專利名稱:從重組體宿主產(chǎn)生抑肽酶同系物及其制造方法，表達(dá)載體、重組體宿主和藥物應(yīng)用的制作方法
本發(fā)明涉及抑肽酶同系物及其用重組體DNA技術(shù)的制造方法。
本文所述化學(xué)合成的DNA分子，其特征為新的多肽或多肽的DNA順序編碼，實質(zhì)上與抑肽酶或抑肽酶同系物的氨基酸順序及組合物一致，且具有抑肽酶或抑肽酶同系物的生物活性。
眾所周知，抑肽酶是由58種氨基酸組成的肽，具有抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血漿酶和激肽釋放酶地作用。這是一種基本的蛋白酶抑制因子，取自牛的臟器，是一種有價值的藥物，又名Trasylol(抑肽酶)，用來治療各種疾病，如高溶解纖維蛋白原的出血和外傷出血的休克(參閱H.Fritz和G.Wunderer，1983年，《藥物研究》33期，479～494頁)。
業(yè)已證明，抑肽酶的同系物與抑肽酶相比在15位上是其它氨基酸，而不是賴氨酸，它是有飾變作用和療效作用的有效蛋白酶抑制劑(德國專利DE-OS 3339693號;H.R.溫澤爾等1985年在《肽和蛋白質(zhì)化學(xué)》3卷)。這些抑肽酶同系物對胰和白細(xì)胞中彈性蛋白酶，以及組織蛋白酶G有強烈的抑制作用。
在急性的、慢性的破壞結(jié)締組織，損害器壁，壞死病變和肺部組織變質(zhì)的炎癥中，胰腺彈性蛋白酶(胰腺炎)、血漿彈性蛋白酶(關(guān)節(jié)硬化)、白細(xì)胞彈性蛋白酶的過度釋放引起的疾病，可用這種抑肽酶同系物治療由溶酶體酶特別是白細(xì)胞彈性蛋白酶在由免疫處理引起的炎性反應(yīng)中，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起著同樣重要的作用。
雖然可從牛的臟器以及通過牛胰蛋白酶抑制因子(Tschesche，M.，Wenzel，M.，Schmuck，R.，Schnab，E.德國書DE 3339693Al從15.05.58起)的半合成轉(zhuǎn)化得到抑肽酶和抑肽酶同系物，但產(chǎn)量較少。
可見，重組體DNA及有關(guān)技術(shù)的應(yīng)用是提供必要的大量高質(zhì)量抑肽酶同系物的有效方法。目的是生產(chǎn)抑肽酶同系物，及生物活性，宿主生物體是用重組體DNA技術(shù)的產(chǎn)品。
在微生物中，異種DNA的表達(dá)方法是熟知的。
已知氨基酸順序的多肽DNA編碼的制備，可用基因組DNA順序、與mRNA互補的cDNA順序或根據(jù)遺傳密碼及制備合成基因的選擇密碼子。
從牛胰腺的胰蛋白酶抑制因子基因中?；蚪M克隆的部分DNA順序的克隆已由S.Anderson和I.B.Kingston(1983年，Proc.Natl.Aead.Sci.USA.80卷，6838～6842頁)說明了牛胰腺胰蛋白酶抑制因子(BPT1)基因組克隆的特征。
近來已把BPT1和牛脾抑制因子Ⅱ的大片段?；蚪M編碼編成順序，已由Kingston，I.B.和Anderson，S.發(fā)表(1986年，《Biochem.J.》233期，443～450頁)。
本發(fā)明的目的是提供抑肽酶同系物、及其核酸編碼、結(jié)合核酸和其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體，以及獲得抑肽酶同系物的方法。
對于本發(fā)明的目的，最有利條件是以恰當(dāng)設(shè)計制備合成基因以及可以廣泛應(yīng)用的選擇密碼子。
特別是這種情況，構(gòu)建包括DNA編碼組或由限制酶的獨特識別部位限定的DNA組的合成主導(dǎo)基因。這種基因設(shè)計在DNA編碼組內(nèi)，可使全部DNA順序容易飾變或突變。
由重組體DNA技術(shù)制備抑肽酶同系物，如Val-15-、Ile-15-、Leu-15-、Phe-15-和Ala-15-、Arg-15、Gly-15、Ser-15、Trp-15、Tyr-15、單獨抑肽酶，或與在52位上由Glu、Leu、Val、Arg或Thr取代的相結(jié)合，業(yè)已發(fā)現(xiàn)與已知的抑肽酶及其同系物是等同的，在52位上有Met，它們的生產(chǎn)方法將一起介紹。取代Met-52，可生產(chǎn)抑肽酶和抑肽酶同系物，其中在融合多肽的Met位上，用溴化氰把遺傳工程的融合多肽切斷。
還介紹了這種同系物的合成DNA編碼，包括表達(dá)該同系物結(jié)構(gòu)基因的重組體質(zhì)粒，以及由重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)。
下文說明編碼抑肽酶和抑肽酶同系物的DNA片段的構(gòu)建和選擇方案。
已知蛋白質(zhì)順序及抑肽酶和抑肽酶同系物的遺傳密碼用來確定這種多肽的DNA順序的編碼。
遺傳密碼的簡并性允許在任何給定的氨基酸順序的密碼子選擇中有很大的靈活性。
測定標(biāo)示這種蛋白質(zhì)的氨基酸順序的密碼子中所有可能的堿基取代。與此相應(yīng)可測定定位在合理的DNA順序內(nèi)全部潛在限制性部位。
通過下述依據(jù)指導(dǎo)主導(dǎo)基因的密碼子選擇首先，選擇密碼子和片段，設(shè)計片段組合，以避免不合適的片段互補性。
其次，富集A-T堿基對的范圍，避免用早期轉(zhuǎn)錄的末端解決問題。
第三，選擇限制部位為促進(jìn)檢驗轉(zhuǎn)化株或通過適當(dāng)?shù)钠闻c其它片段置換的堿基取代，以致易于產(chǎn)生抑肽酶的飾變，檢查結(jié)構(gòu)及其活性間的關(guān)系。
第四，大多數(shù)選擇的密碼子最好是微生物基組表達(dá)中的那些密碼子(見H.Grosjean和W.Fiers，基因，18期(1982年)192～209頁;M.Gouy和C.Gautier，Nucleic Acids Research，10期(1982年)7055～7074頁。
圖1表示合成抑肽酶基因及其同系物的主要設(shè)計。
合成主導(dǎo)基因的設(shè)計，由限制性核酸內(nèi)切酶的識別部位圍繞的四個組(稱作α、β、γ、δ)組成，易于進(jìn)一步飾變以及不融合和融合表達(dá)DNA順序的更替(密碼子使用、突變、蛋白質(zhì)工程，基因的擴增)。
按如下構(gòu)建合成基因
經(jīng)由重疊末端區(qū)的15種純寡核苷酸的組合，用主導(dǎo)基因構(gòu)建抑肽酶和抑肽酶同系物的合成基因(見圖1)。這個構(gòu)建由兩個步驟完成，首先，將部分A的DNA片段1、2、3、4和6，與部分B的DNA片段5、7、8、9、10、11、12、13、14和16通過雜交、連接以及純化產(chǎn)生基因的部分A和部分B(見圖2)。其次，連接和純化基因的部分A和B。下文介紹這種結(jié)構(gòu)所用的材料和方法，圖3表示主導(dǎo)基因的DNA順序，它包括起始密碼子ATG，兩個末端密碼子TAG和TAA，Eco RI的5′末端限制部位和HindⅢ、BamHI的3′末端限制部位，以及ApaⅠ、StuⅠ、SacⅡ(SstⅡ)的內(nèi)部限制部位。這些部位，尤其是內(nèi)部的部位，促進(jìn)編碼順序的克隆，以及通過交換別的氨基酸編碼或有其它密碼子用途的DNA片段的主導(dǎo)基因的飾變。增加適當(dāng)?shù)穆?lián)結(jié)子順序很容易擴增基因。蛋白質(zhì)工程的總的領(lǐng)域是有可能用這種構(gòu)建的。
為構(gòu)建抑肽酶同系物的基因，僅僅具有適當(dāng)?shù)腄NA順序的限制片段作了交換。對圖2b給出了為包括15和52位的氨基酸變體編碼的這種片段的順序。
按如下構(gòu)建重組體質(zhì)粒
為試驗抑肽酶克隆選擇的質(zhì)粒是pUC8(J.Vierira和J.Messing，1982年Gene，19期259頁)。該克隆載體由pBR322衍生氨芐青霉素酶基因和連接到包含獨特限制酶識別部位排列的Lac Z基因部分的DNA復(fù)制起點所構(gòu)成。當(dāng)該載體引入Lac大腸桿菌時，轉(zhuǎn)化株就在相應(yīng)的指示平板上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，將DNA片段克隆到許多限制部位，如Eco RI和Bam HI之間，鈍化了產(chǎn)生白色菌落的Lac基因。質(zhì)粒pUC8可從P-L Biochemicals得到。
按下述構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒
為表達(dá)如融合蛋白質(zhì)的抑肽酶及其同系物，已構(gòu)建質(zhì)粒，其中適宜的基因與β-半乳糖苷酶的羧基末端融合。如同U.Rüther和B.Müller-Hill于1983年，在《EMBO》第2期，1791～1794頁所述相似實驗。親代質(zhì)粒pUR278有單克隆部位即在Lac Z基因3′端的Bam HⅠ、SalⅠ、PstⅠ、XbaⅠ和HindⅢ(見德國書P3309501.9)。將編碼DNA順序插入合適的克隆部位以及正確的讀碼，導(dǎo)致有活性的β-半乳糖苷酶的融合蛋白質(zhì)與由DNA編碼的肽的結(jié)合。
為了克隆表達(dá)載體中抑肽酶和抑肽酶同系物的合成基因，選擇表達(dá)載體pUR278的限制部位Bam HI和HindⅢ。為此有必要通過加在基因的5′EcoRI端的Bam HⅠ部位和應(yīng)用3′端HindⅢ部位以飾變抑肽酶基因(見圖6)。
使用如下重組體DNA工作的標(biāo)準(zhǔn)材料及方法
可以制備本文中所介紹的合成基因、重組體質(zhì)粒及帶有這種基因的表達(dá)載體，其特征在于下述材料和方法。
材料
酶
多核苷酸激酶(PNK)5.5單位/微升;Baehringer-Mannheim633542期，
DNA聚合酶;Klenow，Boehringer Mannheim 104523期，
T4DNA連接酶，0.9單位/微升;Boehringer Mannheim 481220期，
限制酶可從貝塞斯達(dá)實驗室(Boehringer Mannheim生物實驗室)獲得，
小牛腸內(nèi)的堿性磷酸酶(CIP);Boehringer Mannheim，溶菌酶;RN酶A;Boehringer Mannheim，
試劑
γ32p腺苷三磷酸(ATP);Amersham PB10168
α32p-dTTP Amersham 167
ATP;σA-6144號
雙丙烯酰胺Serva 29195
丙烯酰胺;Serva和Bio-Rad 161-0103
N，N，N，N-四甲基乙烯二胺(TEMED);Serva 35925
過硫酸銨;Serva 13375
尿素;BRL超高純5505 UA
DE52(preswollen二乙氨乙基纖維素);Whatman，
目錄;4057-050
DTE;Serva 20697
異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG);σI5502，
5-溴-4氯-吲哚基-β-D-半乳糖(Xgal);Boehringer651745
N，N′-二甲基甲酰胺;Merck 2 203034
乙二醇四醋酸(EGTA)
蔗糖;BRL 5503 UA
二氨基庚二酸(Diaminopimelin acid);σD1377
M13-雙脫氧核苷酸順序系統(tǒng);美國馬薩諸塞州貝弗利408號、409號，新英格蘭生物實驗室。
三氯甲烷
異戊基醇
胸核苷;Serva18600
葡萄糖D(+);Merck8337
三羥甲基氨基甲烷(Tris);Merck8382
氫氧化鉀;Merck5033
氯化鈣;Merck2382
氯化銣;σR2252
氯化錳;σM3634
二甲亞砜;σD5879
乙二胺四乙酸(EDTA);
乙酸鉀;
十二烷基硫酸鈉(SDS);
DNA
質(zhì)粒pUC8;Pharmacia P-L Biochemicals 27-4916-xx
Bam HI聯(lián)結(jié)子
培養(yǎng)基和抗菌素
Bacto-胰胨;Difco 0123-01
Bacto-酵母-提取物;Difco 0127-01
Bacto-瓊脂;0140-01
LB-培養(yǎng)基(用于1升)10克Bacto-胰胨，5克Bacto-酵母提取物，10克NaCl，用NaOH調(diào)整pH值為7.5。
Kappa 1776-培養(yǎng)基(用于1升)25克Bacto-胰胨，7.5克Bacto酵母提取物，1克分子Tris-HCl(pH7.5)20毫升，加到950毫升，高壓滅菌并冷卻，添加滅菌物質(zhì)5毫升1克分子MgCl2，10毫升1%二氨基庚二酸(diaminopimeline acid)，10毫升0.4%胸核苷，25毫升20%葡萄糖。
YT-培養(yǎng)基(用于1升)8克Bacto胰胨，5克Bacto酵母提取物，5克NaCl。
把15克Bacto瓊脂加到1升適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，制備瓊脂平板。
指示平板把下列溶液加到1升高壓滅菌的YT培養(yǎng)基與1.5%瓊脂中2毫升0.1克分子IPTG，2毫升N，N′二甲基甲酰胺的2%x-gal和2毫升100毫克/毫升氨芐青霉素。
抗菌素，
氯霉素;Boehringer Mannheim 634433，
氨芐青霉素;Serva 13397，
四環(huán)素;Serva 35865
緩沖液和溶液
20微克分子ATP在水中。
10毫克分子ATP在水中。
10X多核苷酸激酶混合物0.5克分子Tris-HCl(Ph7.6);0.1克分子MgCl2;50毫克分子DTE;1毫克分子EDTA。
10X連接酶混合物0.5克分子Tris-HCl(pH7.4);0.1克分子MgCl2;0.1克分子DTE;10毫克分子ATP。
10X SP-SO∶100毫克分子Tris-HCl(pH7.5);100毫克分子MgCl2;500毫克分子NaCl;10毫克分子二硫蘇糖醇。
10X SP-100∶100毫克分子Tris-HCl(pH7.5);100毫克分子MgCl2;1克分子NaCl;10毫克分子二硫蘇糖醇。
10X SP-0∶100毫克分子Tris-HCl(pH7.5);100毫克分子MgCl2;10毫克分子二硫蘇糖醇。
1克分子TBE∶1克分子Tris;0.83克分子硼酸;10毫克分子EDTA;pH8.3。
3X甲酰胺染料混合物70%甲酰胺;20%丙三醇;1毫克分子EDTA;0.33毫克/毫升溴酚蘭;0.66毫克/毫升二甲苯苯胺FE;0.66毫克/毫升橙紅G。
20X E-緩沖液0.8克分子Tris;0.4克分子乙酸鈉;40毫克分子EDTA;pH8.3。
10X CIP-緩沖液0.5克分子Tris-HCl(Ph9.0)，10毫克分子MgCl2，1毫克分子ZnCl2，10毫克分子亞精胺。
轉(zhuǎn)化緩沖液如下制備。15克蔗糖，1毫升3.5克分子KOH，1毫升1克分子CaCl2，2毫升5.0克分子RbCl引到50毫升聯(lián)二苯乙酮(bidest)溶液，用10%乙酸調(diào)整pH值為6.2，加1毫升4.5克分子MnCl2，用10%乙酸調(diào)整pH值為5.8，用聯(lián)二苯乙酮(bidest)溶液注滿100毫升并過濾滅菌。
TE-緩沖液10毫克分子Tris-HCl pH8.0，0.1毫克分子EDTA。
10X NT-緩沖液
溶菌酶混合物50毫克分子葡萄糖，1毫克分子EDTA，10毫克分子Tris-HCl pH8.0。
酚/sevag80%酚和sevag(三氯甲烷∶異戊基醇＝24∶1)以1∶1(體積)的混合物。
標(biāo)準(zhǔn)方法
在Maniatis等人1982年(《分子克隆》，美國科爾德斯普林港，科爾德斯普林港實驗室)所介紹的使用重組體DNA工作的標(biāo)準(zhǔn)方法，用下文所述的某些飾變。
標(biāo)準(zhǔn)乙醇沉淀
溶解DNA片狀沉淀物或把溶液調(diào)至0.3克分子乙酸鈉，加入兩份體積乙醇，在-70℃保溫15分鐘，離心分離，用80%乙醇洗滌片狀沉淀物兩次，再真空干燥。
標(biāo)準(zhǔn)酚萃取
以酚sevag為1∶1(體積)充分混合溶液，再離心分離。酚相用1/10(體積)緩沖液或水再萃取，水相儲集。
聚丙烯酰胺凝膠電泳后，DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)分離
通過凝膠電泳分離DNA小片段(至多250個核苷酸)，由放射性自顯影或紫外線使帶可見(預(yù)涂薄層色譜板Silgur-25，Macherey-Nagel Co.)，將帶切下，用硅玻璃棒搗爛，在42℃下用約400微升TE緩沖液pH為8.0稀釋18小時。經(jīng)離心分離材料，片狀沉淀物在42℃下再稀釋4小時并離心分離。兩份上清液混合，并在1克分子TEABC緩沖液的小型DE-52巴氏滅菌吸管柱上經(jīng)陰離子交換層析而純化，凍干后DNA在水中兩次溶解和凍干。
標(biāo)準(zhǔn)連接
對于標(biāo)準(zhǔn)連接(片段小于載體)，載體與片段之比用克分子比1∶5。DNA最終濃度為25微克/毫升。DNA溶解在少量TE緩沖液中，加入10X連接酶混合物、T4 DNA連接酶，調(diào)節(jié)至1X連接酶混合物濃度(50毫克分子Tris-HCl pH7.4，10毫克分子MgCl2，10毫克分子DTE，1毫克分子ATP;標(biāo)準(zhǔn)體積30微升)。最好在14℃反應(yīng)16小時。
DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)5′端標(biāo)記
脫磷酸DNA(最終濃度約0.2微克分子)溶于1X激酶緩沖液Ⅰ(50毫克分子Tris-HCl，pH7.6，10毫克分子MgCl2，5毫克分子DTE，0.1毫克分子EDTA)與未標(biāo)記ATP與γ32p ATP(3000居里/毫摩爾)一起加入，ATP最終濃度總是大于1微克分子，靠單位清晰度和DNA濃度超過多核苷酸激酶的500～1000倍，在37℃時反應(yīng)30分鐘，萃取酚時停止該反應(yīng)。用乙醇沉淀DNA，再洗滌和干燥。
標(biāo)準(zhǔn)核酸內(nèi)切限制酶消化
主要根據(jù)發(fā)生器工作手冊進(jìn)行核酸內(nèi)切限制酶消化。無鹽的純DNA溶于緩沖液(Sp-0，Sp-50，Sp-100分別用于所用的酶)，用適量的酶進(jìn)行消化，最終材料用酚萃取及用乙醇沉淀。
瓊脂糖凝膠電泳后，DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)分離
通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段(見T.Maniatis等人1982年科爾德斯普林港實驗室，分子克隆)，用溴乙錠染色并在長波紫外線光下切斷。切片放入透析袋，注滿0.5X E-緩沖液(緩沖液與凝膠切片的體積比1.5∶1)，最好被浸于緩沖液。密封袋口，使無氣泡，放入注滿0.5XE-緩沖液的電泳室，在200伏時電泳30分鐘，再變換電流極性30秒，從透析袋壁釋放DNA。謹(jǐn)慎地除去包圍凝膠切片的緩沖液，進(jìn)一步在二乙氨乙基纖維素或DE 52層析柱(見上)上純化。
標(biāo)準(zhǔn)DNA脫磷酸
完全消化和純化的DNA溶于水，調(diào)節(jié)至1X CIP-緩沖液(標(biāo)準(zhǔn)總?cè)莘e為48微升)，加1微升(20單位)CIP，在37℃開始反應(yīng)，30分鐘后再加1微升CIP，1小時后加5微升50毫克分子EGTA，在65℃保溫10分鐘停止反應(yīng)。為了對含有鈍端或切口5′末端的DNA脫磷酸，分別在37℃時為15分鐘，56℃時為15分鐘，重復(fù)保溫用酚/sevag萃取及乙醇沉淀DNA。
放射性自顯影
膠片AGFA-Gevaert，Curix RP1，100AFW，柯達(dá)XAR5，1651512 X射線顯影劑;AGFA G153，柯達(dá)Lx24X射線是影劑;AGFA G353，柯達(dá)AL4。
標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法
采用D.Hanahan方法轉(zhuǎn)化(1983年，J.Mol.Biol.，166期，557～580頁)。
20毫升用單個菌落接種并在K1776培養(yǎng)基中生長(37℃，2000轉(zhuǎn)/分搖床)的宿主菌株的隔夜培養(yǎng)菌，取其中1毫升接種到100毫升預(yù)熱的37℃)K1776培養(yǎng)基。
這種培養(yǎng)菌在同樣條件下培養(yǎng)，在0.2光密度500毫微米時停止細(xì)胞生長，冷卻到4℃后離心分離，細(xì)胞片狀沉淀物再完全懸浮在20毫升冰冷的轉(zhuǎn)化緩沖液中，在0℃時保溫培養(yǎng)5分鐘。懸浮液再離心分離(3000轉(zhuǎn)/分，4℃，15分鐘)并再懸浮在4毫升冰冷的轉(zhuǎn)化緩沖液。將7微升DMSO加到200微升被培育的整分細(xì)胞，再在冰水中保溫15～60分鐘。將溶于20微升TE緩沖液的DNA加入，整分反應(yīng)潛能細(xì)胞，該混合物在冰水中培育20分鐘，在42℃保溫3分鐘。將這種整分細(xì)胞接種到1毫升預(yù)熱的(37℃)K1776培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)1小時。為轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化株，細(xì)胞被旋轉(zhuǎn)(3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘，4℃)，再懸浮在YT培養(yǎng)基并涂覆在指示板上，根據(jù)轉(zhuǎn)化株的期望量，一定量的懸浮液用于轉(zhuǎn)移。
標(biāo)準(zhǔn)快速分析質(zhì)粒分離
這個方法是Birnboim和Doly(1979年)方法的一種改進(jìn)(見T.Maniatis等人，1982年)。從每個應(yīng)分析的轉(zhuǎn)化株，制備2毫升隔夜培養(yǎng)菌(木刺挑菌37℃，16小時，轉(zhuǎn)盤)，在離心力為12000克的Eppendorf離心機上離心分離1.5毫升隔夜培養(yǎng)菌1分鐘，片狀沉淀物再溶于新鮮制備的每毫升溶菌酶混合物含有2毫克溶菌酶的溶液，在20℃時保溫5分鐘，在加入新鮮制備的冰冷的含1%十二烷基磺酸鈉的0.2克分子NaOH以后，該樣品在冰上保溫5分鐘。為沉淀染色體DNA和蛋白質(zhì)，加入150微升冰冷的乙酸鉀，pH值為4.8。在0℃保溫5分鐘，并在離心力為12000克離心機上離心分離含上清液的質(zhì)粒10分鐘后，再轉(zhuǎn)移到新的試管，并用三氯甲烷/導(dǎo)戊基醇(24∶1)萃取，把500微升異丙醇加到水相，混合物在-20℃時保溫30分鐘。離心分離后(10分鐘，12000克)，沉淀物用80%乙醇洗滌，并在真空中短暫干燥。該材料足以滿足5～6次通過凝膠電泳的不同的限制分析。
用聚丙烯酰胺凝膠電泳的標(biāo)準(zhǔn)純化寡核苷酸
寡核苷酸(大約20光密度，260毫微米)溶于緩沖的甲酰胺(0.1克分子TBE，并在7克分子尿素，20%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離(Maxam和Gilbert，Meth.Enzymol.65期，500～560頁1980年)。凝膠放在熒光薄板上，照射紫外線使DNA可見，在聚丙烯酰胺凝膠電泳(見上后，在分離DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法最好作大概的分離和純化，通常用γ32pATP和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析5′端磷酸化，以檢驗這種方法的質(zhì)量。
從β-半乳糖苷酶Lys-15-Glu-52-抑肽酶融合蛋白質(zhì)制備Glu-52-抑肽酶
細(xì)菌以不溶形式聚集，大量合成多種蛋白質(zhì)(D.C.Williams，R.M.Van Frank，J.B.Burnett，W.L.Muth 1982年，Science 215卷，687頁)。這些不溶性蛋白質(zhì)稱作包涵體。它們通常只用變性劑使之溶液化，所以易于由其它細(xì)胞蛋白質(zhì)純化。
大腸桿菌株RRl δM15(ATCC 35102)用質(zhì)粒pRK48.1.1轉(zhuǎn)化，從大腸桿菌后動子、操縱基因和核糖體結(jié)合部位的下游編碼Glu-52-抑肽酶β-半乳糖苷酶基因。15-Glu-52-抑肽酶β-半乳糖苷酶融合蛋白質(zhì)的最大聚集量是細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的20%。包涵物一般定位在極區(qū)或亞極區(qū)，靠近每個極有一個很大百分?jǐn)?shù)含包涵物的正態(tài)長細(xì)胞。
離心分離大腸桿菌株RRl δM15隔夜培養(yǎng)菌，然后，片狀沉淀物再懸浮在致斷(breaking)緩沖液，在聲破碎以后，細(xì)胞溶解產(chǎn)物經(jīng)離心分離回收包涵體，該包涵體用2克分子鹽酸鈲洗滌，根據(jù)Laemmli(U.K Laemmli 1970年，Nature 277卷，680～685頁)所述(見圖8)，由SDS-聚丙烯酰胺電泳檢查提純步驟。
為回收完整的lys-15-Glu-52-抑肽酶，包涵體必須由溴化氰增溶和切開，并且不折疊的Glu-52-抑肽酶必須折疊。
包涵體可在含足夠量DTT的6克分子鹽酸鈲中增溶。在不增溶部分被分離后，融合蛋白質(zhì)因?qū)?0毫克分子巰基乙醇的水透折而沉淀。該濕的融合蛋白質(zhì)溶于70%甲酸并根據(jù)Gross(E.Gross，B.Witkop 1961年，Amer.Chem.Soc.83卷，1510-1511頁)所述，由溴化氰切開。
Glu-52-抑肽酶通過離子交換層析，從β-半乳糖苷酶的溴化氰片段分離出來，同時根據(jù)Creighton(T.E.Creighton，Proceedings of Genex-UCLA symposium 1985年，金斯敦，在印刷中)(圖9)所述的方法再折疊?；钚砸种埔蜃涌捎肳esternblot分析法(圖10)測定。
活性部分通過蒸發(fā)濃縮，然后，對0.1克分子NH4HCO3進(jìn)行透析。凍干后，在大孔RP-18層析柱上，用緩沖液A的0.1%TFA和緩沖液B的0.1%TFA、60%CH3CN的梯度，通過高壓液相色譜法(HPLC)提純抑制因子。
匯集活性部分，抑制因子的特征在于根據(jù)Hewick(R.M.Hewick，M.W.Hunkapiller，L.E.Hood，W.I.Dreyer 1981年J.Biol.Chem.256卷，7990～7997頁)所述，用氣相順序發(fā)生器使之微順序化。首先從氨基末端的20種殘基與預(yù)期的抑制因子完全相同(表2)。氨基酸分析說明抑制因子有期望的氨基酸組合物(表1)。
抑肽酶和Glu-52-抑肽酶通過胰蛋白酶抑制活性的對比表示了相同的劑量反應(yīng)曲線(圖11)。
所有的這些實驗表明，有可能制造大腸桿菌中融合蛋白質(zhì)的Glu-52-抑肽酶，并且在復(fù)性條件下分裂和分離后對其進(jìn)行分離。
Val-15-Glu-52-抑肽酶及其衍生物的制備
可按上述Glu-52-抑肽酶的同樣方法，從β-半乳糖苷酶融合蛋白質(zhì)制備Val-15-Glu-52抑肽酶(圖12，13)。通過彈性蛋白酶抑制分析測定抑制活性。
抑制因子的特征在于氨基酸分析和氨基末端順序(表1和2)。
所有其它的抑肽酶衍生物可按上述Glu-52-抑肽酶和Val-15-Glu-52-抑肽酶的同樣方法進(jìn)行制備。
表1
抑肽酶、Glu-52-抑肽酶和Val-15-Glu-52-抑肽酶的氨基酸分析
氨基酸 抑肽酶 Glu-52 Val-15-Glu-52
ASP 4.75(5) 4.92(5) 5.10(5)
THr 2.90(3) 2.91(3) 2.85(3)
Ser 0.98(1) 1.01(1) 0.95(1)
Glu 2.90(3) 4.30(4) 4.30(4)
Gly 5.92(6) 5.91(6) 6.30(6)
Ala 6.00(6) 6.00(6) 6.00(6)
Val 1.04(1) 1.02(6) 2.06(2)
Met 0.95(1) - -
Ile 1.29(2) 1.30(2) 1.35(2)
leu 2.10(2) 2.01(2) 2.01(2)
Tyr 3.92(4) 3.70(4) 3.81(4)
Phe 3.86(4) 4.08(4) 4.05(4)
lys 3.99(4) 3.80(4) 3.10(3)
Arg 5.82(6) 5.75(6) 6.00(6)
用鄰-苯二醛在立式塔衍生后，測定氨基酸。
Cys和Pro未測定。
表2
Glu-52和Val-15-Glu-52-抑肽酶(氨基末端)的氨基酸順序
1.Glu-52-抑肽酶;大約1毫摩爾物質(zhì)的順序超過20個循環(huán)
1 15
Arg-pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-
16 20
Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-
2.Val-15-Glu-52-抑肽酶;大約1毫摩爾物質(zhì)設(shè)計順序超過20個循環(huán)
1 15
Arg-Pro-Aps-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Val-
16 20
Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-
比較抑肽酶/Glu-52-抑肽酶
用BrCN分裂后得到的Glu-52-抑肽酶與抑制豬胰蛋白酶活性的真實抑肽酶相比較，Pyrglu-Gly-Arg-pNA和苯甲酰-Arg-pNa兩種物質(zhì)用于胰蛋白酶測定。
抑肽酶的原料溶液是1微克/毫升，Glu-52-抑肽酶的原料溶液是0.6微克/毫升。0、100、200、300、400、500微升這種原料溶液和苯甲酰-Arg-pNA用于試驗，在試驗中使用0、3、6、9、12、15微升Pryglu-Gly-Arg-pNA，其結(jié)果列于表3。
表3
抑肽酶 Glu-52-抑肽酶
作用物 抑制因子量 △E/10分 抑制因子量 △E/10分
每次測定 每次測定
苯甲酰- 0毫微克 0.91 0毫微克 0.91
Arg-pNA 100 0.76 60 0.77
200 0.57 120 0.68
300 0.39 180 0.58
400 0.08 240 0.44
500 0.00 300 0.30
Pyr-Glu- 0毫微克 0.85 0毫微克 0.84
Gly-Arg- 3 0.62 1.8 0.67
pNA 6毫微克 0.39 3.6毫微克 0.56
9 0.29 5.4 0.47
12 0.18 7.2 0.32
15 0.13 9.0 0.28
這些結(jié)果說明，抑肽酶和Glu-52-抑肽酶在兩種胰蛋白酶抑制測定中的劑量響應(yīng)曲線是相等的。這不僅說明Glu-52-抑肽酶幾乎含100%活性分子，而且胰蛋白酶即抑制因子復(fù)合物的平衡常數(shù)數(shù)量級相同。
西部斑跡(Western blotting)
用Towbin所述方法進(jìn)行西部斑跡(Western blotting)(H.Towbin，T.Staehelin)，I.Gordon1979年，美國國家科學(xué)院論文集76卷，4350～4354頁)。以兔子的多克隆抗抑肽酶抗體作為初級抗體，含生物素的輔助抗免子抗體作為次級抗體，探測硝化纖維的缺陷。用產(chǎn)品供應(yīng)者手冊所述的作用物4-氯-1-萘酚的抗生蛋白鏈菌素-生物素的辣根過氧物酶復(fù)合物檢測免疫復(fù)合物(Amersham buchler，Braunschweig)。
固相酶連接免疫吸收劑測定(ELISA)
固相酶連接免疫吸收劑測定(ELISA)按Müller-Esterl(W.Müller-Esterl，A.Oettle.E.Truscheit，H.Fritz，F(xiàn)resenius Z.Anal.Chem.(1984年)317卷，718～719頁)所述，用微滴定度抗體板以競爭性方式進(jìn)行。
氨基酸順序測定
在30微升TFA中增溶大約0.5～2毫微摩爾蛋白質(zhì)，該試樣加到用3毫克polybrene預(yù)處理過的玻璃纖維濾器，順序分析根據(jù)Hewick(R.M.Hewick，M.W.Hunkapiller，L.E.Hood，W.Dreger 1981年，I.Biol.Chem.256卷，7990～7997頁)所述應(yīng)用生物系統(tǒng)(美國股份有限公司)由氣相蛋白質(zhì)順序裝置來完成。分析逐步釋放的氨基酸乙內(nèi)酰苯硫脲衍生物，用氰基-HPLC柱(DU PONT)以及由Beyreuther(K.Beyrenther，B.Biesler，J.Borsens，R.Dildrop，K.Neufer，K.stüber，S.Zais，R.Ehring，P.Zabel 1983年，《蛋白質(zhì)化學(xué)的現(xiàn)代方法》303～325頁，Walterde Gruyter &Co.，Berling)所述的分離系統(tǒng)進(jìn)行。使用Waters HPLC系統(tǒng)，它包括M510泵、WISP7108自動注射器、LC-分光光度計M481和Shimadzu積分儀C-R3A。
酸水解和氨基酸分析
給入耐熱玻璃管大約1毫微摩爾蛋白質(zhì)，再加入200微升6克分子含0.05%2-巰基乙醇的恒沸HCl(I.T.Potts Jr.1969年《分析生物化學(xué)》131期，1～15頁)。管子在真空下密封，110℃保溫22小時。水解產(chǎn)物快速干燥，再溶解于150微升0.2克分子檸檬酸鈉緩沖液，pH2.2，并經(jīng)過濾。用裝有熒光指示器和Shimadzu c-R2AX積分儀的Biotronik Lc 5000氨基酸分析器進(jìn)行氨基酸分析，基本上按Benson所述，與鄰-苯二醛反應(yīng)后，定量表示氨基酸(J.R.Benson，P.E.Hare 1975年，美國國家科學(xué)院論文集72卷，619～622頁)。
標(biāo)準(zhǔn)白細(xì)胞彈性蛋白酶測定
材料
人體白細(xì)胞彈性蛋白酶的獲自彈性蛋白產(chǎn)品公司Inc.，P.O.Box147，Pacific，Miss.63069/美國。
甲氧琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-纈氨酸-對硝基酰苯胺(K.Nakajima，J.C.Powers，M.J.Castillo，B.M.Ashe and M.Zimmermann，《生物化學(xué)》254卷，4027頁，1979年)可得自Fa.Bachem，F(xiàn)einchemikalien AG，Hanptstr，144，CH-4416 Bubendorf/Schweiz。
方法
將上述材料加入550微升由下列材料組成的混合物，這些材料是含0.05%多山梨酸脂80(Tween80)和0.05克分子氯化鈣的0.2克分子Tris緩沖液pH8.0，以及在100毫升50%乙二醇中溶解1毫克酶所得到溶液的5微升抑制劑溶液。該混合物在室溫下保溫30分鐘，然后，攪拌加入100微升由6.5微升在1毫升二甲亞砜中有59毫克甲氧琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L纈氨酸-對-硝基酰苯胺的溶液和試驗緩沖液組成的混合物，在405處顯示了光密度的增加，通過放大含試樣和控制酶的抑制劑光密度增加系數(shù)來測定抑制百分率。
胰蛋白酶的抑制(測定)
胰蛋白酶抑制的測定，借助于作用物苯甲酰-DL-精氨酸-對-硝基酰苯胺(Merck 1670)或焦谷氨?；?甘氨酰-精氨酸-對-硝基酰苯胺，它由可買到的焦谷氨?；?甘氨酸(SENN 6886)和精氨酸-對-硝基酰苯胺×HBr(SENN 9123)藉二環(huán)己基碳二亞胺縮合法合成。這種作用物還通過KAB1作為尿激酶作用物命名為S-2444被銷售。
前者對試樣的抑肽酶量有線性響應(yīng)的優(yōu)點，但靈敏度較低。后者有較高的靈敏度，但由于抑肽酶-胰蛋白酶復(fù)合物在低濃度下的解離，劑量響應(yīng)曲線是非線性的。
測量胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制因子的緩沖液是含0.01克分子CaCl2和0.05% Tween80
的0.2克分的Tris。
這種測定可用在400毫微米能讀數(shù)光密度(ODs)的任意分光光度計完成。為全自動測量，光度計必須裝有微處理機或與適宜的個人計算機相連接。
全部測定使用可任意處理的1厘米半微量塑料比色杯。每隔1分鐘讀數(shù)光密度，在室溫下超過8個周期。每分鐘OD的平均增加量可任意地取作活性單位。
為測定抑制作用，豬的胰蛋白酶(Merck 8350)溶液(0.001克當(dāng)量HCl/50%甘油)與抑制因子試樣混合，用緩沖液調(diào)節(jié)至500微升，在室溫下保溫10分鐘，再加入作用物溶液促使反應(yīng)進(jìn)行。更詳細(xì)情況列于下表。抑制活性取自標(biāo)定曲線或特意為此目的編制計算機程序的自動計算。
用Pyrglu-Gly-Arg-pNA 用苯甲酰基-Arg-pNA
為作用物的測定 為作用物的測定
胰蛋白酶 15微升(1微克/毫升) 20微升(100微升/毫升)
作用物 50微升(10%乙醇含0.02 50微升(10%DMSO含0.012
克分子) 克分子)
在本領(lǐng)域內(nèi)已知大量的各種微生物適用于轉(zhuǎn)化，也就是能在培養(yǎng)物中生長或發(fā)酵的單細(xì)脆微生物。用于轉(zhuǎn)化的最好的生物包括細(xì)菌、酵母和真菌。
本文公開的為此工作所選擇的特定微生物是E.Coli RR1△15，存儲在美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫，編號為ATTC 35102號。也應(yīng)用其它適宜的E.Coli菌株。
本發(fā)明包括除無毒性藥物制劑之外還包括根據(jù)本發(fā)明的含1種或多種化合物的藥用上適宜的惰性賦形劑，或者根據(jù)本發(fā)明由1種或多種活性化合物組成的藥物制劑，以及這些制劑的制造方法。
本發(fā)明還包括藥物制劑的劑量單位，即這些制劑成各種形式，如片劑、包衣片劑、膠囊、丸藥、栓劑和針劑。其中活性化合物的含量相當(dāng)于單劑量一部分或是單劑量的幾倍。劑量單位可包括如1、2、3、或4單劑量，或者1/2、1/3或1/4單劑量，單劑量最好含有一次服用的活性化合物的量，通常相當(dāng)于一日劑量的總量、1/2或1/3或1/4。
所謂無毒、藥用上適宜的惰性賦形劑指的是固體、半固體或液體稀釋劑，填料及所有類型的配方助劑。
片劑、包衣片劑、膠囊、丸藥、粒劑、栓劑、溶液、懸浮液和乳劑、泥膏劑、軟膏、凝膠、乳膏、洗滌劑、粉劑和噴霧劑可說是最好的藥用制品。
片劑、包衣片劑、膠囊、丸藥和粒劑可含活性化合物或常規(guī)賦形之外的化合物，如(a)填料和膨脹劑如淀粉、乳糖、蔗糖、葡糖、甘露糖醇和二氧化硅，(b)粘合劑如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮，(c)致濕劑如甘油酰，(d)崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸鈉、(e)溶液阻滯劑如石蠟，(f)吸收加速劑如季銨化合物，(g)潤濕劑如鯨蠟醇和甘油酰-硬脂酸，(h)吸附劑如高嶺土和膨潤土，以及(i)潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂以及固相聚乙二醇，或所述(a)至(i)物質(zhì)的混合物。
提供的片劑、包衣片劑、膠囊、丸藥和粒劑，用通常的包衣和殼層，可任意地選擇不透明劑，還可是如此組合物，它們僅僅釋放活性化合物或化合物，或者優(yōu)先是一定部分腸道?？蓛?yōu)先地選擇延遲方法，以及可用于等效異位物質(zhì)和蠟的包埋組合物的樣品。
活性化合物或化合物與一種或幾種上述賦形劑一起，還以微膠囊包藥的形式存在。
栓劑可包括除活性化合物或化合物外，還包括通常的水可溶性或水不可溶性賦形劑，例如聚乙二醇、脂肪如可可脂肪和較高的酯(例如C16脂肪酸的C14醇或這些物質(zhì)的混合物。
軟膏、泥膏劑、乳膏和凝膠可包括活性化合物或化合物以外的常規(guī)賦形劑例如動物脂肪和植物脂肪、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、二氧化硅、滑石粉和氧化鋅，或這些物質(zhì)的混合物。
粉劑和噴霧劑可包含除活性化合物或化合物以外的常規(guī)賦形劑例如乳糖、滑石粉、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可另外包含通常的發(fā)射劑，如含氯氟烴。
溶液和乳劑包括普通賦形劑及活性化合物或化合物，如溶劑、增溶劑和乳化劑，例如水、乙醇、異丙基醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類、尤其是棉子油、花生油、玉米芯油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油、甘油、甘油縮甲醛、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯，或是這些物質(zhì)的混合物。
對于不經(jīng)腸道的給藥，還可以是與血液等滲壓的無菌溶液和乳劑。
懸浮液可包括普通的賦形劑及活性化合物或化合物，例如液體稀釋劑水、乙醇、丙二醇，懸浮劑如乙氧基異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂以及黃蓍膠，或是這些物質(zhì)的混合物。
所述配方形式還可包括著色劑、殺菌劑及改善氣味和調(diào)味的添加劑，如薄荷油和桉油，以及增甜劑如糖精。
治療用的活性化合物最好應(yīng)存在于上述藥品中，濃度大約是混合物總量的0.1～99.5%(重量)，最好為0.5～95%(重量)。
上述藥用用制劑除了包括本發(fā)明的化合物外，還可包括其它藥用活性化合物。
上述藥用制劑是用已知的常規(guī)方法制造的，例如用活性化合物或多種化合物與一種賦形劑或多種賦形劑相混合的方法。
服用活性化合物或藥物制劑可以是局部的、口服的、非腸道的、腹膜內(nèi)的和/或直腸的方法，最好是口服或非腸道用藥如靜脈或肌肉注射。
總的說來，人用藥品和獸用藥品根據(jù)本發(fā)明每24小時以總量的大約0.5～500，最好是5～100毫克/公斤體重給以活性化合物或多種化合物，可任意選擇幾種單獨給藥形式，以達(dá)到所要求的結(jié)果。單獨給藥中本發(fā)明的活性化合物或多種化合物，最好大約1～250，特別是3～60毫克/公斤體重。然而，偏離所述的劑量，特別是倘若發(fā)生用藥超越接受治療的本身機能和體重、病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，制劑和用藥的性質(zhì)，以及給藥的時間和間隔的情況，則是必需考慮的。
因此，在某些情況下，處理少于上述活性化合物的量是可以滿足的。而在另一些情況下，上述活性化合物量必定超過。特別需要的最佳劑量和活性化合物給藥類型，熟悉本領(lǐng)域的任何人在其熟悉的知識基礎(chǔ)上可容易地決定。
用表達(dá)質(zhì)粒pRK49.2.1和pRK48.1.1轉(zhuǎn)化的E.coli，存放在德國微生物收藏中心，戈廷根，格利斯巴赫大街8，D-3400，收藏號DSM3678和DSM3679。
作為實施例7的同系物ArG-15同系物對治療急性炎癥非常有效，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、遺傳、血管神經(jīng)性水腫、肺炎、胰炎和休克。該ArG-15-同系物進(jìn)一步用作透析方法中人造膜和體外循環(huán)中的保護(hù)劑。
實施例1
編碼Glu-52和Val15-Glu-52-抑肽酶的DNA片段合成與純化
用固相合成方法制備含基因的寡核苷酸。寡聚體的合成圖是示意圖，活化所用質(zhì)子，即保護(hù)的2′-脫氧核苷酸磷酰胺。用從這個制造廠得到的保護(hù)核苷酸、溶劑、化學(xué)藥品及試劑在應(yīng)用生物系統(tǒng)模型380DNA合成器，用自動操縱法完成全部順序步驟。從同一工廠得到的固相支持物由已附加起始的3′-核苷酸微孔試管控制。引入自動反應(yīng)循環(huán)的某些改進(jìn)符合制造廠操作規(guī)程和使用規(guī)定。直至合成完成，根據(jù)制造廠建議，寡聚體在DNA合成器內(nèi)從固相支持物解封和離開。
在密封管形瓶中，含寡聚體與濃氫氧化銨的水溶液在55℃加熱4～24小時，除去保護(hù)基團(tuán)。蒸發(fā)所得溶液，殘敘物溶于0.01克分子碳酸氫三乙基銨緩沖液，pH7.0(TEAB緩沖液)。這種溶液在Sephadex-G50
凝膠過濾樹脂上層析，用同樣的TEAB緩沖液處理和洗脫該層析柱，匯集洗脫空柱的物料并蒸發(fā)該溶液。
一部分溶于裝載緩沖液(組分在甲酰胺中0.1%溴酚藍(lán)，0.1%氰二甲苯，10毫米乙二胺四乙酸二鈉)的殘余物(在260毫微米處吸光度單位的10～40%)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步純化，該凝膠尺寸是18×32厘米，厚度1.5毫米。用這種方法純化的每個寡聚體的合適尺寸，其寬度為2～5厘米，用單個凝膠純化的寡聚體至多5個。凝膠中丙烯酰胺濃度變化為14～20%，取決于所要求產(chǎn)品的鏈長。對較長的寡聚體，最好是14%丙烯酰胺凝膠，而純化較短的寡聚體，丙酰胺凝膠至多20%，該凝膠還包括7克分子尿素和Tris-硼酸鹽-EDTA緩沖液(0.1克分子Tris，0.1克分子硼酸鹽，2毫克分子EDTA，pH8.3)。流動緩沖液是同樣的Tris-硼酸鹽-EDTA混合物。在恒定功率20～60瓦特，電泳18～6小時。這種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可參閱應(yīng)用生物系統(tǒng)的各種用戶信息公報。
完成電泳后將凝膠包在塑料包裝紙內(nèi)，寡聚體由紫外線投影顯象。包好的凝膠放在熒光薄層色譜板上，用短波長紫外光源觀察凝膠。所要求的產(chǎn)品即藍(lán)色DNA大片段，用這種投影技術(shù)表現(xiàn)為最慢的轉(zhuǎn)移，自凝膠產(chǎn)生的帶是存在的。用EpiGene D-Gel
電泳裝置將DNA寡聚體從凝膠洗脫到粉狀二乙氨乙基(DEAE)纖維素。用1克分子TEAB緩沖液洗脫纖維素，回收寡聚體，再蒸發(fā)含寡聚體的緩沖液，殘余物溶于0.01克分子TEAB緩沖液，然后，通過所述Sephadex-G50
柱脫鹽，儲集空柱內(nèi)洗脫物并凍干得到最終產(chǎn)品。
用以上概述的方法，得到的每個純化寡聚體大約0.5～5.0A260單位。
實施例2
Glu-52和Val-15-Glu-52-抑肽酶的合成抑肽酶主導(dǎo)基因的構(gòu)建
這些特定的合成抑肽酶基因構(gòu)建包括15種純核寡苷酸的組合(見圖14)。圖3所示DNA順序包括起始密碼子ATG，兩個末端密碼子TAG和TAA，末端限制部位Eco RⅠ，HindⅢ和Bam HⅠ，以及內(nèi)限制部位。選擇這些部位有助于編碼順序及其飾變的克隆。
用來生成這種合成基因的構(gòu)建，除應(yīng)用這些片段外，還使用多核苷酸激酶、T4 DNA連接酶，以及在材料與方法一節(jié)詳細(xì)敘述的限制酶。
15種純核寡苷酸片段溶于50毫克分子TEABC(碳酸氫三乙基銨緩沖液，pH7.5)最終濃度為10微微摩爾/毫升。所有片段磷酸化，處理成4個單獨部分(片段1，3;片段2，4，6;片段5，7，9，11，13;片段8，10，12，14，16)。為此制備目的，各個片段80微微摩爾分別溶于由下述物質(zhì)組成的混合物，這些物質(zhì)為1X PNK-混合物、2微克分子ATP、每10微微摩爾片段0.5微居里32P gamma ATP、每微微摩爾片段10單位PNK，使總?cè)莘e分為片段1，3∶300微升;片段2，4，6∶400微升;片段5，7，9，11，13和片段8，10，12，14，16∶各為700微升。各部分反應(yīng)在37℃時進(jìn)行30分鐘，所有部分被酚解，用乙醇沉淀、洗滌和干燥。
為了雜交，片段1，3和2，4，6(A組)被溶解混合于1X連接酶混合物，總?cè)莘e120微升，在70℃保溫5分鐘，在5小時內(nèi)冷卻到室溫。其它片段(B組)按照相同方法在240微升中雜交。
為了連接，A組溶液補充12微升10毫克分子ATP，12微升100毫克分子DTE，20微升TA-DNA連接酶，而B組溶液補充兩倍同樣的量。在14℃反應(yīng)7小時，此后，對A組添加10微升T4 DNA連接酶，對B組添加20微升，再在14℃保溫45分鐘。酚解該混合物，用乙醇沉淀并干燥。
得到的A組溶液溶于90微升1X SP-100和10微升Eco RⅠ(10微米/微升)，B組溶液溶于90微升1X SP-50和10微升Bam HⅠ，在37℃保溫1小時。用酚萃取和乙醇沉淀而停止這些反應(yīng)，進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，DNA各組按上述同樣方法進(jìn)行回收。
等量放射性標(biāo)記的A組和B組溶于水，調(diào)節(jié)至1X連接酶混合物，為最終連接成合成基因按上述雜交。為此，3微升10毫克分子ATP，3微升100毫克分子DTE，3微升T4 DNA連接酶加到22微升雜交混合物，在14℃保溫7小時，再加1微升T4 DNA連接酶，該反應(yīng)在14℃時進(jìn)行45分鐘，通過酚萃取和乙醇沉淀提純連接產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)的限制酶消化(Bam HⅠ1.5微升，EcoRⅠ1.5微升雙重消化)在Sp-50中完成，酚萃取的物料在乙醇沉淀前，該水溶液調(diào)節(jié)至3毫克分子MgCl20.3克分子乙酸鈉。然后進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，按上述同樣方法回收基因。
實施例3
重組體質(zhì)粒pRK63.1.1和pRK54.1.1的構(gòu)建
為實驗抑肽酶克隆精選的質(zhì)粒是pUC8(J.Vieira和J.Messing，1982年Gene，19期，259頁)，這種克隆載體的組成是pBR322衍生的α-氨基芐青霉素酶基因和連接至含單一限制酶識別部位序列的Lac Z基因部分的DNA復(fù)制起點。當(dāng)這種載體引入Lac E.coli，轉(zhuǎn)化株就在適當(dāng)?shù)闹甘景迳袭a(chǎn)生藍(lán)色菌落，將DNA片段克隆到許多限制部位的任意部位上，如EcoRⅠ和BamHⅠ之間的部位，使Lac基因失活產(chǎn)生白色菌落。
載體制備
為把合成抑肽酶主導(dǎo)基因連接進(jìn)pUC8，完成制備載體制劑，用EcoRⅠ和Bam HⅠ，在標(biāo)準(zhǔn)核酸內(nèi)切限制酶消化條件下兩次消化純pUC8DNA(大約30微微摩爾)，切出一小段內(nèi)部的Eco RⅠ-Bam HⅠ片段。這種制劑用小牛腸內(nèi)的磷酸酶脫去磷酸，通過瓊脂糖凝膠電泳被分離，并提純載體的Eco RⅠ-Bam HⅠ大片段(標(biāo)準(zhǔn)條件下)。這種方法非常便于用載體進(jìn)一步工作，因為除去在Eco RⅠ和Bam HⅠ末端上的載體分子的自身連接，轉(zhuǎn)化株的底物急劇地減少。
連接
用1微微摩爾載體通過連接純合成抑肽酶基因的總量構(gòu)建pRK63(見圖4)(1.8單位T4-DNA-連接酶，1X連接酶混合物，總?cè)莘e45微升，在14℃保溫7小時，添加1單位T-DNA-連接酶，在14℃再保溫45分鐘)。
轉(zhuǎn)化
用D.Hanahan的轉(zhuǎn)化方法(詳見標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法)，E.coli菌株RRIδM15(A.Kalnins等人，1983年，EMSO Journal，2期，593頁;ATCC35102)用作受體細(xì)胞。用50%連接物在含200微克/毫升α-氨基芐青霉素的指示板上轉(zhuǎn)化后，得到15個“白色”轉(zhuǎn)化株。15個轉(zhuǎn)化株都用Birnboim和Doly1979年(見上)的方法，快速分析質(zhì)粒分離的飾變進(jìn)行篩選。為此，15個試樣的片狀沉淀物再溶于30微升含1微克RNase A.的1X SP-100，用Eco RⅠ和Bam HⅠ完成限制消化。
凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)15個轉(zhuǎn)化株中的4個含有攜帶近似200堿基對長的Eco RⅠ-Bam HⅠ片段的質(zhì)粒DNA。
攜帶這種Eco RⅠ-Bam HⅠ片段的所有轉(zhuǎn)化株大量生長，從每個轉(zhuǎn)化株分離出質(zhì)粒并作進(jìn)一步分析，其中兩個根據(jù)Maxam和Gilbert方法編順序，順序全部正確，證明了化學(xué)合成和構(gòu)建極好。
通過ApaⅠ-StuⅠ片段的合成基因的β組與含有在15位取代Lys的Val密碼子的β組作簡單交換，構(gòu)建質(zhì)粒pRK54.11(Val-15-Glu-52抑肽酶)。
大約100微微摩爾合成SS DNA片段BEA 4A和BEA 4B(見圖2B)溶于20微升水，在95℃加熱5分鐘，再在5小時內(nèi)緩慢冷卻至室溫。用1.5微微摩爾pRK63.1.1的純DNA連接雜交的未磷酸化片段，失去ApaⅠ-StuⅠ片段，用30微升連接混合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)連接，用50%連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli RRⅠ△M15。通過分析質(zhì)粒分離和限制分析，從1500個轉(zhuǎn)化株中檢查24個，全部可靠，其中兩個用Biolabs，Beverly，MA USA的M13雙脫氧核苷酸順序系統(tǒng)編排順序。轉(zhuǎn)化株pRK54.1.1用于進(jìn)一步實驗。
實施例4
表達(dá)質(zhì)粒pRK48.1.1和pRK49.2.1的構(gòu)建
為表達(dá)融合蛋白質(zhì)的抑肽酶，構(gòu)建一種質(zhì)粒，其中抑肽酶基因位于β-半乳糖苷酶基因的羧基末端，證明與U.Rüther和B.Müller-Hill(1983年，EMBO Journal 2期，1791～1794頁以及德國專利DE-OS 3309501.9號)的實驗相同。
為克隆表達(dá)載體pUR278的合成抑肽酶基因，選擇克隆部位BamHⅠ和HindⅢ，因此有必要在基因的5′EcoRⅠ端添加BamHⅠ部位，以及在3′端用HindⅢ部位，飾變抑肽酶基因(見圖6)。
50微微摩爾pRK63.1.1DNA在37℃下，用120微升1×SP-100中EcoRⅠ(15微微摩爾hit/微升)處理過夜而被完全消化。通過用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)、dATP和dTTP(Maniatis等人，1982年)的酶反應(yīng)填滿這種DNA材料伸出的5′EcoRⅠ端。溶解600微微摩爾干燥的α32pATP(250微居里)，并與160微升DNA(50微微摩爾)、10微升1毫克分子dATP(10000微微摩爾)、20微升NT緩沖液混合。然后添加10微升DNA聚合酶Ⅰ(Klenow，50微米)，在室溫進(jìn)行第一次保溫，30分鐘后，加入10微升1毫克分子dTTP(10000微微摩爾)與5微升聚合酶(25微米)一起加入，在室溫進(jìn)行第二次保溫。用酚/Sevag萃取的物料，將放射性標(biāo)記的分子量部分儲集后用乙醇沉淀、洗滌、溶于50微升TE，于20℃儲存。
為用BamHⅠ聯(lián)結(jié)子連接，使用20微升這種齊平端的材料，因此，用γ32p ATP標(biāo)記的400微微摩爾5′BamHⅠ聯(lián)結(jié)子(標(biāo)準(zhǔn)5′磷酸化方法)連接到40微微摩爾DNA端(標(biāo)準(zhǔn)連接條件，4.5微米T4 DNA連接酶，總?cè)莘e60微升)。為檢查聯(lián)結(jié)子連接質(zhì)量，進(jìn)行分析凝膠電泳，加入100微微摩爾BamHⅠ聯(lián)結(jié)子、1.8單位T4 DNA連接酶以后，在20℃保溫1小時，再加入1單位T4 DNA連接酶，在14℃保溫18小時，達(dá)到完全連接。用酚/Sevag萃取反應(yīng)混合物，用乙醇沉淀、洗滌、干燥并溶于40微升TE。
對制備具有BamHⅠ和HindⅢ末端的合成抑肽酶基因，首先用HindⅢ(10.5微微摩爾hit/微升，5小時，37℃)及BamHⅠ(40微微摩爾hit/微升，20小時，37℃標(biāo)準(zhǔn)條件)切斷連接的線狀質(zhì)粒(10微微摩爾)。在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和謹(jǐn)慎地提純(見標(biāo)準(zhǔn)方法)后，分離出該片段。
載體制備
起始載體pUR278(大約5微微摩爾)首先用由酚/Sevag萃取、乙醇沉淀、再溶解純化的HindⅢ(標(biāo)準(zhǔn)條件)切開，然后用BamHⅠ(標(biāo)準(zhǔn)條件)消化。這種材料裝到1%瓊脂糖凝膠上，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行電泳，分離和提純，除去18堿基對長的BamHⅠ-HindⅢ片段，該片段與合成抑肽酶基因競爭連接。
連接和轉(zhuǎn)化
為連接0.3微微摩爾載體，使用1.5微微摩爾片段(近似)、2單位T4 DNA連接酶(標(biāo)準(zhǔn)條件，總?cè)莘e30微升，在14℃保溫4小時)。
E.Coli菌株RRl δMIS作為宿主，用1/3連接酶混合物(標(biāo)準(zhǔn)條件)完成轉(zhuǎn)化。在含200微克α-氨基芐青霉素/微升的指示板上得到總數(shù)為173個“藍(lán)”菌落。從此用快速分析質(zhì)粒分離法(標(biāo)準(zhǔn)條件)分析12個轉(zhuǎn)化株，173個轉(zhuǎn)化株中有30個是背景轉(zhuǎn)化株，用來計算由再連接載體得到轉(zhuǎn)化株的百分率。這個結(jié)果由12個轉(zhuǎn)化株質(zhì)粒的限制分析得到肯定，其中8個顯示大約200堿基對的BamHⅠ-HindⅢ限制片段是可靠的?？煽康闹亟M體質(zhì)粒也由SstⅡ和抑制肽酶基因內(nèi)單一限制部位線性化。根據(jù)Maxam和Gilbert的堿基順序分析(1980年)展現(xiàn)了質(zhì)粒pRK48.1.1.插入所要求的抑肽酶DNA片段(見圖6)，用質(zhì)粒pRK48.1.1作進(jìn)一步分析和表達(dá)工作。
用pRK54.1.1的Val-15-Gln-52基因的同樣方法，嚴(yán)格構(gòu)建質(zhì)粒49.2.1。表示正確的DNA順序的可靠重組體質(zhì)粒49.2.1和將這個構(gòu)建用來進(jìn)一步分析和表達(dá)工作。
檢測β-半乳糖苷酶-Glu-52抑肽酶和β-半乳糖苷酶-Val-15-Gln-52-抑肽酶的表達(dá)
為試圖表達(dá)各個構(gòu)建，帶有pRK48.1.1(收藏在DSM，DSM3679號)和pRK49.2.1(收藏在DSM，DSM3678號)的E.Coli菌株接種到2微升用4微升0.1克分子IPTG補給的Lβ-α-氨基芐青霉素培養(yǎng)基。將含無抑肽酶基因插入物pUR278的克隆，接種到培養(yǎng)基，對測定提供相反控制。在37℃下攪拌生長12～16小時后，將1毫升樣品接種到100毫升Lβ-α-氨基芐青霉素培養(yǎng)基。在37℃下攪拌生長12～16小時后，在貝克曼JA10旋轉(zhuǎn)器(5000轉(zhuǎn)/分)中離心分離10分鐘，得到細(xì)胞。
根據(jù)Laemmli，U.K.所述，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳直接融合蛋白質(zhì)(1970年，Nature，277期，680頁，參閱B.D.Hames和D.Rickwood1981年，蛋白質(zhì)的凝膠電泳，IRL Press股份有限公司，牛津)。
每個通道(lane)約1×10E9細(xì)胞被離心分離，再溶于稀釋度1∶5的SDS樣品緩沖液(0.3克分子Tris HCl pH8.8，50%甘油，5%SDS，25%巰基乙醇)。電泳后，凝膠用Coomassie藍(lán)染色，圖7說明E.Coli蛋白質(zhì)與可歸納的β-半乳糖苷酶Glu-52抑肽酶融合蛋白質(zhì)的典型型式。
溶液
致斷(bleaking)緩沖液
50毫克分子Tris;
100毫克分子氯化鈉;
10毫克分子氯化鎂;
10毫克分子巰基乙醇;
2克分子鹽酸鈲溶液;
2克分子鹽酸鈲;
50毫克分子Tris-HCl，pH7.7;
100毫克分子氯化鈉;
10毫克分子巰基乙醇;
6克分子鹽酸鈲溶液;
6克分子鹽酸鈲;
50毫克分子Tris-HCl;
100毫克分子氯化鈉;
10毫克分子巰基乙醇。
實施例5
Glu-52-抑肽酶的制備
1，β-gal-融合蛋白Lys-15-Glu-52-抑肽酶的分離和溴化氰分裂
為此制備目的，用8000轉(zhuǎn)/分離心分離6升E.Coli隔夜培養(yǎng)物菌株RRl δM15 15分鐘，大約有15克(重量)再懸浮于30毫升致斷(breaking)緩沖液并聲破碎6分鐘(冰冷卻)，用20000轉(zhuǎn)/分離心分離細(xì)胞溶解產(chǎn)物20分鐘，廢棄上清液，大約10克片狀沉淀物再懸浮于20毫升2克分子鹽酸鈲溶液，并被均勻化。用20000轉(zhuǎn)/分離心分離20分鐘后，廢棄上清液，在N2氣氛下，大約8克片狀沉淀物溶于20毫升6克分子含200毫克DTT的鹽酸鈲溶液，在50℃時還原1小時。該溶液用10000轉(zhuǎn)/分離心分離10分鐘，滲析24小時，防止含10毫克分子巰基乙醇的水。用20000轉(zhuǎn)/分離心分離20分鐘，收集沉淀的融合蛋白質(zhì)，該濕融合蛋白質(zhì)溶于30毫升濃甲酸，然后用水稀釋到70%，該融合蛋白質(zhì)因添加4克溴化氰而分裂，在暗室氮氣氛下保溫18小時，用200毫升水稀釋，停止該反應(yīng)，通過凍干排除水和揮發(fā)性副產(chǎn)品。根據(jù)Laemmli，用SDS凝膠電泳檢查溴化氰分裂，產(chǎn)量大約是1.5克溴化氰片段，在一系列實驗中產(chǎn)量變化為0.8～2.5克。
溶液
緩沖液A.pH8.2，
50毫摩爾Tris-HCl，
1毫摩爾EDTA，
調(diào)整至pH8.2，
緩沖液B，pH8.2，
在緩沖液A中加入
8克分子尿素，
1毫摩爾雙-(2-羥乙基)-二硫化物，
1毫摩爾2-巰基乙醇，
緩沖液C，pH8.2，
在緩沖液A中加入
1毫摩爾雙-(2-羥乙基)-二硫化物，
1毫摩爾2-巰基乙醇，
緩沖液D，pH8.2，
在緩沖液A中加入0.6摩爾氯化鈉。
2.Glu-52-抑肽酶的分離和復(fù)性作用
大約300毫克凍干Lys-15-Glu-52-抑肽酶β-半乳糖苷酶溴化氰片段溶于300毫升含300毫克DTT的緩沖液B。該溶液在氮氣氛及50℃下還原1小時，然后加到CM-Sephadex層析柱(25×100毫米)，注入約15毫升CM-Sepharose Fast FlowR。該柱用緩沖液B平衡、洗滌，直至基準(zhǔn)穩(wěn)定為止。在第一級線性梯度洗脫中，該柱子用100毫升緩沖液B和100毫升緩沖液C展開施加第二級線性洗脫梯度之前，用緩沖液A洗滌該柱，直至基準(zhǔn)穩(wěn)定為止。用100毫升緩沖液A和100毫升緩沖液D形成第二級梯度。試驗的峰值部分用于胰蛋白酶抑制活性并通過ELISA和西部斑跡(Western blot)(見圖10)。在一系列實驗中，通過不同試驗估算的產(chǎn)量是0.4～2毫克。
3.用反相高壓液相色譜法純化Glu-52-抑肽酶
用蒸發(fā)濃縮活性部分，然后滲析18小時，阻止0.1克分子NH HCO pH＝7.5。凍干后，抑制因子溶于0.1%TFA，并在大孔RP-18柱(BIORAD)用含0.1%TFA的緩沖液A和0.1%TFA的緩沖液B反相色譜法分級。該抑制因子的特征在于氨基末端順序和氨基酸分析。
實施例6
Val-15-Glu-52-抑肽酶的表達(dá)及該產(chǎn)品的特征
按實施例5所要求的相同方法完成含有質(zhì)粒pRK49.2.1的E.Coli轉(zhuǎn)化株發(fā)酵，以及Val-15-Glu-52-抑肽酶的純化，其差別在于通過彈性蛋白酶抑制因子測定而不是胰蛋白酶試驗活性。Val-15-Glu-52-抑肽酶比Glu-52-抑肽酶從CM-Sephadex柱洗脫為早。
在一系列實驗中，由不同試驗計算的產(chǎn)量是0.1～1毫克。
相同的HPLc純化法應(yīng)用于Val-15-Glu-52-抑肽酶的分離。由測定白細(xì)胞彈性蛋白酶的抑制確定抑制活性。該抑制因子的特征在于氨基末端順序和氨基酸分析。
實施例7
Arg-15-Glu-52-抑肽酶的構(gòu)建、表達(dá)和特征
為了構(gòu)建Arg-15-Glu-52-抑肽酶基因，我們變換B組(圖1)。這是ApaI-StnⅠDNA片段，屬Val-15-Glu-52-抑制酶基因，克隆在質(zhì)粒pRK54.1.1。
用密碼子CGT為精氨酸在氨基酸15位處編碼的相應(yīng)片段替換這個片段，得到的重組體載體稱為pNH01.1.1，部分順序化并用作進(jìn)一步實驗。
在Arg-15-Glu-52-抑肽酶基因的5′端，加入BamHⅠ部位，分離基因連接入切開的表達(dá)載體pUK278的BamHⅠ-HindⅢ。
這種DNA用于轉(zhuǎn)化E.Coli RRl δM15和選擇含新的表達(dá)質(zhì)粒pRK112.1.1的轉(zhuǎn)化株。從這種轉(zhuǎn)化株，分離β-半乳糖苷酶Arg-15-Glu-52-抑肽酶融合蛋白質(zhì)，如上述溴化氰分裂后，純化Arg-15-Glu-52-抑肽酶。
出于意料的是動力學(xué)研究表明重組體Arg-15-Glu-52-抑肽酶是非常有效的人血漿激肽釋放酶(Ki＝3.2×10-10(M))的抑制因子，帶有Ki值小于10-11(M)的陽離子和陰離子人胰蛋白酶。該Ki值由M.W.Empie和M.Laskowski的方法確定，見《生物化學(xué)》21卷，2274頁(1982年)。
權(quán)利要求
1、微生物方法制造的抑肽酶和抑肽酶同系物。
2、微生物方法制造的在15位上被天然存在的除蛋氨酸外可任意選擇的氨基酸取代的抑肽酶。
3、微生物方法制造的抑肽酶和Arg-15-，Val-15-，Ile-15-，Leu-15-，Phe-15-，Gly-15，Ser-15-，Trp-15-，Tyr-15和Ala-15-抑肽酶。
4、根據(jù)權(quán)利要求
2的微生物方法制造的抑肽酶，其中在52位上可被Glu，Leu，Val，Thr或Ser取代。
5、微生物方法制造的Glu-52-抑肽酶。
6、微生物方法制造的Val-15-Glu-52-抑肽酶。
7、微生物方法制造的Ile-15-Glu-52-抑肽酶。
8、微生物方法制造的Leu-15-Glu-52-抑肽酶。
9、DNA片段適用于構(gòu)建編碼抑肽酶和/或抑肽酶同系物的主導(dǎo)基因。
10、DNA片段選自下列各組，及功能與其相等的組
片段 1 AATTCATGCTCCGGACTTCTGCCTCGAGC
片段 2 CAGAAGTCCGGACGCATG
片段 3 CGCCGTACACTGGGCCCTGCAAAGCT
片段 4 CCCAGTGTACGGCGGTCGAGG
片段 5 CGTATCATCCGTTACTTC
片段 6 ATGATACGAGCTTTGCAGGG
片段 7 TACAATGCAAAGGCAGGCTGTGTCAGACC
片段 8 CCTGCCTTTGCATTGTAGAAGTAACGG
片段 9 TTCGTATACGGCGGTTGCCGTGCTAAGCGT
片段 10 AACCGCCGATACGAAGGTCTGACACAGG
片段 11 AACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCGAA
片段 12 ATTTGAAGTTGTTACGCTTAGCACGGC
片段 13 CGTACTTGCGGTGGTGCTTAGTAAAGCTTG
片段 14 CACCGCAAGTACGTTCGCAGTCTTCCGCGG
片段 16 GATCCAAGCTTTACTAAGCAC
11、DNA的特征在于下列順序及功能與其相等的順序，
DNA基本上包括權(quán)利要求
11的DNA順序，其中Lys-15-密碼子被編碼Val-15，Ile-15-，Leu-15-，Phe-15-，Gly-15-，Ala-15-，Arg-15-，Ser-15-，Trp-15-或Tyr-15-Glu-52-抑肽酶的密碼子取代。
12、DNA基本上包括權(quán)利要求
11的DNA順序，其中Lys-15-密碼子被編碼Val-15，Ile-15-，Leu-15-，Phe-15-，Gly-15-，Ala-15-，Arg-15-，Ser-15-，Trp-15-或Tyr-15-Glu-52-抑肽酶的密碼子取代。
13、根據(jù)權(quán)利要求
11和12的DNA，其中Glu-52-密碼子被編碼Leu，Val，Thr或Ser的密碼子取代。
14、質(zhì)粒pRK63.1.1，pRK54.1.1，pRK49.2.1和pRK48.1.1。
15、表達(dá)質(zhì)粒用于產(chǎn)生權(quán)利要求
1至8的蛋白質(zhì)。
16、表達(dá)質(zhì)粒用于產(chǎn)生權(quán)利要求
5至8選自由pRK48.1.1和pRK49.2.1組成的組的蛋白質(zhì)。
17、用編碼抑肽酶和/或抑肽酶同系物的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
18、用編碼抑肽酶和/或抑肽酶同系物的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的E.coli。
19、用權(quán)利要求
16的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的E.coli。
20、用權(quán)利要求
16的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的E.coli.RRl△M15(ATCC35102號)。
21、一種包括從由重組體DNA技術(shù)得到的β-半乳糖苷酶融合制備抑肽酶及其同系物的抑肽酶和/或抑肽酶同系物的分離方法。
22、一種制備抑肽酶的方法，包括
(a)合成編碼抑肽酶的DNA片段，
(b)連接DNA片段，得到主導(dǎo)基因，
(c)克隆抑肽酶主導(dǎo)基因，
(d)取代主導(dǎo)基因中的DNA片段，
(e)連接在相應(yīng)表達(dá)載體中得到的主導(dǎo)基因，
(f)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，
(g)培養(yǎng)生長宿主細(xì)胞，
(h)從細(xì)胞培養(yǎng)物分離融合蛋白質(zhì)，
(i)切開融合蛋白質(zhì)，
(j)分離抑肽酶或抑肽酶同系物。
23、含微生物方法制造的抑肽酶和/或抑肽酶同系物的藥用組合物。
24、微生物方法制造的抑肽酶及藥用制品中抑肽酶的應(yīng)用。
25、根據(jù)權(quán)利要求
9適于編碼抑肽酶和/或抑肽酶同系物基因構(gòu)建的DNA片段的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及抑肽酶同系物、及其核酸編碼、結(jié)合核酸和其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體，以及獲得抑肽酶同系物的方法。
文檔編號A61K38/55GK87102412SQ87102412
公開日1987年10月7日 申請日期1987年3月26日
發(fā)明者厄恩斯特-奧古斯特·奧爾斯沃爾德, 沃納·施羅德, 尤金·施納貝爾, 沃爾夫?qū)げ紓愃? 格爾德·萊因哈特, 邁克爾·科蒂克 申請人:拜爾公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan