專利名稱：：使用病毒來治療贅生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能夠在干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷的的瘤細(xì)胞中復(fù)制并導(dǎo)致瘤贅生細(xì)胞死亡的病毒。在這點上，RNA和DNA病毒都有用。本發(fā)明還涉及使用這些病毒來治療贅生性疾病包括癌癥和大腫瘤。
背景技術(shù)：
：贅生性疾病包括癌癥是造成人類死亡的主要原因之一。在美國每年診斷的新癌癥病例超過一百三十萬，并且550，000例死亡。在癌癥擴(kuò)散到身體的繼發(fā)部位之前盡早檢測到癌癥，將大大提高宿主的存活機(jī)會。但是癌癥的早期檢測并不總是可能的，而且即使可能，治療也不令人滿意，特別在高惡性癌癥時。癌癥治療包括化療和放療在晚期效果不佳，特別是當(dāng)瘤生長很快和／或形成較高腫瘤負(fù)荷時。(見HillardStanley，CancerTreat，Vol．1，Jan／Feb1977，p．29-36，Tannock，CancerResearch，42，4921-4926，Dec．1982)。與暴露于多種病毒有關(guān)的腫瘤消退已有報道。已經(jīng)介紹的病毒多數(shù)對人來說是致病性的，包括流行性腮腺炎和麻疹。其他特殊病毒對特定類型的癌癥細(xì)胞的影響也已有介紹。Smith等，(1956)Cancer，9，1211(腺病毒對宮頸癌的影響)；Holzaepfel等，(1957)Cancer，10，557(腺病毒對上皮細(xì)胞瘤的影響)；Taylor等，(1970)J．Natl．CancerInst．，44，515(牛腸道病毒-1對內(nèi)瘤的影響)；Shingu等，(1991)J．GeneralVirology，72，2031(牛腸道病毒MZ-468對F-647a白血病細(xì)胞的影響)；Suskind等，(1957)PSEBM，94，309(柯薩奇B3病毒對HeLa腫瘤細(xì)胞的影響)；Rukavishnikova等，(1976)ActaVirol．，20，387(流感A株對腹水瘤的影響)。最早的文獻(xiàn)介紹了在用活的減毒病毒疫苗進(jìn)行免疫接種以對抗天花或狂犬病的病人中的部分腫瘤消退。見Depace，N．G．(1992)Ginecologia，9，82-88；Salmon，P．＆Baix(1992)Compt．Rend．Soc．Biol．，86，819-820。腫瘤的部分消退和白血病的消退也在天然存在的麻疹感染中被注意到。見Pasquinucci，G．(1971)Lancet，1，36；Gross，S．(1971)Lancet，1，397-398；Bluming，A．Z．和Ziegler，J．L．(1971)Lancet2，105-106。在一個有意用活的腮腺炎病毒對90例癌癥病人進(jìn)行感染的研究中，79例中發(fā)現(xiàn)部分的腫瘤消退。見Asada(1994)Cancer，34，1907-1928。這些病毒的副作用是暫時的，主要考慮的是用這些人類病原體進(jìn)行感染的嚴(yán)重后遺癥。★★★病毒分類如下[見MurphyA和KinsburyDW，1990，見《病毒學(xué)》第2版(Ed．Fields，B．N．)，RavenPress，NewYork，pp9-35]分類特征病毒科名稱單股RNA，正鏈，微核糖核酸病毒科，嵌杯樣病毒科非分段，非包膜單股RNA，正鏈，披蓋病毒科，黃病毒科非分段，日冕形病毒科包膜單股RNA，負(fù)鏈，彈狀病毒科，F(xiàn)iloviridae非分段，副粘病毒科包膜單股RNA，負(fù)鏈，正粘病毒科分段，包膜單股RNA，正負(fù)鏈，布尼安病毒科，分段，包膜嵌沙樣病毒科雙股RNA，正鏈，呼腸孤病毒科，Birnaviridae分段，非包膜單股RNA，復(fù)制過程中含DNA步驟逆轉(zhuǎn)錄病毒科正鏈，非分段，包膜DNA病毒單／雙股DNA，非包膜嗜肝DNA病毒科單股DNA，非包膜細(xì)小病毒科雙股DNA，非包膜乳多空病毒科，腺病毒科雙股DNA，包膜皰疹病毒科，痘病毒科虹色病毒科皰疹病毒科(或皰疹病毒)包括甲型皰疹病毒亞科(包括水痘病毒屬和單純皰疹病毒屬)、乙型皰疹病毒亞科和丙型皰疹病毒亞科。新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科(或副粘病毒)的一個成員。NDV的天然宿主是雞和其他鳥類。NDV通常與動物宿主細(xì)胞表面上的特定分子結(jié)合，與細(xì)胞表面融合，并將其遺傳物質(zhì)注入宿主。NDV是一種殺細(xì)胞型病毒。一旦進(jìn)入細(xì)胞，病毒基因?qū)⒅笇?dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生多個病毒拷貝，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，釋放NDV拷貝，后者感染其他細(xì)胞。不像某些病毒，已知NDV不會導(dǎo)致任何嚴(yán)重的人類疾病。不像其他種類的病毒(例如HTLV-1、乙型肝炎病毒)，已知副粘病毒不是致癌性的。已有報道在少數(shù)接觸NDV的病人中腫瘤暫時消退，見Csatary，L．K．(1971)Lancet，2，825。Csatary在其養(yǎng)雞場中的雞流行新城疫時發(fā)現(xiàn)了一種胃腸道癌癥的消退。在一個相似的趣聞報道中，Cassel，w．A．和Garrett，R．E．(1965)Cancer，18，863-868注意到，在一個病人中，在將NDV注射到宮頸瘤后，已經(jīng)擴(kuò)散到淋巴結(jié)的原發(fā)性宮頸癌消退。因為殺腫瘤活性的機(jī)制被認(rèn)為是免疫性的，沒有進(jìn)行工作來確定這種病毒的直接腫瘤細(xì)胞毒活性。相反，工作集中在NDV的免疫調(diào)節(jié)影響上。見諸如，Murray，D．R．，Cassel，w．A．，Torbin，A．H．，Olkowski，Z．L．＆Moore，M．E．(1977)Cancer40，680；Cassel，W．A．，Murray，D．R．，＆Phillips，H．S．(1983)Cancer52，856；Bohle，W．，Schlag，PJ．，Liebrich，W．，Hogenberger，P．，Manasterski，M．，Miller，P．，和Schirrmacher，V．(1990)Cancer，66，1517-1523。用于腫瘤消退的特殊病毒的選擇過去是基于上述引文中的偶然發(fā)現(xiàn)或試驗和錯誤。直到最近，合理的、以機(jī)制為基礎(chǔ)的將病毒用于癌癥治療的方法才使用DNA病毒發(fā)展起來。這種類型的方法的例子可見于僅在特殊組織來源的腫瘤中復(fù)制(Rodriguez，R．etal，1997CancerRes．，572559-2563)或缺乏某些關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白(Bischoff，JR．etal，1996Science，274373-376)的重組腺病毒載體的發(fā)展中。另一個最近的方法是使用一種復(fù)制不完全的重組腺病毒載體來在某些腫瘤細(xì)胞中重建喪失的關(guān)鍵蛋白功能(Zhang，WW，etal，1994Cancergenetherapy，15-13)。最后，單純皰疹病毒也被遺傳改造來優(yōu)先在快速分裂的細(xì)胞中復(fù)制，后者是腫瘤的特征(Mineta，T．，etal，1994CancerRes．，543963-3966)。美國申請系列號08／260，536在此全文引入作為參考，它公開了在癌癥治療中NDV或其他副粘病毒的使用。病毒IFN轉(zhuǎn)基因的表達(dá)一種使用病毒療法來治療癌癥的常規(guī)方法是使用病毒載體來向腫瘤實體傳遞特定的基因。重組腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒都已被修飾來單獨表達(dá)一種干擾素基因或與其他細(xì)胞因子基因組合表達(dá)。在Zhangetal．(1996)Proc．Natl．Acad．Sci．USA934513-4518中，一種表達(dá)人干擾素共有(即合成的)基因的重組腺病毒被用來在裸鼠中治療人乳腺癌(和其他)的異種移植物。作者得出了以下結(jié)論“…一種使用低病原性病毒的病毒溶癌作用的組合，而它自身對IFN和IFN基因治療的作用有抗性，可能是治療多種不同腫瘤尤其是乳腺癌的有效方法。”與涉及干擾素敏感病毒的本發(fā)明相反，Zhang等人(1996)介紹了在腫瘤治療中使用干擾素抗性的腺病毒。在Zhang等((1996)CancerGeneTher．，331-38)中，表達(dá)共有IFN的腺伴隨病毒被用來在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞，接著注射進(jìn)裸鼠。轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤既不形成腫瘤，也不比非轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照生長緩慢。而且，在將一種轉(zhuǎn)導(dǎo)的人腫瘤細(xì)胞注射進(jìn)另一個腫瘤實體中時，非轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤的大小減小。在Peplinski等((1996)Ann．Surg．Oncol．，315-23)中在一個小鼠乳腺癌模型中檢測了γ-干擾素(以及其它細(xì)胞因子，單獨或組合表達(dá))。小鼠用重組痘苗病毒修飾的腫瘤細(xì)胞免疫。當(dāng)再用腫瘤細(xì)胞攻擊時，用病毒修飾的細(xì)胞免疫的小鼠在無病生存時間上有統(tǒng)計學(xué)意義上的提高。Gastl等((1992)CancerRes．，526229-6236)使用表達(dá)γ-干擾素的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)腎癌細(xì)胞。這些細(xì)胞顯示能產(chǎn)生較高數(shù)量的對免疫系統(tǒng)的功能非常重要的多種蛋白。Restifo等((1992)J．Exp．Med．，1751423-1431)使用表達(dá)γ-干擾素的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)一種鼠肉瘤細(xì)胞系，使腫瘤細(xì)胞能更有效地將病毒抗原呈遞給CD8+T細(xì)胞。Howard等((1994)Ann．NYAcad．Sci．，716167-187)使用表達(dá)γ-干擾素的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠和人的黑素瘤細(xì)胞。這些細(xì)胞被觀察到能提高對免疫功能重要的蛋白的表達(dá)。這些細(xì)胞與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的親本細(xì)胞系相比在小鼠中也具有較低的致瘤性，并在體內(nèi)產(chǎn)生一種腫瘤特異性的CTL應(yīng)答的激活。使用治療劑量的干擾素作為癌癥病毒療法的佐劑因為已知干擾素的免疫增強(qiáng)活性，因此幾項研究檢測了干擾素蛋白與其它癌癥病毒療法組合的應(yīng)用。在Kirchner等((1995)WorldJ．Urol．，13171-173)中，208位病人用自體的、NDV修飾的、和致死性照射的腎細(xì)胞癌瘤細(xì)胞免疫，并用低劑量的IL-2或IFNα共同處理。作者指出，這種治療方案在局部發(fā)展的腎細(xì)胞癌的病人中相對天然進(jìn)程能產(chǎn)生很大的改善。劑量為大約3．3×103至2．2×105PFU／kg。這是一種局部療法，與系統(tǒng)性方法相對，其目的是誘導(dǎo)一種抗腫瘤免疫應(yīng)答。Tanaka等((1994)J．Immunother．EmphasisTumorImmuno1．，16283-293)將IFNα和一種重組痘苗病毒一起給藥來作為小鼠中的癌癥痘苗治療模型。該研究顯示，接受IFN的小鼠與未接受的小鼠相比，存活性有統(tǒng)計學(xué)意義上的提高。作者將IFN的作用歸因于這些動物中CD8陽性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。Arroyo等((1990)CancerImmunol．，31305-311)使用小鼠結(jié)腸癌模型來檢測IFNα和／或IL-2協(xié)同療法對痘苗病毒結(jié)腸溶癌(VCO)性癌癥治療的影響。他們發(fā)現(xiàn)在這種小鼠模型中VCO+IL-2+IFN三聯(lián)療法最為有效。這種方法依賴于免疫作為抗腫瘤活性的機(jī)制。在這些研究中，IFN被用來提高癌細(xì)胞被免疫系統(tǒng)識別的能力?！铩铩锇l(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供用于疾病包括癌癥治療的病毒。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的目的是提供用于贅生性疾病包括癌癥治療的病毒。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的目的是提供一種方法，通過這種方法可以選擇和／或篩選用于贅生性疾病治療的候選病毒。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的目的是為增強(qiáng)病毒在贅生性疾病治療中的治療用途而對其進(jìn)行遺傳改造提供指導(dǎo)。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的目的是提供一種方法，在目標(biāo)是評價候選靶細(xì)胞對病毒殺傷的敏感性時，通過該方法來篩選用于病毒治療的潛在靶細(xì)胞。本發(fā)明的另一個進(jìn)一步的目的是在病毒治療的管理中提供指導(dǎo)。本發(fā)明的一個目的是提供一種治療大型腫瘤的方法。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的目的是提供純化的病毒和獲得純化病毒的方法。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒給藥于哺乳動物，所說的病毒選自RNA病毒和腺病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒、虹色病毒和皰疹病毒的DNA病毒。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括系統(tǒng)地將干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒給藥于哺乳動物。本發(fā)明還涉及一種在哺乳動物中治療贅生物包括癌的方法，包括將治療有效量的干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒給藥于哺乳動物，所說的病毒選自RNA病毒和腺病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒、虹色病毒和皰疹病毒的DNA病毒科。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆痘苗病毒給藥于哺乳動物，所說的痘苗病毒在一種或多種參與阻斷干擾素的抗病毒活性的基因中具有一個或多個突變，所說的基因選自K3L、E3L和B18R基因。本發(fā)明還涉及一種在哺乳動物中治療贅生物包括癌的方法，包括將治療有效量的干擾素敏感的、復(fù)制活性的、克隆痘苗病毒給藥于哺乳動物，所說的痘苗病毒在一種或多種參與阻斷干擾素的抗病毒活性的基因中具有一個或多個突變，所說的基因選自K3L、E3L和B18R基因。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中用病毒感染大小至少為1cm的贅生物的方法，包括將選自(1)RNA病毒、(2)嗜肝DNA病毒、(3)細(xì)小病毒、(4)乳多空病毒、(5)皰疹病毒、(6)痘病毒和(7)虹色病毒的克隆病毒給藥于哺乳動物。本發(fā)明還涉及一種在哺乳動物中治療贅生物包括癌的方法，包括將治療有效量的選自(1)RNA病毒、(2)嗜肝DNA病毒、(3)細(xì)小病毒、(4)乳多空病毒、(5)皰疹病毒、(6)痘病毒和(7)虹色病毒的克隆病毒給藥于哺乳動物，其中贅生物的大小至少為1厘米。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中治療腫瘤的方法，包括將治療有效量的對該腫瘤有殺細(xì)胞能力的RNA病毒給藥于哺乳動物，其中哺乳動物具有至少占全部體重1．5％的腫瘤負(fù)荷。本發(fā)明還涉及篩選新取自病人的腫瘤細(xì)胞或組織來確定細(xì)胞或組織對一種病毒殺傷作用的敏感性的方法，包括將細(xì)胞或組織用于一種使用干擾素敏感病毒的差別細(xì)胞毒試驗。本發(fā)明還涉及鑒別在哺乳動物中具有抗瘤活性的病毒的方法，包括a)使用待測病毒感染Ⅰ)IFN介導(dǎo)的抗病毒活性有缺陷的細(xì)胞和Ⅱ)IFN介導(dǎo)的抗病毒活性完全的細(xì)胞，和b)確定相對于IFN介導(dǎo)的抗病毒活性完全的細(xì)胞，待測病毒是否能優(yōu)先殺死IFN介導(dǎo)的抗病毒活性缺陷的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及制備用于抗瘤治療的病毒的方法，包括a)通過消除或刪除一種病毒機(jī)制以使IFN的抗病毒作用失活來修飾現(xiàn)存的病毒，并且可以可選地b)產(chǎn)生能導(dǎo)致比所說的現(xiàn)存的病毒毒性低的減毒突變。本發(fā)明還涉及在用病毒處理的哺乳動物中控制病毒復(fù)制的方法，包括給予一種抗病毒化合物，所說的病毒選自RNA病毒和腺病毒、痘病毒、虹色病毒、細(xì)小病毒、嗜肝DNA病毒、水痘皰疹病毒、乙型皰疹病毒和丙型皰疹病毒。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中治療或感染贅生物的方法，包括將來自哺乳動物的樣品(例如血清、腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織、腫瘤切片)進(jìn)行免疫分析，來檢測病毒受體存在的數(shù)量，以確定贅生物是否允許病毒結(jié)合并導(dǎo)致細(xì)胞裂解，以及確定受體是否存在，該方法包括將一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的、克隆的、能與受體結(jié)合的病毒給藥于哺乳動物。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括系統(tǒng)地將脫敏劑量的一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒給藥于哺乳動物。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒經(jīng)過一個至少4分鐘的過程給藥于哺乳動物。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括用選自新城疫病毒毒株MK107、新城疫病毒毒株NJRoakin、Sindbis病毒和水皰性口炎病毒的復(fù)制活性的克隆病毒進(jìn)行給藥。本發(fā)明包括Ⅰ)通過超離但不沉淀純化的副粘病毒；ⅱ)純化至每毫克蛋白至少2×109PFU水平的副粘病毒；ⅲ)純化至每毫克蛋白至少1×1010PFU水平的副粘病毒；ⅳ)純化至每毫克蛋白至少6×1010PFU水平的副粘病毒；ⅴ)純化至每毫克蛋白至少2×109PFU水平的RNA病毒；ⅵ)純化至每毫克蛋白至少1×1010PFU水平的RNA病毒；ⅶ)純化至每毫克蛋白至少6×1010PFU水平的RNA病毒；ⅷ)一種殺細(xì)胞性DNA病毒，它對干擾素敏感，并被純化至每毫克蛋白至少2×109PFU水平；ⅸ)一種復(fù)制活性的痘苗病毒，它a)在K3L、E3L和B18R基因中的一個或多個中具有一個或多個突變，和b)在編碼胸苷激酶、核糖核苷酸還原酶、痘苗生長因子、胸苷酸激酶、DNA連接酶、dUTP酶的基因的一個或多個中具有減毒突變；ⅹ)在選自K3L、E3L和B18R的兩個或更多基因中具有一個或多個突變的一種復(fù)制活性痘苗病毒；ⅹⅰ)在(2’-5’)A類似物的表達(dá)中具有一個修飾，從而導(dǎo)致皰疹病毒具有更高干擾素敏感性的一種皰疹病毒；以及ⅹⅱ)在ω3中有一個減毒突變，從而使所說的病毒變成干擾素敏感的一種呼腸孤病毒。本發(fā)明還包括以下方法Ⅰ)一種純化RNA病毒的方法，包括a)制備一種克隆病毒；并b)通過超離但不沉淀來純化所說的克隆病毒；或c)通過切向流過濾并接著進(jìn)行或不進(jìn)行凝膠滲透色譜來純化所說的克隆病毒；以及ⅱ)一種純化副粘病毒的方法，包括通過超離但不沉淀來純化病毒，或通過切向流過濾并接著進(jìn)行或不進(jìn)行凝膠滲透色譜來純化病毒。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中治療疾病的方法，其中疾病細(xì)胞在干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答中有缺陷，包括向哺乳動物給予治療有效量的干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒。附圖簡述圖1顯示抗β干擾素抗體在NHEK(正常人上皮角質(zhì)細(xì)胞)中對病毒抗原表達(dá)和感染滴度的影響。圖2顯示β干擾素在不同細(xì)胞(正常人皮膚成纖維細(xì)胞CCD922-sk和兩種類型的頭和頸癌細(xì)胞(KB和Hep2細(xì)胞))中對病毒抗原表達(dá)的影響。圖3A顯示干擾素在CCD922-sk細(xì)胞中對病毒抗原表達(dá)的影響。圖3B顯示干擾素在KB細(xì)胞中對病毒抗原表達(dá)的影響。圖4顯示攜帶人ES-2卵巢癌細(xì)胞并用鹽水或NDV毒株P(guān)PMK107處理的無胸腺小鼠的生存曲線。圖5顯示多種人腫瘤和正常細(xì)胞系的干擾素應(yīng)答。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，通過這種機(jī)制，病毒復(fù)制選擇性地殺死干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷的贅生細(xì)胞。本發(fā)明還提供選擇、設(shè)計、純化和使用病毒來治療贅生疾病包括癌癥和大型腫瘤的方法。本發(fā)明的病毒選擇性地在贅生細(xì)胞中復(fù)制并殺死細(xì)胞，其基礎(chǔ)在于這些細(xì)胞中IFN介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答選擇性的缺陷。給予適當(dāng)劑量的病毒將導(dǎo)致贅生細(xì)胞死亡，而正常細(xì)胞由于擁有完整的IFN介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答，能限制病毒的復(fù)制，并且不會被殺死。本發(fā)明的主題包括使用副粘病毒例如NDV和其它病毒，來用于疾病包括贅生性疾病例如癌癥的治療。本發(fā)明還介紹其它適用于治療贅生性疾病的其它病毒的篩選和遺傳操作。本發(fā)明另一個實施方案涉及鑒別能作為病毒療法候選者的腫瘤組織的方法。最后，本發(fā)明還介紹了高純病毒的制備。使用干擾素敏感的病毒包括NDV治療贅生性疾病的原理證明NDV對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷新城疫病毒對多種人腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生選擇性細(xì)胞毒作用，而對正常的人細(xì)胞的影響則明顯低。在一個差別性細(xì)胞毒試驗中，來自內(nèi)瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、成蝕質(zhì)細(xì)胞瘤的人癌細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)對NDV的敏感性比多種正常人細(xì)胞(腎上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、黑素細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(見實施例1))高大約3-4個數(shù)量級。差別細(xì)胞毒試驗還可用于來自病人細(xì)胞或腫瘤組織的新鮮分離物。如實施例1中的介紹，一種體外試驗被用來確定NDV的殺瘤活性。該試驗測量了在5天期間殺死50％的待測細(xì)胞培養(yǎng)物所需的病毒數(shù)量。實施例2和實施例3顯示了體內(nèi)實驗的結(jié)果，其中病毒通過腫瘤內(nèi)途徑(實施例2)或靜脈途徑(實施例3)給藥于攜帶人腫瘤異種移植物的無胸腺小鼠。這些結(jié)果證明，NDV能在用于檢測潛在化療試劑的標(biāo)準(zhǔn)動物模型中導(dǎo)致多種人腫瘤類型的消退。NDV特異性地在腫瘤中復(fù)制，該證據(jù)通過對病毒抗原的免疫組化染色被證明(實施例2)。在腫瘤內(nèi)病毒注射30分鐘內(nèi)，腫瘤組織的病毒抗原為陰性。但在處理后的2天后，在腫瘤中可觀察到大量的病毒抗原的免疫染色，這說明病毒在腫瘤中復(fù)制。重要的是，病毒復(fù)制對腫瘤組織有特異性，因為相鄰的結(jié)締組織和皮膚的病毒抗原為陰性。重要的是，NDV的有效復(fù)制對病毒殺死感染細(xì)胞是關(guān)鍵，如使用UV失活的非克隆病毒的研究中所證實的(Lorence，R．，etal，1994JNatlCancerInst，861228-1233)。NDV還可在腫瘤內(nèi)和靜脈給藥后導(dǎo)致大腫瘤的消退(實施例4至9)。在無胸腺小鼠中用NDV治療大的皮內(nèi)A375人黑素瘤異種移植物(在最大徑向≥10mm；腫瘤體積≥300mm3)，將導(dǎo)致高速的腫瘤消退(實施例4至8)。在無胸腺小鼠中用NDV經(jīng)靜脈治療大的皮下HAT1080人纖維肉瘤異種移植物(最大徑向≥10mm)，在6只小鼠的5只中導(dǎo)致完全的或部分的腫瘤消退(實施例9)。細(xì)胞因子中的I型干擾素是病毒感染的重要負(fù)性調(diào)節(jié)劑I型干擾素包括IFNα和IFNβ，IFNα最初發(fā)現(xiàn)于造血來源的細(xì)胞，而IFNβ最初發(fā)現(xiàn)于成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。[Joklik，W．K．1990．Interferons．pp383-410．《病毒學(xué)》，第二版，B．N．Fields，D．M．Knipe等編輯，RavenPressLd．，NewYork；和Sreevalsan，T．1995．BiologicalTherapywithInterferon-αandβPreclinicalStudies．pp347-364．《癌癥生物治療》第二版，V．T．DeVita，Jr．，S．Hellman和S．A．Rosenberg，J．B．編輯．LippincottCompany，Philadelphia]。兩種類型的IFN都通過明顯相同的作用機(jī)制起作用，包括降解病毒復(fù)制的雙鏈RNA中間產(chǎn)物和抑制通過由雙鏈RNA激活的一種蛋白激酶活性的細(xì)胞翻譯(Joklik，W．K．1990．Interferons．pp383-410．《病毒學(xué)》，第二版，B．N．Fields，D．M．Knipe等編輯，RavenPressLd．，NewYork，及其參考文獻(xiàn))。數(shù)種病毒(流感、EBV、SV40、腺病毒、痘苗病毒)已經(jīng)進(jìn)化了多種機(jī)制，通過這些機(jī)制，IFN系統(tǒng)的一個或多個系統(tǒng)被失活，從而使病毒有效復(fù)制(Katze，M．G．1995．TrendsinMicrobiol．375-78)。多種腫瘤細(xì)胞缺少通過IFN依賴的機(jī)制限制病毒感染的能力人宮頸癌細(xì)胞(Hela)與非轉(zhuǎn)化的成纖維對照細(xì)胞系相比，在用IFN處理后，對水皰性口炎病毒復(fù)制的抑制的敏感性要低300多倍(MaheshwariR．K．，1983．Biochem．Biophys．Res．Comm．17161-168)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，致瘤性人頭和頸癌細(xì)胞(KB)與正常人皮膚成纖維細(xì)胞(CCD922-sk)的共培養(yǎng)物的感染將導(dǎo)致病毒最初在兩種細(xì)胞類型中復(fù)制，接著在正常細(xì)胞中感染被限制，與此相對，病毒在腫瘤細(xì)胞中繼續(xù)復(fù)制并殺死腫瘤細(xì)胞(實施例10)。而且，雖然IFN正被正常細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，但腫瘤細(xì)胞不能對正被產(chǎn)生來建立抗病毒狀態(tài)濃度的IFN產(chǎn)生應(yīng)答。IFN在腫瘤細(xì)胞相對正常細(xì)胞被NDV殺傷的不同敏感性中的作用的進(jìn)一步證據(jù)由兩個獨立的實驗獲得，其中正常成纖維細(xì)胞(CCD922-sk)或正常上皮角質(zhì)細(xì)胞(NHEK)顯示在存在針對IFN的中和抗體時變得對NDV的感染更敏感(實施例11和12)。最后，在存在IFN時正常成纖維細(xì)胞(CCD922-sk)和人腫瘤細(xì)胞(KB)的平行感染顯示，正常細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞對加入的IFN的抗病毒作用至少敏感100倍(實施例13和14)。對不同腫瘤細(xì)胞系(總數(shù)為9)的相似檢測顯示了在一種細(xì)胞系對NDV殺傷作用的相對敏感性與細(xì)胞系不能顯示干擾素介導(dǎo)抗病毒應(yīng)答(實施例26)之間的明顯相關(guān)性。干擾素和細(xì)胞生長干擾素有多個種類，包括α-IFN、β-IFN、ω-IFN和γ-IFN的天然和重組形式以及合成的共有序列形式(例如Zhang等(1996)CancerGeneTherapy，331-38的介紹)。除了導(dǎo)致其被發(fā)現(xiàn)的抗病毒活性，目前已知IFN在細(xì)胞生長和分化的正常調(diào)節(jié)中起重要作用。IFN被視為生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子，數(shù)種參與IFN活性的功能和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白已顯示是在正常細(xì)胞中作為腫瘤抑制蛋白起作用(Tanakaetal．1994Cell77829-839)。而且，幾種已知拮抗IFN的抗病毒作用的其它蛋白已顯示在不適當(dāng)表達(dá)時具有致癌能力。(見下文，Barber，GN，1994．Proc．Natl．Acad．Sci．USA914278-4282)。來自多種人癌的細(xì)胞已顯示在編碼IFN的基因中有刪除(James，CD，etal．1991，CancerRes．511684-1688)，并且在人宮頸癌(Pitricoin，E．etal，1994Mol．Cell．Bio．，141477-1486)、慢性淋巴性白血病(Xu，B．etal，1994，Blood，841942-1949)和惡性黑素瘤細(xì)胞(Linge，C．，etal．1995，CancerRes．，554099-4104)中已觀察到IFN功能的喪失。IFN誘導(dǎo)的蛋白激酶(p68)已顯示是細(xì)胞和病毒蛋白合成的重要調(diào)節(jié)物。一種將p68激酶的表達(dá)或活性與細(xì)胞的分化狀態(tài)聯(lián)系起來的相關(guān)性已經(jīng)出現(xiàn)。這樣，分化較低的細(xì)胞例如那些出現(xiàn)于多種癌癥中的細(xì)胞缺少p68功能(Haines，G．K．，etal．，1993VirchowsArchBCellPathol．63289-95)。缺少p68活性的細(xì)胞通常對病毒介導(dǎo)的殺傷敏感，因為p68激酶是IFN誘導(dǎo)的抗病毒狀態(tài)的重要的效應(yīng)器。p68的抗病毒活性可通過與一種名為p58的細(xì)胞蛋白直接作用來拮抗。當(dāng)在NIH3T3細(xì)胞中克隆和過量表達(dá)時，p58導(dǎo)致細(xì)胞顯示轉(zhuǎn)化表型和貼壁不依賴生長(BarberGNetal．，1994ProcNatlAcadSciUSA914278-4282)。并且多種人白血病細(xì)胞系已顯示過量表達(dá)p58蛋白(KorthMJ，etal．，1996Gene170181-188)。未分化細(xì)胞對病毒殺傷的敏感性可通過誘導(dǎo)更多的分化表型來逆轉(zhuǎn)(Kalvakolanu，DVRandSen，G．C．1993ProcNatlAcadSciUSA903167-3171)?！铩铩锒x干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答完全的細(xì)胞用于此處，“干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答完全的細(xì)胞”是指這樣一種細(xì)胞，它能對低水平(例如10單位／ml)的外源干擾素產(chǎn)生應(yīng)答，即與不存在干擾素時相比，能顯著減少(至少10倍，更優(yōu)選至少100倍，更優(yōu)選至少1000倍，最優(yōu)選至少10000倍)一種干擾素敏感的病毒的復(fù)制。病毒復(fù)制的程度可通過測量病毒的數(shù)量(例如感染性病毒、病毒抗原、病毒核酸)來測定。CCD922正常成纖維細(xì)胞是干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答完全的細(xì)胞。干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞用于此處，“干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞”一詞是指不能滿足上面列出的干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答完全的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞，也就是說，與不存在干擾素時相比，它們不能通過顯著減少一種干擾素敏感的病毒的復(fù)制來對低水平(例如10單位／ml)的外源干擾素產(chǎn)生應(yīng)答。KB口腔癌細(xì)胞是干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷的病毒?？寺　翱寺　辈《疽辉~的使用在這里定義為來源于一個單一的感染性病毒顆粒的病毒，以及單個分子克隆具有明顯的核酸序列同源性的病毒。例如，序列的同源性至少是，來自病毒群體的8個克隆的序列在300個以上的連續(xù)核苷酸上同源性大于95％，更優(yōu)選大于97％，更優(yōu)選大于99％，最優(yōu)選為100％。殺細(xì)胞性用于此處，“殺細(xì)胞性”病毒一詞指一種能感染細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞死亡的病毒。脫敏劑量用于此處，術(shù)語“脫敏劑量”指減低病毒給藥后副作用所需的病毒的數(shù)量。差別細(xì)胞毒試驗用于此處，使用一種病毒來篩選腫瘤細(xì)胞或組織的“差別細(xì)胞毒試驗”這一術(shù)語是指(a)腫瘤細(xì)胞和一種或多種對照細(xì)胞或組織的病毒感染；(b)感染1日或多日后每種樣品的細(xì)胞存活或死亡的測定(例如，如實施例1中的詳細(xì)介紹，通過使用一種細(xì)胞存活的染料指示劑)；并(c)根據(jù)結(jié)果，與對照相比，估計樣品的敏感性(例如，如實施例1中的詳細(xì)介紹，通過測定IC50)。感染贅生物用于此處，“感染贅生物”一詞是指病毒核酸進(jìn)入贅生細(xì)胞或組織。干擾素敏感性用于此處，術(shù)語“干擾素敏感性”病毒(如NDV)是指存在干擾素時與沒有干擾素時相比，復(fù)制明顯降低(至少降低100倍，優(yōu)選至少降低1000倍，更優(yōu)選至少降低10000倍)的病毒。這可通過測量在存在或不存在低水平的外源干擾素(例如10單位／ml)時從干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答完全的細(xì)胞獲得的病毒數(shù)量(例如感染性病毒、病毒抗原、病毒核酸)來測定。贅生物和贅生性疾病用于此處，“贅生物”是指組織的新生長，包括腫瘤、良性生長物(例如濕疣、乳頭瘤)和惡性生長物(例如癌癥)。用于此處，“贅生性疾病”是指表現(xiàn)為存在贅生物的疾病。復(fù)制活性用于此處，“復(fù)制活性”病毒是指一種能在贅生性細(xì)胞中產(chǎn)生感染性子代的病毒?；旧蠠o污染的卵蛋白“基本上無污染的卵蛋白”一詞是指病毒純度，其中在由一個本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行的Western印跡中檢測不到卵清蛋白，方法為(1)使用每孔1．7×109PFU病毒(寬度為3．3cm)在SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠(1mm厚)上電泳；(2)將病毒蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并(3)使用兔抗卵清蛋白[兔IgG是4mg／ml抗體濃度(獲自Cappel，Inc)的1∶200稀釋物組分或相當(dāng)?shù)亩嗫寺】贵w]對卵清蛋白進(jìn)行免疫染色。治療有效量用于此處，“治療有效量”一詞在治療贅生性疾病時是指產(chǎn)生所需效果的病毒的數(shù)量，例如抑制贅生物生長、腫瘤消退、改善的臨床狀況或存活提高。本發(fā)明的化合物不同類型的病毒被用來選擇性殺死贅生細(xì)胞。天然或遺傳工程改造的病毒可用作一種抗贅生物試劑。這些病毒Ⅰ)感染贅生細(xì)胞，從而導(dǎo)致其死亡；ⅱ)在贅生性細(xì)胞中有復(fù)制活性；(ⅲ)通過干擾素的抗病毒作用使殺傷正常細(xì)胞受到限制。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，具有上述三個特征[(Ⅰ)它們感染贅生細(xì)胞，從而導(dǎo)致贅生細(xì)胞死亡；ⅱ)它們在贅生性細(xì)胞中有復(fù)制活性；(ⅲ)它們通過干擾素的抗病毒作用使殺傷正常細(xì)胞受到限制]的病毒也能誘導(dǎo)干擾素。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，具有上述三個特征的病毒也可導(dǎo)致人的贅生物消退，和／或因為已經(jīng)存在的免疫而在靶人群中不被中和。在另一個優(yōu)選實施方案中，具有上述三個特征的病毒對腫瘤細(xì)胞具有殺細(xì)胞活性。副粘病毒(用于此處“副粘病毒”是指副粘病毒科的一個成員)可根據(jù)本發(fā)明用來治療贅生物，包括大的腫瘤或具有高腫瘤負(fù)荷的宿主。副粘病毒可包括三個屬(1)副粘病毒屬、(2)麻疹樣病毒屬(麻疹病毒屬)以及呼吸道合胞病毒屬(肺病毒屬)。這些病毒含有一個RNA基因組。使用殺細(xì)胞性的副粘病毒科的病毒，尤其是副粘病毒例如新城疫病毒(“NDV”)和其它禽類副粘病毒例如禽類副粘病毒2型，是應(yīng)用本發(fā)明的一個優(yōu)選方法。根據(jù)本發(fā)明，這些病毒的減毒株在治療贅生物時特別有用。根據(jù)本發(fā)明，NDV是尤其優(yōu)選的病毒。根據(jù)它們對雞和雞胚的作用，NDV被分為三個不同的組?！暗投拘浴倍局晔侵篙p型毒株，在最小致死劑量(MLD)時殺死雞胚需要90至150小時；“中等毒性”毒株是指中等毒力株，在MLD時殺死雞胚需要60至90小時；“高毒性”毒株是指強(qiáng)毒株，在MLD時殺死雞胚需要40至60小時。見諸如Hanson和Brandly，1995(Science，122156-157)，和Dardiri等，1961(Am．J．Vet．Res．，918-920)。所有三個組都是有用的，優(yōu)選的是NDV的中等毒性株，例如毒株MK107、毒株NJRoakin和毒株Connecticut-70726。(見實施例21-23)。見諸如Schloer和Hanson，1968(J．Virol．，240-47)中的其它中等毒性株的名單。為了特定的目的，需要獲得一種克隆病毒來保證或增加一種特定病毒株的遺傳同源性，并去除缺陷的干擾顆粒。通過克隆來去除缺陷性的干擾顆?？稍试S最后產(chǎn)物的純度提高，這可用每感染顆粒的病毒顆粒數(shù)來評估(例如每PFU的顆粒數(shù))?？寺〔《究砂凑占夹g(shù)人員可用的任何方法來制備。例如，空斑純化被常規(guī)用來獲得克隆病毒。見諸如Maassabetal．，InPlotkinandMortimer，eds．Vaccines，PhiladelphiaW．B．SaundersCo．，1994，pages78-801。三重空斑純化尤為理想，其中在純化的每一輪選擇一個具有所需特征的一個空斑，例如優(yōu)選的大小、形狀、表現(xiàn)、或親本株的代表特征。制備克隆病毒的另一個方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用的重組DNA技術(shù)。獲得一種克隆病毒的另一個方法是使用有限稀釋的技術(shù)(例如通過增加病毒樣品的稀釋來獲得在每個含有易感細(xì)胞單層培養(yǎng)的孔中平均只有一個或更少的感染性病毒顆粒)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，純化的病毒被用來治療贅生性疾病。純化卵來源的病毒的一個優(yōu)選方法如下所列(在這些方法中，病毒在任何步驟都不被沉淀)純化方法Aa)制備一種克隆病毒(例如空斑純化)b)用克隆的病毒接種卵c)溫育卵d)冷卻卵e)從卵中收獲尿囊液f)從尿囊液中去除細(xì)胞殘渣g)超離尿囊液，但不沉淀(例如使用一種不連續(xù)的蔗糖梯度)在本發(fā)明的另一個實施方案中，在去除細(xì)胞殘渣(從尿囊液中)后和超離之前，增加了額外的步驟，包括●冷凍然后融化尿囊液●從病毒懸液中去除污染物(例如通過離心的方法)在本發(fā)明的另一個實施方案中，超離通過一種連續(xù)的流式超離來完成。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種純化復(fù)制活性的RNA病毒的方法，包括以下步驟a)制備一種克隆病毒，并b)通過超離但不沉淀來純化所說的克隆病毒。本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種純化副粘病毒(例如NDV)的方法，包括通過超離但不離心來純化病毒?？蛇x地，超離之前額外的純化步驟包括a)通過空斑純化來制備一種克隆病毒，b)用克隆病毒接種卵，c)溫育卵d)冷卻卵e)從卵中收獲尿囊液，并f)從尿囊液中去除細(xì)胞殘渣。本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種從卵或細(xì)胞培養(yǎng)物中純化復(fù)制活性的克隆病毒的方法，包括超離，但不含病毒被沉淀的步驟。本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種純化副粘病毒(例如NDV)的方法，包括通過順序切向流過濾(TFF)來純化病毒?？蛇x地，病毒可另外通過凝膠滲透色譜進(jìn)行純化，其中每個步驟都在穩(wěn)定緩沖液中進(jìn)行(實施例15)a)空斑純化來制備一種克隆病毒，b)用克隆病毒接種卵，c)溫育卵d)冷卻卵e)從卵中收獲尿囊液，并用緩沖液稀釋尿囊液，f)通過TFF從尿囊液中去除細(xì)胞殘渣。g)通過TFF純化病毒，并e)通過凝膠滲透色譜純化病毒?？蛇x地，從凝膠滲透步驟獲得的病毒可用TFF進(jìn)行濃縮。本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種從卵或細(xì)胞培養(yǎng)物中純化復(fù)制活性的克隆病毒的方法，包括用順序切向流過濾(TFF)純化病毒的步驟，可選地，接著用凝膠滲透色譜純化病毒，可選地，接著用TFF濃縮病毒?？寺〔《臼褂眠@些方法可將一種克隆病毒[包括副粘病毒(如NDV)]純化到至少2×109PFU／mg蛋白，優(yōu)選至少3×109PFU／mg蛋白，更優(yōu)選至少5×109PFU／mg蛋白，更優(yōu)選至少1．0×1010PFU／mg蛋白，更優(yōu)選至少2．0×1010PFU／mg蛋白，更優(yōu)選至少3×1010PFU／mg蛋白，更優(yōu)選至少4×1010PFU／mg蛋白，更優(yōu)選至少5×1010PFU／mg蛋白，最優(yōu)選至少6×1010PFU／mg蛋白。使用這些方法可將一種克隆病毒[包括副粘病毒(如NDV)]純化到這樣的水平，其中每PFU的病毒顆粒數(shù)小于10，更優(yōu)選小于5，更優(yōu)選小于3，更優(yōu)選小于2，最優(yōu)選小于1．2(每PFU的病毒顆粒數(shù)越低，表明純度越高)。RNA病毒在另一個實施方案中，這些方法能純化(達(dá)到上面克隆病毒中所述的水平)一種RNA病毒[包括(a)一種殺細(xì)胞型RNA病毒；(b)一種單鏈RNA、非分段、非包膜病毒；(c)一種單鏈RNA、分段、包膜病毒；(d)一種雙鏈RNA、分段、非包膜病毒；(e)一種單鏈RNA、非分段、包膜病毒(例如副粘病毒(例如NDV)和例如逆轉(zhuǎn)錄病毒)。DNA病毒在另一個實施方案中，這些方法能純化(達(dá)到上面克隆病毒中所述的水平)一種干擾素敏感的殺細(xì)胞型病毒，它可選自(a)包膜、雙鏈DNA病毒(包括痘病毒)；(b)非包膜、單鏈DNA病毒；和(c)非包膜、雙鏈DNA病毒。卵來源病毒在另一個實施方案中，這些方法可將卵來源的病毒純化至基本上無污染的卵蛋白的水平。在用于人治療的病毒制備物中優(yōu)選限制卵蛋白的數(shù)量，因為主要的卵蛋白如卵清蛋白是過敏原?！铩铩镌谥委熧樕约膊“ò┌Y中有用的病毒示于表1。可根據(jù)需要篩選這些病毒的天然存在的突變體(特定的毒株或分離株)，使其產(chǎn)生相對于親本株的改變的IFN產(chǎn)生。表1用于癌癥治療的天然存在的病毒<tablesid="table1"num="001"><table>病毒類型病毒科病毒例子RNA、負(fù)鏈副粘病毒科新城疫病毒禽副粘病毒2型腮腺炎病毒人副流感病毒彈狀病毒科水皰性口炎病毒RNA、正鏈披蓋病毒科辛德畢斯病毒黃病毒科黃熱病毒(減毒)微核糖核酸病毒科鼻病毒牛腸道病毒?？刹《救彰嵝尾《究魄輦魅拘灾夤苎撞《救巳彰嵝尾《?lt;/table></tables>在本發(fā)明的另一個實施方案中，候選病毒，不管是天然存在的還是遺傳工程改建的，都被檢測了在治療贅生物中提供治療應(yīng)用的能力。在一個實施方案中，候選病毒殺死50％的干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞如KB頭和頸癌細(xì)胞所需的數(shù)量，與殺死50％的相似量的干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答完全的細(xì)胞如正常皮膚成纖維細(xì)胞所需的病毒數(shù)量，進(jìn)行了比較。殺死的數(shù)量可用任何方法包括臺盼藍(lán)排除或MTT試驗(見實施例1)進(jìn)行測量。相對于殺死干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答完全的細(xì)胞所需的數(shù)量，殺死干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞所需的病毒數(shù)量明顯減少(例如至少5倍)，這就說明待測病毒顯示了在治療贅生物中應(yīng)用所需的活性。其它NDV病毒和辛德畢斯病毒是這樣的能顯示腫瘤選擇性殺傷的天然病毒(見實施例21-23和25)。理解參與建立抗病毒狀態(tài)的因子就能設(shè)計一種篩選可能對病毒治療應(yīng)答的腫瘤的試驗?？偟膩碚f，在獲自活檢樣品的病人來源的腫瘤組織中篩選p68激酶、p58或其它參與抗病毒狀態(tài)或細(xì)胞分化的因子的表達(dá)。其它因子包括但不限于干擾素應(yīng)答因子I(IRF-1)、干擾素刺激基因因子-3(ISGF-3)、c-Myc、cMyb和IFN受體。對于c-Myc、cMyb或p58，高水平表達(dá)說明腫瘤組織或細(xì)胞是病毒療法的治療候選物。對于p68、IRF-1、ISGF-3和IFN受體，低水平表達(dá)說明腫瘤組織或細(xì)胞是病毒療法的治療候選物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，將獲自病人活檢樣品的原代腫瘤組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，并檢測其對合適的病毒治療的殺傷的敏感性。在一個實施方案中，按照上面對篩選候選病毒所介紹的方法，將殺死50％腫瘤組織培養(yǎng)物所需的病毒數(shù)量與殺死50％正常細(xì)胞培養(yǎng)物所需的數(shù)量進(jìn)行比較。腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞對病毒試劑殺傷的敏感性提高10倍或更高，就說明腫瘤細(xì)胞對病毒療法的殺細(xì)胞作用特別敏感。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步的實施方案中，靶腫瘤細(xì)胞應(yīng)答于內(nèi)源或外源提供的IFN的能力通過在存在IFN(α或β型，使用如10單位／ml，見實施例27)的情況下進(jìn)行上述篩選來測定。理解病毒粘附或進(jìn)入所需的細(xì)胞受體，可以為具有高受體表達(dá)并因而對干擾素敏感病毒的敏感性較高的腫瘤進(jìn)行另外的篩選。這是一種對可能對病毒療法應(yīng)答的病人進(jìn)行的額外水平的篩選。對于用一種干擾素敏感的病毒進(jìn)行治療來說，病人的腫瘤優(yōu)選既對干擾素有抗性，又高表達(dá)病毒的細(xì)胞受體?？偟膩碚f，病人來源的血清、腫瘤細(xì)胞、組織或組織切片通過免疫試驗或免疫染色來篩選血清或腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織表面存在的病毒受體的數(shù)量。例如辛德畢斯病毒利用高親和性的層粘連蛋白受體來感染哺乳動物細(xì)胞(Wang，etal．，1992，JVirol．，66，4992-5001)。已知這種相同的受體在多種不同類型的轉(zhuǎn)移性癌癥中高數(shù)量表達(dá)。PANC-1腎細(xì)胞系和結(jié)腸腺癌細(xì)胞系SW620已知表達(dá)高水平的高親和性層粘連蛋白受體mRNA(Campoetal．，1992，AmJPathol141107301983；Yowetal．，(1988)Proc．Natl．AcadSci85，6394-6398)，并且對辛德畢斯病毒高度敏感(實施例25)。相反，直腸腺癌細(xì)胞系SW1423已知表達(dá)非常低水平的高親和性層粘連蛋白受體mRNA(Yowetal．，(1988)Proc．NatlAcadSci，85，6394-6398)，并且比SW620細(xì)胞對PPSINDBIS的殺傷作用敏感超過4個數(shù)量級。對已經(jīng)存在的NDV或其它病毒包括RNA和DNA病毒進(jìn)行篩選或遺傳工程改造，來獲得在正常細(xì)胞中有改變的IFN應(yīng)答(例如，優(yōu)選為IFN應(yīng)答增強(qiáng))。除了誘導(dǎo)強(qiáng)IFN應(yīng)答的能力，其它病毒特征也進(jìn)行篩選或遺傳導(dǎo)入病毒中。本發(fā)明包括具有改變的受體特異性的(例如辛德畢斯病毒PPSINDBIS-Ar339，見實施例25)或低神經(jīng)毒的(例如NDV病毒PPNJROAKIN，見實施例24)病毒。本發(fā)明的病毒優(yōu)選具有直接通過細(xì)胞接觸進(jìn)行擴(kuò)散的能力。這里介紹的本發(fā)明包括廣泛種類的(見表1)能以與NDV顯示的類似方式用于治療贅生物的病毒。此外，由于存在使IFN應(yīng)答在正常細(xì)胞中失活的機(jī)制，天然不能作為使用候選的病毒可以非必要地進(jìn)行遺傳改造來克服上述限制。如果不進(jìn)行修飾，具有使干擾素應(yīng)答失活的機(jī)制的病毒將比這種機(jī)制被去掉的病毒對正常細(xì)胞有更高的毒性。本發(fā)明提供(1)一種更容易操作的載體的建立；和(2)一套治療性病毒的制備。操作包括加入IFN基因來使病毒表達(dá)一種表達(dá)IFN的轉(zhuǎn)基因或其它IFN應(yīng)答途徑的激活劑。其它改變包括遺傳表達(dá)藥物前體激活酶如皰疹病毒胸苷激酶或胞嘧啶脫氨酶(B1aeseRMetal．，1994，Eur．J．Cancer30A1190-1193)和表達(dá)合適的標(biāo)記抗原以通過免疫系統(tǒng)靶向腫瘤細(xì)胞。一種另外的改變包括遺傳工程表達(dá)受體的配體來通過這些受體靶向細(xì)胞[例如，表達(dá)其它病毒的受體來靶向其它病毒感染的細(xì)胞(見Mebastsionetal．，1997，Cell90841-847；和SchnellMJetal．，1997，Cell90849-857)]。數(shù)種新城疫病毒株被證明能選擇性殺死腫瘤細(xì)胞。在使用一種第二種中等毒性的新城疫病毒的差別細(xì)胞毒試驗中，腫瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)比正常細(xì)胞對病毒的殺傷作用敏感3個數(shù)量級(實施例21)。此外，當(dāng)?shù)谌N新城疫病毒株用于差別細(xì)胞毒試驗時，腫瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)比正常細(xì)胞對病毒的殺傷作用敏感80至5000倍。在經(jīng)腫瘤內(nèi)注射進(jìn)攜帶人腫瘤異種移植物的無胸腺小鼠后，這兩種中等毒性的新城疫病毒也都能引起腫瘤消退。(實施例23)。在獨立的實驗中，三種不同新城疫病毒株的安全性在無胸腺和免疫活性小鼠的腦內(nèi)接種后進(jìn)行了研究。該研究的結(jié)果顯示，所有三種病毒株在具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠中都能很好地耐受。腦內(nèi)接種到無胸腺小鼠的腦中顯示，一種病毒的耐受明顯優(yōu)于其它兩種(實施例24)。這些結(jié)果證明，在單一一個病毒科內(nèi)，病毒特征可以有重要的差別，并可以治療性開發(fā)使之更安全或更有效。用溶癌性病毒治療后提高其效果和降低其毒性的方法可以通過使用干擾素敏感的病毒來完成，這種病毒需要在腫瘤細(xì)胞上優(yōu)勢表達(dá)的特殊的細(xì)胞表面受體。辛德畢斯病毒提供了這種類型的限制的一個例子。辛德畢斯病毒使用高親和性的層粘連蛋白受體來感染哺乳動物細(xì)胞(Wang，etal．，1992，JVirol．，66，4992-5001)。當(dāng)在一個差別細(xì)胞毒試驗中，正常和腫瘤細(xì)胞用辛德畢斯病毒進(jìn)行感染時，具有致瘤性和表達(dá)高親和性層粘連蛋白受體的細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)比其它細(xì)胞對這種病毒的殺傷作用有更高的敏感性(實施例25)。正常的角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)高親和性的層粘連蛋白受體(Handetal．，(1985)CancerRes．，45，2713-2719)，但在此試驗中能抵抗辛德畢斯病毒的殺傷。當(dāng)VSV在存在外源干擾素的情況下被用來感染非致瘤性人WISH細(xì)胞和致瘤性HT1080或KB細(xì)胞時。水皰性口炎病毒(VSV)提供了溶癌性病毒的腫瘤選擇性殺傷的證據(jù)，即腫瘤細(xì)胞在干擾素應(yīng)答中的一種遺傳缺陷使這些細(xì)胞對干擾素敏感的復(fù)制活性病毒的殺傷作用敏感。下面是這樣一些病毒的名單，當(dāng)被修飾去除了天然存在的抗干擾素活性時，它們可用于病毒癌癥治療(見表2)。已經(jīng)將內(nèi)源的抗干擾素活性破壞或降低的修飾病毒(除了抗干擾素修飾，還優(yōu)選但不是必須減毒，見表3)對癌癥治療非常有用。此名單包括但不限于下面介紹的病毒。因為同一類型病毒之間的相似性，下面列出的每種病毒的確定機(jī)制也以相同或功能類似的機(jī)制的形式存在于該病毒類型的其它成員。括號內(nèi)是更廣泛的病毒的種類。通過任何方法包括天然存在的突變以及遺傳工程刪除或點突變而功能性喪失了抗干擾素活性的病毒如下面所列都可用于本發(fā)明的方法中。使用超過一種機(jī)制的病毒可以可選地修飾來在一個、一些或所有活性中含有突變。一些介紹的活性的突變可在普通科學(xué)通訊中獲得。比野生型病毒的生長速率慢的天然存在的或遺傳工程病毒的分離株特別優(yōu)選，因為較慢的生長速率能使一種在干擾素應(yīng)答中有活性的細(xì)胞或細(xì)胞群體在病毒復(fù)制能殺死細(xì)胞或細(xì)胞群體前建立有效的抗病毒狀態(tài)。本發(fā)明還包括使病毒抗干擾素活性失活來作為病毒特征的特異性改變，從而使一種感染細(xì)胞的干擾素應(yīng)答增強(qiáng)，但仍允許病毒在贅生性細(xì)胞中復(fù)制。表2顯示了通過遺傳工程改造去除了抗干擾素活性的已有病毒。表3列出了通過遺傳工程改造進(jìn)行了毒性減毒的病毒。表2通過遺傳工程改造去除了抗IFN活性的多種病毒<tablesid="table2"num="002"><table>病毒種類病毒科病毒抗IFN活性參考文獻(xiàn)RNA呼腸孤病毒科呼腸孤病毒σ3ImaniF和JacobsB(1988)ProcNatlAcadSciUSA857887-7891．DNA痘病毒科痘苗病毒K3LBeattieEetal．(1991)Virology183419E3LBeattieEetal．(1996)VirusGenes1289-94．B18RSymonsJAetal．(1995)Cell81551-560腺病毒科不同亞型VA1轉(zhuǎn)錄子MathewsMB和ShenkT(1991)JVirol645657-5662．甲型皰疹病毒HSV-1γ34．5基因產(chǎn)物ChouJetal．(1996)ProcNatlAcadSciUSA9210516-10520．</table></tables>表3所選病毒中的已知減毒突變<tablesid="table3"num="003"><table>病毒種類病毒科病毒減毒參考文獻(xiàn)RNA呼腸孤病毒科呼腸孤病毒σ1SpriggsDR和FieldsBN(1982)Nature29768-70．輪狀病毒牛株(WC3)C1arkHF(1988)JInfectDis158570-587DNA痘病毒科痘苗病毒痘苗生長因子BullerRMLetal(1988)Virology164∶182．胸苷激酶BullerRMLetal(1985)Nature317813-815．胸苷酸激酶HughesSJetal(1991)JBiolChem26620103-20109．DNA連接酶KerrSMeta1(1991)EMBOJ104343-4350．核糖核苷酸還原酶ChildSJetal(1990)Virology174625-629dUTP酶PerkusMEetal(1991)Virology180406-410．</table></tables>贅生物治療本發(fā)明涉及贅生物的病毒治療，特別是在有癌癥的動物中。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及最大徑向為1厘米(cm)或以上的腫瘤的治療。用于此處，“1cm腫瘤”是指至少在一個方向上腫瘤的長度是1cm。這種腫瘤比預(yù)期的對病毒療法更敏感，如果不是比大小較小的腫瘤更敏感，至少也同樣敏感。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的方面，大于1cm的腫瘤得到了治療，例如2cm或更大的腫瘤，從約2cm至5cm，以及大于5cm的腫瘤。本發(fā)明也被用于治療帶有高腫瘤負(fù)荷的宿主。用于此處，術(shù)語“腫瘤負(fù)荷”是指機(jī)體中腫瘤的總數(shù)量，以機(jī)體重量的百分比表示。帶有腫瘤負(fù)荷的宿主例如從機(jī)體總重量約1％至約2％的病毒治療令人驚奇的有效，例如產(chǎn)生腫瘤消退和總的腫瘤負(fù)荷的減少。這是尤其沒有料到的，因為一種約2％機(jī)體總重量的腫瘤負(fù)荷(例如一個60kg人的1kg腫瘤)基本上是生命能忍受的最大腫瘤質(zhì)量。見諸如Cotraneta1．，InRobbinsPathologicalBasisofDiseases，4thEdition，WBSaunders，1989，page252。在實施例中，一個小鼠宿主中體積達(dá)到397mm3的黑素瘤癌癥(例如A375)應(yīng)答于用新城疫病毒(例如三重空斑純化的病毒)的治療，顯示完全的消退。假定1000mm3的組織相當(dāng)于1克，一個具有397mm3的腫瘤占一個20克小鼠的機(jī)體總重量的約2％。如下文實施例4至9所示，用大小至少為1cm的腫瘤達(dá)到了腫瘤消退，而在不處理時，對照動物在荷載腫瘤的幾周內(nèi)開始死亡。因此，盡管將在兩周內(nèi)死亡，這樣的患病動物得到了成功的治療。因此，根據(jù)本發(fā)明，一個接近其腫瘤負(fù)荷極限的動物可以用病毒療法進(jìn)行治療。同時，本發(fā)明可用于治療對傳統(tǒng)療法如化療如氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和放射療法不應(yīng)答的病人。經(jīng)過腹膜途徑給藥后NDV治療癌癥的效果也進(jìn)行了檢測。使用卵巢癌的腹水預(yù)防模型，在攜帶ES-2人卵巢瘤的小鼠中腹膜注射NDV能產(chǎn)生比用鹽水處理的小鼠提高的存活(實施例16)。當(dāng)ES-2細(xì)胞用于一個最初用腹水形式處理一次的卵巢癌腫瘤模型時，腹水產(chǎn)量在病毒處理的動物中比在鹽水對照中明顯減少(實施例17)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，病毒給藥導(dǎo)致1)腫瘤相關(guān)的癥狀緩解例如但不限于腹水產(chǎn)生率降低、疼痛減輕以及阻塞性疾病緩解，和2)生命延長。23個病人經(jīng)靜脈途徑接受了空斑純化的NDV分離株(實施例20)。治療應(yīng)答包括可觸腫瘤的消退、在47％的病人中疾病穩(wěn)定、以及疼痛的減少。給藥和制劑在本發(fā)明的一個實施方案中，腫瘤細(xì)胞或組織在體外進(jìn)行篩選，以確定那些攜帶對病毒敏感的腫瘤的病人。從病人中取出的腫瘤細(xì)胞(通過諸如對實體瘤用細(xì)針吸取或?qū)β殉哺顾鲇么┐绦g(shù)的方法)在體外進(jìn)行生長并接種病毒。在本發(fā)明的這個實施方案中，如果病毒對其腫瘤細(xì)胞有高活性，就選擇這些病人進(jìn)行治療。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，病毒給藥的數(shù)量導(dǎo)致腫瘤或多種腫瘤的消退。用于此處，“消退”一詞是指腫瘤退縮，例如大小、質(zhì)量或體積。腫瘤大小的退縮可通過多種方法來證明，包括物理檢測、胸片或其它X-射線、超聲圖譜、CT掃描、MRI、或放射性核苷酸掃描方法。根據(jù)本發(fā)明，不同類型的贅生物包括癌癥都是可以治療的。本發(fā)明的病毒可用于治療多種癌癥、包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、膀胱癌、Wilm’s瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、黑素瘤、滑膜肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、淋巴瘤、白血病、腦癌包括成蝕質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、腎癌、頭和頸癌、胃癌、食管癌、陰道癌、內(nèi)瘤、皮膚癌、甲狀腺胰腺癌和間皮瘤。本發(fā)明的病毒也可用于治療多種良性腫瘤，包括但不限于濕疣、乳頭瘤、腦膜瘤和腺瘤。將治療有效量的病毒給予一個帶有贅生物的宿主。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，病毒給藥的劑量依賴于所選的病毒、贅生物的類型、贅生細(xì)胞生長或惡變的程度、贅生物的生物位置或在機(jī)體中的位置、病毒的株、給藥途徑、給藥方案、給藥模式、與任何其它將給予哺乳動物的藥物或治療例如放射、化療、外科手術(shù)治療的一致性而各不相同。這些參數(shù)通過在動物模型中確定最大耐受劑量進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)相對的機(jī)體表面積或機(jī)體質(zhì)量換算成人劑量。還應(yīng)當(dāng)理解，在特定場合，可以給予超過一個劑量的病毒。這種多劑量病毒之間的最佳間隔可以憑經(jīng)驗并在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)確定。NDV的通常給藥量在約3×106至約5×1012PFU病毒之間。對于局部給藥(例如直接注射進(jìn)腫瘤)，通常使用總量為3×106至5×1010PFU的病毒。對于系統(tǒng)給藥，使用約1×108至4×1011PFU每平方米機(jī)體表面積的病毒。對于靜脈給藥，使用每周一次、每周兩次和每周三次的給藥計劃。根據(jù)本發(fā)明，一種病毒，可以可選地與化療試劑一起，通過各種途徑進(jìn)行給藥，例如腸道、腸道外、口、鼻、直腸、鞘內(nèi)、靜脈(例如使用導(dǎo)管)、皮下、腫瘤內(nèi)(例如直接注射進(jìn)其組織或注射進(jìn)擴(kuò)散到其中的血管中)、腫瘤外周、局部地、舌下、頰、表面、肌肉內(nèi)、通過吸入、經(jīng)皮、陰道、動脈內(nèi)、顱內(nèi)、皮內(nèi)、硬膜外、系統(tǒng)地、表面、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)等等。對于肺腫瘤，可以使用支氣管途徑(例如支氣管給藥)。在合適時也可以使用內(nèi)窺鏡對胃腸道腫瘤進(jìn)行注射以及對直腸腫瘤進(jìn)行栓劑治療。用NDV進(jìn)行的小鼠毒性研究表明，靜脈病毒給藥后的急性毒性作用可能是由細(xì)胞因子介導(dǎo)的反應(yīng)引起的。在初始的誘導(dǎo)事件后，針對重復(fù)刺激的細(xì)胞因子應(yīng)答已知能脫敏或下調(diào)(Takahashietal．，(1991)CancerRes．51，2366-2372)。用脫敏劑量的病毒經(jīng)靜脈注射的小鼠在第二次給藥時能夠比在第一次注射只接受載劑注射的小鼠耐受多大約10倍的病毒(實施例18)。病毒經(jīng)靜脈途徑給藥的速率能明顯影響其毒性。兩組無胸腺小鼠用相同劑量的NDV進(jìn)行處理，其中一組給藥慢(4分鐘給藥0．2ml)，一組給藥快(30秒內(nèi)給藥0．2ml)。比較每組的最大體重喪失表明，在接受慢注射的組中比快注射組中的體重喪失少50％。(實施例19)。在一個臨床分組試驗中，病人在一周內(nèi)接受三次空斑純化的NDV分離物注射(實施例20)。在這些條件下，一次初始劑量的脫敏作用減輕了與第二次和第三次劑量相關(guān)的毒性。這些數(shù)據(jù)與用動物研究獲得的數(shù)據(jù)一起示于實施例18。一個與在癌癥治療中使用溶癌病毒相關(guān)的考慮是在治療過程中體液免疫應(yīng)答可能產(chǎn)生潛在的抑制作用。在臨床研究中，顯示穩(wěn)定病情一個月后的病人適合進(jìn)行第二個治療過程，后者接著在存在針對NDV的中和抗體的情況下給藥。但是，在第二個劑量過程后的第7天仍能在病人的尿中發(fā)現(xiàn)感染性的病毒，這證明高劑量的病毒給藥能克服中和性抗體的影響，并在病人體內(nèi)建立感染。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在后續(xù)高劑量給藥之前給予一次脫敏劑量。為進(jìn)行脫敏，使用1×108至2．4×1010PFU／m2的病毒劑量。脫敏后，另外使用3×108至4×1012PFU／m2的病毒劑量。劑量之間的時間間隔，包括脫敏劑量和下一個劑量的時間間隔，為1至14天，優(yōu)選為1至7天。脫敏劑量可通過各種途徑進(jìn)行給藥，例如靜脈、腸道、腸道外、口、鼻、直腸、鞘內(nèi)、靜脈、皮下、腫瘤內(nèi)、腫瘤外周、局部、舌下、頰、表面、肌肉內(nèi)、通過吸入、經(jīng)皮、陰道、動脈內(nèi)、顱內(nèi)、皮內(nèi)、硬膜、系統(tǒng)性地、表面、腹膜、胸膜、內(nèi)鏡、支氣管內(nèi)等。隨后的劑量可用與脫敏劑量相同的途徑進(jìn)行給藥或通過其它途徑，例如靜脈內(nèi)、腸道、腸道外、口、鼻、直腸、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)、腫瘤外周、局部、舌下、頰、表面、肌肉內(nèi)、通過吸入、經(jīng)皮、陰道、動脈內(nèi)、顱內(nèi)、皮內(nèi)、硬膜、系統(tǒng)性地、表面、腹膜、胸膜、內(nèi)鏡、支氣管內(nèi)等?？蛇x地，可以以順序或同時進(jìn)行的方式使用一種以上的給藥途徑。同時或順序給藥的途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、腸道、腸道外、口、鼻、直腸、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)、腫瘤外周、局部、舌下、頰、表面、肌肉內(nèi)、通過吸入、經(jīng)皮、陰道、動脈內(nèi)、顱內(nèi)、皮內(nèi)、硬膜、系統(tǒng)性地、表面、腹膜、胸膜、內(nèi)鏡、支氣管內(nèi)等。一個例子可以是一個經(jīng)靜脈給藥的脫敏劑量接著一個腹膜劑量。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，病毒通過緩慢擴(kuò)散進(jìn)行給藥，包括使用靜脈泵或在4分鐘至24小時的時間內(nèi)緩慢注射。病毒以及可選的一種或更多的化療試劑，可以通過單次注射、通過多次注射或連續(xù)地注射進(jìn)行給藥。病毒可以在化療試劑(包括但不限于白消安、環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、阿糖胞苷、博來霉素、順鉑、阿霉素、美法侖、樂疾靈、硫酸長春堿、5-氟尿嘧啶、紫杉酚和視黃酸)給藥之前、同時或之后進(jìn)行給藥。根據(jù)本發(fā)明，病毒療法可以可選地與其它療法包括外科手術(shù)、放射、化療(見諸如CurrentMedicalDiagnosisandTreatment，Ed．Tierneyetal．，Appleton＆Lange，1997，特別是78-94頁)和生物療法組合使用。病毒可以在生物試劑例如(1)其它溶癌試劑[例如但不限于其中一個基因在一個前列腺細(xì)胞特異性應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄控制之下的腺病毒(見Rodriques，R．etal．，1997，CancerRes，572559-2563)；不能編碼能結(jié)合p53的E1b多肽的腺病毒(見Bischoff，J．R．etal．，1996，Science274373-376)；不能表達(dá)一種功能性γ34．5基因產(chǎn)物的單純皰疹病毒(見Mineta，T．etal．，1995，NatureMedicine，1938-943)]；(2)細(xì)胞因子(例如但不限于集落刺激因子如GM-CSF、腫瘤壞死因子和白介素如IL-1、IL-2、IL-6和IL-10)；(3)病毒載體[例如但不限于編碼p53的腺病毒(見Zhang，WWetal，1994，CancerGeneTherapy，1∶5-13)]；以及(4)癌癥疫苗的給藥之前、同時、或之后進(jìn)行給藥。在本發(fā)明的一個實施方案中，療法包括用抗原性不同的病毒進(jìn)行系列治療，這些病毒是細(xì)胞毒性和通過IFN機(jī)制而腫瘤選擇性的。該實施方案可允許病毒療法持續(xù)一個較長時期而不受免疫干擾。另一個實施方案涉及在NDV(或其它病毒)給藥之前、同時或之后，用IFN(例如IFNα、IFNβ或IFNγ)處理病人。IFN選自Ⅰ型(α、β、ω)和Ⅱ型(γ)以及其重組物和類似物，如諸如Sreevalsoun，T．，1995(《癌癥生物治療》第2版，編者V．T．DeVita，Jr．，S．Hellman，andS．A．Rosenberg，J．B．LippincottCompany，Philadelphia，pp347-364)中所討論的。正常細(xì)胞對IFN預(yù)處理應(yīng)答，對病毒感染的IFN應(yīng)答的增強(qiáng)使這些細(xì)胞具有更高的安全性。在IFN信號途徑中有缺陷的腫瘤細(xì)胞保留了對病毒殺傷作用的敏感性。這將允許使用更高劑量的病毒療法。IFN根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的臨床指南進(jìn)行給藥，其中劑量和方式已知對治療病毒感染有效。在本發(fā)明的另一個實施方案中，已知能影響IFN應(yīng)答途徑的其它藥物也可選擇性地用來增加腫瘤細(xì)胞的敏感性，或增加正常細(xì)胞對病毒感染的殺細(xì)胞作用的抗性。這類藥物包括但不限于酪氨酸激酶抑制劑、西咪替丁和線粒體抑制劑。缺氧和體溫過高已知也能調(diào)節(jié)干擾素應(yīng)答。在本發(fā)明的另一個實施方案中，免疫抑制劑如環(huán)孢菌素A、硫唑嘌呤和leflunomide、各種皮質(zhì)甾類制備物、和抗CD40配體抗體(Foy，T．M．，etal．，1993，J．Exp．Med．1781567-1575)與病毒一起給藥。此外，免疫刺激劑如脂肽也可與病毒一起給藥。一種獨立的機(jī)制是應(yīng)答于病毒感染而產(chǎn)生的干擾素的數(shù)量可通過使用核苷(Machida，H．，1979．Microbiol．Immunol．23643-650)、核苷前體或能提高細(xì)胞中一種或多種核苷濃度的藥物來提高，這也可以可選地用作病毒療法的一種輔助。某些嘌呤核苷類似物如2-氯脫氧腺嘌呤和2’-去氧助間型霉素能在體內(nèi)減少干擾素的產(chǎn)生。這種化合物可用來進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞對干擾素敏感性的差別，并且可以可選地用作病毒療法的一種輔助。在一個方面，有效量的病毒可被分成較小劑量單位，并在同一時間注射進(jìn)同一腫瘤的不同位置。對于連續(xù)給藥，所需的試劑可通過植入的微型泵進(jìn)行給藥，或?qū)⑵浣B進(jìn)入所需的聚合物，然后植入所需的位置(例如直接進(jìn)入腫瘤)來延緩或延遲釋放。本發(fā)明的病毒被配制成藥物制備物的形式，即通過將其與至少一種賦形劑或輔助劑以及在需要時與一種或多種其他活性化合物一起組成一種合適的藥劑形式。這種制備物可作人用和獸用。合適的賦形劑包括諸如適合于腸道或腸道外給藥的有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)如水、鹽水、組織培養(yǎng)基、緩沖液、賴氨酸、檸檬酸、甘油三乙酸和其他脂肪酸甘油、明膠、大豆卵磷脂、碳水化合物如甘露糖、蔗糖、乳糖或淀粉、硬脂酸鎂、滑石、纖維素或蛋白載劑、或一種上述化合物的組合物如甘露糖／賴氨酸或甘露糖／賴氨酸／蔗糖。制備物為無菌的，并含有添加劑如防腐劑或穩(wěn)定劑。為進(jìn)行腸道外給藥，如系統(tǒng)性或局部注射，病毒制備物可配制成諸如含水懸液或乳劑。本發(fā)明還涉及一種在哺乳動物中治療疾病的方法，其中疾病細(xì)胞在干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答中有缺陷，該方法包括將治療有效量的干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒給予哺乳動物。例如，用多種病毒如乙肝病毒感染的、不能進(jìn)行干擾素應(yīng)答的細(xì)胞對本發(fā)明的病毒易感。有證據(jù)表明人免疫缺陷型病毒(HIV)能使干擾素應(yīng)答失活。本發(fā)明的干擾素敏感病毒可用于治療慢性病毒感染如由乙肝病毒、丙肝病毒、HIV、Epstein-Barr病毒、人乳頭瘤病毒和皰疹病毒引起的疾病。在這里，除非另外說明，本發(fā)明的病毒療法的細(xì)節(jié)和條件與美國申請系列號08／260，536一致，后一公開在此全文引入作為參考。所有上面引用的申請、專利和發(fā)表物以及其圖表均在此引入作為參考。★★★下面的實施例是說明性的而不是對本發(fā)明的方法和組合物進(jìn)行限制。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說非常明顯，對臨床治療中通常遇到的各種條件和參數(shù)進(jìn)行的其他適當(dāng)修改和適用都包含在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。實施例1PPMK107(NDV毒株MK107的三重空斑純化分離物)相對于正常人細(xì)胞對多種人癌細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒活性人腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在24孔組織培養(yǎng)皿中生長至約80％連匯。移去生長培養(yǎng)基，加入PPMK107的10倍梯度稀釋物，范圍為106空斑形成單位(PFU)／孔至10-1PFU／孔。每個皿中都包括沒有加入病毒的對照孔。病毒在一個旋轉(zhuǎn)平臺上在37℃吸收90分鐘。在溫育期結(jié)束時，移去病毒稀釋物，代之以1ml生長培養(yǎng)基。然后將皿在37℃在5％CO2中溫育5天，然后定量評估細(xì)胞致病變效應(yīng)(CPEO的數(shù)量。細(xì)胞毒通過使用MTT(2-[4、5-二甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(CellTiter96，catalog#G4000，ProgemaCorporation，MadisonWI53711)進(jìn)行測量，MTT比色法在570nm處進(jìn)行監(jiān)測，能監(jiān)測線粒體酶的活性(MosmanT．，1983，J．Immunol．Methods6555)。病毒處理的孔中的存活以未處理對照孔的百分?jǐn)?shù)來表示。數(shù)據(jù)用PFU／孔對以對照的百分?jǐn)?shù)形式表示的存活性來作圖。IC50通過能產(chǎn)生50％活細(xì)胞數(shù)量減少的PFU／孔的病毒數(shù)量來計算。結(jié)果示于表4、5和6。PPMMK107對多種人癌細(xì)胞具有高度細(xì)胞毒活性，39個惡性細(xì)胞系中有30個的IC50值小于1O00，而與此相對，正常人細(xì)胞類型不敏感。大多數(shù)人癌細(xì)胞具有的IC50比多數(shù)正常人細(xì)胞類型要低2至3個數(shù)量級。表4．細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述表5．使用正常人細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述表6．使用快速增殖的正常細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述實施例2將PPMK107用于在無胸腺小鼠中進(jìn)行人腫瘤異種移植物(＜10mm并且＞5mm)的腫瘤內(nèi)治療無胸腺小鼠用1千萬人腫瘤細(xì)胞進(jìn)行皮內(nèi)注射。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到5至10mm的范圍時，給予單一劑量的PPMK107(劑量為3x108PFU)或鹽水。在用PPMK107處理的小鼠中幾乎所有的腫瘤類型都顯示完全或50％至100％的部分消退率(見表7)。一個例外是使用U87MG的實驗(實驗I)雖然在用PPMK107處理的9個腫瘤中只有一個完全消退，另兩個病毒處理的腫瘤顯示32％和20％的消退，另兩個病毒處理的腫瘤顯示比所有8個用鹽水對照處理的腫瘤生長慢。在鹽水對照處理的腫瘤中基本上沒有腫瘤消退在所有這些實驗中(表7中列出的A至I)，73個對照腫瘤只有一個顯示消退。這些結(jié)果表明，不同的腫瘤類型顯示對PPMK107的腫瘤內(nèi)治療產(chǎn)生應(yīng)答。為檢測病毒在腫瘤中的復(fù)制，使用皮下HT1080纖維肉瘤模型對病毒抗原進(jìn)行免疫組化染色(使用針對NDV的P蛋白的單克隆抗體)。在腫瘤內(nèi)注射3x108PFU的PPMK107后的30分鐘內(nèi)，腫瘤組織中的病毒抗原為陰性。但在處理2天后，在腫瘤中可觀察到大量的病毒抗原的免疫染色，這說明病毒在腫瘤中復(fù)制。重要的是，病毒特異性地在腫瘤組織中復(fù)制，因為相鄰的結(jié)締組織和皮膚的病毒抗原為陰性。實施例3將PPMK107用于在無胸腺小鼠中進(jìn)行人腫瘤異種移植物(＜8．5mm并且＞5．5mm)的靜脈治療無胸腺小鼠用1千萬人HT1080纖維肉瘤細(xì)胞進(jìn)行皮內(nèi)注射。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到5至8mm時，靜脈注射PPMK107或鹽水。如表8所示，在最高病毒劑量水平(1×109PFU)時，在所有7只小鼠中都觀察到腫瘤的完全消退。單次注射3×108和6×107產(chǎn)生超過90％的消退率。而單次IV注射3×108僅產(chǎn)生55％的腫瘤消退，在此劑量水平的三次IV注射產(chǎn)生100％的應(yīng)答率。用IV鹽水處理的小鼠沒有顯示腫瘤消退的證據(jù)。這些結(jié)果表明，皮下的HT1080腫瘤對PPMK107的IV處理應(yīng)答強(qiáng)烈。實施例4在無胸腺小鼠中用PPMK107經(jīng)腫瘤內(nèi)治療大型A375黑素瘤異種移植物的首次實驗無胸腺小鼠用1千萬A375人黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行皮內(nèi)注射。10天后，不同大小的腫瘤用單次PPMK107(劑量為3×108、9×108和1．5×109PFU)或鹽水注射進(jìn)行處理。就那些最大徑向為10至11mm的腫瘤來說，應(yīng)答于這些劑量的PPMK107處理，所有9個腫瘤都完全消退，而就那些最大徑向為8至9．5mm的腫瘤來說，應(yīng)答于病毒治療，24個腫瘤中有12個完全消退(P＜0．008，表9，部分A)。在用鹽水處理的任何小鼠中都沒有觀察到腫瘤消退。將這些相同的腫瘤按腫瘤體積分類也表明，在較大腫瘤體積的腫瘤中，完全消退的百分?jǐn)?shù)高。應(yīng)答于這些劑量的PPMK107，在體積＞300mm3(范圍為304-397mm3)的17個腫瘤中有14個發(fā)生了完全消退，而在＜300mm3(范圍為144至295；p＜0．023；表9，部分B)的16個腫瘤中有7個完全消退。這些結(jié)果表明，腫瘤至少在長度為1cm或體積為300mm3時用PPMK107腫瘤內(nèi)治療至少與較小腫瘤同樣敏感或更敏感。實施例5在無胸腺小鼠中用PPMK107經(jīng)腫瘤內(nèi)治療大型A375黑素瘤異種移植物的第二次實驗如實施例14中，腫瘤在腫瘤細(xì)胞接種10天后建立。治療包括不同劑量的PPMK107(3×106PFU、3×103PFU、3×108PFU和1．5×109PFU)或鹽水。就最大徑向為10至11．5mm的腫瘤來說，在用這些劑量的PPMK107處理的所有28個腫瘤中產(chǎn)生了完全或部分(至少50％)的消退，與此相對，在任何鹽水處理的小鼠中沒有發(fā)生消退(表10，部分A)。當(dāng)這些相同的腫瘤按腫瘤體積進(jìn)行分類時，所有26個大于300mm3(范圍為309-525mm3)的腫瘤應(yīng)答于PPMK107都完全或部分消退(至少50％)，與此相對，用鹽水處理的小鼠都沒有發(fā)生消退(表10，部分B)。這些結(jié)果證明，長度至少為1cm或體積至少為300mm3的腫瘤對PPMK107腫瘤內(nèi)治療敏感。實施例6在無胸腺小鼠中用PPMK107經(jīng)腫瘤內(nèi)治療大型A375黑素瘤異種移植物的第三次實驗如實施例4，腫瘤在腫瘤細(xì)胞接種19天后建立。腫瘤內(nèi)治療包括不同劑量的PPMK107(3×108、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102PFU)或鹽水。就最大徑向為12．5至14mm的腫瘤(體積范圍632至787mm3；平均體積為698mm3)來說，3只用3x108PFU處理的小鼠中有2只產(chǎn)生了至少50％的消退，與此相對，在用鹽水處理的小鼠中沒有發(fā)生消退(表11)。在使用相同劑量的PPMK107(3×108PFU)處理最大徑向為10至12mm的腫瘤(體積范圍320至600mm3；平均體積411mm3)的腫瘤時，8只小鼠有7只顯示至少25％的消退(p＜0．001，至少25％消退，與不顯示消退的用鹽水處理的小鼠比較，表11)。在腫瘤長度為10至12mm的小鼠中，在用3×106PFU、3×105PFU、3×104PFU、3×103PFU處理時也觀察到至少25％的消退，但用3×102PFU或鹽水處理卻沒有觀察到(表11)。這些結(jié)果證明，長度至少為1cm或體積至少為300mm3的腫瘤對PPMK107腫瘤內(nèi)治療敏感。實施例7在無胸腺小鼠中用PPMK107經(jīng)腫瘤內(nèi)治療大型A375黑素瘤異種移植物的第四次實驗最大徑向為10至12mm的腫瘤按實施例4在腫瘤細(xì)胞接種后13天建立。腫瘤內(nèi)治療包括單次注射3×108PFU的PPMK107或鹽水。用PPMK107處理的這些腫瘤的體積范圍為295至600mm3(平均腫瘤體積為437mm3)。每個處理組中的小鼠組在第0、2、3、4、7和14天處死，分析腫瘤的組織學(xué)。就那些至少觀察了4天的小鼠來說，12只用PPMK107處理的小鼠有11只顯示至少25％的消退，而與此相對，鹽水組中8只沒有一只顯示(P＜0．0001，表12)消退。在PPMK107處理2天后，已經(jīng)有兩個腫瘤顯示消退的跡象，但程度少于25％。實施例8在無胸腺小鼠中用PPMK107經(jīng)腫瘤內(nèi)治療大型A375黑素瘤異種移植物的第五次實驗最大徑向為10至12mm的腫瘤按實施例4在腫瘤細(xì)胞接種后20天建立。腫瘤內(nèi)治療包括單次注射3×108PFU的PPMK107或鹽水。用PPMK107處理的這些腫瘤的體積范圍為361至756mm3(平均腫瘤體積為551mm3)。10只用PPMK107處理的小鼠有9只顯示至少25％的消退，而與此相對，10只鹽水組中沒有一只顯示消退(P＜0．0001，表13)。實施例9使用PPMK107經(jīng)靜脈治療大型HT1080纖維肉瘤異種移植物的第一次實驗無胸腺小鼠用1千萬HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞進(jìn)行皮下注射。6天后，腫瘤用單次PPMK107(劑量為1．5×109PFU)或鹽水注射進(jìn)行處理。就那些最大徑向為10至11mm的腫瘤來說，應(yīng)答于一個劑量的PPMK107靜脈內(nèi)注射，6個腫瘤中有5個完全或部分消退，而與此相對，鹽水處理的腫瘤沒有一個消退(表14，P＜0．025)。這些結(jié)果證明，長度至少為1cm的腫瘤對PPMK107的靜脈治療敏感。表14實施例10從正常細(xì)胞但不從腫瘤細(xì)胞中特異性清除PPMK107感染為檢測NDV毒株P(guān)PMK107的腫瘤特異性殺傷的機(jī)制，根據(jù)下面的標(biāo)準(zhǔn)選擇代表性的腫瘤細(xì)胞a)能夠形成腫瘤，如在無胸腺小鼠中形成異種移植物；b)在給予PPMK107后，腫瘤異種移植物在體內(nèi)被特異性地殺傷；c)腫瘤細(xì)胞在體外顯示能被PPMK107殺傷，其殺傷的病毒濃度比殺傷有抗性的正常細(xì)胞的濃度低幾個數(shù)量級；并且d)在混合培養(yǎng)時，腫瘤細(xì)胞必須容易與正常細(xì)胞區(qū)別。異源移植腫瘤包括KB頭和頸癌細(xì)胞在應(yīng)答于單獨的PPMK107腫瘤內(nèi)注射時，能顯示83％的完全或部分消退，并且其在體外被PPMK107殺傷要比正常的原代成纖維細(xì)胞(CCD922-sk)敏感4個數(shù)量級，并且在混合培養(yǎng)時能容易地與CCD922-sk細(xì)胞區(qū)別。因此，KB和CCD922-sk細(xì)胞的共培養(yǎng)物用0．0005的感染復(fù)數(shù)(m．o．i．，每個細(xì)胞加入的病毒比例)進(jìn)行感染，感染持續(xù)5天，然后對病毒抗原(NDVP蛋白)進(jìn)行免疫組化染色。正常細(xì)胞的感染在第2天達(dá)到高峰，用單層細(xì)胞的光學(xué)檢查測定出很少或沒有明顯的細(xì)胞死亡。在感染后的第3天，正常細(xì)胞中的病毒表達(dá)數(shù)量明顯減少，而腫瘤細(xì)胞的感染仍非常明顯。正常細(xì)胞中的病毒抗原的數(shù)量在第4天和第5天基本上消失，而在腫瘤細(xì)胞中的感染通過腫瘤細(xì)胞群體迅速增加，導(dǎo)致共培養(yǎng)物中的腫瘤細(xì)胞大多數(shù)被破壞。因此，正常細(xì)胞能被感染并且能容易地清除感染，其方式與IFN的抗病毒作用一致。盡管存在正常細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的生理效應(yīng)濃度的IFN，但腫瘤細(xì)胞不能應(yīng)答而建立抗病毒狀態(tài)，并被不受影響的病毒生長殺死。實施例11證明干擾素是在正常CCD922-sk細(xì)胞中清除病毒的重要組分對干擾素介導(dǎo)CCD922-sk細(xì)胞清除PPMK107感染的能力這一假說進(jìn)行了檢驗。將針對人干擾素α或人干擾素β的多克隆中和抗體單獨或組合，每天加入到以0．0005的感染復(fù)數(shù)用PPMK107感染的CCD922-sk細(xì)胞的培養(yǎng)物中，感染持續(xù)3天。細(xì)胞中存在的病毒抗原的數(shù)量隨中和抗體的濃度增高而增加，其中抗干擾素β抗體的作用比抗干擾素α抗體明顯，這與成纖維細(xì)胞主要產(chǎn)生β型干擾素的報道相一致。加入針對干擾素的中和抗體能使正常的非敏感細(xì)胞對PPMK107感染更易感支持了這樣一種假說，即正常和腫瘤細(xì)胞被PPMK107殺傷的敏感性之間的關(guān)鍵差異在于正常細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞能建立干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答。實施例12證明干擾素β是其他正常細(xì)胞清除病毒的重要組分在本實驗中，確定了已知對PPMK107的殺傷作用有很高抗性的另一種正常細(xì)胞(NHEK，正常人上皮細(xì)胞)能通過向感染細(xì)胞的培養(yǎng)物加入如多克隆的抗干擾素β抗體變得更加敏感。NHEK(正常人上皮角質(zhì)細(xì)胞)以0．0005或0．05的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染，并每天加入抗體，持續(xù)5天。在低感染復(fù)數(shù)(0．0005)的感染培養(yǎng)物中，在感染后5天中抗體依賴的病毒抗原表達(dá)增加非常明顯，但在實驗的早期不那么明顯。在以0．05的感染復(fù)數(shù)的PPMK107感染的培養(yǎng)物中加入抗體能導(dǎo)致病毒抗原在感染后第4和第5天明顯增加。在感染后第2和第3天，加入中和性抗體產(chǎn)生病毒抗原的較少積累(圖1)。來自高感染復(fù)數(shù)樣品的培養(yǎng)上清也通過在人HT1080纖維肉瘤腫瘤細(xì)胞上進(jìn)行空斑實驗滴定了存在的感染性病毒的數(shù)量這是本實驗室的一種標(biāo)準(zhǔn)實驗系統(tǒng)。該分析的結(jié)果證明，在感染后第5天，在抗體處理的培養(yǎng)物中，相對于模擬處理的對照，感染性病毒的數(shù)量提高了19倍(圖1)。這些結(jié)果說明，正常細(xì)胞不被PPMK107殺傷的一般保護(hù)機(jī)制是通過一種干擾素相關(guān)的機(jī)制。實施例13干擾素β對PPMK107在腫瘤和正常細(xì)胞中感染的影響的比較對外源加入的干擾素β對正常細(xì)胞(CCD922-sk)和對PPMK107高度敏感(KB)或中等敏感(HEp2)的腫瘤細(xì)胞的影響進(jìn)行了比較。三種細(xì)胞的獨立培養(yǎng)物在以0．0005的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染的1天前和2天后，用20、200或2000單位／ml的干擾素β進(jìn)行處理。在感染后第3天，正常細(xì)胞中存在的低水平的病毒抗原表達(dá)在使用所有劑量的干擾素時都被消除。相反，在高度敏感的KB腫瘤細(xì)胞中加入濃度為2或200單位／ml的干擾素能將病毒抗原表達(dá)的相對水平降低2倍，在1000單位／ml的干擾素時完全抑制。中等敏感的HEp2細(xì)胞在所有使用的干擾素劑量時能應(yīng)答于外源干擾素清除病毒抗原的表達(dá)(圖2)。KB和CCD922-sk細(xì)胞對外源加入的干擾素β的抗病毒作用的敏感性的圖譜與這些細(xì)胞被PPMK107殺傷的敏感性成反比。HEp-2細(xì)胞應(yīng)答于干擾素作用的能力表明，這些細(xì)胞能有效地利用本實驗中所用的干擾素濃度。類似地，KB細(xì)胞對高劑量的干擾素應(yīng)答說明，不能建立干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答不是由于干擾素途徑中的絕對缺陷造成的，而僅是相對于正常細(xì)胞來說不敏感。實施例14低濃度的干擾素β對PPMK107感染正常和腫瘤細(xì)胞的影響在本實驗中正常細(xì)胞(CCD922-sk)和腫瘤細(xì)胞(KB)在用PPMK107以0．05的感染復(fù)數(shù)感染的前1天和感染后的第2天用低濃度的干擾素B(0．2、2和20單位／ml)處理。在這些條件下，正常細(xì)胞顯示劑量依賴的病毒抗原數(shù)量的減少，而在腫瘤細(xì)胞中相應(yīng)水平的病毒抗原不受外源干擾素加入的影響(圖3)。實施例15PPMK107的純化方法APPMK107通過三重空斑純化從中等毒性的新城疫病毒毒株Mass-MK107中獲得。將大約1000PFU(空斑形成單位)活的PPMK107接種到每只10日齡的受精雞蛋的尿囊腔內(nèi)。在36℃溫育46小時，將雞蛋冷卻，然后收集尿囊液。在1750xg離心30分鐘除去細(xì)胞和細(xì)胞殘渣。然后將澄清的尿囊液(含有病毒的上清)鋪于20％／55％的不連續(xù)蔗糖梯度，在約100，000xg離心30分鐘。從20％／55％界面收獲純化病毒，并對鹽水進(jìn)行透析以除去蔗糖。方法B在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，澄清的尿囊液在-70℃冷凍。融化后，將液體維持在1℃至4℃過夜，然后通過離心(1750xg離心30分鐘)從病毒懸液中除去污染物質(zhì)。此物質(zhì)用不連續(xù)蔗糖梯度按上述方法超離進(jìn)行進(jìn)一步的加工。方法C在另一個優(yōu)選實施方案中，在不連續(xù)的蔗糖梯度上超離通過連續(xù)的流式超離的方法來完成。方法D在另一個優(yōu)選實施方案中，收集的尿囊液用含有5％甘露糖和1．0％的L-賴氨酸、pH8．0的緩沖液(ML緩沖液)稀釋，并澄清，使用標(biāo)示孔徑為0．45u的濾膜用切向流過濾(TFF)置換ML緩沖液。收集含有ML緩沖液中的澄清病毒的滲透物，并在ML緩沖液中使用標(biāo)示截止大小為300，000道爾頓的濾膜通過TFF純化病毒。收集在此步驟中以存留物形式存在的ML緩沖液中的濃縮、純化病毒，并在上樣于用ML緩沖液平衡的SephacrylS500(Pharmacia)凝膠滲透柱之前再次用ML緩沖液稀釋。收集含有純化的病毒的級份，混合，并可在ML緩沖液中使用標(biāo)示截止大小為300，000道爾頓的濾膜通過TFF進(jìn)行再次濃縮。結(jié)果*克隆病毒通過空斑純化制備PPMK107后，在病毒群體中發(fā)現(xiàn)有8個單獨的分子克隆具有在NDV的融合蛋白基因中的超過300個連續(xù)核苷酸上有相同的序列(例如同源性為100％)。PPMK107是一種具有高度遺傳均一性的克隆病毒。*PFU／mg蛋白一種測定純度的定量方法是通過測定PFU／mg蛋白。較高的值表示高水平的純度。使用方法A可以獲得至少4．8x1010的PFU／mg值(見表15)。使用方法C可以獲得至少2．0×1010的PFU／mg值。對于一種NDV的中等毒性株，還沒有見到這種純度測量的文獻(xiàn)中的值。NDV的一種中等毒性株的最好估計是病毒制備物(NDVMassMK107，lotRU2，按FaabergKS和Peeples，ME，1988，JVirol62586；Bratt，MA和Rubin，H．1967，Virology33598-608的介紹制備)。該RU2lot被發(fā)現(xiàn)具有1．3x109PFU／mg的蛋白。用方法A獲得的純度值比Peeples方法所獲得的要好大約40倍(見表15)。*顆粒／PFU比另一種測量純度的定量方法是通過測定顆粒／PFU比。較低值表明高水平的純度。顆粒計算可用標(biāo)準(zhǔn)方法用電子顯微鏡來進(jìn)行。不管使用方法A或方法B，都可以達(dá)到接近1的顆粒／PFU值(表15)。表15．病毒純度<tablesid="table5"num="010"><table>病毒制備方法病毒編號PFU／毫克蛋白顆粒／PFU優(yōu)選方法APPMK107L24．8×10100．80L4L5L6L76．9×10106．6×10107．7×10106．1×1010NTaNT0．55NT優(yōu)選方法BPPMK107D004D005D0102．0×10104．5×10104．4×10100．320．52優(yōu)選方法CPPMK107RD2RD35．6×10105．0×1010NTNTaNT未檢測</table></tables>使用方法A和C制備的病毒可允許NDV純化到基本上不含污染的卵蛋白的水平。對于使用方法A制備的PPMK107lot7制備物，在Western印跡中沒有檢測到卵清蛋白，Western印跡使用(1)每孔使用1．7×109PFU純化病毒(寬度為3．3cm)在SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠(1mm厚)上電泳；(2)硝酸纖維素膜用于轉(zhuǎn)移，以及(3)兔抗卵清蛋白(Cappel的兔IgG級份，4mg／ml抗體濃度的1∶200稀釋物)。對于使用方法D制備、并用SDS-PAGE接著用銀染進(jìn)行分析的PPMK107制備物，沒有觀察到相當(dāng)于卵清蛋白的帶。實施例16使用PPMK107來在無胸腺小鼠中防止因ES-2卵巢癌腹水而死亡在本實驗中，所有的無胸腺小鼠(雌性，NCRnu／nu，8周齡)都給予一次106的ES-2細(xì)胞的腹膜內(nèi)注射。7天后，在腹水形成之前，將它們用鹽水或PPMK107(1×109PFU)經(jīng)腹膜內(nèi)處理。如圖4所示，與用鹽水處理相比，用PPMK107處理的動物中，存活有明顯的提高。在處理后7天，鹽水處理組的小鼠多數(shù)已形成腹水，并在38天后，這些動物全部死亡。與此明顯不同，92％的用PPMK107處理的小鼠在38天后仍然存活，并且25％的這些動物長期存活(存活＞120天)。實施例17當(dāng)腹水存在時在無胸腺小鼠中用PPMK107治療ES-2卵巢癌在本實驗中，所有的無胸腺小鼠(雌性，NCRnu／nu，8周齡)都給予一次106的ES-2細(xì)胞的腹膜內(nèi)注射。14天后，當(dāng)多數(shù)小鼠已形成腹水時，將沒有形成腹水的小鼠排除，將有腹水的小鼠隨機(jī)分成7個腹膜內(nèi)處理組(PPMK107-在第0天處理一次；PPMK107-在第一周處理兩次；PPMK107-每周處理一次；PPMK107-每周處理兩次；鹽水-在第0天處理一次；鹽水一在第一周處理兩次；鹽水-每周處理兩次)。每次病毒處理使用1×109PFU／小鼠的劑量。所有小鼠在第一次處理和任何額外處理前都抽出腹水。第0天指第一次處理當(dāng)天。對每只小鼠的腹水程度進(jìn)行測量并記錄如下<tablesid="table6"num="011"><table>腹水指數(shù)腹水程度1．0動物表現(xiàn)正常-很少或沒有腹水存在2．0腹部輕微腫脹；動物有正常功能3．0腹部腫脹；動物移動緩慢，身體呈弓形，行走搖晃4．0腹部完全腫脹；動物瀕死5．0腹水形成后死亡</table></tables>如表16中所示，在最初處理后的第7天和第10天，所有鹽水處理的動物比PPMK107處理的動物具有發(fā)展程度更高的腹水。在最初處理后第7天，每個鹽水組具有的平均腹水指數(shù)超過3．5，而所有的PPMK處理組具有的平均腹水指數(shù)為3．0或更低。與此類似，在最初處理后第10天，每個鹽水組具有的平均腹水指數(shù)高于4．5，而所有的PPMK107處理組具有的平均腹水指數(shù)至少為4．1或更低。這些結(jié)果表明，與鹽水對照相比，病毒處理動物中的腹水產(chǎn)生明顯降低。表16．當(dāng)腹水已經(jīng)存在時，在無胸腺小鼠中用PPMK107治療ES-2卵巢癌實施例18使用脫敏劑量的PPMK107來降低PPMK107隨后劑量的致死性C57BL／6小鼠(7周齡)在第0天用鹽水或脫敏劑量的PPMK107(3x108PFU／小鼠)進(jìn)行靜脈注射。2天后，將每組小鼠進(jìn)一步分組，來用鹽水或PPMK107(劑量為1×109、2．5×109、5×109和1×lO10PFU／小鼠)進(jìn)行靜脈給藥。如表17所示，當(dāng)鹽水用于預(yù)處理小鼠時，在隨后用2．5×109、5×109和1×1010PFU給藥的小鼠中記錄到了死亡。5×109PFU和1×1010PFU的劑量對用鹽水預(yù)處理的小鼠有100％的致死性。相反，在第0天給予了一個脫敏劑量的PPMK107接著在2天后注射高達(dá)1×1010PFU水平的PPMK107的任何小鼠組中都沒有觀察到死亡。這些數(shù)據(jù)表明，PPMK107可以用來防止使用這種相同藥劑隨后給藥的致死性．而且，當(dāng)使用這種病毒作為脫敏試劑時，PPMK107的最大耐受劑量可以提高適當(dāng)?shù)臄?shù)量級。表17．使用脫敏劑量的PPMK107來降低PPMK107隨后劑量的致死性<tablesid="table7"num="013"><table>組在第0天注射第2天給藥小鼠數(shù)死亡數(shù)致死率％1鹽水鹽水8002鹽水PPMK107，1．0E+098003鹽水PPMK107，2．5E+0983384鹽水PPMK107，5．0E+09881005鹽水PPMK107．1．0E+10881006PPMK107，3E+08鹽水8007PPMK107．3E+08PPMK107，1．0E+098008PPMK107，3E+08PPMK107，2．5E+098009PPMK107，3E+08PPMK107，5．0E+0980010PPMK107，3E+08PPMK107．1．0E+10800</table></tables>實施例19較慢的靜脈注射速率降低PPMK107的毒性用氯胺酮／噻拉嗪混合物將22只無胸腺小鼠(8周齡)麻醉，并置入一個夾子來在注射過程中幫助阻止其活動，這樣就可以進(jìn)行緩慢或快速注射PPMK107。對于慢注射組，0．2mL在鹽水中的4×109PFUPPMK107經(jīng)靜脈在4分鐘內(nèi)注射，每10至15秒注射0．01ml?？熳⑸浣M接受相同的劑量和體積，但在30秒的時間內(nèi)給藥。如表18所示，在4分鐘內(nèi)接受PPMK107給藥的動物的最大體重?fù)p失(在給藥后第2天記錄)是在30秒內(nèi)接受相同IV劑量的動物的一半。這些結(jié)果表明，PPMK107在較慢的速率進(jìn)行注射時，對于靜脈給藥來說，具有較低的毒性并且更安全。表18．較慢的IV注射PPMK107導(dǎo)致毒性降低<tablesid="table8"num="014"><table>組給藥時間長度小鼠數(shù)目最大體重喪失百分?jǐn)?shù)4E+09快速注射30秒12％4E+09慢注射4分鐘6％</table></tables>實施例20在晚期癌癥病人的治療中使用PPMK107PPMK107已在美國通過靜脈途徑進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗。23名不再適合于治療的晚期實體瘤病人用PPMK107進(jìn)行了治療。這些病人中有17名接受了單一劑量進(jìn)行最初的療程。其他6名病人接受每周3次劑量，進(jìn)行一周的最初療程。每月追蹤一次每名病人的腫瘤大小。具有至少穩(wěn)定病情的病人(在沒有任何新的病灶的情況下，所有可測量的腫瘤的產(chǎn)物總量的增加少于25％，減少少于50％)適合于每月進(jìn)行額外的療程?？捎|腫瘤的消退一名68歲的患有結(jié)腸癌的老年婦女在其廣泛的轉(zhuǎn)移瘤中有一個可觸摸的腹部瘤。在用PPMK107進(jìn)行單次IV治療后，該病人在兩周的療程后，她的這個單獨的腹腔壁腫瘤有91％的消退(表19)。在給藥1天后該腫瘤的測量值(3．75×3cm)與4×3cm的基礎(chǔ)測量值相似。但在給藥7天后，該腫瘤的大小減少至2×2cm，并且在PPMK107給藥14天后繼續(xù)減少至大小1．5×1．5cm。在進(jìn)行PPMK107治療前，該腫瘤在PPMK107給藥前的2周內(nèi)腫瘤體積快速增加了1065％。該病人由于其他部位的腫瘤繼續(xù)增長而在研究過程中去世。表19．病人#123(患有遷移性結(jié)腸癌的68歲的老年婦女)中可觸的腹腔壁腫瘤在一次120億PFU／m2的IVPPMK107劑量后的大小癌癥的穩(wěn)定8名病人在以前用常規(guī)癌癥療法治療時，腫瘤都在發(fā)展，他們在給予了PPMK107后都獲得了益處，他們正在發(fā)展的癌癥被穩(wěn)定下來。這些病情穩(wěn)定的病人代表了不同類型的癌癥，包括腎癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌。在3個月的PPMK107治療后，一名患有晚期和廣泛擴(kuò)散的腎癌的67歲的老人目前已經(jīng)病情穩(wěn)定，沒有任何新的生長的跡象，沒有腫瘤大小增加的跡象。PPMK107的劑量越高，病情穩(wěn)定益處的比例也越高6名病人中有2名(33％的病人)在頭兩個單一劑量水平(59和120億PFU／m2)獲得病情穩(wěn)定，在最高單一劑量(240億PFU／m2)時，5名病人有4名(80％的病人)獲得了病情穩(wěn)定(表20)。表20．用PPMK107治療晚期癌癥病人<tablesid="table9"num="016"><table>劑量水平(十億PFU／m2)用此劑量水平治療的病人數(shù)目病情穩(wěn)定的病人數(shù)目病情穩(wěn)定的病人％至少在一個月內(nèi)病情穩(wěn)定的癌癥種類及病情穩(wěn)定的時間5．96233％腎癌-持續(xù)3個月肺癌-持續(xù)2個月126233％胰腺癌-持續(xù)2個月卵巢癌-持續(xù)1個月245480％乳腺癌-持續(xù)1個月乳腺癌-持續(xù)1個月肺癌-持續(xù)1個月胰腺癌-持續(xù)1個月總數(shù)17847％上面標(biāo)出</table></tables>疼痛藥物的減少一名病人在單一劑量為59億PFU／m2劑量水平時用PPMK107治療獲得了益處，其形式為癌癥疼痛的癥狀得到了緩解，這可由麻醉疼痛藥物的減少看出。脫敏首次劑量(為59億PFU／m2)的明顯脫敏作用可以在同一周內(nèi)的后續(xù)給藥(也為59億PFU／m2)上觀察到。一般來說，報道的第二次和第三次給藥的副作用非常少。例如，在此多劑量療程中(一周三次，進(jìn)行一周)，盡管接受了用對乙酰氨基酚和布洛芬進(jìn)行的預(yù)防性抗熱處理，前4名病人在第一次給藥時仍然發(fā)燒。這些病人在接受第二次和第三次給藥時多數(shù)沒有發(fā)燒，即使在沒有接受抗熱藥物時也是如此。這說明，在每周三次的治療計劃中，第一次給藥能減少第二次和第三次給藥的毒性。通過血清中的中和抗體的給藥使用此Ⅰ期臨床研究的劑量范圍(≥59億PFU／m2)，有明顯的證據(jù)表明，在病人已經(jīng)產(chǎn)生中和抗體的情況下，也能將病毒有效傳遞給病人。一名患有胰腺癌的72歲老年婦女在接受120億PFU／m2單一劑量水平后，從PPM107治療開始的2個月中病情穩(wěn)定。在第一次給藥1個月后，當(dāng)病人已開始在其血清內(nèi)產(chǎn)生中和性抗體時，進(jìn)行第二個療程的給藥(包括一次單一的PPMK107IV劑量)。在此第二個療程的7天后，她的尿中為PPMK107陽性，滴度至少為40PFU／mL。這個結(jié)果表明，該病人血清中的抗PPMK107中和抗體不能完全抑制病毒的第二個療程。實施例21新城疫病毒PPNJROAKIN的細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述人腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在24孔組織培養(yǎng)皿中生長至約80％連匯。移去生長培養(yǎng)基，將PPNJROAKIN(空斑純化的中等毒性的新城疫病毒株NewJerseyRoakin-1946的克隆)經(jīng)10倍稀釋后加入，范圍為107空斑形成單位(PFU)／孔至1PFU／孔。每個皿中都包括沒有加入病毒的對照孔。病毒在一個旋轉(zhuǎn)平臺上在37℃吸收90分鐘。在溫育期結(jié)束時，移去病毒稀釋物，代之以1ml生長培養(yǎng)基。然后將皿在37℃在5％CO2中溫育5天。細(xì)胞毒通過使用MTT(2-[4、5-二-甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(CellTiter96，catalog#G4000，ProgemaCorporation，MadisonWI53711)進(jìn)行測量，MTT比色法在570nm處進(jìn)行監(jiān)測，能監(jiān)測線粒體酶的活性(MosmanT．，1983，J．Immunol．Methods6555)。病毒處理的孔中的存活以未處理對照孔的百分?jǐn)?shù)來表示。數(shù)據(jù)用PFU／孔對以對照的百分?jǐn)?shù)形式表示的存活性來作圖。IC50通過能產(chǎn)生50％活細(xì)胞數(shù)量減少的PFU／孔的病毒數(shù)量來計算。表21．PPNJROAKIN的細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述<tablesid="table10"num="017"><table>細(xì)胞類型細(xì)胞系IC50(PFU／孔)纖維肉瘤HT108013．8頭和頸癌KB2．4正常成纖維細(xì)胞CCD922sk1．2×104</table></tables>這些結(jié)果(表21)表明，PPNJR0AKIN證明了相對于正常的皮膚成纖維細(xì)胞，至少對兩種不同的人腫瘤細(xì)胞(HT1080和KB)具有腫瘤選擇性殺傷作用。兩種腫瘤細(xì)胞系的IC50值比正常細(xì)胞低800至5000倍。實施例22新城疫病毒PPCONN70726的細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述人腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在24孔組織培養(yǎng)皿中生長至約80％連匯。移去生長培養(yǎng)基，將PPCONN70726(空斑純化的中等毒性的新城疫病毒株Connecticut的克隆)經(jīng)10倍稀釋后加入，范圍為107空斑形成單位(PFU)／孔至1PFU／孔。每個皿中都包括沒有加入病毒的對照孔。病毒在一個旋轉(zhuǎn)平臺上在37℃吸收90分鐘。在溫育期結(jié)束時，移去病毒稀釋物，代之以1ml生長培養(yǎng)基。然后將皿在37℃在5％CO2中溫育5天。細(xì)胞毒通過使用MTT(2-[4、5-二甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(CellTiter96，catalog#G4000，ProgemaCorporation，MadisonWI53711)進(jìn)行測量，MTT比色法在570nm處進(jìn)行監(jiān)測，能監(jiān)測線粒體酶的活性(MosmanT．，1983，J．Immunol．Methods6555)。病毒處理的孔中的存活以未處理對照孔的百分?jǐn)?shù)來表示。數(shù)據(jù)用PFU／孔對以對照的百分?jǐn)?shù)形式表示的存活性來作圖。IC50通過能產(chǎn)生50％活細(xì)胞數(shù)量減少的PFU／孔的病毒數(shù)量來計算。表22．PPCONN70726的細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述<tablesid="table11"num="018"><table>細(xì)胞類型細(xì)胞系IC50(PFU／孔)頭和頸癌KB18．1成蝕質(zhì)細(xì)胞瘤U87MG12．7成蝕質(zhì)細(xì)胞瘤U373MG879正常成纖維細(xì)胞CCD922sk7．3×104</table></tables>這些結(jié)果(表22)表明，PPCONN70726證明了相對于正常的皮膚成纖維細(xì)胞，至少對三種不同的人腫瘤細(xì)胞(KB、U87MG和U373MG)具有腫瘤選擇性殺傷作用。兩種腫瘤細(xì)胞系的IC50值比正常細(xì)胞低800至5000倍。實施例23使用PPMK107、PPNJROAKIN或PPCONN70726在無胸腺小鼠中腫瘤內(nèi)治療HT1080纖維肉瘤異種移植物在本實驗中，無胸腺小鼠(雌性、NCRnu／nu，5至6周齡)接受一次107HT1080腫瘤細(xì)胞的皮下注射。4天后，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到6至8．5mm時，小鼠用鹽水、PPMK107(1x108。CFU)、PPNJROAKIN(1x108CFU)或PPCONN7026(1x108CFU)進(jìn)行腫瘤內(nèi)處理．如表23所示，用這三種病毒(PPMK107、PPNJROAKIN或PPCONN70726)處理的小鼠中觀察到了腫瘤消退。在PPMK107處理后，12只小鼠有4只腫瘤完全消退，有6只部分消退。在PPNJROAKIN處理后，12只小鼠有1只小鼠腫瘤完全消退，2只小鼠部分消退。在PPCONN70726處理后，12只小鼠有3只腫瘤完全消退，2只部分消退。在鹽水處理的任何動物中，都沒有觀察到腫瘤消退。這些結(jié)果顯示三種中等毒性的NDV毒株都能引起腫瘤消退。表23．在用劑量均為1×108PFU的三種病毒(PPMK107、PPNJKOAKIN和PPCONN70726中的一種處理后，無胸腺小鼠中的HT纖維肉瘤腫瘤的消退)實施例24PPMK107、PPNJROAKIN、PPCONN70726在腦內(nèi)注射進(jìn)免疫缺陷的無胸腺小鼠(nu／nu)和免疫活性的雜合小鼠(nu／+)后的作用56只無胸腺小鼠(nu／nu)和56只免疫活性的雜合小鼠(nu／+)用鹽水、PPMK107、PPNJROAKIN或PPCONN70726進(jìn)行立體定位的腦內(nèi)注射。每種類型的另外8只小鼠用作未處理的對照。病毒使用兩個劑量水平(2×104或3．5×106PFU／鼠)中的一個。如表24所示，在39天內(nèi)，所有用三種病毒以兩個劑量水平處理的雜合nu／+小鼠都存活，一個例外是一只用低劑量水平的PPCONN70726處理的小鼠非神經(jīng)癥狀死亡。用PPMK107或PPCONN70726處理的無胸腺nu／nu動物的存活明顯少于雜合小鼠。這在3．5×106PFU／鼠的最高PPMK107或PPCONN70726病毒劑量時尤其如此，其中在每個病毒組中只有13％(8只中的1只)的無胸腺動物存活至39天。相反，在用相同劑量水平(3．5×106PFU／鼠)的PPNJROAKIN處理的無胸腺小鼠中有75％的存活。這些數(shù)據(jù)表明，PPNJROAKIN比其他兩種病毒株能更好地在無胸腺小鼠的腦中耐受。表24．腦內(nèi)注射PPMK107、PPCONN7072和PPNJROAKIN后小鼠的存活<tablesid="table12"num="020"><table>腦內(nèi)注射小鼠數(shù)目在第39天的存活％nu／+未處理8100nu／+鹽水8100nu／+PPMK107，2E+048100nu／+PPMK107，3．5E+068100nu／+PPCONN70726，2E+04888*nu／+PPCONN70726，3．5E+068100nu／+PPNJROAKIN，2E+048100nu／+PPNJROAKIN，3．5E+068100nu／nu未處理8100nu／nu鹽水8100nu／nuPPMK107，2E+04875nu／nuPPMK107，3．5E+06813nu／nuPPCONN70726，2E+04875nu／nuPPCONN70726，3．5E+06813nu／nuPPNJROAKIN，2E+048100nu／nuPPNJROAKIN，3．5E+06875</table></tables>*在此處理組中的一個非存活小鼠是因非神經(jīng)癥狀死亡實施例25辛德畢斯病毒PPSINDBIS-Ar339的細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述人腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在24孔組織培養(yǎng)皿中生長至約80％連匯。移去生長培養(yǎng)基，將PPSINDBIS-Ar339(空斑純化的辛德畢斯病毒克隆)經(jīng)10倍稀釋后加入，范圍為107空斑形成單位(PFU)／孔至1PFU／孔。每個皿中都包括沒有加入病毒的對照孔。病毒在一個旋轉(zhuǎn)平臺上在37℃吸收90分鐘。在溫育期結(jié)束時，移去病毒稀釋物，代之以1ml生長培養(yǎng)基。然后將皿在37℃在5％CO2中溫育5天。細(xì)胞毒通過使用MTT(2-[4、5-二甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(CellTiter96，catalog#G4000，ProgemaCorporation，MadisonWI53711)進(jìn)行測量，MTT比色法在570nm處進(jìn)行監(jiān)測，能監(jiān)測線粒體酶的活性(MosmanT．，1983，J．Immunol．Methods6555)。病毒處理的孔中的存活以未處理對照孔的百分?jǐn)?shù)來表示。數(shù)據(jù)用PFU／孔對以對照的百分?jǐn)?shù)形式表示的存活性來作圖。IC50通過能產(chǎn)生50％活細(xì)胞數(shù)量減少的PFU／孔的病毒數(shù)量來計算。表25．“PPSINDBIS-Ar339的細(xì)胞毒試驗結(jié)果概述“已知能過量表達(dá)高親和性層粘連蛋白受體mRNA的細(xì)胞辛德畢斯病毒在哺乳動物細(xì)胞上的細(xì)胞受體是高親和性層粘連蛋白受體，后者主要表達(dá)于上皮細(xì)胞系的細(xì)胞，但經(jīng)常在多種遷移性癌細(xì)胞如Panc-1胰腺癌細(xì)胞系和SW620結(jié)腸腺癌細(xì)胞系中過量表達(dá)(Campoetal．，(1992)Am．J．Pathol．141，1073-1083；Yowetal．，(1988)Proc．Natl．Acad．Sci．，85，6394-6398)。相反，直腸腺癌細(xì)胞系SW1423已知表達(dá)非常低水平的高親和性層粘連蛋白受體mRNA(Yowetal．，(1988)ProcNatlAcadSci，85，6394-6398)，并且對PPSINDBIS-Ar339的殺傷作用的抗性比SW620細(xì)胞要高4個數(shù)量級。這些結(jié)果(表25)證明，致瘤性和表達(dá)高水平的高親和性層粘連蛋白受體的細(xì)胞對辛德畢斯克隆PPSINDBIS-Ar339的殺傷作用比其他腫瘤或正常細(xì)胞更加敏感。實施例26在存在干擾素時VSV對致瘤性和非致瘤性細(xì)胞的殺傷作用在96孔板中，致瘤性的KB和HT1080細(xì)胞(3×104細(xì)胞每孔)和非致瘤性的WISH細(xì)胞(2．5×104細(xì)胞／孔)在存在系列稀釋的干擾素α(范圍為2800至22單位／ml)的情況下接種，并在37℃溫育24小時。然后用水皰性口炎病毒(VSV，Indiana株)以10的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞。對照包括沒有干擾素的細(xì)胞和沒有干擾素或病毒的細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃溫育24小時。細(xì)胞毒通過使用MTT(2-[4、5-二甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(CellTiter96，catalog#G4000，ProgemaCorporation，MadisonWI53711)進(jìn)行測量，MTT比色法在570nm處進(jìn)行監(jiān)測，能監(jiān)測線粒體酶的活性(MosmanT．，1983，J．Immunol．Methods6555)。病毒處理的孔中的存活以沒有接受病毒的對照孔的活性百分?jǐn)?shù)來表示。表26．VSV在用外源干擾素處理的細(xì)胞中的殺細(xì)胞活性的比較<tablesid="table13"num="022"><table>存活細(xì)胞百分比WISHHT1080KB100U／mlIFN50601000U／mlIFN952012</table></tables>這些結(jié)果(表26)證明，VSV能夠選擇性地殺傷在干擾素應(yīng)答中有缺陷的腫瘤細(xì)胞(見實施例27)。WISH細(xì)胞(人羊膜細(xì)胞)是一個成熟的用于干擾素生物試驗的細(xì)胞系，因為它們能有效地應(yīng)答干擾素。實施例27對PPMK107的殺傷作用敏感或抗性的細(xì)胞中的干擾素應(yīng)答將單獨的細(xì)胞系在96孔板中生長至接近連匯，并用5至5000U／ml的INFαA處理24小時。然后用PPMK107以1．0的感染復(fù)數(shù)感染培養(yǎng)物，并繼續(xù)培養(yǎng)另外24小時。在化學(xué)固定后，病毒表達(dá)的數(shù)量使用一種可溶性指示劑染料通過免疫組化的方法進(jìn)行定量。病毒生長的數(shù)量用相對于未用干擾素處理的對照細(xì)胞的P抗原表達(dá)的百分?jǐn)?shù)來表示(圖5)。在此試驗中，干擾素應(yīng)答細(xì)胞顯示應(yīng)答于干擾素至少有50％的病毒抗原減少。圖5中對PPMK107敏感的細(xì)胞用實線表示，較低敏感的細(xì)胞用虛線表示。本實驗的結(jié)果顯示，在細(xì)胞系對外源干擾素的抗病毒作用的抗性與細(xì)胞對PPMK107殺傷作用的相對敏感性(用圖說明中細(xì)胞系名稱附近的括號內(nèi)顯示的IC50表示，見圖5)之間有很高的相關(guān)性。例如，在用5U／ml的干擾素預(yù)處理后，對干擾素不應(yīng)答的7個細(xì)胞系中有6個(86％)對PPMK107的殺傷作用敏感，當(dāng)用500U／ml干擾素預(yù)處理時，所有的非應(yīng)答細(xì)胞系(4個中的4個)都對PPMK107的殺傷作用敏感。上述數(shù)據(jù)也提供了一個篩選試驗的例子，這種篩選試驗可用來鑒定可能對PPMK107或其他干擾素敏感病毒的殺傷作用敏感的候選細(xì)胞。例如，在用外源干擾素預(yù)處理后能表達(dá)明顯(例如比對照多50％)的病毒抗原的感染細(xì)胞，將被認(rèn)為是干擾素缺陷的，并因而對病毒的溶癌作用敏感。★★★上述內(nèi)容是用來說明本發(fā)明而不是為了限制。在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以進(jìn)行多種改變和修飾。權(quán)利要求1．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆RNA病毒給藥于所說的哺乳動物。2．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種復(fù)制活性的克隆RNA病毒給藥于所說的哺乳動物，其中所說的病毒對干擾素敏感。3．一種在哺乳動物中治療贅生物的方法，包括將一種治療有效量的干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆RNA病毒給藥于所說的哺乳動物。4．權(quán)利要求1的方法，其中所說的RNA病毒在存在干擾素時比在沒有干擾素時復(fù)制至少要低100倍。5．權(quán)利要求1的方法，其中所說的RNA病毒在存在干擾素時比在沒有干擾素時復(fù)制至少要低1000倍。6．權(quán)利要求1的方法，其中所說的給藥步驟是系統(tǒng)性的。7．權(quán)利要求1的方法，其中所說的贅生物是一種癌。8．權(quán)利要求1的方法，其中所說的哺乳動物是人。9．權(quán)利要求1的方法，其中所說的克隆病毒是一種空斑純化的病毒。10．權(quán)利要求1的方法，其中所說的克隆病毒來源于重組克隆。11．權(quán)利要求1的方法，其中所說的RNA病毒是一種副粘病毒。12．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒被純化至至少為2x109PFU／毫克蛋白的水平。13．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒被純化至至少為1×1010PFU／毫克蛋白的水平。14．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒被純化至至少為6×1010PFU／毫克蛋白的水平。15．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒被純化至這樣一種水平，即顆粒／PFU比不大于5。16．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒被純化至這樣一種水平，即顆粒／PFU比不大于3。17．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒被純化至這樣一種水平，即顆粒／PFU比不大于1．2。18．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒是禽副粘病毒2型。19．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒是NDV。20．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒是腮腺炎病毒。21．權(quán)利要求11的方法，其中所說的副粘病毒是人副流感病毒。22．權(quán)利要求1的一種方法，其中所說的RNA病毒選自彈狀病毒、披蓋病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、微核糖核酸病毒和日冕形病毒。23．權(quán)利要求22的方法，其中所說的披蓋病毒是辛德畢斯病毒。24．權(quán)利要求22的方法，其中所說的呼腸孤病毒在ω3有一個修飾。25．權(quán)利要求22的方法，其中所說的呼腸孤病毒在ω1有一個減毒突變。26．權(quán)利要求22的方法，其中所說的呼腸孤病毒是一種減毒的輪狀病毒。27．權(quán)利要求26的方法，其中所說的輪狀病毒是輪狀病毒W(wǎng)C3。28．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆痘苗病毒給藥于所說的哺乳動物，其中痘苗病毒在選自K3L、E3L和B18R的基因的一個或多個中有一個或多個突變。29．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種復(fù)制活性的克隆痘苗病毒給藥于所說的哺乳動物，其中痘苗病毒在選自K3L、E3L和B18R的基因的一個或多個中有一個或多個突變，其中所說的病毒對干擾素敏感。30．一種在哺乳動物中治療贅生物的方法，包括將一種治療有效量的干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆痘苗病毒給藥于所說的哺乳動物，其中痘苗病毒在選自K3L、E3L和B18R的基因的一個或多個中有一個或多個突變。31．權(quán)利要求30的方法，其中所說的哺乳動物是人。32．權(quán)利要求30的方法，其中所說的痘苗病毒是一種在選自編碼痘苗生長因子、胸苷激酶、胸苷酸激酶、DNA連接酶、核糖核苷酸還原酶和dUTP酶的基因的一種基因中具有一種減毒突變的痘苗病毒。33．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆DNA病毒給藥于所說的哺乳動物，其中所說的DNA病毒選自腺病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒和虹色病毒。34．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種復(fù)制活性的克隆DNA病毒給藥于所說的哺乳動物，其中所說的DNA病毒選自腺病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒和虹色病毒，其中所說病毒對干擾素敏感。35．一種在哺乳動物中治療贅生物的方法，包括將一種治療有效量的干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆DNA病毒給藥于所說的哺乳動物，其中所說的DNA病毒選自腺病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒和虹色病毒。36．權(quán)利要求33的方法，其中所說的哺乳動物是人。37．權(quán)利要求33的方法，其中所說的腺病毒在VA1轉(zhuǎn)錄物中有一個修飾，使所說的腺病毒變得對干擾素敏感。38．權(quán)利要求37的方法，其中所說的腺病毒選自疫苗株Ad-4、Ad-7和Ad-21。39．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆的皰疹病毒給藥于所說的哺乳動物。40．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種復(fù)制活性的克隆的皰疹病毒給藥于所說的哺乳動物，其中所說的病毒對干擾素敏感。41．一種在哺乳動物中治療贅生物的方法，包括將一種治療有效量的干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆皰疹病毒給藥于所說的哺乳動物。42．權(quán)利要求41的方法，其中所說的皰疹病毒是乙型皰疹病毒亞科或丙型皰疹病毒亞科的一個成員。43．權(quán)利要求41的方法，其中所說的皰疹病毒是甲型皰疹病毒亞科的一個成員，但不是HSV-1。44．權(quán)利要求41的方法，其中所說的哺乳動物是人。45．權(quán)利要求41的方法，其中所說的皰疹病毒是甲型皰疹病毒亞科的一個成員，它的(2’-5’)An類似物的表達(dá)減少。46．權(quán)利要求45的方法，其中所說的皰疹病毒在選自編碼胸苷激酶、核糖核苷酸還原酶的基因中有一個減毒突變，或在b’a’c’反向重復(fù)位點中有一個刪除。47．權(quán)利要求45的方法，其中所說的皰疹病毒在γ34．5基因中有一個修飾。48．權(quán)利要求41的方法，其中所說的皰疹病毒在γ34．5基因中有一個修飾，并在編碼胸苷激酶的基因中有一個減毒突變，或在b’a’c’反向重復(fù)位點或功能類似位點中有一個刪除。49．權(quán)利要求41的一種方法，其中所說的皰疹病毒是在選自編碼胸苷激酶、核糖核苷酸還原酶的一個基因中有一個減毒突變或在b’a’c’反向重復(fù)位點中有一個刪除的皰疹病毒。50．權(quán)利要求1的方法，其中所說的贅生物是一種選自肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌和腦癌的癌癥。51．權(quán)利要求1的方法，其中所說的贅生物是一種實體瘤。52．權(quán)利要求50的方法，其中所說的腦癌是一種成蝕質(zhì)細(xì)胞瘤。53．權(quán)利要求1的方法，其中所說的病毒含有一個編碼干擾素的基因，使病毒表達(dá)干擾素。54．權(quán)利要求1的方法，其中所說的病毒含有一個編碼一種藥物前體活化酶的基因。55．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在所說的病毒給藥前、給藥過程中、給藥后給予IFN。56．權(quán)利要求55的方法，其中所說的干擾素選自α-IFN、β-IFN、ω-IFN、γ-IFN和IFN的合成的共有形式。57．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在所說的病毒給藥前、給藥過程中，給藥后，給予一種酪氨酸激酶抑制劑。58．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括給予一種選自嘌呤核苷類似物、酪氨酸激酶抑制劑、西咪替丁和線粒體抑制劑的化合物。59．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在所說的病毒給藥前、給藥過程中、給藥后，給予一種化療試劑。60．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在所說的病毒給藥前、給藥過程中、給藥后，給予一種細(xì)胞因子。61．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在所說的病毒給藥前、給藥過程中、給藥后，給予一種免疫抑制劑。62．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括給予病毒復(fù)制控制數(shù)量的一種選自IFN、三氮唑核苷、無環(huán)鳥苷和更昔洛韋的化合物。63．權(quán)利要求1的方法，其中所說的給藥是經(jīng)靜脈或腫瘤內(nèi)。64．一種在哺乳動物中用病毒感染大小至少為1厘米的贅生物的方法，包括將選自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)細(xì)小病毒；(4)乳多空病毒；(5)皰疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹色病毒的克隆病毒給藥于所說的哺乳動物。65．一種在哺乳動物中治療贅生物的方法，包括將治療有效量的選自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)細(xì)小病毒；(4)乳多空病毒；(5)皰疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹色病毒的克隆病毒給藥于所說的哺乳動物，其中所說的贅生物大小至少為1厘米。66．權(quán)利要求64的方法，其中所說贅生物至少體積為300mm3。67．權(quán)利要求64的方法，其中所說的RNA病毒是一種副粘病毒。68．權(quán)利要求67的方法，其中所說的副粘病毒是NDV。69．權(quán)利要求64的方法，其中所說的哺乳動物是人。70．權(quán)利要求64的方法，其中給藥是經(jīng)靜脈或腫瘤內(nèi)。71．權(quán)利要求64的方法，其中所說的副粘病毒被純化至至少為2×109PFU／毫克蛋白的水平。72．權(quán)利要求68的方法，其中所說的NDV是中等毒性的。73．權(quán)利要求65的方法，其中所說的贅生物是癌性的。74．一種在哺乳動物中治療腫瘤的方法，包括將一種治療有效量的對所說腫瘤有殺細(xì)胞作用的RNA病毒給藥于所說的哺乳動物，其中所說的哺乳動物攜帶的腫瘤負(fù)荷至少占所說哺乳動物機(jī)體總重量的1．5％。75．權(quán)利要求74的方法，其中所說的腫瘤不對化療應(yīng)答。76．一種篩選從病人中新取出的腫瘤細(xì)胞或組織的方法，該方法用來確定所說細(xì)胞或組織對一種病毒殺傷作用的敏感性，包括將組織樣品進(jìn)行使用干擾素敏感病毒的差別細(xì)胞毒試驗。77．權(quán)利要求76的方法，進(jìn)一步包括在所說的細(xì)胞或組織中篩選選自p68蛋白激酶、C-Myc、C-Myb、ISGF-3、IRF-1、IFN受體和p58的蛋白或編碼蛋白的mRNA的步驟。78．一種鑒定在哺乳動物中具有抗贅生物活性的病毒的方法，包括a)使用所說的待測病毒感染Ⅰ)在干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性中缺陷的細(xì)胞，和ⅱ)在干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性中有活性的細(xì)胞，并，b)確定相對于干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性完全的細(xì)胞所說的待測病毒是否能優(yōu)先殺傷干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性缺陷的細(xì)胞。79．權(quán)利要求78的方法，其中所說的干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性缺陷的細(xì)胞是KB頭和頸癌細(xì)胞。80．權(quán)利要求78的方法，其中所說的干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性完全的細(xì)胞是人皮膚成纖維細(xì)胞。81．一種制備用于抗贅生物療法的病毒的方法，包括a)通過消除或去除一種使IFN的抗病毒活性失活的病毒機(jī)制來修飾一種現(xiàn)存的病毒，并且可選地b)制造一種減毒突變。82．一種在用選自RNA病毒、腺病毒、痘病毒、虹色病毒、細(xì)小病毒、嗜肝DNA病毒、水痘皰疹病毒、乙型皰疹病毒和丙型皰疹病毒的病毒處理的哺乳動物中控制病毒復(fù)制的方法，包括給予一種抗病毒化合物。83．權(quán)利要求82的方法，其中所說的抗病毒化合物是干擾素。84．權(quán)利要求82的方法，其中所說的抗病毒化合物選自三氮唑核苷、無環(huán)鳥苷和更昔洛韋。85．權(quán)利要求82的方法，其中所說的抗病毒化合物是針對所說病毒的一種中和抗體。86．一種通過超離心但不沉淀而純化的副粘病毒。87．一種純化至至少為2×109PFU／毫克蛋白水平的副粘病毒。88．權(quán)利要求87的副粘病毒，其中所說的副粘病毒生長于卵，并且基本上沒有污染的卵蛋白。89．權(quán)利要求87的副粘病毒，其中所說的副粘病毒具有不大于5的顆粒／PFU比。90．權(quán)利要求87的副粘病毒，其中所說的副粘病毒具有不大于3的顆粒／PFU比。91．權(quán)利要求87的副粘病毒，其中所說的副粘病毒具有不大于1．2的顆粒／PFU比。92．一種被純化至至少為1×1010PFU／毫克蛋白水平的副粘病毒。93．一種被純化至至少為6×1010PFU／毫克蛋白水平的副粘病毒。94．權(quán)利要求87的副粘病毒，其中所說的病毒是殺細(xì)胞性的。95．權(quán)利要求87的副粘病毒，其中所說的副粘病毒是新城疫病毒。96．權(quán)利要求95的NDV，其中所說的NDV是殺細(xì)胞性的。97．權(quán)利要求95的NDV，其中所說的NDV是中等毒性的。98．一種被純化至至少為2×109PFU／毫克蛋白水平的RNA病毒。99．權(quán)利要求98的RNA病毒，其中所說的病毒是復(fù)制活性的。100．一種復(fù)制活性的殺細(xì)胞性病毒，它對干擾素敏感，并被純化至至少為2×109PFU／毫克蛋白的水平。101．權(quán)利要求100的殺細(xì)胞性病毒，其中所說的病毒是克隆的。102．一種殺細(xì)胞性DNA病毒，它對干擾素敏感，并被純化至至少為2×109PFU／毫克蛋白的水平。103．權(quán)利要求102的殺細(xì)胞性DNA病毒，其中所說的病毒是一種痘病毒。104．權(quán)利要求103的痘病毒，其中所說的痘病毒是一種在選自K3L、E3L和B18R的一個或多個基因中有一個或多個突變的痘苗病毒。105．一種復(fù)制活性的痘苗病毒，它具有a)在K3L、E3L和B18R的一個或多個基因中有一個或多個突變，和b)在編碼胸苷激酶、核糖核苷酸還原酶、痘苗生長因子、胸苷酸激酶、DNA連接酶和dUTP酶的一種或多種基因中有一種減毒突變。106．一種復(fù)制活性的痘苗病毒，它在選自K3L、E3L和B18R的兩個或更多基因中有一個或多個突變。107．一種在(2’-5’)A類似物的表達(dá)中有一個修飾的皰疹病毒。108．一種在ω3有突變并被純化至至少為2×109PFU／毫克蛋白水平的呼腸孤病毒。109．一種在ω1和ω3有突變的呼腸孤病毒。110．一種純化RNA病毒的方法，包括以下步驟a)制備一種克隆病毒，并b)通過超離心但不沉淀來純化所說的克隆病毒。111．權(quán)利要求110的方法，其中所說的RNA病毒是復(fù)制活性的。112．一種純化副粘病毒的方法，包括通過超離心但不沉淀純化所說的病毒。113．權(quán)利要求112的方法，其中所說的純化步驟在所說的超離心前另外包括a)用空斑純化來制備一種克隆病毒，b)用所說的克隆病毒接種卵，c)溫育所說的卵，d)冷卻所說的卵，e)從所說的卵中收集尿囊液，并f)從所說的尿囊液中除去細(xì)胞殘渣。114．權(quán)利要求112的方法，其中所說副粘病毒是NDV。115．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括將一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的RNA病毒給予所說的哺乳動物。116．權(quán)利要求1的方法，其中所說的病毒選自新城疫病毒毒株MK107、新城疫病毒毒株NJRoakin、辛德畢斯病毒和水皰性口炎病毒。117．一種在哺乳動物中用病毒感染贅生物的方法，包括用一種選自新城疫病毒毒株MK107、新城疫病毒毒株NJRoakin、辛德畢斯病毒和水皰性口炎病毒的克隆病毒給藥。118．權(quán)利要求1或權(quán)利要求28或權(quán)利要求33的方法，其中所說的病毒給藥多于一次劑量。119．權(quán)利要求118的方法，其中第一次劑量是一種脫敏劑量。120．權(quán)利要求119的方法，其中所說的第一次劑量經(jīng)靜脈給藥，并且隨后的一次劑量也經(jīng)靜脈給藥。121．權(quán)利要求119的方法，其中所說的第一次劑量經(jīng)靜脈給藥，并且隨后的一次劑量經(jīng)腹膜內(nèi)給藥。122．權(quán)利要求119的方法，其中所說的第一次劑量經(jīng)靜脈給藥，并且隨后的一次劑量經(jīng)動脈內(nèi)給藥。123．一種在哺乳動物中治療贅生物的方法，包括將從所說的哺乳動物中取得的樣品進(jìn)行免疫試驗以檢測存在的病毒受體的數(shù)量，如果所說的受體存在，就給予所說的哺乳動物一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒，后者能結(jié)合所說的受體。124．權(quán)利要求123的方法，其中所說的病毒是辛德畢斯病毒，并且所說的受體是高親和性層粘連蛋白受體。125．權(quán)利要求1或權(quán)利要求28或權(quán)利要求33的方法，其中所說的病毒經(jīng)過最少為4分鐘的過程進(jìn)行給藥。126．一種治療腫瘤腹水的方法，包括給予一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒。127．一種在哺乳動物中減輕疼痛的方法，包括給予一種干擾素敏感的、復(fù)制活性的克隆病毒。全文摘要本發(fā)明涉及能夠復(fù)制并因而殺死在IFN介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷的贅生細(xì)胞的病毒,以及它們在治療瘤性疾病包括癌癥和大腫瘤中的使用。在這點上,RNA和DNA病毒都有用。本發(fā)明還涉及用于癌癥治療的這種病毒的選擇、設(shè)計、純化和使用。文檔編號A61P35/00GK1281336SQ98812019公開日2001年1月24日申請日期1998年10月9日優(yōu)先權(quán)日1997年10月9日發(fā)明者M(jìn)·S·羅伯茨,R·M·羅倫斯,W·S·格雷尼,H·拉賓,R·W·馮波爾斯特申請人:病毒防御公司