專利名稱：調(diào)節(jié)吞噬作用和icam－1表達(dá)的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療，該疾病可通過改變某些細(xì)胞內(nèi)的吞噬作用或ICMA-1表達(dá)來改善。本發(fā)明提供了各種組合物、方法和生產(chǎn)制品，并涉及了各種廣泛的疾病，如皮膚、免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本發(fā)明根據(jù)的是發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)吞噬作用和ICAM-1表達(dá)的機(jī)制。
背景技術(shù)：
通常的吞噬作用和ICAM-1表達(dá)吞噬作用(胞吞作用)是攝食的細(xì)胞過程，通常是顆粒物質(zhì)分離或破壞的細(xì)胞過程。在脊椎動(dòng)物中，它是各種白細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的特征性功能。吞噬作用作為體內(nèi)重要的防御機(jī)制，起抵抗微生物感染、抵抗外來顆粒和組織碎片閉合粘液表面和組織的作用。吞噬作用和胞飲作用是不同的，胞飲作用是細(xì)胞通過內(nèi)陷和夾斷細(xì)胞質(zhì)膜來吸收液體。在這里，術(shù)語“胞吞作用”和“細(xì)胞攝入”可以互換使用。
胞間粘附分子-1(“ICAM-1”)是一種可誘導(dǎo)的細(xì)胞表面糖蛋白，其參與細(xì)胞-細(xì)胞之間的粘附和吞噬作用。具體地說，ICAM-1的調(diào)節(jié)在炎性情況、膿毒休克和神經(jīng)病學(xué)疾病中起一定作用(參見van de Stolpe和van der Saag，J Mol Med 741，13-33，1996)。在自身免疫疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬中，ICAM-1的水平升高。在ICAM-1缺失的小鼠中，炎性和免疫反應(yīng)被破壞(Sligh等人，PNAS 908529-33 1993)。
與吞噬作用和ICAM-1表達(dá)有關(guān)的哺乳動(dòng)物疾病在不同細(xì)胞中，吞噬作用和ICAM-1表達(dá)的水平具有重要的牽連。本文提供了這些牽連的許多例子。
免疫有關(guān)的和炎性疾病導(dǎo)致肺氣腫的主要原因是肺中外來物質(zhì)(例如煙凝結(jié)物)的堆積。在此堆積后隨即對(duì)嘗試性吞噬期間失粒的中性粒細(xì)胞補(bǔ)充(Travis，等人，Am．J．Respir．Crit．CareMed．Vol．1505143-5146，1994)。
免疫性肺病(如變應(yīng)性支氣管肺曲霉病)導(dǎo)致粘液堵塞氣道、嗜酸性肺炎和細(xì)支氣管閉塞。在該疾病中，中性粒細(xì)胞彈性酶斷裂的免疫球蛋白和消化的C3b受體限制了病原體的胞吞作用(Greenberger，JAMA，278卷，No．22，1997)。中性粒細(xì)胞彈性酶的增加(同時(shí)破壞了吞噬作用)對(duì)于肺中持續(xù)細(xì)菌感染是有利的，尤其對(duì)于CF患者來說(Doring，等人，Am．J．Respir．Crit．Care Med．1506 Pt 2，S114-7，1994)。
牙周病開始時(shí)是蝕斑堆積在齒根部，然后是機(jī)會(huì)細(xì)菌在牙床下生長(zhǎng)。和肺氣腫中的免疫反應(yīng)一樣，中性粒細(xì)胞被募集至受感染部位，然后在破壞性吞噬作用期間失粒(Travis，等人，Am．J．Respir．Crit．Care Med．Vol．1505143-5146，1994)。牙周病患者的多形核細(xì)胞(“PMN”)對(duì)受調(diào)理的金黃色葡萄球菌粘附和攝食的速度明顯慢于健康對(duì)照(MacFarlane，等人，J Peiodontol 1992；63908-913，1992)。
在遺傳上免疫調(diào)和的個(gè)體、獲得免疫抑制的個(gè)體(如感染了HIV的個(gè)體)或臨時(shí)獲得免疫抑制的個(gè)體(例如在器官移植、植入外來物、瓣膜替代或癌癥治療等后)通常會(huì)得繼發(fā)性感染。
糖尿病患者的肺多形核白細(xì)胞顯示出，與健康的個(gè)體相比，其在攝食和殺死細(xì)菌水平上的吞噬活性降低(例如Musclow，等人，Cytobios，6515-24 1991)。特別是，免疫反應(yīng)中的糖尿病異常包括趨化性受損，吞噬作用受損和粘附作用受損(Grant-Theule，Periodontal Abstracts，Vol．44，No．3，1996)。這些患者通?；加胁幌Ｍ母腥尽?br> 心血管系統(tǒng)疾病動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成由年齡老化或氣球血管成形術(shù)后的再狹窄引起。動(dòng)脈粥樣硬化病灶含有富含膽固醇的顆粒，這些顆粒有許多聚集在一起并被巨噬細(xì)胞吞噬作用以不受調(diào)節(jié)的方式內(nèi)化。該吞噬過程不依賴于LDL或清除受體。載有脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞(稱為泡沫樣受體)能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)一步生長(zhǎng)(Hoff，等人，European Heart Journal，Ⅱ(Supp．E)，105-115，1990；Robert，等人，Annals New YorkAcad．of Sciences，673331-341，1992)。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)表明，在淀粉樣斑塊核心周圍發(fā)現(xiàn)的小角質(zhì)細(xì)胞含有β／A4淀粉樣蛋白的空斑原纖維(E1 Hachimi和Foncin，C．R．Acad．Sci．Paris，Sciences de la vie／Life sciences，317445-451，1994)。小角質(zhì)細(xì)胞吞噬和清除老年性空斑核心的能力在星形角質(zhì)細(xì)胞分泌的可擴(kuò)散因子存在下受到抑制。該因子阻止了老年性空斑的清除，從而使得它們?cè)贏lzheimer′s疾病和其它神經(jīng)病理學(xué)退化過程中持續(xù)存在(DeWitt，等人，Experimental Neurology，149329-340，1998)。
發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞吞噬作用在心理壓抑的患者中減弱(例如McAdams和Leonard，Prog．Neuro-Psychopharmacol．& Biol．Psychiat．，Vol．17∶971-984，1993；Maes等人，J．Psychiat．Res．，Vol．26，No．2，125-134，1992)?；伎植腊Y的患者具有低下的吞噬作用和殺細(xì)胞能力。用于治療神經(jīng)性疾病的苯并二氮雜化合物顯示出減少或抑制了吞噬作用(例如Covelli等人，Immunopharmacology and Immunotoxicology，11(4)701-714，1989)。
皮膚疾病中皮(mid-dermal)彈性組織變性(一種皮膚病)在臨床上的特征是出現(xiàn)皺紋和老年性外表，這部分是由形態(tài)上正常的彈性組織的吞噬作用所導(dǎo)致的(例如Fimiani，等人，Arch Dermatol Res．，287152-1 57，1995)。
許多類型的色素沉著疾病以多種形式存在。它們可以是遺傳性的(例如白癲風(fēng))、獲得性的(例如炎癥后白糠疹，自發(fā)性滴狀黑色素過少癥、黑斑病)和通過感染傳播(例如花斑糠疹)。這些疾病可以是良性的和自限性的(例如分離的咖啡牛乳色斑、光接觸性皮炎)，或是更嚴(yán)重的潛伏疾病的征兆(例如多發(fā)性咖啡牛乳色斑、惡性黑棘皮病)(Hacker，Postgrad Med99177-86，1996)。
已知UV輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性狀況和ICAM-1表達(dá)調(diào)節(jié)異常。這種誘導(dǎo)作用被記載成曬斑形式和PUVA治療的副作用。PUVA治療用于治療各種皮膚疾病，如牛皮癬，一種與ICAM-l表達(dá)上調(diào)有關(guān)的疾病(例如Tronnier，等人，J．Cutan Pathol 1997，24278-85；Ahrens，等人，PNAS 1997，946837-41)。
尋常痤瘡是一種多階段的疾病?；A(chǔ)的痤瘡病損是粉刺。當(dāng)中性粒細(xì)胞被募集至粉刺區(qū)域，第二個(gè)炎性階段是疾病進(jìn)展的原因。幾乎所有與痤瘡有關(guān)的問題均來自該炎性階段。經(jīng)過四環(huán)素處理的患者的中性粒細(xì)胞證實(shí)向趨化因子遷移的速度較慢，在體外的隨機(jī)遷移受到抑制(例如Webster，J．Am．Acad．Dermatol．1995，33247-53)。
蛋白酶激活的受體蛋白酶激活的受體-2(″PAR-2″)是7個(gè)跨膜G蛋白偶聯(lián)的受體，它的序列與凝血酶受體(“TR′s”，也稱為PAR-1，和PAR-3)以及PAR-4有關(guān)但不同。蛋白酶激活的受體通過胞外結(jié)構(gòu)域處精氨酸-絲氨酸斷裂而被蛋白水解激活。然后，新產(chǎn)生的N端激活了作為聯(lián)系在一起的配體的這些受體。胰蛋白酶能激活兩種受體，但是凝血酶只能激活TR′s和PAR-4。只有PAR-2被肥大細(xì)胞類胰蛋白酶激活。這些受體還能被對(duì)應(yīng)于其新的N端、獨(dú)立于受體斷裂的肽激活。SLIGRL(小鼠PAR-2-激活肽)在激活人受體上與SLIGKVD(人激活肽)等效。(綜述參見Coughlin，PNAS 919200-202，1994；Brass和Molino，Thrombosis and Haemostasis 78234-41，1997；Morley，等人，Can．J．Physilo Pharmacol 25832-41，1997)。盡管TR的功能已有詳細(xì)記載，但是PAR-2的生物學(xué)性質(zhì)還未被完全鑒定。最近，Derian等人，在Cell Growth & Differentiation8743-749，1997中描述了PAR-2激活在抑制角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中的作用。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于治療和預(yù)防某些哺乳動(dòng)物疾病的組合物。這些組合物和有關(guān)的方法根據(jù)的是發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)吞噬作用和ICAM-1表達(dá)的機(jī)制。本發(fā)明包括下列組合物(1)一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的組合物，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)治療有效量的增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體；(2)一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的組合物，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)治療有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體；(3)一種用于預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的組合物，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)預(yù)防有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體；和(4)一種用于預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的組合物，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)預(yù)防有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了改變細(xì)胞中吞噬作用或ICAM-1表達(dá)水平的方法。本發(fā)明首先提供了一種增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的方法，該方法包括使該細(xì)胞與有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑接觸。其次，本發(fā)明提供了一種減少哺乳動(dòng)物細(xì)胞中吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的方法，該方法包括使細(xì)胞與有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑接觸。
本發(fā)明還提供了治療和預(yù)防受改變的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)之影響的疾病的方法。具體地說，本發(fā)明提供了下列方法(1)一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物治療有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑；(2)一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物治療有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑；(3)一種預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的方法，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑；和
(4)一種預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的方法，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑。
本發(fā)明還提供了用來給予哺乳動(dòng)物本發(fā)明組合物的制品，它包含一個(gè)與該組合物操作性附帶的固體輸送工具。
最后，本發(fā)明提供了一種給予哺乳動(dòng)物治療、預(yù)防或美容組合物的方法，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物(a)化合物和(b)組合物，該組合物包含藥學(xué)或美容上可接受的載體以及特異性增加吞噬作用的制劑，該制劑的用量足以增加希望攝取化合物的細(xì)胞中的吞噬作用，其中組合物的給予在給予化合物之前和／或同時(shí)進(jìn)行。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了在用化合物Ⅰ或SLIGRL處理后暴露于熒光微珠下的原代角質(zhì)細(xì)胞。
圖2顯示了在用化合物Ⅰ或SLIGRL處理后暴露于熒光微珠下的角質(zhì)細(xì)胞系的細(xì)胞。
圖3顯示了在用大豆胰蛋白酶抑制劑(“STI”)或SLIRL處理后暴露于熒光微珠下的成纖維細(xì)胞系的細(xì)胞。
圖4A顯示了經(jīng)STI處理并暴露于熒光大腸桿菌下的巨噬細(xì)胞的劑量響應(yīng)曲線。
圖4B顯示了經(jīng)化合物Ⅰ或SLIGRT處理并暴露于熒光大腸桿菌下的巨噬細(xì)胞的劑量響應(yīng)曲線。
圖5A顯示了經(jīng)SLIGRL、STI或化合物Ⅰ處理的角質(zhì)細(xì)胞的黑色素?cái)z食。
圖5B顯示了采用分離的黑素體后和圖5A一樣的結(jié)果。
圖6A顯示了經(jīng)處理的角質(zhì)細(xì)胞的ICAM-1免疫熒光染色。
圖6B顯示了經(jīng)處理的角質(zhì)細(xì)胞的免疫沉淀的ICAM-1蛋白的Western印跡。
圖7A顯示了移植到免疫抑制的小鼠上、經(jīng)載體或SLIGRL處理過的人皮膚。
圖7B顯示了移植到免疫抑制小鼠上、經(jīng)載體或SLIGRL處理過的人皮膚的組織切片。
圖8顯示了經(jīng)處理的角質(zhì)細(xì)胞的掃描電子顯微圖象。
圖9顯示了經(jīng)處理的角質(zhì)細(xì)胞的F-肌動(dòng)蛋白染色。
圖10顯示了抗ICAM-1抗體對(duì)角質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響。
圖11顯示了本發(fā)明的化合物減少人老年斑的效果。
發(fā)明詳述本發(fā)明根據(jù)的是發(fā)現(xiàn)可以特異性地改變PAR-2介導(dǎo)的吞噬作用和PAR-2介導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)。這種特異性增加和減少這些細(xì)胞功能的能力可以治療和預(yù)防某些疾病，這些疾病可通過增加或減少吞噬作用和／或ICAM-1表達(dá)來改善。因此，本發(fā)明提供了各種組合物和方法用來治療和預(yù)防通過特異性改變吞噬作用和／或ICAM-1表達(dá)來改善的疾病。
更具體地說，本發(fā)明提供用來治療和預(yù)防某些哺乳動(dòng)物疾病的組合物。這些組合物包括下列組合物(1)一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的組合物，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)治療有效量的增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體；(2)一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的組合物，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)治療有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體；(3)一種用于預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的組合物，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)預(yù)防有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體；和(4)一種用于預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的組合物，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)預(yù)防有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了改變細(xì)胞中吞噬作用或ICAM-1表達(dá)水平的方法。本發(fā)明首先提供了一種增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的方法，該方法包括使該細(xì)胞與有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑接觸。其次，本發(fā)明提供了一種減少哺乳動(dòng)物細(xì)胞中吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的方法，該方法包括使細(xì)胞與有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑接觸。
本發(fā)明還提供了治療和預(yù)防受改變的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)之影響的疾病的方法。具體地說，本發(fā)明提供了下列方法(1)一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物治療有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑；(2)一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物治療有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑；(3)一種預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的方法，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑；和(4)一種預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的方法，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑。
本組合物可以是本領(lǐng)域已知的任何形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含藥學(xué)上可接受的載體以及一種或多種分散的藥物化合物，該藥物化合物起特異性改變吞噬作用或ICAM-1表達(dá)之制劑的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含認(rèn)為是藥學(xué)上或美容上可接受的天然存在的組合物、提取物或其組分。這些天然存在的組合物含有起活性劑作用的某些組分，以及起藥學(xué)上或美容上之載體作用的其它許多組分。本組合物可以是人造的、天然存在的或它們的組合。另外，該組合物可以是本領(lǐng)域已知的任何物理形式，例如液體(如溶液、乳膏、洗液、凝膠、可注射劑)、固體(如片劑、膠囊劑、粉末、顆粒劑)、氣霧劑和涂料。
本發(fā)明可采用抑制胰蛋白酶的天然化合物，例如是絲氨酸蛋白酶抑制劑，尤其是大豆胰蛋白酶抑制劑(“STI”)。大豆提取物、利馬豆提取物和類似的提取物，以及從大豆等制得的其它天然制品如豆奶、豆?jié){、豆面醬，來自大豆或利馬豆等的胰蛋白酶抑制劑，這些也能通過該機(jī)制來減少吞噬作用。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，天然存在的組合物是豆奶或STI。絲氨酸蛋白酶抑制劑的其它來源例如包括，下列植物家族茄屬(如土豆、西紅柿、粘果酸漿(tomatilla)等)；禾本科(例如，水稻、蕎麥、高粱、小麥、大麥、燕麥等)；葫蘆科(如黃瓜、南瓜、葫蘆、絲瓜等)；以及較佳的豆科(如菜豆、豌豆、小扁豆、花生等)。
例如，制劑可以含有豆奶或從豆類或其它合適植物直接衍生獲得的其它液體制劑。在一個(gè)例子中，這種制劑含有大部分的豆奶、維持該豆奶物理穩(wěn)定性的乳化劑，以及任選的一種螯合劑、防腐劑、潤(rùn)膚劑、保濕劑和／或增稠劑或膠凝劑。
本組合物中特異性增加或減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑可以是本領(lǐng)域已知的任何類型的化合物。例子包括但不局限于，有機(jī)分子、無機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)、糖類、核酸分子、脂質(zhì)及其任何組合。例如，絲氨酸蛋白酶和PAR-2激動(dòng)劑可用來增加吞噬作用。胰蛋白酶、類胰蛋白酶和凝血酶抑制劑以及PAR-2拮抗劑可用來減少吞噬作用。
在增加吞噬作用的一個(gè)較佳實(shí)施方案中，制劑是SLIGRL、SAIGRL或SLIGKVD。在減少吞噬作用的較佳實(shí)施方案中，制劑是大豆衍生物(如豆奶、豆?jié){或STI)或化合物Ⅰ。化合物Ⅰ具有化學(xué)式(S)-N-甲基-D-苯基丙氨酰-N-[4-[(氨基亞氨基甲基)氨基]-1-(2-苯并噻唑基羰基)丁基]-L-脯氨酰胺(在Chemical Abstract中鑒定)，在結(jié)構(gòu)如下。 該化合物在美國(guó)專利5，523，308以及Costanzo，等人，J．Med．Chem．，1996，393039-3043中有所描述。美國(guó)專利5，523，308描述了作為絲氨酸蛋白酶抑制劑因而可用來減少吞噬作用和ICAM-1表達(dá)的有關(guān)化合物(例如具有d-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸基序的化合物)。與化合物Ⅰ有關(guān)的其它化合物在下文實(shí)施例中有詳細(xì)的描述。
本文所用的術(shù)語“哺乳動(dòng)物”指較高等脊椎動(dòng)物中的任何成員，其包括Webster′sMedical Desk Dictionary 407(1986)中定義的哺乳類，其包括但不局限于人、其它靈長(zhǎng)類、豬、狗和嚙齒類動(dòng)物(如免疫抑制的小鼠)。在本發(fā)明的較佳實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是人。
可用本發(fā)明治療或預(yù)防的疾病包括可通過增加或減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善(即對(duì)疾病本身和／或其次級(jí)效果有正效應(yīng))的任何疾病。在較佳的實(shí)施方案中，吞噬作用由PAR-2介導(dǎo)。這些疾病包括，但不局限于，免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、炎性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、皮膚病、物理性受傷、牙周病和呼吸道疾病。這些疾病例如還包括，不需要的受精作用，在一個(gè)實(shí)施方案中這可通過給予啟動(dòng)PAR-2通道的精蛋白酶頂體素抑制劑(即PAR-2抑制劑)來阻止(關(guān)于頂體素的討論見Fox等人，F(xiàn)EBS Lett 4173，267-9，1997)。
許多疾病具有多類疾病的特征。這些疾病例如包括，粘附疾病(adhesiondisorder)，它可分到皮膚病和免疫系統(tǒng)疾病的類別中。因此，本文所稱的術(shù)語特定類別(如皮膚疾病)的疾病指該疾病至少具有該類別的特征。然而，該疾病還可具有另一類別的特征。
增加免疫細(xì)胞攝食外來物質(zhì)如細(xì)菌和病毒的能力預(yù)計(jì)將會(huì)增強(qiáng)免疫反應(yīng)。例如，單核吞噬細(xì)胞在慢性微生物感染中沒有活性(Reiner，Immunol Today 158，374-81，1994)，將它們重新激活預(yù)計(jì)會(huì)治療該疾病?；蛘撸ㄟ^抑制吞噬作用可以改善免疫系統(tǒng)過度活潑的疾病。
可用本發(fā)明治療的免疫系統(tǒng)和炎性疾病的例子包括，AIDS、化療誘導(dǎo)的免疫缺陷癥、哮喘、由于接觸毒性物質(zhì)(如石棉或煙)的損傷、宿主排斥植入物和移植的組織，粘附疾病、輕度感染(如普通感冒)、嚴(yán)重的感染(如腦膜炎或“殺傷細(xì)菌”)、傷口(如感染性、糖尿病性、急性和慢性傷口)、再狹窄、囊性纖維化、肺氣腫、牙周病和尿布疹。
皮膚疾病包括不希望的色素沉著、不希望的脫色素、牛皮癬、皮疹和某些物理性皮膚不完善(例如皺紋)。在一個(gè)具體例子中，用黑色素(通過脂質(zhì)體或直接輸遞)和增加吞噬作用的制劑(例如 SLIGRL)一起治療白癲風(fēng)患者，以使亮斑變暗。或者，用化合物Ⅰ對(duì)其進(jìn)行治療，以使較深的部位變淺(見美國(guó)申請(qǐng)No．09／110，409，1998年7月6日提交)。在與皮膚疾病有關(guān)的一個(gè)例子中，用黑色素和增加吞噬作用的制劑(例如 SLIGRL)(理想的是在洗發(fā)水或乳膏中)處理灰色的頭發(fā)(直接輸送或通過脂質(zhì)體輸送)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括，但不局限于，Alzheimer′s疾病和其它老年性空斑疾病(通過上調(diào)淀粉樣原纖維的吞噬作用來治療)、憂郁癥、恐怖癥、和由苯并二氮雜草治療的繼發(fā)作用引起的其它疾病。
本發(fā)明方法中處理的哺乳動(dòng)物細(xì)胞宜為表達(dá)PAR-2的細(xì)胞，其包括但不局限于，角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和“專職的吞噬細(xì)胞”(即以吞噬作用作為主要功能的細(xì)胞)。專職的吞噬細(xì)胞例如包括，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞(例如郎氏細(xì)胞和枯否細(xì)胞)。在較佳的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
在本發(fā)明中，其中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)必定會(huì)因本發(fā)明組合物而改變的“合適的細(xì)胞”很容易根據(jù)待治療或預(yù)防的疾病的特征來確定。例如，如果受治療的疾病是色素沉著疾病，則需要改變吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的合適的細(xì)胞是角質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的方法涉及預(yù)防以及治療疾病。本文所用的術(shù)語“治療”疾病指減少疾病的進(jìn)展、中止疾病的進(jìn)展、中止或改善疾病的繼發(fā)作用、逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展、或較佳的治愈疾病。本文所用的“預(yù)防”疾病指減少、較佳的是消除疾病發(fā)生的可能性。
在本發(fā)明中，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法和輸藥系統(tǒng)來給予本發(fā)明的組合物。例如，可以通過靜脈內(nèi)、口服、通過植入、透粘膜、局部、透皮、肌內(nèi)、皮下和通過氣霧劑來給藥。另外，理想的是本發(fā)明的組合物含有一種或多種常規(guī)采用的藥學(xué)上或美容上可接受的載體。這些載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。下列采用了多種常用載體的輸藥系統(tǒng)僅僅代表性地描述了預(yù)期用來給予該組合物的許多實(shí)施方案。
透皮輸藥系統(tǒng)包括貼劑、凝膠、膠帶、洗液、肥皂、洗發(fā)劑和乳膏，并可含有賦形劑如增溶劑、滲透增強(qiáng)劑(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪族醇和氨基酸)、親水性聚合物(例如玻璃纖維增強(qiáng)聚碳酸酯塑料(polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮)、以及粘合劑和增粘劑(例如聚異丁烯、硅氧烷為基體的粘合劑、丙烯酸酯和聚丁烯)。
本發(fā)明的一些組合物(尤其是包含蛋白質(zhì)(如胰蛋白酶、類胰蛋白酶和STI)的那些組合物)的局部輸送可用脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)。脂質(zhì)體宜為非離子型。在一個(gè)例子中，它們含有(a)甘油二月桂酸酯；(b)具有膽固醇中所見類固醇骨架的化合物；和(c)具有12-18個(gè)碳原子的脂肪酸的醚，其中組成脂質(zhì)體的化合物之比約為37．512．533．316．7。包含甘油二月桂酸酯／膽固醇／聚氧乙烯-10-硬脂酰醚／聚氧乙烯-9-月桂酰醚(″GDL″脂質(zhì)體)是較佳的。在一個(gè)實(shí)施方案中，以組合物總體積計(jì)，脂質(zhì)體存在的量約為10毫克／毫升至100毫克／毫升，較佳的約為15毫克／毫升至50毫克／毫升。比例約為37．512．533．316．7是較佳的。制備脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域所熟知的，例如在Niemiec，等人，12Pharm．Res．1184-88(1995)中有所描述。
另外，為了進(jìn)行局部或透皮給藥，本發(fā)明的組合物可以和其它組分組合，這些組分例如是增濕劑、美容佐劑、抗氧化劑、漂白劑、酪氨酸酶抑制劑和其它已知的脫色素劑、α-羥基酸、表面活性劑、起泡劑、調(diào)節(jié)劑、保濕劑、芳香劑、增粘劑、緩沖劑、防腐劑、防曬劑等。本發(fā)明的組合物還可含有活性量的類視黃酸，例如包括維甲酸、視黃醇、維甲酸和／或視黃醇的酯等。
跨粘膜輸藥系統(tǒng)包括貼劑、片劑、栓劑、陰道栓劑、凝膠和乳膏，并可含有賦形劑如增溶劑和增強(qiáng)劑(例如丙二醇、膽汁鹽和氨基酸)，以及其它載體(如聚乙二醇、脂肪酸酯及其衍生物，以及親水性聚合物如羥丙基甲基纖維素和透明質(zhì)酸)。
可注射輸藥系統(tǒng)包括溶液、懸浮液、凝膠、微珠和可注射聚合物，并可包含賦形劑如改變?nèi)芙舛鹊脑噭?例如乙醇、丙二醇和蔗糖)以及聚合物(如聚己酸內(nèi)酯和PLGA′s)。用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)輸藥的系統(tǒng)例如包括，通過腦血管屏障的連接脂質(zhì)的衍生物(如DHA)。可植入的系統(tǒng)包括棒和圓片，并可含有賦形劑如PLGA和聚己酸內(nèi)酯。
口服輸藥系統(tǒng)包括片劑和膠囊劑。這些系統(tǒng)可含有賦形劑，如粘合劑(例如羥丙基甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，其它纖維素材料和淀粉)、稀釋劑(如乳糖和其它糖類、淀粉、磷酸二鈣和纖維素材料)、崩解劑(如淀粉聚合物和纖維素材料)以及潤(rùn)滑劑(如硬脂酸和滑石)。這些輸藥系統(tǒng)例如還包括，牙膏、漱口劑、錠劑和棒糖。
用于可重建輸藥系統(tǒng)的溶液、懸浮液和粉末包括載體，如懸浮劑(例如樹膠、黃原膠、纖維素和糖)、潤(rùn)濕劑(例如山梨糖醇)、增溶劑(例如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性劑(例如十二烷基硫酸鈉、絲盤、吐溫、和十六烷基吡啶)、防腐劑和抗氧化劑(例如對(duì)羥基苯甲酸酯、維生素E和C、抗壞血酸和天然的提取物)、抗結(jié)塊劑、涂覆劑和螯合劑(例如EDTA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的水包油乳劑、油包水乳劑、溶劑為基的制劑和水凝膠也可作為載體來輸送本發(fā)明的組合物。
確定給予人體該組合物的治療和預(yù)防有效劑量的方法是本領(lǐng)域已知的。例如這些有效劑量很容易從動(dòng)物研究的結(jié)果確定。
在一個(gè)例子中，將本發(fā)明組合物施加到皮膚表面上，從而使得在希望改變吞噬作用時(shí)有約2至200微升／平方厘米的改變吞噬作用的試劑存在(以每平方厘米的皮膚表面計(jì))。當(dāng)在制劑中采用凝血酶和胰蛋白酶抑制劑(如化合物Ⅰ或其類似物)(無論是合成的還是天然存在的)時(shí)，該活性化合物存在的量為組合物重量／體積的大約0．0001％至15％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其存在的量約為組合物的0．0005％至5％。較佳的，其存在的量約為組合物的0．001至1％。
在另一個(gè)例子中，從植物或植物來源直接制得的液體衍生物和天然提取物在本組合物中采用的濃度(w／v)約為1至99％，較佳的約75至95％。在還有一個(gè)實(shí)施例中，天然提取物以及用天然方法衍生的蛋白酶抑制劑(如STI)部分的濃度范圍約為0．01-20％，較佳的約為組合物的1％-10％。
本發(fā)明還提供了用于給予哺乳動(dòng)物本發(fā)明組合物的生產(chǎn)制品，它包含一個(gè)固體輸送工具，該工具中操作性地(即可輸送地)附有該組合物。該固體輸送工具可以是任何裝置，該裝置被設(shè)計(jì)成臨時(shí)或永久性地接觸身體，無論其最初目的是否用作輸送工具。該生產(chǎn)制品的例子包括，但不局限于，涂敷的繃帶或其它處理傷口的傷口敷料，用來預(yù)防或促進(jìn)組織生長(zhǎng)的涂敷身體植入物(包括具有涂敷的內(nèi)部搭架的植入物)，以及用來預(yù)防再狹窄的氣球?qū)Ч?balloon catheter)和斯坦特固定模。
最后，本發(fā)明提供了一種給予哺乳動(dòng)物治療、預(yù)防或美容化合物的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物(a)化合物和(b)一種組合物，該組合物包含藥學(xué)或美容載體以及一種特異性增加吞噬作用的制劑，其用量足以增加需要吸收該化合物的細(xì)胞中的吞噬作用，其中組合物的給予在給予化合物之前和／或同時(shí)進(jìn)行。
該藥物化合物例如可以是多肽、蛋白質(zhì)或核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物化合物和組合物通過顯微級(jí)多孔的生物可降解的珠粒來一同給予，該珠粒被合適細(xì)胞的吞噬作用攝入后釋放出藥物化合物。
在閱讀了下面的實(shí)施例后，將能更好地了解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅僅描述了本發(fā)明，更全面的描述在下文的權(quán)利要求中。另外，整個(gè)申請(qǐng)中引用了各種文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均被納入本申請(qǐng)作為參考，以更全面地描述本發(fā)明所述領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)水平。
實(shí)施例實(shí)施例1SLIGRL、STI和化合物Ⅰ影響角質(zhì)細(xì)胞吞噬作用為了研究PAR-2通道在吞噬作用中的作用，采用了幾個(gè)體外模型系統(tǒng)。所用的一種系統(tǒng)含有原代人角質(zhì)細(xì)胞或人角質(zhì)細(xì)胞系。在本實(shí)施例和下文許多實(shí)施例中，用測(cè)試化合物處理細(xì)胞不同時(shí)間(從1小時(shí)至3天)，然后使樣品和熒光微珠一起培育2小時(shí)。用熒光顯微鏡拍攝被細(xì)胞攝入的珠粒。
在本實(shí)施例中，體外模型系統(tǒng)采用人原代角質(zhì)細(xì)胞或人角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT來研究PAR-2調(diào)節(jié)劑對(duì)角質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響。所用的人原代角質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自Clonetics(San Diego，CA)。將細(xì)胞涂布到分室玻片上，每個(gè)玻片上2個(gè)室，每個(gè)室有60000個(gè)細(xì)胞。每天用化合物I(1微摩爾)、SLIGRL(10微摩爾)或載體(磷酸緩沖鹽溶液，(″PBS″)，購(gòu)自Gibco-BRL(Gaithersburg，MD))處理細(xì)胞1次，持續(xù)2或3天。暴露于測(cè)試化合物2或3天后，使細(xì)胞接觸尼羅紅或FITC熒光微珠(直徑為1微米，每個(gè)細(xì)胞50個(gè)微珠，37℃下2小時(shí))。微珠購(gòu)自Molecular Probes(Eugene，OR)，根據(jù)生產(chǎn)商說明書進(jìn)行加工。在該處理后，用15％胎牛血清(“FBS”，購(gòu)自Gibco-BRL)37℃培育細(xì)胞15分鐘后，用-PBS沖洗。此時(shí)，將室與玻片分開，用甘油和蓋玻片覆蓋玻片。用Zeiss Axiovert35或Nikon Optiphot-2顯微鏡進(jìn)行熒光鏡檢。
圖1顯示了經(jīng)載體(對(duì)照)、化合物Ⅰ或SLIGRL處理2天后的人原代角質(zhì)細(xì)胞的三個(gè)圖片。從該圖中可以看出，微珠被對(duì)照角質(zhì)細(xì)胞攝入，并分散在細(xì)胞核周圍。發(fā)現(xiàn)微珠還在細(xì)胞的周圍，這可能是因?yàn)樗鼈兣c細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)組分非特異性地連接的緣故。被攝入的微珠的量隨處理的不同而變化。用化合物Ⅰ(PAR-2激活的抑制劑)處理，結(jié)果導(dǎo)致被攝入的微珠數(shù)量大幅度減少。用SLIGRL(PAR-2激活性肽)處理，結(jié)果導(dǎo)致被攝入的微珠數(shù)量大幅度增加。
當(dāng)用人角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT代替原代角質(zhì)細(xì)胞后，也獲得了相同的結(jié)果(見圖2)。測(cè)試SLIGRL、STI和化合物Ⅰ對(duì)角質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響。在這些試驗(yàn)中，微珠的胞外積累可以被清除。唯一可見的顆粒是被角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化的微珠，它們堆積在細(xì)胞核周圍。在本實(shí)驗(yàn)中，大豆胰蛋白酶抑制劑(″STI″)(一種能影響PAR-2通道的絲氨酸蛋白酶抑制劑)以及化合物Ⅰ顯示出減少了微珠的攝入。另一方面，SLIGRL的處理導(dǎo)致微珠攝入增加。這些實(shí)驗(yàn)每個(gè)均重復(fù)至少三次。這些實(shí)驗(yàn)首次表明，角質(zhì)細(xì)胞具有PAR-2-介導(dǎo)的吞噬能力。這些實(shí)驗(yàn)還證明調(diào)節(jié)PAR-2通道的化合物能調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的水平。
當(dāng)用不表達(dá)PAR-2的黑色素細(xì)胞重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)時(shí)，SLIGRL對(duì)微珠攝入沒有可誘導(dǎo)的效果。黑色素細(xì)胞在上述任一種情況下均不攝入珠粒。由于SLIGRL僅僅激活PAR-2，而黑色素細(xì)胞不表達(dá)PAR-2，因此這些細(xì)胞對(duì)SLIGRL信號(hào)沒有反應(yīng)，從而不會(huì)影響吞噬作用。
實(shí)施例2SLIGRL和化合物Ⅰ影響成纖維細(xì)胞的吞噬作用用成纖維細(xì)胞細(xì)胞系92-3T3(從Rockville，MD的ATCC獲得)重復(fù)實(shí)施例1所述的實(shí)驗(yàn)。不知道成纖維細(xì)胞具有吞噬能力。實(shí)際上，用未經(jīng)處理的成纖維細(xì)胞觀察到只有極少的珠粒被攝入。然而，SLIGRL-處理的成纖維細(xì)胞增加了攝入珠粒的數(shù)目(圖3)。SLIGRL-誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞吞噬作用在量上與角質(zhì)細(xì)胞不同，因?yàn)槌衫w維細(xì)胞在體內(nèi)不擔(dān)任吞噬的任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)首次表明，成纖維細(xì)胞具有可誘導(dǎo)的PAR-2吞噬能力。換句話說，本實(shí)驗(yàn)證明調(diào)節(jié)PAR-2通道的化合物能調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的吞噬作用水平。
實(shí)施例3SLIGRL，STI和化合物Ⅰ影響巨噬細(xì)胞的吞噬作用用與和腹膜巨噬細(xì)胞共有吞噬特征的巨噬細(xì)胞系IC-21(從ATCC獲得)重復(fù)實(shí)施例1所述的實(shí)驗(yàn)。如角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞所顯示的那樣，化合物Ⅰ和STI減少了作為“專職的吞噬”細(xì)胞的這些巨噬細(xì)胞攝入的微珠數(shù)目，而SLIGRL則增加了該數(shù)目。
為了更好地定量測(cè)定吞噬作用的水平，采用Molecular Probes(Eugene，Oregon)的″VybrantTM吞噬作用測(cè)定試劑盒″，按照生產(chǎn)商說明書，修改IC-21細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)條件。該試劑盒采用熒光素標(biāo)記的大腸桿菌K-12顆粒，經(jīng)過設(shè)計(jì)可用來定量測(cè)定藥物或其它環(huán)境因素對(duì)吞噬功能的影響。用100nM化合物Ⅰ、5μM SLIGRL或0．1毫克／毫升STI(均溶于PBS中)處理巨噬細(xì)胞過夜。表1中記錄了經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞攝入熒光大腸桿菌的能力(經(jīng)該試劑盒測(cè)得)。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)三次。表1代表一個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
表1
本實(shí)驗(yàn)證明巨噬細(xì)胞的吞噬作用可通過PAR-2通道的調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)還表明，合成的化合物以及天然衍生的化合物均可通過PAR-2通道調(diào)節(jié)吞噬作用。
實(shí)施例4PAR-2信號(hào)傳導(dǎo)和巨噬細(xì)胞吞噬作用之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系為了確認(rèn)巨噬細(xì)胞-吞噬作用試驗(yàn)的定量特征，進(jìn)行劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。用0、0．01、0．1和1毫克／毫升的STI處理巨噬細(xì)胞，如實(shí)施例3所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖4A表明，觀察到有隨STI濃度增加吞噬作用減少的劑量-反應(yīng)關(guān)系。0．01、0．1和1nm的化合物Ⅰ獲得了相似的結(jié)果，而SLIGRL的處理卻導(dǎo)致吞噬作用增加(圖4B)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。本實(shí)驗(yàn)證明PAR-2-調(diào)節(jié)性化合物的吞噬效果是是劑量-反應(yīng)性的，可定量測(cè)定。
實(shí)施例5PAR-2信號(hào)傳導(dǎo)和角質(zhì)細(xì)胞吞噬作用之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系用濃度增加的SLIGRL(PAR-2肽激活劑和激動(dòng)劑)在0、5和10μM下以實(shí)施例1所述相同方式處理人角質(zhì)細(xì)胞2天。增加SLIGRL的濃度導(dǎo)致吞噬作用增加。另用濃度增加的化合物Ⅰ和STI處理人角質(zhì)細(xì)胞2天。濃度增加的化合物Ⅰ(從1pM到1μM)或STI(從0．01到1毫克／毫升)的處理結(jié)果導(dǎo)致吞噬作用呈劑量依賴型減少(見表2)。
用對(duì)角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的熒光珠粒進(jìn)行圖象分析作為定量測(cè)定該系統(tǒng)中吞噬效果的另一種方式。在Gateway 2000 P5-100計(jì)算機(jī)(Media Cybemetics，Silver Springs，MD)上用Empire Imagins Database 1．1版捕獲圖象。用Image Pro Plus 1．3版進(jìn)行測(cè)定，用Microsoft Excel 5．0版處理數(shù)據(jù)。該角質(zhì)細(xì)胞-微珠系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)與巨噬細(xì)胞／大腸桿菌系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)完全符合。
表2處理攝入％未處理 100+／-12STI，0．01％76+／-15STI，0．1％ 55+／-14STI，1％41．6+／-11實(shí)施例6化合物Ⅰ、SLIGRL和STI影響角質(zhì)細(xì)胞捕獲色素本實(shí)施例測(cè)試了角質(zhì)細(xì)胞在體外捕獲黑色素或黑色素體的能力，從而可作為皮膚中黑色素體吸收的一個(gè)簡(jiǎn)單化的系統(tǒng)。如上所述，將角質(zhì)細(xì)胞接種到玻璃分室玻片上，用SLIGRL、化合物Ⅰ或STI處理2天。此時(shí)，將黑色素粉末(購(gòu)自Sigma，St．Louis，MO)混入無菌PBS成10微克／毫升，加入培養(yǎng)基(1∶10稀釋)中放置2小時(shí)。然后用PBS洗滌細(xì)胞，用Fontana-Mason(″F&M″)染色。F&M使還原的硝酸銀分子染色，從而能鑒定角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的黑色素。如圖5A所示，未處理的角質(zhì)細(xì)胞能從培養(yǎng)基中攝入黑色素，使內(nèi)化的黑色素局限在其細(xì)胞核周圍。因此，該系統(tǒng)可模擬體內(nèi)的黑色素體轉(zhuǎn)移和黑色素分布，因?yàn)槠つw角質(zhì)細(xì)胞用黑色素作為其細(xì)胞核的UV保護(hù)性罩子。如實(shí)施例1、圖1和2所證實(shí)的，攝入的微珠也觀察到有該遮罩方式。圖5A還顯示了打開PAR-2通道的SLIGRL處理大幅度地增加了黑色素的內(nèi)化及其在細(xì)胞核周圍的沉積。相反，化合物Ⅰ和STI卻大幅度地減少了角質(zhì)細(xì)胞對(duì)黑色素的吸收。本實(shí)施例證明了合成和天然來源的PAR-2調(diào)節(jié)劑能影響表皮細(xì)胞中的色素分布。用S．Orlow等人，J．I．D．10055-64(1993)所述分離的黑色素體也觀察到相同的結(jié)果(圖5B)。
實(shí)施例7細(xì)胞-細(xì)胞接觸是化合物Ⅰ影響色素從黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角質(zhì)細(xì)胞所必需的。
由于PAR-2在角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而不在黑色素細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，因此測(cè)試化合物Ⅰ和SLIGRL對(duì)于角質(zhì)細(xì)胞的黑色素體吞噬作用的影響可能需要角質(zhì)細(xì)胞-黑色素細(xì)胞接觸。在表皮等效物(equivalent)(EpiDerm，MatTek，Ashland，MA)下涂布原代黑色素細(xì)胞培養(yǎng)物(購(gòu)自Clonetics，San Diego)，產(chǎn)生等效的單層共培養(yǎng)物，使角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞之間沒有接觸。將這些共培養(yǎng)物與MalanoDerm等效物(MatTek，其中黑色素細(xì)胞存在于等效物的基底層中)相比。用化合物Ⅰ、PAR-2激動(dòng)劑TFLLRNPNDK和PAR-2激動(dòng)劑SLIGRL處理培養(yǎng)物。在表3中，角質(zhì)細(xì)胞用“K”表示，黑色素細(xì)胞用“M”表示，黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞之間沒有接觸用″沒有K-M接觸″表示。如表3所示，當(dāng)以色素沉著水平測(cè)定時(shí)，經(jīng)這些制劑處理的等效物-單層共培養(yǎng)物(角質(zhì)細(xì)胞與黑色素細(xì)胞沒有接觸)中沒有觀察到對(duì)黑色素體轉(zhuǎn)移的效果。在含有黑色素細(xì)胞的等效物中，化合物Ⅰ和SLIGRL通過影響黑色素體的轉(zhuǎn)移分別減少和誘導(dǎo)了色素沉著。用角質(zhì)細(xì)胞與黑色素細(xì)胞接觸的單層角質(zhì)細(xì)胞／黑色素細(xì)胞共培養(yǎng)物也觀察到有相同的結(jié)果。這些結(jié)果證明角質(zhì)細(xì)胞-黑色素細(xì)胞的接觸是對(duì)黑色素體吞噬作用的PAR-2效果所需的。
表3
實(shí)施例8化合物Ⅰ和SLIGRL對(duì)吞噬作用的效果的時(shí)間用化合物Ⅰ或SLIGRL處理人角質(zhì)細(xì)胞一定時(shí)間(從1小時(shí)至2天)。在處理期最后，如實(shí)施例1所述用微珠處理細(xì)胞。表4顯示了這些化合物影響吞噬作用所需的時(shí)間。加號(hào)表示對(duì)吞噬作用有影響，減號(hào)表示對(duì)吞噬作用沒有影響，加號(hào)／減號(hào)表示對(duì)吞噬作用或多或少有影響。測(cè)得的效果是化合物Ⅰ為減少，SLIGRL為增加。本實(shí)驗(yàn)表明，在激活或抑制PAR-2信號(hào)傳導(dǎo)通道后，要改變角質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力至少需要8小時(shí)。這暗示，PAR-2信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致合成新的蛋白質(zhì)，在需要周轉(zhuǎn)時(shí)間來消除已有的相關(guān)蛋白時(shí)減少蛋白質(zhì)的合成，或重排蛋白質(zhì)(在細(xì)胞骨架組分重新組織時(shí)發(fā)生)。
表4處理時(shí)間化合物ⅠSLIGRL1小時(shí)--2小時(shí)--4小時(shí)--6小時(shí)--8小時(shí)-／+ -／+16小時(shí) ++24小時(shí) ++48小時(shí) ++實(shí)施例9化合物Ⅰ、STI和SLIGRL影響ICAM-1的胞內(nèi)表達(dá)和定位胞間粘附分子-1(ICAM-1)是一種可誘導(dǎo)的細(xì)胞表面糖蛋白，它參與了細(xì)胞-細(xì)胞的粘附、細(xì)胞膜的抽取(raffling)和吞噬作用。因此，測(cè)試了PAR-2對(duì)ICAM-1調(diào)節(jié)的效果。如上所述，使角質(zhì)細(xì)胞在分室玻片上生長(zhǎng)，用SLIGRL、化合物Ⅰ和STI處理，然后用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)CAM-1進(jìn)行免疫熒光染色。從Jackson ImmunoresearchLaboratory(Westgrove，PA)獲得正常的驢血清(以1∶5稀釋使用)。從R&DSystems(Minneapolis，MN)獲得多克隆山羊抗人ICAM-1抗體，(以1∶200稀釋使用)從Jackson Immunoresearch Laboratory獲得FITC偶聯(lián)的驢抗山羊抗體。如圖6A所示，ICAM-1的胞內(nèi)定位可通過PAR-2通道來調(diào)節(jié)。在未經(jīng)處理的角質(zhì)細(xì)胞中，ICAM-1主要定位于質(zhì)膜處，在細(xì)胞核膜處有一些染色。在經(jīng)化合物Ⅰ或STI處理后，在胞質(zhì)膜處觀察到的染色較少，而更多的在細(xì)胞核膜處。SLIGRL處理具有相反的效果，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜染色增加并更加擴(kuò)散，而細(xì)胞核膜染色減少。
根據(jù)已知的方法進(jìn)行免疫沉淀和Western印跡實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)在經(jīng)處理的角質(zhì)細(xì)胞中ICAM-1蛋白質(zhì)的水平。如圖6B所示，SLIGRL增加了這些細(xì)胞中的ICAM-1表達(dá)水平，而化合物Ⅰ減少了ICAM-1的表達(dá)水平。
實(shí)施例10STI和化合物Ⅰ影響趨化細(xì)胞的遷移由于ICAM-1涉及細(xì)胞遷移，因此在經(jīng)化合物Ⅰ和STI處理的細(xì)胞中研究朝向趨化肽的細(xì)胞遷移。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將人PMN細(xì)胞置于Boyden室的一側(cè)，將趨化肽(FMLP)置于另一個(gè)室內(nèi)。使該細(xì)胞向第二個(gè)室遷移，計(jì)算每個(gè)遷移區(qū)和遷移距離的遷移細(xì)胞數(shù)目。用經(jīng)下列物質(zhì)之一預(yù)處理的PMN細(xì)胞重復(fù)該實(shí)驗(yàn)5或0．5毫克／毫升STI、1或0．1微摩爾化合物Ⅰ、緩沖液載體、以及具有和不具有趨化肽。測(cè)定每個(gè)區(qū)內(nèi)與未處理細(xì)胞遷移相同距離的細(xì)胞數(shù)目。這些數(shù)據(jù)歸納在表5中。沒有肽和未經(jīng)處理時(shí)，每個(gè)區(qū)平均有19個(gè)細(xì)胞遷移了80微米。加入趨化肽后，導(dǎo)致每個(gè)區(qū)有41個(gè)細(xì)胞遷移115微米。兩種化合物均完全抑制細(xì)胞向此肽的遷移。換句話說，在115微米處沒有鑒定出細(xì)胞(或每個(gè)區(qū)少于5個(gè))。這表明，這些抑制劑不僅影響吞噬作用，還影響細(xì)胞遷移。抑制PMN遷移的能力是抗炎性化合物的一個(gè)重要的組成部分。
表5處理每個(gè)區(qū)的細(xì)胞 遷移緩沖液 19 80μFMLP41 115FMLP+化合物Ⅰ ＜5115FMLP+STI＜5115實(shí)施例11SLIGRL和STI影響人皮膚色素沉著用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將人白色臉部皮膚樣品移植到免疫抑制的小鼠上。大約6周后，用載體(乙醇∶丙二醇70∶30)或50μM SLIGRL處理來自同一個(gè)體、移植到不同小鼠上的移植物。每天進(jìn)行處理，1周5天。在治療的最后一周用肉眼觀察到SLIGRL處理的移植物變黑(見圖7A)。在第66天，處死動(dòng)物，對(duì)其皮膚進(jìn)行組織學(xué)分析。F&M染色的切片揭示SLIGRL處理的移植物中黑色素有所增加，如圖7B所示。本實(shí)驗(yàn)證明了在人皮膚上用SLIGRL能誘導(dǎo)無日光的曬黑。
用移植到免疫抑制的小鼠上的黑色人乳房皮膚樣品重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)。用載體(GDL脂質(zhì)體)或1％STI處理同一個(gè)體的移植物。GDL脂質(zhì)體如Niemiec等人，所述的那樣制備，只是作下列改變非離子性脂質(zhì)體配方含有二月桂酸甘油酯(EmulsyntGDL，ISP Van Dyk)／膽固醇(Croda)／聚氧乙烯-10硬脂酰醚(Brij76，ICI)／聚氧乙烯-9-月桂酰醚，比例為37．512．533．316．7。在制備脂質(zhì)體時(shí)，用Hepes緩沖液，0．05M，pH7．4(Gibco-BRL of Gaithersburg，MD)作為水相。圖7C顯示了這些移植物的F&M-染色的皮膚切片。該圖清楚地證明了STI減少人皮膚內(nèi)色素沉著的能力。
實(shí)施例12PAR-2對(duì)吞噬作用和遷移的效果與細(xì)胞形狀的變化有關(guān)吞噬作用和細(xì)胞遷移均涉及細(xì)胞形狀的變化。因此，用掃描電子顯微術(shù)研究PAR-2通道制劑對(duì)細(xì)胞足(cell podia)的影響。用化合物Ⅰ(鑒定為“SH00230”)、SLIGRL和緩沖液載體處理角質(zhì)細(xì)胞2天，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行SEM。如圖8所示，觀察到細(xì)胞足的形狀有很大變化。與載體處理的對(duì)照相比，經(jīng)化合物Ⅰ處理的細(xì)胞具有非常短的足。換句話說，細(xì)胞的“手指”較短，呈畸形，因此它們不能象對(duì)照細(xì)胞那樣抓住物體。經(jīng)SLIGRL處理的樣品表現(xiàn)出相反的作用。它們的足的數(shù)目增加，一定程度上較長(zhǎng)，并且細(xì)得多。換句話說，這些細(xì)胞更可能與顆粒發(fā)生生產(chǎn)性相互作用。比較圖8中的SEM圖片，顯然SLIGRL-處理的細(xì)胞更能與顆粒相互作用，而化合物I處理的細(xì)胞較不適合這個(gè)任務(wù)。
實(shí)施例13PAR-2影響細(xì)胞骨架的組成圖8中所示的細(xì)胞形狀的變化需要重新組織細(xì)胞骨架組分。因此，測(cè)試在PAR-2調(diào)節(jié)后的F-肌動(dòng)蛋白絲的組織。如實(shí)施例1所述，用化合物Ⅰ(10nM)、STI(0．1毫克／毫升)或SLIGRL(5μM)處理角質(zhì)細(xì)胞，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)F-肌動(dòng)蛋白染色。圖9顯示出在這些處理后肌動(dòng)蛋白絲的組織有很大的變化。SLIGRL處理誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合在細(xì)胞皮質(zhì)周圍，該區(qū)域在控制細(xì)胞移動(dòng)和吞噬作用中非常重要。相反，STI和化合物Ⅰ減少了細(xì)胞皮質(zhì)的有序組織，從而減少了細(xì)胞調(diào)節(jié)其移動(dòng)和足的能力。
實(shí)施例14ICAM-1調(diào)節(jié)影響角質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用如實(shí)施例1所述，使角質(zhì)細(xì)胞暴露于熒光微珠(即珠粒)。用50微克／毫升的小鼠抗人ICAM-1抗體(購(gòu)自R&D Systems)預(yù)處理這些細(xì)胞16小時(shí)，然后在與珠粒一起培育前4小時(shí)再次強(qiáng)化。如圖10所示，封閉角質(zhì)細(xì)胞表面上的ICAM-1分子導(dǎo)致珠粒的攝入減少。因此，本實(shí)驗(yàn)在ICAM-1和角質(zhì)細(xì)胞吞噬作用之間建立一個(gè)關(guān)系。
實(shí)施例15STI／脂質(zhì)體配方能使人老年斑變淺如下所述，處理手背上有三個(gè)老年斑的個(gè)體8周，每天2次。用含有20毫克／毫升脂質(zhì)體的安慰劑處理最靠近身體的老年斑。中間的老年斑不作處理。最遠(yuǎn)的老年斑用STI(1％，在脂質(zhì)體中(20毫克／毫升))處理。如Niemiec等人所述的那樣制備GDL脂質(zhì)體，只是作下列改動(dòng)。非離子性脂質(zhì)體配方含有二月桂酸甘油酯(EmulsyntGDL，ISP Van Dyk)／膽固醇(Croda)／聚氧乙烯-10硬脂酰醚(Brij76，ICI)／聚氧乙烯-9-月桂酰醚，比例為37．512．533．316．7。在制備脂質(zhì)體時(shí)，用Hepes緩沖液，0．05M，pH 7．4(Gibco-BRL of Gaithersburg，MD)作為水相。在治療的第0、4和8周拍攝UV和可見光數(shù)字圖片。用Adobe Photoshop計(jì)算圖象的L*值(亮度)。
如圖11所示，在處理8周后，經(jīng)STI處理的老年斑顏色變淺。圖11顯示了一組四幅圖片。左側(cè)是手在處理前(上圖)和處理8周后(下圖)的可見光圖片。在方向是，最靠近身體的老年斑用安慰劑處理，中間的老年斑未作處理，最遠(yuǎn)的老年斑用STI處理。右圖顯示了用UV照相術(shù)在同一時(shí)間拍攝的同一個(gè)手的圖片。UV光能使皮膚中較深的色素顯示出來，這表明STI的增白效果并不在表面。圖11明顯證明STI配方使遠(yuǎn)端的老年斑變淺。從此STI處理過的斑點(diǎn)計(jì)算出L*單位增加15個(gè)單位，這進(jìn)一步證實(shí)該處理具有使老年斑變淺的能力。
實(shí)施例16與化合物Ⅰ類似的減少吞噬作用的化合物某些化合物，及其藥學(xué)上可接受的鹽，例如在Costanzo等人，″探測(cè)S1′亞基的強(qiáng)效的凝血酶抑制劑基于雜環(huán)-激活的羰基基團(tuán)的三肽過渡態(tài)類似物″，J．Med．Chem．，1996，Vol．39，3039-3043頁中所述的那樣，可作為絲氨酸蛋白酶抑制劑(即吞噬作用抑制劑)，并具有下列結(jié)構(gòu)式 其中A選自C1-8烷基，羧基C1-4烷基，C1-4烷氧羰基C1-4烷基，苯基C1-4烷基，取代的苯基C1-4烷基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、甲?；1-4烷氧羰基、C1-2烷基羰基、苯基C1-4烷氧羰基、C3-7環(huán)烷羰基、苯基羰基、取代的苯基羰基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、C1-4烷磺?；?、C1-4烷氧基磺酰基、全氟C1-4烷基-磺酰基、苯磺酰基、取代的苯磺酰基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、10-樟腦磺?；?、苯基C1-4烷磺?；?、取代的苯基C1-4烷磺酰基、C1-4烷基亞磺?；⑷鶦1-4烷基亞磺?；?、苯基亞磺?；⑷〈谋交鶃喕酋；?其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、苯基C1-4烷基亞磺?；?、取代的苯基C1-4烷基亞磺?；?-萘基磺?；?-萘基磺?；蛉〈妮粱酋；?其中萘基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、1-萘基亞磺?；?-萘基亞磺?；蛉〈妮粱鶃喕酋；?其中萘基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)；一種D型或L型氨基酸，氨基酸的羧基端與上述結(jié)構(gòu)所示的氮相連，該氨基酸選自丙氨酸、天冬酰胺、2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、甘氨酸、N-C1-8烷基甘氨酸、脯氨酸、1-氨基-1-環(huán)C3-8烷基羧酸、噻唑烷-4-羧酸、5，5-二甲基噻唑烷-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、2-哌啶酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、叔-亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、[1，2，3，4]-四氫異喹啉-1-羧酸和[1，2，3，4]-四氫異喹啉-2-羧酸，其中所述氨基酸的氨基端與一種物質(zhì)相連，該物質(zhì)選自下列C1-4烷基、四唑-5-基-C1-2烷基、羧基C1-4烷基，C1-4烷氧羰基C1-4烷基，苯基C1-4烷基，取代的苯基C1-4烷基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、1，1-二苯基C1-4烷基、3-苯基-2-羥基丙酰基、2，2-二苯基-1-羥乙基羰基、[1，2，3，4]-四氫異喹啉-1-羰基、[1，2，3，4]-四氫異喹啉-3-羰基、1-甲氨基-1-環(huán)己烷羰基、1-羥基-1-環(huán)己烷羰基、1-羥基-1-苯乙?；?、1-環(huán)己基-1-羥基乙?；?-苯基-2-羥基丙?；?，3-二苯基-2-羥基丙酰基、3-環(huán)己基-2-羥基丙酰基、甲?；?、C1-4烷氧羰基、C1-12烷基羰基、全氟C1-4烷基、C1-4烷基羰基、苯基C1-4烷基羰基、取代的苯基C1-4烷基羰基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、1，1-二苯基C1-4烷基羰基、取代的1，1-二苯基C1-4烷基羰基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、全氟C1-4烷磺?；1-4烷磺?；1-4烷氧基磺?；⒈交酋；⑷〈谋交酋；?其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C-1烷基、全氟C1-4烷基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、10-樟腦磺?；?、苯基C1-4烷磺?；⑷〈谋交鵆1-4烷磺?；⑷鶦1-4烷基亞磺?；?、C1-4烷基亞磺酰基、苯基亞磺?；?、取代的苯基亞磺酰基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、1-萘基磺?；?、1，2-萘基磺?；⑷〈妮粱酋；?其中萘基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、1-萘基亞磺酰基、2-萘基亞磺酰基和取代的萘基亞磺?；?其中萘基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)；或包含兩個(gè)氨基酸的多肽，其中第一個(gè)氨基酸是D型或L型氨基酸，它通過其羧基端與式Ⅰ所示的氮相連，該氨基酸選自甘氨酸、N-C1-8烷基甘氨酸、丙氨酸、2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、噻唑烷-4-羧酸、5，5-二甲基噻唑烷-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、1-氨基1-環(huán)C3-8烷基羧酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、3-(C1-4烷氧基)脯氨酸、4(C1-4烷氧基)脯氨酸、3，4-二氫脯氨酸、2，2-二甲基-4-噻唑烷羧酸、2，2-二甲基-4-噁唑烷羧酸、2-哌啶酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、叔-亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、[1，2，3，4]-四氫異喹啉-2-羧酸、天冬氨酸-4-C1-4烷酯以及谷氨酸5-C1-4烷酯和其中第二個(gè)D型或L型氨基酸與所述第一個(gè)氨基酸的氨基端相連，它選自苯丙氨酸、4-苯甲酰苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-(羧基C1-2烷基)苯丙氨酸、取代的苯丙氨酸(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-二苯基丙氨酸、高(homo)苯丙氨酸、八氫吲哚-2-羧酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-噻唑基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、3-三-C1-4烷基甲硅烷基丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸、二苯基甘氨酸、苯基甘氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、2，2-二環(huán)己基丙氨酸、2-(1-萘基丙氨酸)、2-(2-萘基丙氨酸)、苯基取代的苯丙氨酸(其中取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C1-4烷酯、谷氨酸、谷氨酸-5-C1-4烷酯、環(huán)C3-8烷基丙氨酸、取代的環(huán)C3-8烷基丙氨酸(其中環(huán)取代基是羧基、C1-4烷酯、環(huán)C3-8烷基丙氨酸、取代的環(huán)C3-8烷基丙氨酸(其中環(huán)取代基為羧基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧羰基或氨基羰基)、2，2-二苯基丙氨酸及其所有氨基酸衍生物的所有的α-C1-5烷基，以及其中所述第二個(gè)氨基酸的氨基端沒有被取代或被選自下列物質(zhì)的一個(gè)成員單取代甲?；?、C1-12烷基、四唑-5-基-C1-2烷基、羧基C1-8烷基，烷氧羰基C1-4烷基，苯基C1-4烷基，取代的苯基C1-4烷基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、1，1-二苯基C1-4烷基、C1-6烷氧羰基、苯基C1-6烷氧羰基、C1-2烷基羰基、全氟C1-4烷基羰基、C1-4烷基羰基、苯基C1-4烷基羰基、取代的苯基C1-4烷基羰基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、1，1-二苯基C1-4烷基羰基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧羰基、10-樟腦磺?；⒈交鵆1-4烷磺?；?、取代的苯基C1-4烷磺?；?、C1-4烷基亞磺?；?、全氟C1-4烷基亞磺?；?、苯基亞磺?；?、取代的苯基亞磺酰基(其中苯基取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、苯基C1-4烷基亞磺?；⑷〈谋交鵆1-4烷基亞磺?；?、1-萘基磺?；?、2-萘基磺?；?、取代的萘基磺酰基(其中萘基取代基選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、1-萘基亞磺?；?、2-萘基亞磺酰基和取代的萘基亞磺?；?其中萘基取代基選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)；R1選自氫和烷基；R2選自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基C2-5烷基、苯基、取代的苯基(其中取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)氨基、脒基、胍基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基)、芐基、苯基取代的芐基(其中取代基獨(dú)立選自下列基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)氨基、脒基、胍基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基)、羥基C2-5烷基、C1-5烷氨基C2-5烷基、C1-5二烷氨基C2-5烷基、4-氨基環(huán)己基C0-2烷基和C1-5烷基p是0或1；B是 其中n是0-3，R3是H或C1-5烷基，B的羰基部分與E相連；E是一個(gè)雜環(huán)，它選白噁唑啉-2-基、噁唑-2-基、噻唑-2-基、噻唑-5-基、噻唑-4-基、噻唑啉-2-基、咪唑-2-基、4-氧代-2-喹喔啉-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、苯并[b]噻吩-2-基、三唑-4-基、三唑-6-基、吡唑-2-基、4，5，6，7-四氫苯并噻唑-2-基、萘并[2，1-d]噻唑-2-基、萘并[1-2-d]噻唑-2-基喹喔啉-2-基、異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、苯并[b]呋喃-2-基、吡嗪-2-基、喹唑啉-2-基、異噻唑-5-基、異噻唑-3-基、嘌呤-8-基和取代的雜環(huán)，其中取代基選白C1-4，全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基、C1-4烷氧羰基、羥基、或苯基C1-4烷氨基羰基、吲哚-2-基、苯并噁唑-2-基、苯并咪唑-2-基和苯并噻唑-2-基。
權(quán)利要求
1．一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的組合物，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)治療有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體。
2．一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的組合物，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)治療有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體。
3．一種用于預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的組合物，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)預(yù)防有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體。
4．一種用于預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的組合物，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該組合物包括(a)預(yù)防有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑，和(b)藥學(xué)上或美容上可接受的載體。
5．根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的組合物，其中該組合物包含激活PAR-2通道的制劑。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中該組合物包含選自SLIGRL、SAIGRL、SLIGKVD和絲氨酸蛋白酶的制劑。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中該制劑選自SLIGRL、胰蛋白酶、凝血酶和類胰蛋白酶。
8．根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的組合物，其中該組合物包含抑制PAR-2通道的制劑。
9．根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的組合物，其中該組合物包含選自大豆衍生物和絲氨酸蛋白酶抑制劑的制劑。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中該制劑選自豆奶、豆?jié){、化合物Ⅰ、胰蛋白酶抑制劑、類胰蛋白酶抑制劑、凝血酶抑制劑和STI。
11．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的組合物，其中合適的細(xì)胞是表達(dá)PAR-2的細(xì)胞。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中合適的細(xì)胞選自角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和專職的吞噬細(xì)胞。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中合適的細(xì)胞是角質(zhì)細(xì)胞。
14．根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中合適的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
15．根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中合適的細(xì)胞是專職的吞噬細(xì)胞。
16．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的組合物，其中該疾病選自皮膚疾病、免疫系統(tǒng)疾病、炎性疾病、呼吸道疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中該疾病是皮膚疾病。
18．根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中該疾病是免疫系統(tǒng)疾病。
19．根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中該疾病是炎性疾病。
20．根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中該疾病是呼吸道疾病。
21．根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中該疾病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
22．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、或4所述的組合物，其中哺乳動(dòng)物是人。
23．一種增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的方法，該方法包括使細(xì)胞與有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑接觸。
24．一種減少哺乳動(dòng)物細(xì)胞中吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的方法，該方法包括使細(xì)胞與有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑接觸。
25．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該制劑激活PAR-2通道。
26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中該制劑選自SLIGRL、SAIGRL、SLIGKVD和絲氨酸蛋白酶。
27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中該制劑選自SLIGRL、胰蛋白酶、凝血酶和類胰蛋白酶。
28．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該制劑抑制PAR-2通道。
29．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中制劑選自大豆衍生物和絲氨酸蛋白酶抑制劑。
30．根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中制劑選自豆奶、豆?jié){、化合物Ⅰ、胰蛋白酶抑制劑、類胰蛋白酶抑制劑、凝血酶抑制劑和STI。
31．根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)PAR-2的細(xì)胞。
32．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、和專職的吞噬細(xì)胞。
33．根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是角質(zhì)細(xì)胞。
34．根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
35．根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是專職的吞噬細(xì)胞。
36．根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
37．一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物治療有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑。
38．一種治療受累于某疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物治療有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑。
39．一種預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的方法，該疾病可通過增加合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量的特異性增加吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑。
40．一種預(yù)防哺乳動(dòng)物患某種疾病的方法，該疾病可通過減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM-1表達(dá)來改善，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量的特異性減少吞噬作用或ICAM-1表達(dá)的制劑。
41．根據(jù)權(quán)利要求37或39所述的方法，其中制劑激活PAR-2通道。
42．根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中制劑選自SLIGRL、SAIGRL、SLIGKVD和絲氨酸蛋白酶。
43．根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中制劑選自SLIGRL、胰蛋白酶、凝血酶和類胰蛋白酶。
44．根據(jù)權(quán)利要求38或40所述的方法，其中制劑抑制PAR-2通道。
45．根據(jù)權(quán)利要求38或40所述的方法，其中制劑選自大豆衍生物或絲氨酸蛋白酶抑制劑。
46．根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中制劑選自豆奶、豆?jié){、化合物Ⅰ、胰蛋白酶抑制劑、類胰蛋白酶抑制劑、凝血酶抑制劑和STI。
47．根據(jù)權(quán)利要求37、38、39或40所述的方法，其中合適的細(xì)胞是表達(dá)PAR-2的細(xì)胞。
48．根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中合適的細(xì)胞選自角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和專職的吞噬細(xì)胞。
49．根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中合適的細(xì)胞是角質(zhì)細(xì)胞。
50．根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中合適的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
51．根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中合適的細(xì)胞是專職的吞噬細(xì)胞。
52．根據(jù)權(quán)利要求37、38、39或40所述的方法，其中疾病選自皮膚疾病、免疫系統(tǒng)疾病、炎性疾病、呼吸道疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
53．根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中該疾病是皮膚疾病。
54．根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中該疾病是免疫系統(tǒng)疾病。
55．根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中該疾病是炎性疾病。
56．根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中該疾病是呼吸道疾病。
57．根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中該疾病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
58．根據(jù)權(quán)利要求37、38、39或40所述的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
59．一種用來給予權(quán)利要求1、2、3或4所述的組合物的生產(chǎn)制品，它包含一個(gè)固體輸送載體，該載體中操作性地附有該組合物。
60．根據(jù)權(quán)利要求59所述的制品，其中該組合物包含激活PAR-2通道的制劑。
61．根據(jù)權(quán)利要求60所述的制品，其中該組合物包含選自SLIGRL、SAIGRL、SLIGKVD和絲氨酸蛋白酶的制劑。
62．根據(jù)權(quán)利要求61所述的制品，其中該制劑是SLIGRL。
63．根據(jù)權(quán)利要求59所述的制品，其中該組合物包含抑制PAR-2通道的制劑。
64．根據(jù)權(quán)利要求59所述的制品，其中該組合物包含選自大豆衍生物和絲氨酸蛋白酶抑制劑的制劑。
65．根據(jù)權(quán)利要求64所述的制品，其中制劑選自豆奶、豆?jié){、化合物Ⅰ、胰蛋白酶抑制劑、類胰蛋白酶抑制劑、凝血酶抑制劑和STI。
66．一種給予哺乳動(dòng)物治療、預(yù)防或美容化合物的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物(a)化合物和(b)組合物，該組合物包含藥學(xué)上或美容上可接受的載體以及特異性增加吞噬作用的制劑，該制劑的用量足以增加希望攝取化合物的細(xì)胞中的吞噬作用，其中組合物的給藥在給予化合物之前和／或同時(shí)進(jìn)行。
67．根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中組合物包含激活PAR-2通道的制劑。
68．根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中該組合物包含選自SLIGRL、SAIGRL、SLIGKVD和絲氨酸蛋白酶的制劑。
69．根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中該制劑是SLIGRL。
全文摘要
本發(fā)明提供了用來治療和預(yù)防某些哺乳動(dòng)物疾病的組合物,這些疾病可通過增加或減少合適細(xì)胞中的吞噬作用或ICAM－1表達(dá)來改善。本發(fā)明還提供了改變細(xì)胞中吞噬作用或ICAM－1表達(dá)水平的方法。本發(fā)明還提供了治療和預(yù)防受吞噬作用或ICAM－1表達(dá)之變化影響的哺乳動(dòng)物疾病的方法。本發(fā)明所有的方法和組合物均涉及特異性增加或減少吞噬作用或ICAM－1表達(dá)的制劑。最后,本發(fā)明提供了有關(guān)的生產(chǎn)制品。
文檔編號(hào)A61K9/127GK1282254SQ98812264
公開日2001年1月31日 申請(qǐng)日期1998年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月16日
發(fā)明者S·米里, S·S·夏皮羅, M·艾辛格 申請(qǐng)人:強(qiáng)生消費(fèi)者公司