專(zhuān)利名稱(chēng)：載脂蛋白a－i激動(dòng)劑及其治療脂血異常癥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療與血脂蛋白異常有關(guān)病癥的載脂蛋白A-I(Apo-I)激動(dòng)劑組合物，例如血膽脂醇過(guò)多癥、心血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、以及其他病癥，例如，膿毒性休克。
2.發(fā)明背景循環(huán)系統(tǒng)膽固醇攜帶者為血漿脂蛋白--能夠轉(zhuǎn)運(yùn)血脂的由復(fù)合脂類(lèi)和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物顆粒。低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)是主要的膽固醇攜帶者。低密度脂蛋白負(fù)責(zé)把肝中的膽固醇輸送到體內(nèi)的肝外組織。術(shù)語(yǔ)“逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)”是指把肝外組織的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝中的過(guò)程，膽固醇在肝中代謝并排泄。血漿HDL顆粒在逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要的作用，扮演著組織膽固醇清潔工的角色。
大量的證據(jù)表明升高的血清脂蛋白與冠心病有關(guān)。例如，動(dòng)脈粥樣硬化是以在動(dòng)脈壁上積聚膽固醇的慢性進(jìn)行性過(guò)程。明顯的證據(jù)支持如下事實(shí)儲(chǔ)存在動(dòng)脈粥樣硬化病變處的脂類(lèi)主要由從血漿LDL輸送而來(lái)；因此，LDLs又被通俗地稱(chēng)為“壞”膽固醇。相反，HDL血清水平與冠心病負(fù)相關(guān)--實(shí)際上，高血清水平的HDL被認(rèn)為是負(fù)危險(xiǎn)度。認(rèn)為高水平血漿脂蛋白不僅可以預(yù)防冠心病，而且確實(shí)可以導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑的衰退(例如，Badimon et al.，1992，Circulation86(Suppl.III)86-94)。因此，普遍地又將HDL稱(chēng)為“好”膽固醇。
2.1.膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以分為兩種途徑一種為用于腸道吸收的膽固醇和甘油三酯的外源性途徑，一種為用于從肝及其他非-肝組織進(jìn)入血流的膽固醇和甘油三酯的內(nèi)源性途徑。
外源性途徑中，飯食中的脂肪被包裝成稱(chēng)為乳糜微粒的脂蛋白顆粒，乳糜微粒進(jìn)入血流并將它們中的甘油三酯運(yùn)輸?shù)街窘M織(用于存儲(chǔ))和肌肉(用于氧化提供能量)。含有膽固醇酯的乳糜微粒剩余物被一種特殊受體從循環(huán)系統(tǒng)中清除，該受體只發(fā)現(xiàn)于肝細(xì)胞。然后，這種膽固醇又可以為細(xì)胞代謝所利用或者作為血漿脂蛋白再循環(huán)到肝外組織。
內(nèi)源性途徑中，肝向血流中分泌大的、極低密度脂蛋白(VLDL)。VLDLs的核心主要由肝中合成的甘油三脂組成，另有較少量的膽固醇脂(肝內(nèi)合成或從乳糜微粒再循環(huán)而來(lái))。兩種主要的蛋白質(zhì)，載脂蛋白B-100和載脂蛋白E。當(dāng)VLDL到達(dá)脂肪組織或肌肉的毛細(xì)血管時(shí)，其中的甘油三脂被提出從而形成一種稱(chēng)為中間密度脂蛋白(IDL)的新顆粒，這種新顆粒大小減小并富集膽固醇酯，但仍保留了其兩種載脂蛋白。
人體內(nèi)，約一半的IDL顆粒被從循環(huán)系統(tǒng)中快速清除(它們合成的2～6小時(shí)內(nèi))，因?yàn)樗鼈兣c肝細(xì)胞緊密結(jié)合，肝細(xì)胞提取出其中的膽固醇，生成新的VLDL和膽汁酸。未被肝細(xì)胞吸收的IDL顆粒則會(huì)在循環(huán)系統(tǒng)中保留更長(zhǎng)的時(shí)間。此時(shí)，載脂蛋白E從循環(huán)顆粒中解離出來(lái)，使該顆粒轉(zhuǎn)化為只有載脂蛋白B-100作為其唯一蛋白的LDL。
首先，肝細(xì)胞吸收并降解大部分膽固醇生成膽汁酸，膽汁酸是膽固醇代謝的終產(chǎn)物。含顆粒膽固醇的吸收由LDL受體介導(dǎo)，該受體以高濃度存在于肝細(xì)胞上。LDL受體結(jié)合載脂蛋白E和載脂蛋白B-100，并負(fù)責(zé)從循環(huán)系統(tǒng)中結(jié)合和去除IDLs和LDLs。但是，載脂蛋白E與LDL受體的結(jié)合力比載脂蛋白B-100大。因此，LDL顆粒具有比IDL顆粒大得多的半衰期范圍--在結(jié)合肝和其他組織中LDL受體之前，LDL循環(huán)的時(shí)間段為2天半。高水平LDL(“壞”膽固醇)與冠心病正相關(guān)。例如，動(dòng)脈硬化癥中，來(lái)自循環(huán)LDLs的膽固醇積聚在動(dòng)脈壁導(dǎo)致形成大塊病變，這種大塊病變抑制血流直到最終形成栓塞，阻塞動(dòng)脈引發(fā)心肌梗塞或心絞痛。
最后，從LDLs從釋放出的胞內(nèi)膽固醇的量控制細(xì)胞膽固醇代謝。來(lái)自VDLs和LDLs細(xì)胞膽固醇的積聚控制著3個(gè)途徑第一，它可以通過(guò)關(guān)閉HMGCoA還原酶-膽固醇生物合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，減少細(xì)胞膽固醇的合成。第二，通過(guò)激活A(yù)CAT-能夠把膽固醇轉(zhuǎn)化成儲(chǔ)存在存儲(chǔ)小滴中的膽固醇酯的酶，新進(jìn)入的LDL-衍生膽固醇促進(jìn)膽固醇的存儲(chǔ)。第三，細(xì)胞中膽固醇的積聚驅(qū)動(dòng)一種反饋機(jī)制，抑制新LDL受體的細(xì)胞合成。因此，細(xì)胞可以調(diào)節(jié)其對(duì)LDL受體的補(bǔ)充，從而能有足夠量膽固醇滿(mǎn)足代謝需要，而不過(guò)量。(綜述，見(jiàn)Brown &Goldstein，In，The Pharmacological Basis Of Therapeutics，8thEd.，Goodman & Gilman，Pergamon Press，NY，1990，Ch.36，pp.874～896)。
2.2.逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)總之，外周(非肝)細(xì)胞從原位合成以及吸收來(lái)自VLDLs和LDLs的預(yù)成固醇的結(jié)合，獲得它們的膽固醇。反之，逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)是這樣一種途徑，即能夠?qū)⑼庵芗?xì)胞膽固醇返回到肝細(xì)胞，用于再循環(huán)到肝外組織，或者以膽汁排泄到腸道，經(jīng)修飾或氧化形成膽汁酸。RCT途徑是從大部分肝外組織中清除膽固醇的唯一方法，對(duì)維持體內(nèi)多數(shù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用。
RCT主要包括3個(gè)步驟(a)膽固醇的流出，最初從外周細(xì)胞的各種庫(kù)中移取膽固醇；(b)卵磷脂膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)作用下的膽固醇酯化，防止流出的膽固醇再進(jìn)入細(xì)胞；以及(c)把HDL膽固醇酯吸收/運(yùn)輸?shù)礁渭?xì)胞。RCT途徑由HDLs介導(dǎo)。HDL是以其高密度為特征的脂蛋白顆粒的通用術(shù)語(yǔ)。HDL復(fù)合物中主要脂類(lèi)成分有各種磷脂、膽固醇(酯)以及甘油三脂。最主要的載脂蛋白成分是A-I和A-II，這二者決定HDL的功能特征；另外還發(fā)現(xiàn)少量載脂蛋白C--I、C-II、C-III、D、E、J等。根據(jù)在代謝RCT級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中改形情況，HDL可以多種大小不同以及上述組分間混合比各異的形態(tài)存在。
參與RCT途徑的關(guān)鍵酶是LCAT。LCAT主要由肝生成，并與HDL級(jí)分結(jié)合循環(huán)于血漿中。LCAT可以把細(xì)胞生成的膽固醇轉(zhuǎn)化成膽固醇酯，膽固醇酯隱藏在運(yùn)去消除的HDL中。另外，膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP)和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PLTP)也參與改形循環(huán)HDL群體。CETP能夠把LCAT制備的膽固醇酯搬運(yùn)到其他脂蛋白，具體為含ApoB脂蛋白，例如VLDL和LDL。PLTP向HDL供應(yīng)卵磷脂。HDL甘油三脂可以被胞外肝甘油三酯脂酶代謝，脂蛋白被肝通過(guò)幾種機(jī)制去除脂蛋白膽固醇。
每個(gè)HDL顆粒含有至少1個(gè)拷貝(通常為2～4拷貝)的ApoA-I。ApoA-I由肝和小腸作為前載脂蛋白原合成，前載脂蛋白原以蛋白原分泌，該蛋白原迅速地被切割生成具有243個(gè)氨基酸殘基的成熟多肽。ApoA-I主要由6～8個(gè)不同的22氨基酸殘基重復(fù)單元組成，該重復(fù)單元被連接單元間隔，該連接單元通常為脯氨酸、某些情況下由數(shù)個(gè)成串殘基構(gòu)成。ApoA-I形成3種類(lèi)型的含脂穩(wěn)定復(fù)合物稱(chēng)為前-β-1 HDL的小、貧脂復(fù)合物；稱(chēng)為前-β-2 HDL的含極性脂類(lèi)(磷脂和膽固醇)的平盤(pán)狀顆粒；以及稱(chēng)為球狀或成熟HDL(HDL3和HDL2)的同時(shí)含極性和非極性脂類(lèi)的球狀顆粒。循環(huán)群體中的多數(shù)HDL含有ApoA-I和ApoA-II(次主要HDL蛋白)，本發(fā)明稱(chēng)其為HDL的AI/AII-HDL級(jí)分。但是，只含ApoA-I的HDL級(jí)分(本發(fā)明稱(chēng)為AI-HDL級(jí)分)在RCT中的效率更高。某些流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)支持下列理論AI-HDL具有抗-粥樣硬化的特性。(Parra et al.，1992，Arterioscler.Thromb.12701-707；Decossin et al.，1997，Eur.J.Clin.Invest.27299-307)。
盡管從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)出膽固醇(即膽固醇外流)的機(jī)制還不清楚，但是可以肯定的是貧脂復(fù)合物，前-β-1 HDL是從參與RCT的外周組織轉(zhuǎn)運(yùn)而來(lái)膽固醇的優(yōu)選受體。(See Davidson et al.，1994，J.Biol.Chem.26922975-22982；Bielicki et al.，1992，J.LipidRes.331699-1709；Rothblat et al.，1992，J.Lipid Res.3310911097；and Kawano et al.，1993，Biochemistry 325025-5028；Kawano et al.，1997，Biochemistry 369816-9825)。在這種從細(xì)胞表面補(bǔ)充膽固醇的過(guò)程中，前-β-1 HDL迅速轉(zhuǎn)化成前-β-2HDL。PLTP可以加快前-β-2 HDL圓盤(pán)狀的形成，但是有結(jié)果表明PLTP不參與RCT。LCAT優(yōu)選與圓盤(pán)狀或球狀HDL反應(yīng)，把卵磷脂或其他磷脂上的2-?；D(zhuǎn)移到膽固醇的羥基上生成膽固醇酯(保留在HDL中)和溶血卵磷脂。LCAT反應(yīng)需要ApoA-I作為激活劑；即，ApoA-I是LCAT的天然輔因子。隱藏在HDL中進(jìn)行的膽固醇向其酯的轉(zhuǎn)化可以防止膽固醇再進(jìn)入到細(xì)胞中，結(jié)果為膽固醇酯必然被清除。AI-HDL級(jí)分(即，含ApoA-I而不含ApoA-II)中成熟HDL顆粒內(nèi)的膽固醇酯被肝清除并處理成膽汁，而且比來(lái)自同時(shí)含ApoA-I和ApoA-II的HDL(AI/AII-HDL級(jí)分)中的膽固醇酯效率更高。這部分取決于AI-HDL與肝細(xì)胞膜的結(jié)合更有效。現(xiàn)已提出存在著HDL受體，而且最近一種清潔受體，SR-BI被鑒定為HDL受體(Acton et al.，1996，Science271518-520；Xu et al.，1997，J.Lipid Res.381289-1298)。SR-BI在類(lèi)固醇生成組織(例如，腎上腺)和肝中的表達(dá)量最為豐富(Landshulz et al.，1996，J.Clin.Invest.98984-995；Rigottiet al.，1996，J.Biol.Chem.27133545-33549)。
CETP沒(méi)在RCT中發(fā)揮主要作用，而是參與了VLDL-和LDL-衍生脂類(lèi)的代謝。但是CETP活性或其受體VLDL和LDL的變化在“改形”HDL群體中發(fā)揮了作用。例如，在缺乏CETP的情況下，HDLs變成了無(wú)法清除的大顆粒。(有關(guān)RCT和HDLs的綜述，見(jiàn)Fielding & Fielding，1995，J.Lipid Res.36211-228；Barrans et al.，1996，Biochem.Biophys.Acta.130073-85；Hirano et al.，1997，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17(6)1053-1059)。
2.3.血脂蛋白異常目前的治療方法目前，有大量治療方法可以用于降低血清膽固醇及甘油三脂(見(jiàn)，例如，上述Brown & Goldstein)。但是，每種方法在治療效果、副作用及確診患者群體方面都存在著其固有的缺陷。
膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂是能阻斷膽汁酸從腸道向肝再循環(huán)的一類(lèi)藥物；例如，膽苯烯胺(Questran Light，BristolMyers Squibb)和鹽酸降膽寧(Colestid，The Upjohn Company)。當(dāng)口服時(shí)，這些陽(yáng)性電荷樹(shù)脂與腸道中帶陰性電荷的膽汁酸結(jié)合。由于樹(shù)脂不能被腸道吸收，它們就攜帶著膽汁酸被排泄出去。但是，使用這類(lèi)樹(shù)脂最多只能減低約20％的血清膽固醇水平，并且伴隨有胃腸道副作用，包括便秘及某些維生素缺乏。此外，由于樹(shù)脂會(huì)結(jié)合藥物，所以必須在攝取該樹(shù)脂前至少1小時(shí)，或過(guò)后4～6小時(shí)才可服用其他的口服藥物；因此，使心臟病患者的治療方案復(fù)雜化。
抑制素是通過(guò)抑制HMGCoA還原酶阻斷膽固醇合成的降膽固醇藥物，HMGCoA還原酶是參與膽固醇合成途徑的關(guān)鍵酶。上述抑制素，例如，洛伐他汀(Mevacor，Merck &Co.，Inc.)和帕伐他丁(Pravachol，Bristol-Myers Sguibb Co.)有時(shí)與膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂聯(lián)合用藥。上述抑制素主要降低血清膽固醇和LDL-血清水平，減緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的病程。LDL降低效應(yīng)的機(jī)制包括降低VLDL濃度和誘導(dǎo)LDL-受體的細(xì)胞表達(dá)，導(dǎo)致LDLs生成的減少和/或代謝的增加。副作用，包括與服用這些藥相關(guān)的肝及腎功能異常(Physicians DeskReference，Medical Economics Co.，Inc.，Montvale，N.J.，1997)。最近，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)將埃托伐丁(atorvastatin)(Parke-Davis開(kāi)發(fā)的一種HMGCoA還原酶抑制劑)(Warner Lambert)投放市場(chǎng)用于治療罕見(jiàn)但危急的家族性高膽甾醇血癥病例(1995，Scrip20(19)10)。
煙酸是一種用作飲食補(bǔ)充及抗高血脂藥的水溶性維生素B-復(fù)合物。煙酸可以減少VLDL的生成，有效降低LDL。某些情況下，它和膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂聯(lián)用。足量使用煙酸可以增加HDL，但是如此高劑量使用帶來(lái)的副作用限制了它的應(yīng)用。
纖維是用于治療各種高脂質(zhì)血癥(即血清甘油三脂升高)，也可以是與血膽脂醇過(guò)多有關(guān)。纖維可以減少VLDL級(jí)分并溫和地增加HDL--但是這些藥物對(duì)血清膽固醇的作用變化不定。在美國(guó)，纖維已被批準(zhǔn)用作抗血脂藥，但是還未被批準(zhǔn)用作血膽脂醇過(guò)多藥物。例如，安妥明(Atromid-S，Wyeth-Ayerst Laboratories)是一種能夠通過(guò)減少VLDL級(jí)分減低血清甘油三脂的抗血脂藥。盡管在特定患者亞群中血清膽固醇能夠降低，而且對(duì)該藥的生化反應(yīng)各不相同，但是不總是能預(yù)見(jiàn)哪位患者將獲得最好結(jié)果。還未表明Atromid-S能有效預(yù)防冠心病。化學(xué)或藥學(xué)上相關(guān)的藥物，吉非貝齊(Lopid，Parke-Davis)是一種脂類(lèi)調(diào)節(jié)劑，能溫和地減少血清甘油三脂和VLDL膽固醇，并能溫和地增加HDL膽固醇--HDL2和HDL3亞級(jí)分以及ApoA-1和A-11二者(即，AI/AII-HDL級(jí)分)。但是，脂類(lèi)反應(yīng)是異源性的，尤其是在不同患者群之間。此外，雖然發(fā)現(xiàn)在年齡為40-55歲且無(wú)冠心病病史或癥狀的男性患者中能預(yù)防冠心病，但是還不清楚這些發(fā)現(xiàn)能在多大程度外推到其他患者群(例如，女性，年齡較大或較小的男性)。實(shí)際上，在已經(jīng)患有冠心病的患者上未發(fā)現(xiàn)任何療效。纖維的使用伴隨著嚴(yán)重的副作用，包括毒性，例如惡性腫瘤(特別是胃腸癌)、膽囊疾病以及非-冠心病死亡率的增加。未指明這些藥物能用于治療只有高LDL或低HDL為唯一脂類(lèi)異常的患者(Physician’sDesk Reference，1997，Medical Economics Co.，Inc.Montvale，N.J.)。
也可以將口服雌性激素替代療法用于絕經(jīng)后女性所患的良性血膽脂醇過(guò)多癥。但是，增加HDL會(huì)伴隨著甘油三脂的升高。當(dāng)然，雌性激素治療限于特定患者群(絕經(jīng)后女性)并與伴隨著嚴(yán)重的副作用，包括誘發(fā)惡性腫瘤、膽囊疾病、血栓栓塞性疾病、肝細(xì)胞性腺瘤、高血壓、葡萄糖不耐受性、以及血鈣過(guò)多。
因此，需要發(fā)展能有效降低血清膽固醇、增高HDL血清水平的更安全的藥物，預(yù)防冠心病、以及/或者治療已有疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化。
2.4.以ApoA-I作靶目前，尚無(wú)一種降膽固醇藥物能安全地升高HDL水平并刺激RCT--最可能控制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，調(diào)節(jié)膽固醇以及VLDL群的飲食攝入、再循環(huán)、合成。
希望發(fā)現(xiàn)能刺激膽固醇排出和去除的藥物，RCT中存在著幾個(gè)潛在目標(biāo)--例如，LCAT、HDL及其各種成分(ApoA-I、ApoA-II及磷脂)、PLTP和CETP--但不知哪個(gè)目標(biāo)在實(shí)現(xiàn)預(yù)期脂蛋白庫(kù)和保護(hù)效應(yīng)方面最有效。RCT途徑中任一單個(gè)成分的混亂最終都會(huì)影響循環(huán)系統(tǒng)中脂蛋白群體的組成以及RCT的效率。
以體內(nèi)獲得結(jié)果為基礎(chǔ)的幾套證據(jù)表明，HDL及其主要蛋白成分ApoA-I能預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化斑，以及潛在地退化病變--使這些有吸引力的目標(biāo)用于治療干預(yù)。首先，男性的血清ApoA-I(HDL)濃度與動(dòng)脈粥樣化形成之間存在著負(fù)相關(guān)(Gordon & Rifkind，1989，N.Eng.J.Med.321131.1-1316；Gordon et al.，1989，Circulation 798-15)。實(shí)際上，已發(fā)現(xiàn)特定HDL亞群與人動(dòng)脈粥樣化發(fā)病率的減小有關(guān)(Miller，1987，AlDer.Heart 113589-597；Cheung et al.，1991，Lipid Res.32383-394)；Fruchart & Ailhaud，1992，Clin.Chem.3879)。
其次，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了ApoA-I(HDL)的保護(hù)作用。用ApoA-I或HDL治療飼喂膽固醇的兔減少了飼喂膽固醇兔中病變(脂肪條紋)的發(fā)生和進(jìn)行。(Koizumi et al.，J.～86，J.Lipid Res.2～J.405-J.415；Badimon et al.，1989，Lab.Invest.60455-461；Badimon et al.，1990，J.Clin.Invest.851234-1241)。但是，治療效率卻因HDL的來(lái)源而不同(Beitz et al.，1992-，前列腺素，白三烯和必須脂肪酸47.149 152 Mezdour et al.，1995，Atherosclerosis 113237-246)。
第三，從使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中獲得了有關(guān)ApoA-I作用的直接證據(jù)。遺傳學(xué)上，轉(zhuǎn)移到小鼠中的人ApoA-I基因的表達(dá)能提前保證飲食誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化不生成大動(dòng)脈病變(Rubin et al.，1991，Nature 353265-267)。另外還發(fā)現(xiàn)ApoA-I轉(zhuǎn)基因能抑制ApoE缺陷小鼠及Apo(a)轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化(Paszty et al.，1994，J.Clin.Invest.94899-903；Plump et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919607-9611；Liu et al.，1994，J.Lipid Res.352263-2266)。在表達(dá)人ApoA-I的轉(zhuǎn)基因兔(Duverger，1996，Circulation 94713717；Duverger et al.，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.161424-1429)，和轉(zhuǎn)基因大鼠中也觀察了類(lèi)似的結(jié)果，在轉(zhuǎn)基因大鼠中人ApoA-I水平的升高防止了動(dòng)脈粥樣硬化形成并抑制球囊血管成形術(shù)后繼發(fā)的再狹窄(Burkeyet al.，199.2，Circulation，Supplement I，86I-472，AbstractNo.1876；Burkey et al.，1995，J.Lipid Res.361463-1473)。
在RCT中，AI-HDL可能比AI/AII-HDL級(jí)分更有效。人ApoA-I或Apo-I以及ApoA-II(AI/AII)轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)表明，HDL的蛋白組成會(huì)顯著地影響它的作用--AI-HDL比AI/AII-HDL具有更強(qiáng)的抗-致動(dòng)脈粥樣硬化的性能(Schultz et al.，1993，Nature 365762-764)。用表達(dá)人LCAT基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的平行實(shí)驗(yàn)表明溫和地增強(qiáng)LCAT活性能明顯地改變脂蛋白膽固醇水平，而且LCAT對(duì)于含ApoA-I的HDL具有明顯的偏嗜性(Francone et al.，1995，J.Clinic.Invest.961440-1448；Berard et al.，1997，NatureMedicine 3(7)744-749)。這些結(jié)果證實(shí)了ApoA-I在活化LCAT和刺激RCT中的作用，同時(shí)另外實(shí)驗(yàn)表明一種更加復(fù)雜假設(shè)HDL中能調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇排出的主要成分是磷脂(Fournier et al.，1996，J.Lipid Res.371704-1711)。
鑒于HDL，即ApoA-I及其相關(guān)磷脂在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化疾病方面的潛在作用，使用重組制備的ApoA-I的人臨床試驗(yàn)被UCB比利時(shí)(Pharmaprojects，Oct.27，1995；IMS R&D Focus，June 30，1997；Drug Status Update，1997，Atherosclerosis 2(6)261-265)；另見(jiàn)M.Eriksson at Congress，″The Role of HDL in DiseasePrevention，″Nov.7-9，1996，F(xiàn)ort Worth；Lacko & Miller，1997，J.Lip.Res.381267-1273；and WO94/13819)開(kāi)始、中斷并且明確地再次開(kāi)始，以及Bio-Tech(Pharmaprojects，April 7，1989)開(kāi)始并中斷。另外嘗試了用ApoA-I治療膿毒性休克的試驗(yàn)(Opal，″Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis，″IBC’s7th International Conference on Sepsis，April 28-30，1997，Washington，D.C.；Gouni et al.，1993，J.Lipid Res.94139-146；Levine，WO96/04916)。但是，存在著與ApoA-I的制備和使用有關(guān)的許多缺陷，這就使得它無(wú)法成為理想藥物，例如，ApoA-I是一種制備困難并昂貴的大蛋白；關(guān)于存儲(chǔ)穩(wěn)定性、活性產(chǎn)物的運(yùn)輸和體內(nèi)半衰期方面，必須克服明顯的制備及重現(xiàn)性問(wèn)題。
鑒于這些缺陷，已經(jīng)嘗試制備模擬ApoA-I的肽。由于ApoA-I的關(guān)鍵活性與該蛋白中獨(dú)特的次級(jí)結(jié)構(gòu)特征的多個(gè)重復(fù)單元-一種A類(lèi)兩親性α-螺旋有關(guān)(Segrest，1974，F(xiàn)EBS Lett.38247-253)，所以設(shè)計(jì)模擬ApoA-I活性肽的大部分努力都集中在設(shè)計(jì)能形成A類(lèi)兩親性α-螺旋的肽上。
A類(lèi)兩親性α-螺旋具有下述獨(dú)特的特性正電荷的氨基酸殘基成簇于疏水性-親水性界面，負(fù)電荷氨基酸殘基成簇于親水表面的中央。而且，A類(lèi)α-螺旋肽具有一個(gè)小于180度的疏水角(Segrest etal.，1990，PROTEINSStructure，F(xiàn)unction and Genetics 8103-117)。設(shè)計(jì)ApoA-I模擬物的初始從頭策略不以天然生成載脂蛋白的一級(jí)序列為基礎(chǔ)，而是在將這些獨(dú)特的A類(lèi)螺旋特性以及ApoA-I結(jié)構(gòu)域一些特性引入到肽類(lèi)似物序列中的基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)計(jì)的(參見(jiàn)，例如，Davidson et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9313605-13610；Rogers et al.，1997，Biochemistry 36288-300；Lins et al.，1993，Biochim.Biophys.Actabiomembranes 1151137-142；Ji and Jonas，1995，J.Biol.Chem.27011290-11297；Collet et al.，1997，Journal of LipidResearch，38634-644；Sparrow and Gotto，1980，Ann.N.Y.Acad.Sci.348187-211；Sparrow and Got to，1982，CRC Crit.Rev.Biochem.1387-107；Sorci-Thomas et al.，1993，J.Biol.Chem.26821403-21409；Wang et al.，1996，Biochim.Biophys.Acta174-184；Minnich et al.，1992，J.Biol.Chem.26716553-16560；Holvoet et al.，1995，Biochemistry 3413334-13342；SorciThomas et al.，1997，J.Biol.Chem.272(11)7278-7284；and Frank et al.，1997，Biochemistry 361798-1806)。
在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ukushima等人合成了一段22殘基肽，該肽完全由有規(guī)律分布的Glu、Lys和Leu殘基組成從而形成具有均等親水和疏水面的兩親性α-螺旋(″ELK peptide″)(Fukushima et al.，1979，J.Amer.Chem.Soc.10l(13)3703-3704；Fukushima et al.，1980，J.Biol.Chem.25510651-10657)。ELK肽與ApoA-I第198～219位殘基節(jié)段見(jiàn)具有41％的序列同源性。通過(guò)定量超濾、凝膠滲透層析以及圓二色性研究，發(fā)現(xiàn)ELK肽能有效地與磷脂結(jié)合，并模擬了ApoA-I的一些理化特性(Kaiser et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801137-1140；Kaiser et al.，1984，Science 223249-255；Fukushima et al.，1980，上文.；Nakagawa et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.1077087-7092)。Yokoyama等人從這類(lèi)研究中推斷出LCAT活化的關(guān)鍵因素僅是存在大量足夠的兩親性結(jié)構(gòu)(Yokoyama et al.，1980，J.Biol.Chem.255(15)7333-7339)。后來(lái)發(fā)現(xiàn)這種22殘基肽的二聚體比其單體更精確地模擬了ApoA-I；根據(jù)這一結(jié)果，可以設(shè)想上述代表ApoA-I中最小功能結(jié)構(gòu)域的44-殘基被螺旋截?cái)辔?Gly或Pro)居中隔開(kāi)。(Nakagawa et al.，1985，上述)。
另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)涉及模擬稱(chēng)為“LAP肽”的兩親性肽(Pownall et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(6)3154-3158；Sparrowetal.，1981，肽合成-結(jié)構(gòu)-功能，Roch and Gross，Eds.，PierceChem.Co.，Rockford，IL，253-256)。在與原始載脂蛋白片段結(jié)合實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了幾種肽，定名為L(zhǎng)AP-16，LAP-20和LAP-24(分別含16、20和24個(gè)氨基酸殘基)。這些模擬兩親性肽與載脂蛋白間無(wú)同源性，而且被設(shè)計(jì)成具有以類(lèi)似于載脂蛋白相關(guān)A類(lèi)兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的方式組成的親水表面(Segrest et al.，1992，J.Lipid Res.33141-166)。從這些研究中，作者推斷出20個(gè)殘基的最小長(zhǎng)度是賦予模擬兩親性肽脂類(lèi)結(jié)合特性所必需的。
對(duì)在序列不同位置含有脯氨酸殘基的LAP20突變體的研究表明，在脂類(lèi)結(jié)合與LCAT活化間直接相關(guān)，但是肽的螺旋潛力單獨(dú)不能導(dǎo)致LCAT活化(Ponsin et al.，1986 J.Biol.Chem.261(20)9202-9205)。而且這種緊靠該肽中點(diǎn)的螺旋截?cái)辔?Pro)能夠減小其與磷脂表面的親和力及其活化LCAT的能力。表明某些LAP肽能結(jié)合磷脂(Sparrow et al.，上述)，關(guān)于脂類(lèi)存在的條件下LAP肽以多大程度螺旋還存在著爭(zhēng)論(Buchko et al.，1996，J.Biol.Chem.271(6)3039-3045；Zhong et al.，1994，Peptide Research 7(2)99-106)。
Segrest等人已經(jīng)合成了由18～24個(gè)氨基酸殘基組成的肽，該肽與上述ApoA-I螺旋間無(wú)序列同源性(Kannelis et al.，1980，J.Biol.Chem.255(3)11464-11472；Segrest et al.，1983，J.Biol.Chem.2582290-2295)。在疏水矩(Eisenberg et al.，1982，Nature299371-374)和電荷分布(Segrest et al.，1990，Proteins 8103-117；U.S.Patent No.4,643,988)方面，這些序列特異性地被設(shè)計(jì)成模擬A類(lèi)可交換載脂蛋白的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域。一種18-殘基肽，即“18A”肽被設(shè)計(jì)成為一種模擬A類(lèi)α-螺旋(Segrest et al.，1990，上述)。對(duì)這些肽和其他具有翻轉(zhuǎn)電荷分布的肽，象“18R”肽的研究，一致表明電荷分布對(duì)于活性是關(guān)鍵的；翻轉(zhuǎn)電荷分布的肽表現(xiàn)出相對(duì)18A A類(lèi)類(lèi)似物減小的脂類(lèi)親和力以及存在脂類(lèi)條件下較低的螺旋含量(Kanellis et al.，1980，J.Biol.Chem.25511464-11472；Anantharamaiah et al.，1985，J.Biol.Chem.26010248-10255；Chung et al.，1985，J.Biol.Chem.26010256-10262；Epand et al.，1987，J.Biol.Chem.2629389-9396；Anantharamaiah et al.，1991，Adv.Exp.Med.Biol.285131-140)。
與已被認(rèn)定有限成功的與載脂蛋白間無(wú)同源性的其他合成肽包括18A肽(Anantharamaiah et al.，1986，蛋白質(zhì)生物體液的3463-66)、GALA和EALA肽(Subbarao et al.，1988，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能和遺傳學(xué)3187-198)和ID肽類(lèi)(Labeur et al.，1997，動(dòng)脈粥樣硬化，血栓和血管生物學(xué)17580-588)以及18AM4肽(Brasseuret al.，1993，7).Biochim.Biophys.Acta 11701-7)的二聚體及三聚體。
另外，已經(jīng)構(gòu)建出了一種以人ApoA-I序列為基礎(chǔ)的含22個(gè)氨基酸殘基的“共有”肽(Anantharamaiah et al.，1990，動(dòng)脈粥樣硬化10(1)95-105；Venkatachalapathi et al.，1991，Mol.Conformati on and Biol.Interactions，Indian Acad S.B.585-596)。通過(guò)鑒定假定的人ApoA-I螺旋每個(gè)位置上的優(yōu)勢(shì)殘基，構(gòu)建出該序列。與上述肽一樣，這種肽形成的螺旋也是正電荷氨基酸殘基成簇于疏水性-親水性界面，負(fù)電荷氨基酸殘基成簇于親水表面的中央，并且疏水角小于180度。這種肽的二聚體在活化LCAT方面有一定效果，但單體幾乎未顯示出任何脂類(lèi)結(jié)合活性(Venkatachalapathi et al.，1991，上述)。
首先，對(duì)上述肽研究的基礎(chǔ)上，已經(jīng)顯示出了設(shè)計(jì)模擬ApoA-I功能的肽的一套“規(guī)則”。重要的是，明白了正電荷殘基成簇于疏水性-親水性界面而且負(fù)電荷氨基酸殘基成簇于親水表面的中央，具有這樣特征的兩親性α-螺旋是脂類(lèi)親和和LCAT活化所必需的(Venkatachalapathi et al.，1991，上述)。另外，Anantharamaiah等人還指出上述22-殘基共有肽中第13位上帶負(fù)電荷的Glu位于α-螺旋疏水面中，它在LCAT活化中起著重要作用(Ananthararnaiah etal.，1991，上述)。此外，Brasseur已經(jīng)提出小于180度的疏水角(pho角)是實(shí)現(xiàn)脂類(lèi)-載脂蛋白復(fù)合物最佳穩(wěn)定性所必需的，而且也使得肽圍繞脂雙層邊緣肽的球形顆粒能夠得以形成(Brasseur，1991，J.Biol.Chem.66(24)16120-16127)。Rosseneu等認(rèn)為小于180度的疏水角是LCAT活化所需的(WO93/25581)。
但是，盡管有了這些“規(guī)則”，但是迄今為止還沒(méi)有人已經(jīng)設(shè)計(jì)或制備出了與ApoA-I一樣活性的肽--通過(guò)本發(fā)明描述的LCAT活化實(shí)驗(yàn)測(cè)量出最佳活性不及ApoA-I活性的40％。文獻(xiàn)中描述的肽中還沒(méi)有一個(gè)能夠用作藥物。
鑒于上述原因，需要發(fā)展一種模擬ApoA-I活性并且制備上相對(duì)簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定的ApoA-I激動(dòng)劑。但是，用于設(shè)計(jì)有效ApoA-I模擬物的“規(guī)則”仍未闡明，用于設(shè)計(jì)具有ApoA-I功能的有機(jī)分子的原理還不清楚。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及能夠形成模擬ApoA-I活性的兩親性α-螺旋的ApoA-I激動(dòng)劑，該類(lèi)似物的特定活性，即活性單位(LCAT活性/質(zhì)量單位)近似或超過(guò)天然分子。具體地說(shuō)，本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑是具有下述特性的肽或肽類(lèi)似物形成兩親性螺旋(脂類(lèi)存在)，結(jié)合脂類(lèi)，形成前-β-類(lèi)或HDL-類(lèi)復(fù)合物，活化LCAT，增加HDL級(jí)分的血清水平，以及促進(jìn)膽固醇的排出。
本發(fā)明部分以申請(qǐng)人對(duì)模擬ApoA-I功能的肽的設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。本發(fā)明肽的設(shè)計(jì)以從ApoA-I的螺旋重復(fù)單元衍生而來(lái)22氨基酸共有序列的假想螺旋結(jié)構(gòu)及兩親性特性為基礎(chǔ)。出人意料的是，本發(fā)明肽的特定活性?xún)?yōu)于現(xiàn)有文獻(xiàn)中描述的ApoA-I衍生肽。實(shí)際上，本發(fā)明的一些實(shí)施方案接近原始ApoA-I活性的100％，而且本發(fā)明中描述的類(lèi)似物超過(guò)了ApoA-I的特定活性。
本發(fā)明的一個(gè)方面部分上也是以申請(qǐng)人的下述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的Segrest的共有22-聚體的第14～17位氨基酸殘基可以缺失而不喪失LCAT活性。一些情況下，上述氨基酸殘基的缺失可以增強(qiáng)LCAT活性。本發(fā)明另一方面，還可以缺失所述共有序列的其他殘基并增強(qiáng)活性。另外，一些實(shí)施方案中，缺失可以與氨基酸殘基的取代結(jié)合使用。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，將從Segrest的共有22-聚體肽中缺失4個(gè)殘基與將第5、9和13位上的殘基改變成疏水的亮氨酸結(jié)合使用。
通過(guò)描述具體兩親性肽的結(jié)構(gòu)、制備和使用的操作實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，所述兩親性肽能夠形成螺旋(有脂類(lèi)存在)，結(jié)合脂類(lèi)，形成復(fù)合物，增強(qiáng)LCAT活性。在例舉的實(shí)施方案的基礎(chǔ)上，本申請(qǐng)人發(fā)明了能夠用于設(shè)計(jì)出仍屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)的改進(jìn)或突變形式的一套“規(guī)則”。
本發(fā)明還涉及含這類(lèi)ApoA-I激動(dòng)劑作為活性成分的藥用制劑，以及制備這類(lèi)制劑的方法和它們?cè)谥委熤鞍籽惓Ｏ嚓P(guān)疾病(例如，心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬、代謝綜合征(metabolic syndrome)、再狹窄、或內(nèi)毒素性血癥(例如膿毒性休克)方面的用途。
3.1縮寫(xiě)本發(fā)明使用遺傳學(xué)上編碼L-異構(gòu)體氨基酸的常規(guī)縮寫(xiě)，并于下面列出
遺傳學(xué)上編碼氨基酸D-異構(gòu)體的縮寫(xiě)用單字母符號(hào)的對(duì)應(yīng)小寫(xiě)形式表示。例如，“R”代表L-精氨酸，“r”代表D-精氨酸。
3.2.定義本發(fā)明使用的下列術(shù)語(yǔ)具有下述含義″烷基″代表飽和分枝、直鏈或環(huán)狀烴基。典型烷基包括，但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基等。優(yōu)選實(shí)施方案中，烷基基團(tuán)為(C1～C6)烷基。
“烯基”是指具有至少1個(gè)碳-碳雙鍵的不飽和分枝、直鏈或環(huán)狀烴基。該基團(tuán)的雙鍵可以是順式或反式構(gòu)象。典型的烯基基團(tuán)包括，但不限于乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、異丁烯基、叔丁烯基、戊烯基、己烯基等。優(yōu)選實(shí)施方案中，烯基基團(tuán)為(C1～C6)烯基。
“炔基”是指具有至少1個(gè)碳-碳三鍵的不飽和分枝、直鏈或環(huán)狀烴基。典型的炔基基團(tuán)包括，但不限于乙炔基、丙炔基、異丙炔基、丁炔基、異丁炔基、戊炔基、己炔基等。優(yōu)選實(shí)施方案中，炔基基團(tuán)為(C1～C6)炔基。
“芳基”是指具有1個(gè)π電子系統(tǒng)的不飽和環(huán)狀烴基。典型的芳基基團(tuán)包括，但不限于戊-2，4-二烯、苯基、萘基、蒽基、薁基、基、蔻基、熒蒽基、indacenyl、idenyl、卵烯基、苝基、phenalenyl、菲基、苉pleiadenyl、芘基、皮蒽基、玉紅省基等。優(yōu)選實(shí)施方案中，芳基基團(tuán)為(C5～C20)芳基，(C5～C10)芳基為特別優(yōu)選。
“烷芳基”是指其中結(jié)合到末端碳上一個(gè)氫原子被一個(gè)芳基取代的直鏈烷基、烯基、或炔基，。典型的烷芳基基團(tuán)包括，但不限于芐基，苯亞甲基，次芐基，benzenobenzyl，naphthenobenzyl等。優(yōu)選實(shí)施方案中，烷芳基基團(tuán)為(C6～C26)烷芳基，即，烷芳基中的烷基、烯基或炔基為(C1～C6)，芳基為(C5～C20)。特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烷芳基基團(tuán)為(C6～C13)烷芳基，即，烷芳基中的烷基、烯基或炔基為(C1～C3)，芳基為(C5～C10)。
“雜芳基”是指其中的1個(gè)多個(gè)碳原子被N，P，O，S，As，Se，Si，Te，等所取代的一種芳基。例如典型的雜芳基包括，但不限于acridarsine，吖啶，arsanthridine，arsindole，arsindoline，咔唑，β-咔啉，色原烯，肉啉，呋喃，咪唑，吲唑，吲哚，indolizine，isoarsindole，isoarsinoline，異苯并呋喃，異色原烯，異吲哚，isophosphoindole，isophosPhinoline，異喹啉，異噻唑，異噁唑呤，naphthyridine，萘嵌間二氮雜苯，菲啶，菲咯啉，吩嗪，phosphoindole，phosphinoline，酞嗪，蝶啶，嘌呤，吡喃，吡嗪，吡唑，噠嗪，嘧啶，嘧啶，吡咯，pyrrolizine，喹唑啉，喹啉，喹嗪，對(duì)二氮萘，selenophene，tellurophene，噻吩以及氧雜蒽。優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雜芳基為5～20元雜芳基，5～10元芳基為特別優(yōu)選。
“烷雜芳基”是指其中結(jié)合到末端碳上一個(gè)氫原子被一個(gè)雜芳基取代的直鏈烷基、烯基、或炔基。優(yōu)選實(shí)施方案中，烷雜芳基基團(tuán)為6～26元烷雜芳基，即，烷雜芳基中的烷基、烯基或炔基為(C1～C6)，雜芳基為5～20元的雜芳基。特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烷雜芳基基團(tuán)為6～13元的烷雜芳基，即，其中的雜芳基為5～10元的雜芳基。
“取代后的烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、雜芳基或烷雜芳基”是指其中1個(gè)或多個(gè)氫原子被另一個(gè)取代基團(tuán)代替。優(yōu)選的取代基團(tuán)包括-OR、-SR、-NRR、-NO2、-CN、鹵素、-C(O)OR以及-C(O)NR，其中每個(gè)R都可以單獨(dú)為氫原子、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、雜芳基或烷雜芳基。
4.附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B是一個(gè)理想兩親性α-螺旋的Schiffer-Edmundson螺旋輪簡(jiǎn)圖，空心圓代表親水氨基酸殘基，陰影圓代表疏水氨基酸殘基。
圖1B是圖1A的理想兩親性螺旋的螺旋網(wǎng)狀圖。
圖1C是圖1A的理想兩親性螺旋的螺旋柱狀圖。
圖2A是結(jié)構(gòu)(I)所示核心肽的Schiffer-Edmundson螺旋輪簡(jiǎn)圖，該圖用來(lái)說(shuō)明螺旋的兩親性(空心圓代表親水氨基酸殘基，陰影圓代表疏水氨基酸殘基，部分陰影圓代表兩親性氨基酸殘基)。
圖2B是結(jié)構(gòu)(I)所示核心肽的螺旋網(wǎng)狀圖，該圖用來(lái)顯示螺旋的疏水面。
圖2C是結(jié)構(gòu)(I)所示核心肽的螺旋網(wǎng)狀圖，該圖用來(lái)顯示螺旋的親水面。
圖3A為螺旋網(wǎng)狀圖，用來(lái)顯示Segrest 18A肽的親水面(DWLKAFYDKVAEKLKEAF；SEQ ID NO244)。
圖3B為螺旋網(wǎng)狀圖，用來(lái)顯示典型核心肽210的親水面(PVLDLFRELLEELKQKLK；SEQ ID NO210)。
圖3C為螺旋網(wǎng)狀圖，用來(lái)顯示Segrest共有22聚體肽的親水面(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK；SEQ ID NO75)。
圖4A為螺旋網(wǎng)狀圖，用來(lái)顯示Segrest 18A肽的疏水面(SEQ IDNO244)。
圖4B為螺旋網(wǎng)狀圖，用來(lái)顯示典型核心肽210的疏水面(SEQ IDNO210)。
圖4C為螺旋網(wǎng)狀圖，用來(lái)顯示Segrest共有22聚體肽的疏水面(SEQ ID NO75)。
圖5A為Segrest 18A肽(SEQ ID NO244)的Schiffer-Edmundson螺旋輪簡(jiǎn)圖。
圖5B為典型核心肽210 SEQ ID NO210)Schiffer-Edmundson螺旋輪簡(jiǎn)圖。
圖6A顯示的是本發(fā)明的三級(jí)分枝網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
圖6B顯示的是本發(fā)明的四級(jí)分枝網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
圖6C顯示的是本發(fā)明的混合級(jí)分枝網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
圖6D顯示的是本發(fā)明的典型“Lys-樹(shù)”分枝網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
圖7A顯示了對(duì)于肽210(SEQ ID NO210)和Segrest共有22聚體肽(SEQ ID NO75)而言，實(shí)際觀察到的Hα化學(xué)位移與列表顯示的無(wú)規(guī)卷曲Hα化學(xué)位移之間的差異。
圖7B顯示了對(duì)于肽210(SEQ ID NO210)和Segrest共有22聚體肽(SEQ ID NO75)而言，實(shí)際觀察到的酰胺質(zhì)子化學(xué)位移與列表顯示的無(wú)規(guī)卷曲酰胺質(zhì)子化學(xué)位移之間的差異。
圖8A的卡通描繪出了用本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑可以得到的各種聚集形態(tài)以及肽-脂類(lèi)復(fù)合物。左圖描繪的是幾個(gè)肽螺旋相互作用得到肽的多聚化過(guò)程，以及在特定的肽濃度、pH和離子強(qiáng)度下引起寡聚體的形成。中圖肽(以這些聚集形態(tài)中的任一存在)與脂類(lèi)實(shí)體(例如SUVs)之間的相互作用能夠引起脂類(lèi)重組。右圖通過(guò)改變脂類(lèi)∶肽之間的摩爾比，可以得到不同類(lèi)型的肽-脂類(lèi)復(fù)合物，從低脂類(lèi)-肽摩爾比時(shí)的脂類(lèi)-肽共膠束，到隨著脂類(lèi)∶肽之間摩爾比的升高而形成的圓盤(pán)狀顆粒，直到最后形成大的多層復(fù)合物。
圖8B顯示的是特定脂類(lèi)∶肽比例范圍內(nèi)形成的圓盤(pán)狀肽-脂類(lèi)復(fù)合物的通常接受模式。沿圓盤(pán)周緣的每個(gè)肽都與其最臨近的兩個(gè)肽緊密接觸。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑模擬ApoA-I的功能和活性。它們能夠形成兩親性螺旋(脂類(lèi)存在)，結(jié)合脂類(lèi)，形成前-β-類(lèi)或HDL-類(lèi)復(fù)合物，活化LCAT，增加HDL級(jí)分的血清水平，以及促進(jìn)膽固醇的排出。所述肽的生物功能與它們的螺旋結(jié)構(gòu)，或者脂類(lèi)存在時(shí)向螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化有關(guān)。
本發(fā)明的可以采用穩(wěn)定大量或單位劑量形式來(lái)制備，例如，可以在體內(nèi)使用前重組合或重配制的凍干產(chǎn)物。本發(fā)明包括藥用制劑以及這類(lèi)制劑在治療高脂質(zhì)血癥、血膽脂醇過(guò)多、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化，以及能引起膿毒性休克的內(nèi)毒素性血癥等其他疾病。
用操作實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以說(shuō)明，這些實(shí)施例表明本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑能極其有效地活化LCAT從而促進(jìn)RCT。本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑在動(dòng)物模型體內(nèi)使用能導(dǎo)致血清HDL濃度的增加。
下面分部分對(duì)本發(fā)明做更為詳細(xì)的闡述，具體的各部分為ApoA-I肽激動(dòng)劑的組成和結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)和功能特征；大量或單位劑量制劑的制備方法；以及使用方法。
5.1.肽的結(jié)構(gòu)和功能通常，本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑是指脂類(lèi)存在時(shí)能形成兩親性α螺旋以及模擬ApoA-I活性的肽或其類(lèi)似物。該激動(dòng)劑的主要特征為由15～22氨基酸殘基，優(yōu)選由18個(gè)氨基酸殘基組成的“核心”肽，或者其類(lèi)似物，該類(lèi)似物肽鏈中至少1個(gè)酰胺鍵被另一種酰胺、酰胺同電子排列體或酰胺模擬物取代。
部分上，本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑以本申請(qǐng)人的下述意外發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)缺失和/或取代22聚體共有序列一級(jí)序列中的特定氨基酸殘基能夠生產(chǎn)出活性近似，一些實(shí)施方案甚至能超過(guò)原始ApoA-I活性的合成肽，上述22聚體共有序列的描述見(jiàn)Venkatachalapathi et al.，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，Indian Acad.Sci.B585-596(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK；SEQ ID NO75；下稱(chēng)″Segrest共有22聚體″or″共有22聚體″)，它是產(chǎn)生活性的關(guān)鍵部分。本發(fā)明一方面，缺失了共有22聚體中的4個(gè)氨基酸殘基，例如第14～17位殘基，形成了能活化LCAT的18聚體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，缺失了另外4個(gè)殘基。一些實(shí)施方案中，用Leu等疏水殘基取代產(chǎn)生活性的關(guān)鍵的3個(gè)帶電氨基酸殘基(Glu-5，Lys-9 andGlu-13)。
不受任一具體理論束縛，認(rèn)為本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑更精確地模擬了原始ApoA-I的兩親性螺旋區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能特性，該區(qū)域在影響脂類(lèi)結(jié)合、膽固醇排出和LCAT活化方面比現(xiàn)有技術(shù)中描述的ApoA-I模擬肽所形成的α螺旋更為關(guān)鍵，因此導(dǎo)致所述肽表現(xiàn)出比其他那些肽明顯高的類(lèi)ApoA-I活性。實(shí)際上，本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑中的大部分都接近，某些實(shí)施方案甚至超過(guò)了ApoA-I的活性，本發(fā)明描述的LCAT活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中描述的最佳的肽ApoA-I激動(dòng)劑模擬物--肽18AM4(EWLEAFYKKVLEKLKELF；SEQ IDNO246)(Corinjn et al.，1993，Biochim.Biophys.Acta 11708-16；Labeur et al.，Oct.1994，ArteriosclerosisAbstract Nos.186 and 187)和N-乙酰化，C-酰胺化肽18AM4(SEQ ID NO239)(Brasseur，1993，Biochim.Biophys.Acta 11701-7)--表現(xiàn)出的活性比ApoA-I的活性分別低4％和11％。
本發(fā)明的一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，組成本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑的核心肽(或其類(lèi)似物)具有下述結(jié)構(gòu)通式(I)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X1是Pro(P)，Ala(A)，Gly(G)，Asn(N)，Gln(Q)或D-Pro(P)；X2是脂肪族氨基酸；X3是Leu(L)；X4是酸性氨基酸；X5是Leu(L)或Phe(F)；X6是Leu(L)或Phe(F)；X7是一個(gè)堿性氨基酸；X8是一個(gè)酸性氨基酸；X9是Leu(L)或Trp(W)；X10是Leu(L)或Trp(W)；X11是一個(gè)酸性氨基酸或Asn(N)；X12是一個(gè)酸性氨基酸；X13是Leu(L)、Trp(W)或Phe(F)；X14是一個(gè)堿性氨基酸或Leu(L)；X15是Gln(Q)或Asn(N)；X16是一個(gè)堿性氨基酸；X17是Leu(L)，以及；X18是一個(gè)堿性氨基酸。
結(jié)構(gòu)(I)的核心肽部分按照氨基酸的指定類(lèi)別來(lái)定義。下面與結(jié)構(gòu)(I)的突變或改進(jìn)實(shí)施方案結(jié)合，提供各種指定類(lèi)別的定義。
結(jié)構(gòu)(I)的核心肽中，氨基酸殘基Xn之間的符號(hào)“-”通常代表骨架的基本連接功能。因此，符號(hào)“-”通常代表1個(gè)肽鍵或酰胺鍵(-C(Q)NH-)。但是，應(yīng)該理解的是本發(fā)明提供的肽類(lèi)似物中的一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵可任選被除酰胺之外的其他一種，優(yōu)選被一種取代酰胺或酰胺同電子排列體取代。因此，盡管結(jié)構(gòu)(I)中的各種Xn殘基通常用氨基酸來(lái)描述，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案用肽來(lái)舉例說(shuō)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到在具有非-酰胺鍵的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”或“殘基”是指其他帶有結(jié)構(gòu)與氨基酸側(cè)鏈近似的基團(tuán)的雙功能部分。
通常，取代酰胺包括，但不限于通式為-C(O)NR-，其中R為(C1-C6)烷基、取代(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代(C6-C26)烷芳基、5～20元雜芳基、取代5～20元雜芳基或6～26元烷雜芳基以及取代6～26元烷雜芳基。
酰胺的同電子排列體通常包括，但不限于-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(順式及反式)、-C(O)CH2-，-CH(OH)CH2-以及-CH～SO-。具有這類(lèi)非酰胺鍵的化合物以及制備這類(lèi)化合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(見(jiàn)，例如Spatola，March 1983，Vega Data Vol.1，Issue 3；Spatola，1983，氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)“肽骨架修飾”。Weinstein，ed.，Marcel Dekker，New York，p.267(綜述)；Morley，1980，Trends Pharm.Sci.1463-468；Hudsonet al.，1979，Int.J.Prot.Res.14177-185(-CH2NH-，-CH2CH2-)；Spatola et al.，1986，Life Sci.381243-1249(-CH2-S)；Hann，1982，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1307-314(-CH＝CH-，順式和反式)；Almquist et al.，1980，J.Med.Chem.231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White et al.，Tetrahedron.Lett.232533(-COCH2-)；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP 45665(1982)CA 9739405(-CH(OH)CH2-)；Holladay et al.，1983，Tetrahedron Lett.244401-4404(-C(OH)CH～-)；and Hruby，1982，Life Sci.31189-199(-CH～-S-)。
此外，可以用不明顯破壞所述肽結(jié)構(gòu)和活性的肽模擬(peptidomimetic)或酰胺模擬部分取代1個(gè)或多個(gè)酰胺鍵。合適的酰胺模擬部分的描述，例如，見(jiàn)Olson et al.，1993，J.Med.Chem.363039-3049。
結(jié)構(gòu)(I)核心肽的關(guān)鍵特征為它們能夠在存在脂類(lèi)的情況下形成一個(gè)兩親性α-螺旋。所謂的兩親性就是指所述α-螺旋具有沿其長(zhǎng)軸分布的相對(duì)的親水面和疏水面，即，該螺旋結(jié)構(gòu)的一個(gè)面主要是親水側(cè)鏈，而相對(duì)的面主要為疏水側(cè)鏈。圖1A和1B是一個(gè)典型的理想兩親性α-螺旋的相對(duì)親水和疏水面。圖1A是Schiffer-Edmundson螺旋輪簡(jiǎn)圖(Schiffer and Edmundson，1967，Biophys.J.7121-135)。在該輪中，螺旋的長(zhǎng)軸垂直于頁(yè)面。從N-末端開(kāi)始，連續(xù)的氨基酸殘基(用圓圈表示)以100度間隔沿圓的周?chē)史派錉钆帕?。因此，氨基酸殘基n+1與殘基n之間的夾角為100度，殘基n+2與殘基n+1之間的夾角為100度，依此類(lèi)推。100度的分布使得每圈有3.6個(gè)氨基酸殘基。圖1A中，所述螺旋的相對(duì)的親水面和疏水面清晰可見(jiàn)；親水氨基酸用空心圓表示，而疏水氨基酸殘基用陰影圓表示。
圖1B是圖1A的理想兩親性螺旋的螺旋網(wǎng)狀圖。(Lim，1978，F(xiàn)EBSLett.8910-14)。典型螺旋網(wǎng)狀圖中，α螺旋用一個(gè)已經(jīng)沿其親水面中線(xiàn)切開(kāi)并展平的圓柱體來(lái)表示。因此，通過(guò)該螺旋的疏水矩測(cè)定，所述疏水面的中心位于圖的中央，導(dǎo)向以致高出頁(yè)面的平面(Eisenberg等，1982，Nature 299371-374)。圖1C描繪的是切開(kāi)并展平前螺旋圓柱體的圖解。通過(guò)沿不同平面切開(kāi)圓柱體，可以觀察到同一兩親性螺旋的不同視圖，得到關(guān)于該螺旋特性的不同信息。
圖2給出的是脂類(lèi)存在情況下結(jié)構(gòu)(I)核心肽形成的α螺旋的兩親性實(shí)質(zhì)。圖2A是Schiffer-Edmundson螺旋輪簡(jiǎn)圖，圖2B代表的是說(shuō)明疏水面的螺旋網(wǎng)狀簡(jiǎn)圖，圖2C代表的是說(shuō)明親水面的螺旋網(wǎng)狀簡(jiǎn)圖。在圖2A、2B和2C中，親水殘基用空心圓表示，疏水殘基用陰影圓表示，兩親性殘基用部分陰影圓表示。下面將結(jié)合結(jié)構(gòu)(I)的改進(jìn)或突變形式進(jìn)行更完全的討論，可以用其他氨基酸殘基取代特定氨基酸殘基，從而使所述肽形成的螺旋的親水和疏水面可以不完全分別由親水和疏水氨基酸組成。因此，可以理解的是，當(dāng)談及本發(fā)明核心肽形成的兩親性α螺旋時(shí)，術(shù)語(yǔ)“親水面”是指具有全部網(wǎng)狀疏水特征的肽的表面。
不受任一具體理論束縛，可以認(rèn)為結(jié)構(gòu)(I)核心肽形成的兩親性螺旋的特定結(jié)構(gòu)和/或物理特性對(duì)于活性是重要的。這些特性包括兩親性程度，完全疏水性、平均疏水性、疏水和親水角度、疏水矩、平均疏水矩、以及α螺旋的凈電荷。
圖2A的螺旋輪狀簡(jiǎn)圖提供的是觀察結(jié)構(gòu)(I)核心肽兩親性實(shí)質(zhì)的便利方式，通過(guò)計(jì)算螺旋的疏水矩可以方便地對(duì)兩親性程度(疏水性不對(duì)稱(chēng)程度)定量。用于計(jì)算特定肽序列μH的方法是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并在文獻(xiàn)中有描述，例如，Eisenberg，1984，Ann.Rev.Biochem.53595-623。對(duì)于一種具體肽獲得的真實(shí)μH取決于組成肽的氨基酸的總數(shù)。因此，直接比較不同長(zhǎng)度肽的μH通常不能提供有用信息。
可以用平均疏水矩(<μH>)對(duì)不同長(zhǎng)度肽的兩親性進(jìn)行比較。μH除以螺旋中的殘基數(shù)目(即，<μH>＝μH/N)可以得到平均疏水矩。通常，用Eisenberg(Eisenberg，1984，J.Mol.Biol.179125-142)的標(biāo)準(zhǔn)化共有疏水秤(scale)測(cè)定時(shí)，<μH>為0.55～0.65的核心肽被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，優(yōu)選<μH>為0.58～0.62。
通過(guò)求出肽中每個(gè)氨基酸參加疏水性的代數(shù)和(即，貼原文第31頁(yè)第17行的公式)，可以方便地計(jì)算出肽的完全或全部疏水性(Ho)。平均疏水性(<Ho>)為疏水性除以氨基酸殘基的數(shù)目(即，<Ho>＝Ho/N)。通常，用Eisenberg(Eisenberg，1984，J.Mol.Biol.179125-142)的標(biāo)準(zhǔn)化共有疏水秤測(cè)定時(shí)，平均疏水性為-0.150～-0.070的核心肽被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，優(yōu)選平均疏水性為-0.130～-0.050。
通過(guò)求出落于疏水角中疏水氨基酸殘基疏水性的總和，可以得到兩親性螺旋疏水面的完全疏水性(HoPho)(即，貼原文第32頁(yè)第1行的公式，其中Hi與上述定義相同，NH為疏水面中疏水氨基酸的總數(shù))。疏水面的平均疏水性<HoPho>為HoPho/NH，其中NH的定義同上。通常，用Eisenberg(Eisenberg，1984，上述；Eisenberg et al.，1982，上述)的標(biāo)準(zhǔn)化共有疏水秤測(cè)定時(shí)，<HoPho>為0.90～1.20的核心肽被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，優(yōu)選<HoPho>為0.950～1.10。
疏水角(pho角)通常定義為當(dāng)肽以Schiffer-Edmundson螺旋輪顯示形式排列時(shí)，最長(zhǎng)的連續(xù)疏水氨基酸殘基串形成的角度或弧度(即，輪上的鄰接疏水殘基數(shù)目乘以20°)。親水角(phi角)為360°與pho角之間的差值(即，360°-pho角)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到pho和phi角部分取決于肽上的氨基酸殘基的數(shù)目。例如，參照?qǐng)D5A和5B，可以看出只有18個(gè)氨基酸適合沿Schiffer-Edmundson螺旋輪環(huán)繞一周。較少的氨基酸會(huì)在輪上留下缺口；更多的氨基酸則導(dǎo)致輪的特定位置2個(gè)以上的氨基酸殘基占據(jù)。
當(dāng)肽中含有多于18個(gè)氨基酸殘基時(shí)，“連續(xù)”疏水氨基酸殘基串意味著，被2個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的沿輪分布的至少1個(gè)氨基酸殘基是疏水氨基酸。
典型地，由18個(gè)或更少氨基酸組成的pho角為120°～160°的核心肽屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，優(yōu)選pho角為130°～150°。典型地，含多于18個(gè)氨基酸的實(shí)施方案的pho角為160°～220°，優(yōu)選180°～200°。
圖3和4對(duì)結(jié)構(gòu)(I)核心肽的特定結(jié)構(gòu)和/或物理特性做了說(shuō)明。圖3B給出的是本發(fā)明典型核心肽，肽210的螺旋網(wǎng)狀簡(jiǎn)圖，顯示了沿螺旋親水面的電荷分布。圖3B中，螺旋圓柱體被沿疏水面的中央切開(kāi)并展平。取代Segrest共有22聚體中親水殘基的3個(gè)疏水Leu(L)殘基(殘基5、9和13)(圖3C)用陰影來(lái)表示。從圖3B中可以看出，正電荷氨基酸殘基成簇于螺旋的最后一個(gè)C-末端圈(C-末端是指頁(yè)面的頂端)。不受具體理論的束縛，可以認(rèn)為這個(gè)C-末端的堿性氨基酸簇(殘基14、16和18)通過(guò)電荷(NH3+)-螺旋偶極靜電相互作用使穩(wěn)定該螺旋。也可以認(rèn)為穩(wěn)定是通過(guò)賴(lài)氨酸側(cè)鏈和螺旋核心之間的疏水作用而發(fā)生的(見(jiàn)，Groebke et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1140.25-40.29；Esposito et al.，1997，Biopolymers4127-35)。
除正電荷的C-末端簇(殘基14、16和18)外，負(fù)電荷分布在親水面的其余部分，每圈上有至少1個(gè)負(fù)電荷(酸性)氨基酸殘基，導(dǎo)致沿螺旋親水面形成一連串負(fù)電荷。
圖4B給出的是用來(lái)說(shuō)明典型核心肽210(SEQ ID NO210)形成的兩親螺旋疏水面的螺旋網(wǎng)狀簡(jiǎn)圖。圖4B中，螺旋圓柱體沿親水面中央切開(kāi)并展平。該核心肽的疏水面由每圈上的2個(gè)疏水殘基組成，最后的C-末端圈除外，其中主要為堿性氨基酸。NMR實(shí)驗(yàn)表明類(lèi)似的22聚體肽(PVLDLFRELLNELLEALKQKLK；SEQ ID NO4)的第3、6、9和10位氨基酸殘基在該螺旋的N-末端附近形成了一個(gè)疏水簇。Phe-6位于該簇的中心，在穩(wěn)定該疏水簇方面起重要作用。
不受具體理論的束縛，可以認(rèn)為由殘基3、6、9和10形成的疏水簇能夠明顯地影響脂類(lèi)結(jié)合和LCAT活性。兩親性肽被認(rèn)為是通過(guò)通過(guò)將它們疏水面對(duì)準(zhǔn)脂類(lèi)部分的烷基鏈來(lái)結(jié)合脂類(lèi)的。因此，認(rèn)為這種高度疏水簇導(dǎo)致了本發(fā)明核心肽所觀察到的強(qiáng)的脂類(lèi)親和力。由于結(jié)合脂類(lèi)是LCAT活化的先決條件，所以可以認(rèn)為這種疏水簇對(duì)于LCAT的活化也是必不可少的。
常?？梢园l(fā)現(xiàn)，芳香族殘基在將肽和蛋白質(zhì)錨向脂類(lèi)中發(fā)揮重要作用(De Kruijff，1990，Biosci.Rep.10127-130；O’Neil andDe Grado，1990，Science 250645-651；Blondelle et al.，1993，Biochim.Biophys.Acta 1202331-336)。因此，可以進(jìn)一步認(rèn)為位于疏水簇中心的Phe-6也在將結(jié)構(gòu)(I)核心肽錨向脂類(lèi)中發(fā)揮重要作用。
本發(fā)明核心肽和脂類(lèi)之間的相互作用導(dǎo)致形成肽-脂類(lèi)復(fù)合物。如圖8A中所示，得到的復(fù)合物的類(lèi)型(共膠束(comicelles)、圓盤(pán)、囊泡或多層)取決于脂類(lèi)∶肽摩爾比，通常在低脂類(lèi)∶肽摩爾比時(shí)形成共膠束，并隨著脂類(lèi)∶肽摩爾比的增加形成圓盤(pán)狀以及囊泡狀或多層復(fù)合物。這種特性在兩親性肽(Epand，The Amphipathic Helix，1993)和ApoA-I(Jones，1992，Structure and Function ofApolipoproteins，Chapter 8，pp.21？250)中做了描述。脂類(lèi)∶肽摩爾比還決定著該復(fù)合物的大小和組成(見(jiàn)，Section 5.3.1，上述)。
結(jié)構(gòu)(I)核心肽形成的α螺旋的長(zhǎng)軸具有完整曲線(xiàn)形狀。在典型的兩親性螺旋中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)親水和疏水面的氫鍵的長(zhǎng)度不同使得該螺旋疏水側(cè)為凹形(Barlow and Thornton，1988，J.Mol.Biol.201601-619；Zhou et al.，1992，J.Am.Chem.Soc.331117411183；Gesell et al.，1997，J.Biomol.NMR 9127-135)。不受理論束縛，可以認(rèn)為該螺旋疏水面的完整曲線(xiàn)在結(jié)合圓盤(pán)狀復(fù)合物中起重要作用--曲線(xiàn)螺旋可以使得肽能沿圓盤(pán)顆粒邊緣更好地吻合，從而增強(qiáng)了肽-圓盤(pán)復(fù)合物的穩(wěn)定性。
在普遍接受的ApoA-I結(jié)構(gòu)模型中，兩親性α螺旋包裹在圓盤(pán)狀HDL的邊緣(見(jiàn)圖8B)。該模型中，該螺旋被設(shè)想為按它們疏水面對(duì)準(zhǔn)脂類(lèi)酰基側(cè)鏈的方式排列的(Brasseur et al.，1990，Biochim.Biophys.Acta 1043245-252)。所述螺旋以反向平行的方式排列，螺旋的協(xié)同效應(yīng)被認(rèn)為對(duì)穩(wěn)定圓盤(pán)狀HDL復(fù)合物起作用(Brasseuret al.，上述)?，F(xiàn)已提出對(duì)穩(wěn)定HDL圓盤(pán)狀復(fù)合物起作用的一個(gè)因素是，酸性和堿性殘基間存在的離子作用導(dǎo)致在鄰接的反向平行螺旋上的殘基之間形成分子間鹽橋或氫鍵。該模型中，肽并非已單獨(dú)的完整形式存在，而是與至少2個(gè)其他相鄰肽分子之間相互作用(圖8B)。
通?？梢越邮艿倪€有，分別位于螺旋i和i+3位上的酸性和堿性殘基之間形成的分子內(nèi)氫鍵或鹽橋可以穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)(Marqusee etal.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(24)8898-8902)。位于第7位殘基上的一個(gè)正電荷通過(guò)與一個(gè)酸性殘基形成一個(gè)轉(zhuǎn)角來(lái)發(fā)揮穩(wěn)定螺旋的作用。
因此，結(jié)構(gòu)(I)核心肽的另一個(gè)關(guān)鍵特性是當(dāng)這些肽的疏水面對(duì)準(zhǔn)同一方向，以反向平行方式排列時(shí)，它們彼此間形成分子間氫鍵的能力，例如這樣一種情況，當(dāng)肽結(jié)合到脂類(lèi)上時(shí)，它們也能在螺旋的N-端或C-端形成分子間氫鍵或鹽橋。可以認(rèn)為當(dāng)結(jié)構(gòu)(I)核心肽以反向平行方式結(jié)合到脂類(lèi)上時(shí)，它們緊密包裹以及離子間作用形成分子內(nèi)和/或分子間鹽橋和/或氫鍵的能力是本發(fā)明核心肽的一個(gè)重要特性。
脂類(lèi)缺乏時(shí)核心肽也能形成良好的分子間肽-肽相互作用。本發(fā)明核心肽自身-聯(lián)合部分起因于它們的高<μH>、<Ho>和疏水角(見(jiàn)，表1，上述)。自身聯(lián)合現(xiàn)象取決于pH、肽濃度以及離子強(qiáng)度，能夠形成幾種聯(lián)合狀態(tài)，從單體到幾個(gè)多聚體形式(圖10A)。肽疏水核心的聚集有利于它們與脂類(lèi)的結(jié)合。在肽聚集體的核心也發(fā)生肽-肽作用，并能同脂類(lèi)-肽作用之間競(jìng)爭(zhēng)。
除上述特性外，其他參數(shù)對(duì)于產(chǎn)生活性也是重要的，包括疏水殘基的總數(shù)，帶電殘基的總數(shù)以及肽的凈電荷。
下面表1中概括了結(jié)構(gòu)(I)核心肽優(yōu)選的物理和結(jié)構(gòu)特性
表1優(yōu)選的結(jié)構(gòu)(I)Apo-I激動(dòng)劑的物理特性
本發(fā)明核心肽形成的兩親性α螺旋的特性明顯不同于A類(lèi)兩親性α螺旋，特別不同于Segrest的18A和共有22聚體肽的A類(lèi)α螺旋。具體的是，與18A肽(SEQ ID NO244)和共有22-聚體(SEQ ID NO75)相比，肽210(SEQ ID NO210)中的第9和13位殘基(圖4B中的陰影部分)是疏水Leu(L)殘基。Segrest的18A和共有22聚體肽中的這兩個(gè)帶電殘基被疏水Leu(L)殘基取代導(dǎo)致該螺旋的兩親性、疏水性、pho角、以及其他特性發(fā)生顯著變化。
下面的表2對(duì)肽210(SEQ ID NO210)與Segrest的18A肽(SEQ ID NO244)和共有22聚體肽(SEQ ID NO75)的物理和結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行了比較
表2例舉核心肽210(SEQ ID NO210)與Segrest的共有22聚體肽(SEQ ID NO75)和18A肽(SEQ ID NO244)之間特性的比較
特性的不同導(dǎo)致活性的明顯差異。在本發(fā)明描述的實(shí)驗(yàn)中，與原始ApoA-I相比，Segrest的18A肽(SEQ ID NO244)和共有22聚體肽(SEQ ID NO75)只分別表現(xiàn)出5％和10％的LCAT活性，而同一實(shí)驗(yàn)中與原始ApoA-I相比，肽210(SEQ ID NO210)表現(xiàn)出46％的活性。同一實(shí)驗(yàn)中，肽210的N-末端乙酰化并且C-末端酰胺化形式的肽193(SEQ ID NO1-93)表現(xiàn)出96％的LCAT活性。
結(jié)構(gòu)(I)核心肽中特定氨基酸殘基可以被其他氨基酸殘基取代，而不明顯破壞，多數(shù)情況下甚至能增強(qiáng)肽的活性。因此，本發(fā)明還提供了結(jié)構(gòu)(I)核心肽的改良或突變形式，其中該結(jié)構(gòu)中最后1個(gè)限定的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代。影響本發(fā)明核心肽的一個(gè)關(guān)鍵特征是，它們能夠在存在脂類(lèi)時(shí)形成α螺旋，表現(xiàn)出兩親性和其他上述特性，從本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中可以看出，氨基酸取代是保守性的，即，取代氨基酸殘基的物理和化學(xué)特性近似于被取代氨基酸殘基。
為了測(cè)定保守的氨基酸取代，可以方便地把氨基酸分為兩種主要類(lèi)別--親水和疏水--主要依據(jù)氨基酸側(cè)鏈的理化特性。這兩種主要類(lèi)別可以進(jìn)一步分為能更清楚限定氨基酸側(cè)鏈特性的亞類(lèi)。例如，親水氨基酸可以進(jìn)一步再分為酸性、堿性及極性氨基酸。疏水氨基酸可以進(jìn)一步再分為非極性和芳香族氨基酸。限定結(jié)構(gòu)(I)的氨基酸各種類(lèi)別的定義如下“親水氨基酸”是指根據(jù)Eisenberg et al.，1984，J.Mol.Biol.179125-142中標(biāo)準(zhǔn)化共有疏水秤測(cè)定結(jié)果疏水性小于零的氨基酸。遺傳學(xué)編碼的親水氨基酸包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。
“酸性氨基酸”是指?jìng)?cè)鏈pK值小于7的親水氨基酸。典型地，由于氫離子的丟失，在生理pH值下酸性氨基酸具有帶負(fù)電的側(cè)鏈。遺傳學(xué)編碼的酸性氨基酸包括Glu(E)和Asp(D)。
“堿性氨基酸”是指?jìng)?cè)鏈pK值大于7的親水氨基酸。典型地，由于氫離子的結(jié)合，在生理pH值下堿性氨基酸具有帶正電的側(cè)鏈。遺傳學(xué)編碼的堿性氨基酸包括His(H)、Arg(R)和Lys(K)。
“極性氨基酸”是指生理pH值下具有不帶電側(cè)鏈的親水氨基酸，但具有至少1個(gè)這樣的鍵，即其中被兩個(gè)原子共同分享的電子對(duì)更靠近其中的一個(gè)原子。遺傳學(xué)編碼的極性氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水氨基酸”是指根據(jù)Eisenberg et al.，1984，J.Mol.Biol.179125-142中標(biāo)準(zhǔn)化共有疏水秤測(cè)定結(jié)果疏水性大于零的氨基酸。遺傳學(xué)編碼的疏水氨基酸包括Pro(P)、Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)和Tyr(Y)。
“芳香族氨基酸”是指?jìng)?cè)鏈上具有至少1個(gè)芳香或雜合芳香環(huán)的疏水氨基酸。所述芳香或雜合芳香環(huán)可以包括1個(gè)或多個(gè)取代基，例如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中每個(gè)R都是獨(dú)立的(C1-C6)烷基、取代(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代(C6-C26)烷芳基、5～20元雜芳基、取代5～20元雜芳基或6～26元烷雜芳基以及取代6～26元烷雜芳基。遺傳學(xué)編碼的芳香族氨基酸包括Phe(F)、Tyr(y)和Trp(W)。
“非極性氨基酸”是指生理pH值下具有不帶電側(cè)鏈的親水氨基酸，但具有至少1個(gè)這樣的鍵，即其中被兩個(gè)原子共同分享的電子對(duì)通常被這兩個(gè)原子同等程度地?fù)碛?即側(cè)鏈?zhǔn)欠菢O性的)。遺傳學(xué)編碼的非極性氨基酸包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。
“脂肪族氨基酸”是指具有一個(gè)脂肪族碳水化合物側(cè)鏈的疏水氨基酸。遺傳學(xué)編碼的脂肪族氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。
氨基酸殘基Cys(C)的特別指出就在于它能與其他Cys(C)或其他含磺?；?sulfanyl)的氨基酸形成二硫鍵。Cys(C)殘基(或其他帶有側(cè)鏈的含-SH氨基酸)以還原態(tài)自由-SH或氧化態(tài)二硫鍵形式存在的能力能夠影響Cys(C)殘基是否會(huì)賦予肽疏水或親水特性。根據(jù)Eisenberg(Eisenberg，1984，上述)標(biāo)準(zhǔn)化共有疏水秤測(cè)定結(jié)果當(dāng)Cys(C)疏水性為0.29時(shí)，不管上述的常規(guī)分類(lèi)如何，按照本發(fā)明Cys(C)都應(yīng)該被歸類(lèi)為極性氨基酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，上述分類(lèi)并不互斥。因此，表現(xiàn)出兩種或多種理化特性的帶側(cè)鏈氨基酸可以分入多個(gè)類(lèi)別中。例如，帶有另外被極性取代基取代的芳香族基團(tuán)的氨基酸，如Tyr(Y)可以表現(xiàn)出芳香族疏水特性以及極性或親水特性，并因此可以歸入芳香族或極性?xún)煞N類(lèi)別。任一種氨基酸的準(zhǔn)確分類(lèi)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的，尤其鑒于本發(fā)明提供的詳細(xì)內(nèi)容。
稱(chēng)為“螺旋破壞”殘基的特定氨基酸殘基當(dāng)它們被包含在螺旋的內(nèi)部時(shí)，能夠破壞α螺旋的結(jié)構(gòu)。具有螺旋破壞特性的氨基酸殘基是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見(jiàn)，例如，Chou和Fasman，Ann.Rev.Biochem.47251-276)，包括Pro(P)、Gly(G)以及潛在的所有D-氨基酸(當(dāng)它們包括在L-肽中時(shí)，相反，當(dāng)包括在D-肽中時(shí)，L-氨基酸則會(huì)破壞螺旋結(jié)構(gòu))。雖然這些螺旋破壞氨基酸殘基可以歸入上述類(lèi)別，但是這些殘基不能用于取代螺旋內(nèi)部的殘基--它們只能用于取代肽N-末端和/或C-末端1～3個(gè)氨基酸殘基。
盡管上述類(lèi)別已經(jīng)按照遺傳學(xué)編碼氨基酸例舉出來(lái)，但是氨基酸取代物不需，特定實(shí)施方案優(yōu)選不限于遺傳學(xué)編碼氨基酸。事實(shí)上，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)(I)肽中的多數(shù)包含遺傳學(xué)非-編碼氨基酸。因此，除天然生成的遺傳學(xué)編碼氨基酸外，結(jié)構(gòu)(I)核心肽中的氨基酸殘基可以被天然生成的非-編碼氨基酸以及合成氨基酸所取代。
可以為結(jié)構(gòu)(I)核心肽提供有用取代的特定常見(jiàn)氨基酸包括，但不限于，β-丙氨酸(β-Ala)以及其他Ω-氨基酸，例如3-丙氨酸，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等；α-氨基異丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鳥(niǎo)氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(tBuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))；3-巰基纈氨酸(Pen)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；亞砜甲硫氨酸(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰賴(lài)氨酸(AcLys)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；對(duì)氨苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)，高苯基丙氨酸(hPhe)以及高絲氨酸(hSer)；羥脯氨酸(Hyp)，高脯氨酸(hPro)，N-甲基化氨基酸以及peptoids(N-取代甘氨酸)。
根據(jù)上述類(lèi)別，對(duì)遺傳學(xué)編碼以及常見(jiàn)非編碼氨基酸的分類(lèi)概括于下列表III中。應(yīng)該理解的是，表III只是用于說(shuō)明，而并非為了窮舉可以用于取代本發(fā)明所述核心肽的所有氨基酸。根據(jù)本發(fā)明提供的定義，本發(fā)明中未特別提及的其他氨基酸可以按照它們表現(xiàn)出的理化特性容易地進(jìn)行分類(lèi)。
表III常見(jiàn)氨基酸的分類(lèi)
盡管多數(shù)情況下，結(jié)構(gòu)(I)核心肽氨基酸被L-對(duì)映結(jié)構(gòu)體氨基酸取代，但是這種取代并不限于L-對(duì)映結(jié)構(gòu)體氨基酸。因此，下述情況也應(yīng)被包括在“突變”或“改良”形式的定義中至少1個(gè)L-氨基酸被一個(gè)同一D-氨基酸取代(例如，L-Arg→D-Arg)或者被同一類(lèi)別或同一亞類(lèi)中的D-氨基酸取代(例如，L-Arg→D-Lys)，而且反之亦然。實(shí)際上，在適宜受試動(dòng)物口服的實(shí)施方案中，所述肽可以有利地至少包括1個(gè)D-對(duì)映結(jié)構(gòu)體氨基酸。含此類(lèi)氨基酸的肽在口腔、胃或血清中比完全由L-氨基酸組成的肽更穩(wěn)定。
如上所述，當(dāng)D-氨基酸位于α螺旋L-肽內(nèi)部時(shí)，往往能破壞α螺旋的結(jié)構(gòu)。因此，不能用D-氨基酸取代內(nèi)部的L-氨基酸；D-氨基酸取代應(yīng)該僅限于肽的N-末端和/或C-末端的1～3個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選，用D-氨基酸只取代N-和/或C-末端氨基酸。
用上述氨基酸類(lèi)別結(jié)合結(jié)構(gòu)(I)核心肽的Schiffer-Edmundson螺旋輪或螺旋網(wǎng)簡(jiǎn)圖，以及本發(fā)明提供的預(yù)期特性的詳細(xì)描述，可以容易地制備出基本保留螺旋兩親性及其他特性的結(jié)構(gòu)(I)核心肽的改良或突變形式，這些形式都屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)固定親水或疏水氨基酸，以及用另一個(gè)氨基酸取代至少1個(gè)氨基酸，優(yōu)選保守取代，即用屬于同一類(lèi)別或亞類(lèi)的另一氨基酸取代，可以獲得結(jié)構(gòu)(I)核心肽的改良或突變形式。也可以根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)固定組成堿性和/或疏水簇的殘基，以及取代至少1個(gè)非固定殘基，優(yōu)選保守取代。
另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)固定位于螺旋親水面中的親水氨基酸，以及用另一個(gè)氨基酸取代至少1個(gè)非固定氨基酸殘基，優(yōu)選用屬于同一類(lèi)別或亞類(lèi)的另一氨基酸取代，可以獲得結(jié)構(gòu)(I)核心肽的改良或突變形式。從圖2A中可以看出，殘基1、4、7、8、11、12、14、15和18位于結(jié)構(gòu)(I)核心肽形成的兩親性螺旋親水面的內(nèi)部。除殘基1既可以是親水性也可以是疏水性外，上述這些殘基都是親水性的。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)，殘基4、7、8、11、12、14、15和18是固定的，而且殘基1、2、3、5、6、9、10、13、16和17中至少有1個(gè)被屬于同一類(lèi)別，優(yōu)選屬于同一亞類(lèi)的另一個(gè)氨基酸取代。替代地，也可以根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)固定殘基1而且殘基2、3、5、6、9、10、13、16和17中至少1個(gè)被取代。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，也可以根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)固定C-末端堿性簇(殘基14、16和18)，而且只有殘基2、3、5、6、9、10、13和/或17被取代。
還有另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以把堿性和疏水簇二者都固定，而且只有殘基2、5、13和/或17被取代。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)固定位于螺旋疏水面中的疏水氨基酸殘基，以及用另一個(gè)氨基酸取代至少1個(gè)非固定氨基酸殘基，優(yōu)選用屬于同一類(lèi)別或亞類(lèi)的另一氨基酸取代，可以獲得本發(fā)明核心肽的改良或突變形式。
從圖2A中可以看出，殘基2、3、5、6、9、10、13、16和17位于疏水面中。除殘基16是親水性氨基酸外，這些殘基都是疏水性的。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)固定殘基2、3、5、6、9、10、13和17，而且殘基1、4、7、8、11、12、14、15、16和18中至少有1個(gè)被另一氨基酸殘基取代，優(yōu)選被屬于同一類(lèi)別或同一亞類(lèi)的另一個(gè)氨基酸取代。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，也可以根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)固定C-末端堿性簇(殘基14、16和18)，而且只有殘基1、4、7、8、11、12和/或15被取代。
另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)固定位于螺旋疏水或親水面中的所有氨基酸殘基，以及用另一個(gè)氨基酸取代位于另一面中的至少1個(gè)氨基酸，可以獲得結(jié)構(gòu)(I)肽的改良或突變形式。也可以按照上述討論根據(jù)結(jié)構(gòu)(I)任選地固定組成疏水簇和/或堿性簇的殘基。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用一個(gè)非保守氨基酸取代至少1個(gè)氨基酸，得到結(jié)構(gòu)(I)的改良或突變形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到這類(lèi)取代應(yīng)該基本上不改變上述螺旋的兩親性和/或結(jié)構(gòu)特性，下文。因此，在特定實(shí)例中，可以期望取代1個(gè)或多個(gè)氨基酸對(duì)從而保持該螺旋的基本特性(net properties)。列于表X(見(jiàn)，Section 8.3，下文)中的肽序列為適當(dāng)?shù)陌被崛〈峁┝肆硗獾闹笇?dǎo)。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)(I)核心肽N-末端和/或C-末端的前1～4個(gè)氨基酸殘基被已知能賦予α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或者1段或或多段肽節(jié)段(“末端加帽”殘基或節(jié)段)取代。這類(lèi)末端加帽殘基和節(jié)段是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見(jiàn)，例如，Richardson and Richardson，1988，Science 2401648-1652；Harper et al.，1993，Biochemistry 32(30)7605-7609；Dasgupta and Bell，1993，Int.J.Peptide Protein Res.41499-511；Seale et al.，1994，Protein Science 31741-1745；Doig et al.，1994，Biochemistry 333396-3403；Zhou et al.，1994，Proteins 181-7；Doig and Baldwin，1995，Protein Science41325-1336；Odaert et al.，1995，Biochemistry3412820-12829；Petrukhov et al-，1996，Biochemistry 35387397；Doiget al.，1997，Protein Science 6147-155)。替代地，可以用模擬末端加帽參加或節(jié)段結(jié)構(gòu)和/或特性的肽模擬基元取代結(jié)構(gòu)(I)N-末端和/或C-末端的前1～4個(gè)氨基酸殘基。合適的末端加帽基元是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且在文獻(xiàn)中已有描述，例如，Richardsonand Richardson，1988，Science 24016481652；Harper et al.，1993，Biochemistry 32(30)7605-7609；Dasgupta and Bell，1993，Int.J.Peptide Protein Res.41499511；Seale et al.，1994，Protein Science 31741-1745；Doig et al.，1994，Biochemistry333396-3403；Zhou et al.，1994，Proteins 181-7；Doig andBaldwin，1995，Protein Science 41325-1336；Odaert et al.，1995，Biochemistry 3412820-12829；Petrukhov et al.，1996，Biochemistry 35387-397；Doig et al.，1997，Protein Science6147-155)。
盡管結(jié)構(gòu)(I)包括18個(gè)氨基酸殘基的位置，但是可以理解本發(fā)明核心肽可以包括少于18個(gè)的氨基酸殘基。實(shí)際上，包括少至14～15個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)(I)截短或內(nèi)部缺失形式基本保留了結(jié)構(gòu)(I)核心肽所形成螺旋的全部特征或特性，這些形式屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
通過(guò)缺失結(jié)構(gòu)(I)N-末端和/或C-末端的1個(gè)或多個(gè)氨基酸，可以獲得結(jié)構(gòu)(I)肽的截短形式。通過(guò)缺失位于結(jié)構(gòu)(I)肽內(nèi)部的1個(gè)或多個(gè)氨基酸，可以獲得結(jié)構(gòu)(I)肽的內(nèi)部缺失形式。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到缺失結(jié)構(gòu)(I)核心肽1個(gè)內(nèi)部氨基酸可以導(dǎo)致該螺旋親水-疏水交界的幾何平面在缺失點(diǎn)旋轉(zhuǎn)100度。由于這類(lèi)旋轉(zhuǎn)能明顯地改變所得螺旋的兩親特性，所以在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中缺失氨基酸以便基本保持親水-疏水交界的幾何平面沿螺旋的整個(gè)長(zhǎng)軸排列。
通過(guò)下述操作可以方便地實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)缺失足夠數(shù)目的連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基使得1個(gè)完整螺圈被缺失。理想α螺旋每圈包括3.6個(gè)殘基。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，成組缺失了3～4個(gè)連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基。是缺失3個(gè)氨基酸還是4個(gè)，這取決于被缺失的第1個(gè)殘基在螺旋中的位置。從一個(gè)兩親性螺旋中任一特定起始點(diǎn)測(cè)定一個(gè)完整螺圈所包括連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基的確切數(shù)目的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
由于結(jié)構(gòu)(I)核心肽C-末端堿性簇在穩(wěn)定螺旋方面推定重要性，以及疏水簇在影響脂類(lèi)結(jié)合和LCAT活性方面的重要性，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，未缺失組成堿性簇和疏水簇的殘基。因此，優(yōu)選實(shí)施方案中，殘基14、16和18(堿性簇)以及殘基3、6、9和10(疏水簇)未被缺失。
也可以用另外的氨基酸殘基在一端或兩端或者內(nèi)部擴(kuò)展結(jié)構(gòu)(I)核心肽，這些殘基基本不破壞，某些實(shí)施方案甚至能增強(qiáng)，所述肽的結(jié)構(gòu)和/或功能特性。實(shí)際上，擴(kuò)展后的包括多達(dá)19、20、21、22或更多個(gè)氨基酸殘基的核心肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，這類(lèi)擴(kuò)展后的肽基本保留了結(jié)構(gòu)(I)核心肽的基本兩親性以及其他特性。當(dāng)然，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到在內(nèi)部添加氨基酸將會(huì)以類(lèi)似于上述內(nèi)部缺失的方式在插入點(diǎn)旋轉(zhuǎn)螺旋親水-疏水交界的幾何平面。因此，與內(nèi)部缺失有關(guān)的上述討論也適用于內(nèi)部添加。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在核心肽的N-末端和/或C-末端擴(kuò)展至少1個(gè)螺圈。優(yōu)選地，這類(lèi)擴(kuò)展能穩(wěn)定脂類(lèi)存在時(shí)的螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如上述末端加帽氨基酸和節(jié)段。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在結(jié)構(gòu)(I)核心肽C-末端擴(kuò)展單個(gè)堿性氨基酸殘基，優(yōu)選Lys(K)。
另外屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)的還有ApoA-I激動(dòng)劑的“封閉”形式，即，這種形式的ApoA-I激動(dòng)劑的N-和/或C-末端被一個(gè)能與N-末端-NH2或C-末端-C(O)OH反應(yīng)的基團(tuán)封閉?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)除去本發(fā)明含18或更少個(gè)氨基酸殘基的ApoA-I激動(dòng)劑N-和/或C-末端電荷(通過(guò)合成N--酰化肽氨化物/酯/酰肼/醇類(lèi)及其取代物)能夠得到近似于，某些實(shí)施方案中甚至超過(guò)該激動(dòng)劑未封閉形式活性的激動(dòng)劑。例如，與原始ApoA-I相比，肽210(SEQ ID NO21O)表現(xiàn)出46％的LCAT活性，但是這種肽的N-末端和C-末端封閉形式肽193(SEQ IDNO193)在同一實(shí)驗(yàn)中卻表現(xiàn)出96％的LCAT活性。一些含22個(gè)氨基酸的實(shí)施方案中，封閉N-或C-末端能夠得到活性低于未封閉形式的ApoA-I激動(dòng)劑。但是，將含22個(gè)氨基酸的ApoA-I激動(dòng)劑N-和C-末端都封閉則有望保持原有活性。因此，在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含18個(gè)或更少氨基酸的核心肽，封閉N-末端和/或C-末端(優(yōu)選兩端都封閉)，但是含多于18個(gè)氨基酸的肽的N-和C-末端則都要封閉或者都不封閉。典型的N-末端封閉集團(tuán)包括RC(O)-，其中R是-H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、5～20元雜芳基或6～26元烷雜芳基。優(yōu)選的N-末端封閉基團(tuán)包括乙?；?、甲酰基和丹?；?。典型的C-末端封閉基團(tuán)包括C(O)NRR和-C(O)OR，其中的每個(gè)R如上述單獨(dú)定義。優(yōu)選的C-末端封閉基團(tuán)包括其中的每個(gè)R都單獨(dú)為甲基的基團(tuán)。不受任一特定理論束縛，可以認(rèn)為這類(lèi)末端封閉基團(tuán)可以在存在脂類(lèi)時(shí)穩(wěn)定α螺旋(見(jiàn)，例如，Venkatachelapathi et al.，1993，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能和遺傳學(xué)15349-359)。
ApoA-I的原始結(jié)構(gòu)中含8個(gè)螺旋單元，這些螺旋單元協(xié)同結(jié)合脂類(lèi)(Nakagawa et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.10770877092；Anantharamaiah et al.，1985，J.Biol.Chem.2601024810262；Vanloo et al.，1991，J.Lipid Res.321253-1264；Mendez etal.，1994，J.Clin.Invest.941698-).705；Palgunari et al.，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16328-338；Demooret al.，1996，Eur.J.Biochem.23974-84)。因此，本發(fā)明還包括由本發(fā)明所述核心肽二聚體、三聚體、四聚體以及更高級(jí)聚合體(“多聚體”)組成的ApoA-I激動(dòng)劑。這類(lèi)多聚體可以串聯(lián)重復(fù)、分枝網(wǎng)狀及其結(jié)合的形式存在?？梢杂靡粋€(gè)或多個(gè)接頭將核心肽直接彼此相連或者分隔。
包括多聚體的核心肽可以是結(jié)構(gòu)(I)所示的肽、結(jié)構(gòu)(I)的類(lèi)似物、結(jié)構(gòu)(I)突變形式、結(jié)構(gòu)(I)截短或內(nèi)部缺失形式、結(jié)構(gòu)(I)擴(kuò)展形式和/或其結(jié)合。核心肽可以頭到尾方式連接(即，從N-末端到C-末端)、頭到頭方式連接(從N-末端到N-末端)、尾到尾方式連接(即，從C-末端到C-末端)或其組合存在。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體為2、3、4直到約10個(gè)核心肽的串聯(lián)重復(fù)。優(yōu)選地，多聚體為2～8個(gè)核心肽串聯(lián)重復(fù)。因此，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑包括具有下述結(jié)構(gòu)通式的多聚體 其中每個(gè)m都單獨(dú)為0～1的整數(shù)，優(yōu)選為1；n是0～10的整數(shù)，優(yōu)選0～8；每個(gè)“HH”都單獨(dú)代表一個(gè)結(jié)構(gòu)(I)核心肽或結(jié)構(gòu)(I)肽類(lèi)似物或者本發(fā)明所述這些肽的突變、截短、內(nèi)部缺失或擴(kuò)展形式；每個(gè)“LL”都單獨(dú)代表1個(gè)接頭；以及每個(gè)“-”都單獨(dú)定義為1個(gè)共價(jià)接頭。
結(jié)構(gòu)(II)中，接頭LL可以是任一種能夠?qū)蓚€(gè)肽彼此共價(jià)相連的雙功能分子。因此，合適的接頭是其中的官能團(tuán)能共價(jià)連接到肽的N-和/或C-末端的雙功能分子。適于連接到肽N-或C-末端的官能團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，用于影響這類(lèi)共價(jià)鍵形成的合適化學(xué)也同樣如此。
根據(jù)多聚體期望特性的不同，所述接頭可以是柔性的、剛性的或半剛性的。合適的接頭包括，例如，Pro或Gly等氨基酸殘基或者含約2～約5、10、15或20或更多個(gè)氨基酸的肽節(jié)段，H2N(CH2)nCOOH等雙功能有機(jī)化合物，其中n是一個(gè)1～12的整數(shù)，等等。這類(lèi)接頭的實(shí)例，以及制備這類(lèi)接頭和引入這類(lèi)接頭肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見(jiàn)，例如，Hunig et al.，1974，Chem.Ber.1003039-3044；Basak et al.，1994，Bioconjug.Chem.5(4)301-305)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用單個(gè)脯氨酸殘基內(nèi)部打斷串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)。為此，在核心肽N-或C-末端以脯氨酸結(jié)尾的情況下，例如，其中結(jié)構(gòu)(I)中的X1是Pro(P)或D-Pro(p)，結(jié)構(gòu)(II)中的m優(yōu)選是0。在核心肽不含N-或C-末端脯氨酸的情況下，LL優(yōu)選是Pro(P)或D-Pro(p)和m優(yōu)選是1。
本發(fā)明特定實(shí)施方案中，可以期望使用在特定情況下能釋放出1個(gè)或多個(gè)螺旋節(jié)段(HH)的可切割接頭。合適的可切割接頭包括具有能被蛋白酶識(shí)別氨基酸序列的肽、能被內(nèi)切酶切割的寡核苷酸以及能用化學(xué)方法切割的有機(jī)化合物，例如在酸性、堿性或其他條件下。優(yōu)選地，切割條件要相對(duì)溫和以確保不變形或降解組成多聚ApoA-I激動(dòng)劑的螺旋節(jié)段和/或未切割接頭。
肽和寡核苷酸接頭可以選擇切割，以及用于切割接頭的方法，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知而且顯而易見(jiàn)的?？梢赃x擇切割的合適有機(jī)化合物接頭為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，其中包括，例如WO94/08051以及其中所引文獻(xiàn)中描述的接頭。
優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的接頭是可以作為內(nèi)源性環(huán)化酶的底物的肽，從而確保多聚ApoA-I激動(dòng)劑可以在體內(nèi)選擇性切割，例如，載脂蛋白A-I蛋白酶原。合適的酶以及能作為這類(lèi)酶的底物的肽節(jié)段是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見(jiàn)，例如，Edelstein et al.，1983，J.Biol.Chem.25811430-11433；Zanis，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802574-2578)。
正如上述討論的那樣，本發(fā)明核心肽的關(guān)鍵特性是它們?cè)谝苑聪蚱叫蟹绞脚帕袝r(shí)能形成分子間氫鍵或鹽橋。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用足夠長(zhǎng)度和柔性的接頭從而確保結(jié)構(gòu)(II)的螺旋節(jié)段(HH)能以反向平行的方式排列，并且形成存在脂類(lèi)時(shí)形成分子間氫鍵或鹽橋。
長(zhǎng)度和柔性足夠的接頭包括，但不限于，Pro(P)、Gly(G)、Cys-Cys、H2N(CH2)n-C(O)OH，其中n為1～12，優(yōu)選為4～6；H2N-芳基-C(O)OH以及糖。
替代地，由于原始載脂蛋白能在反向平行螺旋節(jié)段之間協(xié)同結(jié)合，所以與連接原始載脂蛋白鄰接螺旋的肽節(jié)段相對(duì)應(yīng)的肽接頭可以方便地用于連接核心肽，上述載脂蛋白包括，例如，ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE和ApoJ。這些接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見(jiàn)，例如，Rosseneu et al.，脂蛋白的結(jié)構(gòu)和功能“脂蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析”Ch.6，159-183，CRC Press，Inc.，1992)。
其他能夠在反向平行螺旋節(jié)段的串聯(lián)重復(fù)之間形成分子間氫鍵或鹽橋的接頭包括β-轉(zhuǎn)角和γ-轉(zhuǎn)角等肽反向轉(zhuǎn)角，以及模擬β-轉(zhuǎn)角和/或γ-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子。通常，反向轉(zhuǎn)角是與多肽方向相反以便使單個(gè)多肽鏈能采用反向平行β-折疊或反向平行α螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域。β-轉(zhuǎn)角通常由4個(gè)氨基酸殘基組成，γ-轉(zhuǎn)角通常由3個(gè)氨基酸殘基組成。
多數(shù)肽β-轉(zhuǎn)角的構(gòu)象和序列在現(xiàn)有技術(shù)中已有詳細(xì)描述，包括，例如并且不限于I-型、I’-型、II-型、II’-型、III-型、III’-型、IV-型、V-型、V’-型、VIa-型、VIb-型、VII-型以及VIII-型(見(jiàn)Richardson，1981，Adv.Protein Chem.34167-339；Rose et al.，1985，Adv.Protein Chem.371-109；Wilmot et al.，1988，J.Mol.Biol.203221-232；Sibanda et al.，1989，J.Mol.Biol.206759-777；Tramontano et al.，1989，ProteinsStruct.Funct.Genet.6382-394)。
β-轉(zhuǎn)角等短的肽轉(zhuǎn)角的特定構(gòu)象主要取決于該轉(zhuǎn)角中特定氨基酸殘基的位置(通常為Gly、Asn或Pro)。通常，除第3位上不能出現(xiàn)Pro外，Iβ-型-轉(zhuǎn)角能與轉(zhuǎn)角第1～4位任一氨基酸殘基相容。在I-型和II-型轉(zhuǎn)角中，第4位的優(yōu)勢(shì)氨基酸為Gly，第2位的優(yōu)勢(shì)氨基酸為Pro。Asp、Asn、Ser和Cys經(jīng)常出現(xiàn)在第1位上，此處它們的側(cè)鏈常常與殘基3的NH形成氫鍵。
II-型轉(zhuǎn)角中，Gly、Asn最常出現(xiàn)于位置3上，這是由于它們最易采取期望的骨架角度。理想地，I’-型轉(zhuǎn)角第2和3位上是Gly，II’-型轉(zhuǎn)角第2位上是Gly。III-型轉(zhuǎn)角通常可以有最多的氨基酸殘基，III’-但型轉(zhuǎn)角通常需要第2和3位上是Gly。VIa-型和VIb-型轉(zhuǎn)角通常具有1個(gè)cis肽鍵以及1個(gè)作為內(nèi)部殘基的Pro。蛋白質(zhì)和肽中β-轉(zhuǎn)角不同類(lèi)型和序列的綜述，讀者可以參考Wilmot et al.，1988，J.Mol.Biol.203221-232。
多數(shù)肽γ-轉(zhuǎn)角的構(gòu)象和序列在現(xiàn)有技術(shù)中也已有詳細(xì)描述(see，～，Rose et al.，1985，Adv.Protein Chem.371-109；Wilmer-White et al.，1987，Trends Biochem.Sci.12189-192；Wilmot et al.，1988，J.Mol.Biol.203221-232；Sibanda etal.，1989，J.Mol.Biol.206759-777；Tramontano et al.，1989，ProteinsStruct.Funct.Genet.6382-394)。本發(fā)明特別提供了所有這些類(lèi)型β-轉(zhuǎn)角和γ-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)及它們的序列，以及最新發(fā)現(xiàn)的肽β-轉(zhuǎn)角和γ-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)和序列。
替代地，接頭(LL)可以包括可以模擬肽β-轉(zhuǎn)角和γ-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子或基團(tuán)。這類(lèi)β-轉(zhuǎn)角和/或γ-轉(zhuǎn)角模擬基團(tuán)，以及合成含這類(lèi)基團(tuán)的肽的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，其中包括下列文獻(xiàn)中描述的那些Giannis and Kolter，1993 Angew.Chem.Intl.Ed.Eng.321244-1267；Kahn et al.，1988，J.MolecularRecognition 175-79；and Kahn et al.，1987，Tetrahedron Lett.281623-1626。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，多聚體以分枝網(wǎng)狀的形式存在(見(jiàn)，圖7)。使用多功能連接部分可以容易地得到這類(lèi)網(wǎng)狀形式，從而使得兩個(gè)以上的螺旋單元能夠結(jié)合到同一接頭部分上。因此，分枝網(wǎng)狀形式使用的分子具有3、4或多個(gè)能共價(jià)結(jié)合到肽N-和/或C-端上的官能團(tuán)。合適的連接基元包括，例如具有帶羥基、磺酰基、氨基、羧基、酰胺和或酯ester官能團(tuán)的側(cè)鏈的氨基酸殘基，例如，Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)、Orn、Asp(D)和Glu(E)；或者含這類(lèi)官能團(tuán)的其他有機(jī)分子。
連接到單個(gè)連接部分上的螺旋節(jié)段不需要是通過(guò)類(lèi)似末端的方式來(lái)連接。實(shí)際上，在一些實(shí)施方案中，將螺旋節(jié)段連接到單個(gè)連接部分上，從而使得能以反向平行方式排列，即，這些螺旋中的一些是用它們的N-末端連接，而其余的則通過(guò)C-末端連接。
可以直接把螺旋節(jié)段連接到連接部分上，或者通過(guò)1個(gè)或多個(gè)上述雙功能接頭(LL)與連接部分間隔開(kāi)。
從圖7A和7B中可以看出，分枝網(wǎng)狀可以用組成該網(wǎng)的“節(jié)點(diǎn)”數(shù)目來(lái)描述，其中每個(gè)多功能連接部分都是1個(gè)節(jié)點(diǎn)。圖7A和7B中，螺旋節(jié)段(即，本發(fā)明核心肽)用柱體表示，多功能連接部分(或節(jié)點(diǎn))用圓點(diǎn)(●)表示，其中從圓點(diǎn)中穿過(guò)的線(xiàn)的數(shù)目代表多功能連接部分的“級(jí)”(或官能團(tuán)的數(shù)目)。
網(wǎng)中節(jié)點(diǎn)數(shù)目通常取決于螺旋節(jié)段的預(yù)期總數(shù)，典型地為約1～2。當(dāng)然，可以理解的是對(duì)于給定數(shù)目的預(yù)期螺旋節(jié)段，較高級(jí)連接部分的網(wǎng)具有較少的節(jié)點(diǎn)。例如，圖7A和7B中，7個(gè)螺旋單元的三級(jí)網(wǎng)有3個(gè)節(jié)點(diǎn)(圖7A)，而7個(gè)螺旋單元的4級(jí)網(wǎng)只有2個(gè)節(jié)點(diǎn)(圖7B)。
所述的網(wǎng)可以是同一級(jí)的，即其中的所有節(jié)點(diǎn)都是，例如，三功能或四功能連接部分，或者也可以是混合級(jí)的，例如，三功能和四功能連接部分。當(dāng)然，可以理解到即使在同一級(jí)的網(wǎng)中，連接部分不必要是同樣的。3級(jí)網(wǎng)可以使用，例如，2、3、4或更多個(gè)不同的三功能連接基元。
與線(xiàn)性多聚體相同，組成分枝網(wǎng)狀形式的螺旋節(jié)段可以是，但不必須是，同樣的。
這類(lèi)混合級(jí)的分枝網(wǎng)的一個(gè)實(shí)例見(jiàn)圖7C。圖7C中，螺旋節(jié)段(即，本發(fā)明核心肽)用圓柱體表示，多功能連接部分用圓點(diǎn)來(lái)表示，其中從圓點(diǎn)中穿過(guò)的線(xiàn)的數(shù)目代表多功能連接部分的“級(jí)”(或官能團(tuán)的數(shù)目)。如上所述，連接螺旋節(jié)段的線(xiàn)代表雙功能接頭LL如上所述，組成分枝網(wǎng)狀形式的螺旋節(jié)段可以是核心肽的串聯(lián)重復(fù)。
在一個(gè)說(shuō)明性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分枝網(wǎng)狀形式可以用下列通式來(lái)描述 其中每個(gè)X都單獨(dú)為； 每個(gè)HH都單獨(dú)代表一個(gè)結(jié)構(gòu)(I)核心肽或者其類(lèi)似物或本發(fā)明所述這些肽的突變、截短、內(nèi)部缺失或擴(kuò)展形式；每個(gè)LL都單獨(dú)代表1個(gè)雙功能接頭；以及每個(gè)“-”都單獨(dú)定義為1個(gè)共價(jià)接頭；每個(gè)m都單獨(dú)為一個(gè)0～1的整數(shù)；每個(gè)n都單獨(dú)為一個(gè)0～8的整數(shù)；Nya和Nyb都各自代表一個(gè)多功能連接基元，其中ya和yb分別為Nya和Nyb上的官能團(tuán)數(shù)目；每個(gè)ya或yb都單獨(dú)是一個(gè)3～8的整數(shù)；p是一個(gè)0～7的整數(shù)；以及每個(gè)“-”都單獨(dú)代表一個(gè)共價(jià)鍵。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分枝網(wǎng)狀形式包括一個(gè)“Lys-樹(shù)”，即網(wǎng)中的多功能連接基元是1個(gè)或多個(gè)Lys(K)殘基(見(jiàn)，例如，圖7D)。
在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，本發(fā)明的“Lys-樹(shù)”分枝網(wǎng)狀形式可用下述通式描述 或 其中每個(gè)X都單獨(dú)為； 每個(gè)HH都單獨(dú)代表一個(gè)結(jié)構(gòu)(I)核心肽或者其類(lèi)似物或本發(fā)明所述這些肽的突變、截短、內(nèi)部缺失或擴(kuò)展形式；每個(gè)LL都單獨(dú)代表1個(gè)雙功能接頭；每個(gè)n都單獨(dú)為一個(gè)0～8的整數(shù)；每個(gè)m都單獨(dú)為一個(gè)0～1的整數(shù)；R1為-OR或-NRR；以及每個(gè)R都單獨(dú)為-H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、5～20元雜芳基或6～26元烷雜芳基。
5.1.1.結(jié)構(gòu)和功能的分析本發(fā)明核心肽或肽類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)和功能，以及組成這類(lèi)核心肽的ApoA-I激動(dòng)劑，包括上述多聚體形式，這些都可以用來(lái)分析從中選擇出ApoA-I的活性激動(dòng)劑或模擬物。例如，可以對(duì)這些核心肽或肽類(lèi)似物的下述能力進(jìn)行分析脂類(lèi)存在時(shí)形成α螺旋的能力、結(jié)合脂類(lèi)的能力、與脂類(lèi)形成復(fù)合物的能力、活化LCAT的能力、促進(jìn)膽固醇排出的能力等等。
分析肽結(jié)構(gòu)和/或功能的方法和實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。操作實(shí)施例中提供了優(yōu)選方法，下文。例如，第7節(jié)，上述中描述的圓二色性(CD)和核磁共振(NMR)實(shí)驗(yàn)，可以用于分析肽或肽類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)--具體為存在脂類(lèi)時(shí)的螺旋性程度。可以用第7節(jié)，下文中描述的熒光光譜分析測(cè)定結(jié)合脂類(lèi)的能力。用第8節(jié).下文中描述的LCAT活性可以容易地測(cè)定出肽和/或肽類(lèi)似物活化LCAT的能力。第9，10和11節(jié)，下文中描述體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以用于測(cè)評(píng)半衰期、分布、膽固醇排出以及對(duì)RCT的影響。
通常，本發(fā)明中表現(xiàn)出下述表IV中所列特性的核心肽和/或肽類(lèi)似物就可認(rèn)為是有活性的。
表IV活性肽的特性
Ri是脂類(lèi)肽摩爾比。
如操作實(shí)施例中所述，通常，表現(xiàn)出高度(≥38％)LCAT活性的核心肽在脂性小單層囊泡(SUVs)存在時(shí)具有明顯的α螺旋結(jié)構(gòu)(含22或更多個(gè)氨基酸殘基的未封閉肽以及含18或更少個(gè)氨基酸殘基的封閉后的肽存在時(shí)，≥60％)，幾乎或根本無(wú)LCAT活性的肽幾乎不具有α螺旋結(jié)構(gòu)。但是，特定情況下，脂類(lèi)存在時(shí)表現(xiàn)出明顯螺旋結(jié)構(gòu)的肽不產(chǎn)生明顯的LCAT活性。
類(lèi)似地，雖然表現(xiàn)出明顯LCAT活性的核心肽典型地能結(jié)合脂類(lèi)，但是特定情況下表現(xiàn)出脂類(lèi)結(jié)合活性的肽卻不能產(chǎn)生明顯的LCAT活性。
因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到本發(fā)明核心肽形成α螺旋(脂類(lèi)存在時(shí))以及結(jié)合脂類(lèi)的能力對(duì)于活性產(chǎn)生起著作用，多數(shù)情況下，這些活性可以不充分地體現(xiàn)出來(lái)。因此，對(duì)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案核心肽進(jìn)行篩選，從中選出表現(xiàn)出明顯藥物活性的核心肽。
第一步中，根據(jù)形成α螺旋的能力，用第7節(jié)，下文中描述的圓二色性(CD)實(shí)驗(yàn)對(duì)核心肽進(jìn)行篩選。然后，根據(jù)結(jié)合脂類(lèi)的能力，用第7節(jié)，下文中描述的熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)滿(mǎn)足下述條件的肽的肽進(jìn)行篩選脂類(lèi)存在時(shí)(濃度約為5μM，而且脂類(lèi)∶肽的摩爾比約30)，至少形成40％螺旋(含18或更少個(gè)氨基酸的未封閉肽)或60％螺旋(含18或更少個(gè)氨基酸的未封閉肽；含22個(gè)或更多個(gè)氨基酸的封閉肽)。當(dāng)然，只有那些含有熒光素標(biāo)記的Trp(W)或Val殘基的核心肽才可以通過(guò)熒光實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行脂類(lèi)結(jié)合的篩選。然而，對(duì)于那些不含熒光素標(biāo)記殘基的肽而言，當(dāng)脂類(lèi)存在時(shí)螺旋增加的情況下與脂類(lèi)的結(jié)合是顯而易見(jiàn)的。
然后，對(duì)SUVs(0.5～10μM肽；脂類(lèi)∶肽摩爾比為1～50)存在時(shí)表現(xiàn)出脂類(lèi)結(jié)合核心肽進(jìn)行藥物活性的篩選。當(dāng)然，所篩選的藥物活性取決于ApoA-I激動(dòng)劑的預(yù)期用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由于能夠活化LCAT的核心肽在本發(fā)明描述的方法中是特別有用的，所以對(duì)核心肽進(jìn)行的是活化LCAT能力的篩選。與原始的人ApoA-I相比表現(xiàn)出至少約38％LCAT活性的核心肽(采用第8節(jié)，下文中描述的LCAT活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定)為優(yōu)選核心肽，表現(xiàn)出50％、60％、70％、80％或者甚至90％或更高的核心肽是特別優(yōu)選的。
5.1.2.優(yōu)選實(shí)施方案可以通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ApoA-I激動(dòng)劑是結(jié)構(gòu)(I)所示的18個(gè)氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-末端?；?或C-末端酰胺化或酯化形式。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ApoA-I激動(dòng)劑是結(jié)構(gòu)(I)所示的18個(gè)氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-末端?；?或C-末端酰胺化或酯化形式，其中X2是Ala(A)、Val(V)或Leu(L)；X4是Asp(D)或G1u(E)；X7是Arg(R)、Lys(K)或Orn；
X8是Asp(D)或Glu(E)；X11是Glu(E)或Asn(N)；X12是Glu(E)；X14是Arg(R)、Lys(K)、Orn或Leu(L)；X16(K)是Arg(R)、Lys(K)或Orn；和/或X18(K)是Arg(R)、Lys(K)或Orn，以及X1、X3、X5、X6、X9、X10、X13、X15和X17同結(jié)構(gòu)(I)中的在前定義。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述ApoA-I激動(dòng)劑是結(jié)構(gòu)(I)所示的18個(gè)氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-末端?；?或C-末端酰胺化或酯化形式，其中當(dāng)X11是Asn(N)時(shí)，X14是Leu(L)，當(dāng)X11不是Asn(N)是，X14就不是Leu(L)。根據(jù)本發(fā)明這方面特別優(yōu)選實(shí)施方案是那些肽，或其N(xiāo)-末端酰化和/或C-末端酰胺化或酯化形式，其中結(jié)構(gòu)(I)中的各種Xn同上段中的定義。本發(fā)明這方面的例舉的具體優(yōu)選實(shí)施方案是肽209(PVLDLFRELLNELLQKLK；SEQ ID NO209)，及其N(xiāo)-末端酰化和/或C-末端酰胺化或酯化形式。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ApoA-I激動(dòng)劑是結(jié)構(gòu)(I)所示肽的改良或突變形式，或其N(xiāo)-末端?；?或C-末端酰胺化或酯化形式，其中。
X1不是Asp(D)；X9不是Gly(G)；X10不是Gly(G)；X12不是Leu(L)；以及X13不是Gly(G)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ApoA-I激動(dòng)劑選自下列肽肽 191 PVLDLLRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO191)；肽 192 PVLDLFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO192)；肽 193 PVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO193)；肽 194 PVLELFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO194)；肽 195 PVLELFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO195)；肽 196 PVLDLFRELLEELKNKLK*(SEQ ID NO196)；肽 197 PLLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO197)；肽 198 GVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO198)；肽 199 PVLDLFRELWEELKQKLK*(SEQ ID NO199)；肽 200 NVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO200)；肽 201 PLLDLFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO201)；肽 202 PALELFKDLLEELRQKLR*(SEQ ID NO202)；肽 203 AVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO203)；肽 204 PVLDFFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO204)；肽 205 PVLDLFREWLEELKQKLK*(SEQ ID NO205)；肽 206 PLLELLKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO206)；肽 207 PVLELLKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO207)；肽 208 PALELFKDLLEELRQRLK*(SEQ ID NO208)；肽 209 PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ ID NO209)；肽 210 PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO210)；肽 211 PVLDLFRELLEELOQOLO*(SEQ ID NO211)；肽 212 PVLDLFOELLEELOQOLK*(SEQ ID NO212)；肽 213 PALELFKDLLEEFRQRLK*(SEQ ID NO213)；肽 214 pVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO214)；肽 215 PVLDLFRELLEEWKQKLK*(SEQ ID NO215)；肽 229 PVLELFERLLEDLQKKLK (SEQ ID NO229)；肽 230 PVLDLFRELLEKLEQKLK (SEQ ID NO230)；肽 231 PLLELFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO231)；N-和/或C-末端封閉或未封閉形式。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ApoA-I激動(dòng)劑選自下列肽
肽 191 PVLDLLRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO191)；肽 192 PVLDLFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO192)；肽 193 PVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO193)；肽 194 PVLELFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO194)；肽 195 PVLELFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO195)；肽 196 PVLDLFRELLEELKNKLK*(SEQ ID NO196)；肽 197 PLLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO197)；肽 198 GVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO198)；肽 199 PVLDLFRELWEELKQKLK*(SEQ ID NO199)；肽 200 NVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO200)；肽 201 PLLDLFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO201)；肽 202 PALELFKDLLEELRQKLR*(SEQ ID NO202)；肽 203 AVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO203)；肽 204 PVLDFFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO204)；肽 205 PVLDLFREWLEELKQKLK*(SEQ ID NO205)；肽 206 PLLELLKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO206)；肽 207 PVLELLKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO207)；肽 208 PALELFKDLLEELRQRLK*(SEQ ID NO208)；肽 209 PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ ID NO209)；肽 210 PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO210)；肽 211 PVLDLFRELLEELOQOLO*(SEQ ID NO211)；肽 212 PVLDLFOELLEELOQOLK*(SEQ ID NO212)；肽 213 PALELFKDLLEEFRQRLK*(SEQ ID NO213)；肽 214 pVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO214)；肽 215 PVLDLFRELLEEWKQKLK*(SEQ ID NO215)；N-和/或C-末端封閉或未封閉形式。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ApoA-I激動(dòng)劑是結(jié)構(gòu)II、III和/或IV所示的多聚體形式，其中每個(gè)HH都單獨(dú)為結(jié)構(gòu)(I)所示肽或其N(xiāo)-末端N-末端酰化和/或C-末端酰胺化或酯化形式，或者是本發(fā)明描述的任一優(yōu)選的結(jié)構(gòu)(I)肽。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組成ApoA-I激動(dòng)劑的核心肽不是下列肽中的任意一種肽 75 PVLDEFREKLNEELEALKQKLK (SEQ ID NO75)；膚 94 PVLDEFREKLNEALEALKQKLK (SEQ ID NO94)；肽 109PVLDEFREKLNERLEALKQKLK (SEQ ID NO109)；肽 237LDDLLQKWAEAFNQLLKK (SEQ ID NO237)；肽 238EWLKAFYEKVLEKLKELF*(SEQ ID NO238)；肽 241DWFKAFYDKVFEKFKEFF (SEQ ID NO241)；肽 242GIKKFLGSIWKFIKAFVG (SEQ ID NO242)；肽 243DWFKAFYDKVAEKFKEAF (SEQ ID NO243)；肽 244DWLKAFYDKVAEKLKEAF (SEQ ID NO244)；肽 245DWLKAFYDKVFEKFKEFF (SEQ ID NO245)；肽 246EWLEAFYKKVLEKLKELF (SEQ ID NO246)；肽 247DWFKAFYDKFFEKFKEFF (SEQ ID NO247)；肽 248EWLKAFYEKVLEKLKELF (SEQ ID NO248)；肽 249EWLKAEYEKVEEKLKELF*(SEQ ID NO249)；肽 250EWLKAEYEKVLEKLKELF*(SEQ ID NO250)；和肽 251EWLKAFYKKVLEKLKELF*(SEQ ID NO251).
在最后一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ApoA-I激動(dòng)劑不是表X中列出的肽中的任意一種(8.3節(jié)，下文)，表中列出的這些肽表現(xiàn)出的LCAT活性低于原始人ApoA-I的38％。
5.2.ApoA-I肽激動(dòng)劑的合成及純化本發(fā)明核心肽的制備可以采用實(shí)際上任一種本領(lǐng)域已知制備肽的技術(shù)。例如，可以用常規(guī)的梯度溶液或固相肽合成，或者重組DNA技術(shù)制備所述肽。
5.2.1.化學(xué)合成可以用常規(guī)梯度溶液或固相合成技術(shù)制備核心肽(見(jiàn)，例如，肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)合成方法Williams et al.，Eds.，1997，CRC Press，Boca Raton Florida，及其參考文獻(xiàn)；固相肽合成實(shí)體操作，Atherton & Sheppard，Eds.，1989，IRL Press，Oxford，England，及其參考文獻(xiàn))。
替代地，可以用文獻(xiàn)中描述的節(jié)段縮合來(lái)制備本發(fā)明所述的肽，例如，Liu et al.，1996，Tetrahedron Lett.37(7)933-936；al.，1995，J.Am.Chem.Soc.1171881-1887；Tam et al.，1995，Int.J.Peptide Protein Res.45209-216；Schnolzer and Kent，1992，Science 256221-225；Liu and Tam，1994，J.Am.Chem.Soc.116(10)4149-4153；Liu and Tam，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916584-6588；Yamashiro and Li，1988，Int.J.PeptideProtein Res.31322-334)。節(jié)段縮合是用于合成含內(nèi)部甘氨酸殘基的實(shí)施方案的特別有效方法。其他可以用于合成本發(fā)明肽的方法在下文的描述Nakagawa et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.1077087-7092。
可以用有機(jī)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備含N-和/或C-末端封閉基團(tuán)的ApoA-I激動(dòng)劑。例如，?；腘-末端或者酰胺化或酯化肽C-末端的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。由于保護(hù)任一側(cè)鏈官能團(tuán)的模型都需要連接末端封閉基團(tuán)，所以N-和/或C-末端帶有其他修飾的模型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的。
用離子交換層析或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他方法，可以方便地制備出藥物學(xué)可接受的鹽(反離子)。
通過(guò)在合成過(guò)程的合適步驟中向肽鏈添加接頭，能夠方便地合成出以串聯(lián)多聚體形式存在的本發(fā)明化合物。替代地，可以合成螺旋節(jié)段，每個(gè)節(jié)段都與接頭反應(yīng)。當(dāng)然，合成的真正方法取決于接頭的組成。合適的保護(hù)方案和化學(xué)也是眾所周知的，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
用下述文獻(xiàn)中描述的三聚物和四聚物樹(shù)脂以及化學(xué)試劑，能夠方便地合成出以分枝網(wǎng)狀形式的本發(fā)明化合物Tam，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855409-5413 and Demoor et al.，1996，Bur.J.Biochem.23974-84。合成樹(shù)脂的修飾，以及合成更高或更低目，或含有不同核心肽螺旋節(jié)段組合的分枝網(wǎng)的策略，這些都在肽化學(xué)和/或有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
如果需要，通常可以在溫和氧化劑存在的條件下誘導(dǎo)形成二硫鍵?？梢允褂没瘜W(xué)氧化劑，或者可以直接把化合物暴露到大氣氧引發(fā)這些鍵的生成。各種方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括下述文獻(xiàn)中描述的，例如，Tam et al.，1979，Synthesis 955-957；Stewartet al.，1984，Solid Phase Peptide Synthesis，2d Ed.，PierceChemical Company Rockford，IL；Ahmed et al.，1975，J.Biol.Chem.2508477-8482；and Pennington et al.，1991 Peptides1990164-1.66，Giralt and Andreu，Bds.，BSCOM Leiden，TheNetherlands。另一個(gè)替代方案的描述見(jiàn)，Kamber et al.，1980，Helv.Chim.Acta 63899-915。一種在固相載體上實(shí)施的方法的描述見(jiàn)，Albericio，1985，Iht.J.Peptide Protein Res.2692-97。這些方法中的任一種都可以用于形成本發(fā)明肽中的二硫鍵。
5.2.2.重組合成如果肽完全是由，或其中的一部分是由基因-編碼氨基酸組成，那么也可以用常規(guī)合成遺傳工程技術(shù)來(lái)合成該肽或相關(guān)部分。
對(duì)于重組制備，則要把編碼肽的聚核苷酸序列插入到合適的表達(dá)載體，即載體中含有被插入編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所需元件，或者當(dāng)使用的是RNA病毒載體時(shí)復(fù)制和翻譯所需元件。然后，把表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到表達(dá)肽的合適的靶細(xì)胞中。根據(jù)所用的表達(dá)系統(tǒng)，然后用本領(lǐng)域的成熟方法分離表達(dá)的肽。用于重組蛋白和肽生產(chǎn)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見(jiàn)，例如，Sambrook et al.，1989，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.；and Ausubel et al.，1989，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.這些文獻(xiàn)在此整體引入作為參考)。
為了提高生產(chǎn)效率，可以將上述聚核苷酸設(shè)計(jì)成被酶切位點(diǎn)間隔開(kāi)的多個(gè)肽單元--同聚體(重復(fù)肽單元)或異聚體(不同肽串在一起)都可以此方式構(gòu)建。為了回收肽單元，可以對(duì)得到的聚肽進(jìn)行切割(例如，用合適的酶處理)。這可以增加由單一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的肽的產(chǎn)量。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以設(shè)計(jì)一個(gè)多順?lè)醋泳酆塑账釓亩D(zhuǎn)錄出編碼多個(gè)肽的單一mRNA(即，同聚體或異聚體)每個(gè)編碼區(qū)域任選地連接到一個(gè)帽-不依賴(lài)的翻譯控制序列；例如，一個(gè)內(nèi)部的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。當(dāng)用于合適的病毒表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，翻譯過(guò)程中該mRNA編碼的每個(gè)肽的翻譯都由，例如IRES內(nèi)部指導(dǎo)。因此，多順?lè)醋訕?gòu)建體指導(dǎo)單個(gè)、大多順?lè)醋觤RNA的轉(zhuǎn)錄，反過(guò)來(lái)，該mRNA指導(dǎo)多個(gè)、單一肽的翻譯。這種方法可以消除聚蛋白的產(chǎn)生和酶處理，并且能夠明顯地增加單一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的肽的產(chǎn)量。
多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可以用于表達(dá)本發(fā)明所述的肽。這些包括，但不限于，用含一段合適編碼序列的重組噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌等微生物；用含一段合適編碼序列的重組酵母或真菌表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的酵母或絲狀真菌；用重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒或煙草花葉病毒)或用含一段合適編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；或者動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。
表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)元件在其強(qiáng)度和特異性方面不同。根據(jù)使用的宿主/載體系統(tǒng)，可以將大量合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任意一種，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，用于表達(dá)載體。例如，當(dāng)在菌體系統(tǒng)中克隆時(shí)，可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如λ噬菌體的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動(dòng)子)等；當(dāng)克隆入昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中時(shí)，可以使用桿狀病毒多角體啟動(dòng)子等啟動(dòng)子；當(dāng)克隆入植物細(xì)胞系統(tǒng)中時(shí)，可以使用來(lái)自植物細(xì)胞基因組(例如，熱休克啟動(dòng)子、RUBISCO小亞基的啟動(dòng)子、葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子)或者來(lái)自植物病毒(例如，CaMV的35S RNA啟動(dòng)子、TMV的衣殼蛋白啟動(dòng)子)；當(dāng)克隆入哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中時(shí)，可以使用來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或者來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒(例如，腺病毒后期啟動(dòng)子、痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子；當(dāng)克隆入含多拷貝表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞系中時(shí)，可以使用帶有適當(dāng)可選擇標(biāo)記物的以SV40-，BPV-和EBV-為基礎(chǔ)的載體。
當(dāng)使用植物表達(dá)載體的情況下，可以用大量啟動(dòng)子中的任一種來(lái)驅(qū)動(dòng)編碼本發(fā)明肽的序列的表達(dá)。例如，可以使用病毒啟動(dòng)子，例如，CaMV的35S RNA和19S RNA啟動(dòng)子(Brisson et al.，1984，Nature310511-514)或TMV的衣殼蛋白啟動(dòng)子(Takamatsu et al.，1987，EMBO J.6307-311)；替代地，可以使用植物啟動(dòng)子，例如RUBISCO小亞基(Coruzzi et al.，1984，EMBO J.31671-1680；Broglie etal.，1984，Science 224838-843)或熱休克啟動(dòng)子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley et al.，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)。可以使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等，把這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中。這類(lèi)技術(shù)的綜述見(jiàn)，例如Weissbach & Weissbach，1988，Methods for PlantMolecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp.421-463；和Grierson & Corey，苜蓿銀紋夜蛾1988，PlantMolecular Biology，2d Ed.，.Blackie，London，Ch.7-9。
在一個(gè)可以用于制備本發(fā)明肽的昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)中，可以用Autographa californica，核性多汁癥病毒(AcNPV)作為載體表達(dá)外源基因。病毒生長(zhǎng)在草地夜蛾細(xì)胞中?？梢詫⒕幋a序列克隆到病毒的非必需區(qū)域(例如多角基因)，并且置于AcNPV啟動(dòng)子的調(diào)控之下(例如，多角體啟動(dòng)子)。成功插入編碼序列可以導(dǎo)致多角體基因的失活和非-封閉型重組病毒的產(chǎn)生(即，不含多角體基因編碼的蛋白質(zhì)衣殼)。然后，用這些重組病毒轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞，插入基因在其中表達(dá)(例如，見(jiàn)Smith et al.，1983，J.Virol.46584；Smith，U.S.Patent No.4，215，051)這種表達(dá)系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)例可以見(jiàn)CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.2，Ausubel et al.，eds.，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用大量以病毒為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)用腺病毒作為表達(dá)載體時(shí)，可以將編碼序列連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控復(fù)合物中，例如，晚期啟動(dòng)子和三分前導(dǎo)序列。通過(guò)體外或體內(nèi)重組，可以把嵌合基因插入到腺病毒基因組中。插入病毒非必需區(qū)域(例如，區(qū)域E1和E3)導(dǎo)致可生存的并能在轉(zhuǎn)染宿主中表達(dá)肽的病毒。(例如，見(jiàn)Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)813655-3659)。替代地，可以使用痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子，(例如，Mackett et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)797415-7419；Mackett et al.，1984，J.Virol.49857-864；Panicali et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.794927-4931)。
用于生產(chǎn)本發(fā)明肽的其他表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
5.2.3.肽的純化可以用本領(lǐng)域已知技術(shù)來(lái)純化本發(fā)明的肽，例如反向高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析等。用于純化一種具體肽的真正條件部分上取決于合成策略以及凈電電荷、疏水性、親水性等因素，這些對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都已清楚?？梢岳茫?，離子交換或大小排阻層析。
對(duì)于親和層析純化而言，任一種能特異結(jié)合所述肽的抗體都可以使用?？贵w的制備，可以用肽注射免疫各種宿主動(dòng)物，包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等。可以通過(guò)側(cè)鏈官能團(tuán)或連接到側(cè)鏈官能團(tuán)上的接頭，把肽連接到BSA等合適的載體上。根據(jù)宿主種類(lèi)的不同，可以使用各種佐劑，包括但不限于弗氏(完全和不完全)，氫氧化鋁等礦物凝膠、溶血卵磷脂等表面活性物質(zhì)、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚，以及潛在有效的人佐劑例如BCG(卡介菌)和小棒狀桿菌。
使用任一種能夠用培養(yǎng)物中連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)，可以制備得到抗肽的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)，最初描述見(jiàn)Kohler and Milstein，1975，Nature 256495-497，或Kaprowski，U.S.Patent No.4,376,110在此引入作為參考；人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472；Cote et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030)；以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，1985，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985)).此外，可以使用用于制備“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrisonet al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851-6855；Neuberger et al.，1984，Nature 312604-608；Takeda et al.，1985，Nature 314452-454，Boss，U.S.Patent No.4,816,397；Cabilly，U.S.Patent No.4,816,567；在此引入作為參考)，該項(xiàng)技術(shù)是通過(guò)剪接來(lái)自具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因和來(lái)自具有合適生物活性的人抗體分子的基因?qū)崿F(xiàn)的。或者可以制備“人源化”抗體(見(jiàn)，例如，Queen，U.S.Patent No.5,585,089在此插入作為參考)。替代地，可以將用于制備單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Patent No.4,946,778)用于制備肽特異性單鏈抗體。
通常，用已知技術(shù)可以生產(chǎn)出含有特異性位點(diǎn)缺失的抗體片段，這類(lèi)片段包括但不限于，用胃蛋白酶消化抗體分子得到的F(ab’)2片段和還原F(ab’)2片段的二硫鍵得到的Fab片段。替代地，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse et al.，1989，Science 2461275-1281)，從而可以快速和容易地鑒定出具有針對(duì)目的肽的預(yù)期特異性的單克隆Fab片段。
可以將對(duì)目的肽具有特異性的抗體或抗體片段連接到，例如瓊脂糖，然后把抗體-瓊脂糖復(fù)合物用于免疫層析，純化出本發(fā)明的肽。見(jiàn)，Scopes，1984，蛋白質(zhì)純化理論和實(shí)踐，Springer-Verlag NewYork，Inc.，NY，Livingstone，1974，酶學(xué)方法蛋白質(zhì)的免疫親和層析34723-731。
5.3.藥用制劑和治療方法本發(fā)明的Apo-I激動(dòng)劑可以用于治療動(dòng)物的任一種疾病，尤其是包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，對(duì)于增加血清HDL濃度、活化LCAT以及促進(jìn)膽固醇排出和RCT是有益的。這類(lèi)疾病包括，但不限于高脂質(zhì)血癥，并且尤其是高膽固醇血癥，以及動(dòng)脈粥樣硬化等心血管病(包括動(dòng)脈粥樣硬化的治療和預(yù)防)；再狹窄(例如，預(yù)防或治療因球囊血管成形術(shù)等治療方法引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化病變)；以及往往導(dǎo)致膿毒性休克的內(nèi)毒素性血癥等其他疾病。
ApoA-I激動(dòng)劑可以單獨(dú)或與其他用于治療上述病癥的藥物配合治療。這類(lèi)治療包括，但不限于同時(shí)或順序給藥。
例如，對(duì)于治療高膽固醇血癥或動(dòng)脈粥樣硬化，ApoA-I激動(dòng)劑制劑可以按照目前使用的任一種或更多種降膽固醇治療方案給藥，例如，膽汁酸樹(shù)脂、煙酸和/或抑制素。由于每種藥物均作用于膽固醇合成和運(yùn)輸中的不同目標(biāo)，所以這種聯(lián)合治療方案可以產(chǎn)生特別有益的治療效果；例如，膽汁酸樹(shù)脂能夠影響膽固醇再循環(huán)、乳糜微粒和LDL族群，煙酸主要影響VLDL和LDL族群；抑制素能夠抑制膽固醇合成，減少LDL族群(以及可能增加LDL受體的表達(dá))；同時(shí)ApoA-I激動(dòng)劑能影響RCT、增加HDL，增強(qiáng)LCAT活性以及促進(jìn)膽固醇的排出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，ApoA-I激動(dòng)劑可以與纖維素結(jié)合用于治療高脂質(zhì)血癥、高膽固醇血癥，和/或動(dòng)脈粥樣硬化等心血管病。
還有另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑可以與目前使用的抗微生物和抗炎性藥物聯(lián)合用于治療內(nèi)毒素引發(fā)的膿毒性休克。本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑可以配制成能以多種途徑向患者給藥的肽或肽-脂類(lèi)復(fù)合物，從而將ApoA-I激動(dòng)劑釋放到循環(huán)系統(tǒng)中。下面描述了例舉性的制劑和治療方案。
5.3.1.ApoA-I激動(dòng)劑和肽/脂類(lèi)復(fù)合物作為活性成分用第5.2節(jié)及其小節(jié)中描述的任一種技術(shù)，可以合成或制備出ApoA-I激動(dòng)劑肽。通過(guò)凍干肽可以制備出半衰期長(zhǎng)的穩(wěn)定制劑--制備成用于再配制的散裝形式，或者制備成在施用給患者前能夠與滅菌水或合適的滅菌緩沖液再水化的單個(gè)等分試樣或劑量單元。
特定的實(shí)施方案中，可以?xún)?yōu)選以肽-脂類(lèi)復(fù)合物的形式配制和施用。這種方法具有幾種優(yōu)點(diǎn)，這是由于該復(fù)合物具有增長(zhǎng)的循環(huán)系統(tǒng)半衰期，特別是當(dāng)該復(fù)合物的大小和密度與HDL近似時(shí)，特別是與前-β-1或前-β-2 HDL族群近似時(shí)。用下述大量方法中的任一種都可以方便地配制出所述的肽-脂類(lèi)復(fù)合物。用凍干方法可以制備出貯藏期限長(zhǎng)的穩(wěn)定制劑-優(yōu)選下述的共凍干方法。凍干的肽-脂類(lèi)復(fù)合物可以用于制備成用于藥物再配制的散裝形式，或者制備成在施用給患者前能夠與滅菌水或合適的滅菌緩沖液再水化的單個(gè)等分試樣或劑量單元。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法都可以用于制備肽-脂類(lèi)囊泡或復(fù)合物。所以，大量用于制備脂質(zhì)體或前脂質(zhì)體的現(xiàn)有技術(shù)都可以使用。例如，所述肽可以與合適的脂類(lèi)混合(用池式或探針超聲波儀)形成復(fù)合物。替代地，所述肽可以與預(yù)制的脂類(lèi)囊泡配合形成肽-脂類(lèi)復(fù)合物的自發(fā)制劑。另一個(gè)替代的實(shí)施方案中，可以用去污劑透析法制備肽-脂類(lèi)復(fù)合物；例如，一種肽、脂類(lèi)和去污劑混合物被透析除去去污劑并且重新組成或形成肽-脂類(lèi)復(fù)合物(例如，見(jiàn)Jonas etal.，1986，Methods in Enzymol.128553-582)盡管上述方法切實(shí)可行，但是每種方法在成本、產(chǎn)量、重現(xiàn)性和安全性方面都出現(xiàn)其獨(dú)有的問(wèn)題。申請(qǐng)人發(fā)明了一種用于制備與HDL具有類(lèi)似特性的肽或蛋白-磷脂復(fù)合物的簡(jiǎn)便方法。該方法可以用于制備ApoA-I肽-脂類(lèi)復(fù)合物，具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)所包括成分中的大多數(shù)或全部都用于形成設(shè)定的復(fù)合物，因此避免了其他方法中通常出現(xiàn)的原料浪費(fèi)的問(wèn)題。(2)配制成保存過(guò)程中很穩(wěn)定的凍干化合物。所得到的復(fù)合物可以在臨用前再配制。(3)制備后和使用前，得到的復(fù)合物通常不需要進(jìn)一步純化。(4)能避免毒性化合物，包括膽酸鹽等去污劑。此外，生產(chǎn)方法易于規(guī)?；⑶疫m用于GMP生產(chǎn)(即，不含內(nèi)毒素的環(huán)境)。
按照優(yōu)選方法，所述肽和脂類(lèi)共溶于一種每種成分都能互溶的溶劑系統(tǒng)中，而且可以通過(guò)凍干完全去除。所以，溶劑對(duì)必須仔細(xì)選擇，以確保兩親性肽和脂類(lèi)二者之間能夠互溶。一個(gè)實(shí)施方案中，引入到顆粒中的蛋白質(zhì)或肽可以溶解于一種水或有機(jī)溶劑或溶劑混合物(溶劑1)中。(磷)脂成分溶解于一種能與溶劑1混溶的水或有機(jī)溶劑或溶劑混合物(溶劑2)中，混合這兩種溶液。替代地，可以將肽和脂類(lèi)引入到一種互溶系統(tǒng)中；例如，一種可混溶溶劑的混合物。首先根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定肽與脂類(lèi)之間的合適比例，以便使得到的混合物具有適當(dāng)?shù)睦砘再|(zhì)；例如，通常(但并非必須)大小近似于將得到的混合物冷凍并凍干。有時(shí)還必須向混合物中另外加入一種溶劑加速凍干。凍干產(chǎn)物能長(zhǎng)期保存并保持穩(wěn)定。
在上述操作實(shí)施例中，將肽210(SEQ ID NO.210)和磷脂分別溶解于甲醇中，合并，然后在凍干前與二甲苯混合?？梢园央暮椭?lèi)二者加入到上述兩種溶劑的混合物中。替代地，可以將所述肽的甲醇溶液與肽的二甲苯溶液混合。必須小心除盡溶劑系統(tǒng)中的鹽類(lèi)以避免鹽析出肽。將得到的含有共溶于甲醇/二甲苯中的肽和脂類(lèi)的溶液凍干成粉末。
再配制凍干產(chǎn)物以得到肽-脂類(lèi)混合物的溶液或懸浮液。所以，用水溶液再水化凍干粉末到合適體積(通常5mgs肽/ml的濃度便于靜脈注射)。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用磷酸鹽緩沖鹽或一種生理鹽溶液再水化凍干粉末。可以攪拌或渦旋混合物以加速再水化，而且多數(shù)情況下，實(shí)施再配制步驟的溫度應(yīng)等于或高于混合物中脂類(lèi)成分的相轉(zhuǎn)化溫度。數(shù)分鐘內(nèi)，得到再配制脂類(lèi)-蛋白混合物的澄清溶液。
取一等份得到的再組成制劑進(jìn)行定性以確證制劑中的混合物具有期望的大小分布；例如，HDL的大小分布。凝膠過(guò)濾層析可以用于此目的。上述的操作實(shí)施例中，使用了一種Pharmacia Superose 6 FPLC凝膠過(guò)濾層析系統(tǒng)。所用的緩沖液在50mM磷酸鹽緩沖液中含150mMNaCl。一種典型的樣品容積為20～200毫升的混合物，其中含5mg肽/ml。柱體流速為0.5ml/min。一系列已知分子量和Stokes’直徑的蛋白質(zhì)以及人HDL用作標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定柱體。用波長(zhǎng)為254或280nm處的吸光度或光散射測(cè)定蛋白質(zhì)和脂蛋白混合物。
本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑可以與多種脂類(lèi)混合，包括飽和、不飽和、天然或合成脂類(lèi)和/或磷脂。合適的脂類(lèi)包括，但不限于，短烷基鏈磷脂、卵磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、鞘脂類(lèi)、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二磷脂酰磷脂基甘油、二肉豆蔻酰磷脂?；视汀⒍王Ａ字Ａ字视?、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂?；掖及贰⒍貦磅Ａ字；掖及贰⒍舛罐ⅤＡ字；z氨酸、二棕櫚酰磷脂?；z氨酸、腦磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二肉豆蔻酰鞘磷脂、磷脂酸、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、腦苷脂類(lèi)、二月桂酰磷脂酰膽堿，(1，3)-D-甘露糖基-(1，3)-甘油二酯、氨基苯配醣，3-膽甾烯基-6’(糖基硫代)己基醚糖脂、以及膽固醇及其衍生物。
申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)當(dāng)本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑與鞘磷脂混合時(shí)，前-β-類(lèi)顆粒的所有HDL被除去。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ApoA-I激動(dòng)劑與鞘磷脂作為混合物給藥。
5.3.2治療方法可以通過(guò)任一種合適途徑施用本發(fā)明的ApoA-I肽激動(dòng)劑或肽-脂類(lèi)混合物以確保循環(huán)系統(tǒng)的生物利用率。胃腸外途徑給藥能夠最大限度地實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，包括靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)(IM)、真皮內(nèi)、皮下(SC)以及腹膜內(nèi)(IP)注射。但是，其他給藥途徑也可以使用。例如，通過(guò)口服(包括但不限于攝取、口腔和舌下途徑)實(shí)現(xiàn)胃腸道吸收，只要合適制劑(例如，腸溶衣)能避免或?qū)⒒钚猿煞值慕到鉁p至最小程度，例如在口腔黏膜、胃和/或小腸等惡劣環(huán)境中。替代地，通過(guò)黏膜組織給藥，例如陰道和直腸給藥模式可以用于避免或最小化胃腸道的降解。在另一個(gè)替代實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑可以經(jīng)皮或吸入給藥(例如，經(jīng)皮)。應(yīng)該理解的是優(yōu)選途徑可以隨病情、年齡以及接受者順應(yīng)性不同而改變。
使用的ApoA-I激動(dòng)劑或肽-脂類(lèi)復(fù)合物的確切劑量隨給藥途徑的不同而改變，而且應(yīng)該調(diào)整實(shí)現(xiàn)循環(huán)血漿濃度為100mg/l～2g/l。本發(fā)明描述的動(dòng)物模型系統(tǒng)中獲得的數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑與HDL成分結(jié)合，人體內(nèi)預(yù)計(jì)半衰期為5天。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，ApoA-I激動(dòng)劑可以0.5mg/kg～100mg/kg的劑量每周一次注射給藥。另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)連續(xù)灌輸或間歇灌輸只要濃度約為0.5mg/kg/hr～100mg/kg/hr，可以保持期望的血清濃度。
用用于測(cè)定LD50(群體的半數(shù)致死量)和ED50(群體的半數(shù)有效治療量)的細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)方法，可以測(cè)定出各種ApoA-I激動(dòng)劑的毒性和治療效果。毒性和治療效果之間的劑量比為療效指數(shù)，它可以表達(dá)為L(zhǎng)D50/ED50比值。優(yōu)選表現(xiàn)出大療效指數(shù)的ApoA-I肽。
5.3.3.藥用制劑本發(fā)明的藥用制劑在一種藥物學(xué)上可接受的適于體內(nèi)給藥或釋放的載體中含有作為有效成分的ApoA-I肽激動(dòng)劑或肽-脂類(lèi)復(fù)合物。由于肽可以含酸性和/或堿性末端和/或側(cè)鏈，所以所述肽可以游離酸或堿的形式包括在制劑中，或者以藥物學(xué)上可接受的鹽形式。
可注射制劑包括活性成分在水或油性溶劑中的滅菌懸液、溶液或乳液。組合物還可以包括成劑的藥劑，例如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑。用于注射的制劑可以單位劑量的形式存在，例如，安瓿或多劑量包裝，而且可以包括附加的防腐劑。
替代地，注射制劑可以使用前可用合適溶劑再配制的粉末形式提供，包括但不限于滅菌的無(wú)熱源水、緩沖液、葡萄糖溶液等。所以，可以?xún)龈芍苽銩poA-I激動(dòng)劑，或者制備共凍干的肽-脂類(lèi)復(fù)合物。保存制劑可以單位劑量形式提供，體內(nèi)使用前再配制。
為了實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期釋放，活性成分可以配制成儲(chǔ)存制劑，用于通過(guò)灌輸給藥，例如皮下、經(jīng)皮或肌內(nèi)注射。因此，例如，活性成分可以用合適的多聚體或疏水物質(zhì)(例如，可接受油的乳液)或離子交換樹(shù)脂配制，或者以防護(hù)性可溶性衍生物形式，例如，ApoA-I激動(dòng)劑的防護(hù)性可溶性鹽形式。
替代地，可以使用經(jīng)皮釋放系統(tǒng)，經(jīng)皮釋放系統(tǒng)制備成能緩慢釋放用于經(jīng)皮吸收的活性成分的吸附性圓盤(pán)或貼片(patch)。所以，為此目的，滲透增強(qiáng)劑可以用于促進(jìn)活性成分的經(jīng)皮滲透。通過(guò)將本發(fā)明的ApoA-I激動(dòng)劑或肽-脂類(lèi)復(fù)合物引入到一個(gè)用于缺血性心臟病和血膽脂醇過(guò)多患者的硝酸甘油貼片中，可以實(shí)現(xiàn)一種特別的優(yōu)勢(shì)。
為了能夠用于口服，所述藥用制劑可以采用，例如，片劑或膠囊形式，通過(guò)常規(guī)方法用藥物學(xué)上可接受賦形劑例如結(jié)合劑(例如，預(yù)先凝膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法包裹片劑。用于口服的液體制劑可以采用，例如，溶液、糖漿劑或懸液，或者它們可以被制備成使用前用水或其他合適溶劑再配制的干燥產(chǎn)物。用藥物學(xué)上可接受的添加劑，例如懸浮劑(例如，山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化的可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水溶劑(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分餾菜子油)；以及防腐劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。所述制劑還可以包括緩沖鹽、調(diào)味、著色及甜味劑作為合適形式?？诜苿┛梢赃m當(dāng)配制使活性化合物控制釋放。
為了能用于口服給藥，所述組合物采用常規(guī)方式配制成的片劑或膠質(zhì)軟糖。用于直腸或陰道途徑給藥時(shí)，活性成分可以配制成溶液(用于保持灌腸)栓劑或油膏。用于吸入給藥時(shí)，活性成分可以采用從加壓包或噴霧器釋放出的氣溶膠噴霧形式，使用一種合適的推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合適氣體。加壓氣溶膠情況下，通過(guò)提供一個(gè)計(jì)量釋放的閥門(mén)，可以測(cè)定出劑量單位。例如用于吸入器或吹藥器中的白明膠的膠囊和藥筒可以配制成含有化合物與一種合適粉末基質(zhì)例如乳糖或淀粉的粉末狀混合物。
如果需要，所述組合物可以存在于一種包裝容器(pack)或分配器中，其中可以含有一個(gè)或多個(gè)含活性成分的單位劑量形式。上述包可以例如包括金屬湖塑料箔，例如泡罩包裝。上述包裝容器或分配器可以配有用藥說(shuō)明書(shū)。
5.4.其他用途本發(fā)明的ApoA-I可以用于測(cè)量血清HDL的體外實(shí)驗(yàn)中，例如用于診斷目的。因?yàn)锳poA-I激動(dòng)劑與血清中的HDL成分結(jié)合，所以該激動(dòng)劑可以用作HDL族群的“標(biāo)示物”。此外，該激動(dòng)劑還可以用作在RCT中發(fā)揮功效的HDL亞群的標(biāo)示物。所以，可以將該激動(dòng)劑加入或與患者血清樣品混合；一段合適的溫育時(shí)間后，通過(guò)檢測(cè)加入的ApoA-I激動(dòng)劑，可以測(cè)定出HDL成分。用經(jīng)過(guò)標(biāo)記的激動(dòng)劑(例如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)、染料等)，或者用特異于該激動(dòng)劑的抗體進(jìn)行免疫測(cè)定，可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
替代地，標(biāo)記后的激動(dòng)劑可以用于成象方法(例如，CAT掃描、MRI掃描)顯象循環(huán)系統(tǒng)，或者監(jiān)測(cè)RCT，或顯象HDL在脂肪條紋、動(dòng)脈粥樣硬化病變等部位的聚積(此處HDL應(yīng)該在膽固醇排出中發(fā)揮作用)。
6.實(shí)施例ApoA-I的肽激動(dòng)劑的合成按照下面分部中描述的方法，合成和定性表X(第8.3節(jié)，下文)中描述的肽。
按照第7和8節(jié)，下文中的描述，從結(jié)構(gòu)和功能上分析上述肽。
6.1.核心肽的合成按照Merrifield技術(shù)(Merrifield，1969，J.Am.Chem.Soc.852149-2154)，用0.25mmol對(duì)烷基苯甲醇樹(shù)脂(HMP resin)(Wang，1973，J.Am.Chem.Soc.951328-1333)和Fmoc化學(xué)品固相合成肽。所有肽的合成均在Applied Biosystems ABI430A型自動(dòng)肽合成儀(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)上完成。下面表V中顯示出了用于每個(gè)偶聯(lián)循環(huán)的溶解和活化時(shí)間
表V單個(gè)偶聯(lián)活化劑循環(huán)
每個(gè)偶聯(lián)步驟之間用NMP洗滌樹(shù)脂。一個(gè)合成循環(huán)的操作見(jiàn)下表VI表VI一個(gè)合成循環(huán)的偶聯(lián)操作
除Fmoc-β-(1-萘基)丙氨酸外，所有氨基酸均以這種方式偶聯(lián)。Fmoc-β-(1-萘基)丙氨酸采取人工偶聯(lián)。對(duì)于人工偶聯(lián)而言，把1mmol Fmoc-β-(1-萘基)丙氨酸和1mmol 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3四甲基脲四氟硼酸(TBTU)溶解于5ml NMP中并與肽-樹(shù)脂混合。此后，加入2mmol N-乙基二異丙胺，混合物振蕩2小時(shí)，用10ml NMP洗滌肽-樹(shù)脂6次。用Kaiser實(shí)驗(yàn)(Kaiser，1970，Anal.Biochem.3459577)檢測(cè)偶聯(lián)效率，如有必要重復(fù)偶聯(lián)。偶聯(lián)萘基丙氨酸后，其余合成步驟均按照上述自動(dòng)進(jìn)行。
6.2.肽酰胺化物的合成如表X(第8.3節(jié)，下文)所示，用一種含F(xiàn)moc-Rink酰胺手柄4-(2’，4’-二甲苯)-Fmoc-苯氧甲基(Rink，1987，Tetrahedron Lett.283787-3790)和第6.1節(jié)，上述中描述的合成方法合成肽酰胺化物。
6.3.N-末端?；牡暮铣扇绫鞽(第8.3節(jié)，下文)所示，通過(guò)讓按照第6.1或6.2節(jié)，下文描述制備的樹(shù)脂-結(jié)合肽與合適的?；噭┙佑|，制備出所述肽的N-末端酰化形式。
就N-末端?；亩?，每1g樹(shù)脂-結(jié)合肽中加入15ml醋酸酣溶液(NMP中10％v/v比)，混合物振蕩5min，過(guò)濾回收樹(shù)脂。用NMP(15ml)洗滌回收后的樹(shù)脂3次，并用乙醇(15ml)洗滌3次。
6.4.切割和去保護(hù)合成后，從樹(shù)脂中切割出第6.1，6.2和6.3節(jié)，上述描述的肽，用含92.5％三氟乙酸(TFA)/3.75％苯甲醚/3.75％十二烷基硫醇(v/v/v)。為了實(shí)現(xiàn)切割，向0.25mmol肽樹(shù)脂中加入10ml切割溶液，室溫振蕩1.5小時(shí)。過(guò)濾除去樹(shù)脂，用二乙醚沉淀切割后/去保護(hù)后的肽，乙醚洗滌，真空干燥。
對(duì)于含Trp(W)肽以及對(duì)于肽酰胺的切割雞尾酒由下述成分組成86.5％TFA、4.5％H2O，4.5％1，2-乙二硫醇、4.5％苯甲醚以及3％苯酚。
6.5.純化用反相HPLC純化第6.4節(jié)中的粗制、切割后的肽。用不同的分析技術(shù)(分析HPLC、毛細(xì)管電泳)驗(yàn)證每個(gè)肽的純化。在長(zhǎng)為70cm和內(nèi)徑為75μm的熔化二氧化硅毛細(xì)管(熱分離產(chǎn)品)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。25℃、15kV的條件下，在下述兩種不同緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行分離35min.緩沖液1(20mM Na2B4O7，pH9.2)和緩沖液2(10mM Na2HPO4，pH2.5)。用250×21mm的Nucleosil 7C18或Nucleosil 7C4柱(Macherey and Nagel，Germany)進(jìn)行HPLC分離，流速為8ml/min。用0.1％TFA水溶液(溶劑A)和0.1％TFA乙腈溶液(溶劑B)的混合物進(jìn)行梯度洗脫。對(duì)所用梯度進(jìn)行調(diào)整以滿(mǎn)足每個(gè)肽的需要。
6.6.特征描述按照下述方法，用質(zhì)譜和氨基酸分析對(duì)第6.5節(jié)中描述的純化肽分別進(jìn)行質(zhì)譜和氨基酸分析。用Edman降解法進(jìn)行測(cè)序。
6.6.1.LC-MS用一種標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)化三級(jí)四重峰質(zhì)譜儀(TSQ 700型；Finnigan MAT，San Jose CA，USA)進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。用空氣輔助電子噴霧(ESI)界面把樣品導(dǎo)入到質(zhì)譜儀的大氣壓電離源。4.5kV正電勢(shì)下進(jìn)行界面噴霧。鋼毛細(xì)管溫度采用200℃而多支管采用70℃。這種離子蒸發(fā)方法產(chǎn)生的陽(yáng)離子進(jìn)入質(zhì)譜儀的分析器中。將增效器調(diào)至100V。質(zhì)譜儀的分析器室為4E-6。所有探測(cè)均在小于1μ的分辨率下進(jìn)行。
用由一個(gè)注射泵(140B型)、一個(gè)UV探頭(785A型)和一個(gè)烘箱/注射器組成的ABI(Applied Biosystems)微孔系統(tǒng)，通過(guò)直接灌輸對(duì)肽進(jìn)行分析。溶劑系統(tǒng)由水(溶劑A)和乙腈(溶劑B)組成，每種溶劑中含0.1％TFA。用梯度或等度方法注入肽，并從AquaporeC18柱中洗脫出來(lái)。流速典型地為300μl/min。每種肽的濃度為約0.03mg/ml，每種各注入20μl(例如，30pmol)。
通過(guò)從500-1500m/z四重掃描4S，獲得全掃描MS實(shí)驗(yàn)。用αDEC平臺(tái)獲得數(shù)據(jù)，并用Finnigan MAT(BIOWORKS)提供的軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
6.6.2.氨基酸分析用ABI(Applied Biosystems)420氨基酸分析儀，進(jìn)行氨基酸分析。該系統(tǒng)由3個(gè)組件組成一個(gè)水解和衍生(derivatisation)裝置、一個(gè)反相HPLC和一個(gè)數(shù)據(jù)系統(tǒng)。將肽樣品加樣(一式三份共3次)到多孔玻璃載片上，然后在氣相條件(155℃，90min.)進(jìn)行水解。除去HCL后，用PITC(異硫氰酸苯酯)將得到的氨基酸轉(zhuǎn)化為PTC-AA(硫羥氨基甲酸苯酯-氨基酸)。轉(zhuǎn)移到HPC樣品環(huán)管后，控溫條件下用梯度模式(試劑A50mmol乙酸胺(NH4Ac)，pH5.4，溶于水；試劑B32mmol乙酸鈉(NaOAc)溶于含水乙腈)在Aquapore Cl8柱上對(duì)得到的混合物進(jìn)行分離。用應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)提供的軟件包處理HPLC數(shù)據(jù)。依據(jù)應(yīng)用生物系統(tǒng)供應(yīng)的肽標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行定量。
6.7.分枝網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的合成按照Demoor et al.，1.996，Eur.J.Biochem.23974-84中描述的方法，合成四聚體-核心肽樹(shù)脂和三聚體-核心肽樹(shù)脂。然后，將仍連接在4-甲基二苯甲基胺樹(shù)脂上的四聚體及三聚體基質(zhì)作為初始的肽-樹(shù)脂，用于上述核心肽的自動(dòng)合成。
用本領(lǐng)域熟知的正交合成和保護(hù)策略，能夠合成出含有氨基酸組成不同的螺旋節(jié)段的分枝網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
7.實(shí)施例ApoA-I肽的結(jié)構(gòu)和肽結(jié)合分析用圓二色法(CD)、熒光光譜以及核磁共振(NMR)，對(duì)按照第6節(jié)，上文中描述合成的純化肽的結(jié)構(gòu)和肽結(jié)合特性進(jìn)行測(cè)定。
7.1.圓二色法該實(shí)施例描述了一種用于測(cè)定本發(fā)明核心肽在游離存在于緩沖液以及存在脂類(lèi)兩種情況下的螺旋程度。
7.1.1.實(shí)驗(yàn)方法用一個(gè)裝有熱電細(xì)胞控制儀及樣品交換器的AVIV62DS分光計(jì)(AVIV Associates，Lakewood，NJ，USA)，記錄190～260nm之間的遠(yuǎn)UV圓二色譜。該裝置用(+)-10-樟腦酸校準(zhǔn)。在1和3之間，收集每個(gè)樣品的，分別用10cm、5cm、1cm和0.1cm的路徑長(zhǎng)度石英Suprasil池，肽濃度為10-7M～10-4M。帶寬固定為1.5nm，掃描速度為每個(gè)波長(zhǎng)步驟1S。報(bào)道的數(shù)據(jù)是至少2或3個(gè)獨(dú)立裝置的平均值。
消除背景后，將光譜轉(zhuǎn)化為每個(gè)殘基的克分子橢圓率(θ)deg.cm-2dmol-1。用氨基酸分析測(cè)定肽濃度，并且當(dāng)肽含有一個(gè)發(fā)色團(tuán)(色氨酸、丹酰、萘基丙氨酸)時(shí)再用Perkin Elmerλ17UV/可見(jiàn)光分光光度計(jì)通過(guò)吸收光譜測(cè)定法測(cè)定肽濃度。
用游離、未結(jié)合肽(以5μM存在于5mM磷酸鹽緩沖液中，pH7.4)、用肽-SUV復(fù)合物(201 EPCChol.，Ri＝50)、用肽-膠束復(fù)合物(1-肉豆蔻酰-2-羥基-錫(sn)-丙三氧基-3-磷脂酰膽堿，Ri＝100)、以及用存在于2，2，2-三氟乙醇(TFE)(5μM肽，90％體積的TFE)中游離、未結(jié)合肽，獲得CD譜。
N2鼓泡5min把脂類(lèi)(10mM，20∶1 EPCChol.，Avanti PoiarLipids，AL)分散在磷酸鹽緩沖液(5mM，pH7.4)中，然后水浴超聲儀超聲波處理(1.5小時(shí))，得到SUVs。用FPLC檢驗(yàn)制劑的均一性。
N2鼓泡5min把脂類(lèi)(6mM 1-肉豆蔻酰-2-羥基-錫(sn)-丙三氧基-3-磷脂酰膽堿，Avanti極性脂類(lèi)，AL)分散在磷酸鹽緩沖液(5mM，pH7.4)中，然后旋渦振蕩得到膠束。
為了得到肽-SUV復(fù)合物，以100的脂類(lèi)-肽摩爾比(Ri)將SUVs加入到肽(以5μM存在于5mM磷酸鹽緩沖液中，pH7.4)中。
為了得到肽-膠束復(fù)合物，以100的Ri將SUVs加入到肽(以5μM存在于5mM磷酸鹽緩沖液中，pH7.4)中。
37℃下記錄所有譜。通過(guò)在一系列不同溫度下的記錄譜，測(cè)定肽210(SEQ ID NO210)作為一個(gè)溫度官能團(tuán)的穩(wěn)定性(游離存在于緩沖液和膠束中)。
另外還測(cè)定了肽210(SEQ ID NO210)作為一個(gè)濃度官能團(tuán)的螺旋程度。
7.1.2.螺旋度的測(cè)定從222nm處平均殘基橢圓率(Chen et al.，1974，Biochemistry133350-3359)，或用CONTIN曲線(xiàn)擬合算法，版本2DP，1CD包裝(Aug.1982)(Provencher，1982，Comput.Phys.Commun.27213-227，229-242)將得到的CD譜與從數(shù)據(jù)庫(kù)得到的標(biāo)準(zhǔn)譜(1.6螺旋標(biāo)準(zhǔn)譜出自Provencher & Glockner，1981，Biochemistry 203337；變性蛋白標(biāo)準(zhǔn)譜出自Venyaminov et al.，1993，Anal.Biochem.21417-24)進(jìn)行對(duì)比，測(cè)定出各種條件下肽的螺旋程度。用CONTIN算法提供的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析法測(cè)定出可接受的擬合。所有方法的誤差為±5％螺旋度。
7.1.3.結(jié)果第8.3節(jié)，下文的表X報(bào)道了游離的未結(jié)合肽(游離)、肽-SUV復(fù)合物(SUVs)、肽-膠束復(fù)合物(mics)以及肽-TFE溶液(TFE)的螺旋程度(％)。
肽210(SEQ ID NO210)在膠束中含有明顯的α-螺旋結(jié)構(gòu)(63％螺旋度)。而且，該α-螺旋結(jié)構(gòu)在5℃～45℃溫度范圍內(nèi)時(shí)完全穩(wěn)定的(數(shù)據(jù)未顯示)。存在TFE時(shí)，肽210(SEQ ID NO210)的螺旋度也增加，由于TFE的介電常數(shù)(ε＝26.7)明顯小于水(ε＝78.4)，所以TFE是一種濃度為5～90％(V/V)時(shí)能夠穩(wěn)定α螺旋和肽間氫鍵的溶劑。
從第8.3節(jié)，下文的表X中可以看出，脂類(lèi)存在時(shí)，那些表現(xiàn)出較高LCAT活性度(≥38％)的肽通常具有明顯的α螺旋結(jié)構(gòu)(含22或更多個(gè)氨基酸的未封閉肽或含18或更少個(gè)氨基酸的封閉肽具有≥60％螺旋結(jié)構(gòu)；含18或更少個(gè)氨基酸的未封閉肽具有≥40％螺旋結(jié)構(gòu))，而幾乎或根本不表現(xiàn)LCAT活性的肽幾乎不具有α螺旋結(jié)構(gòu)。但是，一些情況下，脂類(lèi)存在時(shí)含有明顯α螺旋結(jié)構(gòu)的肽不表現(xiàn)明顯的LCAT活性。因此，由于在脂類(lèi)存在時(shí)能夠形成α螺旋結(jié)構(gòu)的能力似乎是LCAT活化的先決條件，所以在脂類(lèi)存在時(shí)本發(fā)明核心肽調(diào)整α螺旋結(jié)構(gòu)的能力被認(rèn)為本發(fā)明核心肽的關(guān)鍵特征。
7.2熒光光譜學(xué)含色氨酸(Trp或W)或萘基丙氨酸(Nal)的情況下，用標(biāo)記后的肽通過(guò)熒光測(cè)量來(lái)測(cè)試第6節(jié)，下文中合成的肽的脂類(lèi)結(jié)合特性。在裝有一個(gè)150W氙燈、兩個(gè)單色器(激發(fā)和發(fā)射)、一個(gè)用于檢測(cè)850nm處(紅光)敏感度的光電倍增管R928以及一個(gè)熱電磁攪拌池控制器(thermoelectric magnetic stirred cell holder)的Fluoromaxfrom Spex(Jobin-Yvon)上記錄熒光光譜。微摩爾濃度范圍內(nèi)用Quartz Suprasil比色杯進(jìn)行測(cè)量。一種裂縫可變(0.4～5nm)的儀器使得能夠根據(jù)所用肽的濃度調(diào)整入射和發(fā)射強(qiáng)度。報(bào)道數(shù)值通常是2～4譜的平均值。通過(guò)Philips PU 8800上的吸收光譜，用Trp(Tris緩沖液中ε280nm＝5,550M-1cm-1)或Nal(甲醇中ε224nm＝92,770M-1cm-1)的吸收譜帶測(cè)定肽濃度。
含有和不含脂類(lèi)載體的(20mM，pH＝7.5)的情況下，在Tris-HCl緩沖液中記錄290nm～450nm之間的熒光光譜。用緩沖液再水合凍干磷脂、分散以及在N2氣流下尖端超聲處理后，形成小單層脂質(zhì)體。使用的脂類(lèi)為卵PC/Chol.(20∶1)or POPC/Chol.(20∶1)。在肽濃度為2μM和溫度為37℃的條件下記錄光譜。含Trp的熒光標(biāo)準(zhǔn)參照物為N-乙酰色氨酰胺(N-acetyltryptophanylamide)(NATA)。
通過(guò)向濃度為2μM的肽溶液中連續(xù)加入脂類(lèi)載體(裂縫5nm激發(fā)以及1.5nm發(fā)射)。要將稀釋效應(yīng)考慮到熒光濃度測(cè)定中。脂類(lèi)濃度在10～600μM的范圍內(nèi)變化，脂類(lèi)與肽的摩爾比(Ri)在5～300之間變化。對(duì)于Trp和Nal兩種情況下激發(fā)波長(zhǎng)均設(shè)定在280nm。
7.2.1熒光光譜實(shí)驗(yàn)直接記錄數(shù)據(jù)，并用來(lái)自Spex的DM3000F的軟件通過(guò)連接到分光熒光計(jì)上的IBM-PC進(jìn)行處理。通過(guò)扣除溶劑作用，并通過(guò)把構(gòu)造器給定系數(shù)的應(yīng)用考慮到與波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的光電倍增器效應(yīng)中，校正光譜。用它們的熒光發(fā)射最大值和與NATA相比色氨酸標(biāo)記肽的量子產(chǎn)量，對(duì)所述肽的熒光光譜進(jìn)行定性。通過(guò)計(jì)算熒光發(fā)射最大值處波長(zhǎng)的遷移(λmax)以及相對(duì)于脂類(lèi)濃度的發(fā)射熒光相對(duì)值，分析結(jié)合脂類(lèi)的過(guò)程。相對(duì)熒光強(qiáng)度定義為下述比值(I-Io)λmax/Ioλmax。在對(duì)應(yīng)于肽初始游離態(tài)，即不含脂類(lèi)的(λmax)處測(cè)定I和Io兩個(gè)值。I是在特定的脂類(lèi)與肽比值處的強(qiáng)度，Io是不含脂類(lèi)時(shí)測(cè)定的同一參數(shù)。這些變化的缺乏同所述肽與脂類(lèi)之間的相互作用的缺乏相關(guān)。
7.2.2結(jié)果和討論肽199(SEQ ID NO199)的脂類(lèi)結(jié)合特性見(jiàn)表VII，除在第10位上含有一個(gè)W(Trp)殘基外，肽199的一級(jí)序列與肽210(SEQ ID NO210)相似。
表VII熒光測(cè)定的肽199(SEQ ID NO199)與脂類(lèi)載體的結(jié)合特性
在濃度為2μM的緩沖液中，肽199(SEQ ID NO199)的色氨酸熒光發(fā)射最大值(λmax)為348nm。這一點(diǎn)與當(dāng)同NATA相比時(shí)相對(duì)暴露于水環(huán)境的色氨酸一致。如同色氨酸的包埋(色氨酸的最大熒光發(fā)射的波長(zhǎng)從348nm變化到325nm)以及高熒光強(qiáng)度的升高表明的那樣(見(jiàn)Table VII)，肽199(SEQ ID NO199)能夠非常有效地結(jié)合EPC/Chol(20∶1)小單層脂質(zhì)體。當(dāng)脂類(lèi)與肽之間的摩爾比約100時(shí)，色氨酸的包埋程度最大。
用第7.1節(jié)，上文中描述的圓二色法測(cè)定時(shí)存在脂類(lèi)條件下表現(xiàn)出高度螺旋(對(duì)于≥22個(gè)氨基酸的未封閉肽或≤18個(gè)氨基酸的封閉肽來(lái)說(shuō)≥60％；對(duì)于≤18個(gè)氨基酸的未封閉肽來(lái)說(shuō)≥40％)的其他肽也顯示出良好的脂類(lèi)結(jié)合特性。當(dāng)然，在用圓二色法篩選選定的所有肽中，只對(duì)那些能隨后發(fā)出熒光的肽才對(duì)其脂類(lèi)結(jié)合特性進(jìn)行測(cè)試。
7.3核磁共振(NMR)該實(shí)施例描述了用于測(cè)定本發(fā)明核心肽結(jié)構(gòu)的NMR方法。
7.3.1NMR樣品制備把5mg肽溶解于其中含有痕量2，2-二甲基-2-硅雜-5-戊烷磺酸(DSS)作為內(nèi)源化學(xué)位移參照物的90％H2O/1.0％D2O中，制備成樣品。上述樣品中的一些含有三氟乙醇(TFE)(表示為體積百分比)。樣品總體積為500μl，肽濃度約為5mM。
7.3.2核磁共振(NMR)譜學(xué)用裝有一個(gè)B-VT2000溫控單元的Bruker DRX500分光計(jì)，獲得500MHz處的1H核磁共振譜。用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列記錄一及二維實(shí)驗(yàn)。(Two Dimensional NMR Spectroscopy，Eds.W.R.Croasmun and RMKCarlson，1994，VCH Publishers，New York，USA)。低功率預(yù)磁飽和2秒鐘完成水抑制。時(shí)間比例的相增加(TpPI)和兩個(gè)方向均為600Hz的譜寬，按照相敏模式(phase sensitive mode)進(jìn)行二維實(shí)驗(yàn)。典型地，把40掃描共加入到帶有2048個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的400t1。用FELIX95軟件(Molecular Simulations)在INDIGO2工作站(Silicon Graphics)上處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)歸0以得到一個(gè)2K×2K數(shù)據(jù)矩陣，并用45°移位直角正弦-圓錐函數(shù)(45°shifted squaredsine-bell function)變跡(apodized)。
7.3.3NMR測(cè)定用文獻(xiàn)(Wuthrich，NMR of Proteins and Nucleic Acids，1986，John Wiley & Sons，New York，USA)中描述的DQFCOSY、TOCSY和NOESY波譜，應(yīng)用連續(xù)測(cè)定技術(shù)得到完全質(zhì)子共振測(cè)定。通過(guò)從相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)值中減去列表顯示的無(wú)規(guī)卷曲化學(xué)位移(Wishart and Sykes，1994，Method.Enz.239363-392)，計(jì)算出HN和Hα質(zhì)子的次級(jí)化學(xué)位移。
7.2.3結(jié)果與討論常規(guī)考慮。由于在NMR波譜所需的高濃度下兩親性螺旋肽往往會(huì)在水溶液中聚集，所以這就使得難以得到高分辨率波譜。已知TFE能夠溶解肽，此外還能穩(wěn)定具有螺旋特性的肽的螺旋構(gòu)象。從NMR波譜的發(fā)現(xiàn)的表明肽210(SEQ ID NO210)是一個(gè)代表性的實(shí)例。對(duì)Segrest的共有22聚體(SEQ ID NO75)進(jìn)行了對(duì)照研究。
次級(jí)化學(xué)位移。氨基酸的質(zhì)子化學(xué)位移取決于殘基類(lèi)型以及肽或蛋白中的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)(Szlagyi，1.995，Progress in NuclearMagnetic Resonance Spectroscopy 27325-443)。因此，通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)位移和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象列表顯示的數(shù)值，能夠鑒定規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)。
典型地，α螺旋的形成能導(dǎo)致Hα共振的高磁場(chǎng)(負(fù))位移。通常，把觀察到幾個(gè)連續(xù)殘基的高磁場(chǎng)(負(fù))位移作為螺旋結(jié)構(gòu)的證據(jù)。肽210(SEQ ID NO21.0)在25％TFE、295K條件下，的Hα次級(jí)位移表明4～15位殘基出現(xiàn)明顯的負(fù)位移。與肽21(SEQ ID NO21.0)相比，在共有22聚體的Hα化學(xué)位移中發(fā)現(xiàn)了細(xì)微的差別。相對(duì)于從無(wú)規(guī)卷曲觀察到的化學(xué)位移，存在于α螺旋區(qū)域中的氨基酸殘基酰胺氫(amide hydrogens)的化學(xué)位移也是高磁場(chǎng)位移。此外，還能觀察到HN位移的周期性，這反映了螺旋翻轉(zhuǎn)的周期。沿序列位移變化的幅度與螺旋肽的兩親性相關(guān)。較高的疏水矩能夠?qū)е赂语@著的振動(dòng)(Zhou et al.，1992，J.Am.Chem.Soc.11.44320-4326)。肽210(SEQ ID NO210)在25％TFE、295K條件下的HN次級(jí)位移表明了一種與螺旋的兩親性本質(zhì)一致的擺動(dòng)性(圖7B)。
氨基酸的取代能夠?qū)е赂用黠@的沿全序列的周期性(圖7B)。該模式清楚地反映了與Segrest的共有22聚體相比，肽210(SEQ IDNO21.0)較強(qiáng)的兩親性本質(zhì)?？梢宰R(shí)別出存在著4～5個(gè)螺圈。
酰胺質(zhì)子的次級(jí)位移受從氫鍵到距離螺旋一個(gè)螺圈的羰基氧的長(zhǎng)度影響。因此，觀察到的化學(xué)位移值的周期性反映出不同的氫鍵長(zhǎng)度。這種差異與螺旋骨架的整個(gè)彎曲螺旋的形狀有關(guān)。疏水殘基位于凹面上。肽210(SEQ ID NO210)的次級(jí)位移表明了一種彎曲的α螺旋構(gòu)象。
8.實(shí)施例LCAT活化分析對(duì)按照上述第6節(jié)中描述合成的肽的活化LCAT的能力進(jìn)行體外分析。在LCAT分析中，用等效質(zhì)量的肽ApoA-I(分離自人血漿中)對(duì)由卵磷脂酰膽堿(EPC)或μM棕櫚酰-2-油烯基-磷脂酰膽堿(POPC)和放射性標(biāo)記的膽固醇組成的基質(zhì)載體(小單層脂質(zhì)體或″SUVs″)進(jìn)行預(yù)溫育。用作陽(yáng)性對(duì)照的原始ApoA-I表現(xiàn)出100％的活化活性。肽的″特定活性″(即，活性單元(LCAT活化)/單位質(zhì)量)可以計(jì)算為能最大程度活化LCAT的肽濃度。例如，可以對(duì)肽的一系列濃度(例如，有限稀釋)進(jìn)行分析，測(cè)定肽的“特定活性”--能在分析中特定時(shí)間點(diǎn)(例如，1小時(shí))實(shí)現(xiàn)最大程度LCAT活化(即，膽固醇到膽固醇酯的轉(zhuǎn)化百分比)的濃度。當(dāng)測(cè)繪例如在1小時(shí)時(shí)間點(diǎn)膽固醇相對(duì)于所用肽濃度的轉(zhuǎn)化百分比時(shí)，可以將“特定活性”定義為達(dá)到測(cè)繪曲線(xiàn)上平臺(tái)的肽濃度。
8.1基質(zhì)囊泡的制備LCAT分析中使用的囊泡是由卵磷脂酰膽堿(EPC)或1-棕櫚酰-2-油烯基-磷脂酰膽堿(POPC)和膽固醇按20∶1的摩爾比組成的SUVs。為了制備足以進(jìn)行40次分析的囊泡原液，將7.7mg EPC(或7.6mg POPC；10μmol)、78μg(0.2μmol)4-14C-膽固醇、116μg膽固醇(0.3μmol)溶解于5ml二甲苯中，并凍干。之后，將4ml分析緩沖液加入到干粉中，4℃下在氮保護(hù)氣氛中超聲波處理。超聲處理的條件為Branson 250超聲波儀、10mm頭、6×5分鐘；分析緩沖液10mM Tris、0.14M NaCl、1mM EDTA、pH7.4)。將超聲波處理后的混合物在14000rpm(16,000×g)下離心6次，每次5分鐘。將得到的上清液用于酶分析。
8.2 LCAT的純化對(duì)于LCAT的純化，用葡聚糖硫酸酯/Mg2+處理人血漿得到無(wú)脂蛋白血清(LPDS)，按照表IX中總結(jié)的代表性純化過(guò)程，將LPDS在苯基瓊脂糖凝膠(Phenylsepharose)、Affigelblue、伴刀豆球蛋白A(ConA)瓊脂糖凝膠和抗-ApoA-I親和層析柱順序?qū)游觯唧w如下表IXLCAT的純化
8.2.1LPDS的制備為了制備LPDS，將500ml血漿加入到50ml葡聚糖硫酸酯(MW＝500000)溶液中。攪拌20分鐘4℃下3000rpm(16,000×g)離心30分鐘。將上清(大約500ml)用于進(jìn)一步純化。
8.2.2苯基瓊脂糖凝膠層析下列物質(zhì)和條件用于苯基瓊脂糖凝膠層析。固相 苯基瓊脂糖凝膠高速流，高物質(zhì)等級(jí)(high subst.Grade)，Pharmacia柱體 XK26/40，凝膠床高度33cm，V＝約175ml流速 200ml/hr(樣品)80ml/hr(蒸餾水)洗滌 200ml/hr(緩沖液)洗脫 80ml/hr(蒸餾水)緩沖液 10rnM Tris，140rnM NaCl，1rnM EDTA pH7.4，0.01％疊氮鈉用Tris-緩沖液平衡柱體，向500ml LPDS中加入29g NaCl，并加到柱體上。用幾倍體積的Tris-緩沖液洗滌直到280nm波長(zhǎng)處的吸光度約在基線(xiàn)上為止，然后開(kāi)始用蒸餾水洗脫。收集含蛋白的級(jí)分(池容量180ml)，并將其用于Affigelblue層析。
8.2.3.Affigelblue層析4℃下，用20rnM Tris-HCl，pH7.4，0.01％疊氮鈉，過(guò)夜透析苯基瓊脂糖凝膠的收集液。超濾(Amicon YM30)將收集液體積縮小到50～60ml，并將其上樣到Affigelblue柱上。固相 Affigelblue，Biorad，153-7301柱，XK26/20，凝膠床高度 約13cm；柱體容積約70ml流速 上樣15ml/h洗滌 50ml/h用Tris-緩沖液平衡柱體，將苯基瓊脂糖凝膠收集液加到柱體上。平行地開(kāi)始收集級(jí)分。用Tris-緩沖液洗滌。將收集到的級(jí)分用于ConA層析。
8.2.4 ConA層析用Amicon(YM30)將Affigelblue收集液體積縮小到50～60ml，4℃下，并用ConA初始緩沖液(1mM Tris HCl PH7.4；1mM MgCl2，1mMMnCl2，1mM CaCl2，0.01％疊氮鈉)過(guò)夜透析苯基瓊脂糖凝膠的收集液。固相 ConA瓊脂糖凝膠(Pharmacia)柱體 XK26/20，凝膠床高度14cm(75ml)流速 上樣40ml/h洗滌(用初始緩沖液)90ml/h洗脫50ml/h，0.2M甲基-α-D-甘露糖苷溶于lmM Tris，pH7.4。收集甘露糖苷洗脫液的蛋白級(jí)分(110ml)，超濾(YM30)將體積縮小到44ml。將ConA收集液分裝為2ml的等分試樣，-20℃保存。
8.2.5抗-ApoA-I親和層析在Affigel-Hz基質(zhì)(Biorad)上進(jìn)行抗-ApoA-I親和層析，該基質(zhì)上已經(jīng)共價(jià)偶聯(lián)有抗-ApoA-I抗體。XK16/20，V＝16ml。用PBS pH7.4平衡柱體。在上樣到柱體之前用PBS對(duì)2ml ConA收集液透析2小時(shí)。流速 上樣15ml/小時(shí)洗滌(PBS)40ml/小時(shí)。將收集到的蛋白級(jí)分(V＝14ml)用于LCAT分析。
用0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH4.5)洗脫結(jié)合的A-I(100ml)，使柱體再生，該操作后立即用PBS再平衡。
8.3結(jié)果LCAT活化分析的結(jié)果見(jiàn)表X，下文。
表X用例舉的核心肽顯示LCAT活化
1/Segrest′s的共有22聚體肽(Anantharamaiah et al.，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105)
2/[A13]共有22聚體肽(Anantharamaiah et a1.，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105).
3/[R13]共有22聚體肽(Anantharamaiah et al.，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105).
4/ID-3肽(Labeur et al.，1997，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology 17(3)580-588).5/Ac-18AMOD-C(O)NH2肽(Epand et al.，1987，J.Biol.Chem.262(19)9389-9396).6/Ac-18AM4-C(O)NH2肽(Brasseur，1993，Biochim.Biophys.Acta 11701-7).
7/18L肽(Segrest et al.，1990，ProteinsStructure，F(xiàn)unction and Genetics 8103-117).8/18A肽(Anantharamaiah et al.，1985，J.Biol.Chem.260(18)10248-10255).9/18AM4肽(Rosseneu et al.，WO93/25581；Corijn et al.，1993，Biochim.Biophys.Acta 11708-16).10/[G]u1，6；Leu5，11，17]18A 肽(Epand et al.，1987，J.Biol.Chem.262(19)9389-9396).11/Ac-18AM3-C(O)NH2(Rosseneu et al.，WO93/25581).12/Ac-18AM2-C(O)NH2(Rosseneu et al.，WO93/25581).
13/Ac-18AMl-C(O)NH2(Rosseneu et al.，WO93/25581).
表X中，*表示N-末端乙?；褻-末端酰胺化的肽；1表示N-末端丹磺?；碾模籹p表示在實(shí)驗(yàn)條件下溶解出現(xiàn)問(wèn)題的肽；X為Aib；Z為Nal；O為Orn；He(％)代表螺旋百分度；mics代表膠束；以及～代表缺失的氨基酸。
9.實(shí)施例ApoA-I激動(dòng)劑的藥物動(dòng)力學(xué)用下列實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虮砻?，ApoA-I激動(dòng)劑能穩(wěn)定地存在于循環(huán)系統(tǒng)，并于血漿中的HDL成分結(jié)合。
9.1.放射性標(biāo)記肽的合成偶聯(lián)14C-標(biāo)記氨基酸作為N-末端氨基酸，合成放射性標(biāo)記肽。根據(jù)L.Lapatsanis，Synthesis，1983，671-173，進(jìn)行合成。簡(jiǎn)而言之，將250μM未標(biāo)記N-末端氨基酸溶解于225μl 9％Na2CO3溶液中，并加入到9.25MBq(250μM)14C-標(biāo)記的N-末端氨基酸溶液(9％Na2CO3)中。將該液體冷卻到0℃，與溶解于0.75ml DMF中的600μM(202mg)9-芴基甲基-N-琥珀酰碳酸(Fmoc-OSu)混合，室溫振蕩4小時(shí)。然后用二乙醚(2×5ml)和氯仿(1×5ml)抽提混合物，用30％HCl酸化剩余的水相(5×8ml)。Na2SO4干燥有機(jī)相，濾出，在氮流下將體積縮小到5ml。用TLC(CHCl)∶MeOH∶Hac，9∶1∶0.1v/v/v，穩(wěn)定相RPTLC silicagel 60，Merck，Germany)測(cè)算純度。
將含14C-標(biāo)記Fmoc氨基酸的氯仿溶液直接用于肽的合成。按照第6節(jié)中的描述，自動(dòng)合成一種含2～22氨基酸的肽樹(shù)脂。用Edman降解法測(cè)定所述肽的序列。按照第6.1節(jié)中的描述進(jìn)行偶聯(lián)。
9.2.小鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，向用一般鼠料或特殊的Thomas-Harcroft改良食物(導(dǎo)致VLDL和IDL膽固醇劇烈升高)飼喂的小鼠腹膜內(nèi)注射2.5mg/kg放射性標(biāo)記后的肽。在多個(gè)時(shí)間間隙，取血樣用于血漿放射性分析。
9.3.人血清中的穩(wěn)定性下面的描述顯示了本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑在人血清中的穩(wěn)定性。
9.3.1.實(shí)驗(yàn)方法取100μg14C-標(biāo)記肽(按照第9.1節(jié)，上文中的描述制備而成)，與2ml of新鮮的人血漿混合(37℃下)，然后立即(對(duì)照樣品)或37℃下溫育8天(測(cè)試樣品)后分層。用等體積的2∶1(v/v)氯仿∶甲醇抽提，實(shí)現(xiàn)分層。將樣品上樣到一個(gè)反相C18 HPLC柱上，并用線(xiàn)性梯度(33min內(nèi)25～58％)的乙腈(含0.1％TFA)洗脫。然后，測(cè)定洗脫分布圖的吸光度(220nm)和放射活性。
9.4.前-β樣顆粒的形成下面的描述顯示了ApoA-I激動(dòng)劑形成前-β樣顆粒的能力。
9.4.1.實(shí)驗(yàn)方法在濃度為d＝1.21g/ml的條件下，通過(guò)KBr密度超速離心分離人HDL得到頂層級(jí)分，然后進(jìn)行Superose 6凝膠過(guò)濾層析從其他脂蛋白中分離出HDL。根據(jù)用Bradford蛋白分析測(cè)定的蛋白成分，用生理鹽水將分離到的HDL調(diào)整到終濃度為1.0mg/ml。從分離的HDL制劑中取出300μl的一等份試樣，用100μl14C-標(biāo)記肽37℃下溫育2分鐘。對(duì)5份單獨(dú)溫育實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行分析，其中包括一份含100μl生理鹽水的空白對(duì)照和4份14C-標(biāo)記肽的稀釋液(i)0.20μg肽∶HDL，比例為1∶15；(ii)0.30μg肽∶HDL，比例為1∶10；(iii)0.60μg肽∶HDL，比例為1∶5；以及(iv)1.00μg肽∶HDL，比例為1∶3。溫育2小時(shí)后，將200μl等份試樣(總體積＝400μl)上樣到Superose 6凝膠層析柱上，進(jìn)行脂蛋白分離和分析，取100μl用于測(cè)定上樣到柱體上的總放射性。
9.5.ApoA-I激動(dòng)劑與人脂蛋白的結(jié)合9.5.1.實(shí)驗(yàn)方法將14C-標(biāo)記肽與每種脂蛋白(HDL，LDL和VLDL)以及不同脂蛋白混合物進(jìn)行溫育，測(cè)定本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑與人脂蛋白級(jí)分結(jié)合的能力。
在d＝1.21g/ml條件下，用KBr密度超速離心分離人HDL、LDL和VLDL，在Superose 6B大小排阻層析柱上通過(guò)FPLC純化(進(jìn)行層析的條件流速為0.7ml/min，載樣緩沖液為10mM Tris(pH8)、115mM NaCl、2mM EDTA和0.01％NaN3)。按肽∶脂蛋白為1∶5(質(zhì)量比)的比例，37℃下用HDL、LDL和VLDL溫育脂蛋白2小時(shí)。將所需量的脂蛋白(根據(jù)生產(chǎn)100μg需要量確定的體積)與0.2ml肽原液(1mg/ml)混合，用0.9％的NaCl將溶液擴(kuò)容到2.2ml。
37℃溫育2小時(shí)后，取一等份試樣(0.1ml)用于液體閃爍計(jì)數(shù)，測(cè)定總放射性，用KBr將剩余溫育混合液的濃度調(diào)整到1.21g/ml，用Beckman臺(tái)式離心機(jī)及TLA 100.3轉(zhuǎn)頭，樣品在4℃、100,000rpm(300,000g)下離心樣品24小時(shí)。從每個(gè)樣品頂層各取0.3ml，對(duì)得到的上清液進(jìn)行總共5級(jí)分的分級(jí)分離。每個(gè)級(jí)分取0.05ml用于液體閃爍計(jì)數(shù)。頂層的兩個(gè)級(jí)分中含有浮選脂蛋白，其他級(jí)分(3～5)中對(duì)應(yīng)于溶液中的蛋白質(zhì)/肽。
9.6.人血漿中本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑選擇性地結(jié)合HDL脂類(lèi)9.6.1.實(shí)驗(yàn)方法為了說(shuō)明在人血漿中本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑能選擇性地結(jié)合HDL蛋白，將20、40、60、80和100μg14C-標(biāo)記肽與2ml人血漿在37℃下溫育2小時(shí)。把濃度調(diào)整至1.21g/ml分離脂蛋白，用TLA 100.3轉(zhuǎn)頭在4℃、100,000rpm(300,000g)下離心36小時(shí)。取頂層的900μl(從300μl級(jí)分中)用于分析。每300μl級(jí)分中取50μl用于放射性計(jì)數(shù)，每300μl級(jí)分中取200μl用FPLC(Superose 6/Superose12混成柱)進(jìn)行分析。
10.實(shí)施例ApoA-I激動(dòng)劑能促進(jìn)膽固醇的排出為了說(shuō)明本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑能促進(jìn)膽固醇的排出，將肝癌細(xì)胞鋪板在6-孔培養(yǎng)皿，生長(zhǎng)至匯合。干燥膽固醇用3H-膽固醇標(biāo)記細(xì)胞，然后向磷酸鹽緩沖液(BSA)中加入1％牛血清白蛋白，超聲處理該溶液，向細(xì)胞中加入0.2ml該標(biāo)記溶液和1.8ml培養(yǎng)基，從而使每孔中含有2μCi放射活性。用標(biāo)記培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。
肽(或蛋白)制備肽(蛋白)∶DMPC之間的比例為1∶2的DMPC復(fù)合物。為了制備出該復(fù)合物，向DMPC的PBS溶液中加入肽或原始人ApoA-I蛋白，室溫溫育過(guò)夜，期間該溶液變得澄清。終溶液中肽或蛋白濃度約為1mg/ml。
除去細(xì)胞中的標(biāo)記培養(yǎng)基，加入復(fù)合物前用PBS洗滌細(xì)胞。向每種細(xì)胞中加入1.6ml培養(yǎng)基，接著用肽(或蛋白)DMPC復(fù)合物和足量PBS將終體積調(diào)至每孔2ml。肽或ApoA-I終濃度約為1、2.5、5、7.5和25μg/ml培養(yǎng)基。37℃下溫育24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，用2ml1％BSA/PBS洗滌細(xì)胞，接著用PBS洗滌2次，每次2ml。用液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定排出到培養(yǎng)基中的3H-膽固醇的量。
11.實(shí)施例ApoA-I激動(dòng)劑在動(dòng)物模型系統(tǒng)中的應(yīng)用用下列方法可以顯示出本發(fā)明ApoA-I在兔體內(nèi)的功效。
11.1.磷脂/肽復(fù)合物的制備用膽固醇透析法制備由磷脂(DPPC)和肽組成的小圓盤(pán)狀顆粒。將磷脂溶解于氯仿中，氮?dú)饬飨赂稍?。?～2mg/ml的濃度將肽溶解于緩沖液(鹽)。將脂類(lèi)薄膜再溶解在含膽固醇的緩沖液中(43℃)，按3∶1的磷脂/肽比例加入肽溶液。43℃下過(guò)夜溫育該混合物，然后43℃透析(24小時(shí))，室溫透析(24小時(shí))，4℃透析(24小時(shí))，在溫度點(diǎn)更換3次緩沖液。過(guò)濾消毒該復(fù)合物用于注射，4℃保存。
1.1.2.11.2.肽/磷脂顆粒的分離和層析用凝膠過(guò)濾柱(Superose 6 HR)分離所述顆粒。通過(guò)測(cè)算各種級(jí)分中的磷脂濃度，鑒定出含該顆粒峰的位置。從洗脫體積中可以測(cè)定出Stokes粒徑。通過(guò)16小時(shí)酸解后測(cè)定苯丙氨酸含量(用HPLC)，測(cè)定出復(fù)合物中的肽濃度。
11.3.注射兔按照單次快速濃注不超過(guò)10-15ml的劑量，用磷脂/肽復(fù)合物靜脈注射(5-10mg/kg體重肽或10mg/kg體重ApoA-I(對(duì)照)，表示為肽或蛋白含量)雄性新西蘭大白兔(2.5～3kg)。操作前輕微地鎮(zhèn)靜動(dòng)物。在注射前和注射后5、15、30、60、240和1440分鐘這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取血樣(用EDTA收集)。測(cè)定每種樣品的血細(xì)胞比容(Hct)。分裝樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 11.4.兔血清的分析血漿脂類(lèi)，按照制造商的建議(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany and Biomerieux，69280，Marcy-l’etoile，F(xiàn)rance)，用商業(yè)化的分析手段酶學(xué)方法測(cè)定總血漿膽固醇、血漿甘油三酯和血漿磷脂。
脂蛋白譜 用蔗糖濃度梯度離心，測(cè)定出將血漿分離成為其脂蛋白級(jí)分后所得級(jí)分的血漿脂蛋白譜。收集級(jí)分，用酶學(xué)方法測(cè)量膽固醇含量。
12.實(shí)施例用共凍干方法制備肽-脂類(lèi)復(fù)合物用下列方法制備肽-脂類(lèi)復(fù)合物。
將1mg肽210(SEQ ID NO210)溶解于盛在一個(gè)1ml透明澈帶蓋細(xì)頸瓶(Waters #WAT025054)內(nèi)的250μl HPLC級(jí)甲醇(PerkinElmer)中。室溫下，不時(shí)地振蕩10分鐘加速肽的溶解。向該混合物中加入含3mg二棕櫚酰-磷脂酰膽堿(DPPC；Avanti極性脂，99％純度，產(chǎn)品號(hào)850355)的等份試樣，該等份試樣取自100mg/ml的甲醇原液。加入甲醇使混合物體積擴(kuò)容到400μl，室溫下，進(jìn)一步間歇地振蕩該混合物10分鐘。向試管中加入200μl甲醇(Sigma-Aldrich 99％純，HPLC-級(jí))，振蕩該試管10秒鐘。用20號(hào)注射針頭在試管頂部穿2個(gè)小孔，將該試管置于液氮中冷凍15秒，將該試管真空凍干過(guò)夜。向試管中加入200ml 0.9％NaCl溶液。振蕩該試管20秒鐘。此時(shí)，試管中的溶液呈乳狀。然后，41℃水浴溫育該試管30分鐘。41℃溫育幾分鐘后，溶液變得澄清(即，外觀類(lèi)似于水)。
12.1.用Superose 6凝膠層析特征描述復(fù)合物用上述共凍干方法制備含肽210的肽-磷脂復(fù)合物。按重量計(jì)算，該制劑中含1mg肽和3mg DPPC。用0.9％NaCl重配混合物后，取該化合物20μl(含100μg肽210)，用0.9％NaCl作為液相以0.5ml/minute的流速上樣到Pharmacia Superose 6柱上。用280nm處的吸光率或光散射監(jiān)測(cè)層析。收集1ml級(jí)分。用bioMerieuxPhospholipides Enzymatique PAP 150試劑盒(#61491)，按照廠(chǎng)商提供方法對(duì)含有20μl上述級(jí)分的試樣進(jìn)行磷脂含量的分析。既含磷脂又出現(xiàn)UV吸光率的大多數(shù)都回收在幾個(gè)約15.1mls處出現(xiàn)峰的級(jí)分中。洗脫體積對(duì)應(yīng)于106埃的Stokes粒徑。
為了進(jìn)行比較，取20μl人HDL2，在使用與肽210(SEQ ID NO210)復(fù)合物同樣條件和同樣柱體的情況下單獨(dú)層析。按照下述方法制備HDL2融解300ml冰凍人血漿(Mannheim Blutspendzentrale#1185190)，用固體溴化鉀將濃度調(diào)至1.25，在20℃、40,000RPM的條件下，用Ti45轉(zhuǎn)頭(Beckman)離心45小時(shí)。收集浮選層，用蒸餾水透析，用固體溴化鉀將濃度調(diào)至1.07，按照上述條件離心70小時(shí)。收集底層(試管底之上1cm)，加入0.01％疊氮鈉，層析前4℃保存4天。用波長(zhǎng)為254nm處的吸光度或光散射監(jiān)測(cè)柱體洗脫液。用一系列分子量及Stokes粒徑已知的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)柱體，用來(lái)計(jì)算顆粒的Stokes粒徑(Pharmacia Gel FiltrationCalibration Kit Instruction Manual，Pharmacia LaboratorySeparation，Piscataway，NJ，revised April，1985)。對(duì)應(yīng)于108nm的Stokes直徑，用14.8ml存留體積洗脫HDL2。
13.實(shí)施例抗體的制備為了制備抗本發(fā)明ApoA-I激動(dòng)劑的抗體，將肽共軛偶聯(lián)到匙孔蝛血藍(lán)蛋白(KLH；1mg peptide對(duì)應(yīng)10mg KLH)上。將KLH偶聯(lián)物(LMG)懸浮在弗氏完全佐劑中，在零時(shí)間點(diǎn)注射兔，第4周時(shí)用0.25mg KLH偶聯(lián)物加強(qiáng)免疫，并在第5周時(shí)再免疫一次。用ELISA測(cè)試取血前和6周取血后抗真實(shí)抗原的抗體滴度。
各自收集2個(gè)兔的制備血樣。用下述方法分離出抗肽抗原的特異性抗體1.按照生產(chǎn)者提供的方法，將游離肽連接到溴化氰活化后的Sepharose 4B(Pharmacia)上。
2.用抗血清預(yù)吸附無(wú)關(guān)肽柱體以及無(wú)關(guān)的人和小鼠血清蛋白柱體。
3.讓預(yù)吸附后的抗血清通過(guò)相應(yīng)肽的柱體(見(jiàn)第1點(diǎn))。
4.用0.1M硼酸鹽緩沖液(pH8.2)洗滌柱體，用從pH4.0到pH3.0再到pH2.0(0.1M甘氨酸緩沖液)的低pH梯度，以及最后用0.1M HCl洗脫結(jié)合抗體。
5.用過(guò)量硼酸鹽中和洗脫后的物質(zhì)，超濾(Amicon，YM30)濃縮，并用硼酸鹽透析。
6.用280nm處的吸光率測(cè)定蛋白濃度。
用純化的人ApoA-I或純化的小鼠ApoA-I，通過(guò)直接ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)試得到的抗體的種特異性。
本發(fā)明不僅限于本發(fā)明描述的特定實(shí)施方案的范圍，這些實(shí)施方案的給出只是為了說(shuō)明本發(fā)明的單個(gè)方面，功效等同的方法和成分都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)際上，從上述的說(shuō)明書(shū)及附圖中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地得到除本發(fā)明給出或描述的內(nèi)容之外對(duì)本發(fā)明所做的各種改進(jìn)。因此，這類(lèi)改進(jìn)應(yīng)當(dāng)落在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明中引用的所有文獻(xiàn)，在此引入僅作參考。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Dasseux，Jean-LouisSekul，RenateButtner，KlausCornut，IsabelleMetz，Gunther(ii)發(fā)明題目載脂蛋白A-I激動(dòng)劑及其治療脂血異常癥的用途(iii)序列數(shù)254(iv)通信地址(A)收信人Pennie & Edmonds LLP(B)街道美國(guó)大道1155(C)城市紐約(D)州紐約(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼10036-2811(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ Version 2.0(vi)目前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US98/20328(B)申請(qǐng)日1998.9.28(C)分類(lèi)號(hào)(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/940，093(B)申請(qǐng)日1997.9.29(viii)律師/代理人信息(A)姓名Coruzzi，Laura A(B)注冊(cè)號(hào)30，742(C)資料/文檔號(hào)9196-006-228(ix)通訊信息(A)電話(huà)650-493-4935(B)傳真650-493-5556(C)電報(bào)66141 PENNIE(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置16(xi)序列描述Xaa＝萘基丙氨酸Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Xaa1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO2Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys Lys20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO3Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Trp1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO4Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Ash Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa＝D-Pro(xi)序列描述SEQ ID NO5Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys Lys20(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO6Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO7Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO8Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO9Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala15 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置17(D)其他信息Xaa＝萘基丙氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO10Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Xaa Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO11Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO12Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Gly Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO13Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置18(D)其他信息Xaa＝Orn
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa＝Orn(xi)序列描述SEQ ID NO14Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Xaa Gln Xaa Leu Xaa20(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO15Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO16Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO17Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO18Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa＝D-Pro(xi)序列描述SEQ ID NO19Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO20Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa＝D-Pro(xi)序列描述SEQ ID NO21Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO22Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Gly1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO23Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO24Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO25Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO26Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa＝萘基丙氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO27Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO28Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO29Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息N-末端丹?；?xi)序列描述SEQ ID NO30Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO31Pro Val Leu Asp Leu Phe Leu Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO32Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO33Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置5(D)其他信息Xaa＝萘基丙氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO34Pro Val Leu Asp Xaa Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO35Pro Val Leu Asp Trp Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO36Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO37Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO38Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Trp Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO39Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala1 5 10 15Leu Lys Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO40Pro Val Leu Asp Leu Phe Asn Glu Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO41Pro Val Leu Asp Leu Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO42Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Trp Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO43的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO43Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息所有遺傳編碼氨基酸都為D-構(gòu)象(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO44Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Ash Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO45Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO46Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO47Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Lau1 5 10 15Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa＝D-Pro(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置2(D)其他信息Xaa＝D-Val(xi)序列描述SEQ ID NO48Xaa Xaa Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO49Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Glu Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO50的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO50Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO51的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO51Pro Val Leu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO52的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO52Pro Val Trp Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO53的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO53Val Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO54的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO54Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Trp Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO55的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO55Pro Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln1 5 10 15Lys Leu Lys(2)SEQ ID NO56的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO56Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Lys Lys20(2)SEQ ID NO57的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO57Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala1 5 10 15Leu Glu Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO58的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO58Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu20(2)SEQ ID NO59的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO59Leu Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO60的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO60Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln(2)SEQ ID NO61的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO61Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Trp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO62的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO62Pro Val Leu Asp Glu Trp Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO63的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO63Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO64的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO64Pro Trp Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO65的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置12
(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO65Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu1 5 10 15Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO66的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO66Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO67的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO67Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu1 5 10 15Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO68的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO68Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Lys Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO69的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO69Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Lys Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO70的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO70Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO71的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO71Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO72的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO72Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO73的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO73Pro Val Leu Asp Glu Phe Trp Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO74的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO74Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO75的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO46Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO76的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO76Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Phe Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO77的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO77Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Lys Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO78的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO78Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Asp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO79的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO79Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO80的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO80Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO81的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO81Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO82的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置11(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO46Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys1 5 10 15Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO83的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13
(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO83Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Trp Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO84的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO84Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO85的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO85Pro Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu1 5 10 15Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO86的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO86Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO87的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...22(D)其他信息所有氨基酸都為D-構(gòu)象(xi)序列描述SEQ ID NO87Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO88的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO88Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO89的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO89Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO90的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置10(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO90Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys Gln1 5 10 15Lys Leu Lys(2)SEQ ID NO91的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO91Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO92的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO92Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Tyr Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO93的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO93Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Lys Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO94的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO94Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ala Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO95的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO95Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO96的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...22(D)其他信息所有遺傳編碼氨基酸都為D-構(gòu)象(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO96Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO97的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO97Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO98的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO98Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO99的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO99Lys Leu Lys Gln Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg1 5 10 15Phe Leu Asp Leu Val Pro20(2)SEQ ID NO100的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...22(D)其他信息所有氨基酸均為D-構(gòu)象(xi)序列描述SEQ ID NO100Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO101的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO101Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO102的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO102Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Glu Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO103的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO103Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO104的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO104Pro Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln Lys Leu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO105的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO105Pro Ala Ala Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Glu Ala1 5 10 15Ala Lys Gln Lys Ala Lys20(2)SEQ ID NO106的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO106Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO107的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...22
(D)其他信息所有氨基酸均為D-構(gòu)象(xi)序列描述SEQ ID NO93Lys Leu Lys Gln Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg1 5 10 15Phe Leu Asp Leu Val Pro20(2)SEQ ID NO108的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO108Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Trp Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO109的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO109Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO11O的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO110Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Xaa Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO111的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO111Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Trp Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO112的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO112Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Ser Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO113的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO113Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Pro Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO114的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO114Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Met Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO115的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO115Pro Lys Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO116的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO116Pro His Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO117的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO117Pro Glu Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO118的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO118Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Glu Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO119的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置17(D)其他信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO119Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Xaa Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO120的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置16(C)其它信息Xaa＝Aib(xi)序列描述SEQ ID NO120Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Xaa1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO121的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO121Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Trp Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO122的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO122Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Trp1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO123的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO123Gln Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO124的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置18(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa＝Orn(xi)序列描述SEQ ID NO124Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Xaa Gln Xaa Leu Xaa20(2)SEQ ID NO125的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO125Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO126的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO126Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Gly Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO127的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO127Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO128的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO128Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Phe1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO129的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO129Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO130的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO130Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO131的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO131Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Arg Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO132的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO132Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO133的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO133Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Gln Ala1 5 10 15Leu Asn Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO134的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO134Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Lys Ala1 5 10 15Leu Asn Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO135的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO135Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO136的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO136Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO137的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置17(D)其他信息Xaa＝萘基丙氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO137Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Xaa Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO138的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO138Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Trp1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO139的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO139Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO140的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置18(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa＝Orn(xi)序列描述SEQ ID NO140Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Xaa Gln Xaa Leu Xaa20(2)SEQ ID NO141的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO141Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO142的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO142Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO143的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...22(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化的肽(xi)序列描述SEQ ID NO143Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO144的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa＝Pro(xi)序列描述SEQ ID NO144Xaa Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO145的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO145Gly Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO146的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO146Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO147的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO147Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Phe Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO148的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO148Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO149的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO149Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO150的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO150Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO151的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO151Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO152的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO152Pro Val Phe Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO153的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO153Ala Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO154的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO154Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO155的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO155Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO156的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO156Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO157的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO157Pro Val Leu Glu Phe Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO158的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO158Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO159的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO159Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO160的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO160Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO161的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO161Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO162的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO162Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Trp Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO163的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO163Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Trp Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO164的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO164Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Trp Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO165的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO165Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO166的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO166Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO167的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO167Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO168的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO168Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gln Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO169的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO169Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO170的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置12(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置19(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa＝Orn(xi)序列描述SEQ ID NO170Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Xaa Xaa Leu Xaa202)SEQ ID NO171的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO171Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO172的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO172Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO173的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO173Pro Val Leu Asp Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Leu1 5 10 15Leu Asn Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO174的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...22(D)其他信息所有氨基酸均為D-構(gòu)象(xi)序列描述SEQ ID NO174Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO175的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO175Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Asn Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO176的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO176Pro Val Leu Glu Leu Trp Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO177的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO177Gly Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO178的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO178Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Arg202)SEQ ID NO179的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO179Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO180的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO180Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Arg202)SEQ ID NO181的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO181Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Trp Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO182的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO182Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu G1u Lys Leu Leu Glu Ala1 5 10 l5Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO183的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO183Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO184的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO184Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Trp Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO185的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置19(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa＝Orn(xi)序列描述SEQ ID NO185Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Xaa Xaa Leu Xaa202)SEQ ID NO186的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO186Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gln Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO187的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO187Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Asn Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO188的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO188Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO189的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO189Asp Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys202)SEQ ID NO190的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO190Pro Val Leu Glu Phe Trp Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Arg20(2)SEQ ID NO191的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO191Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO191的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO192Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO193的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO193Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO194的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO194Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO195的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO195Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO196的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO196Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO197的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO197Pro Leu Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO198的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO198Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO199的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO199Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO200的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO200Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO201的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO201Pro Leu Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO202的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ 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NO206的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO206Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO207的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO207Pro Val Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO208的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO208Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gln Arg1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO209的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO209Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO210的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO210Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO211的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置16(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置18(D)其他信息Xaa＝Orn(xi)序列描述SEQ ID NO211Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gln Xaa1 5 10 15Leu Xaa(2)SEQ ID NO212的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置7(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa＝Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置16(D)其他信息Xaa＝Orn(xi)序列描述SEQ ID NO212Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gln Xaa1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO213的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO213Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Phe Arg Gln Arg1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO214的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Pro的D-構(gòu)象(xi)序列描述SEQ ID NO214Pro Val Lau Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO215的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO215Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Trp Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO216的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO216Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO217的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO217Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Leu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO218的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO218Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO219的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO219Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO220的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO220Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Gln Lys Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO221的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO221Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO222的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO222Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO223的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO223Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Ala Gln Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO224的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO224Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Trp Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO225的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO225Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Gln Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO226的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO226Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Gly Glu Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO227的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO227Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO229的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO228Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO229的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO229Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Gly Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO230的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO230Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Gln Lys Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO231的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO231Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO232的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO232Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO233的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(ii)分子類(lèi)型(xi)序列描述SEQ ID NO233該序列被有意省略(2)SEQ ID NO234的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(ii)分子類(lèi)型(xi)序列描述SEQ ID NO234該序列被有意省略(2)SEQ ID NO235的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(ii)分子類(lèi)型(xi)序列描述SEQ ID NO235該序列被有意省略(2)SEQ ID NO236的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(ii)分子類(lèi)型(xi)序列描述SEQ ID NO236該序列被有意省略(2)SEQ ID NO237的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO237Leu Asp Asp Leu Leu Gln Lys Trp Ala Glu Ala Phe Asn Gln Leu Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO238的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO238Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO239的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO239Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO240的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO240Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe(2)SEQ ID NO241的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO241Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Phe(2)SEQ ID NO242的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO242Gly Ile Lys Lys Phe Leu Gly ser Ile Trp Lys Phe Ile Lys Ala Phe1 5 10 15Val Gly(2)SEQ ID NO243的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO243Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Ala Phe(2)SEQ ID NO244的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO244Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe(2)SEQ ID NO245的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO245Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Phe(2)SEQ ID NO246的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO246Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO247的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO247Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Phe(2)SEQ ID NO248的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(xi)序列描述SEQ ID NO248Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO249的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO249Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Glu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO250的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO250Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO251的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...18(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO251Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO252的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...15(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO252Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Gln Lys Leu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO253的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...16(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO253Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO254的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...16(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO254Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Lys Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO255的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...15(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO255Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO256的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...16(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO256Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO257的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...16(D)其他信息N-末端乙?；褻-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO257Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO258的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型不確定(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1...16(D)其他信息N-末端乙酰化且C-末端酰胺化(xi)序列描述SEQ ID NO258Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種ApoA-I激動(dòng)劑，包括(i)一種14～22個(gè)殘基的肽或肽類(lèi)似物，它能在脂類(lèi)存在時(shí)形成兩親性α螺旋并包括下列結(jié)構(gòu)通式(I)Z1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18X1為Pro(P)、Ala(A)、Gly(G)、Asn(N)、Gln(Q)或D-Pro(P)；X2為脂族氨基酸；X3為L(zhǎng)eu(L)；X4為酸性氨基酸；X5為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X6為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X7為一個(gè)堿性氨基酸；X8為一個(gè)酸性氨基酸；X9為L(zhǎng)eu(L)或Trp(W)；X10為L(zhǎng)eu(L)或Trp(W)；X11為一個(gè)酸性氨基酸或Asn(N)；X12為一個(gè)酸性氨基酸；X13為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)或Phe(F)；X14為一個(gè)堿性氨基酸或Leu(L)；X15為Gln(Q)或Asn(N)；X16為一個(gè)堿性氨基酸；X17為L(zhǎng)eu(L)；X18為一個(gè)堿性氨基酸；Z1為H2N-或RC(O)NH-；Z2為-C(O)NRR、-C(O)OR或-C(O)OH或其鹽；每個(gè)R都單獨(dú)為-H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、5～20元雜芳基或6～26元烷雜芳基或1～4個(gè)殘基的肽或肽類(lèi)似物；殘基Xn之間的每個(gè)“-”都單獨(dú)代表一個(gè)酰胺鍵、一個(gè)取代后的酰胺鍵、一個(gè)酰胺同電子排列體或一個(gè)酰胺模擬物；或者(ii)結(jié)構(gòu)通式(I)的缺失形式，殘基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、和X18中至少1～8個(gè)殘基被缺失；或(iii)結(jié)構(gòu)通式(I)的缺失形式，殘基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15-、X16、X17、和X18中至少有1個(gè)被另外的一個(gè)殘基保守性取代。
2.權(quán)利要求1中的ApoA-I激動(dòng)劑，與人ApoA-I相比該激動(dòng)劑表現(xiàn)出至少38％的LCAT活化活性。
3.權(quán)利要求1中的ApoA-I激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑為結(jié)構(gòu)通式(I)的變化形式。
4.權(quán)利要求3中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中按照通式(I)固定疏水氨基酸并且至少一個(gè)非固定殘基被另外一個(gè)殘基保守性地取代。
5.權(quán)利要求4中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中X1為Pro(P)、D-Pro(P)、Gly(G)、Asn(N)或Ala(A)；X2為L(zhǎng)eu(L)、Ala(A)或Val(V)；X3為L(zhǎng)eu(L)；X5為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X6為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X9為L(zhǎng)eu(L)或Trp(W)；X10為L(zhǎng)eu(L)或Trp(W)；X13為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)或Phe(F)；X17為L(zhǎng)eu(L)；以及X4、X7、X8、X11、X12、X14、X15、X16和X18中至少一個(gè)被另外一個(gè)殘基保守性地取代。
6.權(quán)利要求3中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中按照通式(I)固定疏水氨基酸并且至少一個(gè)非固定殘基被另外一個(gè)殘基保守性地取代。
7.權(quán)利要求6中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中X4為Asp(D)或Glu(E)；X7為Arg(R)、Lys(K)或Orn；X8為Asp(D)或Glu(E)；X11為Asn(N)或Glu(E)；X12為Glu(E)；X14為L(zhǎng)ys(K)、Arg(R)或Orn；X15為Gln(Q)或Asn(N)；X16為L(zhǎng)ys(K)、Arg(R)或Orn；X18為Asn(N)或Gln(O)；X1、X2、X3、X5、X6、X9、X10、X13和X17中至少一個(gè)被另外一個(gè)殘基保守性取代。
8.權(quán)利要求6中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中X3為L(zhǎng)eu(L)，X6為Phe(F)，X9為L(zhǎng)eu(L)或Trp(W)，X10為L(zhǎng)eu(L)或Trp(W)，并且X1、X2、X5、X13和X17中至少一個(gè)被另外一個(gè)殘基保守性取代。
9.權(quán)利要求5或7中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中所述的取代殘基和被取代殘基屬于同一亞類(lèi)。
10.權(quán)利要求1中的ApoA-I激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑是結(jié)構(gòu)通式(I)的缺失形式。
11.權(quán)利要求10中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中所述肽或肽類(lèi)似物缺失了1個(gè)螺圈。
12.權(quán)利要求1中的ApoA-I激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑是結(jié)構(gòu)通式(I)所示的18個(gè)殘基的肽或肽類(lèi)似物。
13.權(quán)利要求12中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中所述的殘基間“-”代表-C(O)NH-；Z1為H2N-；且Z2為-C(O)OH或其鹽。
14.權(quán)利要求13中的ApoA-I激動(dòng)劑，其中X1為Pro(P)、Ala(A)、Gly(G)、Asn(N)或D-Pro(P)；X2為Ala(A)、Val(V)或Leu(L)；X3為L(zhǎng)eu(L)；X4為Asp(D)或Glu(E)；X5為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X6為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X7為Arg(R)、Lys(K)或Orn；X8為Asp(D)或Glu(E)；X9為L(zhǎng)eu(L)或Trp(W)；X10為L(zhǎng)eu(L)或Trp(W)；X11為Asn(N)或Glu(E)；X12為Glu(E)；X13為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)或Phe(F)；X14為Arg(R)、Lys(K)或Orn；X15為Gln(Q)或Asn(N)；X16為L(zhǎng)ys(K)、Arg(R)或Orn；X17為L(zhǎng)eu(L)；以及X18為L(zhǎng)ys(K)、Arg(R)或Orn。
15.權(quán)利要求1中的ApoA-I激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑選自下列肽肽 191 PVLDLLRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO191)；肽 192 PVLDLFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO192)；肽 193 PVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO193)；肽 194 PVLELFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO194)；肽 195 PVLELFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO195)；肽 196 PVLDLFRELLEELKNKLK*(SEQ ID NO196)；肽 197 PLLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO197)；肽 198 GVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO198)；肽 199 PVLDLFRELWEELKQKLK*(SEQ ID NO199)；肽 200 NVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO200)；肽 201 PLLDLFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO201)；肽 202 PALELFKDLLEELRQKLR*(SEQ ID NO202)；肽 203 AVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO203)；肽 204 PVLDFFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO204)；肽 205 PVLDLFREWLEELKQKLK*(SEQ ID NO205)；肽 206 PLLELLKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO206)；肽 207 PVLELLKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO207)；肽 208 PALELFKDLLEELRQRLK*(SEQ ID NO208)；肽 209 PVLDLFRELLNELLQKLK(SEQ ID NO209)；肽 210 PVLDLFRELLEELKQKLK(SEQ ID NO210)；肽 211 PVLDLFRELLEELOQOLO*(SEQ ID NO211)；肽 212 PVLDLFOELLEELOQOLK*(SEQ ID NO212)；肽 213 PALELFKDLLEEFRQRLK*(SEQ ID NO213)；肽 214 pVLDLFRELLEELKQKLK*(SEQ ID NO214)；肽 215 PVLDLFRELLEEWKQKLK*(SEQ ID NO215)；肽 229 PVLELFERLLEDLQKKLK(SEQ ID NO229)；肽 230 PVLDLFRELLEKLEQKLK(SEQ ID NO230)；肽 231 PLLELFKELLEELKQKLK*(SEQ ID NO231)；以N-末端或C-末端封閉或未封閉的形式存在。
16.一種多聚體ApoA-I激動(dòng)劑或其藥物學(xué)上可接受的鹽，與人ApoA-I相比該激動(dòng)劑表現(xiàn)出至少38％的LCAT活化活性，并且具有下述結(jié)構(gòu)通式(II) 其中每個(gè)m都單獨(dú)為0～1的整數(shù)，優(yōu)選為1；n是0～10的整數(shù)；每個(gè)“HH”都是權(quán)利要求1所述肽或肽類(lèi)似物；每個(gè)“LL”都單獨(dú)代表1個(gè)雙功能接頭；以及每個(gè)“-”都單獨(dú)定義為1個(gè)共價(jià)連接。
17.一種多聚體ApoA-I激動(dòng)劑或其藥物學(xué)上可接受的鹽，與人ApoA-I相比該激動(dòng)劑表現(xiàn)出至少38％的LCAT活化活性，并且具有下述結(jié)構(gòu)通式(III) 其中每個(gè)X都單獨(dú)為； ；每個(gè)HH都單獨(dú)代表一個(gè)結(jié)構(gòu)(I)核心肽或者其類(lèi)似物或本發(fā)明所述這些肽的突變、截短、內(nèi)部缺失或擴(kuò)展形式；每個(gè)LL都單獨(dú)代表1個(gè)雙功能接頭；以及每個(gè)m都單獨(dú)為一個(gè)0～1的整數(shù)；每個(gè)n都單獨(dú)為一個(gè)0～8的整數(shù)；Nya和Nyb都各自代表一個(gè)多功能連接部分，其中ya和yb分別為Nya和Nyb上的官能團(tuán)數(shù)目；每個(gè)ya或yb都單獨(dú)是一個(gè)3～8的整數(shù)；p是一個(gè)0～7的整數(shù)；以及每個(gè)“-”都單獨(dú)代表一個(gè)共價(jià)鍵。
18.一種多聚體ApoA-I激動(dòng)劑或其藥物學(xué)上可接受的鹽，與人ApoA-I相比該激動(dòng)劑表現(xiàn)出至少38％的LCAT活化活性，并且具有下述結(jié)構(gòu)通式(IV)或(V) 或 其中每個(gè)X都單獨(dú)為； 每個(gè)HH都單獨(dú)代表一個(gè)權(quán)利要求1所述的肽或肽類(lèi)似物；每個(gè)LL都單獨(dú)代表1個(gè)雙功能接頭；每個(gè)n都單獨(dú)為一個(gè)0～1的整數(shù)；每個(gè)m都單獨(dú)為一個(gè)0～8的整數(shù)；R1為-OR或-NRR；以及每個(gè)R都單獨(dú)為-H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、5～20元雜芳基或6～26元烷雜芳基。
19.權(quán)利要求16、17或18中的多聚ApoA-I激動(dòng)劑，其中所述的雙功能接頭是可切割的。
20.權(quán)利要求16、17或18中的多聚ApoA-I激動(dòng)劑，其中n是0。
21.權(quán)利要求20中的多聚ApoA-I激動(dòng)劑，其中m是0。
22.權(quán)利要求16、17或18中的多聚ApoA-I激動(dòng)劑，其中每個(gè)HH都單獨(dú)代表一個(gè)權(quán)利要求13所述的肽。
23.權(quán)利要求16、17或18中的多聚ApoA-I激動(dòng)劑，其中每個(gè)HH都單獨(dú)代表一個(gè)權(quán)利要求14所述的肽。
24.權(quán)利要求16、17或18中的多聚ApoA-I激動(dòng)劑，其中每個(gè)HH都單獨(dú)代表一個(gè)權(quán)利要求15所述的肽。
25.一種ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，該復(fù)合物包括一種ApoA-I激動(dòng)劑和一種脂類(lèi)，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑為一種權(quán)利要求1所述的肽或肽類(lèi)似物、權(quán)利要求16所述的多聚ApoA-I激動(dòng)劑、權(quán)利要求17所述的多聚ApoA-I激動(dòng)劑、或權(quán)利要求18所述的多聚ApoA-I激動(dòng)劑。
26.權(quán)利要求25中的ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑為權(quán)利要求12所述的肽。
27.權(quán)利要求25中的ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑為權(quán)利要求13所述的肽。
28.權(quán)利要求25中的ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑為權(quán)利要求14所述的肽。
29.權(quán)利要求25中的ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑為權(quán)利要求15所述的肽。
30.權(quán)利要求25中的ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中所述的脂類(lèi)是鞘磷脂。
31.權(quán)利要求25中的ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，該復(fù)合物以?xún)龈煞勰┑男问酱嬖凇?br> 32.權(quán)利要求25中的ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，該復(fù)合物以溶液的形式存在。
33.一種藥用組合物，該組合物包括一種ApoA-I激動(dòng)劑和一種藥物學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋液，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑為一種權(quán)利要求1所述的肽或肽類(lèi)似物、權(quán)利要求16所述的多聚ApoA-I激動(dòng)劑、權(quán)利要求17所述的多聚ApoA-I激動(dòng)劑、或權(quán)利要求18所述的多聚ApoA-I激動(dòng)劑。
34.權(quán)利要求33中的藥用組合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑是一種權(quán)利要求12所述的肽。
35.權(quán)利要求33中的藥用組合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑是一種權(quán)利要求13所述的肽。
36.權(quán)利要求33中的藥用組合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑是一種權(quán)利要求14所述的肽。
37.權(quán)利要求33中的藥用組合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑是一種權(quán)利要求15所述的肽。
38.權(quán)利要求33、34、35、36或37中的藥用組合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑以ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物的形式存在，所述的復(fù)合物包括該ApoA-I激動(dòng)劑和一種脂類(lèi)。
39.權(quán)利要求38中的藥用組合物，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物以?xún)龈煞勰┑男问酱嬖凇?br> 40.一種用于治療患有脂血異常癥相關(guān)疾病的患者的方法，該方法包括向患者施用有效量的權(quán)利要求1所述肽激動(dòng)劑的步驟。
41.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑以藥用組合物形式存在，該組合物中包括所述的ApoA-I激動(dòng)劑和一種藥物學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
42.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的ApoA-I激動(dòng)劑以ApoA-I激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物的形式存在，該復(fù)合物中包括所述的ApoA-I激動(dòng)劑和一種脂類(lèi)。
43.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的脂血異常癥相關(guān)疾病是血膽脂醇過(guò)多。
44.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的脂血異常癥相關(guān)疾病是心血管病。
45.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的脂血異常癥相關(guān)疾病是動(dòng)脈粥樣硬化。
46.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的脂血異常癥相關(guān)疾病是再狹窄。
47.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的脂血異常癥相關(guān)疾病是HDL或ApoA-I缺乏。
48.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的脂血異常癥相關(guān)疾病是高甘油三酯血癥。
49.權(quán)利要求40中的方法，其中所述的脂血異常癥相關(guān)疾病是代謝綜合征。
50.一種用于治療患有膿毒性休克患者的方法，該方法包括向患者施用有效量的權(quán)利要求1所述ApoA-I激動(dòng)劑的步驟。
51.權(quán)利要求40或50中的方法，其中所述的患者是人。
52.權(quán)利要求40或50中的方法，其中包括向所述患者施用約0.5mg/kg～100mg/kg的ApoA-I激動(dòng)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了模擬人Apo－I結(jié)構(gòu)和藥物活性的多肽及多肽類(lèi)似物。該多肽及多肽類(lèi)似物用于治療多種與脂血異常癥有關(guān)的病癥。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1345245SQ98811672
公開(kāi)日2002年4月17日 申請(qǐng)日期1998年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者瓊·路易斯·達(dá)索克斯, 雷納特·塞庫(kù)爾, 克勞斯·巴特納, 伊莎貝爾·康納特, 岡瑟·梅茨 申請(qǐng)人:瓊-路易斯·達(dá)索克斯, 雷納特·塞庫(kù)爾, 克勞斯·巴特納, 伊莎貝爾·康納特, 岡瑟·梅茨