn)行探針。結(jié)果表明，兩種分子量分別為27和32kD的多肽具有與幾丁質(zhì)酶類似的抗原決定部位(圖11)。27kD多肽在冷馴化葉中的含量高于非馴化葉，而32kD多肽則是由低溫誘導(dǎo)而產(chǎn)生的。次級免疫吸附如圖12所示。圖中的每一道分別代表用幾丁質(zhì)酶抗體探針的在5℃下生長2、5、6、7、8和9周后的冬裸麥胞外多肽。27kD幾丁質(zhì)酶在2周齡的植物葉中存在不明顯，但在整個9周的時間內(nèi)持續(xù)積累。32kD幾丁質(zhì)酶僅僅當(dāng)植物在5℃下生長7周后才明顯存在。到第9周，兩種幾丁質(zhì)酶都以雙重道出現(xiàn)(32和31kD，27和26kD)。實施例13胞外多肽在裸麥冰凍耐受性中所起的作用在5℃和8小時晝長下冷馴化的冬裸麥葉用20mM CaCl2和10mM抗壞血酸抽提，以減小非原質(zhì)體中的蛋白質(zhì)濃度。非馴化葉、冷馴化葉和經(jīng)抽提的冷馴化葉分別被切成2.5cm長的碎片，并用蒸餾水充分漂洗。三份樣品中的每一份都將碎葉片放入50個裝有4mL HPLC級水的試管中。將這些試管置于冰浴中，每隔22分鐘將溫度降低1℃。在每一溫度下，都將冰凍的樣品移動并置于冰上緩慢解凍。然后將樣品置于室溫并測定樣品的傳導(dǎo)率。將樣品煮沸以除去所有的內(nèi)離子，冷卻至室溫，再次測定溶液的傳導(dǎo)率。結(jié)果如圖14所示。對胞外蛋白的抽提導(dǎo)致冷馴化葉在-11℃出現(xiàn)致命的凍傷。如果胞外蛋白不被抽提，冰晶在-1℃下成核時，冷馴化葉到-30℃這樣低的溫度下仍然可以正常生存。即使讓未經(jīng)抽提的冷馴化葉自然冷凍，它們在-13℃以上的溫度下都不會凍死。由此可見，胞外蛋白的存在確實減輕了冰凍帶來的傷害。實施例14AFP的N-端氨基酸序列分析，證明AFP與病原相關(guān)蛋白類似對圖9第4道所示七種主要多肽中的三種進(jìn)行了部分氨基酸順序的測定。其中具有抗凍活性的9kD多肽的N-端前20個氨基酸被測序NH2-ALA-ILE-PHE-CYS-GLY-GLN-VAL-ASN-PRO-ALA-LEU-GLY-PRO-PRO-ILE-TYR-PRO-ALA-PHE-GLY-11kD多肽的前16個氨基酸的順序如下NH2-ARG-SER-PHE-SER-ILE-THR-ASN-ARG-CYS-TRP-SER-PHE-THR-VAL-PRO-GLY-其中前11個氨基酸顯示與一種激酶有關(guān)的轉(zhuǎn)移蛋白(列于蛋白質(zhì)信息庫的文件名MUSHCK和TVMSHC下)有55％的同源性。
30kD蛋白質(zhì)的N-端前30個殘基的序列如下NH2-ILE-GLY-VAL-CYS-TYR-GLY-VAL-ILE-GLY-ASN-ASN-LEU-PRO-SER-ARG-SER-ASP-VAL-VAL-GLN-LEU-TYR-ARG-SER-GLY-X-ILE-ASN-X-MET-其中X代表未知的氨基酸殘基。
將這一順序與列于國立癌癥研究所的超型計算機(jī)數(shù)據(jù)庫中列出的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性比較。這一序列與以前從大麥中純化的葡聚糖內(nèi)-1，3-β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.39)具有63％的同源性。30kD帶有時表現(xiàn)為一條31至33kD的帶，推測為內(nèi)葡聚糖酶的前體。這些結(jié)果表明，冷馴化所誘導(dǎo)的過程之一，是產(chǎn)生修飾細(xì)胞壁的能力。細(xì)胞壁流動性的增加，對于凍結(jié)-解凍周期中細(xì)胞的收縮和此后的膨脹可能是重要的。這一葡聚糖酶活性或許還能抑制真菌菌絲的生長，因而提供對低溫病害的抵抗力。
除此之外的六種表現(xiàn)出抗凍活性的胞外多肽的氨基酸序列也得到了確定。這些多肽用SDS-PAGE分離，采用Tris-tricine緩沖液，從凝膠中洗出，進(jìn)行抗凍活性的測定，如圖10所示，然后用于序列分析。它們的N-端序列如下11kD多肽NH2-ALA-ILE-SER-X-GLY-GLU-GLN-VAL-ASN-SER-ALA-LEU-[GLY]-PRO-X-ILE-[SER]-TYR-ALA-[ARG]-[GLY]對蛋白質(zhì)信息庫的FASTA檢索揭示這一序列與大麥中的一種分子量為9kD的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的20個的氨基酸重疊區(qū)具有80％的同源性(II-14.2)。圖10中這一11kD的多肽與圖9前文中已提及經(jīng)測序的多肽相對應(yīng)。正如前文所述，這一分子量的差異是由凝膠電泳的可變性造成的。
15kD多肽NH2-ARG-SER-PHE-SER-ILE-THR-ASN-ARG-X-ALA-PHE-THR-VAL-X-PRO-ALA-ALA-THR-PRO-VAL-GLY-GLY-GLY-GLY-GLN對國立生物醫(yī)藥研究基金蛋白質(zhì)信息資源庫的FASTA檢索發(fā)現(xiàn)，該序列與一種從Oryza sativa中提取的類西非竹芋精蛋白所報道的一段24個氨基酸的重疊區(qū)有75％的同源性。這一圖10中15kD的多肽或許與前文圖9中的11kD多肽相對應(yīng)。
25kD多肽NH2-ALA-THR-ILE-THR-VAL-VAL-ASN-[LYS]-PHE-SER-TYR-THR-VAL-X-PRO-GLY-ALA-LEU-PRO-PHE-GLY-GLY-VAL-GLY-LEU-GLY-PRO-GLY-GLN-經(jīng)FASTA檢索發(fā)現(xiàn)，該序列與大麥西非竹芋精同源蛋白1中的一段29個氨基酸的重疊區(qū)有79％的同源性。它同時還與燕麥中分離的avematin中的一段22個氨基酸的重疊區(qū)有77％的同源性，與小麥中分離的trimatin中的一段22個氨基酸的重疊區(qū)有82％的同源性。與西非竹芋精類似的蛋白被證明具有一系列的活性，包括α-淀粉酶活性、蛋白酶活性和膜滲透活性(II-8.2)。
圖10中的31kD多肽與前文圖9中的30kD多肽相對應(yīng)，只是多出一段氨基酸序列NH2-ILE-GLY-VAL-X-TYR-GLY-VAL-ILE32kD多肽NH2-ILE-GLY-VAL-X-TYR-GLY-VAL-ILE-GLY-ASN-ASN-LEU-PRO-[SER]-ARG-[SER]-ASP-VAL-VAL-GLU33kD多肽NH2-ILE-GLY-VAL-X-TYR-GLY-VAL-ILE-GLY-ASN-ASN-LEU-PRO-SER以上列出的三個序列都與葡聚糖內(nèi)-1，3-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.39)具有顯著的同源性。
33kD多肽NH2-GLU-GLN-X-GLY-SER-GLN-ALA-GLY-GLY-ALA-THR-X-PRO-ASN-ASN-LEU-LEU-FASTA檢索表明，這一序列與類橡膠樹的橡膠蛋白中一段16個氨基酸的重疊區(qū)具有81％的同源性。該序列同時也與從水稻和煙草中分離出來的內(nèi)源幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)中一段16個氨基酸的重疊區(qū)具有88％的同源性，還與從小麥中分離的凝集素(又稱異血凝素11)中的一段14個氨基酸的重疊區(qū)具有92％的同源性。
象類西非竹芋精蛋白(TLP)，葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶這樣的蛋白質(zhì)都是人們所知的與致病機(jī)理有關(guān)的蛋白質(zhì)，因為它們是病原體大批滋生的植物中累積?，F(xiàn)在我們可以證明，類西非竹芋精蛋白(TLP)，類葡聚糖酶蛋白(GLP)和類幾丁質(zhì)酶蛋白(CLP)在冰凍耐受性植物的冷馴化期間產(chǎn)生，并展現(xiàn)抗凍活性。除我們的工作外，其他的科學(xué)文獻(xiàn)未見有報道低溫可以誘導(dǎo)與致病機(jī)理相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，未見報道低溫誘導(dǎo)的致病機(jī)理相關(guān)蛋白表現(xiàn)出抗凍活性，亦未見報道低溫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)或低溫誘導(dǎo)基因的產(chǎn)品展現(xiàn)抗凍活性。實施例15胞外提取液的葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性用20mM氯化鈣和10mM抗壞血酸組成的pH3.5的提取劑抽提冬裸麥葉，獲得胞外提取液。通過用二硝基水楊酸試劑測定從海帶多糖中釋放的葡萄糖來測定胞外提取液中β-1，3-葡聚糖酶活性(II-1.0)。在我們的實驗中，葡聚糖酶測定在如下條件下最為理想pH3.5，1％海帶多糖，CaCl2(與MgCl2或MnCl2相對立)，5℃，以及測定470nm的吸光率。在粗胞外提取液中，β-1，3-葡聚糖酶活性大約為312毫克葡萄糖當(dāng)量每毫克總蛋白每小時。當(dāng)采用羧甲基纖維素作底物時，提取液不表現(xiàn)β-1，4-葡聚糖酶活性。
在5℃短晝長下生長的冬裸麥葉的粗胞外提取液中，內(nèi)源幾丁質(zhì)酶活性(I-10.1)為每克鮮重每小時釋放115納摩爾氨基葡萄糖，而外源幾丁質(zhì)酶活性則為每克鮮重每小時釋放9納摩爾氨基葡萄糖。在20℃下生長的裸麥植株則表現(xiàn)每克鮮重每小時釋放出34納摩爾氨基葡萄糖的內(nèi)源幾丁質(zhì)酶活性和每克鮮重每小時釋放不到3納摩爾氨基葡萄糖的外源幾丁質(zhì)酶活性。實施例16對細(xì)胞懸浮液冰晶成核活性的表征分別將20℃和5℃的冬裸麥葉組織用果膠酶降解，然后用密度梯度法純化，以獲得單個葉肉細(xì)胞的懸浮液。為對冬裸麥中存在的冰晶核原進(jìn)行定量，用小滴技術(shù)對經(jīng)系列稀釋的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行冰晶成核活性測定。對從20℃葉和從5℃葉分離出來的葉肉細(xì)胞來說，平均冰晶成核起始沒有顯著的差別，均為-7.3℃(表IV和表V)。
在不同條件下生長的植物葉中冰晶核原成分，是通過將單個細(xì)胞在已知能夠影響蛋白質(zhì)、巰基和與蛋白質(zhì)相連的二硫鍵、碳水化合物和磷脂(表IV)的化合物和酶存在下保溫的方法來確定。將細(xì)胞用3M尿素處理并加熱到90℃使蛋白質(zhì)變性后，冰晶成核活性明顯下降。非特異性蛋白酶(鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K)也使冰晶成核活性降低。由此可見，與冬裸麥葉肉細(xì)胞相關(guān)的冰晶核原具有蛋白質(zhì)的成分。二硫蘇糖醇對二硫鍵的還原和N-乙基馬來酰亞胺與游離巰基的反應(yīng)也降低冰晶成核活性，表明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對冰晶成核活性的產(chǎn)生是重要的。硼酸和高碘酸兩者都能與碳水化合物反應(yīng)，而兩種化合物都能使冰晶成核活性降低，這也證明冰晶核原同樣含有碳水化合物成分。最后，磷脂酶C由于能釋放磷酸基和磷脂的頭部，同樣也能降低冰晶成核活性。綜合以上結(jié)果表明，與冬裸麥葉肉細(xì)胞有關(guān)的冰晶核原具有蛋白質(zhì)、碳水化合物和磷脂成分。由于游離多肽的冰晶成核活性發(fā)生在植物組織的胞間空隙中，它在細(xì)胞懸浮液實驗中的表現(xiàn)說明冰晶成核蛋白可能被束縛于細(xì)胞壁上，并被還原二硫鍵的試劑所釋放。實施例17具有抗凍活性多肽的抗體對存在于冷強(qiáng)化的冬裸麥葉胞外提取液中的多肽制備單克隆和多克隆抗體。用SDS-PAGE分離和從凝膠中電洗提(用經(jīng)生物放射預(yù)備的細(xì)胞)的單獨的多肽用作抗原。將抗體純化，用于多肽的免疫純化，以確定每一多肽的冰晶成核活性、抗凍性以及藕節(jié)它們葡聚糖酶或幾丁質(zhì)酶活性。此外，這些抗體用于多肽的免疫測定?？贵w的制備及純化，抗原的免疫純化，以及免疫測定的操作步驟按Harlow和Lane的詳盡描述(II-8.1)。這些多肽的檢測和定量可用于選擇為減少低溫引起的植物凍傷和產(chǎn)量降低而設(shè)計的程序。以前對程序的選擇依賴于越冬作物在冬季的生存，以增加對霜凍的耐受性，這些程序是不成功的。免疫測定因為具有高度敏感性，因而為選擇含有高濃度的與防凍(AFP的存在和冰晶核原的不存在)抑或耐凍(冰晶成核蛋白、抗凍蛋白和葡聚糖酶蛋白的存在)有關(guān)的植物提供了一種非傷害性的方法?？贵w也可用于其它植物中抗凍蛋白質(zhì)的鑒定和分離。此外，這些抗體也可通過與AFP結(jié)合來增加其抗凍活性。實施例18粗提取液和不同植物器官中的抗凍結(jié)活性將冷馴化冬裸麥的葉、冠和根分開。將植物的這些器官裝入塑料袋中，在液氮中冷凍并在室溫下解凍。然后將這些植物組織經(jīng)壓榨、過濾和離心處理，以獲得可溶性組分。測定這些組分調(diào)控冰晶生長的能力。在抗凍活性測定中，葉、冠和根部的可溶性組分均表現(xiàn)出六邊形雙棱錐的形成。這些結(jié)果表明，抗凍活性不但存在于粗提取液中，而且這一活性存在于植物的所有部位。實施例19具有抗凍活性的不同植物種和變種十六個不同的植物種或變種，既包括單子葉植物又包括雙子葉植物(見表IV)在5/2℃(目溫/夜溫)和16小時晝長下生長。所有這十六種植物的葉分別用真空抽提法提取，然后離心法分離，采用20mMCaCl2和10mM抗壞血酸，pH3.5的溶液。盡管在變種和種之間程度有所不同，但所有這十六種胞間提取液都表現(xiàn)出調(diào)節(jié)冰晶生長的正常模式的能力。在實驗的植物中，冬裸麥(Secale cereale cv.Musketeer)，玉黍螺(Vinca minor)，冬小麥(Triticum aestivum cv.Karatand Ruby)和冬大麥(Hordeum vulgrare cv.Acton)提取物通過形成六邊形雙棱錐冰晶來表現(xiàn)出對冰晶生長的最大影響，而冬canola(Brassica napus cv.Ceres)提取液對冰晶生長的影響最小，只形成六邊形的碟狀冰晶。
正如對這些多肽進(jìn)一步的描述所證明的那樣，至少11種多肽是在非冰凍低溫下合成，也就是圖9第4道和圖10的那些多肽，分子量從5kD到36kD，以及60，68kD，93到99kD和16kD的附加多肽。我們已經(jīng)證明，其中的六種多肽，包括兩種葡聚糖酶，兩種幾丁質(zhì)酶和兩種類西非竹芋精蛋白質(zhì)，具有出人意料的抗凍性。同時這些多肽也與本發(fā)明的其它多肽一樣，在很低的濃度下呈現(xiàn)抑制再結(jié)晶的活性。
重要的是關(guān)注圖3的這些結(jié)果，特別是時程實驗中的裸麥葉胞間蛋白在冷馴化過程中的變化。在霜凍的嚴(yán)重性和胞間多肽的增加之間存在一種相關(guān)性。胞外多肽的含量在第78天達(dá)到最高峰，這與裸麥植株在8小時晝長下的冷馴化進(jìn)入最嚴(yán)酷的階段相對應(yīng)。在萌芽后的第102天，大多數(shù)的胞外多肽降低了濃度，而余下的則再也檢測不到。這一結(jié)果表明當(dāng)植物春化時失去其冰凍耐受性。冰晶成核活性也在表V中顯現(xiàn)，其水平高達(dá)-7℃。這相信是對高等植物蛋白質(zhì)性質(zhì)中與冰晶核有關(guān)的性質(zhì)的首次報道。也有跡象似乎表明，在裝配供冰晶生長的模板過程中需要一些冰晶成核分子?？梢岳斫?，胞間空隙中的冰晶成核蛋白對于冷馴化葉中冰凍耐受性的發(fā)展是重要的。
關(guān)于如上所述而分離出來并與符合發(fā)明的描述的多肽已確立明確的結(jié)論，即植物對霜凍耐受的這一優(yōu)點，是依靠冰晶成核作用和對冰晶的調(diào)節(jié)這兩方面的抗凍結(jié)機(jī)制結(jié)合來實現(xiàn)的。這些胞外蛋白同樣具有抗真菌活性并提供對低溫病原體如真菌和細(xì)菌的抵抗力。已經(jīng)得到證明的是，冷馴化的冬裸麥葉即使當(dāng)首次降溫達(dá)到-12℃時也不會因結(jié)冰而受到傷害，而非馴化冬裸麥葉只要一結(jié)冰就受到傷害。同時，根據(jù)本發(fā)明，胞間空隙中冰的形成表明，AFP的存在并非并非決定冰凍條件下細(xì)胞生存的低溫極限的唯一因素。隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)的水分因為細(xì)胞間冰塊的形成而喪失，從而造成細(xì)胞本身的脫水。因此，霜凍耐受型植物的低溫生存極限也與細(xì)胞對干燥的耐受程度有關(guān)(II-16，II-18)。
傳統(tǒng)的栽培程序無法改善作物的抗凍性，是因為缺乏特異性的生理標(biāo)記(II-2)。正如本發(fā)明所證實的那樣，冰晶核原和冰凍耐受性植物產(chǎn)生固有AFP的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著農(nóng)業(yè)上的重大突破。這主要有兩個原因。首先，冰晶核原和AFP是第一次被證明直接參與影響植物體內(nèi)冰的形成過程的多肽，因而抗凍結(jié)和冰晶成核多肽可以被證明為增加越冬作物成活率的選擇標(biāo)記。其次，隨著冰晶核原和AFP的進(jìn)一步分離和描述，它們將用于生產(chǎn)更高成活率和更高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物。到將來，作物在因低溫冰凍的限制而不能栽種的地區(qū)和季節(jié)生長將成為可能。
正如已經(jīng)表述的那樣，也可用于生產(chǎn)冷凍食品以及生物組織的低溫貯藏。用這些多肽處理冷凍食品，可以確保食品在解凍后保持優(yōu)良的質(zhì)量。同樣，不論是生產(chǎn)冰淇淋這樣的產(chǎn)品還是低溫保藏生物組織，都需要更小的冰晶結(jié)構(gòu)。AFP限制冰晶的大小和阻止冰再結(jié)晶的特性對于提供優(yōu)良產(chǎn)品和減少貯藏?fù)p耗都是非常有用的。正如實施例中所證明的那樣，多肽在這些生物材料和食物成分中的用量是很小的。例如，在生物材料和食品中的每升含水量中加入象25微克這樣小量的多肽就會產(chǎn)生效果。冷馴化草本植物這的抗凍活性實施例20不同植物中的抗凍活性將冬裸麥(Secale cereale L.cv.Voima)、春裸麥(S.Cereale L.cv.Jo02)、冬小麥(Triticum aestivum L.cv.Ruby)和春大麥(T.Aestivum L.cv.Katepwa)種植于粗蛭石中，在20/16℃(晝/夜)、16小時晝長下生長，用經(jīng)改進(jìn)的Hoagland溶液(III-34)每周澆灌一次。7天后，或?qū)⑦@些植物收獲以提供非馴化的植物組織，或轉(zhuǎn)移到低溫(5/2℃)和8小時晝長下進(jìn)行7周的冷馴化。將春燕麥(Avena sativa L.cv.Ogle)、冬canola(Brassica napus cv.Ceres)、羽衣甘藍(lán)(B.Oleracea var.acephala cv.Dwarf蘭色卷曲)和煙草(Nicotiana tabacum L.)種植于Pro-Mix中并在23℃和16小時晝長下生長，直到長到夠大，以便提供足夠多的葉用于實驗。然后，或?qū)⑦@些植物收獲以提供非馴化的植物組織，或在上文描述的條件下冷馴化7周。
分別用冬大麥、冬小麥和春小麥、冬裸麥和春裸麥、春燕麥、菠菜、冬canola和春canola，以及羽衣甘藍(lán)的葉的胞外提取液做抗凍活性測定(圖15)。在所有的非馴化植物中都檢測不到抗凍活性，它們的胞外提取液中只形成平而圓的冰晶(圖15)。經(jīng)過冷馴化后，所有的春冬谷類的葉都耐受低溫，耐受的溫度范圍從-10℃到-27℃，而且全都表現(xiàn)出抗冰凍活性?？箖龌钚栽诮?jīng)冷馴化的冬裸麥、冬小麥、冬大麥、春裸麥、春小麥以及春燕麥、冬canola和羽衣甘藍(lán)中檢測到。因此，抗凍活性存在于本次實驗所檢測的所有耐凍的單子葉植物葉的胞外提取液中，它們包括實驗中所檢測的所有禾本科植物(冬裸麥、冬小麥、冬大麥、春裸麥、春小麥)(圖15，表1)。
在冷馴化的雙子葉植物冬canola和羽衣甘藍(lán)中也檢測到低水平的抗凍活性(圖15)。Duman和Olsen(III-11)還在羽衣甘藍(lán)葉的全提取液中檢測到了高水平的熱滯后現(xiàn)象，而我們只是對胞外提取液進(jìn)行檢測。羽衣甘藍(lán)的某些抗凍活性有可能存在于細(xì)胞內(nèi)。最先得到鑒定的胞內(nèi)AFP是在冬季比目魚的皮膚中(III-15)，它被認(rèn)為能夠防止外界的冰接種到表皮細(xì)胞上。對我們在羽衣甘藍(lán)中檢測到低的抗凍活性的另一種解釋，是與發(fā)育階段或環(huán)境因素有關(guān)。Urrutia等(III-52)在十字花科的其它成員，包括Brassica oleracea的亞種如卷心菜和Brussel的苗芽中檢測到熱滯后活性，但必須在5℃下冷馴化4個月。此外，還發(fā)現(xiàn)Brassica napus只有在經(jīng)暴露于輕微的冰凍條件下之后(III-27)才表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐凍性。因此，越冬的雙子葉植物產(chǎn)生AFP的條件，可能是必需暴露于輕微的霜凍中。煙草中檢測不到抗凍活性，即便經(jīng)過冷馴化也是如此。表1.12種草本植物在5/2℃和8小時晝長下冷馴化后的耐凍性(LT50，半數(shù)致死溫度)。LT50(℃)依據(jù)傳導(dǎo)性而確定，是取至少三個獨立冷馴化樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。單子葉植物 LT50(℃) 雙子葉植物L(fēng)T50(℃)冬裸麥 -27±1.0 菠菜 -17.3±1.3冬小麥 -19.5±1.7 冬canola -16.0±1.2春小麥 -15.0±0.6 羽衣甘藍(lán) -14.7±0.7冬大麥 -14.7±1.3 春canola -14.0±0.0春裸麥 -14.0±1.6 煙草 ＞1春燕麥 -10.3±0.5玉米＞-2實施例21在不同植物中胞外蛋白的累積我們對不同植物的胞外蛋白在低溫下的累積進(jìn)行了定量。將谷類植物的葉切成3cm的小段，進(jìn)行胞外蛋白的抽提，按照Hon等(III-22)的操作步驟。闊葉植物的葉則切成規(guī)格相等(3cm×1cm)的小片其它操作按照與谷類植物類似的步驟進(jìn)行。通過真空抽提的方法用20mM抗壞血酸和20mM氯化鈣(pH3)提取30分鐘，然后離心。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用經(jīng)Bio-Rad Laboratoties Ltd.，Mississauga，ON，Canada改進(jìn)的Bradford(1976年)蛋白質(zhì)測定法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測定，每個樣品做三次獨立重復(fù)。這些實驗的結(jié)果表明，低溫下蛋白質(zhì)在非原質(zhì)體中的累積普遍發(fā)生于單子葉植物(圖16)。在耐凍的雙子葉植物中同樣有小量胞外蛋白的累積(圖16)。實施例22在不同的冷馴化植物中AFP的免疫測定將冷馴化期間累積的胞外蛋白濃縮，并用SDS-PAGE檢測。為對AFP進(jìn)行免疫檢測的需要，采用預(yù)先制備的對三類Musketeer裸麥AFP(III-2)抗血清來探測胞外多肽的印跡。這三種抗血清分別特異性地作用于35和32kD GLP，35和28kD CLP，以及25和16kD TLP。這三種多肽都在冷馴化的Musketeer裸麥葉(III-2)胞外提取液中顯示抗凍活性。
將等量經(jīng)提取的胞外蛋白按照Laemmli(1970年)的方法，在15％SDS聚丙烯酰胺凝膠中分離。用超濾法將稀的提取液濃縮，并將對這些多肽進(jìn)行電泳和染色，染色用考馬斯亮藍(lán)或銀染色法(Bio-Rad)。為免疫印跡法測定的需要，按照制造商的指示使用微型轉(zhuǎn)移-印跡槽(Bio-Rad)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45-m硝基纖維素膜上。印跡在25mM Tris-HCl(pH7.6)，140mM NaCl，0.01％(v/v)Tween 20和5％脫脂奶粉的緩沖液中成塊?？苟沱淕LP和TLP的抗血清在1∶10000的稀釋度下使用，而抗冬裸麥CLP的抗血清按1∶1000稀釋并保溫過夜，如Antikainen等所述(1996年)。免疫反應(yīng)通過堿性磷酸酶結(jié)合的山羊抗兔IgG(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)以5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺鹽(BCIP；Sigma)和硝基藍(lán)四唑(NBT；Sigma)為底物而檢測。冬裸麥cv.Musketeer的胞外蛋白經(jīng)分離和轉(zhuǎn)移，作為所有免疫印跡的正對照。只要正對照在背景下清晰可辨，印跡就可以繼續(xù)展開。
所有三種AFP(即GLP，GLP和TLP)都在Musketeer冬裸麥、Voima冬裸麥、春裸麥、冬小麥、春小麥和春大麥的胞外提取液中用免疫方法檢測到，但燕麥中檢測不到(圖17，18)。這些AFP在經(jīng)檢測的禾本科小麥屬植物的所有成員中發(fā)現(xiàn)(III-6)。在雙子葉植物中，抗-TLP血清是唯一從冷馴化的菠菜中檢測到胞外多肽(分子量為25kD)的血清(圖19D)。有一種可能，是因為從冬裸麥多肽產(chǎn)生的抗血清與雙子葉植物的多肽不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。
冷特異性小麥蛋白WCS 120的分布與冷誘導(dǎo)AFP相似但不完全相同(III-24)。WCS120在冬小麥、冬裸麥和冬大麥中發(fā)現(xiàn)，但在燕麥或低溫敏感性的玉米和水稻，抑或在低溫耐受性的雙子葉植物如冬canola中都檢測不到(III-24)。實施例23胞外糖類對調(diào)節(jié)細(xì)胞間冰晶生長的作用植物同樣可以用分泌的糖類來調(diào)節(jié)細(xì)胞間冰晶的生長。我們用蒽酮實驗檢測所有非馴化和完全冷馴化植物胞外提取液中糖的濃度(圖20)。由于胞外提取物要受到濃硫酸的水解，因此這一實驗可能既測定了提取液中的單糖，又測定了因多糖和糖蛋白水解而釋放的單糖。通過在5％的顯著度下的t檢驗，我們發(fā)現(xiàn)，冬裸麥、春燕麥、冬大麥和冬小麥在冷馴化后胞外糖類顯著增加(圖20A)。在春小麥或春裸麥中則觀測到胞外糖類發(fā)生了較小的變化。而在玉米中，胞外糖類水平在冷誘導(dǎo)下的增加則不呈現(xiàn)統(tǒng)計意義上的顯著。我們的結(jié)果證明，在非原質(zhì)體中累積糖類的同一植物通常也累積AFP(圖16，圖17，圖18和圖20)。這些結(jié)果表明，胞外糖類的累積在調(diào)節(jié)冰的形成上冰不能代替AFP。相反，更有可能的情況是，這些糖類增強(qiáng)了冷馴化植物組織的抗凍活性。冬裸麥的胞外糖類在冷馴化期間的累積在前人的研究中也曾被發(fā)現(xiàn)過(III-37，III-38，III-39)，但早期研究所檢測的糖類是更大的多聚糖，被認(rèn)定為阿拉伯糖基木聚糖(III-29)。
為減少抗凍蛋白發(fā)生效用所需的用量，或為增強(qiáng)或補(bǔ)足抗凍蛋白的抗凍活性，在抗凍蛋白中加入糖類是有用的。為達(dá)到使用一種或多種抗凍蛋白所達(dá)到的同樣目的，使用一種或多種類型的糖類與一種或多種抗凍蛋白的配方也是有效的。合適的糖類包括果糖，葡萄糖，蔗糖或果聚糖(多聚果糖)。例如，為增強(qiáng)抗凍蛋白的活性，可在將一種或多種抗凍蛋白加入冰淇淋之前、之后或在加入抗凍蛋白的同時將果糖或其它糖加入冰淇淋中。實施例24用加熱的方法純化冬裸麥抗凍蛋白為簡化AFP的純化過程，對冬裸麥AFP的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了測定。冬裸麥和冬小麥在在低溫下生長，如實施例1所述。全葉組織提取液的獲得，是用含20mM抗壞血酸和20mM CaCl2的水性緩沖液，或用含20mM重碳酸銨的緩沖液與葉和/或冠組織勻漿，而胞外提取液則按照實施例1所述的程序而獲得。將全葉組織和胞外提取液加熱到60℃持續(xù)30分鐘，或加熱到100℃持續(xù)10分鐘，離心除去變性蛋白質(zhì)和微粒物質(zhì)。不論在加熱前還是加熱后，用觀測對冰晶的調(diào)節(jié)來測定抗凍活性，都發(fā)現(xiàn)冬小麥和冬裸麥的全葉組織提取液和胞外提取液的上層清液在pH3到pH8的范圍內(nèi)存在抗凍活性。用SDS-PAGE檢測經(jīng)加熱的提取液，顯示類葡聚糖酶蛋白和類西非竹芋精蛋白在加熱后仍然可溶(圖26)。這一簡化純化過程的技術(shù)對重組蛋白也有效。這一技術(shù)對本申請書所描述的其它多肽或多肽片段同樣有用。
本發(fā)明從植物材料或重組表達(dá)系統(tǒng)中分離抗凍蛋白的方法，該方法包括將可溶性提取物加熱到至少60℃左右，然后將經(jīng)加熱的提取液離心或過濾，以除去變性的蛋白質(zhì)和不溶性物質(zhì)。類幾丁質(zhì)酶AFP的DNA分離和蛋白質(zhì)序列(CH-9和CH-46)實施例25類幾丁質(zhì)酶AFP的cDNA分離本研究的目的，是分離幾丁質(zhì)酶的cDNA，并確定那些DNA編碼了類幾丁質(zhì)酶AFP。那些熟練這一技術(shù)的人相信，克隆具有抗凍活性的幾丁質(zhì)酶是困難的，因為植物基因組本身含有編碼幾丁質(zhì)酶的基因族。同樣有人認(rèn)為，在某些場合下，只需對一個蛋白質(zhì)作很小的修飾，就可以對該蛋白賦予抗凍活性，因此很難將不具備抗凍活性的幾丁質(zhì)酶同具備抗凍活性的幾丁質(zhì)酶區(qū)分開來。例如，KVEwart等(1998，Biochemistry 374080-4085)展示，在魚的C-型外源凝集素中將其中一段Glu-Pro-Asn改變?yōu)镚lu-Pro-Asp，就將該蛋白賦予了抗凍活性。通過從在使得只有具備抗凍活性的幾丁質(zhì)酶才能夠表達(dá)的條件下，亦即，低溫而無病原體或其它壓力的條件下生長的裸麥植株中分離mRNA的方法，我們得以克隆帶有抗凍活性的幾丁質(zhì)酶。冷誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的cDNA被分離然后分類，以確定哪一段cDNA編碼了對冰晶具有調(diào)節(jié)能力的蛋白。熟練于這一技術(shù)的同行將會發(fā)現(xiàn)，還可用其它的方法來克隆編碼裸麥AFP的基因。25冬裸麥基因組DNA的Southern印跡分析對裸麥基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析，以估計裸麥基因組中存在多少個幾丁質(zhì)酶基因，從而知道可能分離出多少個克隆?；蚪MDNA按照改進(jìn)后的方法提取(III-42)。從8日齡的裸麥植株中采集葉和冠組織，在液氮中冷凍，用研缽研成粉末。將經(jīng)上述處理的植物組織加入到5mL 60℃的抽提緩沖液(100mM Tris，1.4M NaCl，20mM EDTA，pH 8.0，2％(w/v)CTAB，使用前加入0.3％(v/v)2-巰基乙醇)中，并加入50mg PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。該溶液在60℃下保溫并振蕩1小時，冷卻至室溫，用6mL氯仿∶辛醇(24∶1)萃取。經(jīng)3000rpm離心20分鐘后，上層液再次用6mL氯仿∶辛醇(24∶1)萃取。加入0.5倍體積的5M NaCl和2倍體積的95％EtOH，先在4℃下保溫30分鐘，然后在-20℃下保溫10分鐘，以沉降DNA。經(jīng)離心后，沉淀物用70％EtOH洗滌兩次，干燥后用TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA)再次懸浮。DNA用核糖核酸酶A和蛋白酶K處理，用苯酚∶氯仿∶IAA(25∶24∶1)萃取兩次，并在20℃下用0.1倍體積的3M NaOAc，pH 5.2和2倍體積的100％EtOH沉降。經(jīng)離心后，沉淀物用70％EtOH洗滌兩次，干燥并在200μL TE中再次懸浮。
從8日齡非馴化冬裸麥葉和冠組織中提取的全部DNA用Bam HI，Eco RI，Hind III，Xba I或Xho I限制性內(nèi)切酶消化。斷片用瓊脂糖凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。采用一種已知的可由病原體誘導(dǎo)的基本大麥幾丁質(zhì)酶cDNA，即pHvch2a，用于鑒別幾丁質(zhì)酶基因。將膜與pHvcht2a在兩種不同的嚴(yán)格控制條件下雜交30％或50％甲酰胺，42℃，6×SSC，并在42℃下洗至0.2×SSC和0.1％ SDS，然后用放射自顯影膠片曝光(圖3B)。在高嚴(yán)格條件(50％甲酰胺)下至少存在三個基因，因為在Eco RI，Hind III和Xba I道上都有三個DNA斷片同pHvch2a探針雜交。高嚴(yán)格條件下有兩條帶出現(xiàn)在BamHI道。在低嚴(yán)格條件雜交中，顯然還多出兩個基因，因為在Eco RI道出現(xiàn)五條帶。五個DNA斷片雜交到探針上，其中三條非常模糊。相似地，在Xba I和Hind III道至少出現(xiàn)兩條額外的帶。25.1冷馴化冬裸麥cDNA文庫的篩選將已知的可由病原體誘導(dǎo)的基本大麥幾丁質(zhì)酶cDNA，即pHvch2a，用于篩選冷馴化冬裸麥的cDNA文庫。PHvch2a的序列是插入pBluescript SK+的Eco RI位點中的一段1028bp。Eco RI用于分離用作探針的斷片。用作探針的斷片的大小為915bp，因為插入者在靠近cDNA的3′端有一個Eco RI限制性位點。PHvcn2a編碼一個幾丁質(zhì)酶，該幾丁質(zhì)酶具有高度保藏的幾丁質(zhì)酶催化功能區(qū)，但缺失幾丁質(zhì)捆綁功能區(qū)。由于大麥也是單子葉植物，而且與裸麥?zhǔn)墙H(III-6)，因此可以想象，大麥和裸麥的幾丁質(zhì)酶或許具有非常相似的核苷順序。
在篩選文庫前，用Northern印跡分析法確定pHvcht2a是否適合于篩選文庫和檢測所有的裸麥幾丁質(zhì)酶。全RNA從非馴化和冷馴化裸麥葉中分離，并在變性甲醛瓊脂糖凝膠中進(jìn)行凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。將膜同pHvcht2a在高嚴(yán)格條件(50％甲酰胺，6×SSC，42℃)下雜交，并在42℃下洗至0.2×SSC和0.1％ SDS。印跡曝光到放射自顯影膠片上，顯示出雜交到探針上的mRNA。大小分別為1.25kb和1.00kb的兩種不同的幾丁質(zhì)酶mRNA得到識別。另一大約3.7kb大小的轉(zhuǎn)錄本也雜交到pHvcht2a上，但這可能是因為與探針的非特異性結(jié)合。1.25和1.00kb的轉(zhuǎn)錄本分別與依據(jù)35和26kD類幾丁質(zhì)酶AFP所預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本大小相符合。pHvcht2a探針用于篩選從冷馴化裸麥葉分離的多聚A+RNA得到的λZap-cDNA文庫，以識別全長度幾丁質(zhì)酶cDNA，如下文所述。
用前文所述(III-33)的經(jīng)改進(jìn)的方法從組織中提取全RNA。將液氮冷凍的植物組織在研缽中研磨。將Z6緩沖液(8M鹽酸胍，20MmMES pH 7.0，20mM EDTA)和200μL的2-巰基乙醇加入到在冷凍條件下進(jìn)一步均質(zhì)化的植物組織中。將這一漿狀物與1倍體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混和以提取蛋白質(zhì)。經(jīng)8000×g離心15分鐘，上層清液再次用1倍體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇提取，與1倍體積的異丙醇和0.1倍體積的3M NaOAc pH 5.2混合，并在-20℃保溫2小時以沉降RNA。將溶液在8000×g下離心45分鐘，使RNA沉降。將沉淀物用70％EtOH洗滌2次，干燥后在經(jīng)DEPC處理的水中再次懸浮。RNA用8M LiCl在20℃下沉降析出。在8000rpm下離心45分鐘，使RNA沉淀，并用70％EtOH洗滌兩次。將沉淀物干燥，在經(jīng)DEPC處理的水中再次懸浮。用PolyATtract mRNA分離系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，USA)將多聚A+mRNA從全RNA中分離出來。
用λZap-cDNAGigapack克隆試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)將多聚A+RNA制成cDNA文庫。將膜在含有6×SSC，0.5％(w/v)SDS，50％甲酰胺，5×Denhardt氏溶液(1×Denhardt氏溶液是0.02％(w/v)Ficoll，0.02％(w/v)PVP，0.02％(w/v)BSA)和100mg mL-1剪切變性的鮭魚精子DNA的50％甲酰胺溶液中于42℃下進(jìn)行至少小時的預(yù)雜交。用大麥幾丁質(zhì)酶cDNA探針在42℃下雜交過夜。探針由Tomas Bryngelsson博士(瑞典農(nóng)業(yè)科技大學(xué)，Svalov，Sweden)提供，用32P-dCTP作標(biāo)記，隨機(jī)裝填至大約1×108至2×108cpm μg-1DNA。雜交液的成分與預(yù)雜交時一樣，只是不用鮭魚精子，而用新鮮的變性標(biāo)記探針添加到1×106cpm mL-1濃度。在42℃保溫過夜后，在42℃下將膜洗到從1×SSC和0.1(v/v)SDS至0.2×SSC和0.1(v/v)SDS的不同嚴(yán)格條件，歷時30分鐘。大約92700個克隆得到篩選，89個陽性區(qū)被識別。在第二輪篩選中，從陽性區(qū)回收噬菌體并分成17組。E.coli細(xì)胞用經(jīng)分組的噬菌體再感染，重新涂平板，轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，用pHvcht2a再篩選。識別出四十八個推定的克隆，并通過體內(nèi)切除從噬菌體中重組到pBluescript SK-質(zhì)粒上。這些克隆用重組質(zhì)粒pCHT-1至pCHT-48表示。25.2推定克隆的分組25.2.1 Pvu II限制性酶消化和G-軌跡分析Pvu II限制性酶消化可讓重新構(gòu)建的pBluescript質(zhì)粒釋放出插入片段，以決定插入片段的大小。pBluescriptr質(zhì)粒有2個Pvu II酶切位點，相距445bp，側(cè)翼有多個克隆位點。酶消化釋放出插入片段，并將450bp結(jié)合在實際大小的插入片段。在瓊脂凝膠上質(zhì)粒大小為2500bp，插入片段顯示為另一帶。若插入片段本身含有任何的Pvu II限制位點，那么總體上應(yīng)有二條或更多的帶出現(xiàn)，即2500bp代表質(zhì)粒，其它帶為插入片段總的大小。消化克隆的瓊脂凝膠電泳顯示不同的插入片段大小為350-2655bp之間。一些克隆顯示相同的帶型，根據(jù)Pvu II限制性酶切模式可首先將這些克隆分組。消化后有17類別具有相似的帶。很明顯，由含31個克隆的10個類別的插入片段大于950bp，而含17克隆的7個類別插入片段小于950bp。估計用于36KD和26KD類幾丁質(zhì)酶AFP全長轉(zhuǎn)錄使用pHvcht2a的Northern印跡雜交資料的插入片段長度最小為950bp。G-軌跡分析可決定那些克隆是相同的因而為富余克隆。對每個克隆以T3和T7序列為引物進(jìn)行桑格序列分析的G反應(yīng)，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以引物基因組的每個克隆進(jìn)行帶型對照，確定哪些相同。G-軌跡分析可獲得一些序列資料并指示相同的克隆。實驗顯示有9個克隆的8個類別相互克隆不匹配。25.2.2 pHvcht2a雜交將酶消化物經(jīng)凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移DNA到尼龍膜上，在嚴(yán)格控制條件下(6×SSC，50％的甲酰胺，42℃)以pHvcht2a為探針雜交后高嚴(yán)格控制條件(0.2×SSC，0.1％ SDS，55℃)沖洗，決定假陽性DNA克隆(圖6B)。實驗顯示有9個克隆未和pHvcht2a重新雜交。這些克隆是PCHT-10，-13，-17，-18，-19，-28，-32，-38和-39，這些基因可能不是幾丁質(zhì)酶cDNA。25.2.3純化的幾丁質(zhì)酶cDNA的序列分析。
首先進(jìn)行的序列分析是那些在pvuII限制酶切資料中具有全長序列的克隆，即選擇那些插入序列大于950bp的克隆。對這些克隆首先進(jìn)行以下T3和T7通用引物的雜交分析，在此基礎(chǔ)上可采取一些序列分析策略以獲得更詳盡的序列資料。一些具有限制性酶切位點的序列允許插入片段的部分從質(zhì)粒中刪除，而后，以T3或T7為引物重新連結(jié)質(zhì)粒測序以得到更多的序列信息。在一些情況下不可能通過以上方法測序，還需要以序列資料來設(shè)計引物，繼續(xù)進(jìn)行測序。PCHT9插入片段為N-末端氨基酸序列，和35KD類幾丁質(zhì)酶ATP的N-末端序列(III-23)相同。PCHT46的插入片斷也具有全長序列。基因翻譯產(chǎn)物和26KD的類幾丁質(zhì)酶AFP相同，且相對其它類別顯示有最長的5’非翻譯區(qū)。估計基因翻譯產(chǎn)物的N-末端氨基酸序列和pHvcht2a的氨基酸序列非常相似。兩種基因都具有ATG起始密碼和可讀框(ORF)，以保證其氨基酸順序和已知幾丁質(zhì)酶(順序)一致。25.2.4 CHT9特征分析在加拿大多倫多大學(xué)的兒童醫(yī)療生物技術(shù)研究中心，根據(jù)多種構(gòu)建質(zhì)粒和由初始的及不斷增長的順序資料設(shè)計引物，用ALFexpressDNA測序儀雙向測定CHT9順序，。cDNA帶聚A尾，長度為1193bp。可讀框(ORF)包括編碼318個氨基酸，由位于插入片段5’末端下游的48bp蛋氨酸密碼子開始到ATG啟動密碼子的955bp終止密碼子結(jié)束。估計基因產(chǎn)物的第一個氨基酸為谷氨酸，在可讀框(ORF)的21位點，和編碼35KD類幾丁質(zhì)酶蛋白的N-末端核酸序列相同。估計基因產(chǎn)物含301個氨基酸，分子量為31647Da，等電點為6.96。在3’端有190bp的非編碼區(qū)。cDNA的PSORT分析顯示有一20個氨基酸的信號序列和蛋白質(zhì)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移有關(guān)(圖21(c)。本發(fā)明也包括一些突變體，這些突變體是和信號順序(或編碼核酸分子)生物功能相同的肽、多肽及蛋白質(zhì)，顯示了相似或相同的信號靶活力。有關(guān)抗凍多肽的突變體討論將在以下涉及到信號序列本身的不同。這一信號序列可容易地結(jié)合到除抗凍多肽以外的多肽上以激活它們向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明還包含有通過重組DNA將肽、多肽或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外的方法，采用蛋白質(zhì)分析或其它技術(shù)將產(chǎn)生的多肽、肽或蛋白質(zhì)固定在信號序列(或相同生物功能序列)上，將多肽、肽或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外。25.2.5 CHT46特征分析已知有很多可用克隆能編碼26KD的類幾丁質(zhì)酶AFP。通過pharmacia T7 kit試劑盒對可能的克隆測序，以決定那些具有全長且能編碼26KD類幾丁質(zhì)酶AFP的克隆。利用T3和T7引物作用產(chǎn)生的順序排列信息，確定CHT46編碼全長的幾丁質(zhì)酶及26KD類幾丁質(zhì)酶AFP，及它的全部順序(圖22)。CHT46含有998bp大小的插入片段，它有從啟動252氨基酸的可讀框(ORF)的ATG開始的78bp下游?；虍a(chǎn)物的分子量為26835Da，等電點為8.25。終止密碼子位于自ATG啟動密碼子開始的757bp位點，含有163bp為3’非翻譯區(qū)。PSORT分析也預(yù)測這種蛋白有一22個氨基酸的序列[圖(d)]，并被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外。25.2.6 CHT9和CHT46的序列對比通過使用GCG順序分析軟件包的GAP研究表明，PCHT9和PCHT46(圖23)在核苷酸水平有62.1％的相同，氨基酸水平有58.6％的相同和63.3％的相似。同時，CHT46在核苷酸和氨基酸水平和PHvcht2a較PCH9更為相似(兩個水平都大于90％的相似)。ABLAST研究可用于每種克隆，以揭示和關(guān)系相近種類其它幾丁質(zhì)酶的相似性分析。CHT9和中國春小麥幾丁質(zhì)酶高度同源(在核苷酸和氨基酸水平高達(dá)90％以上的相似)。對比CHT9；CHT46及裸麥種子幾丁質(zhì)酶，它們在核苷酸水平有82％相同，在氨基酸水平有86.6％相似。而CHT46和裸麥種子幾丁質(zhì)酶在核酸水平僅為57.4％相同，氨基酸水平為62.2％的相似。CHT9，CHT46，Hvcht2a，煙草幾丁質(zhì)酶(x16939)，谷幾丁質(zhì)酶(D16223)；春麥幾丁質(zhì)酶(x76041)及裸麥種子的2種幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列非常保守(conserved)。我們以前的結(jié)果顯示煙草在低溫條件(圖16和19)并不累積細(xì)胞外AFP酶或幾丁質(zhì)酶。盡管煙草和裸麥幾丁質(zhì)酶序列是高度保守的，但事實是裸麥蛋白受低溫誘導(dǎo)，顯示抗凍活力而煙草蛋白是非低溫誘導(dǎo)，不顯示抗凍活力。
根據(jù)圖21和22的順序設(shè)計cDNA探針來鑒定類幾丁質(zhì)酶AFP。一種是404bp的探針(CH46bp)，由一段和CHT46的第340位核苷酸到774位核苷酸的基因段相補(bǔ)的基因序列組成[圖22(b)]。第二種是404bp探針(ch9hp)，其序列和CHT9序列的以541位核苷酸開始到第945位核苷酸結(jié)束的同源區(qū)互補(bǔ)[圖21(a)]。這些探針的核苷酸序列突變體(相同生物功能探針)同樣是有益的。這些探針有益于用以下方法鑒定相似的DNA，cDNA或RNA序列。將有疑問的DNA或RNA轉(zhuǎn)移到膜上，最好接著以50％甲酰胺，6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt溶液(a×1溶液是0.02％W/V聚蔗糖，0.02％W/V PVP，0.02％W/V BSA)和100kg/ml切割變性鮭魚精子DNA條件下預(yù)雜交，溫度為42℃，有疑問的DNA或RNA可在同樣條件下，以標(biāo)記的變性ch46p或標(biāo)記的變性ch9hp代替鮭魚精子DNA進(jìn)行雜交。膜最好于42℃下用0.2×SSC和0.1％SPS沖洗30分鐘。
正如以下將要詳細(xì)討論的，來發(fā)明不僅包括裸麥類幾丁質(zhì)酶AFP(由圖21和22所示的基因序列編碼)，而且還含有相同生物功能活力的肽，多肽和蛋白質(zhì)，它們都顯示出和裸麥ATPs相同或相似的抗凍活力。本發(fā)明也包括一些和CHT9，CHT46，PCHT9或PCHT46具有相同生物功能的核苷酸序列。實施例26幾丁質(zhì)酶CHT9和CHT46的表達(dá)分析26.1在低溫和非低溫馴化葉的表達(dá)分離非低溫馴化和低溫馴化葉子的總RNA含量。通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳(圖11A)，分離出RNA總量，顯示為核糖體RNA帶。將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，后和CHT9、CHT46基因特異探針雜交。根據(jù)兩者不同的3’非翻譯區(qū)分別設(shè)計兩種探針。CHT9基因特異探針為含有30個核苷酸寡核苷酸CGAATAATGGTGCAATCCATCGCAAGATGC。CHT46基因特異探針是長度為292bp的cDNA片段，它包含轉(zhuǎn)錄子聚A尾(TCGAGTGCGGCATGGGCCGGAACGACGCCAACGTCGACCGCATCGGCTACTACACACGCTACTGCGGCATGCTTGGCACGGCCAGGGGGGGCAACTCGACTGCATCACCCAGCGAAACTTCGCTAGCTAGACAGTGTATCTCACGTGTTATAAATAAATGGCAATGCATATGCCATCCCCGAATAAATAATTCAACATGTGACAGTTGATTTGTATGGTAATACGAGTAAGTTGTTGCAACAAATTATGAATATTGAATAAAATCAAATTTTATCAAAAAAAAAAAAAAAAA)。
CHT9基因特異探針雜交產(chǎn)物為1.25kb轉(zhuǎn)錄物而CHT46基因特異探針雜交物為1.0kb轉(zhuǎn)錄物。對于CHT46基因特異探針，應(yīng)在高嚴(yán)格控制條件(0.2×SSC，0.1％SDS，溫度為65℃)下沖洗，以減少探針的聚A尾引起的非特異結(jié)合。非馴化和冷馴化RNA的相對強(qiáng)度由光密度來衡量。對于CHT9和CHT46，冷馴化葉子的強(qiáng)度分別較非冷馴化葉的強(qiáng)度增加了2.5和1.3倍。26.2冷馴化期間不同裸麥組織的表達(dá)冷馴化期間對裸麥組織取樣。于冷馴化期間的一周，三周，五周，七周后分別對冠(分生或分裂組織)，新葉、老葉和根組織取樣，以非冷馴化條件生長了四周的植物組織為對照。當(dāng)植物轉(zhuǎn)移到冷馴化條件下以后長出的葉子為新葉樣本，在非冷馴化條件下，轉(zhuǎn)移到冷馴化條件以前已伸展的葉子為老葉樣本。
抽提出樣本組織的總RNA含量并以變性甲醛凝膠電泳(圖13)分析，后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用以上描述的CHT9和CHT46基因特異探針進(jìn)行Northern印跡分析。CHT9的雜交產(chǎn)物為1.25kb的轉(zhuǎn)錄物(根組織除外)，這一轉(zhuǎn)錄物的信號強(qiáng)度在冷馴化一周后較低，但隨后不斷增強(qiáng)，在馴化七周后達(dá)到最高；CHT46基因特異探針的雜交產(chǎn)物為1.0kb的轉(zhuǎn)錄物，轉(zhuǎn)錄物的信號強(qiáng)度變化同上，即在冷馴化一周后較低，但隨后不斷增強(qiáng)。CHT46探針雜交轉(zhuǎn)錄物存在于包括根組織在內(nèi)的所有組織樣本。26.3非馴化、冷馴化和馴化減少條件下在葉中的表達(dá)為證實低溫誘導(dǎo)是可逆轉(zhuǎn)的，我們將裸麥植物置非馴化條件下一周，后移入冷馴化條件七周，再轉(zhuǎn)回到非冷馴化條件。以非冷馴化條件下生長二周的植物作為對照。冷馴化期間的取樣時間為6、12、36小時和1、3、5、7周后，7周后將植物轉(zhuǎn)移到非冷馴化條件下，分別于6、12、30小時和9天后取樣。分別從這些樣本組織中抽提RNA總量，以甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析帶型，而后和基因特異探針(見實施例26.1)雜交。對于CHT9基因特異探針，1.25kb的轉(zhuǎn)錄物于冷馴化七周以后及轉(zhuǎn)移到非馴化條件后的6、12小時才得到，以后信號強(qiáng)度減弱，而在其它樣本組織中無信號強(qiáng)度；而PCHT46基因特異探針雜交物(在低控制條件下為1中kb的轉(zhuǎn)錄物出現(xiàn)于所有的樣本組織，其信號強(qiáng)度在低溫強(qiáng)化條件下不斷提高，而在植物轉(zhuǎn)移到非馴化條件后慢慢消失。這些結(jié)果證實CHT9和CHT46的表達(dá)低溫調(diào)節(jié)可逆轉(zhuǎn)。26.4水楊酸處理的葉中的表達(dá)水楊酸能誘導(dǎo)編碼抗真菌幾丁質(zhì)酶的基因表達(dá)。在冷馴化條件下，對生長了二周的裸麥植物進(jìn)行20ppm的水楊酸(溶解于0.5％Tween液)噴霧，一天一次，連續(xù)8天。以未噴霧植物為對照，每天水楊酸處理后一小時對植物葉組織取樣以分離總RNA含量，以CHT46基因特異探針的Northern印跡法(在低控制條件下沖洗)分析表達(dá)情況。1kb和3.7kb的轉(zhuǎn)錄物存在于所有樣本中(水楊酸處理或非處理樣本)，3.7kb的轉(zhuǎn)錄物可能是由于低控制條件沖洗造成的非特異結(jié)合。開始，轉(zhuǎn)錄物的信號強(qiáng)度相似，水楊酸處理5和6天后，對照樣本的轉(zhuǎn)錄物信號強(qiáng)度高于水楊酸處理的植物樣本轉(zhuǎn)錄物強(qiáng)度。使用CHT9基因特異探針不產(chǎn)生任何陽性結(jié)果。以上結(jié)果顯示CHT46和CHT9的表達(dá)并非象抗真菌幾丁質(zhì)酶基因那樣由相同的信號誘導(dǎo)。實施例27擬南芥(Arabidopsis thaliana)中CHT46和CHT9的超級表達(dá)將CHT9和CHT46克隆到pkylx7.1-35s2 Agrobacterinmtemefaciecs相容性載體，通過電穿孔將載體轉(zhuǎn)化到A.tumefacicn菌株(C58PGV3850)中.真空抽濾使菌株導(dǎo)入擬南芥后，將獲種子。對這些種子進(jìn)行卡那霉素抗性篩選，對T1植物進(jìn)行插入片段數(shù)量分析。含有兩個CHT9或CHT46中任何一個插入片段的植物在T3代表純合性。通過基因特異探針的Northern印跡法(實施例25)和抗凍活力測定證實類幾丁質(zhì)酶AFP的累積?？箖龌盍δ茉趯嵤├?8所描述的粗抽提物或?qū)嵤├?描述的細(xì)胞外抽提物中加以測定。
DNA編碼類幾丁質(zhì)酶AFP的超表達(dá)“編碼DNA”是指編碼本發(fā)明中的冬裸麥AFP或其它AFP例類幾丁質(zhì)酶AFP的蛋白質(zhì)的染色體DNA，質(zhì)粒DNA，cDNA或合成DNA。本發(fā)明的編碼DNA可導(dǎo)入微生物，植物或動物寄主。微生物寄主包括藻、細(xì)菌、真菌和原生動物。導(dǎo)入寄主的編碼DNA能嵌入到微生物細(xì)胞核才細(xì)胞器的質(zhì)粒、染色體中。超級表達(dá)是在通常情況下不存在的重組蛋白的累積或較一般的內(nèi)源基因有更高的表達(dá)水平。實施例28大腸桿菌(E.coli)中的CHT9的表達(dá)及類幾丁質(zhì)酶AFP的分泌28.1克隆CHT9到細(xì)菌表達(dá)載體將CHT9基因插入到大腸桿菌((E coli)表達(dá)載體pET12a(Novagen，Madson，WI)的BamHI位點，以合成寡核苷酸5’-TTAAGGATCCGGAGCAGTGCGGCTCGCAGGC和5’-GGTTGGATCCTGCGAACGGCCTCTGGTTGTA作為引物對CHT9進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在基因的開始和結(jié)尾產(chǎn)生BamHI酶切位點。用BamHI消化約800bp PCR擴(kuò)增片段，連接pET12a的單一BamHI位點。將連接混合物轉(zhuǎn)化入到DH52，涂布LB-氨苯青霉素(150kg/ml)平板，37℃培養(yǎng)。分析單個菌落的質(zhì)粒，以發(fā)現(xiàn)含有按正確方向插入BamHI片段的克隆，例如CHT9閱讀方向和載體上的分泌信號方向相同。鑒定菌落并命名為cht9/12a。為證實PCR-擴(kuò)增的幾丁質(zhì)酶cDNA的DNA序列，根據(jù)廠商指南(Pharmacia，Montreal，Quebec，Canada)使用T7 DNA測序試劑盒，按照雙脫氧核苷酸鏈終止法進(jìn)行雙鏈DNA測序。28.2 ch9/12a重組質(zhì)粒的表達(dá)用QIAGEN DNA純化試劑盒(QIAGEN Germany)從DH52細(xì)胞中純化蟲ch9/12a的質(zhì)粒DNA，后轉(zhuǎn)化到來源于Novagen(Madison，WI)的寄主BL-21(DE3)細(xì)胞，這些細(xì)胞含有質(zhì)粒嵌入的T7聚合酶以指導(dǎo)質(zhì)粒編碼基因的表達(dá)。為表達(dá)類幾丁質(zhì)酶AFP，從新鮮的劃線LB平板挑取單個菌落；接種于2ml LB/氨芐青霉素培養(yǎng)液中于30℃振蕩培養(yǎng)，過夜，后將1ml的過夜培養(yǎng)物接種于含50ml LB/氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml燒瓶中振蕩培養(yǎng)，溫度為30℃，直到培養(yǎng)液的OD600達(dá)到0.4。再在培養(yǎng)液中加入IPTG(sigma)直到其最終濃度為0.4mm，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，而后將培養(yǎng)液于4℃下離心(轉(zhuǎn)速為5000×g)5分鐘，收獲細(xì)胞。28.3表達(dá)蛋白的純化和分析為純化周質(zhì)蛋白，將細(xì)菌沉淀重新懸浮于冰冷20％蔗糖，2.5mmEDTA，20mm tris-HCL PH8.0液中，直到其達(dá)到50D550單位/ml的濃度并在冰上培養(yǎng)10分鐘。將懸浮液離心(轉(zhuǎn)速為1500×g)5分鐘，細(xì)菌沉淀重新以上操作，后再將懸浮液離心(轉(zhuǎn)15000×g)10分鐘。上清液即為周質(zhì)蛋白片段，運(yùn)用SDS-PAGE和由裸麥類幾丁質(zhì)酶AFP產(chǎn)生的抗血清免疫印跡法進(jìn)一步分析(見實施例17)。
細(xì)菌表達(dá)載體pET12a含有ompT(外膜蛋白T)蛋白的前導(dǎo)序列。在某些情況下，目的蛋白可被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外空間。前導(dǎo)序列對于轉(zhuǎn)移到周質(zhì)是必需的，但不是充分的。蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)也依賴于目的蛋白的成熟區(qū)。從BL-21細(xì)胞獲得周質(zhì)部分的一個簡單方法是滲透休克方法。圖24顯示了細(xì)胞中用pEL12a/cha轉(zhuǎn)化的細(xì)胞幾丁酶的表達(dá)。所有細(xì)胞獲得的蛋白抽提物顯示了約32Kda(列2.4)主要帶，而在對照組細(xì)胞中缺失(列1，3)。盡管周質(zhì)部分含有表達(dá)蛋白，但表達(dá)的類幾丁質(zhì)酶AFP的大多數(shù)存在于細(xì)胞內(nèi)(資料未見)。為評估周質(zhì)部分中的類幾丁質(zhì)酶AFP是否有抗凍活力，將這些部分濃度提高到1000倍，后通過觀察冷凍過程中形成的冰晶形態(tài)來確定其抗凍活力。結(jié)果顯示這些片段具有抗凍活力，因為冰晶以垂直六位雙金字塔形式生長。重組蛋白同樣顯示有幾丁質(zhì)酶活力，這可由實施例15所描述的方法測定。實施例29在Pichia pastoris中類幾丁質(zhì)酶AFP的表達(dá)和分泌29.1具C-末端His/MYC標(biāo)記的CHT基因從Ivitrogen(San Diego，CA)購買Pichia表達(dá)載體，將CHT9 cDNA插入到表達(dá)載體PGAPZA的EcoRI和Notl位點，以合成寡核苷酸5’-AATTGAATTCGAGCAGTGCGGCTCGCAGGCC和5’-AATTGCGGCCGCTGCGAACGGCCTCTGGTTGTA為引物將CHT9進(jìn)行PCR擴(kuò)譜，分別在cDNA的5’和3’端產(chǎn)生EcoRI和Notl位點。用Ecoli和Notl消化擴(kuò)增片段，和用相同限制性酶消花的PGAPZαA載體相連。將連接混合物轉(zhuǎn)化到DH52，涂布在低鹽LB-Zeocin(25ug/ml)平板，37℃培養(yǎng)。分析重組質(zhì)粒鑒別有EcoRT/Notl片段嵌入酵母-因子序列中的菌落并命名為pGAPZ/cht9。用以上提到的DNA序列分析方法確定重組質(zhì)粒的DNA序列。以His/MYC作為標(biāo)記的策略有助于產(chǎn)生活性幾丁質(zhì)酶和其它抗凍蛋白。因此本發(fā)明也包括純化幾丁質(zhì)酶和其它抗凍蛋白的一種方法。和His/MYC標(biāo)記相似的標(biāo)記也可用于純化。29.2無C-末端標(biāo)記的CHT9構(gòu)建克隆以合成的新寡核苷酸5’-TCTGGAGACTATGCGAACGGCCTCTTGGTT-3’，及以上已描述的5’-寡核苷酸作為引物，對CHT9進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別產(chǎn)生CHT9 5’和3’端EcoRI和Xbal位點。用EcoRI和xbal消化擴(kuò)增片段并和用相同限制酶消化的PGAP2A相連。這一策略保證了由載體編碼的帶His/MYC標(biāo)記的序列不會附著在CHT9的C-末端。如以上方法選擇和擴(kuò)增重組質(zhì)粒。陽性菌命名為pGAPZαA/chtgc-tag)，它有助于提高重組蛋白的抗凍活力。29.3 pGAPZαA/cht9和pGAPZαA/chtg(-tag)轉(zhuǎn)化到Pichiax-33使用大量DNA純化試劑盒(QIAGEN Germany)純化pGAPZαA/chtg和pGAPZαA/chtg(-tag)的質(zhì)粒DNA。根據(jù)用戶手冊推薦的參數(shù)進(jìn)行電穿孔(Bio-Rad基因脈沖)將大約10ug的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞株x-33(Invitrogen)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞于含100ug/ml Zeocin的YPDS平板(1％酵母汁，2％D-葡萄糖，2M山梨糖醇，2％瓊脂)培養(yǎng)3天。在新鮮的YPS/Zeocin平板劃線以獲得單個菌落，更一步純化。分析8種抗Zeocin Picha轉(zhuǎn)化子以獲知CHT9 cDNA的存在。分離出單個菌落的基因DNA并根據(jù)Pichia表達(dá)手冊(invitrogen)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以確定插入片段的存在。選擇在染色體插入有CHT9cDNA的克隆進(jìn)行表達(dá)分析。29.4在Pichia中重組CHT的表達(dá)及類幾丁質(zhì)酶AFP分析從一個重組菌落中挑取單個菌落接種于10ml的YPD培養(yǎng)基(1％酶母汁，2％胨，2％葡萄糖)，28-30℃振蕩培養(yǎng)過夜，將約0.1ml的夜培養(yǎng)液接種于含50mlYPD培養(yǎng)基的250ml燒瓶中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。在每一天結(jié)束時收集1ml培養(yǎng)液，離心，以SDS-PAGE和免疫印跡法分析上清液和沉淀。
PGAPZαA(2.9kb)載體以GAP啟動子組成性表達(dá)Pichia pastoris中的重組蛋白。GAP是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的啟動子，在包括Pichta pastoris 5很多有機(jī)體中都組成性表達(dá)。另外，這種載體一編碼啤酒酵母(Saccharomyces cererisisiae)α因子分泌信號的N-末端肽，在某些情況下，能將外源蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外空間(上清液)。圖25a顯示了酵母細(xì)胞的重組質(zhì)粒的超級表達(dá)和分泌。酵母培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)樣本在SDS-PAGE分析中為-約32KD(列1，2)的帶。圖25b顯示了相同樣本的免疫印跡分析。然而無論怎樣，和以上描述的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)不同的是，在酵母中表達(dá)的大多數(shù)幾丁質(zhì)AFP存在于上清液中(對比列1，2和3，4)，這說明分泌過程己基本完成。經(jīng)計算表達(dá)和分泌水平為每升培養(yǎng)液含50至100mg。Pichiapastoris很少分泌自身蛋白，所以說重組類幾丁質(zhì)酶AFP的成功分泌使純化和特征鑒定更加容易。實施例30.PGAPZαA/chtg(-tag)的表達(dá)和分泌為使獲得的蛋白更加符合其天然形式，可選擇構(gòu)建一基因來消除His/MYC標(biāo)記和天然幾丁質(zhì)酶C-末端連接。對比和PGAPZαA/chtg的表達(dá)和分泌水平，兩者表達(dá)蛋白的SDS-PAGE和免疫印跡分析表明重組類幾丁質(zhì)酶AFP酶具有抗凍活力，因在AFP液中形成了六體體形冰晶。重組類幾丁質(zhì)酶AFP也顯示幾丁質(zhì)酶活力，這已在實施例15中加以描述。實施例31大腸桿菌(E.coli)中CHT46的表達(dá)CHT46通過載體(見實施例27)在大腸桿菌(E.coli)中以融合蛋白形式表達(dá)，其融合蛋白有一含6個組氨酸的前導(dǎo)鏈。以實施例27描述方法準(zhǔn)備并以Ni螯合物柱從溶菌產(chǎn)物中純化重組蛋白，經(jīng)過重折疊(refolding)和His標(biāo)記切除，成熟重組蛋白顯示一定的抗凍活力，因在重組AFP液中形成了六位體冰晶。實施例32抗凍活力的增強(qiáng)位點選擇性突變可進(jìn)一步增強(qiáng)類幾丁質(zhì)酶AFP的抗凍活力。例如通過這種途徑(III32)可提高大西洋鮭(Ocean Pout)的活力。使用蛋白模型分析和其它一些預(yù)測方法，我們確定AFP的冰結(jié)合區(qū)和其它關(guān)鍵氨基酸殘基可突變、嵌合或刪除。通過U.S.E(獨特位點消去)突變試劑盒(pharmacia生物技術(shù))或其它相似的商用突變試劑盒對含有類幾丁質(zhì)酶AFP基因的DNA質(zhì)粒表達(dá)載體進(jìn)行研究。一旦DNA序列分析確認(rèn)發(fā)生突變，即可用任何一種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行突變蛋白的表達(dá)及其抗凍蛋白活力測定。此途徑不僅能提高蛋白抗凍活力，而且有利于其它性狀的功能區(qū)的操作，例如純化蛋白質(zhì)的應(yīng)用或其生物功能的添加等等。同時使合成基于幾丁質(zhì)酶樣ATPs序列的DNA片段成為可能，這些片段編碼較少蛋白且更為容易表達(dá)。另外這也可能修飾cDNA的表達(dá)，以便其表達(dá)可受環(huán)境條件所誘導(dǎo)，例如低溫、不同的化學(xué)誘導(dǎo)物或荷爾蒙等。再者通過修飾DNA序列，使蛋白質(zhì)可定位不同分布，所有的DNA序列的修飾見圖21和22，并且本發(fā)明還包含了由這些修飾序列表達(dá)的蛋白質(zhì)。實施例33冬麥和春麥中抗凍蛋白的遺傳Cheyenne冬小麥(Triticum aesticum aestivum Lcv Cheyenne)，中國春小麥(Triticum aesticum Lcv Chinese Spring)和21個染色體取代品系的生長情況見實施例1。在每種染色體取代品系中，中國春小麥的一對染色體被Cheyenn冬小麥的同源染色體所取代，而Cheyene冬小麥具更強(qiáng)的低溫忍受力。如實施例20和21中描述的從中國春小麥、Cheyene冬小麥和21個染色體取代品種的葉中獲得質(zhì)外體抽提物，對每種抽提物進(jìn)行抗凍活力測定(見實施例5)，量化抽提物中蛋白(見實施例21)，SDS-PAGE法分離，用由裸麥AFP產(chǎn)生的抗血清免疫印跡分析，這些AFP和葡聚糖酶，幾丁質(zhì)酶及西非竹芋精相似(見實施例22)。
冷馴化后，所有品種的葉質(zhì)外體抽提液都顯示抗凍活力，都有葡聚糖酶，幾丁質(zhì)酶和類西非竹芋精AFP存在(chun et al 1998，Euphytica102219-226)每片葉子的質(zhì)外體蛋白及抗凍活力水平和23種品種的冬季存活時間呈正協(xié)同相關(guān)。染色體5B和5D攜帶了和更多的質(zhì)外體蛋白累積及更高抗凍活力相關(guān)的主要基因。實施例34真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中AFP的表達(dá)產(chǎn)物從cDNA文庫中可獲得本發(fā)明的DNA序列(也稱核酸分子)，如實施例25所描述的方法(基因DNA文庫)。從其它來源也可得到核苷酸分子，例如標(biāo)記序列的表達(dá)分析或體外(ln vitro)合成。這里應(yīng)用的AFP編碼DNA(含相同生物功能突變體)可導(dǎo)入多種真核和原核寄主細(xì)胞并加以表達(dá)。AFP的重組核苷酸分子含有適用的可操作聯(lián)結(jié)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)因子，由多種來源可獲得適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)因子，它們可被選擇性地讀取[Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.E & Maniatis，T(1989)分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，紐約；Ausubel et al(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&sons Inc.]。例如，若要提高基因的表達(dá)，可通過插入有義序列和適當(dāng)?shù)膯幼佑谳d體中。植物啟動子可以是誘導(dǎo)性、組成性、環(huán)境和發(fā)育調(diào)節(jié)性或細(xì)胞和組織特異性。轉(zhuǎn)錄過程也可通過一些已知技巧例如用超級啟動子(superpromoter)[Niet al(1995)Plant Journal 7661-676]或菜花嵌合病毒的35s啟動子[Shah et al.(1986)Science 233478-481]啟動子增強(qiáng)。
誘導(dǎo)啟動子包括a)干旱和ABA誘導(dǎo)啟動子，含ABA-反應(yīng)因子[Ono et al.(1996)Plant physiol.112483-491；Abe et al.(1997)Plant Cell91859-1868]；b)熱休克誘導(dǎo)啟動子包括HSES(熱休克因子)和CCAAT框序列因子[Raghitgama et al.，(1997)Plant Mol Biol 34393-402]；d)銅誘導(dǎo)啟動子，包括ACE1結(jié)合位點[Mett et al.，(1996)Transgenic Res5105-113.]；e)類固醇誘導(dǎo)啟動子，包括糖皮質(zhì)素反應(yīng)因子和編碼哺乳動物類固醇受體的表達(dá)載體[Schena et al.，PNAS 8810421-10425]。
另外，運(yùn)用組織特異性啟動子也可獲得特異表達(dá)，例如，調(diào)節(jié)綠葉高水平表達(dá)的Fd(Ferredorin)啟動子[Vorst et al.，(1990)Plant Mol Biol14491-499.]和根特異性表達(dá)的過氧化物酶啟動子[Wanapu&shinmyo(1996)Ann.NY Acad.Sci.782107-114].花粉、花、果實和種子特異性啟動子也同樣適用。這些啟動子可以改變轉(zhuǎn)錄的比率和效率。
若要調(diào)低基因的表達(dá)，可在載體中嵌入反義序列和適當(dāng)?shù)膯幼樱贿@些技術(shù)已有公開發(fā)表。核酸分子或基因片段可由自然基因源(在有義或反義方向)分離、合成，也可由突變來源或合成序列或兩者結(jié)合而獲得。
調(diào)節(jié)因子包括有例如轉(zhuǎn)錄啟動子和增強(qiáng)子或RNA聚合酶結(jié)合序列，核糖體結(jié)合序列，核糖體結(jié)合序列(含翻譯啟動信號)等。另外，根據(jù)不同的載體，其它一些遺傳因子例選擇標(biāo)記可被整合入重組分子。其它的調(diào)節(jié)區(qū)如啟動子和終止區(qū)域也可作為調(diào)節(jié)因子。以上調(diào)節(jié)因子可由動物、植物、酵母、細(xì)菌、真菌、病毒、鳥、昆蟲或其它來源獲得，包括合成和突變因子。
除實施例28所用的表達(dá)載體外，可將多肽插入到已知的細(xì)菌、病毒、哺乳動物、昆蟲、真菌或鳥類的表達(dá)系統(tǒng)的重組核酸分子中。利用諸如基于細(xì)胞類型的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、粒子-轟擊介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、直接吸收、微注射、協(xié)同沉淀、轉(zhuǎn)染和電穿孔等技術(shù)可將重組分子插入細(xì)胞中。載體有挽回載體，腺病毒載體，DNA病毒載體和脂質(zhì)體。適量的構(gòu)建序列嵌入表達(dá)載體，它包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。構(gòu)建序列可被嵌入到由限制性酶得到的酶切位點上。
本發(fā)明的一個核心是帶有本發(fā)明核酸分子或嵌入到載體的核酸片段在細(xì)胞中能被轉(zhuǎn)化和表達(dá)AFP的細(xì)胞能繁殖且具相同分泌特性。基因組或基因由自然來源分離，合成或由突變來源、合成序列及這幾方面的結(jié)合而獲得。
本發(fā)明的另一核心是轉(zhuǎn)化本發(fā)明的核酸分子或核酸分子片斷的插入質(zhì)粒，并使細(xì)胞表達(dá)AFP的方法以及在細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明多肽的方法。
轉(zhuǎn)錄后的植物細(xì)胞可進(jìn)一步進(jìn)行組織培養(yǎng)、種子或整個植物。產(chǎn)生突變的結(jié)合體及方法已有文章報道。
在單子葉植物和雙子葉植物中成功地進(jìn)行了轉(zhuǎn)化和植物再生。能轉(zhuǎn)化AFP核酸分子或受含AFP的組分處理的植物(或植物細(xì)胞)包括蘆筍、arabidopsis、土豆、煙草、油菜屬(例如canola)、棉花、葵花、草莓、菠菜、萵苣、大米、大豆、小麥、園草、稞麥、大麥、atriplex、saliconia oat、高粱、苜蓿、甜菜、胡椒、檸檬、南瓜、豌豆、可可樹、大麻、咖啡樹、甘蔗、黃瓜和葡萄。樹也可被轉(zhuǎn)化，這里包括楓樹、樺樹、松樹、桉樹、蘋果樹、梨樹、李樹、杏樹、橄欖樹、無花果、檸檬樹、菩提樹、桔、紅橘和葡萄柚。裝飾性花植物例如康乃馨和玫瑰也可轉(zhuǎn)化本發(fā)明的基因。莢果植物例如山核桃，胡桃和如樹等可轉(zhuǎn)錄出抗凍蛋白核酸分子。一些香料及中草藥的植物，例如人參、姜、銀杏、檸檬香草、肉桂、荳蔻、胡椒和孜然芹同樣能被抗凍蛋白核酸分子轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的突出特點在于，我們選擇那些已轉(zhuǎn)化的并表明抗凍活性的植物組織細(xì)胞或培養(yǎng)物和表達(dá)抗凍蛋白并且低渴忍受力的植物是培養(yǎng)物的再生。這些植物能繁殖例如通過對有低溫耐受力植物和不具低溫耐受力植物的相互授粉等。如果植物的自身授粉，同源的不耐低溫子代基因可在種子中進(jìn)行鑒定。例如將這些植物種植于低溫環(huán)境，使用基因標(biāo)記或低溫耐受或抗凍蛋白的活性檢測等。經(jīng)過相互授粉獲得的成熟植物能栽培，生長到性成熟進(jìn)一步進(jìn)行相互授粉或自身授粉。
在一些植物種類通過回交的栽培方法也能插入核酸分子來產(chǎn)生和AFP耐低溫核酸分子同源的植物。對于AFP核酸分子同合子的植物可作為父本或母本與缺失AFP忍受核酸分子的植物雜交可產(chǎn)生雜交植株，通常是其核酸分子為雜合子。AFP抗性核酸分子同合子的兩個植株雜交可產(chǎn)生雜合子，其為抗性核酸同合子。
本發(fā)明的核酸分子在植物的轉(zhuǎn)化實驗中可作為標(biāo)記。低溫敏感植物可轉(zhuǎn)化帶有抗凍蛋白核酸分子，連結(jié)了有益的核酸分子，這樣被轉(zhuǎn)化了有益核酸分子的植物能在低溫環(huán)境下生長，相反，未轉(zhuǎn)化植物將不能生長。
本發(fā)明的核酸分子也能用于僅僅植物某些部分的表達(dá)。例如，核酸分子可僅僅在果實中或收獲部分表達(dá)，以提高其在低溫或冰凍環(huán)境下的儲存質(zhì)量及提高殼或儲藏壽命。本發(fā)明的核酸分子可僅在植物的溫度敏感部位表達(dá)，例如花，它在春天開花但可能發(fā)生霜凍；或者根莖，它在過冬植物中對低溫敏感。
也可控制本發(fā)明的核酸分子低水平表達(dá)，主要是通過反義技術(shù)或共抑制對核酸分子處理，以降低野生型和導(dǎo)入核酸分子的表達(dá)水平，這樣就增加了植物對低溫的敏感，例如可通過對雜草處理，使之對低溫敏感，降低成活率，達(dá)到除去雜草的目的。實施例35相同生物功能肽、多肽及蛋白質(zhì)目前，本發(fā)明不僅指由圖21、22的核酸序列編碼的類幾丁質(zhì)酶AFP和實施例中描述的蛋白質(zhì)，而且也包括那些具相同植物功能的肽、多肽及蛋白質(zhì)，它們和應(yīng)用中的AFP具有相同或相似的抗凍活性。相同生物功能活性肽、多肽及蛋白質(zhì)指那些具有和本發(fā)明檢測的一種或多種的AFP相同或相似AFP活力的肽、多肽及蛋白質(zhì)?！跋嗤蛳嗨艫FP活力”意味著具有和本發(fā)明AFP相同或相似功能的能力。這些肽、多肽及蛋白質(zhì)包合一些區(qū)域或部分和應(yīng)用中的AFP相同的對應(yīng)區(qū)域或部分，但這并不是一定要求，只要兩者表現(xiàn)相同或相似的AFP活性。相同是指將兩種多肽(或核酸序列)排列起來獲得兩者的匹配程度的相似度。根據(jù)已發(fā)表的文章，例如以下介紹的GAP或BestFit軟件可計算出同一度。例如，若一多肽(稱“序列A”)和圖21或明或22有90％的相同，那么，序列A就和圖21或明或22中的多肽的相應(yīng)部分相同，除非序列A含有高達(dá)10個位點的突變，例如被其它氨基酸刪除或取代，圖21或明或22中多肽部分區(qū)域的每100氨基酸。和AFP生物功能相同的肽、多肽及蛋白質(zhì)可以以下多種突變體形式出現(xiàn)。
如實施例18所描述的，應(yīng)用中的AFP也可用于抗體準(zhǔn)備的抗原，用于純化或指示AFP或其它類AFP蛋白質(zhì)。單克隆和多克隆抗體的準(zhǔn)備技術(shù)已有文章發(fā)表。例如單克隆抗體的準(zhǔn)備及應(yīng)用見美國專利5688681、5688657、5683693、5667781、5665356、5591628、5510241、5503987、5501988、5500345、和5496705。多克隆抗體的準(zhǔn)備及應(yīng)用見美國專利5512282、4828985、5225331和5124147。識別AFP的抗體能用于篩選含AFP或類AFP蛋白的有機(jī)物。同時，抗體有益于從粗抽提物中純化AFP和類AFP蛋白。
A).AFP序列中的保守氨基酸變化
AFP蛋白的生物功能活性相同的肽，多肽和蛋白質(zhì)含有和AFP序列相同的但也有部分變化的氨基酸序列。相同生物功能活性肽，多肽和蛋白質(zhì)和自然產(chǎn)生的多肽或相應(yīng)部分有40％的序列相同，或更高，至少約60％，80％或90％相同。大多數(shù)情況下，至少97％，98％或99％相同?！靶蛄邢嗤庇蒅AP或BestFit軟件包確定。BestFit軟件排列出兩條相似序列的最適部分。可用Smith和Waterman的部分同源算法確定排列(1981 Adv.Appl.Math.2482-489)。GAP軟件使用的是Needlemen和Wunsch的算法(1970 J Mol.Biol.48443-453)。
B).抗凍蛋白片段和突變體本發(fā)明包含了和AFP具有相似或相同AFP活力的AFP片段及突變體。
C).AFP片段本發(fā)明的多肽片段和多肽有相似或相同的活力。這種肽大多數(shù)由至少5個氨基酸組成，在最佳情況下，由本發(fā)明多肽鏈的第6至10，16至25，26至50位氨基酸組成。只要片段和AFP保持相似或相同的AFP酶活力，通過從C-末端，N-末端或蛋白質(zhì)的內(nèi)部區(qū)域(或以上結(jié)合)去除一個或多個氨基酸來獲得AFP片段。這些片段可以是AFP的自然突變或?qū)幋a核苷酸序列的限制性核酸酶處理的產(chǎn)物。多肽片段可用于結(jié)合多肽的相同復(fù)合物測定。一些文章已發(fā)表的方法可鑒定這些片段的激動劑和拮抗劑。
本發(fā)明中的AFP片段和變型必需大多和自然生成蛋白或相應(yīng)區(qū)域部分有40％的相同序列，最好至少60％、80％、90％或95％。在大多數(shù)情況下，片段和自然生成蛋白或相應(yīng)區(qū)域部分有97％、98％或99％的相同序列，GAP或BestFit軟件的任何一種都較適合片段相同性的測定。
本發(fā)明還包括一些無多肽相似或相同活力的多肽片段，但它們可作為多肽特征分析的研究工具。實施例36AFP突變體突變(實施例32)或剪切的實驗技術(shù)可創(chuàng)造AFP的突變體。本發(fā)明的AFP自然突變也可產(chǎn)生變型突變體。正如很多文章已發(fā)表的氨基酸取代，通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)中的位點指向突變能產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)變型突變體。這些已知技術(shù)的結(jié)合可用于氨基酸的取代、去除和添加。例如，蛋氨酸的疏水殘基可被另外的疏水殘基例丙氨酸所取代；丙氨酸殘基可被較多的疏水殘基例亮氨酸、拮氨酸或異亮氨酸所取代；一芳香族殘基例苯丙氨酸可被蘇氨酸取代；一酸性負(fù)電荷氨基酸例如天冬氨酸可被谷氨酸取代；一帶正電荷氨基酸例如賴氨酸可被帶正電荷氨基酸例如精氨酸取代。使用改變側(cè)鏈組的物質(zhì)處理來發(fā)明的多肽可對蛋白進(jìn)行修飾，例如，將一氫基轉(zhuǎn)化為另外的例羥基或氨基酸基團(tuán)。
本發(fā)明注意到了有一或多個D-氨基酸的肽及有一或多個N-末端乙酰化氨基酸的肽。已發(fā)表資料表明這些可使用多種技術(shù)對多肽處理以利于構(gòu)建修飾肽(例如修飾肽或多肽或蛋白質(zhì))，它們不僅具有本發(fā)明相應(yīng)肽結(jié)合物的相同或相似生物活力，而且在溶解性、穩(wěn)定性或?qū)λ夂偷鞍酌附庖赘行缘确矫婢哂斜入母嗟挠欣盍?。具體實施例見Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med.Chem.，24243-252(1989)。
本發(fā)明還包括雜交基因和多肽。例如，當(dāng)一基因的核酸序列和其它核酸序列結(jié)合形成融合肽。例如可將有益AFP的核酸分子或其它核酸分子和編碼本發(fā)明中描述的AFP的AFP核酸分子相連接。利用化學(xué)合成或其它已知技術(shù)也能產(chǎn)生融合基因和肽。
和自然生成的AFP一樣，突變體較好的保持有相似或相同的AFP活力。這里可對此類變型進(jìn)行AFP活力測定。
以上提到的由生物技術(shù)結(jié)合的有相似或相同AFP活力的突變體(同自然生成)已包括在本發(fā)明中(例如氨基酸添加、去除、取代或三者結(jié)合)。實施例37相同生物活性核酸分子本發(fā)明包括那些和圖21或22所示序列或其它序列具有相同生物功能活力的核酸序列。相同生物功能活力的核酸序列是指DNA和RNA(例如基因DNA、cDNA、合成DNA、和mRNA核酸序列，編碼肽、多肽和蛋白質(zhì)，具有和圖21或22或本發(fā)明所含的AFP相同或相似的AFP活力。相同生物功能活力的核酸序列能編碼和本發(fā)明中的AFP具有部分相同的肽、多肽和蛋白質(zhì)。
A)編碼AFP中保守氨基酸變化的核苷酸分子本發(fā)明包括有編碼AFP氨基酸序列中的保守氨基酸變化的相同生物功能活力的核酸序列，這些序列同時對AFP序列產(chǎn)生沉默氨基酸變化。B)編碼AFP中非保守氨基酸的取代、添加或去除的核苷酸序列本發(fā)明包括那些和圖21或22所示序列或其它序列具有相同生物功能活力的核酸序列。相同生物功能活力的核酸序列是指DNA和RNA(例如基因DNA、cDNA、合成DNA、和mRNA核酸序列，編碼非保守氨基酸的取代、添加或去除但具有和圖21或22或本發(fā)明所含的AFP相同或相似的AFP活力肽、多肽和蛋白質(zhì)。DNA和RNA能編碼本發(fā)明中AFP的片段或變型。用以上所述檢測方法確定這些片段和變型的AFP或類AFP活力。本發(fā)明包括的相同AFP生物功能活力的核酸序列、片段和變型應(yīng)和自然生成的多肽或匹配區(qū)域至少有40％的相同序列，較好至少60％、80％、95％。最好的是片段和自然生成的多肽或匹配區(qū)域至少有97％、98％或99％的相同序列。本發(fā)明包括那些和圖21或22所示AFP具有相同生物功能活力的核酸序列。序列相同性采用Gap或BestFit軟件測定。(1)來源于冬裸麥和其它抗凍蛋白的DNA。例如如圖21(a)所示序列被自然或人為突變比方說有部分核苷酸插入或去除，從而改變了序列長度。若以圖21(b)的編碼序列長度定為100％，那么具有相同生物功能活力的核酸序列長度僅為60-120％，最好是約80-110％。(2)含部分自然或人為突變的核苷酸序列(通常為全長的80％或少，較好60％或少，最好是40％或更少)，它們編碼不同的氨基酸，但其產(chǎn)物有和自然生成的抗凍蛋白相同或相似的AFP酶活力。突變DNA編碼的蛋白質(zhì)序列應(yīng)和圖21或22的AFP酶序列有至少40％，較好60％、80％、90％和95％，最好97％、98％或99％的相同。序列相同性采用Gap或BestFit軟件測定。
C)遺傳簡并核苷酸序列隨著基因密碼子的簡并，我們將認(rèn)識到圖21或22以及其它核酸序列不再是能編碼有抗凍酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶或西非竹芋精活性多肽的唯一序列。本發(fā)明包括那些和圖21或22中描述的核酸分子具有主要相同信息的核酸序列。和研究中描述的核酸序列以及如圖21或22顯示的編碼多肽的序列相比，有一個或多個核酸變化的核酸分子(含RNA)也納入了本發(fā)明的范圍。在申請書中討論的所有核酸序列簡并形式也包含于本發(fā)明中。
本發(fā)明也包括那些有一或多個核酸變化的核酸分子以及和圖21或22有化學(xué)相似氨基酸的但已有一或多個氨基酸替代的多肽。
D)雜交指示的相同生物功能核苷酸順序編碼AFP的幾種核苷酸序列見圖21或22或使用本應(yīng)用所描述的方法可很容易地確定。采用傳統(tǒng)的DNA-DNA或DNA-RNA雜交技術(shù)可很容易地分離出編碼AFP的核酸的相同生物功能形式。因此，本發(fā)明也包括和圖21或22的一條或多條鏈雜交的序列，它們的互補(bǔ)序列以及那些編碼和AFP是有相同或相似活力的序列(這些序列表達(dá)之物為肽、多肽和蛋白質(zhì)。這些核苷酸序列在中等至高控制條件下較易和圖21或明或22中的一條或多條序列雜交(見Sambrook etal.(1989)Molecular CloningAlaboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor，N.Y.)。最適條件見實施例25描述。
本發(fā)明也包括那些和基因DNA、cDNA或編碼本發(fā)明AFP的氨基酸序列的合成DNA分子或遺傳退化形式(在同本應(yīng)用中描述的鹽和濕度條件下，遺傳密碼退化造成的)以及編碼和本發(fā)明AFP是相同生物功能活力的肽、多肽及蛋白質(zhì)的序列。如果仍然可以觀察到再結(jié)晶或冰晶生長修飾的抑制作用，那么以上所述的核苷酸序列被認(rèn)為是和本發(fā)明AFP基因具有相對等同的生物功能。當(dāng)編碼的多肽的濃度為0.1g/l或更小，較好1g/l或更少，或更好100mg/l或更少。實施例38探針本發(fā)明也包括由實施例25中的克隆APF核酸分子或其它核酸分子獲得的寡核酸探針。探針在長度上為15至30個核苷酸，最好至少30或以上核苷酸。實施例25給出了較滿意(優(yōu)越)的探針。這些探針較其它優(yōu)越之處在于它有利于辨別植物中編碼抗凍肽、多肽和蛋白質(zhì)的核酸序列，也包括本應(yīng)用描述的和ATPs生物功能相同的多肽、肽和蛋白質(zhì)的核酸序列。在控制雜交條件下，寡核苷酸探針可和圖21或22或本發(fā)明的其它的基因序列雜交。采用在高控制條件下和標(biāo)記探針雜交篩選基因文庫，就可以由其它有機(jī)物中分離出編碼本發(fā)明所含肽的一個核酸分子。由核酸分子編碼的肽、多肽及蛋白質(zhì)活力采用實施例25描述的DNA克隆和表達(dá)來檢測。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶或西非竹芋精活性測定。
采用PCR方面擴(kuò)增可從其它植物中分離出相同AFP生物功能基因，相同的AFP編碼cDNAs和合成DNAs。根據(jù)圖21或22的氨基酸序列，可以準(zhǔn)備寡核苷酸引物，包括簡并引物，這些引物結(jié)合用逆轉(zhuǎn)錄酶的PCR技術(shù)，以擴(kuò)增從其它有機(jī)物的基因cDNA中獲得的相同生物功能DNAs。
可以另外選擇的是寡核苷酸，包括簡并核酸也可作為探針來篩選cDNA文庫。實施例39AFP的異源超級表達(dá)使用實施例25中的表達(dá)載體可獲得高水平的蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核酸分子的植物和細(xì)胞培養(yǎng)物是很好的研究工具。根據(jù)文章中公布的多種技術(shù)，在研究中采用植物和細(xì)胞培養(yǎng)。通過包含AFP核酸分子(或突變體)的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(固定化細(xì)胞培養(yǎng)物或原始細(xì)胞培養(yǎng)物)，可以核酸分子的表達(dá)水平和核酸分子的活力。本發(fā)明的一多肽用于辨別結(jié)合多肽的復(fù)合物。文章中的方法可用于辨別多肽的激活劑和拮抗劑。在實驗中你可以不表達(dá)AFP的植物來檢測AFP基因的表達(dá)。采用含AFP基因的不同類型基因(或相似AFP，AFP片段核酸分子)的內(nèi)合子轉(zhuǎn)化到實驗組的植物，以測定產(chǎn)生的蛋白水平和功能以及植物的表型(phenotype)。多肽同樣有益于AFP活力的活體分析。例如，表現(xiàn)蛋白可用于顯微鏡或X射線結(jié)晶拓?fù)溲芯?。其它表達(dá)系統(tǒng)也可用于在重組植物中AFP的超級表達(dá)。實施例40冬稞麥中編碼多余AFP的核酸分子克隆采用實施例25描述的發(fā)明方法，克隆冬稞麥中編碼類葡聚糖酶和類西非竹芋精AFP的DNA和RNA。采用異源單子葉植物，或最好是禾本科植物中得到的探針(實施例25)，可篩選由從低溫訓(xùn)化冬稞麥的健康組織中分離的mRNA產(chǎn)生的cDNA文庫。這種探針在中等控制條件下(實施例25.1)利用Northern印跡來和低溫誘導(dǎo)稞麥AFP的轉(zhuǎn)錄物雜交顯示其編碼葡聚糖或類西非竹芋精蛋白，通過這些探針來雜交確定的陽性基因可如實施例25描述的進(jìn)行特征和序列分析。如實施例27，39或?qū)嵤├?8，29，30，31，34的其它表達(dá)系統(tǒng)所述，cDNAs可通過轉(zhuǎn)化植物被表達(dá)。本發(fā)明包括有相同生物功能肽、多肽和蛋白質(zhì)，這些AFP變型和類葡聚糖酶、類西非竹芋精AFP具相同生物功能核酸和它們的核酸序列。本發(fā)明也包括適用于編碼葡聚糖酶樣和類西非竹芋精AFP核酸的探針。實施例41在食物或生物材料貯存中作為添加劑的AFP的生產(chǎn)可以以粗抽提物，部分片化抽提物或純化肽、多肽、蛋白質(zhì)產(chǎn)品形式生產(chǎn)出在原核或真核生物表達(dá)系統(tǒng)合成的編碼AFP或相同生物功能AFP的肽、多肽或蛋白質(zhì)，用于食物和生物材料。例如，圖21或明或暗2發(fā)明DNA能在植物中表達(dá)，然后從植物中獲得總?cè)芙獬樘嵛?實施例18，24)或細(xì)胞外抽提物(實施例1，15，19和20)，這些抽提物可用于食物或生物材料。通過Nidcel Chelation、膠體幾丁質(zhì)親和層析、免疫親和層析、標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)層析技術(shù)純化肽、多肽或蛋白質(zhì)。
如果原核或真核細(xì)胞系將產(chǎn)生的肽、多肽或蛋白質(zhì)分泌在生長培養(yǎng)基或保存在細(xì)胞內(nèi)，那么我們就可以獲得總?cè)芙獬樘嵛?，部分純化抽提物或純化肽、多肽或蛋白質(zhì)，以用于食品或生物材料的添加劑。
這里已詳細(xì)描述了本發(fā)明內(nèi)容特別是對核心部分的描述尤為詳盡。不管怎樣，只要對文章中的技能有一般認(rèn)識的人都會懂得萬變不離其宗的道理，例如，講到多肽，那么很清楚一定會涉及肽和蛋白質(zhì)。
本說明書將所有出版物、專利和專利申請在此整合為一體，并保持其完整性；每一單獨出版物、專利或?qū)＠暾埗继囟ǖ鼗騻€別地指示其整合為一體，并保持其完整性。
參考文獻(xiàn)為了便于對關(guān)于植物耐受霜凍的能力的已知的各個方面以及本主體發(fā)明進(jìn)行討論，這里按照下列第I組、第II組和第III組參考文獻(xiàn)的索引號參考了幾種雜志文章。第I組1.0作者Andersson JA，Ashworth EN(1986年)；文章題目鏈霉素、干燥和紫外線輻照對由假單胞菌viridiflava引起的冰晶成核的影響；雜志名植物生理學(xué)；80期，956至960頁。1.1作者Cuter AJ，Saleem M，Kendall E，Gusta LV，Georges F，F(xiàn)letcher GL(1989年)；文章題目冬季比目魚抗凍蛋白可改善植物組織對寒冷的耐久力；雜志名植物生理學(xué)雜志；135期，351至354頁。2.作者Duman JG，Morris JP，Castellino FJ(1984年)；文章題目取自大黃蜂皇，Vespula maculata的冰晶成核蛋白質(zhì)的提純和組成；雜志名比較生物化學(xué)生理學(xué)雜志；B 154期，79至83頁。3.作者Fischer R，Behnke S，Apel K(1989年)；文章題目化學(xué)應(yīng)力對大麥葉的細(xì)胞內(nèi)液體的多肽組成的影響；雜志名植物；178期，61至68頁。3.1作者Georges F，Saleem M，Cutleer AJ(1990年)；文章題目比目魚抗凍蛋白的一種合成基因的設(shè)計和復(fù)制以及其在植物細(xì)胞中的表達(dá)；雜志名基因；91期，159至165頁。4.作者Guy CL(1990年)；文章題目冷馴化和對凍結(jié)應(yīng)力的耐受能力蛋白質(zhì)代謝的作用；雜志名Annu Rev植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)；41期，187至223頁。5.作者Guy GL，Haskell D(1987年)；文章題目菠菜中的霜凍耐受能力誘導(dǎo)作用是與冷馴化一誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成相關(guān)的；雜志名植物生理學(xué)；84期，872至878頁。5.1作者Guy CL，Neimi KJ和Brambl 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WR(1978年a)；文章題目在霜凍對敏感植物造成的傷害中細(xì)菌冰晶成核的作用；出自Li PH，Sakai A(eds)的植物對寒冷的耐久力和凍結(jié)應(yīng)力；倫敦學(xué)術(shù)出版社出版，第I卷249至263頁。13.作者Lindow SE，Arny DC，Upper CD(1978年b)；文章題目草上寄生歐文氏菌屬在霜凍傷害加重的過程中細(xì)菌冰晶成核的作用；雜志名植物病理學(xué)；68期，523至527頁。14.作者Lindow SE，Arny DC，Upper CD(1982年)；文章題目細(xì)菌冰晶成核導(dǎo)致植物霜凍傷害的一個因素；雜志名植物生理學(xué)；70期，1084至1089頁。15.作者M(jìn)aki LR，Willoughby KJ(1978年)；文章題目細(xì)菌作為凍結(jié)晶核形成的生物源；雜志名實用氣象學(xué)雜志；17期，1049至1053頁。16.作者M(jìn)auchF，Staehelin LA(1989年)；文章題目豆葉中的乙烯誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶和乙撐-1，3-葡聚糖酶的亞細(xì)胞定位的功能含義；雜志名植物細(xì)胞；第1期，447至457頁。17.作者M(jìn)eza-Basso L，Alberdi M，Raynal M，F(xiàn)erro-Cardinahos M-L，Delseny M(1986年)；文章題目低溫處理期間油菜籽Brasica napus苗中的蛋白質(zhì)合成的變化；雜志名植物生理學(xué)；82期，733至738頁。18.作者M(jìn)ohapatra SS，Poole RJ，Dhindsa RS(1987年)；文章題目在紫花苜蓿冷馴化期間蛋白質(zhì)模式和可翻譯的信使RNA種群的變化；雜志名植物生理學(xué)；84期，1172至1176頁。19.作者M(jìn)ohapatra SS，Poole RJ，Dhindsa RS(1988年)；文章題目由兩種脫落酸和冷馴化誘導(dǎo)的兩種膜多肽的檢測對霜凍的耐受能力的可能作用；雜志名植物細(xì)胞生理學(xué)；29期，727至730頁。20.作者O、Farrell PH(1975年)；文章題目蛋白質(zhì)的高分辨率二維電泳現(xiàn)象；雜志名生物化學(xué)雜志；250期，4007至4021頁。21.作者Perras M，Sarhan F(1989年)；文章題目在小麥冷馴化期間，葉、冠和根中的耐凍蛋白質(zhì)的合成；雜志名植物生理學(xué)；89期，577至585頁。22.作者Rajashekar CB，Li PH，Carter JV(1983年)；文章題目在有塊莖的茄屬植物的葉中的霜凍傷害和不同種類的冰晶的成核；雜志名植物生理學(xué)；71期，749至755頁。23.作者Robertson AJ，Gusta Lv，Reaney MJT，Ishikawa M(1987年)；文章題目在使用脫落酸和低溫進(jìn)行耐霜凍能力誘導(dǎo)期間，在雀麥草(Bromus inermis Leyss)培養(yǎng)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成；雜志名植物生理學(xué)；34期，1331至1336頁。24.作者Southworth M W，Wolber PK，Warren GJ(1988年)；文章題目濃度和某種細(xì)胞冰晶成核蛋白質(zhì)的活性之間的非線性關(guān)系；雜志名生物化學(xué)雜志；263期，15211至15216頁。25.作者Warren GJ(1987年)；文章題目細(xì)菌冰晶核的形成分子生物學(xué)及其應(yīng)用；雜志名生物技術(shù)基因工程評論；5期，109至135頁。26.作者Wolber P， Warren G(1989年)；文章題目細(xì)菌冰晶成核蛋白質(zhì)；雜志名生物化學(xué)科學(xué)發(fā)展趨勢；14期，179至182頁。第II組1.0作者Abeles，F(xiàn).B和Forrence L.E.(1970年)，植物生理學(xué)；45期，395至400頁。作者Ashworth，E.N.植物生理學(xué)；92期，728至725頁(1990年)。2.作者Blum，A.雜志CRC Crit.植物生理學(xué)評論，第2期，199至238頁(1985年)2.1作者Broekaert W.Lee H，KushA，Chua NH，Raikhel N(1990年)，國家科學(xué)院學(xué)報IJSA，87期，7633至7637頁。3.作者Chakrabartty，A.，Yang，D.S.C.&Hew，C.L.J.，生物化學(xué)，264期，11313至11316頁(1989年)。4.作者Davies，P L.Hew，C.L.雜志名FASEB雜志.第4期，2460至2468頁(1990年)。5.作者DeVries，A.L.Meth.酶學(xué)，127，293(1986年)。6.Duman，J.G.，Su，L.，Neven，L.G.，Tursman，D.&Wu，D.W.低溫條件下的昆蟲，R.J.Lee，Jr.及D.L.Denlinger，Eds.(Chapman and Hall出版公司，紐約，1991年)，94至127頁。7.作者Feeney，R.E.，農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)評論，第1期，147至181頁(1988年)。8.0作者Foumey，R.M.，Joshi，S.B.&Hew，C.L.，加拿大動物學(xué)雜志，62期，28至33頁(1988年)。8.1作者Harlow，E.&Lane D.Antibodies，實驗室手冊，Cold SpringHarbor實驗室，紐約Cold Spring港(1988年)。8.2作者Hejgaard J，Jacobsen S，Svendsen 1(1991年)歐洲生物化學(xué)協(xié)會聯(lián)合會通信，291期，127至131頁。8.3Huang JK，Wen L，Swedle M，Tran HC，Thin TH，Naylor HM，Muthukrishnan S，Reeck GR(1991年)植物分子生物學(xué)，16期，479至480頁。9.作者；Hew，C.L.，Slaughter，D.，Joshi，S.B.，F(xiàn)letcher，G.L.&Ananthanarayanan，V.S.J.比較生理學(xué)，B 155期，81至88頁(1984年)。10.作者Knight，C.A.及Duman，J.G.，低溫生物學(xué)，23期，256至262頁(1986年)。11.作者Krol，M.，Griffith，M.及Huner，N.P.A.加拿大生物學(xué)雜志，62期，1062至1068頁(1984年)。12.作者M(jìn)auch，F(xiàn).及Staehelin，L.A.植物細(xì)胞，第1期，447至457頁(1989年)。12.1作者Neale AD，Wahleithner KA，Lund M，Bennett HT，Kelly A，Meeks-Wagner DR，Peacock WJ，Dennis ES(1990年)，植物細(xì)胞，第2期，673至684頁。13.作者Parody-Morreale，A.，Murphy，K.P.，Di Cera，E.，F(xiàn)all，R.，DeVries，A.L.及Gill，S.J.自然，333期，782至783頁。14.作者Pearce，R.S.植物，175期，313至324頁，(1988年)。15.作者Sakai，A.及Larcher，W.植物的抗霜凍生存，(Springer-Verlag，柏林，海德爾堡，1987年)，1至38頁。15.1作者Schagger H，Von Jagow G(1987)，分析生物化學(xué)，166期，368至379頁。16.作者Storey，K.B.及Storey，J.M.，生理學(xué)評論，68期，27至84頁，(1988年)。17.作者Tomchaney，A.P.，Morris，J.P.，Kang，S.H.及Duman，J.G.生物化學(xué)，第21期，716至721頁，(1982年)。18.作者Uemura，M.及Steponkus，P植物生理學(xué)，91期，1131至1137頁(1989年)。18.1作者Wright CS，Raikhel N(1989年)，分子進(jìn)化雜志，28期，327至336頁。19.作者Wu，D.W.及Duman，J.G.J.比較生理學(xué)，B 161期，279至283頁(1991年)。20.作者Wu，D.W.，Duman，J.G.及Xu，Lei.，雜志名Biochim.Biophys.Acta，1076期，416至420頁。第III組1.作者Aloni R，Griffith M(1991年)；文章題目六種谷物種類的根莖接合部的功能木質(zhì)部解剖；雜志名植物；184期，123至129頁。2.作者Antikainen M，Griffith M，Zhang J，Hon W-C，Yang DSC，Phihakaski-Maunsbach K(1996年)；文章題目利用組織印刷法對冬裸麥葉、冠部和根部的抗凍蛋白進(jìn)行檢測；雜志名植物生理學(xué)；110期，845至857頁。3.作者Antikainen M&Pihakaski S(1994年)；文章題目在冬裸麥(Secale cereale)葉中發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)期間RNA、蛋白質(zhì)、和糖的水平的早期發(fā)展；雜志名Ann.Bot；74期，335至341頁。4.作者Arav A，Rubinsky B，Seren E，Roche JF，Boland MP(1994年)；文章題目熱滯后蛋白質(zhì)在卵母細(xì)胞和胚芽超低溫冷藏期間的作用；雜志名獸醫(yī)產(chǎn)科及母畜醫(yī)學(xué)；41期，107至112頁。5.作者Bradford MM(1976年)；文章題目利用蛋白質(zhì)染料粘合原理對蛋白質(zhì)的顯微照片數(shù)量進(jìn)行量化的一種快速而靈敏的方法；雜志名分析生物化學(xué)；72期，248至254頁。6.作者Dahlgren RMT，Clifford HT，Yeo PF(1985年)；書名單子葉植物的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、和分類學(xué)；柏林Springer-Verlag出版社出版，書號ISBN 3-540-13655-X。7.作者Davis BJ(1964年)；文章題目圓盤電泳法II方法和對人類血清蛋白質(zhì)的應(yīng)用；雜志名AnnN.Y.Acad.Sci.；121期，404至427頁。8.作者DeVries 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權(quán)利要求
1.來自單子葉植物的分離的核酸分子，這種分子編碼一種抗凍蛋白。
2.權(quán)利要求1中的分子，包括在圖21(A)、圖21(B)、圖22(A)或圖22(B)中的DNA序列。
3.權(quán)利要求1中的分子，其中，該序列包含至少40％的序列與在圖21(A)、圖21(B)、圖22(A)或圖22(B)中的DNA序列全部相同或部分相同。
4.權(quán)利要求1中的分子，該分子是從由mRNA、cDNA、有義鏈DNA、反義鏈DNA、單鏈DNA、以及雙鏈DNA構(gòu)成的一組核酸中選取的。
5.像權(quán)利要求2中的核酸分子那樣，給同樣的氨基酸序列編碼的核酸分子序列。
6.一種給類似幾丁質(zhì)酶的防凍多肽編碼的核酸分子，這種多肽在圖22(A)中從340位置到744位置與編碼鏈的核酸分子雜交，其過程是在一種嚴(yán)格由0.2×SSC到2×SSC，0.1％的SDS組成的洗提液中，在溫度為42攝氏度的溫度條件下進(jìn)行的。
7.一種給類似幾丁質(zhì)酶的抗凍蛋白編碼的核酸，這種抗凍蛋白在從圖21(A)中從541位置到745位置與編碼鏈的核苷序列雜交，其過程是在一種嚴(yán)格由0.2×SSC到2×SSC，0.1％的SDS組成的洗提液中，在溫度為42攝氏度的溫度條件下進(jìn)行的。
8.在權(quán)利要求1中的，用核酸分子編碼的一種多肽。
9.在權(quán)利要求8中的一種經(jīng)過提純和分離的擬態(tài)。
10.在權(quán)利要求8中的多肽，這種多肽具有在圖21(a)、圖21(b)、圖21(c)、圖21(d)、圖22(a)、圖22(b)、圖22(c)、或圖22(d)中所示的氨基酸序列。
11.在權(quán)利要求8中的多肽，這種多肽至少有40％的序列是全部或部分與圖21(a)、圖21(b)、圖21(c)、圖21(d)、圖22(a)、圖22(b)、圖22(c)、或圖22(d)中所示的氨基酸序列相同的。
12.從一種單子葉植物分離出來的一種經(jīng)過冷誘導(dǎo)的防凍多肽。
13.從一種單子葉植物分離出來的，與病原體相關(guān)的，具有抗凍活性的一種經(jīng)過冷誘導(dǎo)的防凍多肽。
14.在權(quán)利要求12中的多肽，其中所使用的單子葉植物選取自禾本科。
15.在權(quán)利要求14中的多肽，其中所使用選取自由大麥、小麥和裸麥、春季裸麥、冬小麥、冬大麥、以及春季燕麥組成的一組植物。
16.在權(quán)利要求12或權(quán)利要求13中的多肽的一擬態(tài)。
17.一具有抗凍活性的，被分離出來的多肽，這種多肽選取自由大麥、小麥和裸麥、春季裸麥、冬小麥、冬大麥、冬canola、以及春季燕麥和羽衣甘藍(lán)組成的一組植物。
18.在權(quán)利要求12或權(quán)利要求13中的多肽，這種多肽選到自由幾丁質(zhì)酶、西非竹芋精和葡聚糖酶組成的一組酶。
19.在權(quán)利要求12或權(quán)利要求13中的多肽，其用途是從下述一組用途中選取的一種產(chǎn)生抗凍蛋白、增強(qiáng)植物和微生物對霜凍的耐受能力、增強(qiáng)曝露于低于零攝氏度的溫度的植物、動物和微生物在野外存活的能力和產(chǎn)量、抑制在生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中的冰晶的重結(jié)晶、細(xì)胞的超低溫冷藏、細(xì)胞的低溫保護(hù)、人類血小板的冷保護(hù)、以及殺死腫瘤細(xì)胞。
20.一種DNA重組體，包括在從權(quán)利要求1到權(quán)利要求7之中的任何一種DNA分子以及一個促進(jìn)劑區(qū)，在功能上互相鏈接，使得促進(jìn)劑增強(qiáng)了這種DNA分子在某種宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。
21.一種幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)系統(tǒng)，包括一種表達(dá)矢量和嵌入在這個表達(dá)矢量內(nèi)的幾丁質(zhì)酶cDNA。
22.在權(quán)利要求21中的表達(dá)系統(tǒng)，其中的表達(dá)矢量包括一種質(zhì)體。
23.在權(quán)利要求22中的表達(dá)系統(tǒng)，其中的質(zhì)體包括一種大腸桿菌矢量。
24.在權(quán)利要求23中的表達(dá)系統(tǒng)，其中的大腸桿菌矢量包括pET12a。
25.在權(quán)利要求21中的表達(dá)系統(tǒng)，其中的表達(dá)矢量包括一種Pichia矢量。
26.在權(quán)利要求25中的表達(dá)系統(tǒng)，其中的Pichia矢量包括pGAPZαA。
27.在權(quán)利要求21中的表達(dá)系統(tǒng)，其中的幾丁質(zhì)酶DNA包括在圖21(a)、圖21(b)、圖22(a)、圖22(b)中的所有或部分DNA序列。
28.由在權(quán)利要求1到權(quán)利要求27中的任何一種系統(tǒng)改造過的某種植物、植物細(xì)胞、動物、動物細(xì)胞、細(xì)菌或酵母。
29.一種表達(dá)幾丁質(zhì)酶的方法，這種方法包括使用一個幾丁質(zhì)酶DNA表達(dá)矢量來改造一個表達(dá)宿主；以及培養(yǎng)宿主。
30.在權(quán)利要求29中的方法，其中的表達(dá)宿主是從由某種植物、植物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、真菌類、原生動物、海藻、動物和動物細(xì)胞組成的一組生物中選取的。
31.在權(quán)利要求21到權(quán)利要求27中的任何一個表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物，其用途是從下述一組用途中選取的一種產(chǎn)生抗凍蛋白、增強(qiáng)植物和微生物對霜凍的耐受能力、增強(qiáng)曝露于低于零攝氏度的溫度的植物、動物和微生物在野外存活的能力和產(chǎn)量、抑制在生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中的冰晶的重結(jié)晶、細(xì)胞的超低溫冷藏、細(xì)胞的低溫保護(hù)、人類血小板的冷保護(hù)、以及殺死腫瘤細(xì)胞。
32.把在下述植物中的蛋白質(zhì)分泌物作為目標(biāo)的一個核苷序列，這些植物由在圖21(A)所示的從位置1到位置60中的編碼鏈及其補(bǔ)足物組成。
33.把在下述植物中的蛋白質(zhì)分泌物作為目標(biāo)的一個核苷序列，這些植物由在圖22(A)所示的從位置1到位置60中的編碼鏈及其補(bǔ)足物組成。
34.一種增強(qiáng)抗凍活性的方法，這個方法包括把防凍多肽與糖類結(jié)合起來，以增強(qiáng)防凍多肽的活性，從而抑制冰晶的重結(jié)晶，以及調(diào)整冰晶的正常生長狀況。
35.一種組份，包括一種或多種抗凍蛋白與一種或多種糖類結(jié)合起來。
36.在從權(quán)利要求8、10到15或權(quán)利要求17到19中的任何一種當(dāng)中的多肽與一種糖結(jié)合起來，其用途是從下述一組用途中選取的一種產(chǎn)生抗凍蛋白、增強(qiáng)植物和微生物對霜凍的耐受能力、增強(qiáng)曝露于低于零攝氏度的溫度的植物、動物和微生物在野外存活的能力和產(chǎn)量、抑制在生物物質(zhì)或食物產(chǎn)品中的冰晶的重結(jié)晶、細(xì)胞的超低溫冷藏、細(xì)胞的低溫保護(hù)、人類血小板的冷保護(hù)、以及殺死腫瘤細(xì)胞。
37.在從權(quán)利要求8、10到15或權(quán)利要求17到19中的任何一種當(dāng)中的多肽，用于抑制由低溫病原體在某種植物、冷凍食品或任何超低溫生物物質(zhì)中引起的某種疾病或損壞的發(fā)生或蔓延。
全文摘要
在冷誘導(dǎo)和冷馴化作用下,冬裸麥產(chǎn)生一系列的抗凍蛋白,這些蛋白質(zhì)類似于與病原體相關(guān)的蛋白質(zhì)。在這些蛋白質(zhì)中,有兩種類幾丁質(zhì)酶蛋白,它們被利用分子生物技術(shù)進(jìn)行復(fù)制,并且采用細(xì)菌和酵母(Pichia)體系以及Arabidopsis thaliana來表達(dá)。這種蛋白質(zhì)重組體顯示出幾丁質(zhì)酶活性和抗凍活性。本發(fā)明包括類似幾丁質(zhì)酶的抗凍蛋白的DNA和蛋白質(zhì)序列,任何這種序列的變體,這些蛋白質(zhì)的表達(dá)法,以及它們在農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥領(lǐng)域上的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/00GK1273604SQ98809742
公開日2000年11月15日 申請日期1998年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月31日
發(fā)明者喬伊·休, 熊非, 芭芭拉·莫法特, 瑪麗蓮·格里菲思 申請人:埃斯生物工程公司