專利名稱：三氧化二砷制劑生產(chǎn)法及用三氧化二砷或米拉索普治癌法的制作方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療白血病、淋巴瘤以及某些其它癌癥的方法和組合物。
更具體地說，本發(fā)明涉及新穎地應(yīng)用三氧化二砷和有機砷的化合物來治療急慢性白血病。
2．發(fā)明背景2．1．癌癌的特征主要是從給定正常組織衍生出來的反常細胞的數(shù)量增長、這些反常細胞侵入附近組織、以及由淋巴液或血液攜帶擴散到區(qū)域內(nèi)淋巴結(jié)和遠方部位(轉(zhuǎn)移)。臨床資料和分子生物學(xué)研究指出，癌是一個多階段的過程，它一開始是少量的腫瘤前變化，在一定條件下這些變化會行進到腫瘤形成。
在腫瘤損害形成前，先有惡性前反常細胞的生長，例如增生、變形和發(fā)育異常(回顧這樣的反常生長情況，請參閱Robbins和Angell著《基礎(chǔ)病理學(xué)》一書1976年第二版68～79頁，該書由費城W．B．Saunders公司出版)。腫瘤損害可克隆生長成硬質(zhì)腫瘤(Solidtumor)，并開發(fā)出日益增大的容量供其侵入、生長、轉(zhuǎn)移和異質(zhì)化，特別是在腫瘤細胞逃過宿主免疫監(jiān)視的條件下是如此(Roitt，I．，Brostoff，J．和Kale，D．，免疫學(xué)，1993年第3版17．1～17．12頁，Mosby，St．Louis)。
白血病是指造血組織的惡性腫瘤。轉(zhuǎn)變成惡性典型地是在單細胞中通過兩個或更多步驟發(fā)生，隨后則增生并克隆擴增。在一些白血病中，已經(jīng)由一貫的(consistent)白血病細胞形態(tài)和特殊的臨床特征辨識出了特異的染色體易位(例如，慢性髓細胞白血病的易位數(shù)為9和22，而急性前髓細胞白血病的易位數(shù)為15和17)。急性白血病占優(yōu)勢的是未分化的細胞群體，而慢性白血病占優(yōu)勢的是更成熟的細胞形態(tài)。
急性白血病可分為成淋巴細胞型(ALL)和非成淋巴細胞型(ANLL)。急性白血病還可根據(jù)法-美-英(FAB)分類法或根據(jù)其類型和分化程度按照它們的形態(tài)和細胞化學(xué)表象來進一步細分。使用特異性的B-和T-細胞和骨髓抗原單克隆抗體來進行分類是最有幫助的。ALL大多數(shù)是兒童期發(fā)病，借助于化驗發(fā)現(xiàn)和骨髓檢查來確立。ANLL也稱為急性成髓細胞白血病(AML)，在所有年齡段均可發(fā)病，是成年人較普通的急性白血病，該病常以擴散為起因。
慢性白血病被描述為淋巴細胞性(CLL)或髓細胞性(CML)的白血病。CLL的特征是在血液、骨髓和淋巴系統(tǒng)器官中出現(xiàn)成熟的淋巴細胞。CLL的標志是持續(xù)的、絕對的淋巴細胞增多(＞5000/μL)以及在骨髓中淋巴細胞增多。多數(shù)CLL患者還具有淋巴細胞的B-細胞克隆擴增的特征。CLL是老年人的疾病。CML的特征是所有分化階段的粒性白細胞在血液、骨髓、肝、腎和其它器官中占優(yōu)勢。在根據(jù)癥狀診斷出的病人中，WBC的總計數(shù)常約為200，000/μL，還可高達1，000，000/μL。CML由于存在有費城染色體，因而是比較容易診斷的。
造血性癌的性質(zhì)本身使得采用全身化學(xué)療法作為主要治療形式成為必要。根據(jù)特定白血病的敏感性而選用的藥物通常是復(fù)合劑。放射療法可作為輔助手段用來處理局部集聚的白血病細胞。外科手術(shù)很少需要作為主要的治療方式，但可用來對付某些并發(fā)癥。從HLA適配的同胞兄弟姐妹作骨髓移值有時是需要的。
2．2．砷及其藥用長久以來，在西方和中國的醫(yī)藥實踐中部把砷看作既是毒物又是藥物。在十九世紀晚期，西方常試用砷來治療血液病。在1878年曾有報告說，用福勒溶液(一種含有亞砷酸鉀的+5價溶液)治療白血病患者可明顯減少白血細胞計數(shù)(見Cutler和Bradford，美國醫(yī)藥科學(xué)雜志，1878年1月號，81～84頁)。更有興趣的是1931年由Forkner和Scott所描述的用福勒溶液作為姑息劑來治療慢性骨髓性白血病(CML)(美國醫(yī)藥協(xié)會雜志，1931，ⅲ，97頁)，稍后在1936年又被Stephens和Lawrence所證實(國際醫(yī)藥年會，9，1488～1502頁)。但是，福勒溶液的活性化學(xué)組分尚未確定，它的毒性是被廣泛承認的。福勒溶液嚴格地作為口服組合物給藥，并以溶液的形式給白血病患者服用，直到白血細胞的水平被壓低到可接受的水平或者直到毒性(例如皮膚角化和色素沉著過多)發(fā)作，使患者享受或長或短的緩解期。在六十年代，偶然仍有試用福勒溶液治療CML的，但多數(shù)CML患者都是被用另外的化學(xué)治療劑來治療，例如用白血福恩和/或放療(見Monfardini等著，癌，1973，31492-501頁)。
自相矛盾地，長期以來認識到，暴露于環(huán)境中的或藥物中的砷的效應(yīng)之一是皮膚癌(Hutchinson，1888，倫敦病理學(xué)會會報(Trans．Path．Soc．Lond．)，39352頁；Neubauer，1947，Br．J．癌，1192頁)。甚至有流行病資料稱，長期服用福勒溶液會導(dǎo)致體內(nèi)部位癌癥發(fā)病率提高(Cuzick等著，Br．J．癌，1982，45904～911頁；Kaspar等，美國醫(yī)藥協(xié)會雜志，1984，2523407～3408頁)。從此，砷的致癌力已被下面的事實展現(xiàn)出來它能誘導(dǎo)染色體畸變、基因增殖、組妹染色單體變化和細胞變形(見例如Lee等著1988版科學(xué)一書，24179～81頁；以及Germolec等著毒理學(xué)應(yīng)用藥理學(xué)一書，1996年141308～318頁)。由于砷有眾所周知的致癌作用，現(xiàn)在在西方醫(yī)藥中砷對人的僅有治療應(yīng)用是用來治療熱帶病如非洲錐蟲病(有機砷劑、米拉索普；見Goodman和Gilman著治療學(xué)的藥理基礎(chǔ)一書第9版，第66章，1659～1662頁，1997)。
在傳統(tǒng)中藥中，亞砷酸或三氧化二砷糊劑已被用來治療牙髓病、牛皮癬、梅毒和風溫病(Chen等，1995，載臨床藥物手冊，中國上海，上海科技學(xué)院，P．830)。在中國，在七十年代曾試驗性地用三氧化二砷來治療急性前髓細胞白血病(APL)(由Mervis在1996年的科學(xué)一書作過評注，273578頁)。三氧化二砷對頑固性APL的臨床效驗最近被重新研究，在15個患有此病的14人中作了試驗，使用10mg/d的靜脈內(nèi)劑量4-9周后，結(jié)果是在不伴用骨髓抑制的情況下取得完全形態(tài)學(xué)緩解(Chen等，1997，血液，893354～3360頁)。研究還顯示出，三氧化二砷在體外會誘發(fā)NB4細胞即APL細胞系的凋亡(細胞按計劃死亡)，以及凋亡明顯地與bc1-2致腫瘤基因的下調(diào)(downregulation)和嵌合體的PML/RARα蛋白在細胞內(nèi)的重新分配有聯(lián)系，這種蛋白是APL細胞所獨有的(Chen等，1996，血液，881052～1061頁；Andre等，1996，實驗性細胞研究(Exp．Cell Res．)229253～260頁)。已有報告說，砷的生物學(xué)活性是由于砷能把PML的核質(zhì)部分導(dǎo)入核使之降解(Zhu等，1997，國家科學(xué)院會議錄(proc．Natl．Acad．Sci)，943978～3983)。
雖然眾所周知砷既是毒物又是致癌劑，但已有很多關(guān)于用砷作藥物治療的報告。另外，從上述討論中應(yīng)能清楚，白血病有多種不同的類型，其中每種類型都要求一個獨特的治療方案，該方案需根據(jù)預(yù)計有治療失敗危險的征候出現(xiàn)而進行改進。因此，開發(fā)出一種可單獨使用或與其它現(xiàn)有藥物結(jié)合使用的抗白血病藥是極其需要的。
3．發(fā)明概述雖然在本技術(shù)領(lǐng)域中關(guān)于給患者服用砷的益處和危險有著互相抵觸的報告，但是本申請人卻發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷、有機砷劑和米拉索普在治療各種類型的白血病、淋巴瘤和硬質(zhì)腫瘤方面有著廣泛的適用性。
在此所描述的本發(fā)明涵蓋治療白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)腫瘤的方法，包括給予需要這種治療的人以治療有效而非致死量的三氧化二砷或米拉索普。如上所述，本發(fā)明還涵蓋用結(jié)合療法來治療白血病，特別是抗拒其它治療方式的那些白血病。
本發(fā)明還涵蓋生產(chǎn)含有三氧化二砷的藥用組合物的方法。
按照本發(fā)明，三氧化二砷或米拉索普化合物可單獨地或與其它已知的治療方劑(包括化學(xué)治療劑、放射防護藥和放射療法)或技術(shù)結(jié)合起來，用來或是改善病人的生活質(zhì)量、或是治療白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)腫瘤。在服用一種或一種以上化學(xué)治療劑、包括抗癌劑以前、正在服用或服用以后，均可使用砷化物。此外，在放射治療前、治療中或治療后，均可使用砷化物。
本發(fā)明的藥用組合物是適用于靜脈內(nèi)注射或輸注的消毒溶液。在另一實施方案中，本發(fā)明涵蓋一種適于口服的組合物；其中含有三氧化二砷或米拉索普以及在藥用上可接受的賦形劑或載體。在另一實施方案中，本發(fā)明還包括適于皮膚表面或透過皮膚用的組合物，透過皮膚的方法包括但不限于離子電滲療法。本發(fā)明還提供出特效的治療方案、藥用組合物和成套藥包。
下面將在各章節(jié)描述本發(fā)明的特種組合物及其應(yīng)用。
4．發(fā)明詳述這里描述的是治療白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)腫瘤的方法和組合物。本發(fā)明提供出治療人的急性或慢性白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)腫瘤的方法，它包括給予需要這種冶療的人以治療有效而非致死量的一種或一種以上的砷化物、如三氧化二砷或米拉索普。
本發(fā)明還包括治療抗拒其它治療方式的人的白血病的方法，它包括給予此人結(jié)合有其它化學(xué)治療劑如全反維生素A酸(ATRA)的三氧化二砷或米拉索普。
本發(fā)明還涉及制造含有三氧化二砷的藥用組合物的方法。本發(fā)明的藥用組合物優(yōu)選是表達出毒性較低、功效改善、貯藏和使用穩(wěn)定性改善的組合劑，而且該組合物具有生理上能接受的pH值。
4．1．砷化物在此“砷化物”一詞是指三氧化二砷(As2O3)或米拉索普在藥用上可接受的形式。米拉索普是一種有機砷化物，它可由氧化蜜胺胂與二巰基丙醇復(fù)合的辦法來合成，也可從市場購得(Arsobal_由Rh_nePoulenc Rorer提供，賓夕法尼亞州Colle-geville)。由于本發(fā)明的非藥用制劑的原料是大家熟知的，這些原料可用本技術(shù)領(lǐng)域大家熟知的化學(xué)技術(shù)來制備(例如可見Kitk-Othmer，化學(xué)工藝技術(shù)百科全書，第4版，卷3，第633～655頁，John Wiley ＆ Sons)。
在此，名詞“治療劑”、“治療方案”、“放射防護藥”、“化學(xué)治療”是指用來治療癌癥、病毒感染和惡性腫瘤的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的普通藥物和藥物療法，包括疫苗?！胺派渲委煛眲┦潜绢I(lǐng)域人員所熟知的。
按照本發(fā)明，三氧化二砷或米拉索普化合物可單獨地或與其它已知的治療劑(包括化學(xué)治療、放射防護藥和放射治療)或技術(shù)結(jié)合使用以便或是改善患者的生活質(zhì)量，或是治療白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)腫瘤。例如，砷化物可在一種或一種以上抗癌劑使用前、使用中或使用后加以使用，抗癌劑包括但不限于下列各種芥子化合物，氮芥，苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，環(huán)磷酰胺，6-巰基嘌呤，6-硫代鳥漂呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，5-氟脫氧尿苷，氨甲喋呤，長春花新堿，長春花堿，紫杉酚，依托泊苷，太米泊苷(temiposide)，放線菌素D，道諾霉素，阿霉素，爭光霉素，自力霉素，順鉑，卡鉑，雌莫斯汀，磷酸鹽，羥基脲，BCNU，甲基芐肼，VM-26，干擾素，以及全反維生素A酸(ATRA)或其它的類維生素A(例如見醫(yī)師日用手冊，1997)。此外，砷化物在放射治療前、治療中和治療后均可使用。
在一個特效實施方案中，本發(fā)明的砷化物和ATRA可以作為混合劑給藥。優(yōu)選的情況是，用本結(jié)合劑治療的人的白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)腫瘤是抗拒普通治療方法的，或者是復(fù)發(fā)的白血病。
按照本發(fā)明，可用任何適當?shù)慕o藥模式，它包括但不限于腸胃外給藥如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)給藥；口服和鼻內(nèi)給藥，以及吸入。給藥模式可根據(jù)癌的類型和病人情況而異。
所用藥用組合物的形式可以是消毒的水溶液或有機溶液、膠體懸浮液、藥盒(caplets)、藥片和膠囊。
4．2．治療方法術(shù)語“治療白血病的方法”意指該疾病的病癥和伴隨病癥的癥狀能被緩和、被減輕、被治愈或被置于緩解狀態(tài)的方法。例如，本發(fā)明的治療方法能使被治療的病人降低白血細胞計數(shù)或減少其淋巴細胞增多。
術(shù)語“治療淋巴瘤的方法”意指該疾病的病癥和伴隨病癥的癥狀能被緩和、被減輕、被治愈或被置于緩和狀態(tài)的方法。
術(shù)語“治療硬質(zhì)腫瘤的方法”意指該疾病的病癥和伴隨硬質(zhì)腫瘤的癥狀能被緩和、被減輕、被治愈或被置于緩解狀態(tài)的方法。
此外，術(shù)語“治療白血病浸潤的方法”意指白血病細胞浸潤離開循環(huán)系統(tǒng)而進入其它器官和系統(tǒng)，而伴隨浸潤的癥狀能被緩解、減輕、治愈或被置于緩解狀態(tài)的方法。
術(shù)語“頑固性”意指該種白血病總體而言是抗拒治療或治愈的。
術(shù)語“腫瘤前”細胞是指從正常形態(tài)向腫瘤形態(tài)轉(zhuǎn)變中的細胞；或者不能正常分化的細胞；以及借助于分子生物學(xué)研究所日益支持的形態(tài)學(xué)證據(jù)表明正在通過多個步驟進展的腫瘤前細胞。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供出一種治療人的白血病的方法，它包括給予病人治療有效而非致死量的三氧化二砷或米拉索普藥劑。本發(fā)明還提供出迄今未公開過的以體重為基礎(chǔ)的藥劑方案，使病人使用這些劇毒化合物時獲得最大的安全。
三氧化二砷(As2O3)能抑制并誘導(dǎo)NB4急性前髓細胞白血病細胞凋亡。急性前髓細胞白血病伴有t(15；17)易位，這種易位會在PML和RARα之間產(chǎn)生PML/RARα融合蛋白。PML是一種集中在伴有基質(zhì)的核粒上的生長抑制基因；RARα是維生素A酸(RA)的核受體。PML/RARα被推薦通過抑制核受體響應(yīng)來阻滯骨髓的分化作用，就象優(yōu)勢陰性RARα變異(dominant negative RARR mutant)所起的作用那樣。此外，在APL細胞內(nèi)，PML/RARα把PML和其它核粒(NB)抗原移置到核小斑上，其結(jié)果也是類似地使PML和/或NB喪失其功能。有人提出，高濃度的三氧化二砷會促進調(diào)亡，而低濃度則會誘發(fā)NB4細胞以及從APL患者取得的細胞的部分分化。有人假定說，As2O3是通過它能特異性地使APL細胞中的PML-RARα重新定位到核粒上以便使之降解的能力而發(fā)揮作用的。(Zhu等，1997，美國國家科學(xué)院會議錄，943978～3983頁)。但是，這些發(fā)現(xiàn)傾向于限制白血病亞型使用三氧化二砷。參見Konig等，1997，血液，90562～57頁。
出乎意料的是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，As2O3和米拉索普都能在PML和PML-RARα獨立無礙狀態(tài)下抑制細胞生長，并誘發(fā)多種骨髓白血病細胞系凋亡。由此，本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)出，與早先的發(fā)現(xiàn)相反，三氧化二砷和米拉索普對廣泛范圍的白血病都能有效，而不管引起白血病的幕后分子機制如何。砷化物對若干種白血病細胞系的效果的工作實例示于5．1和5．2節(jié)。
據(jù)此，本發(fā)明的砷化物可用來針對各種各樣的白血病，它們包括但不限于急性淋巴細胞白血病(ALL)急性淋巴B-細胞白血病急性淋巴T-細胞白血病急性成髓細胞(原始粒細胞)白血病(AML)急性前髓細胞白血病(APL)急性成單核細胞白血病急性紅白血病急性成巨核細胞白血病急性粒-單核細胞白血病急性未分化細胞白血病慢性髓細胞白血病(CML)慢性淋巴細胞白血病(CLL)熟練的技術(shù)人員會承認，其它的白血病也是可能按照本發(fā)明來治療的。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供出一種治療人的淋巴瘤的方法，它包括給予病人治療有效而非致死量的三氧化二砷或米拉索普藥劑?？捎帽景l(fā)明的方法治療的淋巴瘤包括但不限于高等級(highgrade)淋巴瘤、中等級淋巴瘤、低等級淋巴瘤，以及各種各樣的亞型分類。
在又一個實施方案中，本發(fā)明提供出一種治療人的硬質(zhì)腫瘤包括腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，它包括給予病人治療有效而非致死量的三氧化二砷或米拉索普藥劑?？捎帽景l(fā)明的方法治療的硬質(zhì)腫瘤包括但不限于消化道癌；食管癌、肝癌、胃癌和結(jié)腸癌；皮膚癌；腦癌；骨癌；乳房癌；肺癌；以及軟組織癌；包括但不限于各種內(nèi)瘤，并優(yōu)選前列腺癌。
在很多實例中，白血病或腫瘤的細胞正在滲入病人的其它器官和系統(tǒng)中，例如滲入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本發(fā)明的方法也可適用來使腫瘤前細胞異常增加的病人減少其腫瘤前細胞的數(shù)量。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供出一種治療人的急性前髓細胞白血病(APL)的方法，它包括給予病人治療有效但非致死量的米拉索普藥劑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，就象在5．2節(jié)中所描述的那樣，在體外能毒害細胞的米拉索普濃度，也能方便地在活體內(nèi)達到。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供出一種治療人的慢性骨髓性白血病(CML)的方法，它包括給予病人治療有效但非致死量的三氧化二砷藥劑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，就象在5．3節(jié)中所描述的那樣，三氧化二砷也能誘發(fā)CML細胞系的凋亡。本發(fā)明的含有三氧化二砷的藥用組合物的治療好處要遠勝于通常配制成福勒溶液的亞砷酸鉀。
在另一個特定實施方案中，本發(fā)明提供出一種治療人的急性前髓細胞白血病(APL)的方法(其中APL伴有把染色體17上的RARα位置移置到染色體11上)，它包括給予病人治療有效但非致死量的三氧化二砷或米拉索普藥劑。在絕大多數(shù)APL病例中，在染色體17上的RARα都易了位并與位于染色體15上的PML基因融合，這就是t(15；17)。在少數(shù)病例中，RARα易位到染色體11上，并在那里融入PLZF基因。隱匿著t(15；17)的病人對用全反維生素A酸(ATRA)的治療無比敏感，能得到75％至95％的完全緩解率。伴有t(11；17)(PLZF-RARα)的APL獨特地顯示出預(yù)后不良，它對化學(xué)療法的響應(yīng)很差，對用ATRA的治療幾乎沒有響應(yīng)或全無響應(yīng)，被定義為新的APL綜合癥。本發(fā)明所提供的那種三氧化二砷或米拉索普，可以用來治療這種APL病例。用本發(fā)明的砷化物試驗過其治療好處和劑量的、伴有t(15；17)和t(11；17)的APL轉(zhuǎn)基因動物模型將在下面的5．4節(jié)內(nèi)描述。
患白血病的人有時會由于經(jīng)歷過抗白血病治療(例如化學(xué)療法)而抗拒普通的治療方法。因此，本發(fā)明提供出一種治療對普通治療方法不起反應(yīng)的人的白血病的方法，它包括給予病人治療有效但非致死量的砷化物和其它化學(xué)治療劑的結(jié)合藥劑，這類其它化學(xué)治療劑包括但不限于全反維生素A酸(ATRA)或其它的類維生素A。該砷化物可以或是三氧化二砷、或是米拉索普、或是它們在藥物治療上可以接受的鹽。本發(fā)明也涵蓋用砷化物治療對類維生素A有抗藥性的患者。
在上述特定實施方案中，本發(fā)明的砷化物和化學(xué)治療劑可以作為混合物給藥，也可以順序地給藥。在順序給藥時，砷化物可以在化學(xué)治療劑之前或之后給藥，只要在第一次給的藥劑仍在人體內(nèi)發(fā)揮抗白血病作用時就給第二種藥劑即可。在此描述的任一種給藥模式都可用來分送該結(jié)合劑。用本結(jié)合劑治療的白血病人優(yōu)選是對普通治療方法抗拒或是復(fù)發(fā)的白血病人。
4．3．生產(chǎn)三氧化二砷消毒溶液的方法本發(fā)明的砷化物可按方配制成消毒的藥用制劑以便向病人給藥用來治療白血病、淋巴瘤和硬質(zhì)腫瘤。與相容的藥用載體制劑并含有本發(fā)明的化合物的組合物可制備、包裝起來并貼上治療所指定的白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)腫瘤的標簽，以用來治療這些疾病。
一方面，本發(fā)明提供出一種含有治療有效而非致死量三氧化二砷(As2O3)的藥用組合物的制造方法。三氧化二砷(原料)是一種可從商店購得的非常純凈的無機化合物。但As2O3很難溶于水溶液中。另外，本發(fā)明人并不知道有任何出版物教人如何把As2O3配制成適于給人直接注射的藥用組合物。砷在溶液中是以+5價狀態(tài)(五價)或+3價狀態(tài)(三價)存在。例如，亞砷酸鉀(KAsO2；它存在于福勒溶液中)和亞砷酸的鹽含有五價砷。大家知道，砷的有一種形式要比其它形式更毒(見Goodman ＆ Gilman著治療學(xué)的藥理基礎(chǔ)一書第9版，第66章，1660頁，1997)。含有三價狀態(tài)的砷的三氧化二砷新鮮溶液如果長時間暴露在空氣中會逐漸被氧化成五價狀態(tài)，而五價砷集聚的結(jié)果是，As2O3溶液的相對毒性在一定時間后會變化。(皮內(nèi)(Id．))另外還觀察到，在一定時間后溶液中砷的總量會減少。這一物質(zhì)損失是由溶液中的砷進行性地轉(zhuǎn)變?yōu)殡?AsH3)而引起的，胂在室溫下是氣態(tài)化合物。這在藥物用途中是特別成問題的，如果注射物中的有效成分的濃度不受控制的話。任憑胂從溶液中逸出進入大氣也是不希望有的，因為胂也是有毒的。
本發(fā)明通過試驗成功地開發(fā)出了配制三氧化二砷的方法，該法克服了上述的溶解性和穩(wěn)定性問題。該法包括將高純度的固態(tài)As2O3溶解在高pH值為pH大于12的水溶液中。例如，可使用5摩爾的氫氧化鈉溶液。為幫助溶解并獲得清澈均勻的溶液，可使用機械攪拌和/或溫和加熱。隔夜溶解固態(tài)化合物也可獲得As2O3的溶液。典型的情況是，1摩爾的As2O3溶液不用這個辦法獲得。但是，這個溶液的堿性太大，不能用作藥用組合物。
為調(diào)節(jié)該As2O3溶液的pH值，首先把它在水中稀釋，例如以濃度為約1mg/ml，pH12。然后將此As2O3溶液用酸、如鹽酸(1摩爾至5摩爾HCl)在不斷攪拌下進行回滴定，直到pH值達到約8～8.5為止。高濃度HCl會引起As2O3溶液中產(chǎn)生沉淀，因此不宜使用。被部分中和了的As2O3溶液隨后即可例如用過濾法(例如通過0.22μm的過濾器)進行滅菌并儲藏在消毒小瓶中。
為制出可直接給對象注射的藥用組合物，該組合物必須是無菌的，可采用消毒技術(shù)人員所熟知的標準技術(shù)。見例如Remington著藥物科學(xué)一書。被部分中和了的As2O3溶液的pH值可進一步用藥用載體、例如5％葡萄糖溶液稀釋(10～100倍)到接近生理pH值。例如，10ml部分中和的As2O3溶液可加到500ml的5％葡萄糖溶液中，以配出最終的pH值為約6.5～7.5。本發(fā)明的方法可減輕砷在溶液中的氧化作用。用本發(fā)明的方法制出的含有三氧化二砷的藥用組合物表達出具有改進的穩(wěn)定性和很長的貨架壽命。
4．4．藥用組合物和給藥模式按照本發(fā)明，砷化物及其生理上能接受的溶合物可配制來作口服或胃腸外給藥。
用作口服時，藥物可制備成液體形式，如溶液、糖漿或懸浮液，或者可以做成在使用前兌水或兌其它適當載劑(vehicle)的藥物產(chǎn)品。這樣的液體制品可用普通工具用下列在藥用上可以接受的添加劑來制備懸浮劑(例如梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水載體(例如杏仁油、油狀酯、或分餾的植物油)；以及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。藥用組合物的形式，例如可以是用普通工具用藥用上能接受的賦形劑做成片或膠囊。這種賦形劑有例如粘結(jié)劑(例如預(yù)膠凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或甘醇酸淀粉鈉酯)；或者濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)。片劑可用本領(lǐng)域熟知的方法包衣。
吸入給藥時，按照本發(fā)明使用的化學(xué)物可方便地以氣溶膠噴射的形式從壓力包裝或噴霧器噴出而送入，其中要用到適當?shù)闹苿┤缍榷淄?、三?氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當?shù)臍怏w。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可加裝一個閥來確定，以送入可計量的量?？捎美缑髂z做的膠囊和藥管、內(nèi)裝化合物和適當?shù)姆勰┗?如乳糖或淀粉)所配的粉末混合物來用于吸入器。
該化合物可配制成供靜脈內(nèi)注射、如濃縮藥團注射或連續(xù)輸注的藥劑。注射制劑可做成單元劑量的方式如裝在安瓿中或多劑量容器中，內(nèi)中加有防腐劑。該組合物可采用這些形式，如在由性或水性載劑中的懸浮液、溶液或乳膠液，并可含有懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑等制劑用料劑。另一種可替代的辦法是，活性組分可以粉末形式，在使用前再與適當?shù)妮d體如無菌無熱源的水(Sterile pyrogen-freewater)配制。
本發(fā)明還提供出實現(xiàn)本發(fā)明治療方案的成套藥包。這種藥包內(nèi)裝有一個或幾個容器，容器內(nèi)以藥用可接受的方式裝有治療有效而非致死量的砷化物。在本發(fā)明的成套藥包小瓶中的砷化物可以是藥用上可接受的溶液形式，例如與無菌的鹽水、葡萄糖溶液、或緩沖溶液、或其它在藥用上可接受的無菌流體結(jié)合在一起的溶液。另外的辦法是，該復(fù)合劑可以是凍干品或干制品；在這種情況下，成套藥包的容器內(nèi)還應(yīng)進一步裝有在藥用上可接受的溶液(例如鹽水、葡萄糖溶液等)，優(yōu)選是滅菌溶液，以便將此復(fù)合劑重新配制成注射用溶液。
在另一實施方案中，本發(fā)明的成套藥包還配有優(yōu)選裝入消毒包裝的針和注射器，和/或酒精棉。可任選包括有對臨床醫(yī)師或病人使用砷化物的用藥指導(dǎo)。
在急性或慢性白血病治療中，砷化物治療劑的量應(yīng)隨著所處理病情的嚴重性和用藥途徑而變化。劑量或劑量頻數(shù)還應(yīng)根據(jù)各個病人的年齡、體重、病情和反應(yīng)而有所不同?？偟膩碚f，對于已描述過的病情來說，一天的三氧化二砷劑量范圍通常為每公斤體重約從0.05至5mg，分幾次通過胃腸外或口服或皮膚表面局部給藥。優(yōu)選的每日總劑量為約從2.5至40mg三氧化二砷。本發(fā)明的三氧化二砷制劑優(yōu)選最多連給60天或者直到緩解為止，然后再跟進二至十個附加周期，每個周期用25天。例如，根據(jù)急性前髓細胞白血病人的體重，每天給予的三氧化二砷劑量大于或少于10mg是可以的。替代的辦法是，遵循按體重給藥的治療方案，每天給予三氧化二砷的劑量少于10mg就可取得治療效果。
對治療硬質(zhì)腫瘤來說，優(yōu)選的劑量方案是每公斤體重每天靜脈輸注約0.1-5mg，共輸5天。每月再重復(fù)一次這樣的5天治療方案，直到腫瘤生長被抑制或腫瘤顯示出消退跡象為止。
至于米拉索普的每天總劑量范圍，對于已描述過的病情來說通常為每公斤體重約0.1～5mg，分幾次通過胃腸外或口服或皮膚表面局部給藥。優(yōu)選的米拉索普每天總劑量為每公斤體重約從0.5至4mg。
三氧化二砷或米拉索普對癌的發(fā)育和進展的治療效果，可借助于本領(lǐng)域熟知的任何方法來監(jiān)視，這些方法包括但不限于測定腫瘤的特異性抗原和推斷用的生物標記物如癌胚抗原(CEA)、α-胎蛋白等的水平；以及用計算機輔助的X線體層照相巡檢和/或聲圖描記來測定形態(tài)學(xué)和/或大小的變化。
要求的血液中的藥物濃度可借助于不斷輸注砷化物來保持，以查驗出的血漿中的藥物濃度(plasma level)來確定。應(yīng)當指出，參與治療的醫(yī)師應(yīng)當知道，如何、以及何時需要結(jié)束、中止或調(diào)整治療方法來減少劑量，在每性大或骨髓、肝臟或腎臟機能障礙時即應(yīng)調(diào)整。相反地，如果臨床的反應(yīng)不足(排除掉毒性副作用)，則參與治療的醫(yī)師也應(yīng)當知道如何、以及何時須把治療調(diào)整到較高的水平。
再者，為給患者提供有效劑量的砷化物，可采用任何適當?shù)慕o藥途徑。例如可采用口服的、經(jīng)皮的、離子電滲的、腸胃外的(皮下的、肌肉的、鞘肉的等等)途徑。藥劑形式包括片、錠、扁形膠囊、分散劑、懸浮劑、溶液、膠囊、膏藥等(見Remington著藥物科學(xué)一書)。
本發(fā)明的藥用組合物中含有作為活性組分的砷化物和它們的在藥用上可接受的鹽，還可含有藥用上可接受的載體(carrier)，并可任選含有其它治療組分如全反維生素A酸。術(shù)語“藥用上可接受的鹽類”指的是用藥用上可接受的無毒的酸和堿、包括無機和有機的酸和堿制備出的鹽。
本藥用組合物包括適于口服、粘膜途徑的、經(jīng)皮的、離子電滲的、腸胃外的(包括皮下的、肌內(nèi)的、鞘內(nèi)的和靜脈內(nèi)的)給藥的組合物，但是，在任何指定案例中最適宜的用藥途徑要取決于被處理的病情的性質(zhì)和嚴重性。
在采用靜脈內(nèi)注射或輸注用組合物的情況下，適當?shù)氖褂脛┝坷缈梢允敲刻斓目偭繛閺募s1至40mg的三氧化二砷；每公斤體重每天的總量為約0.001至10mg的三氧化二砷；或者每公斤體重每天的總量為約0.1至10mg的米拉索普。
此外，砷的載體可通過帶電的和不帶電的基質(zhì)而把藥物分送出去，這種起藥物分送器作用的物質(zhì)如乙酸纖維素膜；還可通過目標分送系統(tǒng)如附著在抗體或特效抗原上的梭茵基因脂質(zhì)體來分送。
在實際使用中，砷化物可作為活性組分按照普通的藥物混合技術(shù)與藥用載體緊密地摻合在一起。視用藥(例如口服或胃腸外給藥)所要求的制備方式的不同，載體可采取多種形式(包括片、膠囊、粉末、靜脈注射或輸注)。在制備口服劑量形式的組合物時，可采用任何一種常用的藥用介質(zhì)(media)，例如在配制口服液體制劑、如懸浮液、溶液、酏劑、脂質(zhì)體和氣溶膠時可采用水、乙二醇、油、酒精、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等；在配制口服固體制劑、如粉劑、膠囊和片劑時，可采用淀粉、蔗糖、微晶纖維素、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。在制備胃腸外劑量形式的組合物、如靜脈內(nèi)注射或輸注的組合物時，可采用類似的藥用介質(zhì)、如水、乙二醇、油、緩沖劑、蔗糖、防腐劑等，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這樣的胃腸外劑量的例子包括、但不限于葡萄糖5％w/v，生理鹽水或其它溶液。砷化物的總劑量可用例如約2ml至2000ml范圍的靜脈內(nèi)流體小瓶來給藥。稀釋流體的容積將隨著總的給藥劑量而變。例如，以10ml濃度為1mg/ml水溶液給藥的三氧化二砷是在10至500ml、5％的葡萄糖溶液中進行稀釋，并用作靜脈內(nèi)輸注約10分鐘至4小時的時間。
白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)癌病人的示例性治療過程包括每天通過靜脈內(nèi)輸注三氧化二砷水溶液，一天的給藥劑量為每公斤病人體重0.01mg至1mg。優(yōu)選每公斤體重使用0.15mg三氧化二砷。治療過程可繼續(xù)到觀察到骨髓緩解為止，或者發(fā)現(xiàn)副作用變得嚴重時即停止。該治療過程在大約10個月中可重復(fù)最多10次，在兩次過程之間停休約3～6周。緩解后治療過程包括每天每公斤病人體重輸注約0.15mg三氧化二砷，每日輸注或只在工作日輸注，累計25天。
5．實施例下面將描述用本砷化物治療各種類型白血病的使用實例。通過這些和其它的試驗，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的三氧化二砷制劑對人來說是很能耐受的。例如，有三個APL患者被給予了10mg本發(fā)明的三氧化二砷制劑，每天一次(單調(diào)劑量(flat dose)靜脈輸注。
5．1．三氧化二砷和米拉索普誘發(fā)骨髓性白血病細胞系凋亡已經(jīng)查明了As2O3和米拉索普對骨髓性白血病細胞系、包括APL細胞系NB4-306(一種從NB4衍生出來的抗維生素A酸細胞系，它已不再表達完整的PML-RARα融合蛋白)、HL-60、KG-1和骨髓單核細胞系U937的活性。為了考察PML調(diào)解砷活性的作用，本發(fā)明人還用鼠胚成纖維細胞(MEFs)和骨髓(BM)前期細胞(其中的PML基因已用同源重組的方法滅活)來試驗這些藥劑。結(jié)果出乎意料地發(fā)現(xiàn)，兩種化合物都能對所有被試的細胞系抑制其生長并誘發(fā)其凋亡。在10-7至10-3mol/l范圍內(nèi)的等摩爾濃度下，米拉索普顯示出更加有力。As2O3則把PML和PML-RARα移位到核粒上，核粒的NB4以及HL60和U937細胞系隨后即被PML降解。雖則米拉索普在抑制生長和誘發(fā)凋亡方面更加有力，但它對PML和/或PML-RARα的核定位不發(fā)生影響。此外，As2O3和米拉索普兩者都能類似地抑制PML+/+和PML-/-MEF的生長并誘發(fā)其凋亡，并且在PML+/+和PML-/-前期細胞的BM培養(yǎng)物中，抑制群落形成單位紅細胞系(CFU-E)和CFU粒性白細胞-單核細胞的形成。關(guān)于這些方法、材料和這些試驗的結(jié)果在Wang等著血液，1998，921497～1504頁中已作了詳細描述。
試驗的結(jié)果顯示，兩種砷劑在這些細胞系中的毒害效應(yīng)都不受依賴于PML或PML-RARα表達的機制的調(diào)解。在大多數(shù)細胞系中，米拉索普在抑制生長和誘發(fā)凋亡方面，比As2O3要更有力一些，而兩種藥劑的效應(yīng)都是依賴于劑量的。如前所述，已經(jīng)確認，As2O3能把PML蛋白移置到核粒上，并在NB4細胞中誘發(fā)PML和PML-RARα降解，同時觸發(fā)凋亡。但是在并不隱匿PML-RARα融合基因的HL60和U937細胞中，也觀察到了類似的效應(yīng)。加之，在所有被試的細胞系中，米拉索普都誘發(fā)凋亡而不改變PML和/或PML-RARα。
As2O3和米拉索普在體外的分化作用顯得微不足道，而且并顯得不依賴于PML和/或PML-RARα任一方的表達和/或調(diào)整。事實上，本發(fā)明人在長時間(長達2周)培養(yǎng)物中所觀察到的微小效應(yīng)，對兩種化合物在所有被試細胞系中都是相類似的。
我們還發(fā)現(xiàn)，過去曾把它與As2O3對APL的抗白血病效應(yīng)相聯(lián)系的bcl-2下調(diào)(downregulation)，也是不依賴于PML-RARα蛋白的表達的，因為bcl下調(diào)是發(fā)生在NB4亞克隆306內(nèi)，而在BN4亞克隆306內(nèi)，未受損傷的蛋白是測不出來的。最后，為試驗PML表達對砷劑的抗白血病效應(yīng)是否重要，兩種藥劑都在鼠胚胎的成纖維細胞和動物的BM細胞中作過試驗，其中的野生型(wild-type)PML已被同源重組所消滅。在這些細胞中全都缺乏PML表達，As2O3和米拉索普在抑制生長和誘發(fā)凋亡方面都同樣有效，而且兩者對正常CFU-E和CFU-GM群落形成都有相似的效果。此外，在野生型和PML-/-細胞之間沒有發(fā)現(xiàn)有區(qū)別。同時，不受任何理論的約束，這些資料強烈地支持著這樣的理論，即這些砷劑的抗白血病效應(yīng)是獨立于PML和PML-RARα兩者的表達而發(fā)生的。這些結(jié)果與砷劑對不以改變PML蛋白為特征的疾病，為慢性髓細胞白血病的藥用歷史相符。
這些結(jié)果表明，As2O3和米拉索普作為抗白血病藥劑都對骨髓的和淋巴的兩類疾病具有廣泛的效果。結(jié)論是，這些資料表明，毒害細胞的活性是不受PML蛋白調(diào)解的，因而也不限于與PML表達變化有關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明的砷化物具有潛在的更廣泛的不受限于APL的治療作用。
5．2．對晚期白血病患者進行的米拉索普臨床研究米拉索普是一種有機砷劑，它由氧化蜜胺胂與二巰基丙醇復(fù)合而成，它最早用于治療非洲錐蟲病。對米拉索普對以慢性B-細胞淋巴組織增生病為代表的細胞系誘發(fā)凋亡的效應(yīng)已經(jīng)作了研究，其結(jié)果如下所述。
米拉索普(商品名為Arsobal(硫砷蜜胺)(36mg/ml)，由賓夕法尼亞州Collegeville的Rhone Poulenc Rorer銷售)在丙二醇中被稀釋成基本原料濃度為10-4mol/L并在室溫下貯存。As2O3(Sigma公司，St．Louis，密蘇里州)被溶解在1.65mol/L的氫氧化鈉(NaOH)中，基本原料濃度為10-3mol/L。在RPMI 1640的介質(zhì)中進行連續(xù)稀釋(10-6至10-9mol/l)。把Epstein-Barr病毒(EBV)轉(zhuǎn)化的B-前淋巴細胞系(JVM-2)、EVB轉(zhuǎn)化的B-細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)細胞系(I83 CLL)和一種非EBV轉(zhuǎn)化的B-CLL細胞系(WSU-CLL)用作靶子。米拉索普的劑量響應(yīng)試驗(10-～10-mol/L)進行了96小時。
出乎意料的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，米拉索普在所有三種細胞系中都能引起隨劑量和時間而改變的對成活和生長的抑制。與此相反，As2O3在相似的濃度下對生活力或生長都不起作用。24小時后，所有三種用米拉索普(10-7mol/l)處理的細胞系都呈現(xiàn)出凋亡的形態(tài)學(xué)特征。在WSU-CLL、183CLL和JVM-2細胞暴露于米拉索普24小時后，觀察到了bcl-2 mRNA的下調(diào)顯著地隨濃度而變。在所有三種細胞紗中也觀察到了bcl-2蛋白表達的減少，而As2O3對此項參數(shù)不起作用。
在已知上述體外資料已出乎意料地顯示，米拉索普一般在濃度比As2O3為低的情況下對骨髓和淋巴細胞兩者都具有廣泛的抗白血病活性的情況下，又開始了一項研究，以便估量米拉索普對復(fù)發(fā)的或頑固性白血病患者的藥物動力學(xué)、安全性和潛在效率。
對適宜的病人進行了治療試驗，采用簡單的一日注射四次，連注三日，每周重復(fù)一次，延續(xù)三周，對有響應(yīng)的病人再外加三周的治療過程。最初的劑量是第1日mg/kg，第2日2mg/kg，第3日3.6mg/kg，以后各天均為此劑量。平行進行的體外研究包括新鮮白血病細胞對米拉索普和As2O3兩者的培養(yǎng)物敏感性，同時對表面抗原表達、調(diào)亡、以及bcl-2表達進行連續(xù)流動血細胞計數(shù)(serial flowcytometric)的研究。三個AML患者和一個CML患者參與了此項研究。
用一臺敏感度約為10mg/ml的高性能液體色譜儀進行測定，最初的藥物動力學(xué)資料表明，血漿藥物濃度的峰值Cmax范圍為注射后立即測定的第1天的1.2ng/ml至第3天測定的2.4ng/ml。雖然初始的分配相很迅速，但延長的T12Y]]>卻表明是從深的腔室中釋放出來的。在濃度～時間曲線下的血漿面積(AUCs)是與給藥劑量成正比的，其范圍為第1天的0.48ng·h/ml至第3天的1.48ng·h/ml。可測量到的藥劑濃度是在初始劑量給藥1周后的血漿中發(fā)現(xiàn)的。藥物較好地被耐受了。不利效應(yīng)包括注射處的瞬時疼痛和溫和的惡心。沒有發(fā)現(xiàn)有“反射性腦病”(在治療CNS錐蟲病時偶有發(fā)現(xiàn))的跡象。
這些研究的結(jié)果說明米拉索普可能具有比As2O3更廣泛的活性；以及在體外能毒害白血病細胞的濃度，在治療上也將方便地在活體內(nèi)取得這一濃度。
5．3．三氧化二砷能誘發(fā)K562慢性髓細胞白血病(CML)細胞的凋亡費城染色體陽性CML細胞系K562被用來克定三氧化二砷(As2O3)是否能促進CML的凋亡。在對數(shù)期內(nèi)的細胞懸浮培養(yǎng)物被暴露于1×10-6M、5×10-6M和1×10-5M、濃度的As2O3中。在72小時過程的多個時間點上分析了細胞的整除部分，以評估其生存能力和凋亡。生存能力用錐蟲藍排斥法來衡量；與此同時，凋亡則用形態(tài)學(xué)、流動血細胞計數(shù)法和DNA凝膠電泳法來測定。
濃度為10-6M的三氧化二砷對K562細胞的生長或生存能力不起作用。對細胞生長和存活有最大作用的是1×10-5M的As2O3。暴露于As2O372小時后K562細胞的生長和生存能力數(shù)據(jù)報告于下表1中表1細胞生長損害％存活％p值對照 0 92.1+0.95×10-6M As2O363.078.8±0.5 0.00011×10-5M As2O375.361.9+2.9 0.0223對這一由砷誘發(fā)的生存能力降低即是代表著凋亡的證據(jù)進行了分析。凋亡的形態(tài)學(xué)特征、包括膜發(fā)泡和核凝縮，在用10-5M As2O3孵育72小時的K562細胞的染色的細胞自旋(cytospins)中是清晰可見的。這一點與DNA核間體損失的證據(jù)相互關(guān)聯(lián)，該損失證據(jù)可借助于從暴露于10-5M As2O3的K562細胞中萃取出來的DNA的凝膠電泳而看到。用隧道法測量所進行的對凋亡的定量評估展示出有75.6％±8.6(1×10-5M As2O3)的細胞在72小時時凋亡，而對照組只有6.3％±3.0的細胞凋亡。用10-5M As2O3處理K562細胞，用Northern分析法測定的結(jié)果是p21 mRNA上調(diào)，這說明細胞被阻于細胞循環(huán)的G1相內(nèi)。這一資料指明，三氧化二砷是CML的治療劑。
5．4．用維生素A酸和三氧化二砷(As2O3)對PML-RARα和PLZF-RARα轉(zhuǎn)基因小鼠進行的治療試驗急性前髓細胞白血病(APL)伴有染色體的易位，它總是包括有染色體17上的維生素A酸受體α(RARα)部位轉(zhuǎn)移到基因組內(nèi)的其它部位上，例如在大多數(shù)APL情況下，PML基因位于染色體15上，而在少數(shù)情況下，PLZF基因則位于染色體11上。隱匿有t(15；17)的患者對用全反維生素A酸(ATRA)治療是很敏感的，能產(chǎn)生出75％至95％的完全緩解率。與t(11；17)(PLZF-RARα)有關(guān)的APL顯示出對ATRA反應(yīng)很小。
為試驗As2O3對治療APL的效能，在轉(zhuǎn)基因小鼠身上制造了兩種疾病模型。用標準技術(shù)產(chǎn)生出轉(zhuǎn)基因小鼠，其法是把PML-RARα或PLZF-RARα融合蛋白的表達置于骨髓-前髓細胞特異性人組織蛋白酶-G(hcG)小基因的控制之下。hcG-PML/RARα和hcG-PLZF-RARα兩種轉(zhuǎn)基因小鼠都發(fā)展成了骨髓性白血病，其APL特性類似于人的APL。
對這些白血病小鼠用下列方案進行了治療試驗1)ATRA，每天每克體重口服1.5μg；以及2)ATRA每天每克體重腹膜內(nèi)給藥6μg。小鼠每周取一次血樣以評估其反應(yīng)。
PML/RARα白血病對ATRA響應(yīng)良好，緩解率很高(第1方案為80％)。令人驚喜的是，在試管中，ATRA能誘發(fā)分化并能抑制白血病細胞生長，同時還能對PML-RARα和PLZF-RARα兩種白血病在骨髓和脾前期細胞中的白血病群落形成進行抑制。另外，在活體外的試驗中，取自PLZF-RARα小鼠的白血病細胞，在用ATRA預(yù)孵育以后被移植到受體無胸腺小鼠后已失去了它的致腫瘤能力，而未經(jīng)處理的細胞則能致腫瘤。但是，在活體內(nèi)，PLZF-RARα白血病對ATRA(28％，用第1方案)響應(yīng)很差，但較高劑量的ATRA(50％，用第2方案)則顯示出較為有效?？傊琍LZF-RARα變基因小鼠的白血病對ATRA治療反應(yīng)敏感，但可能要求用高劑量ATRA的治療方案。這些發(fā)現(xiàn)在治療隱匿有t(11；17)的APL患者中具有直接的影響。
在PML-RARα和PLZF-RARα兩種白血病中，ATRA能延長存活時間，但白血病在短時緩解后會復(fù)發(fā)，并對進一步的ATRA治療產(chǎn)生抗藥性。該兩種轉(zhuǎn)基因小鼠模型還用來試驗As2O3的效能和劑量，并對抗拒ATRA的APL患者和伴有t(11；17)的APL患者作了ATRA+As2O3結(jié)合治療的試驗。治療方案是腹膜內(nèi)給藥每克體重每天6μg As2O3或6μg As2O3與1.5或6μg ATRA的結(jié)合劑。小鼠每周抽血樣一次以便評估APL的緩解情況。
5．5．藥用方劑的制造及其穩(wěn)定性固態(tài)超純?nèi)趸?As2O3)被溶解在5M的氫氧化鈉(NaOH)溶液中。該懸浮液在室溫下被攪拌5分鐘，產(chǎn)生出清澈均勻的溶液。As2O3溶液(2ml，1.0M)被加入到500ml錐形瓶中的393.6ml水中，配出As2O3濃度為1mg/ml和pH值=12的溶液。在250ml錐形瓶中用HCl(49.26ml，37％wt/wt，10/15M)與H2O(50.74ml)配制出5M的HCl。該HCl溶液稍后用注射器轉(zhuǎn)移到1000ml空的抽真空容器中。As2O3溶液用HCl(0.725ml，5.0M)回滴定到pH8.0。大約10ml的回滴定As2O3溶液被通過Millex-GS 0.22μm的過濾器進行過濾，并被加入到30個抽真空的消毒小瓶中。為制成能給病人作靜脈內(nèi)注射的藥用組合物，從其中兩個小瓶中抽出10ml這種溶液并加入到500ml 5％葡萄糖溶液中配成最終pH值為6.5。
本體超始材料的高純度用原子吸收比色法確認(見表2)對四種中間步驟或最終步驟溶液的復(fù)制樣品測定了總的砷含量。測定本體粉末確認了起始材料的超高純度。中間的和最終的產(chǎn)品溶液中的砷含量資料列于下表2中。
下表的數(shù)據(jù)顯示，溶液是穩(wěn)定的，因為經(jīng)過一段時間后沒有出現(xiàn)任何砷的重量損失的跡象。
表2三氧化二砷中間制劑和最終產(chǎn)品溶液中的砷含量(ppm)
*樣品代碼的特性A-01最初溶解在NaOH中后的中間產(chǎn)品溶液。
A-02在HCl滴定前的中間產(chǎn)品溶液。
A-03在Millex過濾前的中間產(chǎn)品。
A-04制造后立即從10ml消毒小瓶中取出的最終產(chǎn)品。
A-05制造二個月后從加蓋小瓶中取出的最終產(chǎn)品。
6．實施例對APL患者的臨床試驗在APL患者中對三氧化二砷進行評估，以確定該制劑是否誘發(fā)了細胞分化或誘發(fā)了凋亡。十二個經(jīng)過多種治療而復(fù)發(fā)的患者用三氧化二砷治療，使用劑量為每天0.06至0.2mg/kg，直到骨髓緩解為止。借助于對免疫表型、現(xiàn)場雜交熒光(FISH)作流動血細胞計數(shù)；對凋亡伴隨蛋白、Caspase 1、2和3的PML/RARα表達、西部吸印表達(Western blot expression)作逆向轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reversetranscription polymerase chain reaction(RT-PCR))測定，來對骨髓單核細胞作一系列的監(jiān)視。結(jié)果顯示，低劑量的三氧化二砷對APL復(fù)發(fā)病人有很高的誘導(dǎo)全面緩解的效應(yīng)。臨床響應(yīng)伴隨有不完全的細胞分化和通過白血病細胞被caspase激活誘發(fā)凋亡。
6．1．方法臨床治療方案適宜性要求包括對APL的診斷，借助于對t(15；17)易位作細胞遺傳學(xué)分析或作現(xiàn)場雜交熒光(FISH)分析，或者對PML/RARα作逆向轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)測定來確認。病人必須是經(jīng)過標準治療、包括全反維生素A酸加上與毒害細胞的藥劑相結(jié)合治療而復(fù)發(fā)的。要求有對通知的簽字同意，而且治療方案要經(jīng)過該中心建立的檢查局的檢查和批準。
三氧化二砷治療三氧化二砷是以10ml的小瓶、藥物濃度為1mg/ml的水溶液來供應(yīng)的。該藥再稀釋到500ml 5％的葡萄糖溶液中并每天一次靜脈輸注2～4小時。與最初的同齡組病人接受10或15mg/d的單調(diào)劑量的同時，有兩個孩子的治療安排促使發(fā)明了直到現(xiàn)在還未聽說的以體重為根據(jù)治療方案(0.15mg/kg/d)。每天都給藥，直到觀察到骨髓緩解為止。得到完全緩解的病人適宜在前述療程后再作3到6周的補充療程。后續(xù)療程一般給的劑量是0.15mg/kg/d，累計25天，可以每天給藥，也可以只在工作日給藥，在大約10個月中最多6個療程。
研究期間的監(jiān)視有凝血病的患者給以血小板和鮮凍血漿的輸液，以使血小板計數(shù)和血纖維蛋白原分別保持在≥50，000細胞/mm3和≥100mg/d1的目標水平。連續(xù)地獲取血液計數(shù)、凝血試驗、血清化學(xué)分布、尿分析和心電圖。按基準抽取骨髓和/或做活組織檢查，并在此后定期進行，直到病案文件證明已經(jīng)緩解。觀察了普通的反應(yīng)判斷標準，包括骨髓恢復(fù)到≤5％未成熟細胞、末稍血白細胞≥3000細胞/mm3、血小板≥10，000細胞/mm3。
細胞免疫表型研究收集了肝素化的骨髓或血液樣品，并用Ficoll-Hypaque離心法分離出了單核細胞。借助于直接免疫熒光染色法測定了表面膜抗原，染色是用isethiocynate熒光素(FITC)或結(jié)合有藻紅蛋白的單克隆抗體CDl6(Leu 11a)、CDl1b、CD33(LeuM9)、HLA-DR、CD45和CD14進行，這些抗體可從Becton-Dickinson(Mountainview，加里福尼亞州)或Immunotech Immunology(Marseille，法國)購得。雙色染色是借助于用兩種單克隆抗體、包括CD33-PE/CDllb-FITC和CD33-PE/CD16-FITC同時對細胞進行孵育來實現(xiàn)的。使用不相干的同型單克隆免疫球蛋白做的陰性對照組也同時進行了分析。流動血細胞計數(shù)分析用一臺配有488nm氬激光器的EPICS Profile Ⅱ型流動血細胞計數(shù)器(Coulter Electronics)來進行。分散到前面和側(cè)面的細胞的參數(shù)系用CD45/CD14染色法分辨出感興趣的種群并把單細胞排除出分析門(analysis gate)的辦法來測定并合并的。使用了多參數(shù)資料收集和展示系統(tǒng)(MDADS，CoulterElectronics)來獲取和分析資料。
現(xiàn)場雜交熒光(FISH)將選定的經(jīng)受過CD33和CD11b免疫熒光染色的標本。對共同表達為兩種抗原的細胞用FACStar Plus型細胞分類器(Becton-Dickinson)進行了分類。分離出來的細胞在培養(yǎng)介質(zhì)中在37℃下孵育一小時，用低張溶液0.075M KCl處理5分鐘，在甲醇∶乙酸的比例為3∶1的固定劑中作固定，并被在空氣中干燥。使用一種特定的PML/RARα易位的雙色探測劑(Vysis；Downer’sGrove，伊利諾斯州)進行了分裂間期的FISH。簡單地說，取自分裂間期細胞的DNA用把載玻片浸入75℃的50％甲酰胺/2xSSC溶液中5分鐘的辦法使之變性；隨后把載玻片用酒精脫水并在空氣中干燥。涂敷了一層雜交混合物中的探測劑混合物(mixture of probe)，用蓋片蓋上，并用橡膠粘合劑封閉。雜交是在潮濕的室內(nèi)，在37℃下進行了12至16小時。雜交后隨即把載玻片在45℃下，放下50％甲酰胺/2xSSC溶液中清洗三次，每鎰10分鐘，隨后再在45℃下放入2xSSC/0.1NP-40溶液中清洗5分鐘，以除去未結(jié)合的探測劑。該載玻片然后被在空氣中干燥并用4’，6-雙脒基-2-苯基吲哚進行復(fù)染，并用玻璃蓋片蓋住。分裂間期細胞的熒光信號分析是用一臺裝在蔡司軸鏡(axioscope)上的Photometrics Sensys照相機進行的。對每種樣品至少研究300個細胞。
西部吸印分析將細胞放入含有以下組分的緩沖液中溶解50mMTris-HCl、0.5mM亞乙基二醇[bis]-[氨?；鵠四乙酸、170mM NaCl、1mM dithiothreitel、0.2％NP-40、0.01U/ml抑肽酶、10μg/ml亮肽素、10μg/ml胃酶抑素，以及1μM苯基甲基磺?；?全部購自Sigma)。在后，該溶胞產(chǎn)物用超聲均漿器(417C系列，Cole Parmer儀器公司，芝加哥，伊利諾斯州)進行聲處理，并在7500g(Sorvall儀器公司，Newtown，康涅狄格州)下進行離心分離。該溶胞產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量余用BioRad蛋白質(zhì)測定套件(Bio-Rad實驗室，Hercules，加里福尼亞州)，在595nm下按照BSA標準進行測定。把在1倍積層緩沖液中含有10％甘油、0.4％SDS、0.3％溴酚藍、0.2％焦寧染料(三基料(Trisbase)0.5M，0.8％SDS)的一種樣品緩沖液，以及20％2-巰基乙醇，加入到細胞溶胞產(chǎn)物中，并在95℃下進行熱變性3分鐘。隨后，15μg/道的蛋白質(zhì)被裝載在含有12.5％聚丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝膠上，并用電泳法按大小分級。蛋白質(zhì)被電泳吸引到Tras-Blot轉(zhuǎn)換媒介(Bio-Rad)上，并作為內(nèi)部裝載對照物用Ponceau-S進行染色，加入了兔子的抗人類(anti-human)單克隆抗體，包括caspase 1，caspase 2(兩者購自Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，加里福尼亞州)和Caspase 3(PharMingen，San Diego，加里福尼亞州)，并用ECLTM化學(xué)發(fā)光測定系統(tǒng)(Amersham，Arlington Heights，伊利諾斯州)進行了測定。蛋白帶(bands)被用計算機密度測定法作了定量。
PML/RARα的RT-PCR分析使用前述方法(見Miller等，1992，國立科學(xué)院會議錄，892694-8；Miller等，1993，血液，821689-94)進行了RT-PCR分析。
6．2．結(jié)果患者治療了12名復(fù)發(fā)的或頑固性的APL病人。所有病人都在過去接受過用類維生素A和毒害細胞藥物的多方治療(表3)。有兩位病人是從同種骨髓移植后復(fù)發(fā)的，其中一位經(jīng)供體T-細胞再輸注后失敗。有一位病人由于慢性腎衰竭而靠血液透析維持著。
臨床效應(yīng)在經(jīng)過三氧化二砷治療后，12個病人中的11個得到了完全緩解。作血液透析的那位病人在第1天遭遇了顱內(nèi)出血，在第5天死亡。在有響應(yīng)病人中，中等治療延續(xù)時間為33天(范圍為12至39日)，中等日給劑量為0.16mg/kg(范圍為0.06至0.2mg/kg)，而誘導(dǎo)期間的中等累積劑量為360mg(范圍為160至515mg)(表3)。自開始治療起斷標準取得完全緩解的中等時間為47天(范圍為24至83天)。按骨髓標準的緩解-這是停止治療的決定因素-是首先取得的，通常順序地隨之而來的是末梢血液白細胞和血小板的恢復(fù)。在此項研究所用劑量的范圍內(nèi)，在響應(yīng)的效能或時間的差異上，沒有一項是顯著的。在經(jīng)過兩個療程后，被試的11個病人中的8個的PML/RARα的RT-PCR測定都從陽性倒轉(zhuǎn)為陰性。
11個完全緩解的病人都至少用三氧化二砷實行了一次后緩解療程。有四個、兩個和一個病人總共分別實施了三次、四次和五次療程。中等緩解延續(xù)時間為5+個月(范圍為1至9+個月)。但是，11個病人中的3個在第二次療程中復(fù)發(fā)；他們中沒有一人逆轉(zhuǎn)了他們的RT-PCR測定，而每個人表達出很快有了抗藥性。這三人中的兩人從那以后就因進行性白血病而死亡。
不利事項該項研究中病人們的臨床癥狀是非常多樣的，這反映了他們過去經(jīng)受過廣泛的治療。治療方案不要求住院；有三個病人完全作為門診病人完成了誘導(dǎo)治療，僅有另外一個住院以放置靜脈導(dǎo)管。但是，有8個病人住院是因為白血病并發(fā)癥；其中5人要求調(diào)換到加強護理的單位、氣管內(nèi)插管和輔助式通氣，并發(fā)癥有肺出血、腎衰竭、膿毒病、宿主排異反應(yīng)病(graft vs．host disease)、非特異性肺浸潤、或低血壓。一個病人在形成嚴重的代謝酸中毒、血鉀過多、低血壓和腎功能不全中發(fā)展成二度心傳導(dǎo)阻滯后，要求插入永久性的起搏器。然而，雖然用進一步的三氧化二砷治療，但心傳導(dǎo)阻滯還是逆轉(zhuǎn)了。在5個病人中，由于嚴重的過程中內(nèi)科并發(fā)癥而暫時停藥，停藥中位天數(shù)為2天(范圍為1～5天)。有兩個病人發(fā)展出類似于“維生素A酸綜合癥”的癥狀，按推測二人都用地塞米松治療，得到了改善。只有兩個病人一點也沒有輸注血小板；輸注的血小板單位的中位數(shù)為61(范圍為0～586單位)。
在接診時，末梢血液白細胞總計數(shù)的中位數(shù)為4，700細胞/mm3(范圍為500至144，000細胞/mm3)。6個病人發(fā)展成白細胞增多(即≥20，000細胞/mm3)其范圍為20，800至144，200細胞/mm3。對這些病人沒有再給額外的藥物，在所有場合下，白細胞過多癥都是在沒有進一步干預(yù)的情況下得到消退的。
一般的不利反應(yīng)包括在輸注時頭暈、乏力、肌肉骨骼痛，以及輕度的血糖過多。有三個病人觸物感痛，推測是末梢神經(jīng)有病。但是，其中二人曾在輔助式通氣時長時間不能動，另一人有過早期神經(jīng)病史。
免疫表型研究APL的特征是具有表達CD33的細胞，CD33是常伴有原始(primitive)骨髓細胞的抗原。三氧化二砷治療誘導(dǎo)出了只表達CD33細胞的比例進行性地減少，同時使表達CD11b細胞的比例增加，CD11b是伴有成熟骨髓細胞的抗原。盡管這些變化可由任何誘導(dǎo)APL緩解的藥劑得到預(yù)期，但是三氧化二砷還誘導(dǎo)出了同時表達兩種抗原的細胞表達。在多數(shù)情況下，這些雙表達細胞占了骨髓細胞群體的大多數(shù)，而且它們在按臨床標準取得完全緩解后很長時期內(nèi)還繼續(xù)存在。
現(xiàn)場雜交熒光分析從完全早期緩解及較晚緩解的病人身上取出骨髓單核細胞，借助于流動血細胞計數(shù)選分出共同表達CD33和CD11b的抗原。使用現(xiàn)場雜交熒光(FISH)分析法，考察了早期緩解的300個細胞。與對照APL細胞相類似，這些細胞中的大多數(shù)產(chǎn)生出了雜種信號，這說明在PML和RAR-α基因之間發(fā)生了易位，并說明它們來源于腫瘤克隆。但是，從同一病人在緩解后期取出的細胞用相同參數(shù)再行選分時，卻只測到了正常型的熒光信號，這說明它們是從造血前期細胞衍生出來的。
西部吸印分析對從骨髓單核細胞萃取而得的蛋白萃取物作了一系列的西部吸印分析。分析表明，在活體內(nèi)caspase 2和caspase 3的前體形式在對三氧化二砷治療作出響應(yīng)中已被上調(diào)。再者，這一治療還誘導(dǎo)出了caspase 1分裂碎片的表達，這表明酶的激活作用。還有一些指證說明，caspase 3的分裂形式的表達是增加了。在這些試驗中使用的抗體不與caspase 2的分裂形式起反應(yīng)。
6．3．討論在這項研究中，被接納參加試驗的病人，除絕少例外，都是持續(xù)多次復(fù)發(fā)并抵抗普通化療、類維生素A和骨髓移植的。在治療開始時，參與此項研究的病人患有數(shù)不清的與白血病相聯(lián)系的并發(fā)癥，它們包括呼吸衰竭、彌散性水痘帶狀皰疹感染、腔曲霉病、慢性腎衰竭、以及宿主排異反應(yīng)病。另外，12個病人中的5個要求允許進入加強護理的單位，以便進行輔助式通氣和支持性護理，但是這些并發(fā)癥并不是與三氧化二砷治療直接有關(guān)的。
事實上，所有確診為APL的病人都取得了緩解，而沒有與類維生素A治療相伴的早死。雖然與全反維生素A酸治療相比所觀察到的受白細胞增多侵襲的情況要少些，但三氧化二砷仍在若干病人身上誘導(dǎo)出了此病。在停止了其它的毒害細胞的藥物后，隨著病人取得緩解，白細胞增多也就消失。
盡管有3人早期復(fù)發(fā)，受試11個病人中的8人其PML/RAR-α(殘余病癥的分子標記)的RT-PCR測定已逆轉(zhuǎn)為陰性，這是單獨用全反維生素A酸治療后不常見的現(xiàn)象。最后，三氧化二砷對APL的有效劑量至少有三倍之差，范圍為0.06至0.20mg/kg。
全反維生素A酸能誘發(fā)APL細胞的“終極”分化，但三氧化二砷的細胞分化效應(yīng)表達出是不完全的。砷能誘發(fā)出同時表達成熟細胞和非成熟細胞表面抗原特性(亦即分別為CD11b和CD33)的細胞群體。在誘導(dǎo)早期，這些細胞保留著表征APL的t(15；17)易位。出乎意料的是，盡管臨床上已完全緩解，但這些細胞在骨髓中仍繼續(xù)存在；但是在緩解后期，雙表達細胞雖能方便地測出，但在現(xiàn)場雜交中已不再是陽性。白血病細胞在治療時的形態(tài)學(xué)外觀也不象用全反維生素A酸治療時觀察到的那樣清晰可辨。事實上，許多病人的白血病細胞在10天或10天以上很少顯示出形態(tài)學(xué)變化，此后，白血病細胞的比例才進行性減少。
在“非終極”分化后，三氧化二砷接著就能誘發(fā)凋亡，同時發(fā)生表達增多以及半胱氨酸蛋白酶(術(shù)語稱為caspases)由非活性的前體向激活的酶的轉(zhuǎn)變。caspase途徑只是最近才被表征為有計劃的細胞死亡的重要途徑。在一開始，被承認是因為c．elegans蛋白質(zhì)ced-3和哺乳動物白細胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)之間是同種，現(xiàn)在，caspase家族包括至少10種不同的蛋白，它們能分裂成很多種多肽。在白血病細胞系中，用多種毒害細胞的藥劑都可誘導(dǎo)出caspase激活，包括用全反維生素A酸。由于這些酶能誘導(dǎo)出分布很廣的蛋白分解作用，因此可以認為PML/RAR-α是caspase的底物。
三氧化二砷和全反維生素A酸最后一個相似之處，是在某些個人能迅速產(chǎn)生臨床抗藥性。從兩個復(fù)發(fā)病人身上取出的白血病細胞，在試管中在濃度范圍為10-4M至10-7M下保持著敏感性。由于細胞內(nèi)輸送降低而引起對砷劑的相對抗藥性已通過與膜輸送器的下調(diào)相聯(lián)系被描述，而膜輸送器是由細菌細胞內(nèi)的ars操縱子來編碼的。哺乳動物細胞內(nèi)的抗藥性還沒有很好地加以定性，但是膜輸送的變化或者出現(xiàn)流出物可能是重要的因素。
總之，三氧化二砷能誘導(dǎo)經(jīng)過廣泛治療而復(fù)發(fā)的APL病人完全緩解。這種藥物能引起白血病細胞局部的但是不完全的細胞分化，隨后能使caspase激活并誘發(fā)凋亡。
表3急性前髓細胞白血病患者用三氧化二砷治療的臨床特征和誘導(dǎo)治療結(jié)果
所有患者先前均接受過一次或多次全反維生素A酸，外加蒽環(huán)類抗生素加阿糖胞苷的療程。*表示該個體已證實對類維生素A有抗藥性(即在再誘導(dǎo)期間缺少反應(yīng)或在保有類維生素A期間復(fù)發(fā))；*表示病人已早期死亡。其它治療amitoxantrone/依托泊苷；b同種異體的骨髓移值；c甲氨喋呤/長春新堿/6-巰嘌呤；d9-cis維生素A酸加M195(抗CD33單元隆抗體)。
7．實施例臨床應(yīng)用于淋巴瘤根據(jù)最初發(fā)現(xiàn)的三氧化二砷在試管中對B-細胞的抗腫瘤效應(yīng)，本發(fā)明人治療了一位經(jīng)過各種形式的普通治療、包括自體固有骨髓移植而復(fù)發(fā)的患有中度大細胞淋巴瘤的病人。盡管在開始三氧化二砷治療前他的病進展很快，在用三氧化二砷治療后，他的癌性淋巴結(jié)和脾的大小出現(xiàn)了較大的(＞50％)收縮，同時也伴隨著他生活質(zhì)量的較大改善。
8．實施例臨床應(yīng)用于非造血性癌(non-hematopoieticcancer)三氧化二砷也被用于治療結(jié)腸癌。在初步試驗中，有一名患結(jié)腸癌的病人接受了一次三氧化二砷治療，顯示出他的血清CEA(癌胚的抗原)水平有了很大降低。該病人接受了每公斤體重每天0.1～5mg三氧化二砷靜脈內(nèi)輸注，每天一次共5天。觀察到CEA水平由19，901ng/ml變到15，266ng/ml，減少了23％。眾所周知血清CEA水平降低是與抗腫瘤反應(yīng)相聯(lián)系的。
臨床資料確認，三氧化二砷也可用來治療其它的非造血性癌、如結(jié)腸癌。
9．實施例藥物動力學(xué)研究進行了幾項確定劑量范圍的研究，來考察As2O3在APL患者和其它血液病患者中的藥物動力學(xué)(PK)和生物學(xué)效應(yīng)。在APL病人中，借助于對免疫表型、現(xiàn)場雜交熒光(FISH)、與凋亡相伴的蛋白-caspase 1、2和3的西部吸印表達的流動細胞計數(shù)，來對骨髓單核細胞進行一系列的監(jiān)視。共同表達CD11b和CD33的細胞和用FISH分析查明，帶有t(15；17)易位的細胞在治療期間進行性地增加，并且在完全緩解的早期繼續(xù)存在。As2O3還在活體中誘導(dǎo)出了caspase 2和caspase 3的前酶的表達，并使caspase 1和caspase 3均激活。對血和尿進行的元素砷(As)PK分析顯示，As在全血中既分布在血漿中、也分布在紅血細胞部分中。平行消除曲線(parallelelimination curve)說明，這2個區(qū)室是可以自由交換的，并且從開始的半衰期約60分鐘的峰值向下衰變。第1天的平均AUC約為400ng·h/ml。在第一個24小時內(nèi)，大約20％的給藥劑量在尿內(nèi)被重新找到。
然后我們就開始對患有除APL以外的病癥的病人進行確定劑量范圍的研究，采用的劑量水平為每公斤體重每天0.1至0.15mg靜脈輸注，一個療程累積日數(shù)為25日，每3～5周做一個療程。至今已收治過10個病人，包括患有CLL(2人)、AML(3人)、淋巴瘤(4人)和CML(1人)的病人。5個病人在早期已被退出該項研究，因為他們的病情進展很快，而5個人完成了計劃的25天療程。在該劑量范圍內(nèi)，該藥物被證明是能很好地耐受的，不利的效應(yīng)包括皮疹、在輸注時頭暈、乏力、以及心電圖上QTc延長。這項正在進行的研究顯示出，臨床應(yīng)用As2O3能誘發(fā)APL的局部分化和凋亡，但是該藥劑的治療效應(yīng)并不限于這一種病。
本發(fā)明并不限于已描述的特定實施方案的范圍。的確，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，從以上描述中會很明白，在已描述的內(nèi)容中可加進本發(fā)明的各種各樣的改進。這樣的改進應(yīng)該歸屬于所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
說明書中提到過多種出版物，它們所公開的內(nèi)容全文都以參考文獻的形式引入。
權(quán)利要求
1．一種治療人的急性骨髓性白血病的方法，它包括給予急性骨髓性白血病病人治療有效量的三氧化二砷。
2．一種治療人的慢性骨髓性白血病的方法，它包括給予慢性骨髓性白血病病人治療有效量的三氧化二砷。
3．一種治療人的硬質(zhì)癌的方法，它包括給予硬質(zhì)癌病人治療有效量的三氧化二砷。
4．權(quán)利要求3的方法，其中硬質(zhì)癌是指消化道癌、軟組織癌、食管癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、乳腺癌、或前列腺癌。
5．一種治療人的對類維生素A治療有抗藥性的白血病的方法，它包括給予需要的病人治療有效量的三氧化二砷或米拉索普(melarsoprol)。
6．一種治療人的白血病、淋巴瘤或硬質(zhì)腫瘤的方法，它包括給予需要的病人治療有效量的米拉索普。
7．權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中每天三氧化二砷的給予量為約2.5-4.5mg。
8．權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中每天的給藥量為病人每公斤體重約0.15mg的三氧化二砷。
9．權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中三氧化二砷是用靜脈內(nèi)輸注法給藥。
10．權(quán)利要求1、2或5的方法，其中三氧化二砷是每天重復(fù)給藥，直到觀察出病人的骨髓緩解為止。
11．權(quán)利要求10的方法，它還包括在3至6周內(nèi)重復(fù)暫停治療一到十次的步驟，并恢復(fù)三氧化二砷每天給藥每周五至七次，累積日數(shù)共25天。
12．權(quán)利要求1、2或5的方法，其中也給予病人全反維生素A酸。
13．權(quán)利要求3或4的方法，其中三氧化二砷每天重復(fù)給藥共5天。
14．權(quán)利要求13的方法，該方法每月重復(fù)一次。
15．權(quán)利要求6的方法，其中每天米拉索普的給藥量為病人每公斤體重約0.5至5mg。
16．一種制造適合人服用的、含有三氧化二砷的、無菌藥用組合物的方法，它包括(a)將三氧化二砷溶解在pH值大于12的水溶液中；(b)用鹽酸把該三氧化二砷溶液中和到pH值約為8.5；(c)將步驟(b)的三氧化二砷溶液在藥用載體稀釋，該載體使pH值穩(wěn)定并降到約7；以及(d)將該藥用組合物消毒；
17．一種適合于注入人體的無菌藥用組合物，其中含有置于藥用載體中的三氧化二砷和葡萄糖。
18．權(quán)利要求17的藥用組合物，它含有1mg/ml的三氧化二砷。
全文摘要
本發(fā)明涉及用砷化物來治療多種白血病、淋巴瘤和硬質(zhì)腫瘤。另外,該砷化物也可與其它治療劑如類維生素A結(jié)合使用。本發(fā)明還提供出生產(chǎn)三氧化二砷制劑的方法。
文檔編號A61K31/53GK1285743SQ98813016
公開日2001年2月28日 申請日期1998年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月10日
發(fā)明者小R·P·瓦雷爾, P·P·潘多菲, J·L·加布里洛維 申請人:斯?。瓌P特林紀念癌癥中心