專利名稱：治療神經(jīng)缺損的方法
該申請要求1997年8月4日提交的暫定申請系列號為60/055,383的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容被引入本文作為參考。
本發(fā)明領(lǐng)域是治療由影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、疾病或發(fā)育障礙引起的神經(jīng)缺損。
背景技術(shù)：
神經(jīng)營養(yǎng)因子是多方面地支持神經(jīng)細胞生存、增生、分化、大小和功能的肽類(綜述，見Loughlin和Fallon，神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophic Factors)，學術(shù)出版社(Academic Press)，San Diego，化學文摘(CA)，1993)。隨著識別的營養(yǎng)因子或生長因子的數(shù)量不斷增加，基于其結(jié)構(gòu)或結(jié)合親和力多數(shù)能被分到一個或另一個確定的家族中。來自各家族的生長因子，包括表皮生長因子(EGF)家族，已被證明支持黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)(按照本發(fā)明方法可治療的一個區(qū)域)的多巴胺神經(jīng)元(綜述，參見Hefti神經(jīng)生物學雜志(J.Neurobiol.)251418-1435，1994；Unsicker，生長因子研究進展(Prog.Growth Facter Res.)573-87，1994)。
作為EGF家族的基本成員，EGF在25多年前被鑒定(Savage and Cohen，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)2477609-7611，1972；Savage等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)247；7612-7621，1972)。此后，其它成員也已被識別；它們包括牛痘病毒生長因子(VGF；Ventatesan等，病毒學雜志(J.Virol.)44637-646，1982)、粘液瘤病毒生長因子(MGF；Upton等，病毒學雜志(J.Viroi.)611271-1275，1987)、休普氏纖維瘤病毒生長因子(SFGF；Chang等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)7535-540，1987)、雙調(diào)蛋白(AR；Kimura等，自然(Nature)348257-260，1990)，和肝素結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF；Higashiyama等，科學(Science)251936-939，1991)。這些因子的一個共同特征是含有六個半胱氨酸的氨基酸序列，其中這些半胱氨酸形成三個二硫鍵交聯(lián)并維持一個使它們共同具有結(jié)合EGF受體能力基礎(chǔ)的保守結(jié)構(gòu)。
EGF是迄今研究最多的家族成員，并是第一個被定位在腦組織中在發(fā)育期成人前腦和包括蒼白球、腹側(cè)蒼白球、腳內(nèi)核、黑質(zhì)和海馬回的中腦區(qū)域，發(fā)現(xiàn)有EGF樣免疫反應活性(IR)(Fallon等，科學(Science)2241107-1109，1984)。
EGF族的另一個成員TGFα，也被定位于腦組織中。它與EGF受體結(jié)合(Todaro等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA775258-5262，1980)，激活受體的酪氨酸激酶活性，并在廣泛的各種細胞類型中，引發(fā)相似的促有絲分裂反應(綜述，見Derynck，癌癥研究進展(Adv.Cancer Res.)，5827-52，1992)。TGFα也可能結(jié)合于其它未識別的受體(這可有助于解釋它在某些細胞內(nèi)的不同作用)。早已證明，TGFα-IR不均一地分布在整個成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的核周體和前腦星形膠質(zhì)細胞亞群上(Code等，腦研究(Brain Res.)421401-405，1987；Fallon等，生長因子(Growth Factors)2241-250，1990)。利用核酸酶保護分析(Weickert和Blum，腦研究進展(Devel.Brain Res.)86；203-216，1995)和核酸原位雜交技術(shù)(Seroogy等，神經(jīng)報道(Neuroreport)6105-108，1994)，在嚙齒動物整個腦部(Lee等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)53655-3646，1985；Kudlow等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2643880-3883，1989)和紋狀體及其它腦區(qū)域(Weickert and Blum，腦研究進展(Devel.Brain Res.)86203-216，1995)已經(jīng)檢測到TGFα mRNA。
TGFα和EGF mRNA在出生后早期達到其相對最高豐度(與總RNA相比)，此后下降，提示其在發(fā)育中起作用(Lee等，1985，見上文；Lazar和Blum，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci)121688-1697，1992)。在全腦，下降超過50％(Lazar和Blum，1992，見上文)，而在紋狀體，相對TGFα mRNA下降峰水平的2/3(Weickert和Blum，1995，見上文)。在整個發(fā)育期進行檢測，全腦TGFαmRNA超出EGF mRNA水平在1個數(shù)量級以上(Lazar和Blum，1992，見上文)。
通過免疫細胞化學方法表明，EGF受體被定位在大鼠腦的星形膠質(zhì)細胞和皮質(zhì)與小腦神經(jīng)元的亞群，在人解剖腦標本的神經(jīng)元中(Gomez-Pinilla等，腦研究(Brain Res.)438385-390，1988；Werner等，組織化學和細胞化學雜志(J.Histochem.Cytochem.)3681-86，1988)。在用放射標記EGF的放射自顯影研究中，在大鼠皮質(zhì)和包括紋狀體的皮質(zhì)下區(qū)域發(fā)現(xiàn)EGF結(jié)合位點(Quirion等，突觸(Synapse)2212-218，1988)。原位雜交研究證明，EGF受體mRNA在紋狀體和腹側(cè)中腦核細胞中(Seroogy等，1994，見上文)及在發(fā)育和成年大鼠腦的增生區(qū)域中(Seroogy等，腦研究(Brain Res.670157-164，1995)。相對于EGF和TGFαmRNAS，紋狀體和腹側(cè)中腦核的EGF受體mRNA在發(fā)育期最豐富，隨著動物成熟而逐漸下降(Seroogy等，1994，見上文)。
在生理上，TGFα作用于全身眾多細胞類型，包括許多神經(jīng)起源的細胞類型(綜述，見Derynck，1992見上文)。它支持培養(yǎng)的中樞神經(jīng)元存活(Morrison等，科學(Science)23872-75，1987；Zhang等，細胞調(diào)節(jié)(Cell.Regul.)1511-521，1990)，以及與EGF不同，增強脊神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元的存活和軸突向外生長(Chalazonitis等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.12583-594，1992)。它也刺激發(fā)育和成年腦的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)祖細胞的增生和分化(Anchan等，神經(jīng)元(Neuron)6923-936，1991)。
近年來已研究了EGF-家族肽對培養(yǎng)物的中腦多巴胺神經(jīng)元的營養(yǎng)作用。EGF增強在混合的中腦培養(yǎng)物中E16多巴胺神經(jīng)元的存活(Casper等，神經(jīng)科學研究雜志(J.Neurosci.Res.)30372-381，1991)，但是它僅輕度刺激多巴胺攝取(Knusel等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)10558-570，1990)。TGFα也支持游離細胞培養(yǎng)物的中腦多巴胺神經(jīng)元的存活，但它的作用較EGF更具選擇性(Ferrari等，神經(jīng)科學研究雜志(J.Neurosci.Res.)30493-497，1991；Alexi和Hefti，神經(jīng)科學(Neurosci)55903-918，1993)。
EGF-家族生長因子的另一重要特征是，它們具有保護中腦多巴胺細胞免受神經(jīng)毒損害的能力。已經(jīng)證實EGF保護多巴胺神經(jīng)元免遭游離細胞培養(yǎng)物中的谷氨酸鹽和使君子酸鹽的細胞外毒素的侵害(Casper和Blum，神經(jīng)化學雜志(J.Neurochem.)651016-1026，1995)。也證實它保護培養(yǎng)的多巴胺細胞免受選擇性多巴胺神經(jīng)毒1-甲基-4-苯基吡啶的損害(MPP+；Park等，腦研究(Brain Res.)59983-97，1992)，和在MPP+-處理的培養(yǎng)基中增加多巴胺攝取(Hadjiconstantinou等，神經(jīng)化學雜志(J.Neurochem.)57479-482，1991)。
EGF在體內(nèi)的研究結(jié)果與在培養(yǎng)物中獲得的結(jié)果一致；EGF在兩種情況下均有神經(jīng)保護作用。例如，腦室內(nèi)(ICV)輸注EGF減少苯丙胺-誘導的旋轉(zhuǎn)，增加SN中酪氨酸羥化酶免疫活性(TH-IR)細胞的存活數(shù)量，及在PD大鼠模型中增加切斷黑質(zhì)紋狀體通路后紋狀體的TH-IR纖維數(shù)(Pezzoli等，運動障礙(Movement Disord.)6281-287，1993；Ventrella，神經(jīng)外科科學雜志(J.Neurosurg.Sci.)371-8，1993)。將EGF ICV輸注至1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)損傷的小鼠腦中，增加多巴胺與3，4-二氫-zy苯乙酸(DOPAC)的含量和紋狀體酪氨酸羥化酶的活性(Hadjiconstantinou等，1991，見上文；Schneider等，腦研究(Brain Tes.)674260-264，1995)。
相對于EGF，TGFα盡管在體外具有更強的活性，但它在體內(nèi)-特別是在患神經(jīng)缺損的動物，包括人的營養(yǎng)作用是未確定的。如在這里描述的，本發(fā)明是根據(jù)正常和異常(損傷的)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞中輸注TGFα所新發(fā)現(xiàn)的作用。
發(fā)明概述本發(fā)明特征是治療患神經(jīng)缺損患者的方法和組合物。該方法可以這樣進行，例如，通過將患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)元祖細胞與結(jié)合表皮生長因子(EGF)受體的多肽接觸(在體內(nèi)或培養(yǎng)基中)，并引導增生祖細胞的子代全部移行到CNS區(qū)域，其中它們在此區(qū)域駐留并以足以減輕神經(jīng)缺損的方式發(fā)揮作用。該方法可包括另一個步驟使神經(jīng)祖細胞的子代與刺激分化的化合物接觸。
通過下面的附圖簡述、發(fā)明詳述和操作實施例，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和新特性將變得更清楚。
附圖簡述

圖1是大鼠前腦的冠狀切面圖。示于右邊的注射吸管代表可輸注生長因子的部位，紋狀體(str)。(大腦皮質(zhì)＝ctx；側(cè)腦室＝1v)。
圖2A-2D是貫穿成年大鼠中腦的腦冠狀切面的顯微照片，照片顯示EGF受體mRNA的分布。在圖2A中，“感覺”探針用作對照。在圖2B-2D中，貫穿黑質(zhì)(sn)的切面顯示，在海馬(hip)、sna中部和腹側(cè)被蓋區(qū)(vta)的臂旁核與黑旁paranigral核的中等豐度表達。在中腦的最-尾側(cè)(圖2D)，腳間核(ip)標記強度最大?？潭劝簦?mm。
圖3是貫穿輸注了TGFα的成年大鼠腦紋狀體的冠狀切面的顯微照片，顯示EGF受體mRNA的分布。在輸注的一側(cè)，鄰接側(cè)腦室的紋狀體內(nèi)側(cè)雜交密度顯著增加。
圖4是貫穿輸注了TGFα并有6-OHDA損傷的成年大鼠前腦的冠狀切面的顯微照片，顯示EGF受體mRNA的分布。進行原位雜交以定位EGF受體mRNA，顯示很強的嵴伸入紋狀體體部。
圖5是表示5組受試動物中(正常；aCSF輸注，沒有損傷；aCSF輸注，損傷；TGFα輸注，沒有損傷；TGFα輸注，損傷)每組在紋狀體中TGFαmRNA雜交的平均標準化密度的直方圖。成對的棒代表在處理的紋狀體同側(cè)和對側(cè)的密度。對接受黑質(zhì)6-OHDA損傷處理的兩組，同側(cè)平均雜交密度以四分之一程度顯著減小。紋狀體輸注TGFα肽對此減小沒有影響。均值±S.EM.(學生t-檢驗，同側(cè)-對側(cè)成對比較；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
圖6是表示在實施例5所述相同的5個受試組動物中，在側(cè)腦室邊界的沿紋狀體邊緣的室管膜下區(qū)TGFα mRNA雜交的平均標準化密度的直方圖。成對的棒代表在處理的紋狀體同側(cè)和對側(cè)的密度。接受T TGFα紋狀體輸注的兩組，在同側(cè)室管膜下區(qū)平均雜交密度大約增倍。均值±S.EM.(學生t-檢驗，同側(cè)-對側(cè)成對比較；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
圖7是表示在紋狀體嵴、紋狀體非-嵴部和所有動物紋狀體嵴室管膜下區(qū)TGFα mRNA雜交的平均標準化密度的直方圖。成對的棒代表在處理的紋狀體同側(cè)和對側(cè)的密度。在處理同側(cè)的紋狀體嵴中，TGFα mRNA雜交的平均標準化密度最高。在對側(cè)紋狀體沒有出現(xiàn)紋狀體嵴。TGFα輸注。均值±S.EM.(學生t-檢驗，同側(cè)-對側(cè)成對比較；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
圖8A和8B是接受黑質(zhì)6-OHDA損傷和TGFα輸注14天的成年大鼠腦貫穿紋狀體的冠狀切面的顯微照片。圖8A，處理同側(cè)的尾狀核-豆狀核銀染色顯示在嵴的背部有大量細胞，許多細胞呈現(xiàn)細長的形態(tài)學并正常朝室管膜下區(qū)方向定向。沿側(cè)腦室(1v)部位細胞數(shù)量也增加。在對側(cè)紋狀體(圖8B)中，紋狀體或沿側(cè)腦室部位的細胞群均未擴展。
圖9A-9D是用6-OHDA損傷和TGFα輸注不同時間期限的成年大鼠腦硫素-染色的冠狀切面的顯微照片。圖9A，輸注4天后，室管膜下區(qū)的細胞擴展僅在背景染色基礎(chǔ)上可檢測到。圖9B，輸注6天后，靠近側(cè)腦室集合的硫素-染色的細胞非常粗大。圖9C，輸注9天后，在細胞擴展的腹側(cè)末端，相對于室管膜下區(qū)輕度外側(cè)處顯示濃厚地染色的細胞區(qū)域。圖9D，輸注14天后，濃密的形成良好的嵴明顯地伸進紋狀體的體部。
圖10A和10B是6-OHDA損傷和TGFα輸注14天的成年大鼠腦冠狀切面的顯微照片。圖10A，nestin免疫組化顯示強的紋狀體嵴。圖10B，接近-交界切片的硫素染色證實nestin-IR細胞和紋狀體嵴之間的標記。
圖11A-11C是6-OHDA損傷和在距側(cè)腦室不同距離處TGFα輸注14天的成年大鼠腦硫素-染色的冠狀切面的顯微照片。圖11A，輸注插管插入遠-腹側(cè)紋狀體，嵴與室管膜下區(qū)平行并較在中-紋狀體輸注時所見的密度小。圖11B，輸注插管插入中-紋狀體，嵴特征性地呈S-形狀，腹側(cè)部分伸向遠處進入腹側(cè)紋狀體。圖11C，緊緊靠近側(cè)腦室輸注，紋狀體嵴是L-形狀并通常顯示出非常濃厚的硫素染色。
圖12是描述用6-OHDA損傷黑質(zhì)和中-紋狀體TGFα輸注14天后成年大鼠腦冠狀切面紋狀體嵴的最大外側(cè)位移(從側(cè)腦室；單位為mm)的直方圖。根據(jù)“方案A”(左-最大棒)處理的動物，首先接受損傷，然后用TGFα輸注4～5周。根據(jù)“方案B”處理的動物，開始輸注14天TGFα后接受損傷2天。均值±S.EM.(學生t-檢驗，P值，*P＜0.01)。
發(fā)明詳述I.紋狀體和黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)A.解剖學、連接和神經(jīng)化學在腦中，紋狀體、蒼白球、黑質(zhì)、被蓋區(qū)(VTA)、下丘腦核和杏仁核共同稱為基底神經(jīng)節(jié)。紋狀體包含背側(cè)和腹側(cè)部分，每一部分進一步細分為其它解剖結(jié)構(gòu)。人的背側(cè)紋狀體由尾狀核和豆狀核組成。C-形尾狀核沿著側(cè)腦室的弧度。其尾部伸出超過下角末端并在雙顳側(cè)與杏仁核連接。尾狀核的頭從前角的前端轉(zhuǎn)向腹側(cè)并與豆狀核融合。盡管人腦的解剖學差異很大，但在嚙齒動物中，它們結(jié)合成共同結(jié)構(gòu)，尾狀核-豆狀核或尾狀豆狀核。
腹側(cè)紋狀體由聽神經(jīng)核、嗅結(jié)節(jié)和有關(guān)的紋狀體細胞橋構(gòu)成。蒼白球包括球蒼白球、腳內(nèi)核(entopeduncular nucleus)、網(wǎng)狀黑質(zhì)部分(SNr)和腹側(cè)蒼白球。腳內(nèi)核和SNr具有非常相似的傳入和傳出聯(lián)系。腹側(cè)核包含既與蒼白球相似又與腳內(nèi)核相似的混合聯(lián)系區(qū)域。黑質(zhì)的其它部分，致密部分(SNc)，包括跨越黑質(zhì)-腹側(cè)蓋區(qū)(SN-VTA)的多巴胺神經(jīng)元以及在SNr中的多巴胺細胞叢?；坠?jié)環(huán)路相當復雜，但在大鼠和人是非常相似的(Fallon和Loughlin，大腦皮質(zhì)(cerebral cortex)，E.G.Jones和A.Peters編著，第6卷，第41-127頁，Plenum出版，紐約，1987；Alheid和Heimer，腦研究進展(Progr.Brain Res.)107461-484，1996)，這使得大鼠成為研究哺乳動物腦中該系統(tǒng)的聯(lián)系、神經(jīng)化學、藥理學、功能和臨床相互關(guān)系的非常有用的模型。
紋狀體，與基底節(jié)的其它核一起參與運動和情緒的調(diào)節(jié)。影響該系統(tǒng)或其神經(jīng)支配的許多疾病與運動神經(jīng)元損傷嚴重有關(guān)，經(jīng)常伴有情感障礙。
尾狀核和豆狀核是基底節(jié)的初級傳入神經(jīng)核，并接受來自大腦皮質(zhì)和丘腦中央核及丘腦板內(nèi)核的興奮性投射。皮質(zhì)紋狀體的傳入纖維是谷氨酰能神經(jīng)。丘腦的傳入纖維也被認為是谷氨酰能神經(jīng)。黑質(zhì)部紋狀體(SNc)通過黑質(zhì)紋狀體通路提供致密多巴胺能傳入纖維到紋狀體(對大鼠此系統(tǒng)的綜述，見Fallon和Loughlin，大鼠神經(jīng)系統(tǒng)(The Rat Nervous System)，G.Paxinos，編著，第215-237頁，學術(shù)出版社，圣地亞哥，1995)。腹側(cè)紋狀體和聽神經(jīng)核接受大量來自中腦腹內(nèi)側(cè)VTA的多巴胺細胞的多巴胺能神經(jīng)支配。來自杏仁核的邊緣傳入纖維和來自中腦或中縫核的5-羥色胺能纖維也終止在腹側(cè)紋狀體。
紋狀體傳入纖維的分布和終止并不是簡單地代表它們的起始區(qū)域。紋狀體構(gòu)成埋入功能和化學上均與其不相同的周圍基質(zhì)中的斑或帶狀體。這種結(jié)構(gòu)最初應用乙酰膽堿酶(AChE)組織化學法得到證明，此AChE選擇性地使基質(zhì)著色(Graybiel和Ragsdale，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，755723-5726，1978)。自那以后，組織化學酶、免疫細胞化學、原位雜交、放射標記配體結(jié)合受體、順行變性和其它方法已被用于識別許多其它在兩個隔室中不同分布的標志物?；|(zhì)標志物包括鈣結(jié)合蛋白、生長抑素和多巴胺攝取([3H]馬吲哚結(jié)合)位點(Gerfen，J.Comp.Neurol.236454-476，1985；Voorn等，J.Comp.Neurol.289189-201，1989)。帶狀體能通過其相對較高豐度的腦啡肽、伴有黑質(zhì)紋狀體損害的5’-核苷酸酶活性、酪氨酸羥化酶、mu opoid結(jié)合受體和P物質(zhì)而被識別(Graybiel等，神經(jīng)科學(Neurosci.)6377-397，1981；Schoen和Grabiel，J.Comp.Neurol.322566-576，1992)。然而，象可能預料的那樣，這些標志物中許多有種屬間變異和發(fā)育變異，而且某些僅在紋狀體特定區(qū)域是有用的。
斑或基質(zhì)隔室中許多紋狀體通路的選擇性起始和終止使得化學標志物的多相性進一步復雜化。例如，從運動原、扣帶回、軀體感覺和基質(zhì)中皮質(zhì)末端視覺區(qū)域的傳入纖維(Gerfen，自然(Nature)311461-464，1984；Donoghue和Herkenham，腦研究(Brain Res.)365397-403，1986)。大多數(shù)來自邊緣皮質(zhì)深處V層和VI層的皮質(zhì)紋狀體傳入纖維終止于斑，而大多數(shù)來自較淺的V層和II、III層的傳入纖維終止于基質(zhì)(Gerfen，科學(Science)246385-388，1989)。來自VTA和SNc背層的傳入纖維提供多巴胺能傳入神經(jīng)進入基質(zhì)。斑接受來自SNc腹層的多巴胺神經(jīng)分布和SNr中的多巴胺細胞叢(Schoen and Graybiel，J.Comp.Neurol.322566-576，1992)。在背側(cè)紋狀體，來自丘腦內(nèi)側(cè)部核的傳入纖維終止于斑，而來自外側(cè)部的傳入纖維(包括前、后板內(nèi)核和rostral ventral tier nuclei)主要分布于基質(zhì)組織(Ragsdaleand Graybiel，J.Comp.Neurol.311134-167，1991)。此外，發(fā)自杏仁核基底外側(cè)核的紋狀體杏仁核纖維，選擇性地分布于斑隔室(Ragsdale和Graybiel，J.Comp.Neurol.269506-522，1988)。
紋狀體傳出纖維對于斑-基質(zhì)組織來說也是特異分布的。已經(jīng)證明，發(fā)自紋狀體兩個主要通路之一的紋狀體黑質(zhì)通路由兩個不同的投射組成。來自斑隔室神經(jīng)元的纖維終止在腹側(cè)SNc多巴胺神經(jīng)元周圍和SNr多巴胺細胞群上?；|(zhì)神經(jīng)元引起局部圖解式排列的投射到SNr，包括非-多巴胺能區(qū)域和樹突位于SNr的多巴胺神經(jīng)元(Gerfen，1984，見上文；Jiminez-Castallanos和Graybiel，神經(jīng)科學(Neurosci.)32297-321，1989)。
其它主要傳出投射，即紋狀體蒼白球通路，投射到蒼白球。尚未表明它的分布與斑-基質(zhì)組織有關(guān)；然而，它在神經(jīng)化學上不同于紋狀體黑質(zhì)系統(tǒng)。大多數(shù)紋狀體蒼白球纖維表達腦啡肽而非強啡肽或P物質(zhì)。相反，很少的紋狀體黑質(zhì)投射含有腦啡肽，但多數(shù)表達強啡肽和P物質(zhì)(Gerfen和Young，腦研究(Brain Res.)46061-167，1988)。在靈長類，兩個系統(tǒng)起源的解剖學區(qū)域也不同紋狀體蒼白球的傳出纖維主要來源自豆狀核，而紋狀體黑質(zhì)的傳出纖維主要源于尾狀核(Parent等，腦研究(Brain Res.)303385-390，1984)。
除了紋狀體連接的多相性分布外，在紋狀體還發(fā)現(xiàn)了幾種形態(tài)上和化學上不同類型的神經(jīng)元(Albin等，神經(jīng)科學趨勢(Trends Neurosci.)12366-375，1989；Groves，腦研究回顧(Brain Res.Rev.)5234-238，1983)?；谒鼈兊臉渫恍螒B(tài)，把它們傳統(tǒng)地分為棘狀或非棘狀神經(jīng)元。紋狀體中有兩類普遍認識的棘狀神經(jīng)元，它們含有γ-氨基丁酸(GABA)、P物質(zhì)、腦啡肽和強啡肽的多種聯(lián)合，但主要是GABA能。中等棘狀神經(jīng)元(棘狀I(lǐng)型)是迄今最豐富的，包含所有紋狀體神經(jīng)元的90-95％。它們有光滑的細胞體并且在它們樹突的遠端部分密集地積聚著棘突。其樹突的分枝范圍距離細胞體大約200μm。中等棘神經(jīng)元是SNc中多巴胺能神經(jīng)元的主要終極靶，主要在棘樹突莖上形成突觸。棘狀I(lǐng)I型神經(jīng)元非常大，伴有可變異的延伸出距離細胞體高達約600μm的樹突。
棘神經(jīng)元是紋狀體的投射神經(jīng)元。在含有GABA和P物質(zhì)基質(zhì)中的那些，主要投射到蒼白球內(nèi)部片段(GPi)和SNr，另一方面，含有腦啡肽的棘狀GABA能基質(zhì)神經(jīng)元，神經(jīng)分布于蒼白球外部片段(GPe)。斑隔室的棘神經(jīng)元將大多數(shù)傳出纖維傳送到SNc(Albin等，1989，見上文)。
兩個主要傳出通路的紋狀體投射神經(jīng)元通過其多巴胺受體亞型也能被辨別。投射到黑質(zhì)的P物質(zhì)/強啡肽神經(jīng)元主要表達D1多巴胺受體，而腦啡肽能紋狀體蒼白球神經(jīng)元主要表達D2受體，然而，在每一種投射中，沒有一種受體類型是特異性的表達(Besson等，神經(jīng)科學(Neurosci.)26101-119，1989；Gerfen等，科學(Science)2501429-1432，1990)。
三種確認類型的棘神經(jīng)元組成了紋狀體中間神經(jīng)元群(Groves，1983，見上文；Carpenter，在神經(jīng)科學核心教材(Core Text of Neurosciences)，325-360頁，Williams和Wilkins，巴爾蒂莫(Baltimore)，1991)。它們一起占紋狀體神經(jīng)元總數(shù)的10％或略少。棘狀I(lǐng)型神經(jīng)元是三種神經(jīng)元中最常見的，有略微小于中等神經(jīng)元的光滑的樹狀樹突。它們大部分是GABA能，但許多含有生長抑素和神經(jīng)肽Y。棘狀I(lǐng)I型神經(jīng)元通過其大的細胞體和AChE與膽鹼乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)染色來識別。該類型細胞與中等棘神經(jīng)元形成對稱的突觸。中等棘狀I(lǐng)II型神經(jīng)元特征最少，但認為它含有GABA。除了已經(jīng)識別的神經(jīng)元亞型之外，可能還有其它化學上定義和連接上定義的這些類型神經(jīng)元的亞型。
B.局部解剖圖和發(fā)育在中腦多巴胺系統(tǒng)的紋狀體投射中用順行性和逆行性跟蹤劑進行實驗，揭示成年嚙齒動物精細的局部解剖圖(Fallon和Moore，J.Comp.Neurol.180545-580，1978)。背側(cè)紋狀體接受來自腹側(cè)和中間SN及VTA神經(jīng)元的多巴胺能神經(jīng)支配。腹側(cè)紋狀體及聽神經(jīng)核接受來自背側(cè)VTA和中間SN的多巴胺能傳入纖維(Fallon，Ann.NY Acad.Sci.5371-9，1988)。
發(fā)育系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)生的梯度與成熟系統(tǒng)投射的局部解剖圖排列相平行。在大鼠胚胎期之前15天(E15)，胚胎中SN的背外側(cè)部分是最早產(chǎn)生的(Altman和Bayer，J.Comp.Neurol.198677-716，1981)。來自該區(qū)域的投射支配紋狀體的外側(cè)和腹側(cè)區(qū)域(Carter和Fibiger，神經(jīng)科學(Neurosci.)2569-576，1977；Veening等，神經(jīng)科學(Neurosci.)51253-1268，1980)，這也是最早產(chǎn)生的紋狀體區(qū)域(Bayer，神經(jīng)科學(Neurosci.)4251-271，1984)。由于較年輕的神經(jīng)元以腹外側(cè)到背內(nèi)側(cè)的梯度在紋狀體聚集，所以來自SN的更多腹內(nèi)側(cè)(及以后產(chǎn)生的)部分(E15后產(chǎn)生)的傳入纖維分布于這些以后產(chǎn)生的紋狀體區(qū)域。這樣，最年輕的(腹內(nèi)側(cè))黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元使神經(jīng)分布于最年輕的(背內(nèi)側(cè))紋狀體神經(jīng)元，而較老的(背外側(cè))黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元使神經(jīng)分布于較老的(腹外側(cè))紋狀體神經(jīng)元。該模式也在GABA能紋狀體黑質(zhì)投射中進行了重復(Bunney和Aghajanian，腦研究(Brain Res.)117423-435，1976)。
紋狀體神經(jīng)元是從出生前和出生后早期腦中的圍繞側(cè)腦室的神經(jīng)上皮衍生而來。一個室區(qū)域最初排列腦室，以后與正好在其下方的室下(或室管膜下)區(qū)域聯(lián)系。當腦成熟時，室區(qū)域消失，但室管膜下區(qū)域繼續(xù)形成一薄層細胞，該區(qū)域含有神經(jīng)干細胞和祖細胞，這些祖細胞沿著一個限定的和受限制的通路移行到嗅球充滿易變中間神經(jīng)元的細胞群(Luskin，神經(jīng)元(Neuron)11173-189，1993；Lois和Alvarez-Buylla，科學(Science)2641145-1148，1994)。
C.病理學紋狀體及其多巴胺能神經(jīng)支配易受許多疾病的傳染，包括神經(jīng)變性疾病(Albin等，1989，見上文)如亨廷頓病(HD)和帕金森病(PD)。HD是一種常染色體顯性遺傳性疾病(4號染色體)，其特點是紋狀體進行性變性。它與四肢和面部不隨意的舞蹈樣不自主(choreathetotic)運動及隨意運動障礙有關(guān)(綜述，見Purdon等，精神病學神經(jīng)科學雜志(J.Psychiatr.Neurosci.)16359-367，1994)。在基質(zhì)隔室中的中等棘狀GABA能神經(jīng)元最易受影響，特別是投射到GPe的GABA/腦啡肽能神經(jīng)元(Albin等，1989，見上文)。也在基質(zhì)隔室中發(fā)現(xiàn)的大的非棘狀膽鹼能中間神經(jīng)元和含有生長抑素、神經(jīng)肽Y和NADPH-黃遞酶的小的非棘狀中間神經(jīng)元則相對地被閑置(Ferrante等，科學(Science)230561-563，1985；Reiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855733-5737，1988)。然而，在HD更進一步的發(fā)展階段，神經(jīng)元變性包括各型紋狀體神經(jīng)元和蔓延到基底神經(jīng)節(jié)、大腦皮質(zhì)、下丘腦和小腦的其它核。
帕金森病(PD)的特點是靜止性震顫、強直、不能初始運動(不能運動)和運動緩慢(運動遲緩)(Marsden，Lancet 335948-952，1990)。與運動缺損有關(guān)的是多巴胺能黑質(zhì)紋狀體通路的進行性變性，和不同程度的聽神經(jīng)核多巴胺神經(jīng)支配的缺失以及藍斑去甲腎上腺素能細胞和縫的5-羥色胺能神經(jīng)元變性有關(guān)(Javoy-Agid等，神經(jīng)病學進展(Adv.Neurol.)40189-198，1984；Agid，Lancet 3371321-1327，1991)。在明顯的運動缺損出現(xiàn)以前，高達80％的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元可能缺失。
在神經(jīng)變性性疾病的治療中，使用已知為神經(jīng)營養(yǎng)因子的肽類作為治療劑的主要策略之一是抑制變性過程和提高殘余細胞的功能。在下面實施例中的研究將闡明本發(fā)明如何開拓除了以前已經(jīng)提示之外的神經(jīng)營養(yǎng)因子的應用。
II.神經(jīng)缺損的治療如下面的實施例證實的那樣，成人前腦室管膜下區(qū)的神經(jīng)元前體可能對輸注結(jié)合EGF受體的多肽(例如，TGFα；這里使用的術(shù)語“多肽”是指任何氨基酸殘基鏈，而不考慮長度或翻譯后修飾)反應，而被刺激增生并且全部移行進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)(例如，進入紋狀體)。另外，人們可以把增生細胞作為致密嵴定向移行。如下面所述，定向移行可按不同方式完成。例如，它通過被靶區(qū)域的去神經(jīng)(它可通過神經(jīng)化學或機械力來達到)、通過使用多肽生長因子(例如，TGFβ，它增加細胞粘附分子(如纖連蛋白和層粘連蛋白)的區(qū)域性表達)，和通過將細胞沿著所需移行的通路與對抑制移行的自然發(fā)生信號具有抑制作用的化合物進行接觸來進行(即，通過抑制一種抑制劑而創(chuàng)造一個許可的微環(huán)境)。
此外，移行嵴的形狀可通過改變輸注位置加以控制(例如，通過變更輸注套管或含有本發(fā)明活性成分的生物降解性膠囊的位置)。相似地，嵴內(nèi)的細胞數(shù)目可以通過改變活性成分的劑量來控制(例如，TGFα的劑量)，或者通過改變釋放化合物相對于室管膜下區(qū)域神經(jīng)前體細胞群的距離。如下面所述(如表10A，10B，11A，11B和11C所說明的)，當動物接受了中紋狀體或中層紋狀體輸注時，移行細胞在它們到達輸注插管以前即停止，產(chǎn)生S-型或L-型嵴。這樣，不僅可能促進細胞的移行而且可能控制移行的終點。調(diào)節(jié)生長因子(和也許其它的成分)釋放的劑量和部位可以使受影響的區(qū)域限制到一個相對局限的靶區(qū)域。
在成年哺乳動物腦中神經(jīng)系統(tǒng)前體細胞的增生和移行是可以獨立控制的不同的過程。沒有傳入神經(jīng)阻滯的TGFα或EGF腦室內(nèi)(ICV)或紋狀體內(nèi)輸注能誘導增生，但是變性的、損傷了的(例如，因傳入神經(jīng)阻滯或其它損傷)，或者其它異常的(即，機能不良)細胞一定表現(xiàn)出促進移行的程度至少足以影響神經(jīng)缺損的修復。如下面進一步所述，人們可以模仿藥物對變性的、損傷的或其它異常細胞的促進作用。例如，通過給藥一種誘導化合物刺激紋狀體中細胞粘附分子的短暫表達。例如，在小腦星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物中，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)使纖連蛋白強有力地上調(diào)(Baghdassarian等，Glia 7193-202，1993)。在過度表達TGFβ的轉(zhuǎn)基因小鼠中，纖連蛋白和層粘連蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也大大增加超過了正常水平(Wyss-Coray等，美國病理學雜志(Am.J.Pathol.).14753-67，1995)。這樣，用刺激細胞外基質(zhì)分子或細胞粘附分子表達的任何化合物來指導移行，特別是沿著所需移行通路的定向移行也認為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
前腦神經(jīng)干細胞，即引起移行的祖細胞，據(jù)信停留在沿著腦室壁的適當位置(Morshead等，神經(jīng)元(Neuron)131071-1082，1994)。在下面描述的實驗中，在移行嵴進入紋狀體之后，強的EGF受體雜交區(qū)域繼續(xù)沿著側(cè)腦室停留。此外，在嵴和側(cè)腦室之間總能發(fā)現(xiàn)伸長的細胞。這樣，盡管整個細胞團移行離開室管膜下區(qū)域，但干細胞本身可能不是移行嵴的部分。這些神經(jīng)干細胞提供新神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的可再生來源。因此可刺激神經(jīng)祖細胞的多個波以移行進入受損的、或者已變性的或者其它與神經(jīng)缺損有關(guān)的腦區(qū)域。這些細胞的持續(xù)性也提示成年前腦中的干細胞的正常功能--目前認為是為嗅球提供新神經(jīng)元--不應該被治療不可逆地打斷。
TGFα(及其mRNA)的紋狀體大量表達和多巴胺能神經(jīng)支配的缺乏也是發(fā)育早期紋狀體的特性(Weickert和Blum，腦研究進展(Devel.Brain Res.)86203-216，1995；Bayer，Intl.J.Devel.Neurosci.2163-175，1984)。相似地，在TGFα-輸注動物中室管膜下區(qū)域EGF受體mRNA表達的增加，擬似在發(fā)育期腦室周神經(jīng)上皮中所見到的大量EGF受體mRNA雜交(Seroogy等，腦研究(Brain Res.)670157-164，1995)。編碼可以促進神經(jīng)祖細胞移行的粘連蛋白、其受體和其它細胞粘附分子的信使RNAs也被發(fā)育性調(diào)節(jié)(Pesheva等，神經(jīng)科學研究雜志(J.Neurosci.Res.)20420-430，1988；Prieto等，細胞生物學雜志(J.Cell Biol.)111685-698，1990；Pagani等，細胞生物學雜志(J.CellBiol.)1131223-1229，1991；Linnemann等，國際神經(jīng)科學進展雜志(Int.J.Devel.Neurosci.1171-81，1993)。這樣，如在本研究中輸注TGFα和6-OHDA損傷的動物中觀察到的效果概念化的一種方式是如對胚胎神經(jīng)發(fā)生的選擇性概括那樣。即，成年哺乳動物腦中的神經(jīng)干細胞可以對增生信號作出反應，它們的子代細胞可以對移行信號作出反應，就象它們在發(fā)育期動物中所進行的那樣。
近來，在成年嚙齒動物CNS整個室管膜下(Weiss，Soc.Neurosci.Abstr.25101，1995；Ray等，Soc.Neurosci.Abstr.22394.5，1996)和在成年人前腦的室管膜下(Kirschenbaum等，腦皮質(zhì)(Cerebral Cortex)4576-589，1994)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)干細胞。按照本文中描述的方法，可以利用這些細胞為腦和脊髓不同區(qū)域的病態(tài)的、受損的、或其它損傷的或機能不良的CNS神經(jīng)元提供一種新的神經(jīng)元來源。
A.本發(fā)明的優(yōu)點如下面進一步所述，提出的治療神經(jīng)病缺損的技術(shù)之一涉及從有此類缺損的病人中取出神經(jīng)前體并使這些前體在培養(yǎng)基中生長以產(chǎn)生大量神經(jīng)祖細胞。然后應用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)將這些祖細胞重新植入同一病人(例如，見Stein等，在腦修復(Brain Repair)第87-103頁，牛津大學出版社，紐約，1995，或leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.22505，1996)。很顯然，該技術(shù)對于那些目前需要使用來自流產(chǎn)胎兒胚胎細胞的技術(shù)來說是先進的；它完全避免了由于需要使用流產(chǎn)胎兒作為組織供體而引發(fā)的倫理問題。另外，由于它不會刺激引起較高移植排斥發(fā)生率的免疫反應，所以它更可能會成功。
在體內(nèi)刺激神經(jīng)前體的增生和移行還有另外的優(yōu)點；體內(nèi)刺激降低了攻擊性神經(jīng)外科操作的程度和可能的數(shù)量。不進行干細胞切除手術(shù)，使用胚胎的或培養(yǎng)細胞移植物時通常需要的多樣移植細胞栓將不再是必需的。此外，不會有由于移植過程引起的未分化神經(jīng)祖細胞的大量消亡。通常，使用人胎兒的多巴胺能細胞移植，90％到超過99％的植入細胞在它們在宿主腦內(nèi)建立以前死亡(Freed等，Soc.Neurosci.Abstr.22481.3，1996)。
本發(fā)明提供的另一個優(yōu)點是神經(jīng)祖細胞不通過瘢痕組織從宿主腦分離出來。移植細胞栓被包封在膠質(zhì)疤痕組織與反應性星形膠質(zhì)細胞的殼內(nèi)。除了致密膠質(zhì)組織的物理屏障外，疤痕組織內(nèi)反應性星形膠質(zhì)細胞釋放抑制軸突自然伸長的因子(Mckeon等，1995)。在體內(nèi)產(chǎn)生的神經(jīng)祖細胞不是通過疤痕組織從腦的其它部位分離的。因而，其軸突的自然生長不會因為反應性星形膠質(zhì)細胞大量增生而受到限制。因此，本發(fā)明提供的定向移行允許大量新細胞選擇性地在CNS特定損害區(qū)域再集聚(其在程度上可以不同)而不干擾未損害區(qū)域。
本發(fā)明的技術(shù)也較以前在體內(nèi)進行的刺激前腦神經(jīng)干細胞的單一研究有了進步。在那項研究中，成年大鼠接受EGF的ICV輸注6天，接著高達7周的后輸注(Craig等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。在本研究中，TGFα輸注14天，接著輸注小于3個月結(jié)束輸注。其差別是關(guān)鍵的，因為僅在本研究中室周擴展的細胞以整體移行進入下覆的紋狀體中。神經(jīng)祖細胞團定向移行進入選擇的靶區(qū)域代表一個非常優(yōu)選使新神經(jīng)元再集聚在變性的腦區(qū)域的方法。
近來非常感興趣的一個領(lǐng)域是控制神經(jīng)干細胞分化。一旦干細胞已經(jīng)分化，細胞的最后定位和神經(jīng)化學表型則是最重要的并且在下面將進一步討論。
當神經(jīng)前體細胞從成年嚙齒動物腦中取出并在體外分化時，可見到免疫化學性地識別為星形膠質(zhì)細胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的細胞(Reynolds和Weiss，科學(Science)255.1707-1710，1992；Reynolds等，J.Neurosci.124565-4574，1992；Lois和Alvarez-Buylla，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902074-2077，1993)。許多識別為神經(jīng)元的細胞對于在紋狀體發(fā)現(xiàn)的兩種正常細胞類型的神經(jīng)化學標志物-GABA和P物質(zhì)，也存在免疫反應。從成年人腦中移植的前體細胞也表達神經(jīng)元的標志物并顯示與神經(jīng)元有關(guān)的神經(jīng)元電生理特性(Kirschenbaum等，腦皮質(zhì)(Cerebral Cortex)4576-589，1994)。
這些實驗提示當紋狀體嵴細胞在體內(nèi)自發(fā)分化時，其中許多將變成具有紋狀體神經(jīng)元典型表型的細胞。最近一些數(shù)據(jù)提示它們的表型可通過暴露于不同聯(lián)合的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白而被改變(Lachyankar等，Soc.Neurosci.Abstr.22394.7，1996)。接受不同處理的前體細胞一旦分化，它們表達不同的神經(jīng)化學免疫標志物，包括乙酰膽堿酯酶、GABA、，酪氨酸羥化酶(TH)和鈣結(jié)合蛋白。TH的表達特別令人感興趣，因為增生、移行和定向分化為多巴胺細胞的聯(lián)合可以提供一種新方法來替代帕金森氏病(PD)中喪失的紋狀體多巴胺。
在PD病人中，大量新的功能性產(chǎn)生多巴胺的紋狀體細胞有助于逆轉(zhuǎn)運動缺損，其方式類似于用流產(chǎn)胎兒的腦組織移植。在亨廷頓氏病(HD)病人中，神經(jīng)前體會受到刺激而使新的中等棘狀GABA能和其它神經(jīng)元在紋狀體處再集聚，而在該疾病時中等棘狀GABA能和其它神經(jīng)元喪失。近來某些來自不同研究領(lǐng)域的證據(jù)指出紋狀體蒼白球通路本身的重建也許是可能的。移植進入紋狀體的在條件控制下不死的神經(jīng)前體細胞分化并且把突起從紋狀體發(fā)送到蒼白球(Lundberg等，1996)。
B.可治療的神經(jīng)缺損由于本發(fā)明建立在多潛能前體細胞受到刺激而在腦內(nèi)分化和移行的發(fā)現(xiàn)上，所以它被用來治療由各種各樣的疾病、障礙和損傷引起的神經(jīng)缺損。這些損傷包括，但不限于，下列所述(本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對下面所列的不同疾病和障礙進行分類；然而歸類的有關(guān)神經(jīng)缺損按照本發(fā)明方法是可以治療的)。
1.變性疾病按照本發(fā)明方法可以治療的變性疾病包括阿耳茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、亨廷頓氏病(HD)、匹克氏病、進行性核上麻痹(PSP)、紋狀體黑質(zhì)變性、皮質(zhì)-基底節(jié)變性、兒童期分裂癥、橄欖體腦橋小腦萎縮癥(OPCA；包括可遺傳的類型)、萊內(nèi)氏病(Leigh disease)、嬰兒壞死性腦脊髓病、亨特氏病(Hunter’s disease)、粘多糖病、各種腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(如克臘伯氏病(Krabbe’s disease)、家族性腦中葉硬化(Pelizaeus-Merzbacher disease)等等)、黑蒙性(家族的)白癡(amaurotic(familial)idiocy)、庫福斯氏病(Kuf’sdisease)、家族黑蒙性白癡(Spielmeyer-Vogt disease)(少年型)、家族黑蒙性白癡(Tay-Sachs disease)、巴氏病(Batten)、Jansky-Bielschowsky病、Reye氏病、小腦共濟失調(diào)、慢性酒精中毒、腳氣病、哈斯二氏綜合征(Hallervorden-Spatz syndrome)、小腦變性等等。
2.中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷和神經(jīng)毒損傷按照本發(fā)明方法治療的外傷和神經(jīng)毒損傷包括槍擊傷、鈍傷、穿透傷(如刺傷)、手術(shù)操作過程中造成的損傷(例如，從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中切除腫瘤或膿腫或治療癲癇)、中毒(例如，MPTP或一氧化碳引起的中毒)、嬰兒顫抖綜合征、藥物的不良反應(包括特應性反應)、藥物過量(例如，苯丙胺過量)、創(chuàng)傷后腦病等等。
3.局部缺血神經(jīng)系統(tǒng)供氧和血流的任何中斷均可能損傷或殺死其中的細胞，包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。按照本發(fā)明方法可以治療這些損傷和包括發(fā)作(包括全身發(fā)作(如可能起因于心臟驟停、心律失常或心肌梗塞)或病灶發(fā)作(如可能起因于血栓、栓子、出血或其它的動脈阻塞))引起的損傷、缺氧、低氧、不完全淹溺、肌陣攣、嚴重吸煙、張力障礙(包括遺傳性張力障礙)、后天性腦積水等等。
4.發(fā)育障礙本發(fā)明方法可以治療的發(fā)育性障礙包括精神分裂癥、某些嚴重的精神發(fā)育遲緩、大腦性癱瘓(不論引起的原因是否是感染、缺氧、早產(chǎn)、血型不合等等和不論表現(xiàn)是否為視覺缺失、聾、遲緩、精細運動不能等等)、先天性腦積水、影響CNS的代謝障礙、嚴重的孤獨癥、Down綜合征、LHRH/下丘腦障礙、脊柱裂等等。
5.影響視覺的障礙本發(fā)明方法可以治療影響視覺的障礙，特別是那些因視網(wǎng)膜細胞缺失或衰竭引起的障礙。這些障礙包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、嚴重的視網(wǎng)膜脫離、與青光眼有關(guān)的視網(wǎng)膜損害、視網(wǎng)膜創(chuàng)傷性損傷、視網(wǎng)膜血管閉塞、黃斑變性、遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、視神經(jīng)萎縮和其它視網(wǎng)膜變性疾病。
6.脊髓損傷和疾病本發(fā)明方法也可以治療影響脊髓的損傷和疾病。這種損傷或疾病包括脊髓灰質(zhì)炎后遺癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、非特異性脊髓變性、外傷損傷(如機動車或運動事故引起的損傷，包括擠壓、部分離斷、完全離斷的任何損傷、或者影響脊髓細胞功能的其它有害方式)、脊髓手術(shù)引起的損傷(例如，切除腫瘤)、前角細胞疾病、麻痹性疾病等等。
7.脫髓鞘或自身免疫性疾病本發(fā)明方法可以治療由脫髓鞘或自身免疫反應引起的神經(jīng)缺損。該缺損可能由多發(fā)性硬化、狼瘡和其它原因引起。
8.感染性或炎癥性疾病本發(fā)明方法可以治療由感染性或炎癥性疾病引起的神經(jīng)缺損。能夠引起可以治療的缺損的感染性或炎癥性疾病包括痙攣性假硬化和其它慢性病毒感染性疾病、AIDS性腦病、腦炎后帕金森氏綜合征、病毒性腦炎、細菌性腦膜炎和由其它微生物引起的腦膜炎、靜脈炎和顱內(nèi)靜脈竇血栓靜脈炎、梅毒性帕金森氏綜合征、CNS結(jié)核等等。
9.其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能很好地認識無論什么原因的神經(jīng)缺損，并且能應用本發(fā)明方法治療有這種缺損的病人。除了上面所列的病癥外，本發(fā)明方法還可以治療下述原因引起的神經(jīng)缺損施萊奈恩二氏綜合征、重癥肌無力、各種癡呆、大量由寄生蟲引起的疾病、癲癇等等。本發(fā)明方法可以很方便地用于減輕由這些和其它疾病、障礙或損傷引起的神經(jīng)缺損。
C.與EGF受體結(jié)合的多肽1.EGF家族EGF家族中的多肽在某種程度上似乎是獨立的。例如，TGFα和EGF僅有30％結(jié)構(gòu)同源性(Marquardt等，科學(Science)2231079-1082，1984)。然而，它們顯示相似的結(jié)合動力學，并刺激分子量為180,000的EGF膜受體酪氨酸-特異性磷酸化(Cohen等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2554834-4842，1980；Reynold等，自然(Nature)292259-262，1981)。兩種生長因子功能上的等同，部分與六個半胱氨酸殘基的相對位置相同有關(guān)，在共有序列CX7CX4，5CX10CXCX8C中用”C”表示半胱氨酸殘基。這些保守殘基產(chǎn)生類似的二硫鍵-介導的結(jié)構(gòu)約束，并因此形成相關(guān)的三維結(jié)構(gòu)(Twardzik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825300-5304，1985)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很好地將已知的任何氨基酸序列與EGF-家族共有序列進行比較以決定一個多肽是否有可能與EGF在功能上相等(如果如此的話，則適用于本發(fā)明方法)。(參見例如，Blomquist等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817363-7367，1984，描述了揭示半胱氨酸和甘氨酸殘基在EGF、TGFα和牛痘病毒19kDa早期蛋白的序列中的相似模式的計算機檢索)。
除EGF、TGFα和牛痘病毒(VGF)以外，已知EGF家族包括雙調(diào)蛋白(AR)、β-動物纖維素(BTC)、(epiregulin)(ER)、肝素-結(jié)合EGF-樣生長因子(HB-EGF)、神經(jīng)鞘瘤-衍生的生長因子(SDGF)、HUS 18878、粘液瘤病毒生長因子、休普氏纖維瘤病毒和畸胎瘤-衍生的生長因子-1(TDGF-1；也稱為Cripto-1(CR-1))。
2.測定EGF受體結(jié)合的方法本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠方便地測定任何已知的多肽是否與EGF受體結(jié)合。這里使用的術(shù)語“結(jié)合”指多肽和EGF之間任何特異性相互作用，其中這種相互作用導致足夠信號傳導以引發(fā)生物反應，優(yōu)選是導致減輕神經(jīng)缺損的反應。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明方法的任何已知多肽將與EGF受體結(jié)合，其中親和力至少為EGF本身結(jié)合親和力的50％，更優(yōu)選至少70％，最優(yōu)選至少90％(見Twardzik等，見上文，VGF、TGFα和EGF在EGF受體結(jié)合方面的生物活性比較)。
如果在進行EGF受體結(jié)合試驗中需要指導，本領(lǐng)域技術(shù)人員可查閱描述適宜方法的多種出版物中的任何一本(與該主題有關(guān)的5本出版物在此全面引用)。例如，可以參閱Cohen和Carpenter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 721317-1321，1975)或者，它們的修訂版，Twardzik等，見上文。類似地，對于EGF受體，包括特異性結(jié)合和序列信息、信號和受體拓撲學，可以參閱例如，McInnes和Sykes(生物聚合物(Biopolymers)43339-366，1997)，Boonstra等，(國際細胞生物學(Cell Biol.Intl.)19413-430，1995)，或Gill(分子生殖發(fā)育學(Mol.Reprod.Dev.2746-53，1990)。
D.定向移行下面的實施例也提供神經(jīng)前體細胞成功地定向移行的證據(jù)，特別是在成年嚙齒動物前腦。在下面的操作實施例中使用的免疫組化和其它技術(shù)(和其中詳細描述的)，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常用的可比技術(shù)，可用于確定任何生長因子輸注或任何其它用于引導細胞移行的刺激物的作用。的確，可以追蹤細胞移行的某些細節(jié)(即，可測定神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細胞數(shù)量、它們的大小、形狀和位置)。
在體內(nèi)，各種刺激可用于細胞以定向引導全部細胞的移行(術(shù)語“全部”，在這里用于描述細胞移行時，是指細胞群基本上向相同方向移動足夠時間被看成一團(正如圖9、10和11所顯示的那樣))。廣義地，可以按一種或兩種方式定向移行(1)助長(conducive)方式，即，使用正向吸引移行細胞的刺激物(如增加細胞粘附分子或細胞外基質(zhì)分子(例如粘連蛋白、層粘連蛋白或神經(jīng)細胞粘附分子)表達的化學吸引劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子或化合物(如TGFβ))，或者(2)允許方式，即，通過使用抑制那些會抑制移行細胞的信號的刺激物。
定向移行的刺激包括在靶區(qū)域(可以是細胞已被破壞的部位，例如，紋狀體或黑質(zhì)，在這些部位已知多巴胺能細胞毀損與大量衰弱性神經(jīng)變性疾病有關(guān)；大腦皮質(zhì)，此處神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)毀損是由血栓或栓塞發(fā)作后引起的局部缺血所致；或者脊髓，此處運動神經(jīng)元由于例如創(chuàng)傷而被毀損；或者由于發(fā)育障礙使細胞形成異常聯(lián)系的任何部位)中組織損傷。另一方面，可以在從神經(jīng)祖細胞發(fā)源地向其所需移行終點伸出的通道內(nèi)或沿著此通道損傷組織。
組織可以下列方式受損傷物理力(例如，腐蝕或切除神經(jīng)元，或切斷一種或多種由神經(jīng)細胞體伸出的突起)、使用化學物質(zhì)如毒素或神經(jīng)毒素(例如，蓖麻毒或6-OHDA)、腐蝕性化學制劑(例如，酸或堿溶液)、誘導細胞程序性死亡的化合物(參見例如，Leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.22505，1996)、或者誘導脫髓鞘作用的化合物(參見例如，Leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.231689，1997)、或能夠抑制細胞活性的化合物，例如反義寡核苷酸(如抑制編碼細胞主要神經(jīng)遞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄)、抗體或多肽。許多此類化合物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且包括那些與細胞表面受體結(jié)合但未能激活受體的化合物，例如metabotropic受體通常被谷氨酸鹽結(jié)合的。例如，在下面描述的研究中，利用6-OHDA(與輸注TGFα一起)的去多巴胺神經(jīng)作用對細胞移行的影響是顯然的。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用上述任何一種化學物質(zhì)能夠很好地將細胞定向移行到神經(jīng)系統(tǒng)的靶區(qū)域，特別是現(xiàn)在可以用例如核磁共振成像或計算機斷層掃描生成的異常清晰和精確的病人腦和脊髓的圖像而確定靶部位。
此外，下面描述的研究可以看出，改變與定向移行所用化合物有關(guān)的一種或多種變量(變量包括性質(zhì)、部位、濃度和使用時間)來影響細胞沿著更精確的途徑定向移行并確定細胞要到達的位置。
E.分化因子盡管一些神經(jīng)前體細胞在給予足夠長的時間內(nèi)可以自發(fā)地進行分化，但是通過控制什么時候和在哪里發(fā)生分化將會極大地受益；對此加以控制使得人們可以把神經(jīng)“再生”(再生可以是部分或全部，只要它足以減輕神經(jīng)缺損即可)限制在其需要的CNS區(qū)域。因此，在神經(jīng)祖細胞與結(jié)合EGF受體的多肽接觸之前、期間或之后，可給予各種刺激。
廣義地說，誘導分化的刺激可包括“普通”分化或“定向”分化。普通分化刺激是刺激細胞以其天然方式進行分化，在通過刺激細胞表達其天然表型即可以減輕神經(jīng)缺損的情況下使用。例如，本領(lǐng)域已知，一旦暴露于普通分化信號，紋狀體室管膜下區(qū)細胞分化成GABA能神經(jīng)元。這樣，通過使用普通分化因子刺激這些細胞分化將會減輕與亨廷頓氏病(Huntington’s disease)有關(guān)的神經(jīng)缺損；此疾病患者中，GABA能介質(zhì)棘狀神經(jīng)元選擇性喪失。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很好地使用刺激普通分化的已知方法來刺激細胞增生和移行。例如，已知將細胞與成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白接觸以使細胞退出細胞周期，退出細胞周期這是分化所必需的(參見最新研究，Slack等，細胞生物學雜志(J.Cell Biol.)1401497-1509，1998)，和將細胞與細胞周期有關(guān)的激酶抑制劑-p21接觸，可以使細胞保持在有絲分裂后期(即，分化的)(Berger等，Soc.Neurosci.Abstr.22505；1996)。在本文方法中可用于刺激分化的另一刺激是細胞周期蛋白D細胞周期調(diào)節(jié)劑(Ouaghi等，Soc.Neurosci.Abstr.221706，1996)。如果希望刺激少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞前體分化，則可以使用整聯(lián)蛋白(參見例如，Buttery等，Soc.Neurosci.Abstr.221723，1996)。眾所周知腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和視黃酸(RA)刺激細胞分化的能力(參見例如，Ahmed等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)155765-5778，1995)。
如果神經(jīng)前體細胞在定向移行之前被培養(yǎng)，則它們可被移植入能夠影響它們分化的腦區(qū)域。例如，當位置靠近室下區(qū)時，與移植到更外側(cè)位點(僅有0-8％細胞分化)的神經(jīng)前體細胞相比，高百分比的移植神經(jīng)前體細胞分化成神經(jīng)元(高達35％)(Catapano和Macklis，Soc.Neurosci.Abstr.23345，1997)。類似地，當將小腦前體細胞移植進海馬時，小腦前體細胞表達海馬神經(jīng)元的標志物(Vicario-Abejon等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.156351-6363，1995)。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解到，作為增生性神經(jīng)祖細胞的子代與刺激祖細胞分化的化合物接觸的另一種方法，可通過將細胞移植入能夠誘導其分化的腦區(qū)域內(nèi)或者足夠近的區(qū)域來完成本發(fā)明。
定向分化刺激是刺激細胞分化，但表型與其天然表達的不同的刺激。當可通過刺激細胞表達非天然表型而減輕神經(jīng)缺損時，可使用定向分化因子。此種情況的一個例子是帕金森氏病，紋狀體細胞分化成產(chǎn)生多巴胺的細胞替代黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)分布的喪失。類似地，人們設(shè)法刺激膽堿能表型在中隔區(qū)的表達，此區(qū)細胞在阿耳茨海默氏病時選擇性喪失；在脊髓運動神經(jīng)元的表達，肌萎縮性側(cè)索硬化和創(chuàng)傷性脊髓損傷后脊髓運動神經(jīng)元喪失；以及在少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞的表達，少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞在諸如多發(fā)性硬化等脫髓殼疾病中喪失。
衍生自神經(jīng)膠質(zhì)細胞株的GDNF/營養(yǎng)因子(TGFβ)家族的因子，可誘導神經(jīng)細胞分化(而且，被RA增強)(Hishiki等，癌癥研究(Cancer Res.)582158-2165)，在大鼠中腦培養(yǎng)基中，GDNF刺激運動神經(jīng)元分化。BDNF和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)也促進運動神經(jīng)元分化(它們的作用對于GDNF的作用似乎是相加或協(xié)同作用)(Zurn等，神經(jīng)科學研究雜志(J.Neurosci.Res.)44133-141，1996)。另外，使用在神經(jīng)管腹側(cè)區(qū)表達的球聯(lián)蛋白(Martinez-Morales等，發(fā)育(Development)1245139-5147)和聲刺猬(sonic hedgehog)編碼的蛋白質(zhì)(Tanabe等，現(xiàn)代生物學(Curr.Biol.)565l-658，1995)可以誘導運動神經(jīng)元分化。聲刺猬家族的成員之一，印度刺猬，在發(fā)育和成熟視網(wǎng)膜中表達并促進視網(wǎng)膜祖細胞增生和光感受體發(fā)育(Levine等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)176277-6288，1997)。
皮質(zhì)神經(jīng)祖細胞采用受EGF、TGFα和生長所基于的底物類型影響的區(qū)域特異性表型。將EGF或TGFα放到生長因子缺乏的MatrigelTM或IV型膠原上，使得衍生自非-邊緣區(qū)域祖細胞的邊緣神經(jīng)元的百分比加倍(Ferri等，發(fā)育(Development)1211151-1160，1995)。
已知胰島素影響胎兒神經(jīng)細胞培養(yǎng)物的分化，甚至超過IGF-1(Abboud等，Soc.Neurosci.Abstr.231425，1997)。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白可用于海馬細胞的定向分化(Vicario-Abejon等，神經(jīng)元(Neuron)15105-114，1995)。
在一實施方案中，本發(fā)明方法可用于修復退行性疾病喪失的神經(jīng)通路。例如，基于其分化，分化的紋狀體GABA能神經(jīng)元可修復紋狀體蒼白球投射。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很好地認識到，本發(fā)明方法能夠使大量神經(jīng)通路重建。
F.藥物組合物適宜在本發(fā)明使用的多肽(即，那些與EGF受體結(jié)合或促進分化的多肽，這里也稱作“活性化合物”)可摻入到適于給藥的藥物組合物中。這些組合物通常包含一種或多種多肽和“藥學上適用的載體”，藥學上適用的載體是指在包括與給藥的藥物相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等等。使用的介質(zhì)和試劑是本領(lǐng)域所熟知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑的范圍內(nèi)與活性化合物不相容外，考慮了它們在組合物中的應用。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將藥物組合物按它們打算給藥的途徑(可以包括腸外，如靜脈、皮內(nèi)或肌內(nèi)注射；口服給藥；或直接用于受影響區(qū)域)進行配制。設(shè)想本方法是這樣進行的把多肽用于從腦部采集并放入培養(yǎng)基中的神經(jīng)元前體中或直接體內(nèi)用于前體細胞中(例如，通過注射小管或分流器輸注，或者通過裝入一個載體如生物降解膠囊內(nèi)而植入)。但是其它給藥途徑，特別是胃腸外(優(yōu)選靜脈內(nèi))給藥，也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
適用于本發(fā)明藥物組合物的溶液或懸浮液(例如，在包含與EGF受體結(jié)合的多肽和促進神經(jīng)元前體分化的化合物的組合物中)可以包括無菌稀釋劑如水、生理鹽水、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌或抗真菌劑如苯甲醇、對羥基苯甲酸酯(如對羥基苯甲酸甲酯)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫汞撒等；抗氧劑如抗壞血酸或硫酸氫鈉；交聯(lián)劑如EDTA；緩沖液如乙酸、檸檬酸或磷酸；和調(diào)節(jié)張力的物質(zhì)如氯化鈉或葡萄糖。pH可用酸或堿來調(diào)節(jié)，如鹽酸或氫氧化鈉。
適于注射的藥學組合物包括無菌水溶液(其中活性化合物是水溶性的)或分散劑和為臨時配制無菌注射溶液或分散劑的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)給藥，適宜的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽液(PBS)。所有情況下，組合物必須是無菌的，而且應當為容易通過注射器的流體(可以保持適當?shù)牧鲃有裕?，通過使用包衣如卵磷脂，在為分散劑時通過維持一定粒度和通過使用包括表面活性劑)。如上所述的組合物必須在制備和貯存條件下穩(wěn)定，并且必須進行抗微生物如細菌和真菌污染的防腐處理。許多情況下，在組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。在組合物中包含延緩吸收物質(zhì)，如單硬脂酸鋁和明膠，可以實現(xiàn)延緩注射組合物吸收的目的。
將活性化合物(如，結(jié)合EGF受體的多肽)按其所需的量摻入到適宜溶劑及如所需的上述列舉的一種或聯(lián)合的配合劑中，然后過濾滅菌，可以制得滅菌注射組溶液。通常，通過將活性化合物摻進包含基本分散介質(zhì)和上述列舉配合劑中所需的其它組分的滅菌載體中而制得分散劑。在為配制滅菌注射溶液的滅菌粉末形式時，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，它產(chǎn)生活性化合物加上得自前述滅菌過濾溶液的任何其它所需的組分的粉末。
在一實施方案中，活性化合物是與保護它不被機體快速清除的一種或多種載體一起制備，如控釋制劑，包括植入體和微囊釋放系統(tǒng)?？墒褂蒙锝到狻⑸锵嗳菪跃酆衔?，例如乙烯基醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酯和聚乳酸。制備此類制劑的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。材料可通過商業(yè)渠道獲得，例如，購自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂質(zhì)體懸浮液也可用作藥學適用載體。這些可按照本領(lǐng)域已知的方法制備，如在美國專利4522811中所描述的方法。
將本發(fā)明組合物制成方便給藥的劑量單位形式和均一劑量是尤為有利的。這里所說的劑量單位形式是指適合接受治療者作為單位劑量使用的物理獨立的單位形式；每一單位包含為產(chǎn)生期望治療效果而計算出的預定量的活性化合物和相關(guān)的所需藥學載體。對本發(fā)明劑量單位形式的說明由下面因素決定或直接依賴于它們活性化合物的獨特的特性、要達到的特定治療效果和合成該用于治療個體的活性化合物的現(xiàn)有技術(shù)中的固有局限性。
作為直接應用結(jié)合EGF受體或促進細胞分化的多肽的替代，可將編碼這些多肽的核苷酸分子插入到載體中并用作基因治療載體?；蛑委熭d體可通過例如靜脈注射、局部給藥(美國專利5328470)或通過立體定位注射(參見例如，Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057，1994)輸送給個體?；蛑委熭d體的藥學制劑可以包括在可適用稀釋劑中的基因治療載體，或者包括包埋在緩釋基質(zhì)中的基因治療載體，例如，在腦和脊髓中。另一方面，如果完整基因釋放載體能夠從重組細胞完整無缺地產(chǎn)生的話，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，則藥學制劑可以包括已知或多種產(chǎn)生基因釋放系統(tǒng)的細胞。
藥物組合物可與給藥說明書一起裝入容器、包裝盒或分散器中。
G.治療方案通過實施例(本領(lǐng)域普通技術(shù)人員從一個模型(無論是體內(nèi)還是體外模型)能夠很好地推導到另一模型，朝著對患者最適劑量進行)，對于嚙齒動物腦，刺激神經(jīng)元前體細胞增生的輸注至少持續(xù)2周的期間。結(jié)果是沿著腦室交界的未分化祖細胞數(shù)量明顯增加。下面的工作實施例中，連續(xù)輸注TGFα也支持放射狀細胞移行，但在某些動物觀察到，靠其自身尚不足以刺激大量放射狀移行。根據(jù)本發(fā)明方法，所進行的任何治療的期間可依所期望的結(jié)果不同而異。例如，在下面工作實施例中，在細胞團從腦室移行開之前的一周多的期間細胞數(shù)量大大增加。另外，靶區(qū)的去神經(jīng)支配(神經(jīng)化學的或機械的方法)促進遲延移行，并且同時輸注的因子如另一神經(jīng)營養(yǎng)因子-TGFβ也可藥理學地促進遲延移行，TGFβ增加細胞粘附分子區(qū)域性表達，所述細胞粘附分子被認為是放射狀移行(如上所述)的基礎(chǔ)。移行細胞嵴的移行模式和最終定位可以通過改變輸注位置來控制。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很好地決定在本發(fā)明中施用的化合物的所需劑量。優(yōu)選地，無論輸注還是從緩釋載體中釋放，活性化合物或組分(例如，TGFα或上述任何因子)的給藥劑量范圍為1～100ng/kg/天；更優(yōu)選施用1～50ng/kg/天；最優(yōu)選1～10ng/kg/天。
實施例實施例1在正常發(fā)育和成年黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中TGFα和EGF受體mRNAS的表達正如在發(fā)明詳述中所述，在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中編碼EGF-家族神經(jīng)營養(yǎng)因子的mRNA被發(fā)育性調(diào)節(jié)。在下述研究中，檢測TGFα和EGF受體mRNA在正常發(fā)育和成年嚙齒動物系統(tǒng)中的表達。
A.動物和組織準備成年雄性和雌性Sprague-Dawley孕鼠(250-350g)購自Simonsen(Gilroy，CA)。在這些實驗中和這里描述的所有其它實驗中，動物保持在室溫和濕度控制的動物園中。依照國立衛(wèi)生研究院的準則，所有實驗過程中動物的使用均得到加利福尼亞大學Irvine動物研究協(xié)會的批準。
新生(P0)、生后1天(P1)和P4動物低溫麻醉并用斷頭術(shù)處死。P10，P21和成年動物用斷頭術(shù)處死?？焖偃〕鏊鼈兊哪X，在-20℃異戊烷中冷凍并貯存于-70℃。在低溫恒溫器上切下20μm的冠狀面切片，并按由前-到后排的順序融解-粘附到VectabondTM(Vector Labs，Inc.)覆蓋的載玻片上。將切片用0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)配制的4％低聚甲醛后固定1小時，磷酸緩沖液洗滌，空氣干燥。切片與干燥劑一起在-20℃貯存待用。
B.雜交探針用大鼠TGFα 5’末端550個核苷酸的XbaI/BamHI cDNA片段制備TGFαmRNA探針，并亞克隆進pGEM 7zf(Promega，Inc.)。反義和正義探針分別用SP6和T7聚合酶轉(zhuǎn)錄。在pGEM 7Zf中，用來自該基因5’末端長度為718堿基對的插入片段制備大鼠EGF受體mRNA探針。使用亞克隆進pGEM 7Zf的1.2kbBamHI/EcoRI片段制備大鼠TH的探針。用T7聚合酶轉(zhuǎn)錄EGF受體和TH的反義亞克隆。用SP6聚合酶轉(zhuǎn)錄EGF受體和TH的正義亞克隆。在存在[35S]UTP時，所有探針轉(zhuǎn)錄時被標記(NEN Research Products，Inc.)。
C.原位雜交和分析按照Simmons等(組織學技術(shù)雜志(J.Histotech.)121169-181，1989)描述的方法進行原位核苷酸雜交，除開發(fā)育腦用0.0001％蛋白酶K溶液和0.05M EDTA處理外。切片在65℃與濃度為107cpm/ml的正義或反義探針雜交過夜。取自同一動物的相鄰切片與每一個探針雜交，以便于直接比較它們的解剖學分布。
取自發(fā)育和成年動物的玻片按組放置并放在14C-標記的腦漿標準品的近處以使BetaMax Hyperfilm(Amersham，Inc.)放射自顯影6到7天。在成功地顯影放射自顯影膠片后，將玻片浸入Kodak NTB-2乳液，曝光4周。放射自顯影單張膠片和NTB-2乳液用D-19顯影劑顯影并快速定影(Kodak，Inc.)。然后用硫素復染并加蓋玻片。半定量分析浸泡和染色的切片并在明和暗視野顯微鏡下照相。
自出生后初期發(fā)育到成年期選擇時間點跟蹤TGFα和EGF受體mRNA在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的表達。發(fā)現(xiàn)TGFα mRNA雜交在出生后初期的紋狀體中非常豐富，然后逐漸降低，到P21時接近成年水平。在胼胝體的表達于出生后發(fā)育期增加到與在紋狀體中可比的水平。在發(fā)育期或成年黑質(zhì)中未檢測到明顯豐富的TGFαmRNA。
紋狀體EGF受體mRNA在生后發(fā)育初期達高峰，到P21又下降。EGF受體在側(cè)腦室周圍的神經(jīng)上皮中含量最高，但在紋狀體體部也發(fā)現(xiàn)有中等水平。在發(fā)育期腹側(cè)中腦，EGF受體mRNA僅在出生后初期的腦中能夠檢測到，但逐漸增加，到P21天時達中等水平。
在成年動物，TGFαmRNA在紋狀體中度表達，在腹側(cè)紋狀體和聽神經(jīng)核低-到-中度表達。發(fā)現(xiàn)EGF受體mRNA在紋狀體體部雜交水平低，而在聽神經(jīng)核有遍布分散的較高的點狀表達，在緊靠側(cè)腦室邊緣的紋狀體區(qū)域保持中等水平。
在成年腹側(cè)中腦，在黑質(zhì)(SN)，特別是中部致密區(qū)(medial parscompacta)，及腹側(cè)蓋區(qū)(VTA)的黑質(zhì)旁(paranigral)和鰓旁核(parabranchial)發(fā)現(xiàn)EGF受體mRNA雜交。
前述研究表明，TGFα和EGF受體mRNA在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)個體發(fā)育過程中被強烈調(diào)節(jié)，它們在成年的表達主要代表發(fā)育模式的繼續(xù)(Lazar和Blum，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)121688-1697，1992；Weickert和Blum，Devel.Bain Res.86203-216，1995)。發(fā)育和成年動物的TGFα和EGF受體mRNA雜交與這些早期報道的發(fā)現(xiàn)極為相似。它們在成年紋狀體和中腦的持續(xù)性與其在成熟黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的支持作用是一致的。
EGF受體mRNA在成年動物沿著前腦室外側(cè)室管膜下區(qū)的適當表達表明在此區(qū)域維持作用或細胞功能(Seroogy等，腦研究(Brain Res).670157-164，1995；Weickert和Blum，1995，見上文)。已表明TGFα(或EGF)支持來自此區(qū)域而在體外移植和生長的“EGF-敏感”細胞的存活和分化(Reynolds和Weiss，科學(Science)2551707-1710，1992；Reynolds等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)124565-4574，1992)。在體內(nèi)發(fā)育期，它可能起著類似功能。
實施例26-羥多巴胺損傷和紋狀體TGFα輸注對TGFα和TGF受體mRNA表達的調(diào)節(jié)。
原位雜交用于測定黑質(zhì)紋狀體TGFα或EGF受體mRNA是否受到紋狀體內(nèi)輸注TGFα的影響。此外，也檢測了單側(cè)6-OHDA損傷對輸注和未輸注動物受體表達的影響。
A.治療組體重250-300克的成年雄性Sprague-Dawley大鼠購自Simonsen(Gilroy，CA)，分配到五個治療組中的每一組(1)紋狀體TGFα輸注，黑質(zhì)6-OHDA損傷(此后稱“損傷”)；(2)TGFα輸注，沒有損傷；(3)人工腦脊液(aCSF)輸注，損傷；(4)aCSF輸注，沒有損傷；(5)無輸注，無損傷。每個實驗組用4至8只動物。每次手術(shù)后監(jiān)測動物直至完全康復，其它所有時間動物在溫度和濕度得到控制的動物園中喂養(yǎng)。
B.6-羥多巴胺損傷用每公斤體重8mg賽拉嗪和100mg氯胺酮將大鼠麻醉。注射前立即用0.9％鹽水和0.01％抗壞血酸配制4.8mg/ml 6-羥多巴胺鹽酸冷溶液(6-OHDA；Sigma Chemical Co.)。使用滅菌技術(shù)，用耳間調(diào)零作參照，以1μl/分的速度定向注入左側(cè)黑質(zhì)(+3.7A/P；+2.1M/L；+2.0D/V)8μl(Paxinos和Watson，The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates，Academic Press，San Diego，1986)。通過酪氨酸羥化酶(TH)mRNA在中腦的原位雜交監(jiān)測6-OHDA損傷的成功和程度。TH是多巴胺合成通路的限速酶，并且是多巴胺產(chǎn)神經(jīng)元的通用標志物。一只具有不完全損傷的動物(保留相當數(shù)量的黑質(zhì)TH-IR細胞)排出在此研究之外，也未包括在總動物數(shù)量中。
C.輸注損傷后4～5周植入滲透微型泵(型號2002，Alzet，Inc.)。對于實驗動物，微型泵充有大約200μl人工腦脊液(aCSF)配制的0.05μg/ml TGFα，而對照動物，微型泵僅僅充有aCSF；在植入前于37℃孵育過夜。如上進行麻醉，在無菌條件下，利用前囟(Bregma)作參照，將聯(lián)在微型泵上的5mm小管(腦輸注工具箱，Alzet，Inc.)定向植入左側(cè)尾-豆狀核(+1.2A/P；+2.7m/l)(Paxinos和Watson，1986，見上文)，并用羧化物粘固粉固定到顱骨上(圖1)。微型泵本身埋在肩胛間區(qū)的皮下。輸注液在2周期間以0.5μl/小時的速度直接釋入紋狀體。
D.組織制備在輸注期末，斷頭處死動物?？焖偃〕鏊鼈兊哪X，在-20℃異戊烷中冷凍并貯存在-70℃。按20μm切下冠狀面切片，并按由前-到后排的順序融解-粘附到VectabondTM(Vector Labs，Inc.)覆蓋的載玻片上。用0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)配制的4％低聚甲醛后固定1小時，用磷酸緩沖液洗滌，空氣干燥。切片與干燥劑一起在-20℃貯存待用。
E.雜交探針用大鼠TGFα5’末端550個核苷酸的XbaI/BamHI cDNA片段制備TGFαmRNA探針，并亞克隆進pGEM 7zf(Promega，Inc.)。反義和正義探針分別用SP6和T7聚合酶轉(zhuǎn)錄。在pGEM 7Zf中，用該基因5’末端長度為718堿基對的插入片段制備大鼠EGF受體mRNA探針。使用亞克隆進pGEM 7Zf的1.2kbBamHI/EcoRI片段制備大鼠TH的探針。用T7聚合酶轉(zhuǎn)錄EGF受體和TH的反義亞克隆。用SP6聚合酶轉(zhuǎn)錄EGF受體和TH的正義亞克隆。在存在[35S]UTP時，所有探針轉(zhuǎn)錄時被標記(NEN Research Products，Inc.)。
F.原位雜交和分析按照Simmons等(1989，見上文)描述的方法進行原位核苷酸雜交。除發(fā)育腦用0.0001％蛋白酶K溶液和0.05M EDTA處理外。來自實驗和對照動物的平行切片在65℃與濃度為107cpm/ml的正義或反義探針雜交過夜。取自同一動物的相鄰切片與每一個探針雜交，以便于直接對比它們的解剖學分布。
取自實驗和對照動物的玻片按組放置并放在14C-標記的腦漿標準品的近處以BetaMax Hyperfilm(Amersham，Inc.)放射自顯影6到7天，玻片浸入Kodak NTB-2乳液，曝光4周。放射自顯影單張膠片和NTB-2乳液用D-19顯影劑顯影并快速定影(Kodak，Inc.)。然后用硫素復染并加蓋玻片。
G.分析和定量檢測浸泡和染色的切片并在明和暗視野顯微鏡下照相。使用MCID系統(tǒng)(Microcomputer Imaging Device，Imaging Research，Inc.)定量分析放射自顯影。在感興趣區(qū)域的每一解剖區(qū)域內(nèi)多位點取樣，讀取密度計讀數(shù)并進行平均。然后，從得自14C腦漿標準品的數(shù)據(jù)而用計算機-生成的三維多項式標準曲線中，可以估算TGFα和EGF受體雜交的相對濃度。接著，將每個治療組的每個區(qū)域的估算值平均并計算標準誤。實驗處理的同側(cè)腦區(qū)與相同切片的相應對側(cè)區(qū)進行比較，或者與大致相同部位的對照腦的相應區(qū)進行比較。使用學生t-檢驗檢測對比的顯著性。
H.正常表達和控制輸注在接受aCSF紋狀體輸注的對照動物中，TH、TGFα和EGF受體mRNA在紋狀體、紋狀體室管膜下區(qū)和SN的表達，與正常動物均無顯著差異(見實施例1中正常發(fā)育和成年鼠的表達)。在整個SN-VTA，TH mRNA雜交顯著。在SN未測到TGFαmRNA。然而，EGF受體mRNA在中腦黑質(zhì)致密部(SNc)、paranigral、臂旁核和VTA的腳間核顯著(圖2)。
TGFαmRNA雜交在尾-豆狀核和聽神經(jīng)核(NA)表達，在NA的密度稍低。發(fā)現(xiàn)在紋狀體的整個體部EGF受體雜交水平低，而NA高的點狀表達分散在整個低水平背景中，在沿著側(cè)腦室的紋狀體增生區(qū)是中等水平。
I.6-OHDA損傷的效果單側(cè)黑質(zhì)6-OHDA損傷使同側(cè)紋狀體TGFαmRNA雜交降低達25％，但不影響對側(cè)TGFαmRNA雜交(圖5)。損傷動物與正常動物比較，紋狀體和室管膜下區(qū)EGF受體雜交沒有變化(圖6)。在中腦，6-OHDA損傷使同側(cè)SN-VTAEGF受體雜交消失。
J.TGFα輸注的作用在接受TGFα輸注的未損傷動物，與對側(cè)紋狀體或正常動物紋狀體相比，輸注紋狀體中的TGFαmRNA雜交沒有變化(圖5)。接受TGFα或aCSF輸注的少數(shù)動物，在緊緊圍繞輸注插管疤痕處顯示出TGFαmRNA雜交輕度增加。輸注沒有使TGFαmRNA雜交在黑質(zhì)增加到可測到的水平。
在所有接受TGFα輸注的動物，EGF受體mRNA雜交在同側(cè)室管膜下區(qū)顯著增加，但在紋狀體其它區(qū)域沒有增加(圖6)。單獨輸注TGFα，在SNcEGF受體雜交與正常沒有變化。
K.TGFα輸注與6-OHDA損傷結(jié)合接受TGFα輸注與黑質(zhì)6-OHDA損傷的動物中的黑質(zhì)TGFαmRNA雜交與僅損傷的動物沒有區(qū)別(圖5)。類似地，EGF受體雜交在TGFα輸注/6-OHDA損傷動物的中腦與僅損傷動物沒有區(qū)別。
除了室管膜下區(qū)雜交增加，前腦EGF受體mRNA雜交在同側(cè)紋狀體體部顯示非正常的致密雜交嵴(圖4，6和7)。在TGFα輸注/損傷聯(lián)合組的6只大鼠中有5只發(fā)現(xiàn)有嵴，但在TGFα輸注/未損傷組6只大鼠中僅有1只有嵴。紋狀體周圍EGF受體雜交沒有變化。
L.討論上述結(jié)果允許能分析黑質(zhì)6-OHDA損傷或紋狀體輸注TGFα，或者二者聯(lián)合對編碼TGFα和EGF受體的mRNA在成年嚙齒動物黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)表達的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果清楚地顯示，表達的變化與每種單獨處理相關(guān)，而且當兩種處理結(jié)合時有獨特的紋狀體表達模式。
1. 6-OHDA損傷的作用在損傷后數(shù)周內(nèi)，6-OHDA損傷中腦降低黑質(zhì)TGFαmRNA雜交達25％。如果在該系統(tǒng)中TGFα肽的水平與TGFαmRNA的表達平行，那么TGFαmRNA的降低可能是嚙齒動物損傷模型有別于原發(fā)性人PD的一個方面TGFα在PD病人紋狀體中大大增加(Mogi等，Neurosci.Lett.180147-150，1994)。已經(jīng)證實TGFα在體外增強大量測量多巴胺神經(jīng)元的功能(Alexi和Hefti，神經(jīng)科學(Neurosci)55903-918，1993)。因而，TGFα(和EGF及其它營養(yǎng)因子)的增加可能反映了對多巴胺神經(jīng)元及其紋狀體傳出纖維的繼續(xù)變性的反應，和可能與中腦的殘留多巴胺細胞代償紋狀體多巴胺能神經(jīng)支配的損失有關(guān)(Mogi等，1994，見上文)。這樣，部分-或者或許慢性-損傷模型可能能夠更好地代表人PD的這一方面。
多巴胺細胞損失時程的不同也有助于解釋6-OHDA嚙齒動物模型和人PD之間的顯然差異。在大鼠模型，單劑量注射神經(jīng)毒殺死中腦多巴胺神經(jīng)元相對較快。而在人PD，中腦多巴胺神經(jīng)元的慢性、進行性變性發(fā)生許多年。本研究中，動物在中腦多巴胺細胞變性后即被殺死。在這些動物中可能已經(jīng)發(fā)生在我們的實驗中不明顯的紋狀體TGFαmRNA表達的早期變化。在大鼠模型損傷后的更短期間，多巴胺神經(jīng)元正在變性過程中時，測定TGFαmRNA表達如何變化將會是令人感興趣的。
TGFαmRNA在尾-豆狀核的中度表達，與它作為中腦多巴胺神經(jīng)元靶-衍生的生長因子的推測作用是一致的。中腦損傷后它在同側(cè)紋狀體降低的原因不明。已證明多巴胺受體結(jié)合影響TGFαmRNA在下丘腦的表達(Borgundvaag等，內(nèi)分泌學(Endocrinol)1303453-3458，1992)，但是在紋狀體已證實沒有這種相互作用。TGFαmRNA在正常成年嚙齒動物紋狀體的神經(jīng)元亞群和神經(jīng)膠質(zhì)中表達(Seroogy等，神經(jīng)化學雜志(J.Neurochem)601777-1782，1993)。紋狀體多巴胺變性對TGFαmRNA在突觸后神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞或者二者的表達具有潛在的影響。
6-OHDA損傷對于對側(cè)紋狀體TGFαmRNA表達沒有明顯改變。這一發(fā)現(xiàn)也與多巴胺變性-介導的TGFαmRNA表達下降一致。僅有少量百分比的中紋狀體(mesostriatral)多巴胺投射是對側(cè)的(Loughlin和Fallon，Neurosci.Lett.3211-16，1982)，因此可以預見，與損傷同側(cè)的作用相比，損傷引起的任何對側(cè)調(diào)節(jié)作用都很小。
DA-去神經(jīng)的紋狀體中的EGF受體mRNA雜交與對側(cè)CP或未損傷對照紋狀體沒有顯著差異。還有，由于中腦損傷或輸注插管的植入，損傷后數(shù)周或植入后2周也許已存在不明顯的表達早期變化。損傷的SNc中EGF受體mRNA雜交消失證實了中腦前腦束6-OHDA損傷后所見到的類似結(jié)果(Seroogy等，神經(jīng)報道(Neuroreport)6105-108，1994)。此前把損傷-誘導的減少引證為黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元表達EGF受體的證據(jù)(Seroogy等，1994，見上文)，但是由于受到周圍黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷或死亡的調(diào)節(jié)從而致使黑質(zhì)產(chǎn)生EGF受體mRNA的可能性是存在的。有趣的是，對PD病人尸體剖檢發(fā)現(xiàn)，其中腦EGF受體結(jié)合與正常人無異(Villares等，腦研究(Brain Res.)62872-76，1993)。所以，損傷后EGF受體mRNA表達消失是嚙齒動物損傷模型與人PD之間的另一差異。由于TGFα在紋狀體表達，部分-損傷模型的大鼠腦可能能夠更好地模擬在帕金森氏病患者觀察到的變化。
2.TGFα輸注的作用在未損傷動物，輸注TGFα或aCSF對中腦或紋狀體TGFαmRNA雜交的正常水平?jīng)]有顯著影響。盡管有在其它組織或細胞類型自動刺激TGFα表達的報道(Coffey等，自然(Nature)328817-820，1987；Barnard等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)26922817-22822，1994)，本研究結(jié)果沒有提供在該系統(tǒng)中具有此活性的證據(jù)。早些研究中的自動刺激作用是在數(shù)個小時的程度上產(chǎn)生。本研究中腦組織是在連續(xù)暴露于生長因子兩周之后取出的。這樣，在后來消退的于一開始輸注時的早期上調(diào)作用便不明顯。
由于TGFα和EGF受體只在損傷動物轉(zhuǎn)錄，在實驗處理一開始后的早期時間點檢測調(diào)節(jié)時程將會是有趣的。TGFα-和aCSF-輸注的紋狀體中，在少數(shù)動物中發(fā)現(xiàn)緊靠輸注疤痕處的TGFαmRNA輕度增加。因而，可能是輸注插管本身而不是輸注造成了繼續(xù)的機械損傷和神經(jīng)膠質(zhì)增生。
TGFα輸注顯著增加同側(cè)室管膜下區(qū)EGF受體雜交，對紋狀體其它區(qū)域沒有影響。在其它組織，EGF受體mRNA可受到數(shù)種化學或機械方式的調(diào)節(jié)。在體外，EGF肽增加大量哺乳動物細胞類型的EGF受體mRNA(Earp等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2614777-4789，1986；Kesavan等，腫瘤基因(Oncogene)5483-488，1990)。在正常嚙齒動物成纖維細胞(Thompaon和Rosner，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2643230-3234，1989)和轉(zhuǎn)移的大鼠肝臟細胞株中(Raymond等，細胞生長分化(Cell.Growth Diff.)1393-399，1990)，視黃酸引起類似的增加。自身或與EGF一起暴露于環(huán)己酰胺刺激培養(yǎng)的人細胞滋養(yǎng)層增加并穩(wěn)定EGF受體轉(zhuǎn)錄，由此提供除增加轉(zhuǎn)錄方式之外的增加EGF受體mRNA總量的機制(Kesavan等，1990，見上文)。
橫切大鼠坐骨神經(jīng)引起切斷末端EGF受體mRNA逐漸增加(Toma等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)122504-2515，1992)。用魚精蛋白處理在體外增加小鼠和人細胞株中125I-EGF結(jié)合和細胞表面受體數(shù)量(Lokeshwar等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)26419318-19326)。TGFα可能模擬這些作用并增加未毀的室管膜下區(qū)細胞EGF受體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生和/或壽命。它也可能刺激并不正常表達相當量的EGF受體mRNA的細胞中的轉(zhuǎn)錄。用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)可以很方便地在體內(nèi)研究這兩種作用。
另一種可能是，TGFα刺激室管膜下區(qū)細胞增生并增加表達EGF受體mRNA的細胞總數(shù)量。EGF和TGFα是由室管膜下區(qū)分離的培養(yǎng)“EGF敏感”細胞的潛在的促細胞分裂劑(Reynolds和Weiss，1992，科學(Science)2551707-1710)。紋狀體TGFα輸注對室管膜下區(qū)EGF受體mRNA雜交的強大的誘導作用可能表明體內(nèi)未損傷大腦的增生細胞類似地與這些細胞反應。
3.TGFα和6-OHDA損傷聯(lián)合紋狀體TGFαmRNA雜交在接受損傷和TGFα聯(lián)合的動物與接受損傷和aCSF聯(lián)合的動物是不同的。盡管TGFα在其它組織具有潛在的自動刺激作用，但在本研究中它對紋狀體TGFαmRNA雜交的減少沒有明顯改變。6-OHDA介導的中腦EGF受體mRNA的消失同樣不受TGFα輸注的影響。在后面這種情況，進行中腦損傷，在開始輸注前數(shù)周將同側(cè)多巴胺細胞神經(jīng)元破壞。這樣，生長因子將沒有機會阻止它們的消除。
有一些證據(jù)表明，多巴胺細胞自身表達EGF受體mRNA(Seroogy等，1994，見上文)，以及如果TGFα與神經(jīng)毒損傷同時施用，則TGFα可以調(diào)節(jié)紋狀體多巴胺能神經(jīng)支配標志物的消失。因而，神經(jīng)毒損傷和給予TGFα之間的時間間歇可以解釋為什么TGFα輸注對中腦EGF受體mRNA消失沒有影響。
在人帕金森氏病腦中，中腦EGF受體結(jié)合與在正常人腦所見無異(Villares等，1993，見上文)。PD紋狀體TGFα(和其它神經(jīng)營養(yǎng)因子)大量增加(Mogi等，1994，見上文)可能通過提高殘留神經(jīng)元表達水平而掩蓋了表達EGF受體的多巴胺細胞數(shù)量的減少。另一方面，體外實驗表明TGFα對中腦多巴胺神經(jīng)元的許多營養(yǎng)作用至少部分是通過黑質(zhì)介導的(Alexi和Hefti，1993，見上文)。因而，TGFα可能通過旁分泌(直接)和順序轉(zhuǎn)運(間接)方式影響多巴胺神經(jīng)元。
TGFα-損傷動物室管膜下區(qū)EGF受體mRNA雜交模式與在TGFα-未損傷動物所見相似。這些動物同側(cè)紋狀體的最顯著特征是紋狀體體部向外伸出的致密雜交嵴，較室管膜下區(qū)增強的雜交更致密。該嵴與任何一種解剖結(jié)構(gòu)均不相對應，而且顯然不是TGFα或TH探針。EGF受體mRNA雜交在非-嵴紋狀體和在所有其它組的紋狀體相似。
6-OHDA損傷的神經(jīng)毒破壞和輸注插管的機械損傷可能刺激神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生和活化。前面的研究已經(jīng)證實神經(jīng)膠質(zhì)增生和星形膠質(zhì)細胞EGF受體表達增加是損傷的結(jié)果(Nieto-Sampedro等，Neurosci.Lett.91276-282，1988；Fernaud-Espinoa等，神經(jīng)膠質(zhì)(Glia)8277-291，1993)。另外，TGFα可能在星形膠質(zhì)細胞活動中起著一定作用(Junier等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)144206-4216，1994)。另一種可能是生長因子輸注和中腦損傷聯(lián)合使室管膜下區(qū)增生細胞離開腦室進入覆在其上面的紋狀體。TGFα是多種細胞類型的潛在的化學吸引劑(Reneker等，發(fā)育(Development)1211669-1680，1995)，但在大多數(shù)動物，它本身還不充足到能夠刺激嵴的形成。中腦損傷可能促進細胞嵴的形成。下面實施例將測定這些細胞的起源和特性。
實施例3紋狀體嵴的特性如上所述，紋狀體輸注TGFα與黑質(zhì)6-OHDA聯(lián)合誘導大量表達EGF受體mRNA的紋狀體體部細胞嵴的形成，但TGFα并不比周圍組織多。嵴由大量厚密的細胞組成，使得它在使用簡單的硫素染色即很清晰地檢測。異常紋狀體嵴的身份尚不明確，但考慮到有三種可能性。
對損傷產(chǎn)生反應的神經(jīng)膠質(zhì)增生是損傷和神經(jīng)毒損害腦組織的一個特征。通常，兩種類型腦損傷促進星形膠質(zhì)細胞增生和星形膠質(zhì)細胞與小神經(jīng)膠質(zhì)細胞對損傷組織的浸潤(Fernaud-Espinoza等，神經(jīng)膠質(zhì)(Glia)8277-291，1993)。已證明星形膠質(zhì)細胞表達EGF受體免疫活性，特別是在對腦損傷反應時(Gomez-Pinilla等，Neurosci.Lett.91276-282，1988)。此外，TGF本身刺激星形膠質(zhì)細胞增生(Alexi和Hefti，神經(jīng)科學(Neurosci.)55903-918，1993)。因此，認為紋狀體嵴可能是對神經(jīng)毒和機械損害和生長因子聯(lián)合反應的膠質(zhì)細胞群。
研究了與嚙齒動物紋狀體的特有解剖結(jié)構(gòu)有關(guān)的嵴的第二種可能來源。嵴與先前已確定的任何解剖結(jié)構(gòu)不相對應。在嚙齒動物，尾狀核和豆狀核解剖學結(jié)構(gòu)不清楚。迄今，沒有鑒定出能把嚙齒動物基底神經(jīng)節(jié)的這兩個核區(qū)別開來的解剖學或神經(jīng)化學標志物。然而，出生前和出生后早期發(fā)育期間，發(fā)育期紋狀體不同區(qū)內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的梯度與在解剖學上核呈不連續(xù)狀態(tài)的動物體內(nèi)尾狀核和豆狀核的特性梯度對應((Bayer，Intl.J.Devel.Neurosci.)2163-175，1984)。在嚙齒動物，新紋狀體神經(jīng)元以外側(cè)-到-中側(cè)梯度加入喙前連合交叉，由此，后產(chǎn)生的神經(jīng)元是那些最接近側(cè)腦室的神經(jīng)元。在發(fā)育尾狀核系統(tǒng)觀察到相同模式，表明嚙齒動物前紋狀體有更象“尾狀核樣”的區(qū)域。尾狀核到前聯(lián)合交叉，神經(jīng)元以中-到-外側(cè)的梯度加入，與在尾狀核豆狀核解剖學不連續(xù)的動物中的發(fā)育期豆狀核相似。這樣，嚙齒動物紋狀體后部可能更象“豆狀核”。認為是這種可能性，即紋狀體嵴可能代表大鼠紋狀體這兩個區(qū)域之間不曾被識別的邊界，它允許細胞密集堆積，可能是由于某些神經(jīng)化學不同的結(jié)果。
對紋狀體嵴來源的第三種可能性也進行了檢測。發(fā)現(xiàn)從成年哺乳動物前腦側(cè)腦室的室管膜下區(qū)分離的細胞能夠增生和分化成新的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，特別是當在含有EGF-家族神經(jīng)營養(yǎng)因子(包括TGFα)進行培養(yǎng)時(Reynolds等，神經(jīng)元(Neuron)131071-1082，1994)。最近，EGF或TGFα輸注側(cè)腦室刺激成年小鼠腦中“EGF-敏感”干細胞和神經(jīng)祖細胞增生(Craig等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。在本研究中，紋狀體嵴來源的可能性是TGFα輸注對大鼠腦具有類似的增生刺激活性。另外，考慮紋狀體嵴是從室管膜下區(qū)衍生的增生神經(jīng)祖細胞大量移行的可能性。
下述實驗使用各種組織化學和免疫組化技術(shù)來鑒定異常紋狀體嵴的特性。通過檢測嵴在紋狀體形成的時程和通過手術(shù)和化學處理聯(lián)合干預，對嵴的起源和其出現(xiàn)的影響因素也進行了研究。
A.實驗方案整個實驗中使用250-300克成年雄性Sprague-Dawley大鼠。24只動物接受標準的大鼠TGFα中紋狀體輸注(0.5μg/天；Sigma Chemical Co.)。另外26只動物或者接受人工腦脊液(aCSF)輸注或者不接受輸注。輸注開始后48小時，標準TGFα輸注組和對照組動物接受6-OHDA黑質(zhì)定向注射。根據(jù)輸注-損傷聯(lián)合情況將此部分研究所用動物按如下分為6組TGFα輸注，損傷(n＝13)；TGFα輸注，未損傷(n＝11)；aCSF輸注，損傷(n＝12)；aCSF輸注，未損傷(n＝12)；未輸注，損傷(n＝1)；未輸注，未損傷(n＝4)。
其它動物接受TGFα輸注到紋狀體的其它區(qū)域、側(cè)腦室、大腦皮質(zhì)或腦干。另有4只動物(每組兩只)在紋狀體中部接受標準劑量的半量或十分之一的TGFα輸注。還有2只動物在紋狀體中部接受表皮生長因子(EGF)輸注以代替TGFα。對這些大鼠的EGF標準給藥劑量是0.5μg/天。這些外加組的所有動物均被損傷。實驗中所有大鼠在損傷后1到16天進行通常的灌注(輸注3-18天)。為測定輸注停止后嵴是否仍存在，在2周末時取出TGFα輸注的4只動物的微泵，但這些動物不進行灌注直到數(shù)天后。制備腦切片并使用各種免疫細胞化學和組織化學技術(shù)進行染色。
B.TGFα輸注用8mg/kg賽拉嗪和100mg/kg氯胺酮麻醉大鼠。使用Alzet滲透微型泵(2002)提供18天的TGFα輸注。微泵中填充約200μl的aCSF用于對照動物，或者填充含20μg TGFα的aCSF 400μl用于實驗動物。在無菌條件下，以前囟為參照，將輸注插管按定向性坐標安置(+1.2A/P；＝2.7M/L；-6.0D/V)(Paxinos和Watson，大鼠腦的定向性坐標(The Rat Brain in StereotaxicCoordinates)，學術(shù)出版社，圣地亞哥，1986)，并用牙用粘固粉固定到顱骨頂部。以大約0.5μl/小時的速度通過小管進行輸注。一些其它對照動物接受側(cè)腦室輸注或者覆蓋皮質(zhì)或其它區(qū)域。
C.神經(jīng)毒損傷微型泵植入后48小時，按上述方法將大鼠麻醉。注射前即時配制4.8mg/ml 6-羥多巴胺鹽酸冷溶液。使用無菌技術(shù)，用耳間為零作參照，將神經(jīng)毒素定向注入同側(cè)黑質(zhì)(+3.7A/P；+2.1M/L；+2.0D/V)。以1μl/分的速率注射6-8μl體積。
D.制備組織損傷后1～16天給動物灌注500ml 4％低聚甲醛的0.1M磷酸緩沖鹽液(PBS；pH 7.4)，動物的腦放入20％蔗糖溶液中。第2天，在-20℃異戊烷中冷凍動物腦。然后在冷凍切片機上切出40微米的冠狀面切片，放入2％低聚甲醛0.1M PBS。連續(xù)切出貫穿紋狀體和黑質(zhì)-VTA的切片。通過腦其它部位的切出代表性切片。
E.尼氏染色將用于尼氏染色的切片機切下的腦切片放在明膠包裹的玻片上，過夜干燥。然后通過乙醇浴進行脫水和再水化作用，在硫素溶液中放置大約4分鐘。通過系列乙醇浴將切片脫水，過量組織洗液洗凈，加蓋玻片。在光學顯微鏡下觀察切片，用Technical Pan Film(Kodak，Inc.)在ISO 100照相(HC-110進行6分鐘)。
F.銀染色使用與Fink-Heimer的方法I相似(Giolli和Karamanlidis，在神經(jīng)解剖學研究技術(shù)(Neuroanatomical Research Techniques)，R.T.Robertson編著，第211-240頁，學術(shù)出版社出版，紐約，1978)的改良的Nauta染色方法，對變性纖維和嵴的細胞進行標記。簡要講，在用新鮮1％氫醌-1％草酸處理之前，將游離-漂浮的切片置入0.05％高錳酸鉀中。用濃度不斷增加的連續(xù)的硝酸鈾酰/硝酸銀溶液處理。再一次漂凈處理后，切片與氨銀反應，接著在乙醇/檸檬酸/低聚甲醛中還原，最后在硫代硫酸鈉中還原。染色后，切片放到玻璃玻片上，在玻片干燥機上干燥15分鐘。接下來用濃度不斷增加的連續(xù)的乙醇洗液脫水，在三種連續(xù)的組織洗液中脫脂，加蓋玻片。
G.免疫組織化學通過同側(cè)腹側(cè)中腦TH-IR的消失測定黑質(zhì)損傷的質(zhì)量和程度?？购谫|(zhì)纖絲酸性蛋白(GFAP)(星形膠質(zhì)細胞的標志物)抗體、抗nestin(神經(jīng)祖細胞的標志物)抗體和抗波形纖維蛋白(放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標志物)抗體，用于嵴的神經(jīng)化學特性研究。在游離-漂浮的切片上進行免疫組化研究。簡要講，0.1M PBS或Tris緩沖鹽液(TBS；3×10分鐘)洗滌腦切片，然后在由0.1MPBS或含250μl Triton TBS3％正常山羊血清組成的封閉溶液中孵育1小時。接著，室溫下在旋轉(zhuǎn)器上與封閉溶液稀釋的下列抗體溶液孵育過夜兔抗-TH抗血清(1∶500；Eigeme Tech Intl.，Inc.)、兔抗-GFAP(1∶6400；DakoCorp.)、小鼠單克隆抗波形纖維蛋白抗體(1∶50；Sigma Chemical Co.)或者小鼠抗-nestin上清液(1∶20；University of Iowa Hybridoma Bank)。
然后洗滌切片并用生物素化的山羊抗-兔抗血清(1∶200；Vector Labs，Inc.)孵育1小時以進行TH或GFAP免疫染色，或用生物素化的馬抗-小鼠抗血清(Vector Labs，Inc.)進行nestin或波形纖維蛋白免疫染色，然后洗滌并在抗生物素蛋白-生物素復合物(ABC Elite kit，Vector Labs，Inc.)中孵育1小時。使用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine)(DAB)過氧化酶技術(shù)顯示初級抗體結(jié)合的定位。徹底洗滌切片，將切片放到明膠-包層的玻片上，過夜干燥。最后，按上面所述的那樣將切片脫水、洗凈和加蓋玻片。
研究中沒有一只動物對于微型泵植入體或損傷手術(shù)表現(xiàn)出不良反應。實驗過程中所有動物繼續(xù)進食和水。如果損傷、輸注或者二者不成功，則將這樣的動物(n＝6)從在起始實驗組中排出并分開進行檢測。損傷成功定義為引起同側(cè)黑質(zhì)TH-IR完全或接近-完全消失。紋狀體輸注成功定義為輸注插管的頭部成功地固定在紋狀體的體部內(nèi)。
對于原位雜交研究，接受6天或更多天紋狀體TGFα輸注的所有動物表現(xiàn)出沿著腦室的輸注同側(cè)大量細胞集聚，用硫素染色可見。與此相比，對側(cè)紋狀體未顯示這種增加，并且與aCSF-輸注的動物沒有差別。損傷動物EGF輸注誘導沿著腦室的細胞擴展，但不誘導紋狀體嵴的形成。低劑量TGFα誘導細胞擴展和嵴的形成，但是，定性地，兩種情況中細胞的數(shù)量均減少。
1.6-OHDA損傷的影響接受aCSF輸注的損傷動物，沒有顯示出沿著同側(cè)腦室的任何細胞擴展或任何紋狀體嵴的證據(jù)。接受TGFα輸注的損傷動物，的確均勻地顯示出沿著腦室的細胞集聚并通常表現(xiàn)外為紋狀體嵴。與未損傷動物相比，黑質(zhì)損傷明顯增加嵴形成的發(fā)生率(表1)。
2.嵴的形態(tài)學和存留狀態(tài)中腦輸注引起特征性S-狀嵴形成，嵴源自背內(nèi)側(cè)尾狀核-豆狀核，反曲(sweeping out)進入紋狀體并在其腹側(cè)末端向中線方向輕度回彎。嵴的最背側(cè)部分與室管膜下區(qū)的集聚細胞相連。通常，嵴的背側(cè)部分硫素染色最厚密，與EGF受體mRNA雜交相似。通常發(fā)現(xiàn)細胞嵴遍及紋狀體喙-尾側(cè)區(qū)域的大部分。TGFα輸注泵移走后3個月，紋狀體中嵴仍很明顯。
3.GFAP免疫組織化學抗膠質(zhì)纖絲酸性蛋白(GFAP)(星形膠質(zhì)細胞的標志物)抗血清，沒能使紋狀體嵴的細胞或沿著腦室的擴展細胞著色。發(fā)現(xiàn)著色的正常GFAP-IR星形膠質(zhì)細胞在嵴的內(nèi)側(cè)和外側(cè)，但幾乎排除嵴本身。
4.銀染色用改良的Nauta方法非特異標記細胞提供有關(guān)腦室細胞擴展和紋狀體嵴細胞的其它信息。一個非常顯著的特征是，大量細胞構(gòu)成室管膜下細胞集聚和嵴(圖8)。細胞厚密地集聚并主要呈梭形(圖8)。在嵴的腹側(cè)部分，伸長的細胞看來是圍繞內(nèi)囊纖維束展開的，這表明細胞通過紋狀體移行。
5.嵴形成的時程嵴的細胞密度使得我們能夠使用簡單的硫素染色追蹤它的形成(圖9)。用于時程實驗的所有動物均接受6-OHDA損傷和中紋狀體TGFα輸注。6天輸注前的時間點中，在室管膜下區(qū)僅有非常小的細胞集聚和沒有顯示紋狀體嵴。輸注6天時，沿著腦室有清晰的細胞擴展。輸注9天時，嵴的腹側(cè)部分開始顯得從腦室位移。輸注12天時，嵴的腹側(cè)部分位于距離腦室壁400μm的部位。輸注16天時，嵴出現(xiàn)在紋狀體中部，它的腹側(cè)部分距腦室達2mm。這樣，嵴起源于腦室區(qū)并且隨著輸注時間增加而逐漸在下面的的紋狀體處放射狀位移。輸注12天和16天時，嵴的外側(cè)限與腦室壁之間距離的差距是大約1.6mm。
6.Nestin免疫組織化學抗神經(jīng)上皮祖細胞標志物nestin的單克隆抗體，使整個嵴的纖維束致密地著色(圖10)。嵴的外側(cè)未見到nestin-IR纖維，但是在嵴的中部偶爾可觀察到著色纖維。纖維主要地與嵴呈直角定向。
7.嵴形態(tài)學變化在損傷動物中腦輸注TGFα，在冠狀切面上均勻地顯示出S-狀紋狀體嵴。在尾狀核-豆狀核其它區(qū)域輸注的大鼠中這種形態(tài)學明顯改變(圖11)。紋狀體中部輸注導致在尾狀核輸注位點附近產(chǎn)生L-狀嵴，“L”形的垂直部分沿著腦室，水平部分從腦室直角延伸進入紋狀體。紋狀體外側(cè)末端輸注刺激與側(cè)腦室壁平行的線狀嵴形成。
8.波形纖維蛋白免疫組織化學抗放射狀膠質(zhì)細胞標志物波形纖維蛋白的抗血清，不能使紋狀體、室管膜下區(qū)或輸注2周的紋狀體嵴的任何細胞染色。然而，該結(jié)果將進一步進行研究，因為對照是在胚胎動物中在不能確保排出假陰性的條件下進行的。
9.嵴位置控制與原位雜交實驗所用大鼠的嵴細胞相比，現(xiàn)在的一系列實驗中的嵴細胞自腦室向更遠處最大地發(fā)生位移(圖12)。這兩組實驗動物之間的差別是輸注時間表和損傷。
用于原位雜交實驗的動物接受損傷，然后在損傷后第2周左右開始進行一系列的行為測試以確定單側(cè)損傷的成功。通常，動物直到損傷后5周才接受輸注。這樣，多巴胺變性過程和紋狀體輸注TGFα是在時間上分開的事件。
現(xiàn)在的一系列實驗中，首先進行輸注；植入輸注泵后48小時進行損傷。在這些動物，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性，引起黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)分別喪失，而且紋狀體施予生長因子是時間上同時發(fā)生的事件。
10.紋狀體之外的其它腦區(qū)域輸注接受紋狀體之外的其它腦區(qū)域輸注的所有動物，接受2周的TGFα輸注和黑質(zhì)6-OHDA損傷。損傷同側(cè)的腦室內(nèi)(ICV)輸注生長因子刺激鄰接腦室壁的細胞集聚，但不誘導任何動物紋狀體嵴的形成。
間隔和紋狀體輸注刺激與側(cè)腦室中層壁結(jié)合的間隔嵴的形成。間隔嵴，與紋狀體嵴一樣，用EGF受體mRNA原位雜交或硫素染色可以很方便地檢測到，但是在密度和細胞數(shù)量方面傾向于不那么粗壯厚密。
背側(cè)皮層輸注，即輸注如此之淺以致于不能通透胼胝體，對于沿著側(cè)腦室的細胞密度沒有可辨別的影響。這些背側(cè)輸注也不誘導嵴的形成?？梢暂p度通透胼胝體的皮質(zhì)輸注，刺激沿著側(cè)腦室的細胞擴展，但不誘導紋狀體嵴的形成。這些動物確實顯示出胼胝體處細胞密集，考慮后者可能是胼胝體嵴。
H.TGFα刺激細胞增生本實驗與上述實驗一起，證明TGFα對于細胞集聚和紋狀體嵴的形成是必要的。與輸注對側(cè)室管膜下區(qū)或正常動物相比，接受紋狀體aCSF輸注的動物，無論是否損傷，沒有一只顯示出任何明顯的室周細胞擴展。很顯然，前腦細胞對TGFα紋狀體輸注敏感，沿著側(cè)腦室增生。
給小鼠ICV輸注EGF或TGFα6天的新近研究表明，腦室周圍細胞被細胞增生標志物-5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)或[3H]胸腺嘧啶核苷免疫標記上的數(shù)量大量增加(Craig等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。95％以上的這些細胞對EGF受體也呈免疫反應陽性。甲酚紫尼斯耳氏染色也顯示這些動物腦室周圍的細胞對施予生長因子有反應。
沿著側(cè)腦室的細胞群擴展的可能性首先考慮是前腦神經(jīng)毒損害、機械損傷和輸注TGFα聯(lián)合刺激膠質(zhì)細胞所致。已知星形膠質(zhì)細胞通過增生和改變其形態(tài)學與功能特性來對腦損傷反應(綜述參見，Norenberg，J.Neuropath.Exper.Neurol.53213-220，1994)。另外，紋狀體星形膠質(zhì)細胞具有EGF受體(Gomez-Pinilla等，1988，見上文；Nieto-Sampedro等，1988，見上文)并且受到TGFα刺激而增生(Alexi和Hefti，1993，見上文)。本研究中，星形膠質(zhì)細胞的標志物-纖性膠質(zhì)細胞酸性蛋白(GFAP)的抗血清，不能證實輸注2周時腦室區(qū)或嵴處的星形膠質(zhì)細胞增加。事實上，大部分GFAP-IR從此區(qū)域被清除掉。例如，在嵴的中部和外側(cè)可以見到正常星形膠質(zhì)細胞著色，而在嵴本身很少觀察到GFAP-IR纖維。這些發(fā)現(xiàn)與ICV輸注EGF或TGFα 6天的實驗結(jié)果一致側(cè)腦室周圍GFAP和其它星形膠質(zhì)細胞標志物-S100β未見顯著增加(Craig等，1996，見上文)。反應的星形膠質(zhì)細胞也表達波形纖維蛋白(Federoff等，神經(jīng)科學研究雜志(J.Neurosci.Res.)1214-27，1984)，但是在任何檢測的切片上未觀察到波形纖維蛋白-IR。也未發(fā)現(xiàn)小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標志物(MAC-1)和少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標志物(MAG，CNP，O4和Rip)有明顯變化(Craig等，1996，見上文)。因此，免疫組織化學證據(jù)表明，TGFα誘導的沿腦室的細胞擴展和在紋狀體嵴不是神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生的結(jié)果。
1.細胞形態(tài)學和定位銀染色和硫素染色清楚地顯示沿腦室的細胞聚集中有大量細胞。室管膜下區(qū)背側(cè)部和嵴處的細胞最致密和最多。細胞主要是梭形的，與發(fā)育期腦中移行神經(jīng)祖細胞相似，它們的長軸與腦室壁成直角(或與背側(cè)紋狀體邊界的室管膜下區(qū)的背側(cè)延伸成直角)。嵴的腦室段細胞銀染色顯得在內(nèi)囊纖維束周圍展開，提示細胞穿越紋狀體移行。
為了測定細胞是否確實移行，進行時程實驗以檢測作為開始輸注生長因子后時間函數(shù)的嵴的發(fā)育和它的位置。
2.紋狀體嵴的細胞移行沿著側(cè)腦室的細胞進行性擴展和接下來這些細胞作為致密嵴進行放射狀移行運動，證實細胞確實作為整體穿越紋狀體移行。這樣，嵴不可能是嚙齒動物紋狀體的推定的“尾狀核-樣”和“豆狀核-樣”區(qū)之間的解剖輪廓。
3.神經(jīng)前體細胞的刺激盡管腦室旁擴展的細胞或紋狀體嵴細胞沒有標記上成熟星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞的免疫標志物，但是單克隆抗體識別的nestin使得嵴和沿著腦室的細胞突起濃密地染色，所述nestin是神經(jīng)上皮前體細胞表達的內(nèi)中間絲極(filament)。反應星形膠質(zhì)細胞也表達nestin-IR，但是在嵴的細胞上GFAP-IR陰性，排除了嵴細胞的最顯著部分是由星形膠質(zhì)細胞形成的可能性。近幾年來，nestin-IR被用于識別和標記體內(nèi)和體外的神經(jīng)前體細胞(Lendahl等，細胞(Cell)60585-595，1990；Craig等，1996，見上文)。紋狀體嵴上強的nestin-IR和缺少膠質(zhì)細胞標志物支持嵴細胞主要是神經(jīng)前體細胞的結(jié)論。
至此，在成年哺乳動物腦中已經(jīng)確定了能夠產(chǎn)生新神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的兩類不同的細胞群(Morshead等，1994，見上文)。一類是相對靜止細胞群，真正的多能神經(jīng)干細胞。另一類，組成型增生的細胞群，被認為是神經(jīng)祖細胞，衍生于干細胞。干細胞群被認為停留在室管膜或室管膜下區(qū)并且在神經(jīng)前體細胞死亡或移行開之后再重新補足神經(jīng)前體細胞。這里使用的術(shù)語“神經(jīng)前體”，是描述在成年哺乳動物腦中能產(chǎn)生神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的未分化的增生細胞，無論這些細胞是神經(jīng)干細胞還是神經(jīng)祖細胞。
先前的研究已經(jīng)顯示許多神經(jīng)祖細胞在它們從室管膜下區(qū)移行之前死亡(Morshead和Van der Kooy，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)12；249-256，1992)。然而，最近發(fā)現(xiàn)許多其它細胞確實存活著并沿著嚴格限定的通路移行到嗅球，在嗅球處細胞分化為嗅球中間神經(jīng)元(Luskin，神經(jīng)元(Neuron)11173-189，1993；Lois和Alvarez-Buylla，科學(Science)2641145-1148，1994)。在稱為“鏈移行”的過程中，細胞沿著側(cè)腦室壁的切線方向移行，其中移行細胞鏈被特異GFAP-IR星形膠質(zhì)細胞包鞘(ensheathed)(Rousseleot等，1994；Lois等，科學(Science)271978-981，1996)。
然后，沿前腦側(cè)腦室的室管膜下區(qū)遠非胚胎期神經(jīng)上皮殘余的休眠狀態(tài)。在正常未處理腦，繼續(xù)產(chǎn)生向喙側(cè)(rostrally)移行的新成神經(jīng)細胞并分化成神經(jīng)元。在EGF-家族神經(jīng)營養(yǎng)因子(包括TGFα)的影響下，體外室管膜下神經(jīng)前體受到刺激產(chǎn)生大量新的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞(Reynolds和Weiss，科學(Science)2551707-1710，1992)。從這些外植體研究可以更清楚地看出，在沿著尾狀核-豆狀核背側(cè)邊界的室管膜下區(qū)的背側(cè)部分神經(jīng)前體細胞濃度最高。
甚至一些更近的證據(jù)表明，體內(nèi)神經(jīng)前體細胞可以在受到刺激后增加它們的數(shù)量并且產(chǎn)生新的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(Craig等，1996，見上文)。發(fā)現(xiàn)ICV輸注EGF 6天后雙重標記上BrdU和成熟神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞的標志物的細胞彌散分布在整個紋狀體、中隔和皮質(zhì)，一直殘存到輸注后7周。然而，在那個研究中沒有發(fā)現(xiàn)室管膜下區(qū)細胞整體移行進入毗鄰的紋狀體(與本發(fā)明方法的結(jié)果明顯不同)，并且細胞數(shù)量也較本發(fā)明在紋狀體嵴處所觀察到的緊密-壓緊的細胞團少許多。另外，在Craig等描述的動物中，沒有一只接受足夠輸注以刺激本發(fā)明觀察到的細胞團移行，以及在該研究中沒有一只動物接受黑質(zhì)6-OHDA損傷，本發(fā)明第一次證實黑質(zhì)6-OHDA損傷明顯增加移行的發(fā)生率。
4.神經(jīng)表型的證據(jù)遺留下來的一個問題是沿著腦室的擴展細胞和移行到紋狀體嵴的細胞是否確實是神經(jīng)祖細胞。表2總結(jié)的數(shù)據(jù)支持這些細胞確實是神經(jīng)祖細胞的結(jié)論。神經(jīng)化學證據(jù)顯示這些細胞不表達成熟神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞或小膠質(zhì)細胞的標志物，然而的確強烈表達未成熟神經(jīng)祖細胞的標志物。它們表達細胞增生的標志物。它們從神經(jīng)祖細胞在成年嚙齒動物腦所位局的側(cè)腦室壁產(chǎn)生，向兩側(cè)擴展并輻射狀移行離開腦室。此外，它們的細胞形態(tài)呈梭狀及它們的突起與腦室和嵴呈直角定向，與胚胎腦中神經(jīng)祖細胞的移行相似并且與它們從室管膜下區(qū)開始移行一致。下表(表2)中總結(jié)的數(shù)據(jù)表明室旁擴展的細胞和紋狀體嵴是發(fā)生自室管膜下神經(jīng)干細胞的神經(jīng)祖細胞。
5.移行機制通過紋狀體多巴胺去神經(jīng)支配和通過定位輸注插管的物質(zhì)可以控制細胞團移行進入紋狀體，但是移行機制尚不清楚。嵴的形狀可以通過簡單改變輸注起始位點而被改變的事實提示有化學吸引作用。已知TGFα是不同細胞類型的可能的化學吸引劑(Ju等，J.Invest.Dermatol.100628-632，1993；Panagakos，Biochem.Mol.Biol.Int.33643-650，1994)。它在產(chǎn)期的尾狀核-豆狀核的豐富表達可能表明它在紋狀體發(fā)育中起著類似的作用。
正常腦的神經(jīng)前體細胞位于側(cè)腦室壁的較薄區(qū)域。輸注進入中-紋狀體更接近該區(qū)域背側(cè)末端的細胞。推測細胞移行進入紋狀體將朝著推定的生長因子濃度較高的釋放TGFα的輸注插管的尖端方向移動。中-紋狀體輸注的動物中嵴呈S-狀的特性，可能是由于靠近輸注插管尖端的室管膜下區(qū)背側(cè)段細胞的受體已經(jīng)飽和的結(jié)果。一旦細胞移動靠近輸注位點，EGF受體已經(jīng)飽和的細胞可能就停止移行。估計靠近室管膜下區(qū)腦室末端的細胞遇到較低的生長因子濃度，在TGFα濃度增加到足以使細胞受體飽和以前不得不朝著輸注點移行更遠的距離。伴有受體飽和的不同移行可以解釋嵴的S-狀特性。
輸注進中部紋狀體產(chǎn)生L-狀嵴，也與神經(jīng)化學梯度/受體飽和作用一致。在這種情況下，背側(cè)室管膜下細胞在它們從室管膜下區(qū)開始移行前可能已經(jīng)使其受體飽和因而停止了移行。只是室管膜下區(qū)最腹側(cè)部分的細胞從腦室移行開。
最外側(cè)輸注可能呈現(xiàn)類似的推定濃度梯度，細胞沿著增生區(qū)域的距離最長。室管膜下細胞自腦室開始移行相似的距離，產(chǎn)生大致線狀的嵴，與化學吸引、神經(jīng)化學梯度作用的想法一致。
然而，來自特性研究的免疫組織化學證據(jù)使人們不相信簡單的化學吸引作用的概念可以完全解釋細胞團的放射狀移行。移行細胞的nestin-IR突起不與推定生長因子濃度最高區(qū)域的輸注插管尖端排成直線，而是與腦室和嵴方向一致。這種定向提示細胞呈直角進入尾狀核-豆狀核--正如移行的神經(jīng)祖細胞從胚胎紋狀體神經(jīng)上皮移行時那樣--并不朝著輸注插管尖端傾斜。
另外兩種發(fā)現(xiàn)與紋狀體嵴移行的簡單化學吸引作用不一致。首先，細胞不是從其產(chǎn)生后開始移行；細胞沿著腦室在1周以上的期間增加數(shù)量，然后作為致密細胞片整體移行。另外，同側(cè)黑質(zhì)損傷大大增加移行發(fā)生率。這兩種觀察結(jié)果提示一套更復雜的因子影響細胞移行。這些資料不能徹底排除化學吸引在嵴移行中的作用，但是它們指出簡單的化學吸引本身不能解釋嵴的移行。
可能與成年紋狀體神經(jīng)祖細胞放射狀移行有關(guān)的另一種機制是，由于神經(jīng)毒損害、輸注插管手術(shù)植入造成的機械損傷或者兩者都有，引起放射狀神經(jīng)膠質(zhì)支撐框架重建。在發(fā)育腦的許多區(qū)域，放射狀神經(jīng)膠質(zhì)引導神經(jīng)祖細胞移行。它們沿著腦室定位，而其突起放射狀伸進下覆的薄壁組織。在出生后早期，一旦成神經(jīng)細胞移行完成，它們便轉(zhuǎn)化成GFAP-IR星形膠質(zhì)細胞并停止表達波形纖維蛋白和nestin。
新生大鼠外板(cortical plate)的冷凍損傷，抑制放射狀神經(jīng)膠質(zhì)轉(zhuǎn)化并引起波形纖維蛋白和nestin在成年腦受損傷區(qū)域持續(xù)表達(Rosen等，發(fā)育腦研究(Dev.Brain Res.)82127-135，1994)。成年大鼠海馬的kainate損傷，誘導放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)學和在海馬室管膜下區(qū)的星形膠質(zhì)細胞表達nestin-IR和波形纖維蛋白-IR，提示腦損傷可以刺激星形膠質(zhì)細胞表型回復到胚胎腦中所發(fā)現(xiàn)的表型(Clarke等，神經(jīng)報道(Neuroreport)51885-1888，1994)。
本發(fā)明免疫組織化學實驗不支持這一現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)輸注第9天時沿著腦室的放射狀-定向的纖維中富含nestin-IR纖維，但在以后的時間點，這些纖維不再沿著腦室停留。由于嵴的細胞移行來自室管膜下區(qū)，所以nestin-IR纖維也是如此。另外，用放射狀膠質(zhì)細胞的特異標志物-波形纖維蛋白免疫染色，無論是在嵴處還是在室管膜下區(qū)均沒有顯示任何標記的纖維。這樣，不大可能是星形膠質(zhì)細胞回復到其胚胎期放射狀膠質(zhì)細胞表型或者是星形膠質(zhì)細胞回復作用在神經(jīng)祖細胞放射狀移行中發(fā)揮了作用。
新近描述的特定地用于成年哺乳動物腦神經(jīng)祖細胞移行的模型闡明這些細胞從前腦室管膜下區(qū)朝著嗅球的切線運動(Lois等，1996，見上文)。喙性移行的成神經(jīng)細胞是致密壓緊并被沿著嚴格限定的移行通路的GFAP-IR星形膠質(zhì)細胞包鞘的。移行細胞主要在特化的膠質(zhì)導向細胞管內(nèi)形成實心的移動細胞流。在我們的實驗中神經(jīng)前體作為薄片穿越紋狀體神經(jīng)纖維網(wǎng)而移行-不是沿著限定的通路--及與GFAP-IR細胞無關(guān)。事實上，增生的室管膜下區(qū)和細胞性嵴基本上排除了GFAP-IR。這樣，鏈移行機制不能解釋本發(fā)明所見的嵴移行。
神經(jīng)祖細胞團移行的另一可能的機理是嵴細胞可能已經(jīng)改變了它們對生長因子、細胞粘附分子或其它對損傷反應的物質(zhì)的表達。在此情況，紋狀體受到刺激以提供其自己的促進放射狀移行的化學吸引劑或分子?；蛘?，它也已經(jīng)可被誘導減量調(diào)節(jié)表達抑制移行的物質(zhì)。
新近檢測紋狀體和室管膜下區(qū)細胞粘附分子的研究提供特別有趣的觀點。高度多唾液酸化的神經(jīng)細胞粘附分子(PSA-N-CAM)免疫活性在發(fā)育期嚙齒動物紋狀體中強烈表達，但是隨著動物成熟而下降(Aaron和Chesselet，神經(jīng)科學(Neurosci.)28701-710，1989；Szele等，神經(jīng)科學(Neurosci.)60133-144，1994)。然而，PSA-N-CAM沿著成年前腦室管膜下區(qū)繼續(xù)表達(Rousselot等，1994；Szele等，1994，見上文)。部分皮質(zhì)剝除術(shù)-誘導的紋狀體傳入神經(jīng)阻滯顯著增加PSA-N-CAM和另一粘附分子-L1在室管膜下區(qū)的表達(Poltorak等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)132217-2229，1993；Szele和Chesselet，J.Comp.Neurol.368439-454，1996)。人腦中PSA-N-CAM在正常紋狀體的表達低，而在亨廷頓病病人的紋狀體，特別是室管膜下區(qū)的表達增加(Nihei和Kowall，Ann.Neurol.3159-63，1992)。
特別有趣的是單側(cè)額的部分皮質(zhì)剝除術(shù)后出現(xiàn)紋狀體纖連蛋白mRNA表達變化(Popa-Wagner等，神經(jīng)報道(Neuroreport)3853-856，1992)。纖連蛋白是在體外已經(jīng)顯示支持神經(jīng)元移行的分子之一(Fishman和Hatten，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)133485-3495，1993)。創(chuàng)傷空穴正下方紋狀體部分的纖連蛋白mRNA雜交在72小時時增加到最高水平。早期增加被認為是短-期傷口愈合過程的成分。接下來是較長-期的纖連蛋白在較大的同側(cè)紋狀體的表達增加，大約于損傷后10天達高峰。繼發(fā)增加被認為是紋狀體對傳入神經(jīng)阻滯的反應。跟隨的另外兩個編碼N-CAM和α微管蛋白的mRNAs表達增加僅僅是出現(xiàn)在傷口愈合早期的受空間條件限制的和暫時的現(xiàn)象。
傳入神經(jīng)阻滯后第10天時紋狀體纖連蛋白mRNA表達高峰很好地對應了本研究中紋狀體去多巴胺神經(jīng)支配后嵴移行的遲延。纖連蛋白mRNA表達高峰的遲延可以幫助解釋為什么本發(fā)明祖細胞一開始不進行放射狀移行而是直到輸注第9天左右才開始，以及為什么當它們最終移行時它們以整體移行。在輸注和損傷相隔數(shù)周進行的動物中，輸注2周時最大側(cè)移行距離明顯減少。該觀察結(jié)果也與紋狀體纖連蛋白表達的短暫高峰一致。在沒有接受黑質(zhì)損傷的少數(shù)幾個有嵴的動物中，下覆皮質(zhì)的機械損傷已經(jīng)刺激足夠的纖連蛋白在紋狀體表達以促進移行。然后，纖連蛋白對同側(cè)紋狀體去多巴胺神經(jīng)支配反應而可能被上調(diào)，反過來，短暫促進來自室管膜下區(qū)的神經(jīng)祖細胞放射狀移行。
影響成年紋狀體中神經(jīng)祖細胞放射狀移行的另一種可能是細胞粘附分子的繼發(fā)作用。N-CAM輸注進接受刺傷的成年大鼠腦的各個不同區(qū)域(包括紋狀體)，抑制星形膠質(zhì)細胞增生(Krushel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA924323-4327，1995)。星形膠質(zhì)細胞釋放抑制軸突分枝的因子并由此抑制神經(jīng)再生反應。因此，紋狀體去神經(jīng)支配及相關(guān)的室管膜下PSA-N-CAM增加可能解除神經(jīng)再生的抑制。
多巴胺-去神經(jīng)支配的紋狀體中移行作用的增強也可能直接與多巴胺能神經(jīng)支配的喪失有關(guān)。在紋狀體胚胎發(fā)育期，未成熟神經(jīng)元起源于腦室區(qū)域并放射狀移行(Bayer，1984，見上文；Bayer和Altman，Prog.Neurobiol.2957-106，1987)。紋狀體神經(jīng)元的發(fā)育性移行發(fā)生在來自中腦的多巴胺傳入纖維的神經(jīng)支配之前。刺激下丘腦神經(jīng)元上的D2多巴胺受體，顯著降低TGFαmRNA表達和腦垂體生長(Rorgundvaag等，內(nèi)分泌(Endocrinology)1303453-3459，1992)。盡管沒有對室管膜下區(qū)多巴胺受體-介導的TGFα表達抑制進行研究，但是與非-損傷動物中移行發(fā)生率的降低一致。因此，隨著前腦多巴胺能神經(jīng)支配的逐漸建立，發(fā)育期多巴胺神經(jīng)支配可能抑制紋狀體細胞的移行。
隨著多巴胺能傳入纖維的建立，在出生后早期紋狀體多巴胺也可能參與紋狀體TGFα的下調(diào)作用。成年紋狀體的去多巴胺神經(jīng)支配可能模擬紋狀體細胞的某些只是在發(fā)育期紋狀體才可見到的局部化學環(huán)境指令，例如，紋狀體神經(jīng)元上表達的多巴胺受體的有效配體減少。紋狀體多巴胺神經(jīng)支配也以相互聯(lián)系的方式而與星型膠質(zhì)細胞細胞外基質(zhì)分子(ECM)的表達有關(guān)(Gates等，神經(jīng)解剖化學雜志(J.Chem.Neuroanat.)6179-189，1993)。有趣的是，PD患者的紋狀體中TGFα選擇性增高(Mogi等，Neurosci.Lett.180147-150，1994)，與胚胎期紋狀體的高表達相似。如果紋狀體TGFα受多巴胺神經(jīng)支配調(diào)節(jié)，那么這種增加可能與紋狀體多巴胺的下降以及隨后的TGFα表達抑制的解除有關(guān)。
無論什么發(fā)生機制，實驗時程證實在成年大鼠腦中室管膜下區(qū)細胞可以被刺激而使細胞數(shù)量增加并作為整體放射狀移行進入相鄰的紋狀體。使用不同位置或劑量進行TGFα輸注的實驗顯示，紋狀體嵴的移動和涉及的細胞總數(shù)量可以得到控制。特性實驗提供了充分證據(jù)表明室管膜下細胞擴展和致密紋狀體嵴是由神經(jīng)祖細胞組成的。下面討論這些發(fā)現(xiàn)的重要性以及它們用于治療人神經(jīng)變性疾病和創(chuàng)傷性腦損傷的潛在用途。
至此，結(jié)合參照具體實施例和實施方案已經(jīng)介紹了本發(fā)明。在參閱本發(fā)明說明書基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以建議其它的實施方案。
盡管為了清楚理解的目的，借助于說明書和實施例詳細描述了本發(fā)明，但是很顯然可以在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)進行一定的變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種治療神經(jīng)缺損患者的方法，所述方法包括(a)將患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)祖細胞同可以與表皮生長因子(EGF)受體結(jié)合的多肽進行接觸，其中多肽的劑量要足以刺激神經(jīng)祖細胞增生，和(b)引導增生祖細胞的子代整體移行到CNS的一個區(qū)域，其中子代細胞在所述區(qū)域駐留并以足以減輕神經(jīng)缺損的方式發(fā)揮作用。
2.權(quán)利要求1所述方法，進一步包括將細胞與刺激增生神經(jīng)祖細胞的子代進行分化的化合物進行接觸。
3.權(quán)利要求1所述方法，其中神經(jīng)缺損由神經(jīng)變性疾病、創(chuàng)傷損傷、神經(jīng)毒損害、局部缺血、發(fā)育疾病、影響視覺的疾病、脊髓損傷或疾病、脫髓鞘疾病、自身免疫病、感染或炎癥性疾病造成。
4.權(quán)利要求3所述方法，其中神經(jīng)變性疾病是阿耳茨海默氏病、亨廷頓氏病或帕金森氏病。
5.權(quán)利要求3所述方法，其中局部缺血與休克有關(guān)。
6.權(quán)利要求1所述方法，其中與表皮生長因子受體結(jié)合的多肽是雙調(diào)蛋白(AR)、β-動物纖維素(BTC)、表皮生長因子(EGF)、epiregulin(ER)、肝素結(jié)合的EGF樣生長因子(HB-EGF)、神經(jīng)鞘瘤衍生的生長因子(SDGF)、粘液瘤病毒生長因子、休普氏纖維瘤病毒生長因子、畸胎瘤-衍生的生長因子-1(TDGF-1)、轉(zhuǎn)移生長因子α(TGFα)或者牛痘生長因子(VGF)。
7.權(quán)利要求1所述方法，其中與表皮生長因子受體結(jié)合的多肽是轉(zhuǎn)化生長因子α。
8.權(quán)利要求1所述方法，其中神經(jīng)祖細胞在體內(nèi)與結(jié)合表皮生長因子受體的多肽進行接觸。
9.權(quán)利要求1所述方法，其中，神經(jīng)祖細胞在培養(yǎng)物中與結(jié)合表皮生長因子受體的多肽進行接觸。
10.權(quán)利要求1所述方法，其中通過將細胞沿著、或者在移行所需通路的末端與增加細胞粘附分子或細胞外基質(zhì)分子表達的化合物進行接觸，從而使移行定向。
11.權(quán)利要求10所述方法，其中化合物是轉(zhuǎn)化生長因子β。
12.權(quán)利要求10所述方法，其中細胞粘附分子是纖連蛋白。
13.權(quán)利要求10所述方法，其中細胞粘附分子是核纖層蛋白。
14.權(quán)利要求10所述方法，其中化合物沿著神經(jīng)前體細胞和其子代細胞定向移行所到的位置之間的通路施用。
15.權(quán)利要求1所述方法，其中移行是通過將細胞沿著移行所需通路與抑制沿該通路自然產(chǎn)生信號的化合物進行接觸而被定向的，其中所述自然產(chǎn)生的信號是抑制移行的信號。
16.權(quán)利要求1所述方法，其中移行是通過機械毀損CNS中的組織而被定向的。
17.權(quán)利要求1所述方法，其中移行是通過神經(jīng)化學阻斷CNS的細胞活性而被定向的。
18.權(quán)利要求2所述方法，其中刺激分化的化合物是視黃酸或腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子。
19.一種治療神經(jīng)缺損患者的方法，所述方法包括(a)將患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)祖細胞同可以與表皮生長因子(EGF)受體結(jié)合的多肽進行接觸，其中多肽的劑量要足以刺激神經(jīng)祖細胞增生，和(b)引導增生祖細胞的子代整體移行到CNS的第二個區(qū)域；(c)將已經(jīng)移行的細胞與刺激分化的化合物進行接觸。
20.權(quán)利要求19所述方法，其中將刺激神經(jīng)干細胞增生的化合物和刺激分化的化合物依次給藥。
21.一種藥物組合物，包括結(jié)合表皮生長因子(EGF)受體的多肽和刺激神經(jīng)祖細胞分化的化合物。
22.權(quán)利要求21所述組合物，其中結(jié)合EGF受體的多肽是轉(zhuǎn)化生長因子α。
23.權(quán)利要求21所述組合物，其中結(jié)合EGF受體的多肽是轉(zhuǎn)化生長因子α，刺激神經(jīng)祖細胞分化的化合物是腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子。
24.權(quán)利要求1所述方法，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是脊髓損傷。
25.權(quán)利要求1所述方法，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是視網(wǎng)膜損傷。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療神經(jīng)缺損患者的方法和組合物。該方法可以這樣進行,例如,將患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)祖細胞與結(jié)合表皮生長因子(EGF)受體的多肽進行接觸(在體內(nèi)或在培養(yǎng)基中),并使增生祖細胞的子代整體定向移行到CNS的一個區(qū)域,其中子代細胞在所述區(qū)域駐留并以足以減輕神經(jīng)缺損的方式發(fā)揮作用。該方法可進一步包括使神經(jīng)祖細胞子代與刺激分化的化合物接觸的步驟。
文檔編號A61P25/28GK1273534SQ98809859
公開日2000年11月15日 申請日期1998年8月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月4日
發(fā)明者詹姆斯·S·里德, 詹姆斯·H·法倫 申請人:加利福尼亞大學董事會