專利名稱：用于調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的氮雜苯并咪唑類化合物的制作方法
背景技術(shù)：
提供下列對發(fā)明背景的說明有助于理解本發(fā)明，但不承認(rèn)其是發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種把調(diào)節(jié)不同細(xì)胞過程的外部刺激傳遞到細(xì)胞內(nèi)部的基本機(jī)理。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵的生物化學(xué)機(jī)理之一涉及蛋白質(zhì)的可逆性磷酸化作用，該作用通過改變成熟蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，能夠調(diào)節(jié)其活性。
真核生物中得到最佳表征的蛋白激酶在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的醇部分上磷酸化蛋白質(zhì)。這些激酶主要分為兩組一組特異性地磷酸化絲氨酸和蘇氨酸，另一組特異性地磷酸化酪氨酸。有些激酶能夠磷酸化酪氨酸以及絲氨酸/蘇氨酸殘基，被稱為“雙特異性”激酶。
蛋白激酶也可以以它們在細(xì)胞內(nèi)的位置為特征。有些激酶是跨膜受體蛋白質(zhì)，能夠結(jié)合細(xì)胞膜外部的配體。與配體結(jié)合，改變了受體蛋白激酶的催化活性。另一些是缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的非受體蛋白質(zhì)。在各種細(xì)胞腔中，從細(xì)胞膜內(nèi)表面到細(xì)胞核，都可以找到非受體蛋白激酶。
很多激酶都涉及調(diào)節(jié)性級聯(lián)，其中它們的底物可以包括活性受其磷酸化作用狀態(tài)調(diào)節(jié)的其他激酶。最終，下游效應(yīng)物的活性受由這樣一種途徑的活化作用所引起的磷酸化作用的調(diào)制。
絲氨酸/蘇氨酸激酶家族包括調(diào)節(jié)信號(hào)發(fā)送級聯(lián)的許多步驟的激酶，信號(hào)發(fā)送級聯(lián)包括控制細(xì)胞生長、遷移、分化、基因表達(dá)、肌肉收縮、糖代謝、細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)的級聯(lián)。
一個(gè)在絲氨酸和蘇氨酸殘基上磷酸化蛋白質(zhì)靶的非受體蛋白激酶的實(shí)例是RAF。RAF調(diào)制其他蛋白激酶的催化活性，其他蛋白激酶例如磷酸化并由此活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的蛋白激酶。RAF本身被膜錨定蛋白質(zhì)RAS所活化，后者的活化又是響應(yīng)于配體活化酪氨酸受體蛋白激酶，例如表皮生長因子受體(EGFR)和血小板衍生生長因子受體(PDGFR)。變形的RAF可導(dǎo)致生物體的癌癥，這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了RAF在控制細(xì)胞活動(dòng)中的生物學(xué)重要性。Monia等《天然藥物》2668，1996提供了RAF在惡性腫瘤中重要性的證據(jù)，其包括圖表在內(nèi)的全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。
在為了發(fā)現(xiàn)針對癌癥和其他疾病的新治療方法所作的努力中，生物醫(yī)學(xué)研究人員和化學(xué)家已對抑制蛋白激酶功能的分子進(jìn)行了設(shè)計(jì)、合成和試驗(yàn)。一些小的有機(jī)分子構(gòu)成了一類調(diào)制蛋白激酶功能的化合物。據(jù)報(bào)道抑制蛋白激酶功能的分子實(shí)例有雙單環(huán)、二環(huán)或雜環(huán)芳基化合物(PCT WO 92/20642)、亞乙烯基-吖吲哚衍生物(PCTWO 94/14808)、1-環(huán)丙基-4-吡啶基喹諾酮(美國專利No.5,330,992)、苯乙烯基化合物(美國專利No.5,217,999)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(美國專利No.5,302,606)、某些喹唑啉衍生物(EP申請No.0 566 266 A1)、硒代吲哚和硒化物(PCT WO94/03427)、三環(huán)多羥基化合物(PCT WO 92/21660)和芐基膦酸化合物(PCT WO 91/15495)。
能夠橫跨細(xì)胞膜并且抗酸解的化合物可能是有利的治療劑，因?yàn)樗鼈冊趯颊呖诜o藥后有較高的生物利用度。不過，很多這些蛋白激酶抑制劑僅僅微弱地抑制蛋白激酶的功能。另外，很多抑制劑抑制了各種蛋白激酶，因此在作為疾病治療劑時(shí)導(dǎo)致多種副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明部分涉及用氮雜苯并咪唑類化合物調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的方法。該方法引入了表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、如RAF的細(xì)胞。另外，本發(fā)明描述了用本發(fā)明鑒定的化合物預(yù)防和治療生物體與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶有關(guān)的異常狀態(tài)的方法。而且，本發(fā)明涉及包含用本發(fā)明方法鑒定的化合物的藥物組合物。
I.篩選調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法本發(fā)明方法提供了調(diào)制受體與胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶二者的功能的手段。這些方法提供了體外與體內(nèi)調(diào)制酶的手段。對體外應(yīng)用來說，本發(fā)明方法部分涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法。
因此在第一方面，本發(fā)明的特征在于用一種氮雜苯并咪唑類化合物調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的方法。該氮雜苯并咪唑化合物可選地被有機(jī)基團(tuán)取代。該方法包括使表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的細(xì)胞與該化合物接觸。
術(shù)語“功能”指的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的細(xì)胞作用。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族包括調(diào)節(jié)信號(hào)發(fā)送級聯(lián)中許多步驟的激酶，信號(hào)發(fā)送級聯(lián)包括控制細(xì)胞生長、遷移、分化、基因表達(dá)、肌肉收縮、糖代謝、細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)的級聯(lián)。
術(shù)語“調(diào)制”指的是化合物改變蛋白激酶功能的能力。調(diào)制劑優(yōu)選地活化蛋白激酶的催化活性，更優(yōu)選地活化或抑制蛋白激酶的催化活性，活化或抑制取決于與蛋白激酶接觸的化合物濃度，或者最優(yōu)選地抑制蛋白激酶的催化活性。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“催化活性”定義了蛋白激酶磷酸化底物的速率。催化活性是能夠測量的，例如測定底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量隨時(shí)間變化的函數(shù)。底物的磷酸化作用發(fā)生在蛋白激酶的活性部位上?；钚圆课辉谡Ｇ闆r下是一種腔，在該腔中底物與蛋白激酶結(jié)合并被磷酸化。
這里所用的術(shù)語“底物”指的是被絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化的分子。底物優(yōu)選是一種肽，更優(yōu)選是一種蛋白質(zhì)。關(guān)于蛋白激酶RAF，優(yōu)選的底物是MEK和MEK底物MAPK。
術(shù)語“活化”指的是提高蛋白激酶的細(xì)胞功能。蛋白激酶的功能優(yōu)選是與天然結(jié)合配偶體的相互作用，最優(yōu)選是催化活性。
術(shù)語“抑制”指的是降低蛋白激酶的細(xì)胞功能。蛋白激酶的功能優(yōu)選是與天然結(jié)合配偶體的相互作用，最優(yōu)選是催化活性。
術(shù)語“調(diào)制”也指的是通過增加或減少在蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間形成復(fù)合體的概率，從而改變蛋白激酶的功能。調(diào)制劑優(yōu)選地增加在蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間形成復(fù)合體的概率，更優(yōu)選地增加或減少在蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間形成復(fù)合體的概率，增加或減少取決于與蛋白激酶接觸的化合物濃度，最優(yōu)選地減少在蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間形成復(fù)合體的概率。
術(shù)語“復(fù)合體”指的是至少兩個(gè)彼此結(jié)合的分子組合。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體通常含有至少兩個(gè)彼此結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。例如，蛋白質(zhì)酪氨酸受體蛋白激酶、GRB2、SOS、RAF和RAS裝配形成響應(yīng)于促分裂配體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體。
術(shù)語“天然結(jié)合配偶體”指的是細(xì)胞中與蛋白激酶結(jié)合的多肽。天然結(jié)合配偶體在蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中能夠起到傳播信號(hào)的作用。蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用的改變本身，能夠表明相互作用的發(fā)生概率的增加或減少，或者能夠表明蛋白激酶/天然結(jié)合配偶體復(fù)合體濃度的增加或減少。
蛋白激酶天然結(jié)合配偶體能夠與蛋白激酶的細(xì)胞內(nèi)區(qū)高親和性地結(jié)合。高親和性表示，平衡結(jié)合常數(shù)為10-6M或以下的數(shù)量級。此外，天然結(jié)合配偶體也能瞬間與蛋白激酶細(xì)胞內(nèi)區(qū)發(fā)生相互作用，從化學(xué)上修飾它。蛋白激酶天然結(jié)合配偶體選自但不限于SRC同源性2(SH2)或3(SH3)結(jié)構(gòu)域、其他磷酰酪氨酸結(jié)合(PTB)域、鳥嘌呤核苷酸交換因子、蛋白磷酸酶和其他蛋白激酶。測定蛋白激酶與其天然結(jié)合配偶體之間相互作用的改變的方法是本領(lǐng)域容易獲得的。
術(shù)語“絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶”指的是這樣一種酶，它的氨基酸序列的至少10％氨基酸等于其他在絲氨酸與蘇氨酸殘基上磷酸化蛋白質(zhì)的酶。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化了磷酸在絲氨酸與蘇氨酸殘基上加成到蛋白質(zhì)上。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶能夠以膜結(jié)合蛋白或胞質(zhì)蛋白形式存在。
這里所用的術(shù)語“接觸”指的是將包含本發(fā)明氮雜苯并咪唑化合物的溶液與浸泡有本方法細(xì)胞的液體介質(zhì)混合。包含該化合物的溶液也可以包含另一種組分，例如二甲基亞砜(DMSO)，它促進(jìn)本方法細(xì)胞對氮雜苯并咪唑化合物的攝取?？梢岳靡环N分液儀器將包含氮雜苯并咪唑化合物的溶液加入到浸泡有細(xì)胞的介質(zhì)中，例如吸移管類裝置或注射器類裝置。
術(shù)語“氮雜苯并咪唑類化合物”指的是被化學(xué)取代基取代的氮雜苯并咪唑有機(jī)化合物。氮雜苯并咪唑化合物的一般結(jié)構(gòu)為
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“取代的”指的是用任意數(shù)量的化學(xué)取代基衍生的氮雜苯并咪唑化合物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的方法，其中該蛋白激酶是RAF。
RAF蛋白激酶在絲氨酸或蘇氨酸殘基上磷酸化蛋白靶。一種靶蛋白是磷酸化并由此活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的蛋白激酶(MEK)。RAF本身是被膜結(jié)合鳥嘌呤三磷酸酯水解酶RAS所活化的，后者響應(yīng)于促分裂原刺激的受體蛋白酪氨酸激酶，例如表皮生長因子受體(EGFR)和血小板衍生生長因子受體(PDGFR)。
本發(fā)明方法能夠檢測調(diào)制細(xì)胞中RAF蛋白激酶功能的化合物。RAF磷酸化一種蛋白激酶(MEK)，后者又磷酸化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。僅用RAF監(jiān)測MEK的磷酸化作用的測定法是不敏感的，因?yàn)镸EK的磷酸化作用水平是不明顯的。為了克服這種敏感性的窘境，MEK和MAPK二者的磷酸化作用都在本發(fā)明的測定法中進(jìn)行跟蹤。MAPK的磷酸化作用信號(hào)放大了MEK的磷酸化作用信號(hào)，使RAF依賴性磷酸化作用在測定法(例如酶聯(lián)免疫吸附測定法)中得以跟蹤。另外，本發(fā)明測定法以高通過量的形式進(jìn)行，因此能夠在短時(shí)間內(nèi)快速監(jiān)測多種化合物。
另一方面，本發(fā)明描述了鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，該方法包括使表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的細(xì)胞與該化合物接觸以及監(jiān)測對細(xì)胞的效應(yīng)的步驟。
術(shù)語“監(jiān)測”指的是觀察向本方法細(xì)胞中加入化合物的效應(yīng)。該效應(yīng)可以表示為細(xì)胞表型、細(xì)胞增殖、蛋白激酶的催化活性或蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用方面的改變。
術(shù)語“效應(yīng)”描述細(xì)胞表型或細(xì)胞增殖的改變或沒有改變。“效應(yīng)”也可描述蛋白激酶的催化活性的改變或沒有改變。“效應(yīng)”也可描述蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用的改變或沒有改變。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中的效應(yīng)是細(xì)胞表型的改變或沒有改變。
術(shù)語“細(xì)胞表型”指的是細(xì)胞或組織的外觀，或者細(xì)胞或組織的功能。細(xì)胞表型的實(shí)例有細(xì)胞尺寸(減小或增大)、細(xì)胞增殖(細(xì)胞數(shù)量的增加或減少)、細(xì)胞分化(細(xì)胞形狀的改變或沒有改變)、細(xì)胞存活、細(xì)胞程序死亡(細(xì)胞死亡)或代謝營養(yǎng)物的利用(例如糖的攝取)。細(xì)胞表型的改變或沒有改變用本領(lǐng)域的已知技術(shù)是容易測量的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中的效應(yīng)是細(xì)胞增殖的改變或沒有改變。
術(shù)語“細(xì)胞增殖”指的是一組細(xì)胞分裂的速率。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)υ谌萜髦猩L的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量，方法是用普通的光學(xué)顯微鏡觀察預(yù)定體積中的細(xì)胞數(shù)?；蛘撸脤?shí)驗(yàn)室儀器定量細(xì)胞增殖的速率，該儀器通過光學(xué)法或電導(dǎo)法測量在適當(dāng)介質(zhì)中的細(xì)胞密度。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中的效應(yīng)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用的改變或沒有改變。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“相互作用”描述在蛋白激酶的細(xì)胞內(nèi)區(qū)與天然結(jié)合配偶體或化合物之間所形成的復(fù)合體。術(shù)語“相互作用”也可以延及在本發(fā)明化合物與所研究蛋白激酶的細(xì)胞內(nèi)區(qū)及細(xì)胞外區(qū)之間所形成的復(fù)合體。盡管胞質(zhì)蛋白激酶不具有細(xì)胞外區(qū)，而受體蛋白激酶細(xì)胞攜帶著細(xì)胞外區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)。
這里所用的術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)區(qū)”指的是存在于細(xì)胞內(nèi)部的蛋白激酶部分。這里所用的術(shù)語“細(xì)胞外區(qū)”指的是存在于細(xì)胞外部的蛋白激酶部分。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，該方法進(jìn)一步包括下列步驟(a)溶解細(xì)胞，使溶胞產(chǎn)物包含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；(b)把絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶吸附到抗體上；(c)用一種或幾種底物培養(yǎng)所吸附的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；和(d)把一種或幾種底物吸附到固體載體或抗體上。監(jiān)測對細(xì)胞的效應(yīng)的步驟包括測量一種或幾種底物的磷酸鹽濃度。
這里所用的術(shù)語“溶解”指的是破壞細(xì)胞完整性、使其內(nèi)容物釋放出來的方法。細(xì)胞溶解是用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)來完成的。該方法優(yōu)選是用超聲處理或細(xì)胞剪切技術(shù)來完成的，更優(yōu)選是用洗滌劑技術(shù)來完成的。
這里所用的術(shù)語“抗體”指的是特異性地與蛋白激酶結(jié)合的蛋白質(zhì)分子?？贵w優(yōu)選地與一類蛋白激酶結(jié)合，更優(yōu)選地，特異性地與RAF蛋白激酶結(jié)合。
這里所用的術(shù)語“特異性地結(jié)合”指的是抗體與一種蛋白激酶結(jié)合的親和性高于與另一種蛋白激酶或細(xì)胞蛋白質(zhì)的親和性。特異性地與一種蛋白激酶結(jié)合的抗體將結(jié)合高濃度的特異性蛋白激酶，其濃度高于任何其他蛋白激酶或細(xì)胞蛋白質(zhì)。
這里所用的術(shù)語“吸附”指的是分子與抗體或固體載體表面的結(jié)合。固體載體的實(shí)例有化學(xué)修飾的纖維素、例如磷酸纖維素，和尼龍。利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，可將抗體與固體載體連接。例如參見Harlo & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，1989，Cold Spring Harbor Laboratories。
這里所用的術(shù)語“測量磷酸鹽的濃度”指的是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)。這些技術(shù)可涉及定量底物中的磷酸鹽濃度或者測定底物中磷酸鹽的相對含量。這些技術(shù)可包括把底物吸附到一種膜上，用放射性測量方法檢測底物中的磷酸鹽含量。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，該方法進(jìn)一步包括下列步驟(a)溶解細(xì)胞，使溶胞產(chǎn)物包含RAF；(b)把RAF吸附到抗體上；(c)用MEK和MAPK培養(yǎng)所吸附的RAF；和(d)把MEK和MAPK吸附到固體載體或一種或幾種抗體上。測量對細(xì)胞的效應(yīng)的步驟包括監(jiān)測所述MEK和MAPK的磷酸鹽濃度。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中該氮雜苯并咪唑類化合物具有如這里所定義的式I、II或III結(jié)構(gòu)或者是這里所述的其任意小類。
術(shù)語“化合物”指的是該化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酰胺、前體藥物、異構(gòu)體或代謝產(chǎn)物。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指的是不會(huì)取消該化合物的生物活性和性質(zhì)的化合物制劑。使本發(fā)明化合物與無機(jī)或有機(jī)酸反應(yīng)，可以得到藥物鹽，酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等。
術(shù)語“前體藥物”指的是在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為母體藥物的藥劑。在某些情況下，前體藥物可能比母體藥物更易于給藥。例如，前體藥物通過口服給藥，可能是生物可利用的，而母體藥物不是，或者前體藥物可以提高溶解度，有利于靜脈內(nèi)給藥。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中該氮雜苯并咪唑類化合物具有如式I、II或III所述結(jié)構(gòu)，其中該氮雜苯并咪唑化合物選自由SABI化合物組成的組。
術(shù)語“SABI化合物”指的是一組具有式A或B所述、下表中第A-1至A-198偏號(hào)結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物
II.預(yù)防或治療異常狀態(tài)的方法另一方面，本發(fā)明的特征在于預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，通過將本發(fā)明化合物對生物體給藥，該化合物是如具有這里所提供的任意約束條件的式I、II或III所確定的。
術(shù)語“生物體”指的是任意活著的實(shí)體，包含至少一個(gè)細(xì)胞。生物體可以簡單如一個(gè)真核細(xì)胞，也可以復(fù)雜如哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物體指的是人或哺乳動(dòng)物。
術(shù)語“預(yù)防”指的是本發(fā)明的減少概率或排除概率的方法，概率指生物體感染或發(fā)展異常狀態(tài)的概率。
術(shù)語“治療”指的是本發(fā)明的具有治療效果和至少在部分程度上減輕或消除生物體異常狀態(tài)的方法。
術(shù)語“治療效果”指的是抑制導(dǎo)致或歸因于異常狀態(tài)的細(xì)胞生長。術(shù)語“治療效果”也指抑制導(dǎo)致或歸因于異常狀態(tài)(例如癌癥)的生長因子。治療效果在一定程度上緩解異常狀態(tài)的一種或幾種癥狀。關(guān)于癌癥的治療，治療效果指的是下列之一或若干(a)腫瘤尺寸的減?。?b)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制(即延緩或停止)；(c)腫瘤生長的抑制；和(d)在一定程度上緩解一種或幾種與異常狀態(tài)有關(guān)的癥狀。證實(shí)對白血病有效的化合物可如本文所述進(jìn)行鑒定，不過這些化合物并不抑制轉(zhuǎn)移，而是延緩或減少細(xì)胞增殖或細(xì)胞生長。
術(shù)語“異常狀態(tài)”指的是生物體細(xì)胞或組織的功能偏離其正常功能。異常狀態(tài)可涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化或細(xì)胞存活。
異常的細(xì)胞增殖狀態(tài)包括癌癥、如纖維變性和腎小球系膜病癥，還包括異常的血管生成和血管發(fā)生、傷口愈合、牛皮癬、糖尿病和炎癥。
異常的分化狀態(tài)包括但不限于神經(jīng)變性疾病、傷口愈合緩慢和組織移植技術(shù)。
異常的細(xì)胞存活狀態(tài)涉及編程性細(xì)胞死亡(細(xì)胞程序死亡)途徑被活化或被取消的情況。一些蛋白激酶與細(xì)胞程序死亡途徑有關(guān)。任何一種蛋白激酶的功能異常都可能導(dǎo)致細(xì)胞的無限增殖化或未成熟細(xì)胞的死亡。
細(xì)胞增殖、分化和存活是用本領(lǐng)域的簡單方法即可測量的現(xiàn)象。這些方法可涉及在顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量或細(xì)胞外觀隨時(shí)間(例如，天)的變化。
術(shù)語“給藥”廣義上涉及對生物體給以化合物，更確切地涉及向生物體細(xì)胞或組織中引入化合物的方法。當(dāng)生物體細(xì)胞或組織存在于生物體內(nèi)或生物體外時(shí)，異常狀態(tài)得以預(yù)防或治療。存在于生物體外的細(xì)胞得以維持或在細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長。對生存在生物體內(nèi)的細(xì)胞來說，本領(lǐng)域有很多用于將化合物給藥的方法，包括(但不限于)口服、胃腸外、皮膚、注射和氣霧劑應(yīng)用。對生物體外的細(xì)胞來說，本領(lǐng)域有很多用于將化合物給藥的方法，包括(但不限于)細(xì)胞微注射技術(shù)、轉(zhuǎn)化技術(shù)和載體技術(shù)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，其中該氮雜苯并咪唑類化合物具有如這里所定義的式I、II或III所示的結(jié)構(gòu)或者是這里所述的其任意小類。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，其中該氮雜苯并咪唑化合物選自由SABI化合物組成的組。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，其中該生物體是一種哺乳動(dòng)物。
術(shù)語“哺乳動(dòng)物”優(yōu)選指的是小鼠、大鼠、兔、豚鼠和山羊等生物，更優(yōu)選為猴和猿，最優(yōu)選為人。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，其中該異常狀態(tài)是癌癥或纖維變性病癥。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，其中癌癥選自由肺癌、卵巢癌、乳腺癌、腦癌、軸內(nèi)腦癌(intra-axial brain cancer)、結(jié)腸癌、前列腺癌、肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組成的組。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，其中該方法應(yīng)用于與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常有關(guān)的異常狀態(tài)，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用為特征。
術(shù)語“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”指的是信號(hào)的傳播。一般來說，細(xì)胞外信號(hào)穿過細(xì)胞膜傳送，成為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。然后該信號(hào)能夠刺激細(xì)胞應(yīng)答。該術(shù)語也涵蓋完全在細(xì)胞內(nèi)傳播的信號(hào)。參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的多肽分子通常是受體與非受體蛋白激酶、受體與非受體蛋白磷酸酶、核苷酸交換因子和轉(zhuǎn)錄因子。
術(shù)語“異?！边B同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程指的是這樣的蛋白激酶，它在生物體中過度表達(dá)或表達(dá)不足，發(fā)生變異使其催化活性低于或高于野生型蛋白激酶活性，發(fā)生變異使其不再能夠與天然結(jié)合配偶體產(chǎn)生相互作用，不再被另一種蛋白激酶或蛋白磷酸酶所修飾或者不再與天然結(jié)合配偶體產(chǎn)生相互作用。
術(shù)語“促進(jìn)或破壞異常的相互作用”指的是能夠通過將本發(fā)明化合物對生物體細(xì)胞或組織給藥而完成的方法。通過在復(fù)合體界面與多個(gè)原子形成有利的相互作用，化合物能夠促進(jìn)蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用?；蛘?，通過危及在復(fù)合體界面原子之間形成的有利相互作用，化合物能夠抑制蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，其中該絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是RAF。
III.本發(fā)明的化合物和藥物組合物另一方面，本發(fā)明的特征在于具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑化合物
其中(a)R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自下組(i)氫；(ii)飽和或不飽和烷基；(iii)NX2X3，其中X2和X3獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(iv)鹵素或三鹵甲基；(v)式-CO-X4的酮，其中X4選自由氫、烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(vi)式-(X5)n-COOH的羧酸或式-(X6)n-COO-X7的酯，其中X5、X6和X7獨(dú)立地選自由烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中n是0或1；(vii)式(X8)n-OH的醇或式-(X8)n-O-X9的烷氧基部分，其中X8和X9獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中該環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯組成的組，其中n是0或1；(viii)式-NHCOX10的酰胺，其中X10選自由烷基、羥基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中該環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯組成的組；(ix)-SO2NX11X12，其中X11和X12選自由氫、烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(x)同素環(huán)或雜環(huán)部分，可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組；(xi)式-CO-H的醛；和(xii)式-SO2-X13的砜，其中X13選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(b)Z1和Z2獨(dú)立地選自由氮、硫、氧、NH和NR4組成的組，其條件是如果Z1和Z2之一是氮、NH或NR4，那么Z1和Z2中的另一個(gè)是氮、硫、氧、NH或NR4；且(c)Z3和X1獨(dú)立地選自由氮、硫和氧組成的組。
術(shù)語“飽和烷基”指的是烷基部分不含有任何烯或炔部分。烷基部分可以是支鏈的或非支鏈的。
術(shù)語“不飽和烷基”指的是烷基部分含有至少一個(gè)烯或炔部分。烷基部分可以是支鏈的或非支鏈的。
術(shù)語“胺”指的是式NR1R2的化學(xué)部分，其中R1和R2獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中該環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組。
術(shù)語“芳基”指的是具有至少一個(gè)環(huán)的芳族基團(tuán)，既包括碳環(huán)芳基(例如苯基)，又包括雜環(huán)芳基(例如吡啶)，該環(huán)具有共軛的π電子系統(tǒng)。術(shù)語“碳環(huán)”指的是含有一個(gè)或多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，并且構(gòu)成環(huán)主干的原子都是碳原子。該術(shù)語因此將碳環(huán)和雜環(huán)區(qū)分開來，后者的環(huán)主干含有至少一個(gè)不是碳的原子。術(shù)語“雜芳基”指的是含有至少一個(gè)雜環(huán)的芳基。
術(shù)語“鹵素”指的是選自氟、氯、溴和碘的原子。
術(shù)語“酮”指的是式-(R)n-CO-R′的化學(xué)部分，其中R和R′選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，n是0或1。
術(shù)語“羧酸”指的是式-(R)n-COOH的化學(xué)部分，其中R選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，n是0或1。
術(shù)語“酯”指的是式-(R)n-COO-R′的化學(xué)部分，其中R和R′選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，n是0或1。
術(shù)語“醇”指的是式-ROH的化學(xué)取代基，其中R選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中該環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組。
術(shù)語“酰胺”指的是式-NHCOR的化學(xué)取代基，其中R選自由氫、烷基、羥基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中該環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基或酯組成的組。
術(shù)語“烷氧基部分”指的是式-OR的化學(xué)取代基，其中R是氫或飽和或不飽和烷基部分。
術(shù)語“醛”指的是式-(R)n-CHO的化學(xué)部分，其中R選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，n是0或1。
術(shù)語“砜”指的是式-SO2-R的化學(xué)部分，其中R選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中Z1和Z2獨(dú)立地選自由氮和NH組成的組。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自下組氫；飽和或不飽和烷基，可選地被同素環(huán)或雜環(huán)部分取代，其中該環(huán)部分可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羥基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組；和同素環(huán)或雜環(huán)部分，可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羥基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組。
在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中R2和R3是氫。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中R1是苯基，可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基或酯部分組成的組。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中R1選自由SABI取代基組成的組。
術(shù)語“SABI取代基”指的是下組取代基苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、2-(三氟甲基)苯基、3-(三氟甲基)苯基、4-(三氟甲基)苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2-羧基苯基、3-羧基苯基和4-羧基苯基。
在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中X1是硫。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中X1是氧。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中Z3是氧。
在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中R4選自由甲基和乙基組成的組。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I、II或III所述結(jié)構(gòu)的氮雜苯并咪唑類化合物，其中該氮雜苯并咪唑化合物選自由SABI化合物組成的組。
另一方面，本發(fā)明的特征在于藥物組合物，該組合物包含如這里所指定的化合物或其鹽和一種生理學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，該組合物包含具有如這里所定義的式I、II或III結(jié)構(gòu)的化合物或者是這里所述的任意小類化合物。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其中該氮雜苯并咪唑化合物選自由SABI化合物組成的組。
術(shù)語“藥物組合物”指的是本發(fā)明的氮雜苯并咪唑化合物與其他化學(xué)組分(例如稀釋劑或載體)的混合物。藥物組合物有利于化合物對生物體的給藥。本領(lǐng)域有多種化合物給藥方法，包括但不限于口服、注射、氣霧劑、胃腸外和局部給藥。也可以使化合物與無機(jī)酸反應(yīng)而得到藥物組合物，無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等。
術(shù)語“生理學(xué)上可接受的”定義了不會(huì)取消化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。
術(shù)語“載體”定義了有利于向細(xì)胞或組織中引入化合物的化合物。例如，二甲基亞砜(DMSO)是一種常用載體，它促進(jìn)生物體細(xì)胞或組織對很多有機(jī)化合物的攝取。
術(shù)語“稀釋劑”定義了稀釋在水中的化合物，它將溶解本發(fā)明化合物以及穩(wěn)定該化合物的生物活性形式。溶解在緩沖溶液中的鹽在本領(lǐng)域中用作稀釋劑。一種常用的緩沖溶液是磷酸鹽緩沖的鹽水，因?yàn)樗M了人血液的鹽條件。由于低濃度的緩沖鹽即可控制溶液的pH，被緩沖的稀釋劑很少改變化合物的生物活性。
IV.本發(fā)明的合成方法另一方面，本發(fā)明涉及用于合成式I、II或III的氮雜苯并咪唑化合物的方法，包括下列步驟(a)使2一氨基-6-氯-3-硝基吡啶與第二反應(yīng)劑在溶劑中反應(yīng)，得到第一中間體，其中該第二反應(yīng)劑是取代的芳基環(huán)；(b)在催化劑和還原劑的存在下，還原第一中間體，得到第二中間體；(c)使第二中間體與第三反應(yīng)劑反應(yīng)；和(d)純化本發(fā)明的化合物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該取代的芳基環(huán)是取代的苯酚、取代的苯硫酚和取代的苯胺。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該取代的苯酚、取代的苯硫酚和取代的苯胺選自由SABI反應(yīng)劑組成的組。
術(shù)語“SABI反應(yīng)劑”指的是下組反應(yīng)劑的鈉鹽苯酚、2-硝基苯酚、3-硝基苯酚、4-硝基苯酚、2-氯苯酚、3-氯苯酚、4-氯苯酚、2-甲酚、3-甲酚、4-甲酚、2-氟苯酚、3-氟苯酚、4-氟苯酚、2-(三氟甲基)苯酚、3-(三氟甲基)苯酚、4-(三氟甲基)苯酚、2-甲氧基苯酚、3-甲氧基苯酚、4-甲氧基苯酚、2-羥基苯甲酸、3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、苯硫酚、2-硝基苯硫酚、3-硝基苯硫酚、4-硝基苯硫酚、2-氯苯硫酚、3-氯苯硫酚、4-氯苯硫酚、2-甲苯硫酚、3-甲苯硫酚、4-甲苯硫酚、2-氟苯硫酚、3-氟苯硫酚、4-氟苯硫酚、2-(三氟甲基)苯硫酚、3-(三氟甲基)苯硫酚、4-(三氟甲基)苯硫酚、2-甲氧基苯硫酚、3-甲氧基苯硫酚、4-甲氧基苯硫酚、2-巰基苯甲酸、3-巰基苯甲酸、4-巰基苯甲酸、苯胺、2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2-氯苯胺、3-氯苯胺、4-氯苯胺、2-甲苯胺、3-甲苯胺、4-甲苯胺、2-氟苯胺、3-氟苯胺、4-氟苯胺、2-(三氟甲基)苯胺、3-(三氟甲基)苯胺、4-(三氟甲基)苯胺、2-茴香胺、3-茴香胺、4-茴香胺、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸和4-氨基苯甲酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該溶劑是正丙醇。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該還原劑是氫。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該催化劑是阮內(nèi)鎳。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該第三反應(yīng)劑是O-甲基異脲。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該第三反應(yīng)劑是S-甲基異硫脲鎓硫酸鹽與氯甲酸烷基酯的反應(yīng)產(chǎn)物。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該氯甲酸烷基酯是氯甲酸甲酯。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明化合物的方法，其中該氯甲酸烷基酯是氯甲酸乙酯。
上述本發(fā)明概述是非限制性的，通過下列對優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求書的說明，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。
優(yōu)選實(shí)施方案的說明本發(fā)明部分涉及用氮雜苯并咪唑類化合物調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的方法。另外，本發(fā)明部分涉及鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法。該方法引入了表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、例如RAF的細(xì)胞。
RAF是一種非受體蛋白激酶，當(dāng)它與活化RAS結(jié)合時(shí)，被募集到細(xì)胞膜，RAS是鳥嘌呤三磷酸酯水解酶。當(dāng)活化受體蛋白酪氨酸激酶、例如EGFR或PDGFR與銜接蛋白GRB2和鳥嘌呤核苷酸交換因子SOS結(jié)合時(shí)，RAS被活化。SOS從RAS除去鳥嘌呤二磷酸酯，代之以鳥嘌呤三磷酸酯，由此活化RAS。然后，RAS結(jié)合RAF，因此活化RAF。然后，RAF可以在絲氨酸和蘇氨酸殘基上磷酸化其他蛋白靶，例如磷酸化并因此活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激酶(MEK)。因此，RAF在促分裂原活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中充當(dāng)中介控制因子。
由于RAF在細(xì)胞中的重要調(diào)節(jié)作用，修飾RAF的氨基酸序列能夠改變其功能，并因此修飾細(xì)胞行為。RAF氨基酸序列的突變與腫瘤和癌癥有關(guān)，這一觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了RAF在細(xì)胞增殖中的作用。因?yàn)橐鸺?xì)胞癌癥的RAF突變會(huì)產(chǎn)生顯示未調(diào)催化活性的RAF分子，所以RAF抑制劑可以減輕或者甚至消除引起這些細(xì)胞癌癥的細(xì)胞增殖。
本發(fā)明方法能夠檢測調(diào)制細(xì)胞中蛋白激酶RAF功能的化合物。RAF磷酸化一種蛋白激酶(MEK)，后者又磷酸化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。僅用RAF監(jiān)測MEK的磷酸化作用的測定法是不敏感的，因?yàn)镸EK的磷酸化作用水平是不明顯的。為了克服這種敏感性的窘境，MEK和MAPK二者的磷酸化作用都在本發(fā)明的測定法中進(jìn)行跟蹤。MAPK的磷酸化作用信號(hào)放大了MEK的磷酸化作用信號(hào)，使RAF依賴性磷酸化作用在酶聯(lián)免疫吸附測定法中得以被跟蹤。另外，本發(fā)明測定法的樣本流量高，因此能夠在短時(shí)間內(nèi)快速監(jiān)測多種化合物。
本發(fā)明方法鑒定了抑制RAF蛋白激酶功能的化合物。這些化合物是氮雜苯并咪唑類衍生物。盡管已經(jīng)試驗(yàn)了氮雜苯并咪唑類衍生物對參與細(xì)菌核苷酸合成的酶的抑制能力，不過很多這些化合物尚未對其蛋白激酶抑制作用進(jìn)行有價(jià)值的研究。
因?yàn)镽AF表現(xiàn)出明顯的與其他絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的氨基酸同源性，本發(fā)明的氮雜苯并咪唑類化合物因此可能抑制除RAF以外的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。因此，本發(fā)明方法也涉及除RAF以外的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括受體與非受體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。
本發(fā)明方法也涉及其他調(diào)制細(xì)胞中RAF功能的化合物，該方法的高產(chǎn)使短時(shí)間試驗(yàn)一大系列分子成為可行。因此，本發(fā)明方法能夠鑒定本發(fā)明中沒有公開的調(diào)制STK功能的現(xiàn)有分子。
I.氮雜苯并咪唑類化合物的生物活性對本發(fā)明的氮雜苯并咪唑類化合物的抑制RAF蛋白激酶功能的能力進(jìn)行了試驗(yàn)。這里報(bào)告了對這些抑制作用研究的生物測定和結(jié)果。用于測量氮雜苯并咪唑類化合物對蛋白激酶功能的調(diào)制作用的方法類似于Tang等人的于1996年8月23日提交的美國申請08/702,232號(hào)中描述的那些，發(fā)明名稱為“二氫吲哚酮(Indolinone)組合文庫和用于疾病治療的相關(guān)產(chǎn)物與方法”(Lyon & Lyon DocketNo.221/187)，涉及該方法的高產(chǎn)方面。包括所有附圖
在內(nèi)的08/702,232申請全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。
II.用氮雜苯并咪唑類化合物治療的靶疾病這里所述的方法、化合物和藥物組合物被設(shè)計(jì)為通過調(diào)制RAF蛋白激酶功能來抑制細(xì)胞增殖病癥。增殖病癥導(dǎo)致多細(xì)胞生物中一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞子集發(fā)生不希望有的細(xì)胞增殖，這對生物體有害。這里所述的方法、化合物和藥物組合物也可以用于治療和預(yù)防生物體的其他病癥，例如與早熟細(xì)胞死亡有關(guān)的病癥(即神經(jīng)病學(xué)上的疾病)或炎癥。這些疾病可以是RAF分子功能不適宜的結(jié)果，或者是RAF相關(guān)蛋白激酶分子功能不適宜的結(jié)果。
RAF蛋白激酶或與RAF有關(guān)的蛋白激酶的功能改變在某些疾病中能導(dǎo)致明顯的細(xì)胞增殖狀態(tài)增強(qiáng)或減弱。異常的細(xì)胞增殖狀態(tài)包括癌癥、纖維變性病癥、腎小球系膜病癥、異常的血管生成和血管發(fā)生、傷口愈合、牛皮癬、再狹窄和炎癥。
纖維變性病癥涉及細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的異常形成。纖維變性病癥的一個(gè)實(shí)例是肝硬化。肝硬化的特征在于細(xì)胞外基質(zhì)組分的濃度增加，導(dǎo)致肝臟瘢痕的形成。肝硬化可導(dǎo)致肝臟硬化等疾病。
腎小球系膜細(xì)胞增殖性病癥的發(fā)生原因是腎小球系膜細(xì)胞的異常增殖。腎小球系膜增殖性病癥包括多種人腎疾病，例如腎小球性腎炎、糖尿病性腎病、惡性腎硬化、血栓性微血管病綜合征、移植排斥和腎小球病。
優(yōu)選可以用本發(fā)明方法和化合物治療的癌癥類型是肺癌、卵巢癌、乳腺癌、腦癌、軸內(nèi)腦癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。這里所提供的證據(jù)表明，本發(fā)明化合物和方法能夠有效地用來阻止和逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的增殖，供參考。
血管生成和血管發(fā)生病癥是由血管的過度增殖引起的。血管增殖在各種正常的生理過程中都是必要的，例如胚胎發(fā)育、黃體形成、傷口愈合和器官再生。不過，血管增殖也是癌腫發(fā)育所必需的。其他血管增殖性病癥的實(shí)例包括關(guān)節(jié)炎，其中新生毛細(xì)血管侵入關(guān)節(jié)并破壞軟骨。另外，血管增殖性病癥還包括眼疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病，其中視網(wǎng)膜中的新生毛細(xì)血管侵入玻璃體，導(dǎo)致出血和失明。相反，與血管皺縮、收縮或閉合有關(guān)的病癥、例如再狹窄，也涉及蛋白激酶的不利調(diào)節(jié)功能。
而且，血管生成和血管發(fā)生與惡性固體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)。迅速生長的癌腫需要富含養(yǎng)分和氧的血液供應(yīng)以繼續(xù)生長。其結(jié)果是，異常大量的毛細(xì)血管經(jīng)常與腫瘤同步生長，充當(dāng)腫瘤的補(bǔ)給線。除了向腫瘤供應(yīng)養(yǎng)分以外，嵌入腫瘤的新生血管還為腫瘤細(xì)胞提供了進(jìn)入生物體循環(huán)和轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端部位的通路。Folkman，1990，《國立癌癥研究所雜志》(J.Natl.Cancer Inst.)824-6。
不適宜的RAF活性可刺激產(chǎn)生細(xì)胞增殖性病癥。特別設(shè)計(jì)成調(diào)制RAF蛋白激酶功能的分子已顯示可抑制細(xì)胞增殖。具體來說，將反義核酸分子設(shè)計(jì)成既與編碼RAF蛋白激酶的信使RNA結(jié)合又阻滯該信使的翻譯，它們體外可有效逆轉(zhuǎn)A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Monia等1996《天然藥物》(Nature Medicine)2688，包括所有圖表在內(nèi)的全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。A549細(xì)胞是人惡性細(xì)胞。
這些以RAF為目標(biāo)的反義研究所提供的證據(jù)表明，調(diào)制RAF蛋白激酶功能的本發(fā)明氮雜苯并咪唑分子能夠阻止、同樣可能逆轉(zhuǎn)生物體中惡性細(xì)胞的增殖。這些氮雜苯并咪唑化合物可以用本文實(shí)施例所提供的體外方法進(jìn)行試驗(yàn)。而且，也用本文實(shí)施例所提供的異種移植方法，還可以試驗(yàn)氮雜苯并咪唑化合物體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。
不適宜的RAF活性刺激特定類型細(xì)胞產(chǎn)生不希望有的細(xì)胞增殖的方式至少有兩種(1)直接刺激特定細(xì)胞的生長；或(2)增加特定區(qū)域、例如腫瘤組織的血管形成，從而促進(jìn)組織的生長。
首先鑒定細(xì)胞增殖性病癥是否由RAF驅(qū)動(dòng)，這有助于本發(fā)明的使用。一旦鑒定為這樣的病癥，即可利用本領(lǐng)域普通醫(yī)師或獸醫(yī)熟知的程序分析他們的癥狀，確診患有該病癥的患者。然后可以用這里所述的方法對患者進(jìn)行治療。
要確定細(xì)胞增殖性病癥是否由RAF驅(qū)動(dòng)，首先測定患者體內(nèi)細(xì)胞或特定位置的RAF活性水平。例如在癌細(xì)胞的情況下，可以比較非RAF驅(qū)動(dòng)的癌癥與RAF驅(qū)動(dòng)的癌癥之間的一種或幾種RAF活性水平。如果癌細(xì)胞的RAF活性水平高于RAF驅(qū)動(dòng)的癌癥，優(yōu)選為等于或大于RAF驅(qū)動(dòng)的癌癥，那么它們是利用本發(fā)明所述的調(diào)制RAF的方法和化合物進(jìn)行治療的候選對象。
在細(xì)胞增殖性病癥是由非癌細(xì)胞的不希望有的增殖引起的情況下，將其RAF活性水平與普通群體比較(例如，不包括患有細(xì)胞增殖性病癥的人或動(dòng)物的普通人或動(dòng)物群體的平均水平)。如果不希望有的細(xì)胞增殖病癥的特征在于其RAF水平高于普通群體，那么該病癥是利用本發(fā)明所述的調(diào)制RAF的方法和化合物進(jìn)行治療的候選對象。
III.氮雜苯并咪唑類化合物的藥物組合物和給藥制備該化合物的藥物組合物的方法、測定對患者給藥的化合物量的方法和化合物對生物體給藥的方式公開在Tang等人的于1996年8月23日提交的美國申請08/702,232號(hào)，發(fā)明名稱為“二氫吲哚酮組合文庫和用于疾病治療的相關(guān)產(chǎn)物與方法”(Lyon & Lyon DocketNo.221/187)，和Buzzetti等人的于1996年8月1日公開的國際專利申請WO 96/22976號(hào)，發(fā)明名稱為“作為酪氨酸激酶抑制劑的水溶性3-亞芳基-2-氧化吲哚衍生物”，包括所有附圖在內(nèi)的二者全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到，這些說明適用于本發(fā)明，并且能夠容易地適應(yīng)本發(fā)明。
實(shí)施例下列實(shí)施例是非限制性的，僅是本發(fā)明不同方面和特征的代表。實(shí)施例描述了合成本發(fā)明化合物的方法和測量化合物對RAF蛋白激酶功能的效應(yīng)的方法。
這些方法中所用的細(xì)胞是商業(yè)上可得到的。由細(xì)胞所攜帶的核酸載體也是商業(yè)上可得到的，不同蛋白激酶的基因序列是易于在序列數(shù)據(jù)庫中查到的。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員利用容易獲得的技術(shù)，通過結(jié)合商業(yè)上可得到的細(xì)胞、商業(yè)上可得到的核酸載體和蛋白激酶基因，能夠容易地適時(shí)再創(chuàng)造細(xì)胞系。
實(shí)施例1合成本發(fā)明的氮雜苯并咪唑化合物的操作現(xiàn)在將以下列非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行闡述，其中，除非另有說明(i)蒸發(fā)是在真空下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法進(jìn)行的；(ii)操作是在惰性氣體氣氛下進(jìn)行的，例如氮；(iii)高效液相色譜法(HPLC)是在Merck LiChrosorb RP-18反相二氧化硅上進(jìn)行的，得自E.Merck，Darmstadt，Germany；(iv)產(chǎn)率僅供舉例說明之用，不必是可達(dá)到的最大值；
(v)熔點(diǎn)是未校正的，用HWS Mainz SG 2000數(shù)字熔點(diǎn)儀測定；(vi)所有本發(fā)明式I、II和III化合物的結(jié)構(gòu)是用質(zhì)子磁共振譜、元素微量分析和某些情況下的質(zhì)譜確定的，質(zhì)子磁共振譜使用Bruker AMX500-NMR分光光度計(jì)；(vii)結(jié)構(gòu)的純度用薄層色譜法(TLC)或HPLC測定，TLC使用硅膠(Merck Silica Gel 60 F254)；和(vii)中間體一般沒有進(jìn)行完整的特征鑒定，其純度用薄層色譜法(TLC)或HPLC測定。
合成操作化合物A-902-甲氧羰基氨基-6-(苯巰基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶2-氨基-3-硝基-6-(苯巰基)吡啶的制備方法是將2-氨基-6-氯-3-硝基吡啶(84.0g，0.484mol)和苯硫酚鈉(Fluka)(72.0g，0.545mol)在2-丙醇(1500ml)中加熱回流2小時(shí)。冷卻至室溫后，混懸液用水(100ml)稀釋，真空過濾收集固體，用水和2-丙醇洗滌，在50℃真空下干燥，得到109.1g(95％產(chǎn)率)2-氨基-3-硝基-6-(苯巰基)吡啶，熔點(diǎn)148-152℃。
2，3-二氨基-6-(苯巰基)吡啶的制備方法是在70℃1200ml 2-丙醇中，在30g阮內(nèi)鎳的存在下，在5atm H2下氫化2-氨基-3-硝基-6-(苯巰基)吡啶(107.1g，0.433mol)。4小時(shí)(29.1L氫)后，把反應(yīng)混合物冷卻至4℃，繼續(xù)攪拌。真空過濾收集沉淀，用2-丙醇洗滌，在50℃真空下干燥。合并了的濾液在減壓下濃縮，用2-丙醇重結(jié)晶。用1000ml THF洗滌氫化設(shè)備兩次，在減壓下蒸發(fā)，用2-丙醇重結(jié)晶后，收集沉淀，在50℃真空下干燥，得到80.4g(87.1％產(chǎn)率)2，3-二氨基-6-(苯巰基)吡啶，熔點(diǎn)119-122℃。
2-甲氧羰基氨基-6-苯巰基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的制備方法是向S-甲基異硫脲鎓硫酸鹽(53g，0.19mol)(Aldrich)在68ml水中的冷溶液(5-15℃)中滴加氯甲酸甲酯(34ml，0.44mol)，同時(shí)保持溫度低于20℃。然后，小心地加入氫氧化鈉水溶液(116g，25％NaOH)，有白色沉淀生成。20分鐘后，加入水(210ml)，用乙酸(冰乙酸，34ml)調(diào)pH為4.0。向該混合物中滴加2，3-二氨基-6-(苯巰基)吡啶(37.8g，0.174mol)在210ml乙醇中的溶液，加熱至85-90℃保持2小時(shí)。冷卻反應(yīng)混合物過夜后，過濾分離沉淀，用溫水(1000ml)洗滌，干燥，在4℃下用乙酸和乙醇重結(jié)晶。過濾收集沉淀，用甲醇洗滌，在50℃真空下干燥，得到30g(57.4％產(chǎn)率)2-甲氧羰基氨基-6-苯巰基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔點(diǎn)269-274℃(分解)。
化合物A-32-甲氧羰基氨基-(6-苯氧基-3H-咪些并[4，5-b]吡啶用苯酚鈉代替實(shí)施例A-90中的苯硫酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到2-甲氧羰基氨基-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔點(diǎn)＞280℃(分解)。
化合物A-42-乙氧羰基氨基-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶用氯甲酸乙酯代替實(shí)施例A-3中的氯甲酸甲酯，進(jìn)行相同的過程，得到2-乙氧羰基氨基-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔點(diǎn)＞280℃(分解)。
化合物A-12-氧代-6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶使O-甲基異脲直接與2，3-二氨基-6-(苯巰基)吡啶反應(yīng)，代替實(shí)施例A-3中S-甲基異硫脲鎓硫酸鹽與氯甲酸甲酯的反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行相同的過程，得到2-氧代-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔點(diǎn)277-278℃。
化合物A-22-氧代-6-苯巰基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶用苯硫酚鈉代替實(shí)施例A-1中的苯酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到2-氧代-(6-苯巰基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔點(diǎn)253-254℃。
化合物A-5至A-25用適當(dāng)?shù)谋椒欲}代替實(shí)施例A-1中的苯酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-23、A-24和A-25來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后一步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-52-氧代-6-(2-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-62-氧代-6-(3-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-72-氧代-6-(4-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-82-氧代-6-(2-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-92-氧代-6-(3-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-10 2-氧代-6-(4-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-11 2-氧代-6-(2-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-12 2-氧代-6-(3-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-13 2-氧代-6-(4-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-14 2-氧代-6-(2-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-15 2-氧代-6-(3-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-16 2-氧代-6-(4-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-17 2-氧代-6-[2-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-18 2-氧代-6-[3-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-19 2-氧代-6-[4-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-20 2-氧代-6-(2-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-21 2-氧代-6-(3-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-22 2-氧代-6-(4-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-23 2-氧代-6-(2-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-24 2-氧代-6-(3-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-25 2-氧代-6-(4-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶化合物A-26至A-46用適當(dāng)?shù)谋搅蚍欲}代替實(shí)施例A-2中的苯硫酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-44、A-45和A-46來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后-步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-26 2-氧代-6-(2-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-27 2-氧代-6-(3-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-28 2-氧代-6-(4-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-29 2-氧代-6-(2-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-30 2-氧代-6-(3-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-31 2-氧代-6-(4-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-32 2-氧代-6-(2-甲基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-33 2-氧代-6-(3-甲基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-34 2-氧代-6-(4-甲基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-35 2-氧代-6-(2-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-36 2-氧代-6-(3-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-37 2-氧代-6-(4-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-38 2-氧代-6-[2-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-39 2-氧代-6-[3-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-40 2-氧代-6-[4-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-41 2-氧代-6-(2-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-42 2-氧代-6-(3-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-43 2-氧代-6-(4-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-44 2-氧代-6-(2-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-45 2-氧代-6-(3-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-46 2-氧代-6-(4-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶化合物A-47至A-68用適當(dāng)?shù)谋桨符}代替實(shí)施例A-1中的苯酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-66、A-67和A-68來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后一步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-47 2-氧代-6-苯氨基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-48 2-氧代-6-(2-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-49 2-氧代-6-(3-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-50 2-氧代-6-(4-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-51 2-氧代-6-(2-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-52 2-氧代-6-(3-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-53 2-氧代-6-(4-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-54 2-氧代-6-(2-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-55 2-氧代-6-(3-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-56 2-氧代-6-(4-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-57 2-氧代-6-(2-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-58 2-氧代-6-(3-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-59 2-氧代-6-(4-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-60 2-氧代-6-[2-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-61 2-氧代-6-[3-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-62 2-氧代-6-[4-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-63 2-氧代-6-(2-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-64 2-氧代-6-(3-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-65 2-氧代-6-(4-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-66 2-氧代-6-(2-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-67 2-氧代-6-(3-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-68 2-氧代-6-(4-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶化合物A-69至A-89用適當(dāng)?shù)谋椒欲}代替實(shí)施例A-3中的苯酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-87、A-88和A-89來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后一步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-69 2-甲氧羰基氨基-6-(2-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-70 2-甲氧羰基氨基-6-(3-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-71 2-甲氧羰基氨基-6-(4-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-72 2-甲氧羰基氨基-6-(2-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-73 2-甲氧羰基氨基-6-(3-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-74 2-甲氧羰基氨基-6-(4-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-75 2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-76 2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-77 2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-78 2-甲氧羰基氨基-6-(2-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-79 2-甲氧羰基氨基-6-(3-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-80 2-甲氧羰基氨基-6-(4-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-81 2-甲氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-82 2-甲氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-83 2-甲氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-84 2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-85 2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-86 2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-87 2-甲氧羰基氨基-6-(2-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-88 2-甲氧羰基氨基-6-(3-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-89 2-甲氧羰基氨基-6-(4-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶化合物A-91至A-111用適當(dāng)?shù)谋搅蚍欲}代替實(shí)施例A-90中的苯硫酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-109、A-110和A-111來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后一步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-91 2-甲氧羰基氨基-6-(2-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-92 2-甲氧羰基氨基-6-(3-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-93 2-甲氧羰基氨基-6-(4-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-94 2-甲氧羰基氨基-6-(2-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-95 2-甲氧羰基氨基-6-(3-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-96 2-甲氧羰基氨基-6-(4-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-97 2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-98 2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-99 2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-100 2-甲氧羰基氨基-6-(2-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-101 2-甲氧羰基氨基-6-(3-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-102 2-甲氧羰基氨基-6-(4-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-103 2-甲氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-104 2-甲氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-105 2-甲氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-106 2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-107 2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-108 2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-109 2-甲氧羰基氨基-6-(2-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-110 2-甲氧羰基氨基-6-(3-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-111 2-甲氧羰基氨基-6-(4-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶化合物A-112至A-133用適當(dāng)?shù)谋桨符}代替實(shí)施例A-3中的苯酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-131、A-132和A-133來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后一步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-112 2-甲氧羰基氨基-6-苯氨基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-113 2-甲氧羰基氨基-6-(2-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-114 2-甲氧羰基氨基-6-(3-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-115 2-甲氧羰基氨基-6-(4-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-116 2-甲氧羰基氨基-6-(2-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-117 2-甲氧羰基氨基-6-(3-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-118 2-甲氧羰基氨基-6-(4-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-119 2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-120 2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-121 2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-122 2-甲氧羰基氨基-6-(2-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-123 2-甲氧羰基氨基-6-(3-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-124 2-甲氧羰基氨基-6-(4-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-125 2-甲氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-126 2-甲氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-127 2-甲氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-128 2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-129 2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-130 2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-131 2-甲氧羰基氨基-6-(2-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-132 2-甲氧羰基氨基-6-(3-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-133 2-甲氧羰基氨基-6-(4-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶化合物A-134至A-154用適當(dāng)?shù)谋椒欲}代替實(shí)施例A-4中的苯酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-152、A-153和A-154來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基酯或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后一步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-134 2-乙氧羰基氨基-6-(2-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-135 2-乙氧羰基氨基-6-(3-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-136 2-乙氧羰基氨基-6-(4-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-137 2-乙氧羰基氨基-6-(2-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-138 2-乙氧羰基氨基-6-(3-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-139 2-乙氧羰基氨基-6-(4-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-140 2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-141 2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-142 2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-143 2-乙氧羰基氨基-6-(2-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-144 2-乙氧羰基氨基-6-(3-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-145 2-乙氧羰基氨基-6-(4-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-146 2-乙氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-147 2-乙氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-148 2-乙氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-149 2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-150 2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-151 2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-152 2-乙氧羰基氨基-6-(2-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-153 2-乙氧羰基氨基-6-(3-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-154 2-乙氧羰基氨基-6-(4-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶化合物A-155至A-176用適當(dāng)?shù)谋搅蚍欲}代替實(shí)施例A-4中的苯酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-174、A-175和A-176來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后-步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-155 2-乙氧羰基氨基-6-苯巰基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-156 2-乙氧羰基氨基-6-(2-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-157 2-乙氧羰基氨基-6-(3-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-158 2-乙氧羰基氨基-6-(4-硝基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-159 2-乙氧羰基氨基-6-(2-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-160 2-乙氧羰基氨基-6-(3-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-161 2-乙氧羰基氨基-6-(4-氯苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-162 2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-163 2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-164 2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氧基(4-methylphMenoxy))-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-165 2-乙氧羰基氨基-6-(2-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-166 2-乙氧羰基氨基-6-(3-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-167 2-乙氧羰基氨基-6-(4-氟苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-168 2-乙氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-169 2-乙氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-170 2-乙氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯巰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-171 2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-172 2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-173 2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-174 2-乙氧羰基氨基-6-(2-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-175 2-乙氧羰基氨基-6-(3-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-176 2-乙氧羰基氨基-6-(4-羧基苯巰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶化合物A-177至A-198用適當(dāng)?shù)谋桨符}代替實(shí)施例A-4中的苯酚鈉，進(jìn)行相同的過程，得到下列實(shí)施例。對實(shí)施例A-196、A-197和A-198來說，羧基被甲基、乙基、芐基、叔丁基或其他適當(dāng)?shù)孽ケＷo(hù)起來，然后在最后一步中去保護(hù)，得到相應(yīng)化合物。
A-177 2-乙氧羰基氨基-6-苯氨基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-178 2-乙氧羰基氨基-6-(2-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-179 2-乙氧羰基氨基-6-(3-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-180 2-乙氧羰基氨基-6-(4-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-181 2-乙氧羰基氨基-6-(2-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-182 2-乙氧羰基氨基-6-(3-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-183 2-乙氧羰基氨基-6-(4-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-184 2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-185 2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-186 2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氧基(4-methylphMenoxy))-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-187 2-乙氧羰基氨基-6-(2-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-188 2-乙氧羰基氨基-6-(3-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-189 2-乙氧羰基氨基-6-(4-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-190 2-乙氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-191 2-乙氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-192 2-乙氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-193 2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-194 2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-195 2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-196 2-乙氧羰基氨基-6-(2-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-197 2-乙氧羰基氨基-6-(3-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶A-198 2-乙氧羰基氨基-6-(4-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶實(shí)施例2測定RAF磷酸化功能的測定法下列測定法報(bào)告了RAF催化的其靶蛋白MEK以及MEK的靶蛋白MAPK的磷酸化作用的量。RAF的基因序列描述在Bonner等1985《分子細(xì)胞生物學(xué)》51400-1407中，在多基因序列數(shù)據(jù)庫中是易于查到的。用在本發(fā)明這部分中的核酸載體和細(xì)胞系的構(gòu)建完整地描述在Morrison等1988《美國國家科學(xué)院院報(bào)》858855-8859中。
材料和試劑1. Sf9(草地貪夜蛾)細(xì)胞；GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD；2. RIPA緩沖液20mM Tris/HCl pH7.4，137mM NaCl，10％甘油，1mM PMSF，5mg/L Aprotenin，0.5％ Triton X-100；3.硫氧還蛋白-MEK融合蛋白(T-MEK)按照廠商提供的操作，用親和色譜法進(jìn)行T-MEK的表達(dá)和純化。目錄#K 350-01和R350-40，Invitrogen Corp.，San Diego，CA；4.His-MAPK(ERK 2)用編碼His-MAPK的pUC18載體轉(zhuǎn)化XL1Blue細(xì)胞，在該細(xì)胞中表達(dá)His-標(biāo)記的MAPK。His-MAPK用Ni-親和色譜法純化。目錄#27-4949-01，Pharmacia，Alameda，CA，如本文所述；5.綿羊抗小鼠IgGJackson實(shí)驗(yàn)室，West Grove，PA，目錄#515-006-008，Lot# 28563；6. RAF-1蛋白激酶特異性抗體來自UBI的URP2653；7.包被緩沖液PBS；磷酸鹽緩沖鹽水，GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD；8.洗滌緩沖液TBST-50mM Tris/HCl pH7.2，150mM NaCl，0.1％Triton X-100；9.封閉緩沖液TBST，0.1％乙醇胺pH7.4；10. DMSO，Sigma，St.Louis，MO；11.激酶緩沖液(KB)20mM Hepes/HCl pH7.2，150mM NaCl，0.1％Triton X-100，1mM PMSF，5mg/L Aprotenin，75mM原釩酸鈉，0.5MMDTT和10mM MgCl2；12. ATP混合物100mM MgCl2，300mM ATP，10mCi g-33P ATP(Dupon t-NEN)/mL；13.終止緩沖液1％磷酸，F(xiàn)isher，Pittsburgh，PA；14. Wallac磷酸纖維素濾墊Wallac，Turku，F(xiàn)innland；15.濾器洗滌溶液1％磷酸，F(xiàn)isher，Pittsburgh，PA；16. Tomtec平板收獲器Wallac，Turku，F(xiàn)innland；17. Wallacβ平板讀數(shù)器#1205，Wallac，Turku，F(xiàn)innland；18.化合物用NUNC 96孔V底聚丙烯平板，應(yīng)用科學(xué)目錄#AS-72092。
操作除非特別說明，下列步驟均在室溫下進(jìn)行。
1.ELISA平板包被在4℃下，ELISA孔用100mL綿羊抗小鼠親和性純化的抗血清(1mg/100mL包被緩沖液)包被過夜。ELISA平板在4℃下貯藏時(shí)可使用兩周。
2.倒置平板，除去液體。加入100mL封閉溶液，培養(yǎng)30分鐘。
3.除去封閉溶液，用洗滌緩沖液洗滌四次。在紙巾上輕拍平板，以除去過量液體。
4.向每孔中加入1mg RAF-1的特異性抗體，培養(yǎng)1小時(shí)。如步驟3所述洗滌。
5.融化感染有Sf9細(xì)胞的RAS/RAF溶胞產(chǎn)物，用TBST稀釋至10mg/100mL。向每孔中加入10mg稀釋了的溶胞產(chǎn)物，培養(yǎng)1小時(shí)。在培養(yǎng)過程中搖動(dòng)平板。陰性對照不加入溶胞產(chǎn)物。用重組桿狀病毒感染細(xì)胞，每種病毒的MOI為5，48小時(shí)后收獲，制得感染有Sf9昆蟲細(xì)胞的RAS/RAF溶胞產(chǎn)物。細(xì)胞用PBS洗滌一次，在RIPA緩沖液中溶解。離心(10000xg，5分鐘)除去不溶性物質(zhì)。將溶胞產(chǎn)物等份在干冰/乙醇中冷凍，在-80℃下貯藏備用。
6.除去沒有被結(jié)合的物質(zhì)，如上(步驟3)所述進(jìn)行洗滌。
7.在每孔中加入2mg T-MEK和2mg His-MAEPK，用激酶緩沖液調(diào)節(jié)體積至40mL。本文實(shí)施例提供了從細(xì)胞提取物中純化T-MEK和MAPK的方法。
8.用TBST加1％DMSO預(yù)稀釋化合物(儲(chǔ)備溶液10mg/mL DMSO)或提取物20倍。向步驟6中所述的孔中加入5mL預(yù)稀釋的化合物/提取物。培養(yǎng)20分鐘。對照不加入藥物。
9.加入5mL ATP混合物開始激酶反應(yīng)。在培養(yǎng)過程中，在ELISA平板搖動(dòng)器上搖動(dòng)平板。
10. 60分鐘后，向每孔中加入30mL終止溶液以終止激酶反應(yīng)。
11.在Tomtec平板收獲器中放置磷酸纖維素墊和ELISA平板。按照廠商的建議，收獲并用濾器洗滌溶液洗滌濾器。干燥濾墊。密封濾墊，放入容器中。把容器插入放射性檢測儀器中，對濾墊上的放射性磷進(jìn)行定量。
或者，從測定平板各孔取40mL等份，轉(zhuǎn)移至磷酸纖維素濾墊上的相應(yīng)位置。風(fēng)干濾器后，把濾器放入托盤中。小心地?fù)u動(dòng)托盤1小時(shí)，每15分鐘更換洗滌溶液。風(fēng)干濾墊。密封濾墊，放入適用于測量樣本放射性磷的容器中。把容器插入檢測裝置中，對濾墊上的放射性磷進(jìn)行定量。
按照用于下列氮雜苯并咪唑類化合物的方案，測量RAF-1 ELISA測定法中的IC50值
IC50值是將磷酸化靶蛋白的最大量或細(xì)胞生長減少50％所需的氮雜苯并咪唑類抑制劑的濃度。RAF-1磷酸化作用測定法中測量的IC50值描繪在表1中表1
>實(shí)施例3MAPK和MEK的純化MAPK和MEK蛋白質(zhì)是易于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的，方法是將編碼這些蛋白質(zhì)的基因亞克隆到商業(yè)上可得到的表達(dá)帶聚組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)的載體中。編碼這些蛋白質(zhì)的基因是易于從實(shí)驗(yàn)室得到的，通常是對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行操作或者從含有cDNA文庫的細(xì)胞中克隆這些基因。文庫是商業(yè)上易于得到的，本領(lǐng)域技術(shù)人員從MEK和MAPK的核酸序列，能夠容易地設(shè)計(jì)與編碼MEK或MAPK的cDNA分子同源的核酸探針，該核酸序列可從多基因數(shù)據(jù)庫如Genbank得到。利用目前本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的技術(shù)，能夠在短時(shí)間內(nèi)完成基因的克隆。
利用下列方案能夠完成MEK和MAPK蛋白質(zhì)從細(xì)胞提取物中的純化，該方案修改自Robbins等1993《生物學(xué)與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2685097-5106
1.用本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的超聲處理、滲透壓或弗氏壓碎器技術(shù)溶解細(xì)胞。下文提供了適當(dāng)?shù)某暰彌_液。
2.將與鎳或鈷共軛的固體載體與下文公開的平衡緩沖液進(jìn)行平衡。聚組氨酸標(biāo)記特異性地與固體載體上的鎳和鈷原子結(jié)合。用十倍于固體載體體積的平衡緩沖液洗滌樹脂三次，達(dá)到平衡。固體載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于得到的。
3.向固體載體中加入溶胞產(chǎn)物，在容器中平衡一段時(shí)間。或者，可將固體載體裝填在蛋白質(zhì)色譜柱中，可以使溶胞產(chǎn)物流經(jīng)固體載體。
4.用下文公開的洗滌緩沖液洗滌固體載體。
5.用一定量的洗脫緩沖液(下文提供)從固體載體中洗脫MEK或MAPK蛋白質(zhì)，該緩沖液可以從固體載體中除去大部分蛋白質(zhì)。
超聲緩沖液50mM磷酸鈉pH8.00.3M氯化鈉10mM β-巰基乙醇1％NP4010mM NaF0.5mM Pefablock平衡緩沖液50mM磷酸鈉pH8.00.3M氯化鈉10mM β-巰基乙醇1％NP4010mM NaF1mM Imidazol
洗滌緩沖液50mM磷酸鈉pH8.00.3M氯化鈉10mM β-巰基乙醇1％NP4010mM NaF10mM Imidazol洗脫緩沖液50mM磷酸鈉pH8.00.3M氯化鈉10mM β-巰基乙醇1％NP4010mM NaF10-500mM Imidazol實(shí)施例4測定EGF受體磷酸化功能的測定法全細(xì)胞中EGF受體激酶活性(EGFR-NIH3T3測定)的測定方法詳細(xì)描述在Tang等人的于1996年6月5日提交的PCT公報(bào)WO 9640116中，發(fā)明名稱為“用于疾病治療的二氫吲哚酮化合物”，包括所有附圖在內(nèi)的全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。
EGF受體磷酸化作用測定法中測定的IC50值描繪在表2中表2
實(shí)施例5測定氮雜苯并咪唑類化合物對表達(dá)Ras的細(xì)胞生長的效應(yīng)的測定法下列測定法測定了表達(dá)RAS的NIH-3T3細(xì)胞的生長速率。該測定法的目的是測定化合物對過量表達(dá)H-Ras的NIH3T3細(xì)胞生長的效應(yīng)。
材料96孔平底無菌板96孔圓底無菌板無菌25mL或100mL液槽移液管，多管自動(dòng)移液器無菌移液管吸頭無菌15mL和50mL試管試劑0.4％SRB的1％乙酸溶液10mM Tris堿10％TCA1％乙酸無菌DMSO(Sigma)化合物的DMSO溶液(100mM或以下的儲(chǔ)備溶液)胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL)細(xì)胞系3T3/H-Ras(NIH 3T3克隆7種表達(dá)致癌H-Ras的基因組片段的細(xì)胞)可以使用下列方案構(gòu)建細(xì)胞1.將編碼Ras的基因片段亞克隆到商業(yè)上可得到的載體中，后者將穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞。該片段來自cHa-ras的基因組轉(zhuǎn)化等位基因。
2.利用磷酸鈣法，用亞克隆的載體轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞。選擇在DMEM中的2％血清中表達(dá)Ras構(gòu)建體的細(xì)胞。2周后觀察到可見的焦點(diǎn)。收集轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞系。
生長培養(yǎng)基2％小牛血清/DMEM+2mM谷氨酰胺，Pen/Strep方案第0天細(xì)胞平板接種這部分測定在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
1.細(xì)胞受胰蛋白酶作用。將200mL細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至10mLisotone中。用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞。
2.將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中稀釋至60,000個(gè)細(xì)胞/mL。向96孔平底板的每孔中轉(zhuǎn)移100mL細(xì)胞，得到6000個(gè)細(xì)胞/孔。
3.每種化合物使用平板的一半(4行)，每種化合物濃度用四個(gè)孔，培養(yǎng)基對照也用一組4個(gè)孔。
4.小心地?fù)u動(dòng)平板，使細(xì)胞均勻地附著。
5.平板在37℃、10％CO2恒溫箱中培養(yǎng)。
第1天化合物的加入這部分測定在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
1.在96孔圓底平板中，向第1到11欄中加入120mL生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有最高屏蔽濃度(screening concentration)的化合物中的2X最終％DMSO。例如，如果最高濃度是100mL，這是從100mM儲(chǔ)備溶液中得到的，那么1X DMSO是0.1％，因此2X DMSO是0.2％。該平板用于滴定化合物，每種化合物4行。
2.在無菌15mL試管中，制備最高屏蔽濃度的化合物在生長培養(yǎng)基加2X DMSO中的2X溶液。每種細(xì)胞系需要1mL?；衔锏钠鹗紳舛韧ǔＪ?00mM，不過該濃度可因化合物的溶解度而異。
3.將240mL的2X起始化合物溶液轉(zhuǎn)移到96孔圓底平板第12欄的四個(gè)孔中。從第12欄向第11欄、從第1 1欄向第10欄，依次類推直到第2欄，從右向左轉(zhuǎn)移12mL，進(jìn)行12連續(xù)稀釋。將100mL化合物稀釋液和100mL第1欄中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到96孔平底平板相應(yīng)孔中的100mL細(xì)胞培養(yǎng)基上。每孔的總體積應(yīng)當(dāng)是200mL。
4.把平板放回恒溫箱，恒溫3天。
第4天測定的開展這部分測定在臺(tái)子上進(jìn)行。
1.抽去或倒掉培養(yǎng)基。向每孔中加入200mL冷10％TCA，以固定細(xì)胞。平板在4℃下培養(yǎng)至少60分鐘。
2.棄去TCA，用自來水沖洗孔5次。將平板倒置在紙巾上干燥。
3.用100mL/孔的0.4％SRB染色細(xì)胞10分鐘。
4.倒掉SRB，用1％乙酸沖洗孔5次。將平板倒置在紙巾上充分干燥。
5.在搖動(dòng)器上，用100mL/孔的10mM Tris堿溶解染料5-10分鐘。
6.在570nm下的Dynatech ELISA平板讀數(shù)器上讀數(shù)，參照波長為630nm。
選擇抑制過度表達(dá)RAS的細(xì)胞的生長速率的化合物，如表3所述。
表3
實(shí)施例6測定氮雜苯并咪唑類化合物對A549細(xì)胞生長的效應(yīng)的測定法下列測定法測定A549細(xì)胞的生長速率。本測定的目的在于測定化合物對A549人肺癌細(xì)胞生長的效應(yīng)。A549細(xì)胞是易于從商業(yè)來源獲得的，例如ATCC(CCL185)。
材料96孔平底無菌板96孔圓底無菌板無菌25mL或100mL液槽移液管，多管自動(dòng)移液器無菌移液管吸頭無菌15mL和50mL試管試劑0.4％SRB的1％乙酸溶液10mM Tris堿10％TCA1％乙酸無菌DMSO(Sigma)化合物的DMSO溶液(100mM或以下的儲(chǔ)備溶液)胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL)細(xì)胞系和生長培養(yǎng)基A549人肺癌細(xì)胞(ATCC CCL185)Ham’s F12-K中的10％胎牛血清方案第0天細(xì)胞平板接種這部分測定在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
1.細(xì)胞受胰蛋白酶作用。將200μL細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至10mLisotone中。用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞。
2.將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中稀釋至20,000個(gè)細(xì)胞/mL。向96孔平底板的每孔中轉(zhuǎn)移100μL細(xì)胞，得到2000個(gè)細(xì)胞/孔。
3.每種化合物使用平板的一半(4行)，每種化合物濃度用四個(gè)孔，培養(yǎng)基對照也用一組4個(gè)孔。
4.小心地?fù)u動(dòng)平板，使細(xì)胞均勻地附著。
5.平板在37℃、10％CO2恒溫箱中培養(yǎng)。
第1天化合物的加入這部分測定在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
1.在96孔圓底平板中，向第1到11欄中加入120μL生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有最高屏蔽濃度的化合物中的2X最終％DMSO。例如，如果最高屏蔽濃度是100μM，這是從100mM儲(chǔ)備溶液中得到的，那么1X DMSO是0.1％，因此2X DMSO是0.2％。該平板用于滴定化合物，每種化合物4行。
2.在無菌15mL試管中，制備最高屏蔽濃度的化合物在生長培養(yǎng)基加2X DMSO中的2X溶液。每種細(xì)胞系需要1mL?；衔锏钠鹗紳舛韧ǔＪ?00μM，不過該濃度可因化合物的溶解度而異。
3.將240μL的2X起始化合物溶液轉(zhuǎn)移到96孔圓底平板第12欄的四個(gè)孔中。從第12欄向第11欄、從第11欄向第10欄，依次類推直到第2欄，從右向左轉(zhuǎn)移120μL，進(jìn)行1∶2連續(xù)稀釋。將100μL化合物稀釋液和100μL第1欄中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到96孔平底平板相應(yīng)孔中的100μL細(xì)胞培養(yǎng)基上。每孔的總體積應(yīng)當(dāng)是200μL。
4.把平板放回恒溫箱，恒溫3天。
第5天測定的開展這部分測定在臺(tái)子上進(jìn)行。
1.抽去或倒掉培養(yǎng)基。向每孔中加入200μL冷10％TCA，以固定細(xì)胞。平板在4℃下培養(yǎng)至少60分鐘。
2.棄去TCA，用自來水沖洗孔5次。將平板倒置在紙巾上干燥。
3.用100μL/孔的0.4％SRB染色細(xì)胞10分鐘。
4.倒掉SRB，用1％乙酸沖洗孔5次。將平板倒置在紙巾上充分干燥。
5.在搖動(dòng)器上，用100μL/孔的10mM Tris堿溶解染料5-10分鐘。
6.在570nm下的Dynatech ELISA平板讀數(shù)器上讀數(shù)，參照波長為630nm。
選擇抑制A549細(xì)胞的生長速率的化合物，如表4所述。
表
中，發(fā)明名稱為“用于疾病治療的二氫吲哚酮化合物”，包括所有附圖在內(nèi)的全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。
在缺少這里沒有明確公開的內(nèi)容或限制的情況下也可以實(shí)施這里所闡述的本發(fā)明。所用的術(shù)語和表達(dá)方式用作說明書的術(shù)語而非限制，在使用這些術(shù)語和表達(dá)方式時(shí)，不排除所有所顯示和所述的等價(jià)特征或其部分，相反，應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，各種變體也是可能在本發(fā)明請求保護(hù)的范圍內(nèi)的。因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，盡管通過優(yōu)選的實(shí)施方案和可選的特征已經(jīng)具體公開了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以采取這里所公開的構(gòu)思變體和差異，而且這些變體和差異被認(rèn)為是在由所附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍之內(nèi)的。
易于為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的是，本發(fā)明充分適合于實(shí)施并達(dá)到上述及其固有的目的和優(yōu)點(diǎn)。這里所述的分子復(fù)合體和方法、操作、處理、分子、特定化合物是優(yōu)選實(shí)施方案的代表，是示范性的，不是對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到變體和其他用途，它們在由權(quán)利要求書范圍所定義的本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，在不背離本發(fā)明范圍和精神的前提下，可以對這里所公開的本發(fā)明作出不同的替換和修飾。
說明書中提到的全部專利和申請是對本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員水平的說明。這里引用全部專利和申請作為參考文獻(xiàn)，就象各自的公報(bào)明確和分別地引用作為參考文獻(xiàn)。
在缺少這里沒有明確公開的內(nèi)容或限制的情況下也可以適當(dāng)?shù)貙?shí)施這里所闡述的本發(fā)明。因此，例如，術(shù)語“包含”、“主要由……組成”和“由……組成”在所有情況下任何一個(gè)都可以和另外兩個(gè)替換使用。所用的術(shù)語和表達(dá)方式用作說明書的術(shù)語而非限制，在使用這些術(shù)語和表達(dá)方式時(shí)，不排除所有所顯示和所述的等價(jià)特征或其部分，相反，應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，各種變體也是可能在本發(fā)明請求保護(hù)的范圍內(nèi)的。因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，盡管通過優(yōu)選的實(shí)施方案和可選的特征已經(jīng)具體公開了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以采取這里所公開的構(gòu)思變體和差異，而且這些變體和差異被認(rèn)為是在由所附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍之內(nèi)的。
另外，本發(fā)明的各特征或方面是以馬庫什類術(shù)語描述的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)，本發(fā)明也可以用馬庫什類的任意個(gè)別成分或小類成分來描述。例如，如果X被描述為選自由溴、氯和碘組成的組，那么關(guān)于X是溴的權(quán)利要求和關(guān)于X是溴和氯的權(quán)利要求也被充分描述了。
前面沒有引用的參考文獻(xiàn)、包括專利和非專利文獻(xiàn)，在所有場合下都特意引用在此作為參考文獻(xiàn)。其他實(shí)施方案體現(xiàn)在下列權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.用氮雜苯并咪唑類化合物調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的方法，包括使表達(dá)所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的細(xì)胞與所述化合物接觸的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是RAF。
3.鑒定調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，包括下列步驟(a)使表達(dá)所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的細(xì)胞與所述化合物接觸；和(b)監(jiān)測對所述細(xì)胞的效應(yīng)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的效應(yīng)是細(xì)胞表型的改變或沒有改變。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述的效應(yīng)是細(xì)胞增殖的改變或沒有改變。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述的效應(yīng)是所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的催化活性的改變或沒有改變。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述的效應(yīng)是所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用的改變或沒有改變，如本文所述。
8.權(quán)利要求3的方法，包括下列步驟(a)溶解所述細(xì)胞，使溶胞產(chǎn)物包含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；(b)把所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶吸附到抗體上；(c)用一種或幾種底物培養(yǎng)所述被吸附的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；和(d)把所述一種或幾種底物吸附到固體載體或抗體上；其中所述監(jiān)測對所述細(xì)胞的所述效應(yīng)的步驟包括測量所述一種或幾種底物的磷酸鹽濃度。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是RAF，該方法包括下列步驟(a)溶解所述細(xì)胞，使溶胞產(chǎn)物包含RAF；(b)把所述RAF吸附到抗體上；(c)用MEK和MAPK培養(yǎng)所吸附的RAF；和(d)把所述MEK和MAPK吸附到固體載體或一種或幾種抗體上；其中所述測量對所述細(xì)胞的所述效應(yīng)的步驟包括監(jiān)測所述MEK和MAPK的磷酸鹽濃度。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的氮雜苯并咪唑類化合物具有式I、II或III所示的結(jié)構(gòu)
其中(a)R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自下組(i)氫；(ii)飽和或不飽和烷基；(iii)NX2X3，其中X2和X3獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(iv)鹵素或三鹵甲基；(v)式-CO-X4的酮，其中X4選自由氫、烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(vi)式-(X5)n-COOH的羧酸或式-(X6)n-COO-X7的酯，其中X5、X6和X7獨(dú)立地選自由烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中n是0或1；(vii)式(X8)n-OH的醇或式-(X8)n-O-X9的烷氧基部分，其中X8和X9獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中所述的環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯組成的組，其中n是0或1；(viii)式-NHCOX10的酰胺，其中X10選自由烷基、羥基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中所述的環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯組成的組；(ix)-SO2NX11X12，其中X11和X12選自由氫、烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(x)同素環(huán)或雜環(huán)部分，可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組；(xi)式-CO-H的醛；和(xii)式-SO2-X13的砜，其中X13選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(b)Z1和Z2獨(dú)立地選自由氮、硫、氧、NH和NR4組成的組，其條件是如果Z1和Z2之一是氮、NH或NR4，那么Z1和Z2中的另一個(gè)是氮、硫、氧、NH或NR4；且(c)Z3和X1獨(dú)立地選自由氮、硫和氧組成的組。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的氮雜苯并咪唑化合物選自由SABI化合物組成的組，如本文所定義。
12.預(yù)防或治療生物體異常狀態(tài)的方法，包括將式I、II或III的氮雜苯并咪唑類化合物對所述生物體給藥的步驟
其中(a)R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自下組(i)氫；(ii)飽和或不飽和烷基；(iii)NX2X3，其中X2和X3獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(iv)鹵素或三鹵甲基；(v)式-CO-X4的酮，其中X4選自由氫、烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(vi)式-(X5)n-COOH的羧酸或式-(X6)n-COO-X7的酯，其中X5、X6和X7獨(dú)立地選自由烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中n是0或1；(vii)式(X8)n-OH的醇或式-(X8)n-O-X9的烷氧基部分，其中X8和X9獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中所述的環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯組成的組，其中n是0或1；(viii)式-NHCOX10的酰胺，其中X10選自由烷基、羥基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中所述的環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯組成的組；(ix)-SO2NX11X12，其中X11和X12選自由氫、烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(x)同素環(huán)或雜環(huán)部分，可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組；(xi)式-CO-H的醛；和(xii)式-SO2-X13的砜，其中X13選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(b)Z1和Z2獨(dú)立地選自由氮、硫、氧、NH和NR4組成的組，其條件是如果Z1和Z2之一是氮、NH或NR4，那么Z1和Z2中的另一個(gè)是氮、硫、氧、NH或NR4；且(c)Z3和X1獨(dú)立地選自由氮、硫和氧組成的組。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的生物體是哺乳動(dòng)物。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述的異常狀態(tài)是癌癥或纖維變性病癥。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的異常狀態(tài)是一種癌癥，選自由肺癌、卵巢癌、乳腺癌、腦癌、軸內(nèi)腦癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組成的組。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述的異常狀態(tài)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常有關(guān)，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的特征在于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體之間的相互作用。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是RAF。
18.氮雜苯并咪唑化合物，具有式I、II或III所示的結(jié)構(gòu)
其中(a)R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自下組(i)氫；(ii)飽和或不飽和烷基；(iii)NX2X3，其中X2和X3獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(iv)鹵素或三鹵甲基；(v)式-CO-X4的酮，其中X4選自由氫、烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(vi)式-(X5)n-COOH的羧酸或式-(X6)n-COO-X7的酯，其中X5、X6和X7獨(dú)立地選自由烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中n是0或1；(vii)式(X8)n-OH的醇或式-(X8)n-O-X9的烷氧基部分，其中X8和X9獨(dú)立地選自由氫、飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中所述的環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯組成的組，其中n是0或1；(viii)式-NHCOX10的酰胺，其中X10選自由烷基、羥基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組，其中所述的環(huán)可選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯組成的組；(ix)-SO2NX11X12，其中X11和X12選自由氫、烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(x)同素環(huán)或雜環(huán)部分，可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組；(xi)式-CO-H的醛；和(xii)式-SO2-X13的砜，其中X13選自由飽和或不飽和烷基和同素環(huán)或雜環(huán)部分組成的組；(b)Z1和Z2獨(dú)立地選自由氮、硫、氧、NH和NR4組成的組，其條件是如果Z1和Z2之一是氮、NH或NR4，那么Z1和Z2中的另一個(gè)是氮、硫、氧、NH或NR4；且(c)Z3和X1獨(dú)立地選自由氮、硫和氧組成的組。
19.權(quán)利要求18的化合物，其中所述的Z1和Z2獨(dú)立地選自由氮和NH組成的組。
20.權(quán)利要求19的化合物，其中所述的R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自下組(i)氫；(ii)飽和或不飽和烷基，可選地被同素環(huán)或雜環(huán)部分或者多核環(huán)部分取代，其中所述的環(huán)部分可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、鹵素、三鹵甲基、羥基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組；和(iii)同素環(huán)或雜環(huán)部分，可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、鹵素、三鹵甲基、羥基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部分組成的組。
21.權(quán)利要求20的化合物，其中所述的R2和R3是氫。
22.權(quán)利要求21的化合物，其中所述的R1是苯基，可選地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自由烷基、烷氧基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基或酯部分組成的組。
23.權(quán)利要求22的化合物，其中所述的R1選自由SABI取代基組成的組。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中所述的X1選自由硫、氧和NH組成的組。
25.權(quán)利要求24的化合物，其中所述的Z3是氧。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中所述的R4選自由甲基和乙基組成的組。
27.權(quán)利要求26的化合物，其中所述的氮雜苯并咪唑化合物選自由SABI化合物組成的組。
28.藥物組合物，包含權(quán)利要求18-27任意一項(xiàng)的氮雜苯并咪唑化合物和生理學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
29.用于合成權(quán)利要求18的式(I)化合物的方法，包括下列步驟(a)使2-氨基-6-氯-3-硝基吡啶與第二反應(yīng)劑在溶劑中反應(yīng)，得到第一中間體，其中該第二反應(yīng)劑是取代的芳基環(huán)；(b)在催化劑和還原劑的存在下，還原所述第一中間體，得到第二中間體；(c)使第二中間體與第三反應(yīng)劑反應(yīng)；和(d)純化所述權(quán)利要求18的化合物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的溶劑是正丙醇。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的取代的芳基環(huán)是取代的苯酚、取代的苯硫酚和取代的苯胺。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述的取代的苯酚、取代的苯硫酚和取代的苯胺選自由SABI反應(yīng)劑組成的組。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述的還原劑是氫。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述的催化劑是阮內(nèi)鎳。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述的第三反應(yīng)劑是O-甲基異脲。
36.權(quán)利要求29的方法，其中所述的第三反應(yīng)劑是S-甲基異硫脲鎓硫酸鹽與氯甲酸烷基酯的反應(yīng)產(chǎn)物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述的烷基是甲基或乙基。
全文摘要
本發(fā)明部分涉及用氮雜苯并咪唑類化合物調(diào)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能的方法。該方法引入了表達(dá)一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、例如RAF的細(xì)胞。另外,本發(fā)明描述了用由本發(fā)明鑒定的化合物預(yù)防和治療生物體與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶有關(guān)的異常狀態(tài)的方法。而且,本發(fā)明涉及氮雜苯并咪唑化合物和包含這些化合物的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1278172SQ98810753
公開日2000年12月27日 申請日期1998年9月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月26日
發(fā)明者G·邁克馬弘, H·維恩伯格, B·庫茨切爾, H·艾普 申請人:Asta藥物股份公司