專利名稱：聚乙二醇－grf偶聯(lián)物的位點特異性制備的制作方法
分明領域本發(fā)明涉及位點特異性制備聚乙二醇-GRF偶聯(lián)物的方法。所述偶聯(lián)物相對每分子hGRF含一個或多個PEG單元，它們與Lys12和／或Lys21和／或Nα共價連接，所述方法的特征在于hGRF肽與活化PEG之間的偶聯(lián)反應在溶液中進行，所需hGRF-PEG偶聯(lián)物用層析法純化。
本發(fā)明的目的還包括用所述方法制備此偶聯(lián)物，以及它們在治療、預防或診斷生長激素相關性疾病方面的應用。
GRF(又稱Somatorelin)是下丘腦分泌的一種肽，作用于受體促進垂體前葉分泌生長素(GH)。其存在形式為44，40或37氨基酸的肽，44氨基酸形式可生理轉化成較短的形式。三種形式據(jù)報道都有活性，活性主要位于前29個氨基酸殘基。據(jù)歐洲專利EP105759所述，已經(jīng)用重組DNA技術制備了對應于人GRF1-29氨基酸序列的一種合成肽[hGRF(h-29)]，又稱Sermorelin。
Sermorelin乙酸鹽已被用于診斷和治療生長素缺乏。
GRF的確具有治療某些生長素相關疾病的醫(yī)療價值。用GRF刺激GH釋放是促進長骨生長和蛋白質(zhì)合成代謝的一種生理方法。
GRF應用中的一個問題是它的生物半衰期很短(約12-30分鐘)。在血漿中，hGRF(1-29)-NH2被二肽基肽酶IV(DPP-IV)在Ala2和Asp3殘基之間切斷，迅速降解。
所以，為了防止或減緩酶降解，有必要對GRF特殊化學修飾以開發(fā)出生物穩(wěn)定的長效GRF類似物。
聚乙二醇是一種親水性、生物相容性無毒聚合物，其通式為H(OCH2CH2)nOH，其中n≥4。其分子量為200至20，000道爾頓不等。
已經(jīng)證明單甲氧基化形式的PEG與蛋白質(zhì)和／或肽化學偶聯(lián)顯著延長后者的生物作用。象糖蛋白中的糖基一樣，PEG提供保護性包膜，使分子增大，因而減少其代謝降解并降低腎清除速度。
PEG偶聯(lián)反應已經(jīng)是一種成熟的肽及蛋白質(zhì)傳遞技術，進行最初基礎研究的是Davis和Abuchowski(Abuchowski等，1977a和1977b)。PEG與肽或蛋白質(zhì)偶聯(lián)一般形成PEG與一個以上氨基酸殘基的非特異性化學固著。所以，所述技術的關鍵之一是找到合適的化學方法使PEG分子與特定氨基酸殘基共價偶聯(lián)。
例如，三氯三嗪活化的PEG具有毒性且反應無特異性，但在被多種帶化學接頭(linker)的PEG試劑取代后能夠特異性地與氨基(Benchamp等，1983；Veronese等，1985；Zalipsky等，1983；Zalipski等，1990；Delgado等，1990)，巰基(sulphydryl)(Sartore等，1991；Morpurgo等，1996)或胍基殘基反應。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多PEG-蛋白偶聯(lián)物受到保護而不被蛋白酶解，而且／或者免疫原性降低(Monfardini等，1995；Yamsuki等，1988)。
蛋白質(zhì)PEG化中的另一技術難題是因為PEG-蛋白偶聯(lián)物一般含不同數(shù)量的固著PEG分子，于是形成PEG蛋白質(zhì)化學計量不等的偶聯(lián)物混合物。位點特異性PEG化仍是一個化學難題。PEG與GH的偶聯(lián)是上述問題的典型例子(Clark等，1996)。已經(jīng)證明，GH任意位置上的Lys殘基均可被PEG化。
為了避免和減少酶活損失，可預先對活性位點加保護，這樣，可以使酶性PEG化發(fā)生在非活性位點(Caliceti等，1993)。
最近，提出了另一種方法，將PEG與固相肽合成制備的低分子量肽(例如GRF)位點特異性偶聯(lián)。在所述偶聯(lián)物中，在固相合成過程中，將預先制備的PEG化氨基酸引入肽序列。但是，這一方法大大增加了產(chǎn)品純化的難度，而產(chǎn)品純化是固相合成中的關鍵步驟。PEG因其高分子量和多分散性使得其存在導致最終產(chǎn)品的純度無法接受，和／或得到有氨基酸缺失的產(chǎn)品，據(jù)認為，后一種情況在Merrifield法中常發(fā)生。
最近的文獻報道了單PEG化法，即用固相合成法僅將一個PEG分子固著于[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2特定氨基酸殘基(Felix等，1995)。該項研究顯示第21或25位被PEG化的[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2完全保留親本[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2的體外活性。但是，其中沒有說明PEG化偶聯(lián)物是否比非PEG化偶聯(lián)物作用更持久的體內(nèi)數(shù)據(jù)。
最近，已經(jīng)在豬模型和小鼠模型中證明與非PEG化的相比，不同分子量PEG與幾種hGRF類似物C末端固著增強作用持久性(Campbell等，1997)。
已知，hGRF微溶于中性／堿性緩沖液，而這正是PEG化反應最有效的化學條件。在hGRF稀溶液中，活化PEG(例如PEG酯)的水解會降低PEG化反應的得率。
我們發(fā)現(xiàn)在hGRF具有高溶解度的合適溶劑中，有可能進行液相的位點特異性PEG化反應。如此，即使起始hGRF未被保護，PEG鏈也會高得率地幾乎只結合Lys12、Lys21和／或Nα的伯氨基(ε-氨基)，這取決于反應條件。我們得到了同屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的以下4種偶聯(lián)物，其中的hGRF∶PEG化學計量主要取決于PEG比hGRF的摩爾比hGRF-PEG偶聯(lián)物其中1分子PEG與Lys12共價結合，hGRF-PEG偶聯(lián)物其中1分子PEG與Lys21共價結合，hGRF-2PEG偶聯(lián)物其中2分子PEG與Lys12和Lys21共價結合，hGRF-3PEG偶聯(lián)物其中3分子PEG與Lys12、Lys21和Nα共價結合。
“Nα”在本發(fā)明中表示肽N末端(Tyr)的氨基。
上述步驟之后，可對反應所得偶聯(lián)物進行簡單的層析分離，用凝膠過濾或直接上到C18 HPLC柱上，用水／乙腈梯度洗脫。優(yōu)選第二種方法，因為它可用于產(chǎn)品的大規(guī)模制備和純化。
所以，本發(fā)明的主要實施例是一種位點特異性制備不同hGRF-PEG偶聯(lián)物的方法，所述偶聯(lián)物，相對每分子hGRF，含有一個或多個與Lys12與和／或Lys21和／或Nα共價結合的PEG，所述方法的特征在于PEG化在溶液中進行，所需的hGRF-PEG偶聯(lián)物用層性法純化。
含有一個或多個與Lys12與和／或Lys21和／或Nα共價結合的PEG的PEG-hGRF偶聯(lián)物也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)選化合物是一分子PEG與Lys12或Lys21共價結合的hGRF-PEG偶聯(lián)物。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，如果上述PEG鏈所結合的3個氨基中一個以上被某些化學基團可逆保護而不參與PEG化反應，將得到特定位點PEG化的所需偶聯(lián)物，然后可用例如超濾或其他層析法從反應混合物中分離出這些偶聯(lián)物。此時，制備方法還可以包括去保護反應。
去保護反應宜根據(jù)要去除的化學保護基根據(jù)已知方法進行。
根據(jù)本發(fā)明，如非另作說明，“hGRF”包括各種人GRF肽，較好的是1-44，1-40，1-29肽及其對應的酰胺(N末端或C末端具有酰胺基團)。優(yōu)選的hGRF肽是hGRF(1-29)-NH2，氨基酸序列見SEQ IN NO．1。
“活化PEG”(或“PEG化劑”)是任何因為具有能夠與蛋白質(zhì)／肽內(nèi)某些官能團反應生成PEG-蛋白質(zhì)／肽而被用作蛋白質(zhì)修飾劑的PEG衍生物。有關可用作蛋白質(zhì)修飾劑的PEG衍生物可參見Harris(1985)。活化PEG可以是烷基化劑，例如PEG醛，PEG環(huán)氧化物或PEG tresylate，或者可以是酰基化劑，例如PEG酯。
最好使用單甲氧基化形式的PEG。其分子量最好在2，000至20，000之間。根據(jù)本發(fā)明，制備活化PEG，最好使用單甲氧基化PEG5，000。
如果活化PEG是?；瘎?，最好含有通過酰胺鍵與PEG連接的正亮氨酸或鳥氨酸殘基。這些殘基允許準確測定每摩爾肽所連接PEG單元(參見Sartore等，1991)。所以，更具體地說，優(yōu)選的活化PEG是通過酰胺鍵與正亮氨酸α氨基結合的單甲氧基化PEG5，000。
也常使用分支PEG。分支PEG可表示為R(-PEG-OH)m，其中R是諸如戊赤蘚糖醇或甘油之類核心部分，m是分支數(shù)。分支數(shù)m可從3至100以上?？蓪αu基進行化學修飾。
另一種分支形式例如PCT專利申請WO96／21469所述，僅一個末端接受化學修飾。這種PEG可用(CH3O-PEG-)PR-X表示，其中P等于2或3，R是諸如賴氨酸或甘油的核心，X是接受化學修飾的官能團，例如羧基。另一種分支形式，“懸垂式PEG”沿著PEG骨架，而不是位于PEG鏈的末端，具有羧基之類反應性基團。
所有上述分支PEG都可以如上所述“活化”。
“層析法”指上樣在支持體(固定相)上，溶劑(移動相)從中流過，如此將混合物各組分分開的各種技術。層析法的分離原理是基于固定相和移動相的不同物理性質(zhì)。
已知的部分特定類型層析方法包括液相層析，高壓液相層析，離子交換層析，吸附層析，親和層析，分配層析，疏水層析，反相層析，凝膠過濾層析，超濾層析或薄層層析。
“PEG化”即，通過該反應，由活化PEG和相應的蛋白質(zhì)／肽得到PEG-蛋白質(zhì)／肽偶聯(lián)物。
根據(jù)需要高得率得到的是什么偶聯(lián)物，PEG∶hGRF摩爾比可以是1∶1，2∶1或3∶1。
PEG化反應的溶劑選自高濃縮煙酰胺水溶液，解折疊劑(例如尿素)的緩沖水溶液或選自二甲基亞砜、二甲基甲酰胺／緩沖液或乙腈／緩沖液的極性有機溶劑。
溶液的pH一般保持在7至9之間。
Lys12和Lys21的化學保護基包括但不限于Alloc(烯丙基氧基羰基)，Dde(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧環(huán)己-1-內(nèi)鎓烯)乙基)，Adpoc(1-(1’-金剛烷基)-1-甲基-乙氧基羰基)或2-Cl-Z(2-氯芐基氧基羰基)。Alloc是優(yōu)選的賴氨酸保護基。
PEG化后，可按照Greene T．W．等1991所述方法之一去除Alloc。Dde可用DMF配制的2％肼溶液去除(W．C．Chan等，1991)。Adpoc的去除與Alloc相似(另可參見Dick F等1997)。2-Cl-Z可能需要更強的酸去保護(HF、TFMSA、HBr)或j加氫(參見Tam等，1987)。
Nα的保護基可以是烷基，例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基，芐基或環(huán)己基。優(yōu)選異丙基。所述烷基可用還原烷基化反應引入(參見Murphy等，1988或Hocart等，1987)。-hGRF和[Lys(Alloc)12，21]-hGRF也是本發(fā)明認為有用的新的PEG化中間體。
已知本發(fā)明的PEG化反應1．不改變肽的構象，2．增強對蛋白酶解的抗性，3．根據(jù)PEG化程度，不影響，或僅輕微降低生物活性，4．能夠得到在緩沖水溶液中溶解度更高的產(chǎn)物(偶聯(lián)物)。
本發(fā)明的另一目的是提供基本純的hGRF-PEG偶聯(lián)物，使它們適合用作藥物組合物的活性成分。
另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明偶聯(lián)物在制造治療、預防或診斷生長素相關疾病所用藥物中的用途，例如生長素缺乏(GHD)，尤其是兒童生長素缺乏。
所述藥物的形式最好是藥物組合物，其中含有本發(fā)明的偶聯(lián)物和一種或多種藥學上認可的載體和／或賦形劑。所述藥物組合物是本發(fā)明的另一項內(nèi)容。
本發(fā)明實施例之一是將藥學活性量的本發(fā)明偶聯(lián)物給予可能患生長素相關疾病或已經(jīng)顯現(xiàn)出此類病癥的個體。
本發(fā)明的另一目的是治療、預防或診斷生長素相關疾病的方法，包括給予有效量的本發(fā)明偶聯(lián)物和一種或多種藥學上認可的賦形劑。
“有效量”指活性成分的量足以影響上述疾病的病程和嚴重性，結果緩解或壓制所述病癥。有效量取決于給藥途徑和患者情況。
“藥學上認可的”包括任何不干擾活性成分生物活性，對接受個體無毒的載體。例如，若是胃腸外給予，所述活性成分可用諸如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液等運載體配制成注射用單位劑型。
除藥學上認可的載體之外，本發(fā)明組合物還可包含少量諸如穩(wěn)定劑、賦形劑、緩沖劑和防腐劑等添加劑。
任何適合主要活性成分的給藥途徑均可使用。優(yōu)選胃腸外給藥，例如皮下、肌內(nèi)或靜脈注射?；钚猿煞值慕o予劑量取決于根據(jù)患者年齡、體重和個體反應所做的處方。
治療人的活性成分劑量約為5-6，000μg／kg體重，更好的是10-300μg／kg體重。
以上參照實施方式對本發(fā)明進行了描述，但其內(nèi)涵覆蓋本領域技術人員在本發(fā)明宗旨和范圍內(nèi)所能進行的各種修改和替換。
以下，將通過實施例對本發(fā)明進行描述，這些實施例不是對本發(fā)明的限定。


圖1是hGRF(1-29)-NH2的氨基酸序列。箭頭所指是可發(fā)生PEG化的位點。
圖2顯示如實施例1所述，在DMSO中進行PEG化所得混合物的反相HPLC層析。前兩個主峰是含1分子PEG鏈／摩爾hGRF的偶聯(lián)物。后面的副峰是hGRF∶2PEG偶聯(lián)物，最后面的副峰是hGRF∶3PEG偶聯(lián)物。
圖3a是本發(fā)明hGRF(1-29)和PEG偶聯(lián)物受枯草桿菌蛋白酶的降解。
圖3b是本發(fā)明hGRF(1-29)和PEG偶聯(lián)物受糜蛋白酶的降解。
圖4顯示[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21-hGRF(1-29)-NH2]的圓二色性光譜特征描述。該光譜與“天然”hGRF的重疊。
圖5顯示各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(第一DMSO制劑)在CHO-hGRFR-LUC體外試驗的生物作用。
圖6告知各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(第二DMSO制劑)在CHO-hGRFR-LUC體外試驗的生物作用。數(shù)據(jù)代表兩次獨立試驗的平均值。
圖7顯示各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(煙酰胺制劑)在CHO-hGRFR-LUC體外試驗的生物作用。數(shù)據(jù)代表兩次獨立試驗的平均值。
圖8說明各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(第一DMSO制劑)在體外對大鼠垂體細胞釋放GH的生物作用。
圖9顯示各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(第二DMSO制劑)在體外對大鼠垂體細胞釋放GH的生物作用。
圖10顯示給雄性大鼠靜脈注射hGRF(400μg／大鼠)后，血漿hGRF水平和血清GH水平的時間-反應曲線。各點代表9只大鼠的平均值±SEM。
圖11A(該頁第一圖)顯示給雄性大鼠靜脈注射hGRF(400μg／大鼠)后，血清GH水平的時間-反應曲線。各點代表3只大鼠的平均值。
圖11B(該頁第二圖)顯示給雄性大鼠靜脈注射hGRF(400μg／大鼠)后，血漿hGRF水平的時間-反應曲線。各點代表3只大鼠的平均值。
圖12評價GRF活性的報導基因試驗所用質(zhì)粒pcDNA3-hGRF-R的限制性酶切圖。
圖13顯示評價GRF活性的報導基因試驗所用質(zhì)粒pTF5-53LUC的限制性酶切圖。
人GRF1-29hGRF(1-29)-NH2來自Bachem，用作hGRF肽。
因為hGRF(1-29)在PEG化所需中性或微堿性pH下在水溶液中的溶解度很低，所以采用替代反應條件A至EA．二甲基亞砜20mg肽溶于1ml DMSO，立即加入適量PEG化劑。
B．體積比1∶1，pH8．0的二甲基甲酰胺／0．2 M硼酸緩沖液立即加入肽和適量PEG化劑。
C．高濃縮煙酰胺水溶液(200mg／ml)將200mg煙酰胺加入40mg hGRF(1-29)在1ml 10mM乙酸中所成溶液。在所述酸性溶液中加pH8．0的0．2M硼酸緩沖液1ml，達所需pH，然后加適量PEG化劑。
D．立即加入體積比1∶1，pH8．0的乙腈／0．2M硼酸緩沖液和適量PEG化劑。
E．立即加入0．2M硼酸緩沖液，5M尿素，pH8．0和適量PEG化劑。
在優(yōu)選實施例中，攪拌加入無水PEG化劑，直至最后的PEG∶hGRF摩爾比為1∶1，2∶1或3∶1。優(yōu)選2∶1。
使用不同的PEG∶hGRF摩爾比能夠制備出以所需偶聯(lián)物為主要偶聯(lián)物的反應混合物。反應混合物室溫下放置5小時，然后純化。得到以下4種hGRF-PEG偶聯(lián)物(A1-A4)A1[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29)-NH2]，A2[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2]，A3[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21-hGRF(1-29)-NH2]，A4Nα-(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21hGRF(1-29)-NH2] 。
用1，000D截留值的濾膜凝膠過濾去除過量DMSO，二甲基甲酰胺，乙腈或脲以及反應副產(chǎn)物(羥基琥珀酰亞胺)。用10mM乙酸將體積調(diào)定為10ml，然后減少到1ml。以上過程重復3次。
凝膠過濾層析或反相層析分離hGRF-PEG偶聯(lián)物。實施例2凝膠過濾層析通過凝膠過濾層析，產(chǎn)物各組分根據(jù)分子量不同而分離(此時，偶聯(lián)物hGRF-PEG1∶1的MW=8，358，hGRF-PEG1∶2的MW=13，358，hGRF-PEG1∶3的MW=18，358)。用Superdex 75-Superose 12樹脂串聯(lián)柱系統(tǒng)(Biotech，Pharmacia)，10ml乙酸，1．5ml／min流速洗脫進行分離。
取收集到的流分1m在280nm處OD法分析蛋白質(zhì)含量，碘試驗測定PEG含量(Sims等，1980)。
在DMSO中用摩爾比1∶1的hGRF-PEG PEG化后，得到3個峰洗脫體積132ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(主峰)；洗脫體積108ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(副峰)；和洗脫體積108ml處的非軛體hGRF(副峰)。
在DMSO中用摩爾比1∶2的hGRF-PEG PEG化后，得到3個峰；洗脫體積108ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(主峰)；洗脫體積132ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(副峰)；和洗脫體積73ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(副峰)。
在DMSO中用摩爾比1∶3的hGRF-PEG PEG化后，得到2個峰
洗脫體積73ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(主峰)；和洗脫體積108ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(副峰)。
收集洗脫峰，用截留值1，000D的濾膜超濾濃縮，冷凍干燥，溶于10mM乙酸，鑒定并定量后進行特征描述。
發(fā)現(xiàn)，洗脫體積73ml處的峰對應于化合物A4。
洗脫體積132ml處的峰對應于化合物A3。
洗脫體積108ml處的峰對應于化合物A2和A1的混合物。
232ml處的洗脫峰被發(fā)現(xiàn)是非偶聯(lián)hGRF。
然而，所述方法無法分離分子量相同僅PEG化位點不同的hGRF-PEG偶聯(lián)物(位點異構體)。
實施例3反相層析用RP-HPLC C18柱進行特異性更高的疏水層析。該方法能分開分子量相同的異構體。實際上，用這種方法，凝膠過濾所得對應于共價結合1分子PEG的偶聯(lián)物的1個峰分成了2個峰。
用RP-HPLC C18制備柱(Vydac)進行反相層析，用H2O／0．05％TFA(洗脫液A)和乙腈／=0．05％TFA(洗脫液B)如下梯度洗脫0-5分鐘35％A5-35分鐘 35％A→2％A35-38分鐘 2％A38-40分鐘 2％A→35％B流速10ml／min；環(huán)(loop)1μl；UV-Vis．檢測器280nm。在DMSO中用摩爾比1∶1的hGRF-PEG PEG化后，得到4個峰1．13．2分鐘，主峰；2．13．7分鐘，主峰；3．14．4分鐘，副峰；和4．8．9分鐘，副峰。在DMSO中用摩爾比1∶2的hGRF-PEG PEG化后，得到4個峰1．13．2分鐘，副峰；2．13．7分鐘，副峰；3．14．4分鐘，主峰；和4．15．5分鐘，副峰。
在DMSO中用摩爾比1∶3的hGRF-PEG PEG化后，得到2個峰1．14．4分鐘，副峰；2．15．5分鐘，主峰。
收集洗脫峰，蒸發(fā)去除乙腈和TFA，然后冷凍干燥。將凍干產(chǎn)品溶于10mM乙酸溶液，如后文所述進行分離物的鑒定和定量分析。發(fā)現(xiàn)13．2分鐘洗出的hGRF-PEG偶聯(lián)物對應于A1化合物(GRF-1PEG，第1峰)。
13．7分鐘洗出的hGRF-PEG偶聯(lián)物對應于A2化合物(GRF-1PEG，第2峰)。
14．4分鐘洗出的hGRF-PEG偶聯(lián)物對應于A3化合物(GRF-2PEG)。
15．5分鐘洗出的hGRF-PEG偶聯(lián)物對應于A4化合物(GRF-3PEG)。
8．9分鐘洗出的峰是非偶聯(lián)hGRF。
作為典型實施例，圖2顯示了用2∶1的PEG∶hGRF摩爾比所得PEG化產(chǎn)物的反相層析。
通過溶劑蒸發(fā)／冷凍干燥獲得干燥產(chǎn)物。實施例3a用PEG10，000進行的hGRF液相PEG化此實施例使用分子量為10，000Da，以賴氨酸為間隔基的分支單甲氧基PEG(得自Shearwater Polymer，Inc．)。所述分支PEG為PEG5，000與賴氨酸各氨基連接而得。
賴氨酸間隔基的羧基被活化成琥珀酰亞胺酯，在DMSO中，以0．9摩爾PEG比1摩爾GRF之比與hGRF(1-29)-NH2的氨基反應。
去除溶劑，在Superose 12 TM制備柱上凝膠排阻層析分離殘留物。洗出2個峰，對應于兩種hGRF-PEG偶聯(lián)物。第一個副峰對應于2單位PEG10，000與hGRF結合的偶聯(lián)物，第二個主峰對應于含1單位PEG10，000／hGRF的偶聯(lián)物。實施例3a用PEG20，000進行的hGRF液相PEG化此實施例使用分子量為20，000Da，以賴氨酸為間隔基的分支單甲氧基PEG(得自Shearwater Polymer，Inc．)。
所述分支PEG為MPEG10，000與賴氨酸各氨基連接而得。
賴氨酸間隔基的羧基被活化成琥珀酰亞胺酯，在DMSO中，以0．9摩爾PEG比1摩爾GRF之比與hGRF(1-29)-NH2的氨基反應。
去除溶劑，在Superose 12 TM制備柱上凝膠排阻層析分離殘留物。只得到1個峰。這個峰對應于1單位PEG20，000／hGRF的偶聯(lián)物。實施例4hGRF-PEG偶聯(lián)物的分析性特征說明根據(jù)以下試驗，檢測以上所得產(chǎn)物所結合的PEG鏈1．用三硝基苯磺酸鹽比色法檢測游離氨基(參見Habeed等，1966)；2．用碘比色法檢測PEG含量(參見Sims等，1980)。
3．在氨基酸分析中根據(jù)作為鏈標記的正亮氨酸使用PEG鏈數(shù)(參見Sartore等，1991)。
4．用質(zhì)譜法測定偶聯(lián)物的分子量。
用MALDI質(zhì)譜儀測定偶聯(lián)物的分子量和由于起始物PEG多分散性造成的多分散性。
根據(jù)氨基酸序列分析hGRF-PEG偶聯(lián)物的PEG結合位點。每份樣品稀釋100倍。然后將10μl溶液溶液(約50pmol)加入測序儀。
用RP-HPLC分析型層析測定最終產(chǎn)品的純度。
分析使用C18分析柱(Vydac)，用H2O／0．05％TFA(洗脫液A)和乙腈／0．05％TFA(洗脫液B)如下梯度洗脫0-5分鐘 80％A5-50分鐘 80％A→5％A50-52分鐘 5％A52-54分鐘 5％A→80％B流速1ml／min；環(huán)20μl；UV-Vis．檢測器226nm。
20．7分鐘時洗出的是非偶聯(lián)hGRF。
22．9分鐘時洗出化合物A1，23．4分鐘時洗出化合物A2，24．4分鐘時洗出化合物A3，25．5分鐘時洗出化合物A4。
用圓二色性分析進行“天然”和結合有聚合物的肽的構象特征描述。
用190-300nm范圍內(nèi)的圓二色性分析進行非偶聯(lián)hGRF與hGRF-PEG偶聯(lián)物的光譜特征描述。樣品(50μg／ml)溶于10mM乙酸或甲醇／10mM乙酸，摩爾比為30∶70和60∶40。在上述溶液中，如化合物A3的圖4A所示，非偶聯(lián)hGRF與hGRF-PEG偶聯(lián)物的表現(xiàn)可重疊。在乙酸溶液中，肽具有隨機構象，但隨甲醇濃度升高，肽呈現(xiàn)α-螺旋結構。
以上結果證明PEG偶聯(lián)物不顯著改變肽的結構特征。實施例 5hGRF-PEG偶聯(lián)物的穩(wěn)定性評價用例如枯草桿菌蛋白酶和糜蛋白酶等蛋白酶考察hGRF和hGRF-PEG偶聯(lián)物的抗蛋白酶解穩(wěn)定性。
用枯草桿菌蛋白酶所做研究為肽在0．1M Tris HCl 0．005M CaCl2pH8．0中所成的0．297mM溶液，以1∶50，000的肽／蛋白酶摩爾比，4℃保溫。
在糜蛋白酶研究中，肽溶于0．08M Tris HCl 0．1M CaCl2pH7．8中，肽／蛋白酶的摩爾比是1∶15，000。
用分析型RP-HPLC跟蹤肽的降解，用的是C18柱，實施例4中的洗脫條件。在與蛋白酶保溫前和保溫一定的時間后計算對應于起始化合物的峰高。估算一定時間后的殘留峰高百分比，記錄在圖3a和b中。實施例6使用烷基化PEG的PEG化用不同的酰化基團和烷化基團活化單甲氧基化PEG，hGRF與之偶聯(lián)。
烷基化PEG具有所得偶聯(lián)物保留賴氨酸上正電荷的優(yōu)點。
如實施例1-4所述進行分離和特征描述。實施例7hGRF-PEG偶聯(lián)物活性的評價材料測試化合物人GRF1-29hGRF(1-29)-NH2，批號1299201，Bachem提供；人GRF3-29hGRF(1-29)-NH2，Bachem提供；人GRF3-29，ISL提供；和以上制備的hGRF-PEG偶聯(lián)物。反應試劑CHO-hGRF-LUC體外試驗含核糖核苷和脫氧核糖核苷(Gibco)，并補充了10％胎牛血清(Gibco)加600μg／ml硫酸遺傳霉素G418(Gibco)的MEMα培養(yǎng)基；細胞培養(yǎng)物裂解劑(Promega)；熒光素酶試劑(Promega)；和Luclite(Packard)。體外大鼠垂體細胞生物試驗
補充了50μg／ml硫酸慶大霉素(Sigma)的Earle’s平衡鹽溶液(EBSS)(Gibco)。
含Earle’s平衡鹽(Gibco)，12．5％胎牛血清(FBS)(Gibco)和50μg／ml硫酸慶大霉素的199培養(yǎng)基(M199)。
Amersham的大鼠GH試驗試劑盒。
用于組織消化的酶溶液(定容至30mlEBBS)120mg膠原酶(Sigma)30mg透明質(zhì)酸酶(Sigma)900mgBSA(Sigma)再生后，溶液過濾滅菌，保存于37℃。體內(nèi)生物試驗Amersham的大鼠GH試驗試劑盒。Phoenix Pharmaceutical的人GRF(1-44)放射性免疫試驗試劑盒。動物SPF成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200-250g，Charles River提供，適應至少7天后使用。方法CHO-hGRF-LUC體外試驗CHO-hGRF-LUC(克隆1-11-20)是載體pcDNA3-hGRF-R和pTF5-53LUC共轉染到CHO-DUKX細胞系內(nèi)獲得的一個克隆細胞系。
質(zhì)粒pcDNA3-hGRF-R是將人生長素釋放因子受體(hGRF-R)的cDNA插入表達載體pcDNA3構建而成的。含hGRF-R cDNA的Bluescript是Dr．B．Gaylinn(University of Virginia)提供的，哺乳動物表達載體pcDNA3得自Invitrogen。hGRF-R編碼序列由人巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動。其限制性酶切圖見圖12。
質(zhì)粒pTF5-53LUC是將c-fos cAMP應答元件與熒光素酶編碼序列上游的內(nèi)源性啟動子一起插入質(zhì)粒poLuc構建而成。cAMP應答元件和c-fos啟動子來自質(zhì)粒pTF5-53(參見Fish等，1989)。具有多克隆位點的熒光素酶編碼序列上游的無啟動子報導基因載體(poLuc)由Dr．Brasier(University of Texas，Galveston)提供。其限制性酶切圖見圖13。
上述共轉染得到的CHO-DUKX細胞常規(guī)培養(yǎng)在MEMα培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含核糖核苷和脫氧核糖核苷，并補充了10％胎牛血清加600μg／ml硫酸遺傳霉素G418。
細胞接種(40，000細胞／孔)到白色96孔板(Dynatech)上，試驗前在200μl生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-18小時。
次日，去除培養(yǎng)基，換以含不同濃度hRGF(1-29)室內(nèi)參照標準(Bachem)或不同hRGF-PEG偶聯(lián)物的培養(yǎng)基，然后孔板在37℃，5％CO2中培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)結束時，用200μl PBS(Sigma)洗滌CHO-hGRF-LUC細胞2次，然后每孔加50μl細胞培養(yǎng)裂解劑(Promega)裂解。再室溫培養(yǎng)15分鐘后，加入150μl熒光素酶試劑(Promega)，在發(fā)光光度計(Dynatech)中讀數(shù)。
另一種方法是，50，000細胞／孔接種CHO-hGRF-LUC細胞，與不同hRGF-PEG偶聯(lián)物一起培養(yǎng)后，如前所述用PBS洗滌。每孔加入100μl含鈣離子和鎂離子的PBS，然后加100μl Luclite(Packard)。室溫培養(yǎng)10分鐘后，孔板在發(fā)光光度計(Lumicount-Packard)中讀數(shù)。
結果表示為相對光單位(RLU)。hGRF(1-29)的體外大鼠垂體細胞生物試驗用CO2吸入殺死動物(SPF雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200g)取出垂體。將組織切碎，裝入瓶中，用酶溶液消化。瓶在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置1小時。
回收消化后的組織，洗滌細胞2次，計數(shù)細胞，校正到5×105／ml濃度。細胞接種(200μl／孔)到48孔板上，板在培養(yǎng)箱中放置72小時。
72小時后，細胞與不同濃度hGRF一起培養(yǎng)4小時。結束時，收集上清液，保存于-80℃。
用購得的大鼠GH放射性免疫試驗試劑盒測定各份樣品中的GH含量。體內(nèi)試驗給動物靜脈注射hGRF(1-29)(400μg／大鼠)。(氯胺酮-賽拉嗪)麻醉動物，幾分鐘后收集血液。每鼠從下腔靜脈抽2ml血。將樣品分成2等份收集1ml，37℃保溫3小時后離心獲取血清；另1ml收集在含50μl 4mg／ml肝素的小管中，立即保存于冰上，4℃離心獲取血漿。
給不同動物注射測試化合物后，在不同時刻收集血液樣品。每次試驗，每一時刻共用3只大鼠。
血漿和血清樣品立即冷凍，保存于-20℃。
用購得的RIA試劑盒測定血清GH水平；用購得的測定hGRF(1-44)的RIA試劑盒測定血漿hGRF水平。結果注在這一部分和相關附圖中，“GRF-1PEG第一峰”對應于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-1 PEG第二峰”對應于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-2PEG”對應于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12．21-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-3PEG”對應于Nα-(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12．21-hGRF(1-29)- NH2]。CHO-hGRF-LUC體外試驗圖5和6顯示用DMSO制備的兩批hGRF-PEG偶聯(lián)物在CHO-hGRF-LUC體外試驗中的活性。
我們發(fā)現(xiàn)，所有制劑都有活性，但程度略低于“天然”hGRF(hGRF接受與PEG化化合物相同的純化步驟)，GRF-1PEG(第一峰和第二峰)的活性高于GRF-2PEG和GRF-3PEG。hGRF與“天然”hGRF之間沒有發(fā)現(xiàn)有區(qū)別(未給出數(shù)據(jù))。
我們觀察到兩批DMSO制備的hGRF-PEG偶聯(lián)物(圖5和圖6)與兩批煙酰胺溶液制備的偶聯(lián)物(圖7)具有相似的體外生物活性。圖6還顯示與hGRF(1-29)相比，兩種不同的hGRF(3-29)制劑沒有顯著的體外活性。hGRF1-29的體外大鼠垂體細胞生物試驗在用兩種DMSO制劑中的hGRF-PEG進行的試驗中，我們發(fā)現(xiàn)，GRF-1PEG第一峰是最具活性的化合物，其次是GRF-1PEG第二峰，GRF-2PEG，接著是GRF-3PEG(圖8和9)。以上發(fā)現(xiàn)與報導基因試驗所得非常一致。體內(nèi)試驗在初步實驗中，給大鼠靜脈注射400μg hGRF后測定血清GH水平和血漿hGRF水平。結果見圖10。如圖所示，GH和hGRF水平都在hGRF注射后10分鐘達到最高值。然后，血清GH水平迅速下降，60分鐘后回到基線，但在以上時段，血漿hGRF水平卻維持恒定。
圖11A和11B中顯示的是給大鼠靜脈注射400μg GRF-1PEG第一峰及第二峰、GRF-2PEG和GRF-3PEG(DMSO制劑)后48小時內(nèi)不同時刻的血液GH和GRF水平。
與hGRF1-29相似，靜脈注射后10分鐘，上述PEG化制劑都誘導產(chǎn)生一個血清GH峰。然而，GRF-1PEG第一峰及第二峰和GRF-2PEG所誘導的GH水平與hGRF1-29的相當，GRF-3PEG仍和體外試驗結果一樣，活性較低。
就血漿GRF水平而言，不論使用何種制劑(DMSO或煙酰胺)，用GRF-1PEG第一峰及第二峰所得的情況與GRF-2PEG和GRF-3PEG完全不同。注射GRF-1PEG第一峰及第二峰后48小時，血漿GRF水平回到基線，而GRF-2PEG和GRF-3PEG水平則較持久。
實施例8PEG化起始化合物即位點保護hGRF(1-29)-NH2衍生物的固相合成本實施例固相合成了在賴氨酸12和21的伯氨基各有一個特定保護基(N-烯丙基氧基羰基)的hGRF(1-29)-NH2衍生物。這樣就可以在Nα-末端進行位點特異性PEG化。另一種氨基被保護的衍生物通過?；忾]Nα-末端和N-烯丙基氧基羰基封閉賴氨酸12制備而得。這種衍生物用于賴氨酸21處的位點特異性PEG化。材料和方法肽合成在Applied Biosystems Inc．431A型肽合成儀上用Fmoc化學法組裝各種hGRF衍生肽-樹脂，對每個殘基使用低取代(0．16mmol／g)PAL-PEG-PS樹脂和雙偶聯(lián)及加帽法以獲得最佳的粗產(chǎn)物產(chǎn)量和純度。此外，通過還原性烷基化人工給[N-異丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-NH2]肽-樹脂添加一個N末端異丙基。
全部肽樹脂用TFA／1，2-乙二硫醇／苯硫醇甲烷／水[10∶0．5∶0．5∶0．5(v／v)]混合物剪切2小時，MTBE沉淀和離心分離出粗肽。反相梯度HPLC純化冷凍干燥的肽，用Vydac18C制備柱和0．1％TFA水／乙腈緩沖液系統(tǒng)。全部純化肽用分析型反相HPLC和MALDI-TOF質(zhì)譜進行特征描述。材料Fmoc-L-氨基酸(Bachem Bioscience，Perseptive Biosystem，NovaBiochem)，DMF，20L轉鼓(drum)(J．T．Baker)，哌啶(Applied Biosystems，Chem-Impex)，HBTU(Rainin，Richelieu Biotechnologies)，NMM(Aldrich)，AceticAnhydride(Applied Biosystems)，樹脂(Perseptive Biosystems Novabiochem)，芥子酸(Aldrich)，2-氰-4-羥-肉桂酸(Sigma)，乙腈(J．T．Baker)，TFA(Sigma，Pierce)，去離子水(Millipore Mille-Q Water System)。其他溶劑和試劑如下試劑／溶劑 供應商NMP Applied Biosystems Inc．，J．T．BakerHBTUApplied Biosystems Inc．Richelieu Biotechnologies Inc．0．5M HOBt的DMF溶液 Applied Biosystems Inc．2．0M DLEA的NMP溶液 Applied Biosystems Inc．哌碇Applied Biosystems Inc．二氯甲烷Applied Biosystems Inc．乙酸酐 Applied Biosystems Inc．氨基酸ABI 431A合成儀上使用的大多數(shù)FMOC氨基酸是購自AppliedBiosystems的已稱重1．0mmol管裝品。FMOC-Lys(Alloc)-OH是購自PerseptiveBiosystems(Framignham，MA)的散裝品和室內(nèi)管裝品。所用的全部氨基酸都是L構形。
樹脂用于hGRF類似物的的基本樹脂是PAL-PEG-PS(肽酰胺接頭-聚乙二醇-聚苯乙烯)樹脂。PAL-PEG-PS支持體購自Perseptive Biosystems，一致具有良好的粗產(chǎn)物得率和純度。0．16mmol／g的低取代樹脂用于全部衍生物。低取代樹脂一般用于長、難序列，通過減少成長肽鏈中的空間障礙和β平面形成確保更好的偶聯(lián)。方法鏈組裝-Applied Biosystems Inc．431A型肽合成儀先在Applied Biosystems Inc．431A型肽合成儀上用Fmoc法組裝被保護肽鏈，該合成儀使用快速FMOC循環(huán)程序(FastMocTM)。用HBTU活化和偶聯(lián)，用20％哌碇去保護，NMP是用于去保護、氨基酸溶解和樹脂洗滌的主要溶劑。氨基酸以已稱重1．0mmol管裝形式引入。0．25mmol FastMocTM循環(huán)使用1．0mmol管和40ml反應管。鏈組裝-過程
0．25mmol程序化循環(huán)的步驟可概括如下1．哌碇去保護-先用NMP洗滌樹脂，然后加入18％哌碇／NMP溶液，去保護3分鐘。倒去反應管中的溶液，加入20％哌碇溶液，繼續(xù)去保護約8分鐘。
2．溶解氨基酸-在小管中加入NMP(2．1g)和0．9mmol 0．45M HBTU／HOBt的DMF(2．0g)溶液，混合6分鐘。
3．NMP洗滌-倒干反應容器，樹脂用NMP洗滌5次。
4．活化氨基酸并轉移倒反應管(RV)-在小管中加入1m 2M DIEA的NMP溶液開始活化已溶解的氨基酸，然后從小管中轉移倒RV中。
5．偶聯(lián)和最后洗滌-活化氨基酸和N末端去保護的肽-樹脂之間的偶聯(lián)反應進行約20分鐘，然后倒干RV，用NMP洗滌樹脂。
6．加帽反應(如有必要)-在反應管中加入約12ml 0．5M乙酸酐，0．125MDIEA和0．015M HOBt的NMP溶液，渦流攪拌15分鐘。這將?；瘶渲先魏挝磁悸?lián)的位點，得到截斷序列而非缺失序列，這簡化了后面的純化步驟。
完整的上述循環(huán)可見Applied Biosystems告使用者書No．35(431A型上的FastMocTM0．25和0．10)。一次典型合成的標準步驟第1步用DFM洗滌樹脂3次。
第2步用20％哌碇／DMF進行2次5分鐘的去保護。
第3步用DMF洗滌樹脂6次。
第4步用HBTU／NMM的DMF溶液活化的氨基酸偶聯(lián)45分鐘。
第5步用DMF洗滌樹脂3次。
對于難序列，在偶聯(lián)之后可另外插入一步加帽反應，該反應用70％乙酸酐的DMF溶液進行20分鐘，?；?樹脂上任何未偶聯(lián)的位點，得到的最終粗產(chǎn)物是截斷序列而非缺失序列。剪切／萃取用于去除側鏈保護基和從樹脂上釋放肽的剪切混合物是用于含精氨酸和／或甲硫氨酸肽的標準混合物。用于0．1-1．5g肽-樹脂的是10ml三氟乙酸，0．5ml去離子水，0．5ml苯硫醇甲烷，0．5ml乙二硫醇(87％三氟乙酸，4．3％去離子水，4．3％苯硫醇甲烷，4．3％乙二硫醇)。剪切過程將100mg-1g肽-樹脂裝入20ml玻璃管，冰浴冷卻。制備剪切混合物，也冰浴冷卻，然后加入肽-樹脂，使得最終體積達到約10ml。
從冰浴中取出試管，溫熱至室溫。蓋上試管，反應混合物室溫下攪拌2小時。
2小時后，溶液經(jīng)中孔-粗孔濾膜真空過濾到30ml冷MTBE中。用1ml TFA洗滌反應管，經(jīng)同一過濾漏斗過濾到冷MTBE中。然后將整個懸浮系轉移到50ml的離心管中，室溫下2，000rpm離心約10分鐘。吸出上清液，沉淀重懸在40ml冷MTBE中，再次離心。重復該步驟一次以上。吸出最后的上清液，在沉淀中吹入氮氣以蒸發(fā)掉大部分殘留的醚。
然后將肽溶于20-30ml 1％-10％乙酸水溶液，用去離子水稀釋至約100-150ml，夾套冷凍(shell frozen)，冷凍干燥。純化RP-HPLC法系統(tǒng)-Waters Delta Prep 4000柱-Vydac反相C18柱，10μm，2．2×25cm(分類號218TP1022)緩沖液-A水／0．1％TFA，B乙腈／0．1％TFA流速-15ml／min檢測-Waters 484 UV檢測器，220nm梯度-可變，一般為0．2％B／min至1．0％B／min將50-100mg冷凍干燥的粗肽溶于200ml 0．1％TFA水溶液。然后通過“A”緩沖液儲備管將肽溶液直接上到制備柱上，開始梯度程序。
收集到的組分在自動取樣儀分析型HPLC系統(tǒng)上運行通宵。集合經(jīng)峰積分判斷純度高于92％的重疊組分，用去離子水按4∶1稀釋，夾套冷凍，然后在Virtis 25SL Freezedryer上冷凍干燥。特征描述反相HPLC條件系統(tǒng)-Waters 510泵，717自動取樣儀，490多波長UV檢測儀柱-Vydac C18，5μm，0．46×25cm(分類號218TP54)緩沖液-A水／0．1％TFA，BACN／0．1％TFA流速-1ml／min檢測-UV214nm，280nm梯度-2％B／min將0．2-1．0mg／ml冷凍干燥的肽溶于0．1％TFA水溶液至0．5-1．0mg／ml的濃度，制成純化肽樣品。
將15-18μl注射到柱上，用0-50％CAN梯度程序，在25分鐘內(nèi)洗脫。用WatersExpert-Ease軟件收集層析數(shù)據(jù)并保存。質(zhì)譜類型MALDI-TOF(基質(zhì)輔助的激光吸收／離子化飛行時間)系統(tǒng)Perseptive Biosystems Voyager Elite基質(zhì)用67％ACN／0．1％TFA配制的10mg／ml a-氰基4-羥基肉桂酸溶液，或用50％ACN／0．1％TFA配制的10mg／ml芥子酸溶液將肽樣品溶于50％ACN／0．1％TFA，制備成1-20μmol濃度。在分析板各孔中先加入0．5μl基質(zhì)溶液，然后加入0．5μl肽樣品，然后自然干燥。將分析板放入儀器中，用對肽優(yōu)化過的反射器延遲-萃取法(Reflector Delayed-Extraction)掃描和分析樣品。收集并分析每份樣品激光擊打32-128次的累計數(shù)據(jù)信號。每次運行包括一份樣品和一份用于校準的標準肽。特異性合成[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-NH2的制備先在Applied Biosystems 431A型肽合成儀(參見前文合成方法部分)上用Fmoc化學法組裝[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS樹脂，包括N末端殘基的Fmoc基團去保護。
肽-樹脂用TFA1，2-乙二硫醇∶苯硫醇甲烷∶水[10∶0．5∶0．5(v／v)]剪切2小時，MTBE沉淀分離出肽，得到240mg粗肽。Vydac C18柱(22×250mm)制備型反相HPLC純化得到60mg純化產(chǎn)物(分析型HPLC測得純度＞95％)。MALDI-TOF質(zhì)譜算得3523．8，測得3524．2。[Nα-異丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-NH2的制備先組裝[Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS樹脂先在Applied Biosystems 431A型肽合成儀(參見前文合成方法部分)上用Fmoc化學法組裝[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS樹脂，包括N末端殘基的Fmoc基團去保護。通過還原性烷基化進行的Nα-異丙基化如Hocart等1987年所述，用氰基硼氫化鈉和對應的酮(丙酮)進行肽-樹脂的還原性烷基化，添加Nα-異丙基。880mg肽-樹脂(約70μmol)在5ml DCM中溶脹30分鐘，然后加入10mmol(174μl)丙酮在7ml MeOH／1％HOAc中所成溶液，環(huán)境溫度下間或攪拌2小時。然后加入溶于12ml MeOH／1％HOAc的2mmol(129mg)氰基硼氫化鈉，混合物間或攪拌2小時，然后靜置過夜(15小時)。定性水合茚三酮監(jiān)測顯示反應完全(無蘭色)。肽-樹脂用TFA1，2-乙二硫醇∶苯硫醇甲烷∶水[10∶0．5∶0．5(v／v)]剪切2小時，MTBE沉淀分離出肽，得到200mg粗肽。Vydac C18柱(22×250mm)制備型反相梯度HPLC純化，用水／乙腈／0．1％TFA溶液，得到50mg純化產(chǎn)物(分析型HPLC測得純度＞95％)。MALDI-TOF質(zhì)譜算得3481．9，測得3481．8。
實施例9被保護hGRF(1-29)的PEG化如實施例8所述制備的hGRF衍生物與實施例1和6所述的活化PEG偶聯(lián)。
此時的純化只需分離掉過量的試劑和副產(chǎn)物，不必進行實施例2和3所述的過程。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名Applied Research Systerms ARS Holding N．V．(B)街道14 John B．Gorsiraweg(C)城市Curacao(E)國家The Netherland Antilies(F)郵政編碼無(G)電話639300(H)傳真614129(ⅱ)發(fā)明名稱GRF-PEG偶聯(lián)物的液相位點特異性制備(ⅲ)序列數(shù)量1(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1．0，1．30版(EPO)(2)SEQ ID NO．1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設無(ⅳ)反義鏈無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．1Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln1510 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg20 2權利要求
1．一種位點特異性地制備相對每分子hGRF含一個或多個與Lys12和／或Lys21和／或Nα共價結合的PEG單元的hGRF-PEG偶聯(lián)物的方法，其特征在于，在溶液中進行hGRF肽與活化PEG之間的偶聯(lián)反應，從反應混合物中分離出所需的hGRF-PEG偶聯(lián)物并純化。
2．根據(jù)權利要求1所述方法，其中的溶液是煙酰胺濃縮水溶液或解折疊劑的緩沖水溶液。
3．根據(jù)權利要求1所述方法，其中的溶劑是極性有機溶劑，選自二甲基亞砜，二甲基甲酰胺／緩沖液或乙腈／緩沖液。
4．根據(jù)權利要求1所述方法，其中，從反應混合物中分離出hGRF-PEG偶聯(lián)物，用層析法純化。
5．根據(jù)前述權利要求中任一項所述方法，其中的hGRF-肽是hGRF(1-29)- NH2。
6．根據(jù)權利要求1所述方法，其中，在PEG化反應之前，hGRF在一個或多個以下位置被保護Nα，Lys12和Lys21。
7．根據(jù)權利要求1或6所述方法，還包括PEG化后去保護。
8．根據(jù)前述權利要求中任一項所述方法，其中的活化PEG是單甲氧基化形式的烷基化或?；疨EG。
9．一種相對每分子hGRF含一個或多個與Lys12和／或Lys21和／或Nα共價結合的PEG單元的hGRF-PEG偶聯(lián)物。
10．根據(jù)權利要求9所述hGRF-PEG偶聯(lián)物，其中，1個PEG單元與Lys12共價結合。
11．根據(jù)權利要求9所述hGRF-PEG偶聯(lián)物，其中，1個PEG單元與Lys21共價結合。
12．根據(jù)權利要求9所述hGRF-PEG偶聯(lián)物，其中，各有1個PEG單元與Lys21和Lys21共價結合。
13．根據(jù)權利要求9所述hGRF-PEG偶聯(lián)物，其中，各有1個PEG單元與Lys21、Lys21和Nα共價結合。
14．權利要求1所述PEG化反應的中間體，即[Lys(Alloc)12，21]-hGRF。
15．權利要求1所述PEG化反應的中間體，即[Nα-異丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF。
16．權利要求9至13所述hGRF-PEG偶聯(lián)物作為藥物的用途。
17．權利要求9至13任一項所述hGRF-PEG偶聯(lián)物在制造治療、預防或診斷生長素相關疾病所用藥物的用途。
18．根據(jù)權利要求17所述用途，是用于制造治療或診斷生長素缺乏(GHD)所用藥物。
19．一種藥學組合物，含權利要求9至13任一項所述hGRF-PEG偶聯(lián)物和一種或多種藥學上認可的載體和／或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種位點特異性地制備相對每分子hGRF含一個或多個與Lys
文檔編號A61K38/04GK1280483SQ98811759
公開日2001年1月17日 申請日期1998年12月1日 優(yōu)先權日1997年12月3日
發(fā)明者F·M·韋羅內(nèi)塞, P·卡利克埃蒂, O·斯基亞沃內(nèi) 申請人:應用研究系統(tǒng)Ars股份公司