專利名稱：角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子－2制劑的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)及其衍生物的液體和凍干制劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及KGF-2制劑，尤其是局部和注射用制劑，它們能用于對(duì)需要軟組織生長(zhǎng)和再生的適應(yīng)癥的治療用途。
KGF最初根據(jù)序列同源性或因子純化和克隆被確定為FGF家族的一員。角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)作為有絲分裂原從培養(yǎng)的鼠角質(zhì)形成細(xì)胞系中分離(Rubin，J.S.等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86802-806(1989))。不同于FGF家族的其它成員，它對(duì)間充質(zhì)衍生的細(xì)胞沒有活性，但刺激上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子是由來(lái)源于皮膚和胎肺的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的(Rubin等人(1989))。發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA在成人腎、結(jié)腸和髂骨中表達(dá)，但不在腦或肺中表達(dá)(Finch，P.W.等人，科學(xué)(Science)245752-755(1989))。KGF顯示FGF蛋白質(zhì)家族內(nèi)的保守區(qū)。KGF可與FGF-2受體高親和力地結(jié)合。
損害性創(chuàng)傷愈合是發(fā)病的一個(gè)重要來(lái)源，可導(dǎo)致如破裂、吻合破裂和非愈合性創(chuàng)傷等并發(fā)癥。在正常個(gè)體中，可以無(wú)并發(fā)癥地實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷愈合。相反，損傷愈合與幾種病癥如糖尿病、感染、免疫抑制、肥胖癥和營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)(Cruse，P.J.和Foord，R.，外科文獻(xiàn)(Arch.Surg.)107206(1973)；Schrock，T.R.等人，外科紀(jì)事(Ann.Surg.)177513(1973)；Poole，G.U.，Jr.，外科學(xué)(Surgery)97631(1985)；Irvin，G.L.等人，美國(guó)外科學(xué)(Am.Surg.)51418(1985))。
創(chuàng)傷修復(fù)是復(fù)雜相互作用和生物過(guò)程的結(jié)果。在正常創(chuàng)傷愈合中描述了三個(gè)階段急性炎癥期、胞外基質(zhì)和膠原蛋白合成，以及重塑(Peacock，E.E.，Jr.，《創(chuàng)傷修復(fù)》(Wound Repair)，第二版，WB Saunders，Philadelphia(1984))。過(guò)程包括角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞在創(chuàng)傷部位的相互作用。
將能促進(jìn)并增強(qiáng)軟組織生長(zhǎng)和再生的多肽配制于藥物組合物中是希望的，該組合物(1)在長(zhǎng)期的儲(chǔ)存期中穩(wěn)定，(2)提高了多肽的藥理學(xué)活性或效力，并且/或者(3)允許治療方案中多肽的方便應(yīng)用或施用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及KGF-2及其缺失或點(diǎn)突變或置換突變體(在此稱為KGF-2多肽)的液體和凍干制劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些KGF-2多肽制劑促進(jìn)或加速軟組織生長(zhǎng)或再生的應(yīng)用，例如用于創(chuàng)傷愈合或治療粘膜炎(mucocytis)或炎癥性腸病。本發(fā)明的優(yōu)選制劑使用KGF-2的新突變體形式，在一個(gè)實(shí)施方案中使用一種在此被稱為KGF2-Δ33的缺失突變體。制劑中使用的輔助成分(1)為KGF-2多肽提供貯存穩(wěn)定性，(2)進(jìn)一步增強(qiáng)治療組合物的軟組織愈合活性，并且/或者(3)以活性形式提供KGF-2多肽，而允許用于特殊治療目的的方便應(yīng)用或施用。
本發(fā)明的第一方面涉及一種含有KGF-2多肽和具有約pH5.0-約pH8.0緩沖容量的緩沖劑的制劑。有用的緩沖劑包括磷酸鹽、乙酸鹽、烏頭酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、碳酸鹽和檸檬酸鹽緩沖劑，檸檬酸鹽緩沖劑是優(yōu)選的。
本發(fā)明的第二方面涉及一種含有KGF-2多肽、凍干填充劑和具有約pH5.0-約pH8.0緩沖容量的緩沖劑的制劑。有用的緩沖劑包括磷酸鹽、烏頭酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、碳酸鹽和檸檬酸鹽緩沖劑，檸檬酸鹽緩沖劑是優(yōu)選的。
本發(fā)明的第三方面涉及一種含有KGF-2多肽和一種能穩(wěn)定KGF-2多肽的含硫醇化合物、優(yōu)選為單硫代甘油的制劑。該制劑優(yōu)選地包含一種具有約pH5.0-約pH8.0緩沖容量的緩沖劑。該制劑也可包含一種或多種抗氧化劑和/或一種或多種金屬螯合劑。
本發(fā)明的第四方面涉及一種含有KGF-2多肽、緩沖液和在預(yù)定溫度下使制劑形成膠體的高分子量化合物的制劑。一種優(yōu)選的高分子量化合物是普流羅尼(Pluronic)或泊洛沙姆(Poloxamer)聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。含硫醇化合物如單硫代甘油也能包含于該制劑中為多肽提供更強(qiáng)的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的第五方面涉及一種含有KGF-2多肽、緩沖劑和增稠劑的制劑。增稠劑用于提高制劑的粘度。優(yōu)選的增稠劑是羧甲基纖維素(CMC)、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、Natrosol和卡波姆(Carbomer)。
另外，本發(fā)明的制劑也可含有金屬螯合劑、抗氧化劑或含硫醇化合物，如抗壞血酸酯、單硫代甘油、半胱氨酸、生育酚、丁基化羥基苯甲醚、硫酸鈉、硫酸氫鈉和焦亞硫酸鈉，以及防腐劑如酚、氯丁烷、苯甲醇、羥苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯。本發(fā)明的制劑也可在瓶子的液上空間中具有氮?dú)飧采w層。此外，也可包括用氦、氬或氮?dú)馇逑磁渲凭彌_液的本發(fā)明的制劑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1C說(shuō)明KGF-2的cDNA和相應(yīng)的推斷氨基酸序列。最初的35個(gè)或36個(gè)氨基酸殘基代表推斷的前導(dǎo)序列(下劃線標(biāo)出)。使用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫。當(dāng)試圖測(cè)定多核苷酸序列時(shí)，測(cè)序錯(cuò)誤是一個(gè)常見的問(wèn)題。用373自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems，Inc.)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序準(zhǔn)確度預(yù)計(jì)大于97％(SEQ ID NO1和2)。
圖2(A)-2(C)描述本發(fā)明的KGF-2多肽對(duì)正常原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激。圖2(A)顯示KGF-2對(duì)正常原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激。圖2(B)顯示KGF-2Δ33對(duì)正常原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激。圖2(C)顯示KGF-2Δ28對(duì)正常原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激。
圖3顯示KGF-2Δ33液體制劑的生物活性結(jié)果-10個(gè)月的穩(wěn)定性。
圖4顯示KGF-2Δ33凍干制品的生物活性結(jié)果-9個(gè)月的穩(wěn)定性。
圖5顯示單硫代甘油對(duì)KGF-2生物活性的作用。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述KGF-2刺激表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，但不刺激間充質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞的增殖。因此，“具有KGF-2蛋白質(zhì)樣活性的多肽”包括在以下所述角質(zhì)形成細(xì)胞增殖測(cè)定中顯示KGF-2活性并可與FGF受體同種型1-iiib和2-iiib結(jié)合的多肽。
本發(fā)明涉及KGF-2多肽的藥用和獸醫(yī)制劑。此處參考圖1(SEQ IDNO2)的多肽或保藏cDNA所編碼的多肽定義KGF-2多肽，其包括圖1(SEQ ID NO2)的多肽或保藏cDNA所編碼的多肽的片段、衍生物和類似物，它們基本上保留了與親代多肽相同的生物功能。本發(fā)明中使用的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，KGF-2多肽在pH4.5或更低時(shí)或在高于大約8.0的pH時(shí)顯示極低的活性和穩(wěn)定性。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，KGF-2多肽氧化并沉淀。當(dāng)試圖配制這些多肽以用于治療目的時(shí)，顯示出一定的困難。為了保持物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性，KGF-2多肽能與抗氧化劑(如氧清除劑)和/或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(如含硫醇化合物)和/或金屬螯合劑(如EDTA)一起配制。此處應(yīng)用時(shí)，穩(wěn)定是指保持KGF-2多肽的物理化學(xué)性質(zhì)和基本生物活性一定時(shí)期。
根據(jù)本發(fā)明的制劑包括凝膠、增稠溶液、溶液和凍干形式。在此也將制劑稱為“藥物組合物”或“組合物”。注射用制劑液體制劑本發(fā)明的第一方面涉及KGF-2多肽的液體制劑，它含有KGF-2多肽和一種緩沖容量為約pH5.0-約pH8.0、更優(yōu)選地pH5.5-pH6.5、最優(yōu)選地pH6.2的緩沖劑。可用的緩沖劑包括由磷酸、乙酸、烏頭酸、檸檬酸、戊二酸、蘋果酸、琥珀酸和碳酸衍生的緩沖劑。一般使用的是上述酸之一的堿或堿土鹽。更優(yōu)選地，緩沖劑是乙酸鹽或檸檬酸鹽，最優(yōu)選地是檸檬酸鹽。例如，該制劑可以包含一種通過(guò)將緩沖量的檸檬酸或其藥學(xué)可接受的鹽與KGF-2Δ33水溶液混合而成的組合物。此外該制劑也可包含一種通過(guò)將緩沖量的乙酸或其藥學(xué)可接受的鹽與KGF-2Δ33水溶液混合而成的組合物。優(yōu)選的緩沖劑濃度為約5mM-約50mM。最優(yōu)選地，乙酸緩沖劑具有約20mM的濃度，而檸檬酸緩沖劑為約10mM-約20mM。該制劑也可含有濃度為約0.01mM-約150mM、最優(yōu)選地約125mM的NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)物(tonicifier)，和濃度為約0.1mM-約10mM、最優(yōu)選地約1mM的金屬螯合劑，如EDTA。另外，本發(fā)明的液體制劑也可含有一種或多種(a)穩(wěn)定量的抗氧化劑，如抗壞血酸鹽，和/或(b)蛋白質(zhì)穩(wěn)定量的硫醇化合物，如單硫代甘油(MTG)。不希望為理論所束縛，可以認(rèn)為，硫醇化合物如MTG用來(lái)保護(hù)KGF-多肽中存在的游離巰基。液體制劑的貯存條件一般為約2℃-約8℃。此外，貯存條件也可為-20℃或更低。最優(yōu)選地，貯存條件為約-20℃。以冷凍狀態(tài)保藏KGF-2液體制劑可限制多肽的氧化量，其隨后產(chǎn)生穩(wěn)定的多肽制劑。
優(yōu)選地，液體制劑含有(1)一種治療有效量的KGF-2多肽；(2)一種有效量的緩沖劑，其具有約pH5.0-約pH8.0的緩沖容量；和(3)一種藥學(xué)可接受的稀釋劑；和(4)任選地一種或多種下列成分(a)NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)物，(b)一種螯合劑，(c)一種穩(wěn)定量的抗氧化劑，和(d)一種穩(wěn)定量的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
KGF-2多肽優(yōu)選地在溶液中保存。
本發(fā)明的組合物是通過(guò)將上列成分混合在一起而制備的，優(yōu)選地以此處所述的濃度和比例。
能在液體制劑中使用的抗氧化劑包括抗壞血酸、生育酚和丁基化羥基苯甲醚。另外，能在液體制劑中使用的穩(wěn)定劑也包括硫醇如半胱氨酸、甲硫氨酸和單硫代甘油。能使用的螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(DPTA)，EDTA是優(yōu)選的。
含有抗氧化劑或硫醇的本發(fā)明的制劑能提高KGF-2多肽的穩(wěn)定性。這使得可能得到具有更長(zhǎng)保存期的藥用產(chǎn)品。
更優(yōu)選的液體制劑含有(1)一種KGF-2多肽，濃度為約0.02-約40mg/ml(w/v)，更優(yōu)選地約0.05-約30mg/ml(w/v)，甚至更優(yōu)選地約0.1-約20mg/ml(w/v)，再更優(yōu)選地約10mg/ml(w/v)，最優(yōu)選地約0.2-4mg/ml；(2)一種緩沖劑，緩沖容量為約pH5.0-約pH8.0，濃度為約5mM-約50mM，優(yōu)選地約5mM-約30mM；和(3)一種藥學(xué)可接受的稀釋劑，優(yōu)選地為水，用來(lái)使組合物達(dá)到指定體積。
可用于本發(fā)明的制劑的緩沖劑包括由乙酸、烏頭酸、檸檬酸、戊二酸、蘋果酸、琥珀酸、磷酸和碳酸衍生的緩沖劑。一般使用的是上述酸之一的堿或堿土鹽。乙酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑如乙酸或其藥學(xué)可接受的鹽、或檸檬酸或其藥學(xué)可接受的鹽是優(yōu)選的。溶液制劑的優(yōu)選pH范圍為約pH5.0-約pH8.0，優(yōu)選地pH5.5-pH6.5，最優(yōu)選地約pH6.2。乙酸鈉或檸檬酸鈉是優(yōu)選的緩沖劑，檸檬酸鈉是最優(yōu)選的。
也可向上述溶液中優(yōu)選地加入(4)一種螯合劑，如EDTA，濃度為約0.1mM-約10mM，更優(yōu)選地約1mM；(5)濃度為約0.01mM-約150mM、更優(yōu)選地約125mM的NaCl。
任選地，液體制劑中也可含有一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定量的化合物，其選自(a)約0.5％-約2％w/v甘油，(b)約0.1％-約1％w/v甲硫氨酸，或
(c)約0.1％-約2％w/v單硫代甘油。
本發(fā)明此方面的優(yōu)選實(shí)施方案包括一種通過(guò)混合下列成分而成的組合物(1)一種KGF-2多肽，濃度為約0.02-約40mg/ml(w/v)，更優(yōu)選地約0.1-約20mg/ml，最優(yōu)選地約0.2-4mg/ml；(2)10mM檸檬酸鈉或20mM乙酸鈉；(3)125mM NaCl；(4)1mM EDTA；和(5)水作為稀釋劑。
更優(yōu)選地，溶液制劑包括一種通過(guò)混合下列成分而形成的組合物(1)約0.2-4mg/ml的KGF-2多肽；(2)20mM乙酸鈉；(3)125mM NaCl；(4)1mM EDTA；和(5)水作為稀釋劑，其中該溶液約pH6.2，貯存于約-20℃。
發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，KGF-2多肽易于氧化、聚集和從溶液中沉淀。盡管KGF-2的氧化不破壞生物活性，但限制產(chǎn)物的氧化程度產(chǎn)生更穩(wěn)定的產(chǎn)物。發(fā)明者觀察到，如果液體制劑在太低的pH時(shí)，KGF-2多肽將喪失生物活性。另外，當(dāng)溶液的pH接近KGF-2的pI時(shí)，蛋白質(zhì)將從溶液中沉淀。因此，發(fā)明者確定，液體制劑應(yīng)當(dāng)在約pH6.0-約pH7.0的范圍中保存，約6.2的pH最適于穩(wěn)定KGF-2多肽。而且，發(fā)明者意外地確定，檸檬酸鹽緩沖液尤其能穩(wěn)定KGF-2多肽。
盡管，約pH6.0-6.2的檸檬酸鹽緩沖液的使用產(chǎn)生了能降低KGF-2多肽的聚集而提高穩(wěn)定性的液體制劑，但液體多肽制劑仍可遭受KGF-2多肽的氧化和沉淀。因此，發(fā)明者發(fā)展了一種如下所述的凍干制劑。凍干制劑本發(fā)明的第二方面涉及KGF-2多肽的凍干制劑，其含有一種KGF-2多肽和一種緩沖容量為約pH5.0-約pH8.0、更優(yōu)選地pH5.5-pH6.5、最優(yōu)選地pH6.2的緩沖劑?？捎玫木彌_劑包括由磷酸鹽、烏頭酸、檸檬酸、戊二酸、蘋果酸、琥珀酸和碳酸衍生的緩沖劑。一般使用的是上述酸之一的堿或堿土鹽。更優(yōu)選地，緩沖劑是磷酸鹽或檸檬酸鹽，最優(yōu)選地是檸檬酸鹽。例如，該制劑可以包含一種通過(guò)將緩沖量的檸檬酸或其藥學(xué)可接受的鹽與KGF-2Δ33水溶液混合而成的組合物。優(yōu)選的緩沖劑濃度為約5mM-約50mM，更優(yōu)選地約10mM。最優(yōu)選地，以約10mM的濃度加入檸檬酸鹽緩沖劑。該制劑中優(yōu)選地也含有濃度為約0.01mM-約150mM、最優(yōu)選地約20mM的NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)物，和濃度為約0.01mM-約10mM、最優(yōu)選地約1mM的金屬螯合劑如EDTA。另外，制劑中也可含有填充劑/冷凍保護(hù)劑，如蔗糖、甘氨酸、甘露醇、海藻糖或其它藥學(xué)可接受的填充劑。使用的填充劑的量將是，使得溶液為等滲的，并在約2％-約10％w/v的范圍內(nèi)。優(yōu)選的濃度如下5％甘露醇、7％蔗糖、8％海藻糖或2％甘氨酸+0.5％蔗糖。更優(yōu)選地，使用蔗糖或蔗糖/甘氨酸混合物。另外，本發(fā)明的凍干制劑也可含有一種或多種(a)穩(wěn)定量的抗氧化劑，如抗壞血酸鹽，或(b)穩(wěn)定量的硫醇化合物，例如單硫代甘油。凍干制劑的貯存條件一般為約2℃-約25℃。更優(yōu)選地，貯存條件為等于或低于約2℃-約8℃。
以初始溶液中約0.02mg/ml-約10mg/ml蛋白質(zhì)的濃度冷凍干燥KGF-2多肽。
初始凍干溶液優(yōu)選地含有(除了KGF-2多肽之外)(1)有效量的檸檬酸或其藥學(xué)可接受的鹽，優(yōu)選地檸檬酸鈉，濃度為約5mM-約20mM；(2)濃度為約0.01mM-約125mM的NaCl；(3)濃度為約0.1mM-約10mM的EDTA；(4)蔗糖、甘露醇、甘氨酸或海藻糖中的一種或多種，濃度為約2％w/v-約15％w/v；和(5)水。
凍干緩沖液的優(yōu)選pH范圍為約5.5-約8.0，優(yōu)選地約pH6.2。
更優(yōu)選地，凍干緩沖液含有10mM檸檬酸鈉、20mM氯化鈉、1mMpH6.2的EDTA二鈉和7％蔗糖。
凍干的KGF-2多肽制劑用無(wú)菌水重建，以保持約290mOsm的等滲條件。KGF-2多肽能用任選地含有穩(wěn)定量的抗氧化劑的無(wú)菌水重建，包括a)約0.01％-約2％w/v的單硫代甘油，b)約0.01％-約2％w/v的抗壞血酸，c)約0.01％-約2％w/v的甲硫氨酸，或d)其組合。
本發(fā)明包括產(chǎn)生穩(wěn)定KGF-2多肽制劑的冷凍干燥循環(huán)。冷凍干燥循環(huán)用來(lái)使KGF-2多肽產(chǎn)物在初步干燥階段低于其垮塌溫度。另外，含濕量?jī)?yōu)選地低于5％，更優(yōu)選地低于2％。這一方案必須在個(gè)體基礎(chǔ)上對(duì)任一特殊蛋白質(zhì)而定。對(duì)于含有蔗糖的根據(jù)本發(fā)明的凍干制劑的KGF-2，一個(gè)典型的凍干循環(huán)確定如下
本發(fā)明的凍干制劑提供一種具有特別增高的穩(wěn)定性的產(chǎn)品。確實(shí)，本發(fā)明的凍干KGF-2制劑在高達(dá)45℃的溫度下可生物學(xué)穩(wěn)定至少9個(gè)月(圖4)。反相HPLC證明，本發(fā)明的凍干KGF-2制劑在45℃或低于45℃的溫度及75％的相對(duì)濕度下保持其物理化學(xué)性質(zhì)可達(dá)8個(gè)月。在這樣高的溫度下如此持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)度的穩(wěn)定性對(duì)蛋白質(zhì)而言是極不尋常的。增稠與凝膠制劑本發(fā)明的第三方面涉及KGF-2多肽的增稠或凝膠制劑。
1)增稠劑可以向上述液體制劑中加入增稠劑來(lái)提高所得到的制劑的粘度。具有提高的粘度的制劑可利于在受控釋放、與創(chuàng)傷形狀的粘附或避免流出可能是重要之處的局部施用。這類增稠制劑可用于局部應(yīng)用，如創(chuàng)傷愈合，來(lái)治療皮膚病或能通過(guò)KGF-2藥物組合物的局部施用而治療的其它任何應(yīng)用。
增稠劑將使粘度升高到約50-約10，000厘泊，更優(yōu)選地約50-約1，000厘泊，最優(yōu)選地約200-約300厘泊。粘度用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)定。增稠劑的最優(yōu)選濃度是0-5％(w/w)。增稠溶液將一直保持液態(tài)。
適當(dāng)增稠劑的實(shí)例包括但不限于，水溶性醚化纖維素和卡波姆(與烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚交聯(lián)的丙烯酸的高分子量聚合物)。醚化纖維素的例子在本領(lǐng)域眾所周知(USP中列出)，包括烷基纖維素、羥烷基纖維素和烷基羥烷基纖維素，例如，甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，局部或切口凝膠可含有約0％-約20％重量的分子量約50，000-約700，000的纖維素衍生物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維素衍生物以約2％-約8％重量存在，并具有約80，000-約240，000的分子量。優(yōu)選的纖維素衍生物是羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素。
當(dāng)向以上詳述的注射用制劑中加入增稠劑時(shí)，為了獲得最佳穩(wěn)定性可加入或從制劑中去除鹽和緩沖劑。例如，可提高檸檬酸鹽濃度。檸檬酸鹽的優(yōu)選濃度是，例如約10mM-約500mM檸檬酸鹽，更優(yōu)選地約10mM-約50mM檸檬酸鹽，最優(yōu)選地約10mM-約20mM檸檬酸鹽。另外，在凍干制劑中可將蔗糖的量降低為約0％-約5％蔗糖。
可將增稠劑直接加入根據(jù)本發(fā)明的液體制劑中然后冷凍干燥。此外，根據(jù)本發(fā)明的凍干制劑可以通過(guò)加入適當(dāng)?shù)南♂寗?、最?yōu)選地加入其中溶解有增稠劑的水來(lái)重建。這些增稠制劑能夠通過(guò)噴霧施用。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選增稠KGF-2多肽溶液的一個(gè)實(shí)例包含通過(guò)混合下列成分而成的產(chǎn)物(1)一種局部有效量的KGF多肽，優(yōu)選地KGF-2Δ33；
(2)約10mM-約500mM檸檬酸鈉緩沖劑；(3)約0.01-約150mMNaCl；(4)約0.75-約1.27mM、優(yōu)選地約1mM EDTA；(5)約0.1％-約7％蔗糖；(6)約0.75％-約1.5％(w/w)羧甲基纖維素，或約0.5％-約1.5％羥丙基甲基纖維素，或約0.25％-約0.75％羥乙基纖維素，或約0％-1％卡波姆，或其任意組合。
這種制劑的pH最優(yōu)選地為pH6.2。2)膠凝劑本發(fā)明的另一方面涉及KGF-2多肽的凝膠制劑。可以向本發(fā)明的注射用制劑中加入膠凝劑，以得到一種在室溫下保持液態(tài)而當(dāng)施用于皮膚表面(約37℃)時(shí)凝固的制劑。這些制劑可用于在受控釋放、與創(chuàng)傷形狀的粘附或避免流出可能是重要之處的局部施用。這些凝膠制劑可用于局部應(yīng)用如創(chuàng)傷愈合，來(lái)治療皮膚病或能通過(guò)KGF-2藥物組合物的局部施用而治療的其它任何應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的KGF-2多肽的凝膠制劑含有(1)一種局部有效量的KGF多肽；(2)一種緩沖劑；(3)一種藥學(xué)可接受的稀釋劑，優(yōu)選地是水；和(4)一種形成凝膠的高分子量化合物。
本發(fā)明的凝膠制劑的粘度在室溫下可以是約1-約10，000厘泊，最優(yōu)選地在室溫下約20-約100厘泊。粘度用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)定。
本發(fā)明中使用的凝膠形成高分子量化合物一般是能形成粘性水溶液的水溶性聚合物，或非水溶性、水溶膨性聚合物(例如膠原蛋白)，它們也能形成粘性溶液，并且在與皮膚接觸后形成膠體。
可用的凝膠形成高分子量化合物可選自乙烯基聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、多糖、蛋白質(zhì)、聚(環(huán)氧乙烷)、丙烯酰胺聚合物及其衍生物和/或鹽。在美國(guó)專利號(hào)5，427，778中能發(fā)現(xiàn)能用來(lái)制備在愈合創(chuàng)傷中使用的藥用凝膠制劑的其它化合物，此處完全引用作為參考。
可用的乙烯基聚合物(或取代的聚乙烯)包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇?？捎玫亩嗵前ɡw維素衍生物、糖胺聚糖、瓊脂、果膠、藻酸、葡聚糖、淀粉(α-直鏈淀粉或支鏈淀粉)和脫乙酰殼多糖。可用的糖胺聚糖包括透明質(zhì)酸、軟骨素、軟骨素-4-硫酸、硫酸乙酰肝素和肝素。糖胺聚糖可用來(lái)與其它任一凝膠形成聚合物如膠原蛋白、明膠、纖連蛋白一起加速創(chuàng)傷痊愈。丙烯酰胺聚合物可以是聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺聚合物。
優(yōu)選的高分子量凝膠形成化合物是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，尤其是那些商品名為普流羅尼(PLURONICS)(BASF)或泊洛沙姆(POLAXAMERS)(BASF)的嵌段共聚物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝膠可以含有約10％-約60％重量的平均分子量為約500-50，000的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝膠可以含有約14％-約18％重量的分子量為1，000-15，000的嵌段共聚物。本發(fā)明的優(yōu)選嵌段共聚物是普流羅尼F108和普流羅尼F127。
聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(普流羅尼或泊洛沙姆)具有用于局部藥物遞送系統(tǒng)的巨大潛力，因?yàn)樗鼈冿@示反熱膠凝行為，具有良好的藥物釋放特征和低毒性。當(dāng)溶液升溫時(shí)凝膠形成。因此，凝膠在室溫下是低粘度的水溶液，而在接觸哺乳動(dòng)物身體以及被體溫升溫后，因溶液形成凝膠而粘度升高。普流羅尼凝膠能用于KGF-2多肽向例如創(chuàng)傷及希望局部遞送的其它部位的受控遞送。KGF-2多肽能與普流羅尼以液態(tài)結(jié)合，并施用于傷口。膠凝發(fā)生，并有效地降低了多肽釋放至傷口的速率，從而允許多肽與創(chuàng)傷部位之間的長(zhǎng)時(shí)間接觸。使用這種凝膠制劑的優(yōu)點(diǎn)包括使傷口保持濕潤(rùn)，和使藥用化合物適合傷口或適合可施用該化合物的其它部位。
根據(jù)本發(fā)明的KGF-2多肽的優(yōu)選凝膠制劑包含檸檬酸鹽緩沖劑和普流羅尼。該制劑也可含有一定量的檸檬酸或其藥學(xué)可接受的鹽。
根據(jù)本發(fā)明的凝膠制劑也可含有螯合劑、穩(wěn)定量的抗氧化劑或硫醇。凝膠制劑將含有一種高分子量的化合物，如普流羅尼，或?qū)⑿纬赡z的量的水溶性醚化纖維素等。在根據(jù)本發(fā)明的凝膠制劑中，KGF-2多肽優(yōu)選地為約0.01mg/ml-約10mg/ml的濃度。
優(yōu)選地，凝膠制劑通過(guò)混合下列成分而形成(1)一種KGF-2多肽，優(yōu)選地KGF-2Δ33，終計(jì)算濃度為0.01mg/ml-約10mg/ml；(2)一種有效量的緩沖劑；(3)約10％-約60％、或更優(yōu)選地約14％-約18％重量的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，其具有約500-50，000的平均分子量；和(4)一種藥學(xué)可接受的稀釋劑，優(yōu)選地水。
另一種優(yōu)選凝膠制劑含有(1)一種藥學(xué)有效量的KGF-2多肽；(2)約10mM-約500mM檸檬酸鈉；(3)約0.01mM-約150mM NaCl；(4)約1mM EDTA；(5)約0.1％-約7％蔗糖；(6)約14％-約18％普流羅尼F127；和(7)水，其中該制劑的pH為約pH6.2。
最優(yōu)選地，凝膠制劑含有(1)一種KGF-2多肽，優(yōu)選地KGF-2Δ33，濃度為約0.01mg/ml-約10mg/ml(w/v)，更優(yōu)選地約0.1mg/ml-約3mg/ml，最優(yōu)選地約0.2mg/ml；(2)濃度約5mM-約20mM的檸檬酸鈉；(3)約10％-約25％(w/v)、優(yōu)選地約15％-約25％、最優(yōu)選地約16％的普流羅尼F127或泊洛沙姆407；(4)約6.7％-約7.3％蔗糖，優(yōu)選地約7％蔗糖；和(5)水，加至所需體積。
凝膠制劑任選地進(jìn)一步含有一種或多種下列成分
(6)濃度約0.1mM-約10mM的EDTA。
(7)濃度約0.01mM-約125mM的NaCl 。凝膠制劑的優(yōu)選pH范圍是約pH5.0-約pH8.0，優(yōu)選地pH6.2，得到的凝及制劑應(yīng)當(dāng)是等滲的。3)其它穩(wěn)定劑所有上述本發(fā)明的制劑都可能得益于抗氧化劑、金屬螯合劑、含硫醇化合物和其它普通穩(wěn)定劑。這些穩(wěn)定劑的實(shí)例包括但不限于(a)約0.5％-約2％w/v甘油，(b)約0.1％-約1％w/v甲硫氨酸，(c)約0.1％-約2％w/v單硫代甘油，(d)約1mM-約10mM EDTA，(e)約0.01％-約2％w/v抗壞血酸，(f)0.003％-約0.02％w/v聚山梨酯80，(g)0.001％-約0.05％w/v聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)葡聚糖硫酸酯，(k)環(huán)化糊精，或(l)其組合。KGF-2多肽的施用本發(fā)明的KGF-2多肽制劑可以使用公知在藥物組合物中有用的適當(dāng)藥用稀釋劑。這類稀釋劑包括但不限于鹽水、緩沖鹽溶液、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。制劑應(yīng)當(dāng)適合施用模式。優(yōu)選地，如上所述根據(jù)本發(fā)明配制藥物組合物。水是優(yōu)選的稀釋劑。
在藥物組合物中，具有KGF-2活性的多肽可以與一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑一起施用。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)對(duì)病人施用時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物的總每日用法由主治醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)決定。對(duì)于任一特定患者的特殊治療有效劑量水平取決于多種因素，包括待達(dá)到的反應(yīng)的類型和程度；特殊組成，包括是否使用其它試劑；患者的年齡、體重、全身健康狀況、性別和飲食；組合物的施用時(shí)間、施用途徑和排除速度；治療持續(xù)時(shí)間；與特定組合物一起或同時(shí)使用的藥物(如化療劑)；以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的其它因素。本領(lǐng)域中公知的適當(dāng)制劑能在《Remington藥物學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(最新版)，Mack Publishing Company，Easton，PA中見到。此處所用的“有效量”的KGF-2(包括KGF-2有效量)因而取決于這些因素。
本發(fā)明的藥物組合物可以以常規(guī)方法施用，如經(jīng)口、直腸、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、吸入、眼球內(nèi)或真皮內(nèi)途徑。腸胃外和局部輸送是優(yōu)選的施用途徑。此處所用的術(shù)語(yǔ)“腸胃外”是指包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射及輸注的施用模式。
藥物組合物以可有效治療和/或預(yù)防特殊適應(yīng)癥的量施用。在大多數(shù)情況中，KGF-2劑量為每日約1μg/kg-約30mg/kg體重，需考慮施用途徑、癥狀等。然而，劑量也能低至0.001μg/kg。例如，在局部施用的特殊情況中，施用劑量?jī)?yōu)選地為約0.01μg-9mg每平方厘米。在鼻內(nèi)和眼內(nèi)施用時(shí)，施用劑量?jī)?yōu)選地為約0.001μg/ml-約10mg/ml，更優(yōu)選地約0.05mg/ml-約4mg/ml。
作為一般問(wèn)題，腸胃外施用的KGF-2多肽的總藥物有效量為約1μg/kg/天-10mg/kg患者體重/天，盡管如上所述這要由治療決定。如果連續(xù)施用，KGF-2多肽一般通過(guò)每天1-4次注射或通過(guò)連續(xù)皮下輸注例如使用微型泵(mini-pump)以約1μg/kg/小時(shí)-約50μg/kg/小時(shí)的劑量率施用。也可使用靜脈袋溶液或瓶溶液。
如果持續(xù)長(zhǎng)于特定最小天數(shù)-對(duì)于小鼠為7天，則影響纖維蛋白溶解系統(tǒng)的KGF-2多肽治療過(guò)程似乎是最佳的。觀察改變所需的治療時(shí)間和發(fā)生反應(yīng)所需的治療后間隔似乎依希望的效果而不同。
對(duì)于腸胃外施用，在一個(gè)實(shí)施方案中，KGF-2多肽通常如下配制，以希望的純度，以單位劑量可注射形式(溶液、懸液或乳劑)，將其與一種藥學(xué)可接受的載體混合，即在使用的劑量和濃度時(shí)對(duì)接受者無(wú)毒性的載體，并且與該制劑的其它成分相容。例如，該制劑優(yōu)選地不包含氧化劑和公知對(duì)多肽有害的其它化合物。
通常，通過(guò)使KGF-2多肽與液體載體或磨碎的固體載體(或此兩者)均勻并緊密地接觸而制備這些制劑。然后，必要時(shí)使產(chǎn)物成形為希望的制劑。優(yōu)選地，該載體是一種腸胃外載體，更優(yōu)選地是一種與接受者血液等滲的溶液。這些載體的實(shí)例包括水、鹽水、林格液和葡萄糖溶液。非水載體如固定油和油酸乙酯以及脂質(zhì)體在此也是有用的。在《Remington藥物學(xué)》(最新版)，Mack Publishing Company，Easton，PA中能發(fā)現(xiàn)本領(lǐng)域所知的適當(dāng)制劑。
也可對(duì)眼睛施用KGF-2多肽，作為液體、滴劑或增稠液-一種凝膠，來(lái)治療動(dòng)物和人中的淚腺損傷、疾病和病理。
也能作為液滴或以噴霧形式對(duì)鼻粘膜鼻內(nèi)施用KGF-2多肽，治療動(dòng)物和人鼻粘膜和鼻竇上皮的疾病、損傷和病理。
通常，通過(guò)使KGF-2多肽與液體載體或磨碎的固體載體(或此兩者)均勻并緊密地接觸而制備這些制劑。然后，必要時(shí)使產(chǎn)物成形為希望的制劑。優(yōu)選地，該載體是一種腸胃外載體，更優(yōu)選地是一種與接受者血液等滲的溶液。這些載體的實(shí)例包括水、鹽水、林格液和葡萄糖溶液。非水載體如固定油和油酸乙酯以及脂質(zhì)體在此也是有用的。在《Remington藥物學(xué)》(最新版)，Mack Publishing Company，Easton，PA中能發(fā)現(xiàn)本領(lǐng)域所知的適當(dāng)制劑。
載體也可含有小量的適當(dāng)添加劑，如提高等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這些物質(zhì)在使用的劑量和濃度時(shí)對(duì)接受者無(wú)毒性，包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸和其它有機(jī)酸或其鹽；抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，如血清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖和其它糖類，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；平衡離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑，如聚山梨酯、泊洛沙姆或PEG。
KGF-2一般在這些載體中配制，濃度約為0.01μg/ml-50mg/ml，優(yōu)選地0.01μg/ml-10mg/ml，pH約5-約8，優(yōu)選地約6-約7，最優(yōu)選地約pH6.2。應(yīng)當(dāng)理解，前述某些賦形劑、載體或穩(wěn)定劑的使用將產(chǎn)生KGF-2鹽的制劑。
用于治療施用的KGF-2可以是無(wú)菌的。通過(guò)無(wú)菌濾膜(例如，0.2微米膜)過(guò)濾可輕易地達(dá)到無(wú)菌。治療用KGF-2組合物可被置于一種具有無(wú)菌入口的容器中，例如一種具有可被皮下注射針頭穿透的塞子的靜脈溶液袋或小瓶。
KGF-2通常作為水溶液或用于重建的凍干制劑貯存于單劑量或多劑量容器中，例如，密封的安瓿或小瓶。凍干制劑的一個(gè)例子是，3ml小瓶中充滿1ml無(wú)菌過(guò)濾的1％(w/v)KGF-2水溶液，并凍干所得混合液。用可能任選地含有一種或多種抗氧化劑的注射用水重建凍干KGF-2，制備輸注溶液。
也可以用患者特異的方式安排劑量，以提供血液中預(yù)定濃度的KGF-2活性，例如通過(guò)RIA技術(shù)所測(cè)定的。因此患者劑量可調(diào)節(jié)為達(dá)到常規(guī)的前進(jìn)性波谷血液水平，如通過(guò)RIA所測(cè)定的，大約50-1000ng/ml，優(yōu)選地150-500ng/ml。
KGF-2也可通過(guò)緩釋系統(tǒng)適當(dāng)施用。緩釋組合物的合適例子包括成形顆粒的半透性聚合物基質(zhì)，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)包括polyactide(美國(guó)專利號(hào)3，773，919、EP 58，481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物(U.Sidman等人，生物聚合物(Biopolymer)22547-556(1983))、聚(異丁烯酸2-羥乙基酯)(R.Langer等人，生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志(J.Biomed.Mater.Res.)15167-277(1981)和R.Langer，化學(xué)技術(shù)(Chem.Tech.)1298-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(R.Langer等人，同前)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133，988)。緩釋KGF-2組合物也包括脂質(zhì)體包埋的KGF-2。含有KGF-2的脂質(zhì)體通過(guò)本身已知的方法制備DE 3，218，121；Epstein等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊823688-3692(1985)；Hwang等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊774030-4034(1980)；EP52，322；EP 36，676；EP 88，046；EP143，949；EP 142，641；日本專利申請(qǐng)83-118008；美國(guó)專利號(hào)4，485，045和4，544，545；和EP 102，324。通常，脂質(zhì)體是小的(約200-800埃)單層類型，其中液體含量高于約30mol百分?jǐn)?shù)膽固醇，為用于最佳KGF-2治療調(diào)整所選比例。
本發(fā)明也提供一種藥物包或試劑盒，其包含一種或多種充滿本發(fā)明藥物組合物的一種或多種成分的容器。與這些容器相連的可能是控制藥物或生物產(chǎn)品生產(chǎn)、使用或出售的政府機(jī)關(guān)所規(guī)定形式的通知，該通知反映生產(chǎn)、使用或出售機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人類施用。另外，本發(fā)明的多肽、激動(dòng)劑和拮抗劑可以與其它治療化合物結(jié)合使用。
當(dāng)發(fā)明者檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的配方制備的KGF-2多肽的生物活性和穩(wěn)定性時(shí)，驚奇地發(fā)現(xiàn)，單硫代甘油的使用可以穩(wěn)定KGF-2多肽，并可作為KGF-2多肽的增效劑在創(chuàng)傷愈合中起作用。單硫代甘油增效作用的最佳濃度范圍為0.1％-2％w/v。KGF-2多肽KGF-2刺激上皮細(xì)胞和表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，但不刺激間充質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞。因此，“具有KGF-2蛋白質(zhì)樣活性的多肽”包括在以下和美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?8/910，875所述角質(zhì)形成細(xì)胞增殖測(cè)定中顯示KGF-2活性并可與FGF受體同種型1-iiib和2-iiib結(jié)合的多肽。盡管活性程度不需要與KGF-2蛋白質(zhì)相同，但優(yōu)選地，“具有KGF-2蛋白質(zhì)樣活性的多肽”顯示與KGF-2蛋白質(zhì)基本上類似的活性(即，相對(duì)于參照KGF-2蛋白質(zhì)，候選多肽顯示更高的活性，或至多低10倍、優(yōu)選地至多低約2倍的活性)。
本發(fā)明的制劑中使用的KGF-2多肽可具有或可不具有N端甲硫氨酸，優(yōu)選地該多肽缺乏N端甲硫氨酸。
KGF-2 cDNA克隆于1994年11月16日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，專利保藏所，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209保藏為ATCC保藏號(hào)75977。另外，插入表達(dá)載體pHE4-5中的編碼KGF-2Δ33的cDNA于1998年1月9日在ATCC保藏為ATCC號(hào)209575。
當(dāng)涉及圖1(SEQ IDNO2)的多肽或保藏cDNA所編碼的多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”意思是一種基本上保留了與這種多肽相同的生物功能或活性的多肽。因此，類似物包括能通過(guò)原蛋白質(zhì)(proprotein)部分的切割所活化，產(chǎn)生活性成熟多肽的原蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
圖1(SEQ ID NO2)的多肽或保藏cDNA所編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)其中一種或多種氨基酸殘基被置換為一種保守性或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選地一種保守氨基酸殘基)，并且這種置換氨基酸殘基可能是或可能不是由遺傳密碼所編碼，或(ⅱ)其中一種或多種氨基酸殘基含有一種取代基，或(ⅲ)其中成熟多肽與另一種化合物，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)相融合，或(ⅳ)其中其它氨基酸與成熟多肽融合，如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于成熟多肽純化的序列或原蛋白質(zhì)序列。從此處所述判斷出，這些片段、衍生物和類似物處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“肽”和“寡肽”被認(rèn)為是同義的(如同通常認(rèn)為的)，當(dāng)需要表示通過(guò)肽鍵偶聯(lián)的至少兩個(gè)氨基酸的鏈時(shí)，每個(gè)術(shù)語(yǔ)能互換使用。術(shù)語(yǔ)“多肽”在此用于含有超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的鏈。所有寡肽和多肽通式或序列在此都從左向右并以從氨基端到羧基端的方向書寫。
本領(lǐng)域中應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，KGF-2多肽的某些氨基酸序列能夠改變而對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能無(wú)顯著影響。如果考慮這些序列差異，應(yīng)當(dāng)記住，在蛋白質(zhì)上存在決定活性的關(guān)鍵區(qū)。通常，只要使用行使相似功能的殘基，則替換形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的殘基是可能的。在其它情況中，如果在蛋白質(zhì)的非關(guān)鍵區(qū)發(fā)生改變，則殘基類型可能是完全不重要的。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選地為分離的形式?！胺蛛x的多肽”是指從其天然環(huán)境中分離的多肽。因此，在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生和/或含有的多肽被認(rèn)為是為了本發(fā)明而分離的。同樣也指從重組宿主細(xì)胞或天然來(lái)源中部分或充分純化的多肽。
本發(fā)明的藥用制劑包括SEQ ID NO2的KGF-2多肽(尤其是成熟多肽)及其缺失突變體，以及與SEQ ID NO2的多肽及其缺失突變體至少有90％、95％、96％、97％、98％、99％相似性(更優(yōu)選地至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)的多肽，也包括這些多肽的部分，這部分多肽(如以下所述的缺失突變體)通常含有至少30個(gè)氨基酸、更優(yōu)選地至少50個(gè)氨基酸。
如本領(lǐng)域中所知，兩種多肽之間的“相似性”是通過(guò)將一種多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸置換序列與第二種多肽的序列相比較而確定的。
兩種多肽的‘％相似性”是指用Bestfit程序(Wisconsin序列分析軟件包，第8版for Unix，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)集團(tuán)，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)和測(cè)定相似性的默認(rèn)設(shè)置，比較兩種多肽的氨基酸序列所產(chǎn)生的相似性得分。Bestfit使用Smith和Waterman(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Advances in Applied Mathematics)2482-489，1981)的局部同源性算法，尋找兩種序列之間相似性的最佳節(jié)段。
具有與KGF-2多肽參照氨基酸序列至少例如95％“相同的”氨基酸序列的多肽是指，除了多肽序列可以在KGF-2多肽的參照氨基酸的每100個(gè)氨基酸中包含可達(dá)5個(gè)氨基酸改變之外，該多肽的氨基酸序列與參照序列相同。換句話說(shuō)，為了獲得具有與參照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，可以使參照序列中高達(dá)5％的氨基酸殘基缺失或置換為另一種氨基酸，或者可以向參照序列中插入可達(dá)參照序列總氨基酸殘基5％的許多氨基酸。參照序列的這些改變可以發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基端或羧基端位置，或這些末端位置之間的任一處，它們或者單個(gè)散布于參照序列的殘基中，或者散布于參照序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)相鄰基團(tuán)中。
作為具體問(wèn)題，任一特定多肽與例如圖1所示氨基酸序列[SEQ IDNO2]或與保藏cDNA克隆所編碼的氨基酸序列是否至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，能用公知的計(jì)算機(jī)程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析軟件包，第8版for Unix，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)集團(tuán)，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)常規(guī)確定。當(dāng)使用Bestfit或其它任一序列對(duì)比程序來(lái)確定一種特定序列是否與根據(jù)本發(fā)明的參照序列例如95％相同時(shí)，設(shè)置參數(shù)，當(dāng)然，使得對(duì)參照氨基酸序列的全長(zhǎng)計(jì)算同一性的百分?jǐn)?shù)，并且允許可達(dá)參照序列氨基酸殘基總數(shù)5％的同源性缺口。KGF-2缺失突變體天然KGF-2在水溶液狀態(tài)時(shí)相對(duì)不穩(wěn)定，并在加工與貯存期間經(jīng)受化學(xué)與物理降解，導(dǎo)致生物活性的喪失。在升高的溫度下，天然KGF-2也傾向于在水溶液中聚集，并在酸性條件下失活。
特別優(yōu)選的KGF-2多肽是以下所示的缺失突變體(編號(hào)從蛋白質(zhì)中的第一個(gè)氨基酸(Met)開始)Thr(殘基36)--Ser(殘基208)Ser(46)--Ser(208)Cys(37)--Ser(208) Pro(47)--Ser(208)Gln(38)--Ser(208) Glu(48)--Ser(208)Ala(39)--Ser(208) Ala(49)--(Ser(208)Leu(40)--Ser(208) Thr(50)--Ser(208)Gly(41)--Ser(208) Asn(51)--Ser(208)Gln(42)--Ser(208) Ser(52)--Ser(208)Asp(43)--Ser(208) Ser(53)--Ser(208)Met(44)--Ser(208) Ser(54)--Ser(208)Val(45)--Ser(208) Ser(55)--Ser(208)Ser(56)--Ser(208)Phe(57)--Ser(208)Ser(59)--Ser(208)Ser(62)--Ser(208)Ala(63)--Ser(208)Gly(64)--Ser(208)
Arg(65)--ser(208)Val(67)--Ser(208)Ser(69)--Ser(208)Val(77)--Ser(208)Arg(80)--Ser(208)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--His(207)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Val(206)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Val(205)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Met(204)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Pro(203)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Leu(202)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Phe(201)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--His(200)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Ala(199)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Ser(198)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Thr(197)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Asn(196)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Lys(195)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Arg(194)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Arg(193)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Thr(192)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Lys(191)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Arg(188)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Arg(187)Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Lys(183)優(yōu)選實(shí)施方案包括N端缺失Ala(63)--Ser(208)(KGF-2Δ28)和Ser(69)--Ser(208)(KGF--2Δ33)。其它優(yōu)選的N端和C端缺失突變體包括Ala(39)--Ser(208)、Pro(47)--Ser(208)、Val(77)--Ser(208)、Glu(93)--Ser(208)、Glu(104)--Ser(208)、Val(123)--Ser(208)和Gly(138)--Ser(208)。其它優(yōu)選的C端缺失突變體包括Met(1)、Thr(36)或Cys(37)--Lys(153)。
本發(fā)明也包括從N端和C端均缺失氨基酸的缺失突變體。這些突變體包括上述N端缺失突變體和C端缺失突變體的所有組合，例如，Ala(39)--His(200)、Met(44)--Arg(193)、Ala(63)--Lys(153)、Ser(69)--Lys(153)等。能用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組技術(shù)進(jìn)行這些組合。
因此，本發(fā)明的藥用制劑中使用的優(yōu)選KGF多肽包括N端缺失突變體，包括那些除了圖1(SEQ ID NO2)的至少前38個(gè)N端氨基酸殘基(即，至少M(fèi)et(1)--Gln(38)的缺失)但最多前147個(gè)N端氨基酸殘基的缺失之外，含有圖1所示氨基酸序列(SEQ ID NO2)的突變體?；蛘?，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少前38個(gè)N端氨基酸殘基(即，至少M(fèi)et(1)--Gln(38)的缺失)但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失。或者，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少前46個(gè)N端氨基酸殘基但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失?；蛘?，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQID NO2)的至少前62個(gè)N端氨基酸殘基但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失。或者，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少前68個(gè)N端氨基酸殘基但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失。此外，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少前76個(gè)N端氨基酸殘基但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失?；蛘?，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少前92個(gè)N端氨基酸殘基但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失?；蛘?，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少前103個(gè)N端氨基酸殘基但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失。或者，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少前122個(gè)N端氨基酸殘基但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失。
除了含有范圍為上述N端缺失突變體的KGF-2突變體的制劑之外，本發(fā)明也涉及一種含有上述范圍所有組合的制劑，例如，圖1(SEQ IDNO2)的至少前62個(gè)N端氨基酸殘基但最多前68個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少前62個(gè)N端氨基酸殘基但最多前76個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少前62個(gè)N端氨基酸殘基但最多前92個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少前62個(gè)N端氨基酸殘基但最多前103個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少前68個(gè)N端氨基酸殘基但最多前76個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少前68個(gè)N端氨基酸殘基但最多前92個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少前68個(gè)N端氨基酸殘基但最多前103個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEO ID NO2)的至少前46個(gè)N端氨基酸殘基但最多前62個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少前46個(gè)N端氨基酸殘基但最多前68個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少前46個(gè)N端氨基酸殘基但最多前76個(gè)N端氨基酸殘基的缺失；等等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有C端缺失突變體的制劑。優(yōu)選地，所述C端缺失突變體的N端氨基酸殘基是圖1(SEQ ID NO2)的氨基酸殘基1(Met)、36(Thr)或37(Cys)。這些含有突變體的制劑包括那些除了圖1(SEQ ID NO2)的至少最后一個(gè)C端氨基酸殘基(Ser(208))但最多最后55個(gè)C端氨基酸殘基的缺失(即，氨基酸殘基Glu(154)--Ser(208)的缺失)之外，含有圖1所示氨基酸序列(SEQ IDNO2)的突變體?；蛘?，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQID NO2)的至少最后一個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后65個(gè)C端氨基酸殘基的缺失。或者，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ IDNO2)的至少最后10個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后55個(gè)C端氨基酸殘基的缺失。或者，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少最后20個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后55個(gè)C端氨基酸殘基的缺失?；蛘?，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少最后30個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后55個(gè)C端氨基酸殘基的缺失?；蛘?，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少最后40個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后55個(gè)C端氨基酸殘基的缺失?；蛘?，該制劑含有一種突變體，其具有包括圖1(SEQ ID NO2)的至少最后50個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后55個(gè)C端氨基酸殘基的缺失。
除了含有范圍為上述C端缺失突變體的KGF-2突變體的制劑之外，本發(fā)明也涉及一種含有上述范圍所有組合的制劑，例如，圖1(SEQ IDNO2)的至少最后一個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后10個(gè)C端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少最后一個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后20個(gè)C端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少最后一個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后30個(gè)C端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQID NO2)的至少最后一個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后40個(gè)C端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少最后10個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后20個(gè)C端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少最后10個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后30個(gè)C端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少最后10個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后40個(gè)C端氨基酸殘基的缺失；圖1(SEQ ID NO2)的至少最后20個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后30個(gè)C端氨基酸殘基的缺失；等等。
在又另一個(gè)實(shí)施方案中，KGF-2多肽可能是一種從N端和C端殘基均缺失氨基酸的缺失突變體。這些突變體包括上述N端缺失突變體和C端缺失突變體的所有組合。這些突變體包括那些除了圖1(SEQ ID NO2)的至少前46個(gè)N端氨基酸殘基但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基的缺失，和圖1(SEQ ID NO2)的至少最后一個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后55個(gè)C端氨基酸殘基的缺失之外，含有圖1所示氨基酸序列(SEQ ID NO2)的突變體?；蛘?，一種缺失可能包括圖1(SEQ ID NO2)的至少前62、68、76、92、103或122個(gè)N端氨基酸但最多前137個(gè)N端氨基酸殘基，和圖1的至少最后10、20、30、40或50個(gè)C端氨基酸殘基但最多最后55個(gè)C端氨基酸殘基的缺失。進(jìn)一步包括上述范圍的所有組合。KGF-2置換突變體有用的KGF-2多肽包括那些具有氨基酸置換的多肽。天然成熟KGF-2含有44種帶電殘基，其中32種帶有正電荷。根據(jù)這些殘基在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的位置，一種或多種這些聚集殘基被帶有負(fù)電荷或中性電荷的氨基酸的置換，可改變相鄰殘基的靜電相互作用，并可用于達(dá)到蛋白質(zhì)的增強(qiáng)的穩(wěn)定性和聚集降低。當(dāng)制備藥用制劑時(shí)，蛋白質(zhì)的聚集不僅能引起活性的喪失而且是有問(wèn)題的，因?yàn)樗鼈兛赡苁敲庖咴缘?Pinckard等人，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)2331-340(1967)，Robbins等人，糖尿病(Diabetes)36838-845(1987)，Cleland等人，治療藥物載體系統(tǒng)評(píng)述(Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystems)10307-377(1993))。任一修飾都應(yīng)當(dāng)考慮使蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)中的電荷排斥達(dá)到最小。因此，特別關(guān)注的是帶電氨基酸被另一種電荷和被中性或帶負(fù)電氨基酸的置換。后者產(chǎn)生正電荷減少的蛋白質(zhì)，改進(jìn)了KGF-2的特性。這些改進(jìn)包括與天然KGF-2蛋白質(zhì)相比，類似物的增強(qiáng)的穩(wěn)定性和降低的聚集。
氨基酸的替換也能改變與細(xì)胞表面受體結(jié)合的選擇性。Ostade等人，自然(Nature)361266-268(1993)，敘述了導(dǎo)致TNFα只與兩種已知TNF受體之一選擇性結(jié)合的某些TNFα突變。
KGF-2分子可包括一種或多種氨基酸置換、缺失或添加，其可來(lái)源于天然突變或人工操作。一些優(yōu)選突變的實(shí)例是Ala (49) Gln， Asn (51) Ala， Ser (54)Val， Ala (63) Pro， Gly (64) Glu， Val (67) Thr， Trp (79) Val， Arg (80) Lys， Lys(87) Arg， Tyr (88) Trp， Phe (89) Tyr， Lys (91) Arg， Ser (99) Lys， Lys (102) Gln，Lys 103(Glu)， Glu (104) Met， Asn (105) Lys， Pro (107) Asn， Ser (109) Asn， Leu(111) Met， Thr (114) Arg， Glu(117) Ala， Val (120) Ile， Val (123) Ile， Ala (125)Gly， Ile (126) Val， Asn (127) Glu， Asn (127) Gln， Tyr (130) Phe， Met (134) Thr，Lys (136) Glu， Lys (137) Glu， Gly (142) Ala， Ser (143) Lys， Phe (146) Ser， Asn(148) Glu， Lys (151) Asn， Leu (152) Phe， Glu (154) Gly， Glu(154) Asp， Arg(155) Leu， Glu (157) Leu， Gly (160) His， Phe (167) Ala Asn (168) Lys， Gln(170) Thr， Arg (174) Gly， Tyr (177) Phe， Gly (182) Gln， Ala (1 85) Val， Ala (185)Leu， Ala (185) Ile， Arg (187) Gln (190) Lys， Lys (195) Glu， Thr (197) Lys， Ser(198) Thr， Arg (194)Glu， Arg(194)Gln， Lys(191)Glu， Lys(191)Gln， Arg(188)Glu，Arg(188)Gln， Lys(183)Glu.
至于命名，例如，Ala(49)Gln是指圖1(SEQ ID NO2)的位置49處的Ala被Gln代替。
改變優(yōu)選地是次要性質(zhì)的改變，如不顯著影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守性氨基酸置換。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的保守性氨基酸置換的實(shí)例如下所示芳族 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸疏水性亮氨酸異亮氨酸纈氨酸極性 谷氨酰胺天冬酰胺堿性 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性 天冬氨酸谷氨酸小丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸甘氨酸當(dāng)然，技術(shù)人員所進(jìn)行的氨基酸置換的數(shù)量取決于許多因素，包括上述因素。一般而言，對(duì)于任一給定的KGF-2多肽，置換的數(shù)量根據(jù)目的不超過(guò)50、40、30、20、10、5或3個(gè)。例如，能在KGF-2的C端進(jìn)行多個(gè)置換以提高穩(wěn)定性。
對(duì)于功能不可缺少的KGF-2中的氨基酸能用本領(lǐng)域眾所周知的方法鑒定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085(1989))。后一方法將單丙氨酸突變引入分子中的每一殘基處。然后檢測(cè)得到的突變分子的生物活性，如受體結(jié)合或體外和體內(nèi)增殖活性。(見，例如實(shí)施例1)。對(duì)于配體-受體結(jié)合關(guān)鍵的位點(diǎn)也能用結(jié)構(gòu)分析如結(jié)晶、核磁共振或光親和標(biāo)記來(lái)測(cè)定。(見，例如Smith等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224899-904(1992)；和de Vos等人，科學(xué)，255306-312(1992))。
其它有用的KGF多肽包括在氨基酸位置37和106和150處用絲氨酸替換半胱氨酸的多肽。不均勻數(shù)量的半胱氨酸意思是，至少一個(gè)半胱氨酸殘基可用于能造成蛋白質(zhì)適應(yīng)一種不希望的三級(jí)結(jié)構(gòu)的分子間交聯(lián)或鍵合。一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸被替換為絲氨酸或如丙氨酸的新型KGF-2蛋白質(zhì)，通常以較高產(chǎn)率的可溶性、正確折疊的蛋白質(zhì)純化。盡管不希望被理論所束縛，但據(jù)認(rèn)為位置106處的半胱氨酸殘基對(duì)于功能是至關(guān)重要的。該半胱氨酸殘基在所有其它FGF家族成員中高度保守。KGF-2多肽組合物的治療用途本發(fā)明的多肽可以刺激角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。因此，能用本發(fā)明的組合物刺激上皮細(xì)胞增殖和基底角質(zhì)形成細(xì)胞用于創(chuàng)傷愈合，并刺激毛囊產(chǎn)生和皮膚創(chuàng)傷的痊愈。這些創(chuàng)傷可能是表面的或是深層的，包括皮膚真皮和表皮的損傷。
KGF-2可用于治療許多疾病和病癥。例如，KGF-2在多種創(chuàng)傷愈合模型中有體外和體內(nèi)活性。見，1997年8月13日提交的美國(guó)專利號(hào)08/910，875，和1998年2月13日提交的09/023，082。
施用KGF-2的個(gè)體可以以正常速度愈合創(chuàng)傷，或者可能是痊愈受損的。當(dāng)對(duì)不是痊愈受損的個(gè)體施用時(shí)，施用KGF-2來(lái)加速正常痊愈過(guò)程。當(dāng)對(duì)痊愈受損的個(gè)體施用時(shí)，施用KGF-2以利于用其它方法只能緩慢愈合或根本不能愈合的創(chuàng)傷的痊愈。許多痛苦和病癥能導(dǎo)致痊愈受損。這些痛苦和病癥包括糖尿病(例如Ⅱ型糖尿病)、用類固醇和非甾類藥劑兩者的治療和局部缺血堵塞或損傷。
許多生長(zhǎng)因子顯示能促進(jìn)痊愈受損的個(gè)體的創(chuàng)傷愈合。這些生長(zhǎng)因子包括生長(zhǎng)激素釋放因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。因此，本發(fā)明也包括KGF-2組合物與一種或多種其它生長(zhǎng)因子或能促進(jìn)創(chuàng)傷痊愈的其它藥劑一起施用。
本發(fā)明的組合物也能促進(jìn)個(gè)體中由手術(shù)操作引起的吻合和其它創(chuàng)傷的愈合，兩種都以正常速度愈合創(chuàng)傷并且是愈合損傷的。
本發(fā)明的組合物也可用來(lái)刺激細(xì)胞的分化，例如肌細(xì)胞、構(gòu)成神經(jīng)組織的細(xì)胞、前列腺細(xì)胞和肺細(xì)胞。
本發(fā)明的組合物在臨床上可用于刺激創(chuàng)傷的創(chuàng)傷愈合中，包括外科創(chuàng)傷、切除創(chuàng)傷、包括真皮和表皮損傷的深層創(chuàng)傷、眼組織創(chuàng)傷、牙組織創(chuàng)傷、口腔創(chuàng)傷、糖尿病潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動(dòng)脈潰瘍、靜脈停滯潰瘍和由于熱暴露于熱或冷的極端溫度、或接觸化學(xué)藥品引起的灼傷，用于正常個(gè)體和那些患有誘導(dǎo)異常創(chuàng)傷痊愈的病癥的個(gè)體，這些病癥如尿毒癥、營(yíng)養(yǎng)不良、維生素缺乏、肥胖癥、感染、免疫抑制和與用類固醇、放射治療和抗腫瘤藥及抗代謝藥全身治療有關(guān)的并發(fā)癥。這些組合物也可用于促進(jìn)愈合與局部缺血和缺血性損傷有關(guān)的創(chuàng)傷，如靜脈循環(huán)系統(tǒng)返回缺陷和/或不足引起的慢性靜脈下肢潰瘍；促進(jìn)皮膚損傷之后的皮膚重建；增強(qiáng)表皮的抗張強(qiáng)度和表皮厚度；增強(qiáng)皮膚移植物與創(chuàng)傷床的粘附，并刺激創(chuàng)傷床的上皮再形成。
KGF-2多肽的其它治療用途包括但不限于，例如，刺激上皮細(xì)胞增殖和基底角質(zhì)形成細(xì)胞，用于治療灼傷和皮膚缺陷如銀屑病和大皰性表皮松解癥。KGF-2能用來(lái)增強(qiáng)皮膚移植物與創(chuàng)傷床的粘附，刺激創(chuàng)傷床的上皮再形成。KGF-2也能用來(lái)減少由輻射、化學(xué)治療或病毒感染引起的腸毒性的副作用。KGF-2能用來(lái)治療肝、肺、腎、胸、胰、胃、小腸和大腸的疾病和病癥。KGF-2能用來(lái)治療炎性腸病、糖尿病、血小板減少癥、低纖維蛋白原血癥、低白蛋白血癥、低球蛋白血癥、出血性膀胱炎、口干燥癥、角膜結(jié)膜炎干燥癥。KGF-2能用來(lái)刺激唾液腺、淚腺的上皮細(xì)胞，刺激竇的上皮再形成和鼻粘膜的生長(zhǎng)。
能用本發(fā)明的組合物治療的許多其它適應(yīng)癥在美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?8/910，875和09/023，082中有述，在此引用作為參考。
本發(fā)明涉及KGF-2及其缺失突變體的新型液體和凍干制劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療用途的KGF-2制劑。這些制劑提供了優(yōu)于活性KGF-2多肽的穩(wěn)定性，在某些情況中能加強(qiáng)并顯著提高多肽的創(chuàng)傷愈合活性。
此處使用時(shí)，“個(gè)體”是指一種動(dòng)物，優(yōu)選地一種哺乳動(dòng)物(如猿、母牛、馬、豬、野豬、綿羊、嚙齒動(dòng)物、山羊、狗、貓、雞、猴、兔、白鼬、鯨和海豚)，更優(yōu)選地為人。
本發(fā)明的制劑中使用的KGF-2Δ33多肽可具有或可以不具有N端甲硫氨酸，優(yōu)選地該多肽缺乏N端甲硫氨酸。如以下所述，本發(fā)明的KGF-2多肽制劑的穩(wěn)定性用增殖測(cè)定法來(lái)測(cè)定。角質(zhì)形成細(xì)胞增殖測(cè)定表皮角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚表皮中的細(xì)胞。皮膚中角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散是創(chuàng)傷痊愈中的一個(gè)重要過(guò)程。因此，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖測(cè)定是蛋白質(zhì)刺激角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因而創(chuàng)傷痊愈的活性的重要指示。
然而，角質(zhì)形成細(xì)胞難以體外生長(zhǎng)。極少存在角質(zhì)形成細(xì)胞系。這些細(xì)胞系具有不同的細(xì)胞和遺傳缺陷。為了避免由細(xì)胞缺陷(如重要生長(zhǎng)因子受體丟失或生長(zhǎng)對(duì)重要生長(zhǎng)因子依賴性)引起的該測(cè)定法的復(fù)雜化，為該測(cè)定選擇原代皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞。這些原代角質(zhì)形成細(xì)胞從Clonetics，Inc.(San Diego，CA)獲得。
KGF-2多肽的生物活性能通過(guò)細(xì)胞增殖測(cè)定法來(lái)測(cè)定，其使用被成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2iiib受體(FGFR2iiib)轉(zhuǎn)染的鼠Baf3 2b細(xì)胞。通過(guò)在細(xì)胞暴露于以下所述蛋白質(zhì)之后[甲基-3H]-胸苷的摻入來(lái)測(cè)定細(xì)胞的增殖。在每孔含有約22000個(gè)Baf3 2b細(xì)胞的96孔組織培養(yǎng)板中進(jìn)行該測(cè)定。一式三份使細(xì)胞暴露于不同濃度的KGF-2多肽，并在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育大約48小時(shí)。隨后向每孔中加入近似量的含有標(biāo)記胸苷的細(xì)胞培養(yǎng)基，并且再繼續(xù)溫育5小時(shí)。然后用細(xì)胞收集器在96孔格式的玻璃纖維濾墊上收集細(xì)胞。干燥濾墊，用平板液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)摻入每一樣品中的放射性。在這些測(cè)定條件下，與用適當(dāng)稀釋的安慰劑緩沖液或簡(jiǎn)單地用磷酸緩沖鹽溶液處理的對(duì)照細(xì)胞相比，暴露于KGF-2的細(xì)胞顯示增強(qiáng)的放射性摻入。
另一種可用的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖測(cè)定法使用Alamar Blue。AlamarBlue是一種可得的藍(lán)色染料，當(dāng)加入培養(yǎng)基中由線粒體代謝。隨后該染料在組織培養(yǎng)上清液中變?yōu)榧t色。紅色染料的量可以通過(guò)讀取570nm與600nm光密度的差直接定量。該讀值反映細(xì)胞活性和細(xì)胞數(shù)量。
正常的原代皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(CC-0255，合并的NHEK-Neo)購(gòu)自Clonetics，Inc.。這些細(xì)胞為第2代。角質(zhì)形成細(xì)胞在完全角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CC-3001，KGM；Clonetics，Inc.)中生長(zhǎng)，直到達(dá)到80％匯合。按照使用說(shuō)明書用胰蛋白酶消化細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，用Hank’s平衡鹽溶液洗細(xì)胞兩次。將2-3ml胰蛋白酶加入細(xì)胞中在室溫下大約3-5分鐘。加入胰蛋白酶中和溶液，收集細(xì)胞。在室溫下以600×g旋轉(zhuǎn)離心細(xì)胞5分鐘，并用預(yù)溫的培養(yǎng)基以每平方厘米3000個(gè)細(xì)胞的濃度接種于新?lián)u瓶中。
對(duì)于增殖測(cè)定，除了最外面幾排之外，在Corning平底96孔板中每孔平板接種1000-2000個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中。將外面的孔填充200μl無(wú)菌水。這有助于使孔的溫度和濕度波動(dòng)保持最小。在37℃、5％CO2下培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜。用角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CC-3101，KBM，Clonetics，Inc.)洗細(xì)胞兩次，并向每孔中加入100μl KBM。溫育24小時(shí)。以用KBM連續(xù)稀釋生長(zhǎng)因子，并向每孔中加入100μl。用KGM作為陽(yáng)性對(duì)照，KBM作為陰性對(duì)照。每一濃度點(diǎn)使用六個(gè)孔。溫育2-3天。溫育結(jié)束時(shí)，用KBM洗細(xì)胞一次，并加入100μl含有10％v/v預(yù)混合于培養(yǎng)基中的alamarBlue的KBM。溫育6-16小時(shí)，直到KGM陽(yáng)性對(duì)照中培養(yǎng)基顏色開始變紅。通過(guò)直接將培養(yǎng)板置于平板讀數(shù)儀中測(cè)定O.D.570nm-O.D.600nm。KGF-2缺失突變體的構(gòu)建在本發(fā)明的組合物中可使用的缺失突變體能通過(guò)下列方法構(gòu)建。
用優(yōu)化的KGF-2構(gòu)建體作為模板，從KGF-2基因的5’端和3’端構(gòu)建缺失突變體。根據(jù)可能負(fù)影響大腸桿菌中表達(dá)的基因區(qū)選擇缺失。對(duì)于5’缺失，用以下所列引物作為5’引物。這些引物含有所示的限制酶切位點(diǎn)和一個(gè)ATG以編碼起始甲硫氨酸。KGF-2(FGF-12)208氨基酸3’HindIII引物用作3’引物。用標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。KGF-236aa/208aa缺失突變體的產(chǎn)物對(duì)于5’位點(diǎn)用BspHI限制性酶切，對(duì)于3’位點(diǎn)用HindIII酶切，并克隆到已用BspHI和HindIII消化的pQE60中。其它所有產(chǎn)物對(duì)于5’限制酶用NcoI限制性酶切，對(duì)于3’位點(diǎn)用HindIII酶切，并克隆到已用NcoI和HindIII消化的pQE60中。對(duì)于KGF-2(FGF-12)，用36aa/153aa和128aa 3’HindIII作為3’引物，用FGF-1236aa/208aa作為5’引物。對(duì)于FGF-12 62aa/153aa，用128aa 3’HindIII作為3’引物，用FGF-12 62aa/208aa作為5’引物。得到的克隆的命名表明由缺失產(chǎn)生的多肽的第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸。例如，KGF-236aa/153aa表明，缺失突變體的第一個(gè)氨基酸是KGF-2的氨基酸36，而最后一個(gè)氨基酸是氨基酸153。這些KGF-2缺失突變體的構(gòu)建在美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?8/910，875和09/023，082中也有描述，在此引用作為參考。此外，如以下所述，每一個(gè)突變體具有添加的N端Met。然而，在根據(jù)本發(fā)明的制劑中使用的KGF-2缺失多肽可具有或可不具有N端甲硫氨酸，優(yōu)選地該多肽缺乏N端甲硫氨酸。缺失引物的序列FGF1236aa/208aa5′BsphI GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC(SEQID NO3)FGF1263aa/208aa5′NcoI GGACAGCCATGGCTGGTCGTCACGTTCG(SEQ ID NO4)FGF1277aa/208aa5′NcoI GGACAGCCATGGTTCGTTGGCGTAAACTG(SEQ ID NO5)FGF1293aa/208aa5′NcoI GGACAGCCATGGAAAAAAACGGTAAAGTTTC(SEQ ID NO6)FGF12104aa/208aa5′NcoI GGACCCCCATGGAGAACTGCCCGTAGAGC(SEQ ID NO7)FGF12123aa/208aa5′NcoI GGACCCCCATGGTCAAAGCCATTAACAGCAAC(SEQ ID NO8)FGF12138aa/208aa5′NcoI GGACCCCCATGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAG(SEQ ID NO9)FGF123，HindIII(用于上述所有缺失克隆)CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEQ ID NO10)FGF1236aa/153aa5’BsphI(如上)3′HindIII CTGCCCAAGCTTATTACTTCAGCTTACAGTCATTGT(SEQ IDNO11)FGF1263aa/153aa5’NcoI和3’HindIII，如上。N端缺失突變體KGF-2Δ33的構(gòu)建KGF-2Δ33在pQE6中的構(gòu)建為了進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)引導(dǎo)的擴(kuò)增和KGF2Δ33向大腸桿菌表達(dá)載體pQE6中的亞克隆，合成與KGF2希望區(qū)互補(bǔ)的兩條寡核苷酸引物(5952和19138)，其具有下列堿基序列。引物59525’GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3’(SEQ ID NO12)引物191385’GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT 3’(SEQID NO13)在N端引物(5952)中，引入了一個(gè)AflIII限制位點(diǎn)，而在C端引物(19138)中引入了一個(gè)HindIII限制位點(diǎn)。引物5952也含有一個(gè)與KGF2編碼區(qū)相鄰并符合讀框的ATG序列，以允許克隆片段在大腸桿菌中的翻譯，而引物19138含有兩個(gè)與KGF2編碼區(qū)相鄰并符合讀框的終止密碼子(優(yōu)勢(shì)性用于大腸桿菌)，它們確保在大腸桿菌中的正確翻譯終止。
應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)條件和成熟KGF-2(aa 36-208)的核苷酸序列作為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。得到的擴(kuò)增子用AflIII和HindIII限制性消化，并亞克隆到NcoI/HindIII消化的pQE6蛋白質(zhì)表達(dá)載體中。KGF-2Δ33在pHE1中的構(gòu)建為了進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)引導(dǎo)的擴(kuò)增和KGF2Δ33向大腸桿菌表達(dá)載體pHE1中的亞克隆，合成與KGF2希望區(qū)對(duì)應(yīng)的兩條寡核苷酸引物(6153和6150)，其具有下列堿基序列。
引物61535’CCGGCGGCATCCATATGTCITACAACCACCTGCAGG3’(SEQ ID NO14)引物61505’CCGGCGGTACCTIATTATGAGTGTACCACCATTGG 3’(SEQ ID NO15)在N端引物(6153)中，引入了一個(gè)NdeI限制位點(diǎn)，而在C端引物(6150)中引入了一個(gè)Asp718限制位點(diǎn)。引物6153也含有一個(gè)與KGF2編碼區(qū)相鄰并符合讀框的ATG序列，以允許克隆片段在大腸桿菌中的翻譯，而引物6150含有兩個(gè)與KGF2編碼區(qū)相鄰并符合讀框的終止密碼子(優(yōu)勢(shì)性用于大腸桿菌)，它們確保在大腸桿菌中的正確翻譯終止。
應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)條件和成熟KGF-2(aa 36-208)的核苷酸序列作為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。得到的擴(kuò)增子用NdeI和Asp718限制性消化，并亞克隆到NdeI／Asp718消化的pHE1蛋白質(zhì)表達(dá)載體中。
KGF-2Δ33的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA (SEQ ID NO 16)KGF-2Δ33的氨基酸序列(貼44頁(yè)5-8行)MSYNFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ1B.優(yōu)化KGF-2Δ33多核苷酸序列的構(gòu)建為了提高KGF2Δ33在大腸桿菌中的表達(dá)水平，優(yōu)化完整基因的密碼子，以匹配那些在大腸桿菌中最常使用的密碼子。當(dāng)在N端區(qū)域中對(duì)用于產(chǎn)生KGF2Δ33的模板進(jìn)行密碼子優(yōu)化時(shí)，C端氨基酸(84-208)需要優(yōu)化。
首先，對(duì)氨基酸172-208進(jìn)行密碼子優(yōu)化，產(chǎn)生KGF2Δ33(s172-208)。這通過(guò)重疊PCR策略實(shí)現(xiàn)。合并寡核苷酸PM07和PM08(對(duì)應(yīng)于氨基酸172-208)，通過(guò)加熱到70℃并使之冷卻到37℃，使之一起退火。退火的寡核苷酸然后作為模板用于由引物PM09和PM10引導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。在一個(gè)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)條件并使用KGF2Δ33作為模板進(jìn)行的單獨(dú)PCR反應(yīng)中，用寡核苷酸PM05(與KGF2編碼區(qū)內(nèi)的PstI位點(diǎn)重疊)和PM11擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于氨基酸84-172的KGF-2區(qū)域。在第三次PCR反應(yīng)中，合并第一次PCR反應(yīng)的產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于密碼子優(yōu)化的氨基酸172-208)和第二次PCR反應(yīng)的產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于密碼子未優(yōu)化的氨基酸84-172)，并作為模板用于由寡核苷酸PM05和PM10引導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。得到的擴(kuò)增子用PstI/HindIII消化，并亞克隆到PstI/HindIII消化的pQE6KGF2Δ33中，有效地置換相應(yīng)的非密碼子優(yōu)化區(qū)，產(chǎn)生pQE6KGF2Δ33(s172-208)。
為了完成KGF2的密碼子優(yōu)化，使用重疊寡核苷酸，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于氨基酸84-172的KGF2區(qū)最適的合成基因密碼子。合并四種寡核苷酸(PM31、PM32、PM33和PM34)，進(jìn)行7個(gè)循環(huán)的下列PCR94℃，30秒；46.5℃，30秒；72℃，30秒。
然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用1μl第一次PCR反應(yīng)物作為模板，進(jìn)行由引物PM35和PM36引導(dǎo)的第二次PCR。得到的密碼子優(yōu)化的基因片段然后用PstI/SalI消化，并亞克隆到PstI/SalI消化的pQE6KGF2Δ33(s172-208)中，產(chǎn)生完全優(yōu)化的KGF2編碼基因pQE6KGF2Δ33s。
為了產(chǎn)生一種備擇的大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體，用引物PM102和PM130對(duì)pQE6KGF2Δ33s PCR擴(kuò)增KGF2Δ33s。得到的擴(kuò)增子用NdeI和EcoRV消化，并亞克隆到用NdeI和Asp718消化的pHE1表達(dá)載體(平端)中，產(chǎn)生pHE1Δ33s。
在密碼子優(yōu)化的KGF-2Δ33s構(gòu)建中使用的寡核苷酸序列PM05 CAACCACCTGCAGGGTGACG (SEQ ID NO18)PM07AACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACC(SEQ IDNO19)PM08GGGGCCCAAGCTTAAGAGTGTACCACCATTGGCAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTACGACGGGTTTTCTGACCACG (SEQ IDNO20)PM09 GCCACATACATTTGTCGACCGTT (SEQ ID NO21)PM10GGGCCCAAGCTTAAGAGTG (SEQ ID NO22)PM11 GCCACATACATTTGTCGACCGTT (SEQ ID NO23)PM31 CTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAG (SEQ ID NO24)PM32 AGCTTTAACAGCAACAACACCGATTTCAACGGAGGTGATTTCCAGGATGGAGTACGGGCAGTTTTCTTTCTTGGTACCAGAAACTTTACC (SEQ ID NO25)PM33 GGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGA ACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAAC (SEQ ID NO26)PM34GTCGACCGTTGTGCTGCCAGTTGAAGGAAGCGTAGGTGTTGTAACCGTTTTCTTCGATACGTTCTTTCAGTTTACAGTCGTTGTTAAATTCTTTGGAACC (SEQID NO27)PM35 GCGGCGTCGACCGTTGTGCTGCCAG (SEQ ID NO28)PM36 GCGGCCTGCAGGGTGACGTTCGTTGG (SEQ ID NO29)PM102 CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG (SEQID NO30)PM130 CGCGCGATATCTTATTAAGAGTGTACCACCATTG (SEQ IDNO31)KGF-2Δ33的核苷酸序列(s172-208)ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTA AAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCCATCCTGGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAACGACTGTAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAAAACGGTTACAACACCTACGCTTCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTGCCAATGGTGGTACACTCTTAA (SEQ ID NO32)KGF-2 A33的氨基酸序列(s172-208)MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO33)實(shí)施例實(shí)施例1KGF-2液體制劑混合下列成分，產(chǎn)生一種液體KGF-2Δ33液體制劑，-20℃貯存。
2mg/ml KGF-2Δ33多肽，20mM乙酸鈉，125mM氯化鈉，1mM EDTA，水，pH6.2。
該制劑在2-8℃或更低溫度的貯存條件下保持其體外生物活性可達(dá)10個(gè)月。圖3顯示第10個(gè)月時(shí)的生物活性。該制劑在2-8℃或更低溫度的貯存條件下保持其所有物理化學(xué)性質(zhì)可達(dá)11個(gè)月。
生物活性用如下的細(xì)胞增殖測(cè)定法測(cè)定。常規(guī)培養(yǎng)BaF3細(xì)胞，保存于含有10％NBCS、10％wEHI細(xì)胞條件培養(yǎng)基、2mM谷氨酰胺、600μg/ml遺傳霉素(GENETICIN)、1μlβ-巰基乙醇/500ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基、500單位青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中(Omitz，D.，M.等人(1996)，生物化學(xué)雜志(J.Biol． Chem.)27115292-15297)。為進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定，離心收集BaF3細(xì)胞，并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(它與生長(zhǎng)培養(yǎng)基具有相同的組成，但不含WEHI條件培養(yǎng)基，而補(bǔ)加有1μg/ml肝素)洗滌。該操作之后，將細(xì)胞重懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并在96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中每孔平板接種22，000細(xì)胞/180μl。在另一個(gè)96孔板中用PBS進(jìn)行KGF-2的適當(dāng)稀釋(比所需的終濃度高10倍)，加到細(xì)胞中至200μl的終體積。將細(xì)胞板在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中溫育36-40小時(shí)，向每孔中加入50μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的0.5μCi甲基-3H胸苷。將平板在培養(yǎng)箱中再溫育5小時(shí)，用Tomtec Harvester 96通過(guò)在玻璃纖維濾器中過(guò)濾收集細(xì)胞。用Wallac β平板閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)摻入的胸苷。
實(shí)施例2 KGF-2凍干制劑混合下列成分，產(chǎn)生一種KGF-2Δ33凍干制劑。
10mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，7％w/v蔗糖，水(凍干后去除)pH6.2。
該制劑在45℃或更低溫度的貯存條件下保持其體外生物活性可達(dá)9個(gè)月。圖4顯示第9個(gè)月時(shí)的生物活性。生物活性用實(shí)施例1中詳述的細(xì)胞增殖測(cè)定法測(cè)定。反相HPLC證明，該制劑在45℃或更低的溫度和75％相對(duì)濕度下保持其物理化學(xué)性質(zhì)可達(dá)8個(gè)月。
實(shí)施例3增稠制劑中的KGF-2混合下列成分，產(chǎn)生一種KGF-2Δ33增稠制劑。
2mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，7％w/v蔗糖，1.25％羧甲基纖維素，水pH6.2。
該制劑通過(guò)將KGF-2Δ33多肽加入羧甲基纖維素溶液中而制備。經(jīng)旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)定，得到的制劑的粘度約為250厘泊。在羧甲基纖維素的存在下KGF-2多肽保留生物活性。制劑的生物活性用實(shí)施例1中詳述的細(xì)胞增殖測(cè)定法測(cè)定。
實(shí)施例4凝膠制劑中的KGF-2混合下列成分，產(chǎn)生一種KGF-2Δ33凝膠制劑。
2mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，7％w/v蔗糖，16％普流羅尼F127，水pH6.2。
向約2℃-約8℃的普流羅尼溶液中加入KGF-2Δ33。得到的制劑的粘度在20℃時(shí)約為50厘泊，在約37℃時(shí)凝固。經(jīng)實(shí)施例1中詳述的細(xì)胞增殖測(cè)定法測(cè)定，在普流羅尼F127存在下KGF-2保留生物活性。
實(shí)施例5單硫代甘油對(duì)KGF2的活化用或不用單硫代甘油(MTG)制備KGF-2Δ33蛋白質(zhì)貯存制劑(0.1-2.0mg/ml)。
用pH7.2的1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋該蛋白質(zhì)制劑，以達(dá)到用于細(xì)胞增殖測(cè)定所需的濃度。細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)BaF32b細(xì)胞，并保存于含有10％NBCS、10％WEHI細(xì)胞條件培養(yǎng)基、2mM谷氨酰胺、600μg/ml遺傳霉素、1μlβ-巰基乙醇/500ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基、50單位青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中(Ornitz，D.，M.等人(1996)，生物化學(xué)雜志27115292-15297)。細(xì)胞增殖測(cè)定為進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定，離心收集BaF32b細(xì)胞，并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(它與生長(zhǎng)培養(yǎng)基具有相同的組成，但不含WEHI條件培養(yǎng)基，而補(bǔ)加有1μg/ml肝素)洗滌。該操作之后，將細(xì)胞重懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并在96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中每孔平板接種22，000細(xì)胞/180μl。在另一個(gè)96孔板中用PBS進(jìn)行KGF2的適當(dāng)稀釋(比所需終濃度高10倍)，加到細(xì)胞中至200μl的終體積。將細(xì)胞板在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中溫育36-40小時(shí)，向每孔中加入50μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的0.5μCi甲基-3H胸苷。將平板在培養(yǎng)箱中再溫育5小時(shí)，用Tomtec Harvester 96通過(guò)在玻璃纖維濾器中過(guò)濾收集細(xì)胞。用Wallac β平板閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)摻入的胸苷。
結(jié)果A.MTG濃度對(duì)KGF-2活性的影響用暴露于不同濃度單硫代甘油(MTG)的KGF-2進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定。對(duì)照樣品不含賦形劑。用不同濃度的MTG觀察到MTG對(duì)KGF-2活性的刺激，如圖5所示?；钚缘脑黾訛閷?duì)照的10-150％，取決于所用MTG的濃度。用該生長(zhǎng)因子家族的其它成員觀察不到細(xì)胞增殖活性的提高。從這些觀察中推斷出，MTG對(duì)KGF-2活性的刺激是相當(dāng)特異的。結(jié)論單硫代甘油似乎特異地刺激KGF-2的體外細(xì)胞增殖活性。
實(shí)施例6含檸檬酸鹽的KGF-2凝膠制劑混合下列成分，產(chǎn)生一種KGF-2制劑，其在室溫下為液體，隨后在施用于皮膚后形成膠體。
20mM檸檬酸鈉，125mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉，17％普流羅尼F127，pH6.0，水。
實(shí)施例7含乙酸鹽的KGF-2凝膠制劑混合下列成分，產(chǎn)生一種在施用于皮膚后能形成膠體的KGF-2制劑。
20mM乙酸鈉，125mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉，17％普流羅尼F127，pH6.0，水。
實(shí)施例8液體KGF-2制劑在四種不同的制劑中，和三種不同的pH下pH5.0、pH5.5和pH6.0，評(píng)估檸檬酸鈉作為保持KGF-2Δ33的緩沖劑的適宜性。制劑A．KGF-2Δ33 1mg/ml或2mg/ml20mM檸檬酸鈉，125mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉，水。
B．如上述“A”，另外含有1％甘油。
C．如上述“A”，另外含有0.05％甲硫氨酸。
D．如上述“A”，另外含有1％單硫代甘油。
在上述所有制劑中KGF-2Δ33的濃度為1mg/ml和2mg/ml。2．凍干制劑在三種填充劑-甘露醇、蔗糖和海藻糖-之一的存在下凍干KGF-2Δ33。制劑A．10mM檸檬酸鈉、20mM氯化鈉、1mM EDTA二鈉和4％甘露醇，pH6.0B．10mM檸檬酸鈉、20mM氯化鈉、1mM EDTA二鈉和7％蔗糖，pH6.0C．10mM檸檬酸鈉、20mM氯化鈉、1mM EDTA二鈉和8％海藻糖，pH6.0KGF-2多肽的濃度為3mg/ml和8mg/ml。評(píng)估參數(shù)為用水重建之前及之后的RP-HPLC、SDS-PAGE、外觀。3．10mg/ml KGF-2凍干評(píng)估了制劑是否允許10mg/ml蛋白質(zhì)的凍干，以及重建后的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。制劑10mM檸檬酸鈉、20mM氯化鈉、1mM EDTA二鈉和4％甘露醇，pH6.0。
凍干產(chǎn)品用水或含有1％單硫代甘油的水重建。
顯然，可以與以上敘述和實(shí)施例中特別描述的不同地方法實(shí)施本發(fā)明。
根據(jù)以上所述，本發(fā)明的大量修改和變化是可能的，因而，它們落在附加的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
此處引用的所有文獻(xiàn)(包括專利、專利申請(qǐng)、雜志文章、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、書或其它文件)的全部公開內(nèi)容都在此引入作為參考。
序列表&#60110&#62Gentz，Reiner L.
Chopra，ArvindKaushal，ParveenSpitznagel，ThomasUnsworth，EdwardKhan，F(xiàn)azalHuman Genome Sciences，Inc.&#60120&#62角質(zhì)成形細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2制劑&#60130&#621488.103PC0l&#60140&#62待分配&#60141&#62如下&#60150&#62US 60/068，493&#60151&#621997-12-22&#60160&#6233&#60170&#62PatentIn Ver.2.0&#60210&#621&#60211&#62627&#60212&#62DNA&#60213&#62人&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(1)..(624)&#60400&#621atg tgg aaa tgg ata ctg aca cat tgt gcc tca gcc ttt ccc cac ctg48Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1 510 15ccc ggc tgc tgc tgc tgc tgc ttt ttg ttg ctg ttc ttg gtg tct tcc96Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser20 25 30gtc cct gtc acc tgc caa gcc ctt ggt cag gac atg gtg tca cca gag144Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu35 40 45gcc acc aac tct tct tcc tcc tcc ttc tcc tct cct tcc agc gcg gga192Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly5055 60agg cat gtg cgg agc tac aat cac ctt caa gga gat gtc cgc tgg 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權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其含有(a)一種KGF-2多肽，濃度為約0.02-約40mg/ml(w/v)；(b)一種緩沖劑，其緩沖容量為約pH5.0-約pH8.0，濃度為約5mM-約50mM；和(c)一種藥學(xué)可接受的稀釋劑，使組合物達(dá)到指定體積。或其反應(yīng)產(chǎn)物。
2．權(quán)利要求1的藥物組合物，其進(jìn)一步含有(d)一種濃度為約0.1mM-約10mM的螯合劑；和(e)濃度為約0.01mM-約150mM的NaCl。
3．權(quán)利要求1的藥物組合物，其進(jìn)一步含有下列成分之一(f)約0.5％-約2％w/v甘油，(g)約0.1％-約1％w/v甲硫氨酸，或(h)約0.1％-約2％w/v單硫代甘油。
4．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽以約0.05-約30mg/ml(w/v)的濃度存在。
5．權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽以約0.1-約20mg/ml(w/v)的濃度存在。
6．權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽以約0.2-4mg/ml的濃度存在。
7．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽為KGF-2Δ33。
8．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述稀釋劑為水。
9．權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述螯合劑為濃度約1mM的EDTA，所述NaCl以約125mM的濃度存在。
10．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述pH為約pH5.5-約pH6.5。
11．權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述pH為約pH6.2。
12．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述緩沖劑選自磷酸、乙酸、烏頭酸、檸檬酸、戊二酸、蘋果酸、琥珀酸、碳酸，及其堿或堿土鹽。
13．權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述緩沖劑是磷酸鹽、乙酸鹽或檸檬酸鹽。
14．權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述緩沖劑是檸檬酸鹽。
15．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述緩沖劑以約5mM-約30mM的濃度存在。
16．權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述緩沖劑是以約10mM-約20mM的濃度存在的檸檬酸鹽。
17．權(quán)利要求1的藥物組合物，其進(jìn)一步含有穩(wěn)定量的一種或多種(a)抗氧化劑或(b)硫醇化合物。
18．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述組合物保存于-20℃或更低的溫度下。
19．權(quán)利要求1的藥物組合物，其含有(a)2mg/ml KGF-2Δ33多肽(w/v)；(b)20mM乙酸鈉；(c)125mM NaCl；(d)1mM EDTA；和(e)水作為稀釋劑，或其反應(yīng)產(chǎn)物。
20．權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述KGF-2Δ33多肽選自含有N端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽、缺乏N端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，及其混合物。
21．一種藥物組合物，其含有(a)一種KGF-2多肽，濃度為約0.02-約40mg/ml(w/v)；(b)一種緩沖劑，其緩沖容量為約pH5.0-約pH8.0，濃度為約5mM-約50mM；(c)一種填充劑；和(d)一種藥學(xué)可接受的稀釋劑，使組合物達(dá)到指定體積；或其反應(yīng)產(chǎn)物。
22．權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述填充劑選自蔗糖、甘氨酸、甘露醇、海藻糖及其混合物。
23．權(quán)利要求21的藥物組合物，其進(jìn)一步含有(e)一種濃度為約0.1mM-約10mM的螯合劑；和(f)濃度為約0.01mM-約125mM的NaCl。
24．權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述填充劑是蔗糖或蔗糖與甘氨酸的混合物。
25．權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述填充劑以約2％-約10％w/v的濃度存在。
26．權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述填充劑為5％甘露醇、7％蔗糖、8％海藻糖或2％甘氨酸+0.5％蔗糖。
27．權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述pH約為pH6.2。
28．權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述稀釋劑是水。
29．權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述緩沖劑選自磷酸、乙酸、烏頭酸、檸檬酸、戊二酸、蘋果酸、琥珀酸、碳酸，及其堿或堿土鹽。
30．權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述緩沖劑是磷酸鹽或檸檬酸鹽。
31．權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所述緩沖劑是檸檬酸鹽。
32．權(quán)利要求28的藥物組合物，其中90％以上的水通過(guò)凍干去除。
33．權(quán)利要求32的藥物組合物，其用能有效保持大約290mOsm等滲條件的量的無(wú)菌水重建。
34．權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述KGF多肽是KGF-2Δ33。
35．權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述KGF-2Δ33多肽選自含有N端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，缺乏N端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，及其混合物。
36．權(quán)利要求21的藥物組合物，其中以約5mM-約50mM的濃度加入所述緩沖劑。
37．權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述緩沖劑是濃度約為10mM的檸檬酸鹽。
38．權(quán)利要求21的藥物組合物，其進(jìn)一步含有穩(wěn)定量的一種或多種(g)抗氧化劑或(h)硫醇化合物。
39．權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述組合物用含有穩(wěn)定量的抗氧化劑的無(wú)菌水重建，這些抗氧化劑包括a)約0.01％-約2％w/v單硫代甘油，b)約0.01％-約2％w/v抗壞血酸，c)約0.01％-約2％w/v甲硫氨酸或d)其組合。
40．一種藥物組合物，其含有(a)一種濃度為約0.02-約40mg/ml(w/v)的KGF-2多肽；(b)濃度為約5mM-約20mM的檸檬酸或其藥學(xué)可接受的鹽；(c)濃度約0.01MM-約125mM的NaCl；(d)濃度約0.1mM-約10mM的EDTA，和(e)蔗糖、甘露醇、甘氨酸或海藻糖中的一種或多種，濃度約2％w/v-約15％w/v；和(f)水。
41．權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽以約2mg/ml、約4mg/ml或約10mg/ml的濃度存在。
42．權(quán)利要求40的藥物組合物，其中90％以上的水通過(guò)冷凍干燥去除。
43．權(quán)利要求1的藥物組合物，其進(jìn)一步含有可有效地使粘度提高到約50-約10，000厘泊的量的增稠劑。
44．權(quán)利要求43的藥物組合物，其中所述增稠劑以有效地使粘度提高到約50-約1，000厘泊的量存在。
45．權(quán)利要求44的藥物組合物，其中所述增稠劑的量可有效地使粘度提高到約200-約300厘泊。
46．權(quán)利要求21的藥物組合物，其進(jìn)一步含有一種可有效地使粘度提高到約50-約10，000厘泊的量的增稠劑。
47．權(quán)利要求43的藥物組合物，其中所述增稠劑以0-5％(w/w)的濃度存在。
48．權(quán)利要求43的藥物組合物，其中所述增稠劑是水溶性醚化纖維素或與烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚與丙烯酸交聯(lián)的高分子量聚合物。
49．權(quán)利要求48的藥物組合物，其中所述醚化纖維素是烷基纖維素、羥烷基纖維素、羧基烷基纖維素或烷基羥烷基纖維素。
50．權(quán)利要求43的藥物組合物，其中所述醚化纖維素是甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素。
51．權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述醚化纖維素衍生物具有約50，000-約700，000的分子量，并以約0％-約20％重量的濃度存在。
52．權(quán)利要求51的藥物組合物，其中所述醚化纖維素衍生物具有約80，000-約240，000的分子量，并以約2％-約8％重量的濃度存在。
53．權(quán)利要求46的藥物組合物，其中所述緩沖劑是濃度為約10mM-約50mM的檸檬酸鹽。
54．權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述緩沖劑是濃度為約10mM-約20mM的檸檬酸鹽。
55．權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述填充劑是濃度為約0.01％-約5％的蔗糖。
56．權(quán)利要求55的藥物組合物，其中直接向液體制劑中加入所述增稠劑，然后凍干。
57．權(quán)利要求55的藥物組合物，其中通過(guò)加入溶解有增稠劑的適當(dāng)稀釋劑重建所述制劑，來(lái)向凍干制劑中加入該增稠劑。
58．一種增稠KGF-2多肽溶液組合物，它是通過(guò)混合下列成分形成的(a)一種局部有效量的KGF-2多肽；(b)約10mM-約500mM檸檬酸鈉緩沖劑；(c)約0.01mM-約150mM NaCl；(d)1mM EDTA；(e)約0.1％-約7％蔗糖；(f)約0.75％-約1.5％(w/v)羧甲基纖維素，或約0.5％-約1.5％羥丙基甲基纖維素，或約0.25％-約0.75％羥乙基纖維素，或約0％-1％卡波姆，或其任意組合。
59．權(quán)利要求1的組合物，其進(jìn)一步含有一種膠凝劑，其量可在室溫下有效地使粘度提高到約0．1-約10，000厘泊。
60．權(quán)利要求21的組合物，其進(jìn)一步含有一種膠凝劑，其量可在室溫下有效地使粘度提高到約0.1-約10，000厘泊。
61．權(quán)利要求59的組合物，其中所述凝膠形成劑是能形成粘性水溶液的水溶性聚合物，或能形成粘性溶液的非水溶性、水溶脹性聚合物。
62．權(quán)利要求61的組合物，其中所述凝膠形成劑是一種高分子量聚合物，其選自乙烯基聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、多糖、蛋白質(zhì)、聚(環(huán)氧乙烷)、丙烯酰胺聚合物或其鹽。
63．權(quán)利要求62的組合物，其中所述凝膠形成劑是(1)一種乙烯基聚合物，選自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇及其鹽和酯；或(2)一種多糖，選自纖維素衍生物、糖胺聚糖、瓊脂、果膠、藻酸、葡聚糖、α-直鏈淀粉、支鏈淀粉、脫乙酰殼多糖及其鹽、酯。
64．權(quán)利要求62的組合物，其中所述凝膠形成劑是一種糖胺聚糖，選自透明質(zhì)酸、軟骨素、軟骨素-4-硫酸、硫酸乙酰肝素、肝素及其鹽和酯。
65．權(quán)利要求64的組合物，其中所述糖胺聚糖與膠原蛋白、明膠或纖連蛋白一起存在。
66．權(quán)利要求62的組合物，其中所述凝膠形成劑是一種丙烯酰胺聚合物，選自聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺。
67．權(quán)利要求62的組合物，其中所述凝膠形成劑是一種聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
68．權(quán)利要求67的組合物，其含有約10％-約60％重量的平均分子量約500-50，000的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
69．權(quán)利要求68的組合物，其含有約14％-約18％重量的分子量為1，000-15，000的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
70．權(quán)利要求69的組合物，其中所述凝膠形成劑是一種聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，為普流羅尼F108、普流羅尼F127或泊洛沙姆407。
71．權(quán)利要求1的組合物，其中所述KGF-2多肽以約0.01mg/ml-約10mg/ml的濃度存在。
72．權(quán)利要求59的組合物，其中所述組合物是通過(guò)混合下列成分形成的(a)一種KGF-2多肽，終計(jì)算濃度為0.01mg/ml-約10mg/ml；(b)一種有效量的緩沖劑；(c)約10％-約60％重量的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，其有約500-50，000的平均分子量；和(d)一種藥學(xué)可接受的稀釋劑，優(yōu)選地水。
73．權(quán)利要求72的組合物，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物以約14％-約18％的濃度存在。
74．一種KGF-2凝膠制劑，其含有(a)一種藥學(xué)有效量的KGF-2多肽；(b)約10mM-約500mM檸檬酸鈉；(c)約0.01mM-約150mM NaCl；(d)約1mM EDTA；(e)約0.1％-約7％蔗糖；(f)約14％-約18％普流羅尼F127；和(g)約pH6.2。
75．一種KGF-2凝膠制劑，其含有(a)一種濃度為約0.01mg/ml-約10mg/ml(w/v)的KGF-2多肽；(b)濃度約5mM-約20mM的檸檬酸鈉；(c)約10％-約25％(w/v)的普流羅尼F127和泊洛沙姆407；和(d)水，加至所需體積。
76．權(quán)利要求75的凝膠制劑，其進(jìn)一步含有(a)濃度約0.1mM-約10mM的EDTA。(b)濃度約0.01mM-約125mM的NaCl。
77．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽是選自Ala(63)--Ser(208)(KGF-2Δ28)和Ser(69)--Ser(208)(KGF-2Δ33)的N端缺失體。
78．權(quán)利要求77的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽含有N端甲硫氨酸，缺乏N端甲硫氨酸，或是其混合物。
79．權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽是一種N端或C端缺失突變體，選自Ala(39)--Ser(208)；Pro(47)--Ser(208)；Val(77)--Ser(208)；Glu(93)--Ser(208)；Glu(104)--Ser(208)；Val(123)--Ser(208)；Gly(138)--Ser(208)；Met(1)、Thr(36)和Cys(37)--Lys(153)。
80．權(quán)利要求79的藥物組合物，其中所述KGF-2多肽含有N端甲硫氨酸，缺乏N端甲硫氨酸，或是其混合物。
81．權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述KGF-2Δ33多肽選自含有N端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，缺乏N端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，及其混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子－2(KGF－2)及其衍生物的液體和凍干制劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療用途如促進(jìn)或加速創(chuàng)傷痊愈的KGF－2制劑。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1283997SQ98813339
公開日2001年2月14日 申請(qǐng)日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月22日
發(fā)明者R·L·杰茨, A·喬普拉, P·考薩爾, T·斯比茨納格爾, E·安斯沃茨, F·克翰 申請(qǐng)人:人類基因組科學(xué)公司