專利名稱:促乳腺實(shí)質(zhì)生長的方法與組合物的制作方法
哺乳動(dòng)物的乳汁產(chǎn)量最終受限于乳腺中腺實(shí)質(zhì)(分泌組織)的數(shù)量。比較乳汁產(chǎn)量與乳腺實(shí)質(zhì)的濕重、干重、去脂肪干重及全部的DNA含量，發(fā)現(xiàn)其間具有高相關(guān)性。Davis等人將遺傳良種動(dòng)物乳汁產(chǎn)量增加完全歸功于其乳腺體積增大，后者又與腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。見Proc.N.Z.Soc.Anim.Prod.43∶71，1983。
經(jīng)典證據(jù)指出，乳腺實(shí)質(zhì)生長受垂體、卵巢、腎上腺和胎盤分泌因子的調(diào)節(jié)。參見Cowie 1980年在內(nèi)分泌方面的十五篇專題文章和Bauman及Sejrsen 1985年6月6日申請(qǐng)的美國專利4521409，現(xiàn)已公布從青春期開始到第一次分娩(多半是第一次妊娠)期間將生長激素(Somatotropin)注到反芻動(dòng)物血流中，其乳腺實(shí)質(zhì)生長增進(jìn)。
如果將藥投放到動(dòng)物血流中，大多數(shù)的乳腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞促有絲分裂因子會(huì)結(jié)合到動(dòng)物的許多其他組織的受體上。由于這種有效的預(yù)期刺激乳腺生長受體作用的減弱，若通過血循給藥以增加乳腺實(shí)質(zhì)，勢必需要給予極大量的促有絲分裂因子。因而，發(fā)展一種切實(shí)可行的不依靠血流給藥的技術(shù)來增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的泌乳能力和/或效率顯得格外必要。
利用生理上異常的兔、小鼠及大鼠，即它們是去卵巢的及/或進(jìn)行預(yù)處理(利用一種生殖激素)，誘發(fā)假孕并通過皮下注射生長激素和/或其他激素，植入釋放霍亂毒素的移植物，或管內(nèi)注射“生乳激素”，對(duì)乳腺發(fā)育的作用進(jìn)行了研究。參見Lyons等人《實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)紀(jì)事》1942，50∶308-311;《激素研究現(xiàn)代進(jìn)展》1958，14∶219-254;Fiddler等人;《內(nèi)分泌學(xué)雜志》1971，49∶459-469;Daniel等人;《科學(xué)》1984，224∶1245-47;Silberstein等人《美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》1984，81∶4950-54。另一些學(xué)者研究了促有絲分裂因子如表皮生長因子，在有或無胰島素存在下對(duì)各種動(dòng)物體外培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞的作用。見Lmagawa等人《美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》1982，79∶4074-77;Taketani等人《內(nèi)分泌學(xué)》1983，113(3)∶871，《美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》1983，80∶2647-50;Tonelli等人《自然》1980，285∶250-52;Turkington《實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)研究》1969，57∶79-85。本段所引的公開內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)列出。
本項(xiàng)發(fā)明具有如下目的1，提供一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物乳腺實(shí)質(zhì)生長的方法、2，該方法對(duì)生理上正常哺乳動(dòng)物產(chǎn)生良好效果;3，對(duì)有效增加哺乳動(dòng)物乳腺實(shí)質(zhì)具有高度特異性;4.需要微量或接近微量的促乳腺實(shí)質(zhì)生長的藥物;5.便于實(shí)施;6.對(duì)動(dòng)物受處理乳腺提供可預(yù)期的效果一致的作用;7.對(duì)動(dòng)物具有極小的生物學(xué)付作用;8，本方法中適用的各種簡便和易于銷售的組合物及制備這類組合物的方法，本項(xiàng)發(fā)明的這些及另外一些目的將在下面詳述中得到闡明。
我們發(fā)現(xiàn)通過乳腺內(nèi)輸注一種對(duì)某種哺乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞具有促有絲分裂作用的物質(zhì)可實(shí)現(xiàn)上述目的。這種方法不需要經(jīng)血流給藥、皮下注射或移植，而是應(yīng)用一種簡便的給藥技術(shù)來有效增進(jìn)正常腺實(shí)質(zhì)生長，在大多數(shù)奶牛和其他哺乳動(dòng)物中，該法在輸注抗菌素相當(dāng)常規(guī)使用。該技術(shù)僅需使用很小劑量的藥物，在短時(shí)間內(nèi)就可使動(dòng)物的乳腺實(shí)質(zhì)比正常對(duì)照增加許多。
該項(xiàng)發(fā)明適用于任何希望增進(jìn)乳腺實(shí)質(zhì)生長的哺乳動(dòng)物，尤其適用于反芻動(dòng)物，包括牛，如各種奶牛、肉牛和牧牛，奶牛和肉牛的小母牛，此法適用于乳牛各種品種，如荷斯坦-弗里斯黑白花牛Hol-stein、Friesien，瑞士褐牛Brownswiss，澤西牛Jersey，格懸西奶牛Guernsey，愛爾夏牛Ayrshire，奶用短角牛Milking Shorthorn，以及它們的雜種牛;此法也適用于各類肉牛，如海福特牛Heveford，安格斯牛Angus，瘤牛Zebu，卡洛萊牛Charolais，白侖格斯牛Brangus，西門塔爾牛Simmental，契安尼娜牛Chianina，荷蘭黑白花牛Dutch Belteel，利莫辛牛Limcusin及其雜交品種，它也適用于其他反芻動(dòng)物，如所有種類綿羊和山羊，各種非反芻動(dòng)物，如各類豬。此項(xiàng)發(fā)明最突出的實(shí)際應(yīng)用是被用于處理生理上正常的哺乳動(dòng)物，此處生理正常是指未做卵巢切除術(shù)和未經(jīng)生殖激素，如雌激素、促性腺激素之類的預(yù)處理誘導(dǎo)假妊娠或青春期的。
文中所用“乳腺實(shí)質(zhì)”一詞指乳腺中生產(chǎn)乳汁的組織(包括通常所說的“乳腺上皮細(xì)胞”)，它是在乳腺泌乳中起作用的組織。通常在雌性哺乳動(dòng)物中乳腺生長，出現(xiàn)在青春期伊始。大量的乳腺生長則常開始于第一次妊娠期(例如小母牛)，此后的妊娠期腺實(shí)質(zhì)進(jìn)一步生長或再增長。
為加速上述生長，此項(xiàng)發(fā)明在于哺乳動(dòng)物物青春期開始(包括臨近青春期階段)到第一次妊娠或第一次妊娠到其他各次妊娠期間給動(dòng)物有促有絲分裂作用理想的藥物。通常在“干”期即非泌乳期給藥，奶牛和其他相近哺乳動(dòng)物在分娩前三個(gè)月給藥最佳。
此項(xiàng)發(fā)明的簡便而有效的給藥技術(shù)是通常所說的乳腺內(nèi)輸注。在哺乳動(dòng)物如牛中，此技術(shù)常規(guī)用于注入含抗菌素的軟膏或其他制劑以防止或控制乳腺炎。具有促有絲分裂作用的物質(zhì)可以用類似的方法給藥，或更簡便些，將該物質(zhì)(有或無其他乳腺生長刺激劑)混入任何一種用于防止或控制乳腺炎或?yàn)檫_(dá)其他目的使用的制劑中一同輸注。
該技術(shù)是用一鈍頭注射器將具有有絲分裂作用的物質(zhì)沿乳口頭和乳腺管注入乳頭池。該物質(zhì)存積在乳頭池，并以此擴(kuò)散到整個(gè)乳頭池、乳腺池及乳腺的管道系統(tǒng)。這一眾所周知的技術(shù)在《獸醫(yī)實(shí)用藥物》，Spinelli等人1978年，PP80-83及1977年3月8日發(fā)布的Reuter等人的美國專利4011312中有論述。就這項(xiàng)發(fā)明而言，將一種物質(zhì)積聚在乳頭池進(jìn)而導(dǎo)致其沿管系統(tǒng)擴(kuò)散到乳腺組織，并在那里發(fā)揮增進(jìn)乳腺實(shí)質(zhì)生長作用的其他方法，在廣義上應(yīng)與乳腺內(nèi)輸注等義。
就本項(xiàng)應(yīng)用的目的而言，“直接”和“類分泌”(Pana-Cvi-ne)的促有絲分裂作用，這即指被輸注物質(zhì)不需要和在多數(shù)情況下也不會(huì)發(fā)生進(jìn)入動(dòng)物血流并達(dá)一定濃度后，通過內(nèi)分泌調(diào)節(jié)來發(fā)揮增加乳腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的作用。有關(guān)乳腺生長的類分泌調(diào)節(jié)請(qǐng)參見Oba等人《臨床內(nèi)分泌與代謝》1986，15(1)78-87。
此項(xiàng)發(fā)明可以使用任何一種對(duì)受處理哺乳動(dòng)物的乳腺實(shí)質(zhì)有明顯的直接或類分泌促有絲分裂作用的物質(zhì)。最重要的途徑是用一種主要通過直接作用于腺實(shí)質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)而增加正常的細(xì)胞增殖速率的藥物。另一種途徑是這類物質(zhì)直接作用于乳腺中的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，使這些細(xì)胞通過類分泌作用，即在局部使直接灌注藥的乳腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂因子數(shù)量增加。
在某些情況下，如在下面的例子中將會(huì)提到的，乳腺內(nèi)輸注這類物質(zhì)引起輸注部位附近的乳腺顯著增長，但動(dòng)物血中該物質(zhì)的濃度沒有明顯升高。然而，只是在動(dòng)物的一定生理階段乳腺中才存在足夠的直接或類分泌作用的物質(zhì)的受體，例如妊娠期中乳腺比未妊娠時(shí)具有更多數(shù)量的生長激素結(jié)合受體。參見Sean-Francois Beckers的《牛胎盤及體催乳激素》第五章，1983;Gertler等人“牛泌乳乳腺的酪旦白合成與器官培養(yǎng)的激素調(diào)節(jié)”，《乳制品研究雜志》1982，49387;Akers“反芻動(dòng)物的生乳激素結(jié)合部位點(diǎn)、乳腺生長，泌乳細(xì)胞分化和乳汁的生物合成”，《乳制品學(xué)雜志》，1985，68501。
多數(shù)情況下，本技術(shù)所用的具有致有絲分裂作用的物質(zhì)是多肽類生長因子。此發(fā)明所選用的某些生長因子分子量低于45000，另一些更常用的分子量低于22500，而那些具有前述直接促有絲分裂作用的生長因子，其分子量多半低于10000。有時(shí)可用非多肽類物質(zhì)，如卵巢和胎盤的類固醇類激素及其激動(dòng)劑。上述兩種情況，所用物質(zhì)可以是自然存在的或人工合成的，能刺激自然存在因子的產(chǎn)生，或人工合成的可提供一種不同于任何天然化合物但具有促有絲分裂作用的合成物。
一種常被選用的多肽類生長因子是表皮生長因子(EGF)。通常這些因子與乳腺上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，刺激上皮細(xì)胞增殖。對(duì)各種哺乳動(dòng)物的EGF已經(jīng)進(jìn)行了序列分析，確定了其氨基酸排列順序及由半胱氨酸殘基借二硫鍵形成的鏈同連接決定的空間構(gòu)型。其中一種EGF是已被完全定性的53個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，它可以從成年雄性小鼠的頜下腺和唾液腺中分離得到。另一種EGF，即人尿抑胃素，合成于十二指腸及唾液腺，可以從尿中分離到。尿抑胃素與小鼠EGF具有70%的同源性(53個(gè)氨基酸殘基中有37個(gè)相同)有三個(gè)二硫鍵在相同的位置上。現(xiàn)有資料揭示人尿抑胃素與人EGF同屬一物。有關(guān)EGF'S的更多資料請(qǐng)參見《生物化學(xué)年鑒》1979年48卷193-216頁，Carperter等人的文章“上皮生長因子”和《自然》1975年257卷325-27頁Gregory的文章。
眾所周知，致有絲分裂活性不需要人或小鼠EGF的全部氨基酸序列。例如1975年11月4日發(fā)布的Gamble等人的美國專利3917824揭示在羧基末端切去2，5或6個(gè)的分子變異體1;1977年7月12日發(fā)布的Gregory等人的美國專利4035485證明可切去7個(gè)氨基酸的分子變異物;1976年4月6日發(fā)布的Cohen的美國專利3948875公開一缺乏C末端亮氨酸-精氨酸殘基的EGF衍生物;Banks等人發(fā)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸不同或其位置有異的尿抑胃素的同類物，見PCT專利申請(qǐng)WO83/04030;Komoriya等人則發(fā)現(xiàn)與天然EGF的Cys20-Cys31之間的氨基酸順序一致的10個(gè)氨基酸多肽具有EGF樣活性，見PCT專利申請(qǐng)WO85/01284。就此而言，上述這些或類似的EGF變異分子，它們的同物，或其他能在乳腺輸注后與乳腺內(nèi)EGF(或功能上相似)的受體結(jié)合并發(fā)揮促腺實(shí)質(zhì)生長的化合物，能滿足此發(fā)明的目的，就此項(xiàng)發(fā)明的目的而言，均屬EGF′S的等同物。
同前已知有幾種制備EGF的方法。例如Nippon Shinyakn發(fā)現(xiàn)縮合被保護(hù)的1-5個(gè)氨基酸肽鏈而形成一個(gè)被保護(hù)的tripentacontapeptide肽，后者再經(jīng)氧化，去保護(hù)基即產(chǎn)生一個(gè)EGF分子，見日本專利申請(qǐng)，59/029858;1984年12月19日發(fā)布的歐洲專利申請(qǐng)，128733和1985年1月31日發(fā)布的專利申請(qǐng)，WO85/00369證明通過重組DNA的表達(dá)生產(chǎn)EGF;Sugimoto發(fā)明通過雜交瘤細(xì)胞增殖生產(chǎn)EGF，見英國專利2092155;而Nishimura等人則是從人尿中回收EGF，見1985年7月9日發(fā)布的美國專利4528186。以上公開亦作為參考文獻(xiàn)列出。
另一種較好實(shí)施方案從胎兒EGF中選擇生長因子，如α型轉(zhuǎn)化的生長因子;見Sgorn等人的歐洲專利申請(qǐng)105014和Todaro等人的專利1900180(此公開亦為參考文獻(xiàn))。通常這些因子與乳腺中的受體結(jié)合產(chǎn)生預(yù)期的促有絲分裂作用。此技術(shù)所用的另一類多肽則定為病毒旦白類似物，見Brown等人的歐洲專利申請(qǐng)，199769，它是基于Wo86/02650。
還有一種實(shí)施方案是選用胰島素族的多肽，它的類似物，或其他可與乳腺上的胰島素樣(insulin-like)生長因子(IGF)或功能上相近的受體結(jié)合發(fā)揮促乳腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞有絲分裂作用的物質(zhì)。常用的IGF為IGF-1(促生長素“Somatomedin”)或IGF-Ⅱ。用胰島素或其前體物(如前胰島素)也能產(chǎn)生類似的效果，但用量遠(yuǎn)比IGF大。
有關(guān)胰島素族生長因子的特性及其生產(chǎn)方法方面的資料很多。如1984年10月31日發(fā)布的歐洲專利申請(qǐng)，128733(Supra)和123288(Chlion Crop)描述了人IGF-Ⅰ和Ⅱ的氨基酸順序及其用在微生物宿主中的重組DNA的表達(dá)技術(shù)來生產(chǎn)。在59位是纈氨酸的IGF-Ⅰ類似物，在1985年10月23日發(fā)布的歐洲專利申請(qǐng)158892中亦有介紹。更多的有關(guān)IGF′S的資料參見Rinder-knecht等人，《美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》1976，732365，Zapf等人《細(xì)胞調(diào)節(jié)現(xiàn)代論題》1981，19257;Wilson等人《內(nèi)分泌學(xué)雜志》1982，9559-64。胰島素及前胰島素的制備在《科學(xué)》1983，219632-37和1982.7.14發(fā)表的歐洲專利申請(qǐng)，55945(Genentech)中有論述。在本節(jié)中所引用的公開亦列在參考文獻(xiàn)中。
通過靜脈輸液可產(chǎn)生類分泌促有絲分裂作用的物質(zhì)有胎盤催乳素、一些垂體前葉激素和另一些具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)可發(fā)揮基本相同的促有絲分裂作用的多肽。一般來講，除催乳激素外垂體前葉激素(如生長激素)常被選用。
本發(fā)明用很少劑量的促有絲分裂物質(zhì)，說明使用這類制劑效力極高。在一些例子中輸注一個(gè)乳腺的單位劑量只需不到2微克，有時(shí)少于此量仍有效果，一次最高劑量可用到100毫克或更多而不影響預(yù)期效果。但為經(jīng)濟(jì)起見，通常選用很小劑量(小于100微克)。在被輸注化合物中有促有絲分裂因子的濃度以5-500毫微克/毫升為好，盡管更高或更低的濃度在某些情況下也可能使用。
最佳劑量、濃度、給藥頻度和給藥次數(shù)可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。多數(shù)情況下連續(xù)1-5次輸注效果最好，間隔可以是1-10天(多用2-5天)。短期內(nèi)即可使乳腺有實(shí)質(zhì)性顯著增長并獲得可觀的經(jīng)濟(jì)效益。理想的總劑量，即一個(gè)哺乳動(dòng)物在妊娠期或妊娠前的青春期連續(xù)輸注的總劑量，一般不少于10微克，不高于500毫克，通常選用不少于1毫克的促有絲分裂因子。
盡管此技術(shù)可用一種促有絲分裂因子，有時(shí)幾種因子混合使用更為有利。多數(shù)情況下，輸注與所處理動(dòng)物種屬的天然物質(zhì)很接近的促有絲分裂因子較為理想，如用牛EGF、IGF和/或生長激素處理牛。當(dāng)然與其他種屬動(dòng)物的天然物質(zhì)相似物也可使用。
本發(fā)明的方法一般使用一種組合物來實(shí)行，該組合物需適于通過乳腺內(nèi)輸注給藥，能在乳腺中積存一定數(shù)量從而有效促進(jìn)腺實(shí)質(zhì)生長，同時(shí)還含有一種對(duì)被投藥動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞具有促有絲分裂作用的物質(zhì)。該組合物必須是動(dòng)物生理上能夠耐受，無刺激作用，不含內(nèi)毒素。如果需要，例如為了在乳頭池中延長釋放，致有絲分裂物質(zhì)可以以固態(tài)形式輸注，后者可分解成或擠壓成有利作用的形狀和大小。在另一些情況下，需要用一種載體，該載體在哺乳動(dòng)物的體溫下顯液態(tài)。最好在環(huán)境溫度下輸注，不管所輸注的藥物是固態(tài)還是液態(tài)，其中最好含有載體，因后者可有助于促有絲分裂物質(zhì)在乳腺中擴(kuò)散。在有些但不是所有情況下，載體最好是水溶性的。
載體的理想型號(hào)和劑量可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。簡言之，1-10毫升pH在正常生理值范圍的液態(tài)載體如生理鹽水，福氏不完全佐劑，或植物(如花生或芝麻)油或礦物油通常地比較理想。最好進(jìn)行兩種或更多的這類載體的乳化。如果需要，適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如單或/和雙糖，乙醇或中性氨基酸也可加入。
本發(fā)明還提供制備促進(jìn)哺乳動(dòng)物乳腺實(shí)質(zhì)生長的組合物的方法。一般來講，該方法包括將對(duì)乳腺上皮細(xì)胞具有促有絲分裂作用的物質(zhì)與可促進(jìn)該物質(zhì)在動(dòng)物乳腺中擴(kuò)散的載體混合，該組合物用所述方法混合后通過乳腺內(nèi)注射給藥。
下面只舉例說明本發(fā)明的具體實(shí)施例，但不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)例中的動(dòng)物均是生理上正常的，所有溫度均采用攝氏度。除特別說明外，各成分和比例以重量為單位。
A表皮生長因子實(shí)例1-2將12頭懷孕，非泌乳的雜種小母牛在懷孕的最后40至80天安置在一個(gè)無分隔欄的室內(nèi)，定量喂給苜蓿干草和濃縮飼料，并在研究的第1、3、5、7、9天通過管道向乳房的1/4象限內(nèi)灌注10毫升賦形劑(乳化的不完全弗氏佐劑與等量生理鹽水)。灌注使用一根從愛琴島公司Jorgen實(shí)驗(yàn)室得到的長為3.2厘米，標(biāo)準(zhǔn)口徑為12的鈍頭式塑料乳頭插管，因?yàn)榕Ｈ榉康那昂髢刹坎坏却?，所以?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的比較只能在側(cè)面對(duì)應(yīng)的1/4象限內(nèi)進(jìn)行，即右前對(duì)左前，右后對(duì)左后，每半乳房的2個(gè)1/4象限則可任意作為實(shí)驗(yàn)和對(duì)照用。實(shí)驗(yàn)灌注組，賦形劑中含有25微克人表皮生長因子(hEGF)或鼠表皮生長因子(mEGF)，它們分別由G.D Searle有限公司V.K和Lexington.MA協(xié)作研究組提供(各6只動(dòng)物)。hEGF是由Searle用重組DNA表達(dá)，經(jīng)10000MW濾器純化。經(jīng)過高壓液相色譜(Hplc)檢測純度達(dá)90%。mEGF為培養(yǎng)純，檢索號(hào)40001，它用Sovage等人的方法從小鼠頜下腺制得，在SDS聚丙酰胺凝膠上測定純度為98%。
實(shí)驗(yàn)開始前，每頭動(dòng)物連續(xù)浸洗乳頭三天，并在實(shí)驗(yàn)對(duì)先用70%乙醇處理每個(gè)乳頭。第14天，將牛處死，取出乳腺，將每個(gè)乳房去皮，(如有必要，將乳汁擠出)，并沿中央懸韌帶將其分成右前，左前，右后，左后4個(gè)部分，將每1/4乳房磨碎，并以每200克樣本體積為準(zhǔn)，加4倍體積水后勻漿，然后再測量每個(gè)部分勻漿的總體積。
要檢測每1/4乳房的干重，按1∶5稀釋勻漿，10毫升一份，共五份，將其放在一個(gè)預(yù)先稱好的容器內(nèi)，60℃過夜蒸干，然后干燥使稱量達(dá)一恒值。
為確定每個(gè)1/4乳房的脫脂組織的重量，可取3份5毫升稀釋勻漿按Anderson法進(jìn)行提取，J.Anim.Sci 41∶118(975)。不同的是將樣本也放到一個(gè)預(yù)先稱重的25×150毫米的玻璃離心管內(nèi)，用10毫升乙醇∶乙醚(3∶1)提取過夜，然后離心(在500rpm下，5分鐘)，吸出上清液，再加另一份10毫升乙醇∶乙醚進(jìn)行第2次提取，然后將樣本在液氮中干燥，直到得到一個(gè)固定的重量。
每個(gè)1/4乳房DNA的重量可用Burton法來檢測。(Methods in Enzymol.12B，163-66，1968)，溶于2N Hcl中的15%三氯醋酸為檢測液。將一部分勻漿用水稀釋成1∶5，再次勻漿。再將它按0.25毫升或0.5毫升分成一式三份，每份與2毫升檢測液混合，30分鐘后，將樣本離心10分鐘，3000rpm，再用2毫升溶于蒸餾水中的10%TCA溶液沖洗沉淀。再次離心后，所形成的沉淀在含0.5N高氯酸2毫升中混勻，70℃加熱30分鐘提取DNA。離心樣本，將所形成的上清1毫升吸入一個(gè)12×75毫米管中，將2毫升含1.5克2苯胺溶液和1.5毫升H2SO4加于100毫升冰醋酸所組成的溶液后(使用前每20毫升試劑再加0.1毫升的0.6%的乙醛水溶液)加入混勻，27℃過夜孵育。胸腺DNA作為標(biāo)準(zhǔn)DNA。結(jié)果列表于1至2
表1，懷孕母牛1/4乳房內(nèi)灌注hEGF的效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 389.9 120.0 63.2 794.5B 對(duì)照組均值 357.3 111.4 58.3 710C 增加均值 32.6 8.6 4.9 84.5D 增長百分比9.1 7.7 8.4 11.9(A-B)/BE 平均增長百12.9 13.1 16.1 14.8分比/動(dòng)物F 百分比增長水平的顯著 0.01 0.09 0.16 0.06性P＜表2.懷孕母牛1/4乳房灌注mEGF效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 脫脂組織干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 419.6 150.2 69.6 905.1B 對(duì)照組均值 402.0 147.9 64.6 794.9C 增長均值17.6 2.3 5.0 110.2(A-B)D 增長百分比4.4 1.6 7.9 13.8(A-B)/BE 平均增長百1.8 2.1 5.2 12.0分比/動(dòng)物F 百分比增長水平的顯著 0.22 0.40 0.19 0.05性p＜如表1、2所示，用hEGF或mEGF灌注的部分的重量和DNA含量始終大于僅灌注賦形劑的部分，總體上來說，有很高的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
例3-6將24頭懷孕、非泌乳的雜種母牛，以每6頭一組分為4組，確定這些動(dòng)物乳腺灌注hEGF的效應(yīng)大至與例1相同。區(qū)別有以下如點(diǎn)(A)，賦形劑1.組給弗氏乳劑，而2、3、4組則給由60份麻油和40份含0.5%吐溫-20(Tween-20)的生理鹽水制成的乳劑。(B)，hEGF劑量每次試驗(yàn)灌注1、2組為25微克，3組給2.5微克，4組給250微克;DNA確定的方法基本與例1-2相同，只是最初的一式三份0.5毫升的勻漿用2毫升乙醇∶乙醚(3∶1)提取1小時(shí)，3000rpm離心15分鐘，再加2毫升70%乙醇作用10分鐘，按3000rpm，離心15分鐘，并在與TCA溶液混合前棄乙醇。1-4組的結(jié)果列表于3-6。
表3，懷孕母牛(第1組)1/4乳房灌注含有總量125微克hEGF弗氏佐劑的效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 364.9 107.2 60.3 723.0B 對(duì)照組均值 349.5 101.0 56.8 629.0C 增長均值15.4 6.2 3.5 94.0(A-B)D 增長百分比4.4 6.1 6.2 14.9(A-B)/BE 平均增長百8.1 10.3 8.3 23.0分比/動(dòng)物F 百分比增長水0.15 0.11 0.13 0.18平的顯著性P＜
表4懷孕母牛(第2組)1/4乳房內(nèi)灌注含有總量125微克hEGF麻油乳劑的效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 370.2 122.1 71.0 995.0B 對(duì)照組均值 356.2 111.1 68.8 703.0C 增長均值14.0 11.0 2.2 292.0(A-B)D 增長百分比均值3.9 9.9 3.2 41.5值(A-B)/BE 平均增長百10.4 20.2 15.9 70.0分比/動(dòng)物F 百分比增長水平的顯著 0.2 0.02 0.3 0.09性P＜表5懷孕母牛(第3組)1/4乳腺內(nèi)灌注含有總量12.5微克hEGF麻油乳劑的效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 397.8 132.4 79.4 867.6B 對(duì)照組均值 400.0 127.0 72.7 896.6C 增長均值(2.2) 5.4 6.7 (29.0)(A-B)D 增長百分比(0.5) 4.2 9.2 (3.3)(A-B)/BE 平均增長百0.6 7.8 16.3 (2.2)分比/動(dòng)物F 百分比增長水平的顯著 - 0.17 0.1 -性P＜
表6懷孕母牛(第4組)1/4乳房內(nèi)灌注含有總量為1.25毫克hEGF麻油乳劑的效果觀察濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 391.9 131.5 81.7 733.2B 對(duì)照組均值 360.2 117.9 75.1 729.2C 增長均值 31.7 13.6 6.6 4.0(A-B)D 增長百分比8.8 11.6 8.8 0.5(A-B)/BE 平均增長百9.9 12.2 11.9 1.6分比/動(dòng)物F 百分比增長0.001 0.004 0.03 -顯著性P＜如表3-6所示，由hEGF灌注1/4乳房的重量和DNA含量大大超過灌注賦形劑的對(duì)側(cè)1/4乳腺。
例7-8將24頭懷孕、非泌乳的雜交小牛按每8頭一組任意分成3組，這些動(dòng)物用乳腺內(nèi)灌注hEGF對(duì)1/4乳腺的效應(yīng)測定，基本同例1-2。所不同之處在于hEGF每次劑量一組為25微克，二組為250微克，三組為2.5微克，腺體重量和DNA含量的測定同例1-2。使用低劑量的第三組由于一些腺體腫脹結(jié)果混淆。第1、2組的結(jié)果分別列表于7-8。
表7懷孕母牛(第一組)1/4乳房內(nèi)灌注總量為125微克hEGF的效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 去脂后干重(克) DNB(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 363.0 113.0 52.8 396.9B 對(duì)照組均值 358.0 109.7 50.7 358.9C 增長均值5.0 3.3 2.1 38.0(A-B)D 增長百分比1.5 3.0 4.1 10.6(A-B)/BE 百分比增長0.34 0.21 0.16 0.12的顯著性P＜表8懷孕母牛(第二組)1/4乳房內(nèi)灌注總量為1.25毫克hEGF的效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 去脂后干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 392.5 122.0 63.8 344.0B 對(duì)照組均值 388.2 115.7 61.4 384.0(A-B)C 增長均值4.3 6.3 2.4 (40.0)(A-B)D 增長百分比1.1 5.3 3.9 (10.4)(A-B)/BE 百分比增長0.4 0.12 0.26 -的顯著性P＜如表7-8所示，用hEGF灌注的1/4乳腺的重量要比只灌注賦形劑的對(duì)應(yīng)象限的重量重。
B.胰島素樣生長因子例9-11將24頭懷孕、未泌乳的雜種小母牛在懷孕的最后40-80天安置在一個(gè)無分隔欄的室內(nèi)，喂予定量的苜蓿干草和濃縮飼料，在研究的第1、3、5、7、9天通過管道內(nèi)乳腺每1/4乳腺內(nèi)灌注10毫升的賦形劑，(在例4-6中使用的麻油乳劑)，此灌注實(shí)驗(yàn)像例1-2一樣隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)與對(duì)照作比較。在實(shí)驗(yàn)組，賦形劑中含有牛胰島素樣生長因子-Ⅰ(bIGF-Ⅰ)，此種因子在大腸桿菌(Prla種079)中段與“Lam”B細(xì)胞壁旦白質(zhì)單鏈相連的編碼bIGF-Ⅰ的重組DNA表達(dá)而成，它可被分泌至大腸桿菌胞漿，再通過凝膠過濾，陽離子交換以及反相HPLC等常規(guī)技術(shù)來獲取、純化。這種bIGF-Ⅰ在例13所使用的AMgen人IGF-Ⅰ有相同的氨基酸順序和二級(jí)結(jié)構(gòu)。在標(biāo)準(zhǔn)成肌細(xì)胞檢測中，它的活性基本上與例13中hEGF-Ⅰ的活性一樣(90%-123%)bIGF-Ⅰ的每次灌注量為1組2.5微克，2組25微克，3組250微克。動(dòng)物準(zhǔn)備好后，就進(jìn)行灌注，它們1/4乳腺的重量和DNA含量如例3-6一樣來確定。第一組的結(jié)果見表9。
表9懷孕母牛(第一組)1/4乳房灌注總量12.5微克bIGF-Ⅰ的效應(yīng)觀察(組Ⅰ)濕重(克) 干重(克) 去脂后干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 408.4 111.7 54.9 1307B 對(duì)照組均值 369.0 102.7 48.0 1219C 增長均值39.4 9.0 6.9 88(A-B)
表9(續(xù))濕重(克) 干重(克) 去脂后干重(克) DNA(微克)D 增長百分比10.7 8.7 14.2 7.2(A-B)/BE 平均增長百11.0 8.8 16.0 12.5分比/動(dòng)物F 百分比增長0.01 0.003 0.03 0.2的顯著性P＜此研究中，兩個(gè)較高劑量的bIGF-Ⅰ(2-3組)沒有見到實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組有恒定的明顯生長，然而非灌注象限則觀察到了較明顯的生長，當(dāng)重復(fù)組1-3的實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果基本上相同。概括最初實(shí)驗(yàn)和重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果。得出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有如下生長趨勢表10劑量 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 綜合中劑量對(duì)低劑量 +27%，p＜0.08 +23.1%，p＜0.12 +25%高劑量對(duì)中劑量+34.4%，p＜0.08 +31.5%，p＜0.09 +33%高劑量對(duì)低劑量+71.3%，p＜0.007 +62%，p＜0.01% +67%上述對(duì)照1/4乳房生長增加甚至在血漿bIGF-Ⅰ水平無明顯增高時(shí)也可發(fā)生。用其它組懷孕未泌乳的母牛重復(fù)上述試驗(yàn)時(shí)，仍可得基本相同的結(jié)果。為了盡量去除實(shí)驗(yàn)中的變化，這些母牛是根據(jù)乳房最初體積基本等大來分組的。
例12當(dāng)奶?；蛭瓷俚男∧概Ｒ约皯言械哪概０蠢?-11的程序灌注125微克至12.5毫克的牛胰島素樣生長因子-Ⅱ，此因子按1986.7.31申報(bào)的美國專利申請(qǐng)888996中例1所述(相應(yīng)于歐洲專利申請(qǐng)86870128.5，此兩個(gè)專利在此引用作參考文獻(xiàn))，純化至不含其他牛的多肽。結(jié)果基本與例9-11相同，實(shí)驗(yàn)組1/4乳房重量及DNA含量均有較大的增長。
C.IGF與EGF的綜合效應(yīng)例13將30只雜交綿羊在它們懷孕的最后35-45天，喂予定量的苜宿干草和羊食，并于研究的第1、3、5、7、9天通過管道灌注2.5ml賦形劑(15只羊用例1-2中相同的弗氏乳劑，另15只羊則只給生理鹽水)至每半邊乳房內(nèi)，灌注采用一根長3.2cm，標(biāo)準(zhǔn)口徑為16的鈍頭Teflon套管，它是從C.R.Bard.Inc得到的，是一種用于安置導(dǎo)管用的插管，每只動(dòng)物的半個(gè)乳房隨機(jī)選作實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組的賦形劑中含有2.5微克在例1-2中使用的鼠EGF和2.5微克的人IGF-Ⅰ，人IGF-Ⅰ是Thousand Oaks CA的AMgen生物公司從重組DNA中表達(dá)后銷售的(檢索號(hào)0411，Lot 407;Hplc檢測純度達(dá)90%)。每支動(dòng)物的另半邊乳房則作為對(duì)照，對(duì)照組只灌入賦形劑，實(shí)驗(yàn)前，每只動(dòng)物應(yīng)連續(xù)浸洗乳頭7天，實(shí)驗(yàn)時(shí)，用70%乙醇清潔每個(gè)乳頭。
第13天處死綿羊，將其乳腺取下，每個(gè)乳房(如有必要擠出乳汁)剝?nèi)テぃ⒀刂醒霊翼g帶分成左、右兩部分？每半邊乳房都加入4倍于它的重量的水后勻漿，然后再測量每部分的總勻漿液的體積。
測定每半邊乳房的干重時(shí)，可將三份10毫升按1∶5稀釋的勻漿液放入一個(gè)預(yù)先稱重的容器內(nèi)，60℃過夜蒸干，然后再干燥和稱重至一個(gè)恒值。
確定每半邊乳房脫脂組織的干重，可將3份5毫升未稀釋的勻漿液用Anderson法提取(J.Anim.Sci.41118.1975)但要將樣本放在預(yù)先稱好的25×150毫米玻璃離心管中，用10毫升乙醇∶乙醚(3∶1)提取過夜，離心(500rpm，5分鐘)棄上清，再加10毫升乙酸∶乙醚液第二次提取，將樣本在氮?dú)庵懈稍镏恋玫揭粋€(gè)恒定的量。
每半邊乳房的DNA量用Burton法測定Biochemistry62315，1956)它采用溶于2NHCl中的15%的三氯醋酸(TCA)作為測定液。在測定中，腺體勻漿液必須解凍融化，用水1∶5稀釋每勻漿。再將此勻漿液按0.5毫升一份分成一式三份，每份加2毫升測定液，30分鐘后，將標(biāo)本離心10分鐘，轉(zhuǎn)速3000rpm，然后用2毫升10%TCA溶液洗滌，再次離心，用2毫升0.5N高氯酸懸浮沉淀，在70°加熱30分鐘提取DNA。離心標(biāo)本，將所得的1毫升上清吸到一個(gè)12×75毫米試管內(nèi)，將2毫升含1.5g二苯胺溶液和1.5毫升H2SO4加至100毫升冰醋酸所形的溶液(使用前，每20毫升試劑內(nèi)加0.1毫升1.6%的乙醛水溶液，每樣本混合搖勻，20℃孵育過夜，小牛胸腺DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品。
結(jié)果列于表11表11懷孕羊半邊乳房內(nèi)灌注mEGF和hIGF-Ⅰ的綜合效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 277.3 73.6 75.2 1021.2B 對(duì)照組均值264.7 66.2 56.4 849.5(只有賦形劑)
表11(續(xù))濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克) DNA(微克)C 增長均值12.5 7.4 18.8 171.7(A-B)D 增長百分比4.7 11.0 33.0 20.2(A-B)/BE 百分比增長0.016 0.03 0.001 0.002的顯著性P＜表11的數(shù)據(jù)表明根據(jù)本發(fā)明，實(shí)驗(yàn)組半邊乳房DNA量，干重、濕重及脫脂后干重均大大高于同一動(dòng)物相應(yīng)的未處理的部分，具有相當(dāng)高的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
例14將8頭未懷孕，未生育過的18個(gè)月令的小牛犢用于檢測乳腺內(nèi)灌注bIGF-Ⅰ和hEGF的聯(lián)合效應(yīng)，其過程依據(jù)例9-11的程序。但有以下不同(A)，賦形劑每次灌注量為2.5毫升。(B)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組灌注含有分別在例9-11和例1-2中使用過的6.25微克的bIGF-Ⅰ和625微升的hEGF，結(jié)果列于表12。
表12Holstein未育母牛1/4乳房灌注hEGF和bIGF-Ⅰ的綜合效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 205.1 93.2 10.7B 對(duì)照組均值 188.2 89.0 9.5(僅有賦形劑)C 增長均值(A-B) 16.9 4.2 1.2D 增長百分比(A-B)/B 8.9 4.7 12.1
表12(續(xù))濕重(克) 干重(克) 脫脂后干重(克)E 平均增長百分比/動(dòng)物 11.3 7.7 18.8F 百分比增長的顯著性p＜ 0.06 0.2 0.09表12中的數(shù)據(jù)表明，根據(jù)本發(fā)明，實(shí)驗(yàn)組的Holstein未育母牛的1/4乳房的濕重、干重、去脂后干重均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)側(cè)相應(yīng)的1/4乳房上給賦形劑的部分，具有很高的統(tǒng)計(jì)學(xué)定義。
例15用上述例9-11的程序來確定對(duì)8頭懷孕、非泌乳雜交小牛妊娠期最后40-80天，乳腺內(nèi)灌注bIGF-Ⅰ和hEGF的綜合效應(yīng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)灌注量為25微克在例1-2中使用的hEGF和250微克在例9-11中使用的bIGF-Ⅰ，結(jié)果見表13。
表13懷孕菜牛1/4乳房內(nèi)灌注bIGF-Ⅰ(總重1.25毫克)和hEGF(總重125微克)的綜合效應(yīng)觀察濕重(克) 干重(克) 去脂干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 496.1 156.4 72.0 1392B 對(duì)照組均值474.0 144.0 60.7 1243(僅有賦形劑)C 增加均值22.1 12.4 11.3 149(A-B)D 增加百分 4.7 8.6 18.7 12.0(A-B)/BE 平均增加百8.2 13.0 11.0 12.0分?jǐn)?shù)/動(dòng)物F 百分?jǐn)?shù)增加的 0.1 0.03 0.08 0.15顯著性p＜
如表13所示，同時(shí)接受bIGF-Ⅰ和hEGF的1/4乳房始終比其對(duì)側(cè)相應(yīng)對(duì)照的1/4乳房重，并含更多的DNA，而且有高水平的統(tǒng)計(jì)意義。
D.生長激素例16-17把24頭懷孕的、非哺乳的雜交母牛在懷孕的最后40-80天分成二組，并檢驗(yàn)乳腺內(nèi)注射的效果，采用例3-6的方法，但不同的是(A)每次注射賦形劑的量是5毫升，(B)每次實(shí)驗(yàn)組注射含1%鋅鹽的N-甲酰蛋氨酸牛生長激素(BST)(1組100毫克;2組40毫克)這種牛生長激素通過重組DNA的表達(dá)而制備，并按照1985年10月16日申報(bào)的美國專利申請(qǐng)787873(根據(jù)歐洲專利177478，1986年4月9日公布)的例1A中所述進(jìn)行純化。此二專利文獻(xiàn)均列入本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。結(jié)果見表14-15。
表14 懷孕牛乳房內(nèi)灌注500毫克BST對(duì)1/4乳房的效果觀察(組1)濕重(克) 干重(克) 去脂干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 790.1 207.6 146.7 2185B 對(duì)照組均值736.6 190.6 141.5 2054(僅賦形劑)C 增加均值(A-B) 53.5 17.0 5.2 131D 增加百分?jǐn)?shù)7.3 8.9 3.6 6.4(A-B)/BE 平均增加百分9.8 10.7 7.9 10.5分?jǐn)?shù)/動(dòng)物F 百分?jǐn)?shù)增加程0.004 0.03 0.18 0.3度的顯著性P＜
表15 懷孕牛乳房內(nèi)灌注200毫克BST對(duì)1/4乳房的效果觀察(組2)濕重(克) 干重(克) 去脂干重(克) DNA(微克)A 實(shí)驗(yàn)組均值 396.9 96.4 49.5 1371B 對(duì)照組均值 345.4 85.1 44.8 1299C 增加均值51.5 11.3 4.7 72(A-B)D 增加百分?jǐn)?shù)14.9 13.3 10.5 5.5(A-B)/BE 平均增加百13.4 10.7 7.8 15.8分?jǐn)?shù)/動(dòng)物F 百分?jǐn)?shù)增加程度的顯著 0.007 0.06 0.06 0.1性p＜表14-15的數(shù)據(jù)表明懷孕牛按本發(fā)明處理后的1/4乳房在DNA、干重、濕重和去脂干重的增加明顯大于僅注射賦形劑的另一側(cè)對(duì)照1/4乳房，而且處理和對(duì)照的區(qū)別有較大統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
E.轉(zhuǎn)移生長因子例18-21當(dāng)用來自Bachem Inc.Fine Chemicals，Torrance，CA(Catalog ＃ PGRO-30)的人二型轉(zhuǎn)移生長因子按例3-6的方法和劑量給奶牛，小母?；蛟信Ｗ⑸鋾r(shí)，結(jié)果基本是一樣的，如，經(jīng)處理的1/4乳房的重量及DNA有明顯的和有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加。
F′.胰島素例22-24當(dāng)用來自Sigma chemical Co，St，louis，Mo(Catalog ＃ Ⅰ-5500;24IU/mg)牛胰島素按例3-6的方法每次以25、100或250毫克給乳牛，小母?；蛟信Ｗ⑸鋾r(shí)，結(jié)果相似，即，經(jīng)處理的1/4乳房的重量和DNA有明顯的和有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加。
G.胎盤催乳素例25-27當(dāng)用Byatt在Endocrin.1191343-50(1986)所述的方法純化的天然牛胎盤催乳素，按例3-6的方法以總量0.25、10或250毫克給乳牛、小母牛、孕牛注射時(shí)，結(jié)果非常相似，即，處理組的1/4乳腺的重量和DNA有明顯的和有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加。
在本發(fā)明的生物學(xué)機(jī)制尚未完全搞清時(shí)，顯然可按常規(guī)判斷標(biāo)準(zhǔn)，它能用于使處理的動(dòng)物的乳腺實(shí)質(zhì)和相應(yīng)的產(chǎn)乳能力增加，這將持續(xù)到該動(dòng)物的下一次哺乳期，而且在不少情況下，還可在以后多次泌乳中維持。
權(quán)利要求
1.促進(jìn)生理正常的哺乳動(dòng)物乳腺實(shí)質(zhì)生長的一種方法，其中是在懷孕或大約在哺乳動(dòng)物的青春期開始和第一次懷孕之間給哺乳動(dòng)物乳腺內(nèi)注射對(duì)該哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞有致有絲分裂作用的促乳腺實(shí)質(zhì)生長量的一種物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中該物質(zhì)對(duì)所說細(xì)胞有直接促有絲分裂作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中該物質(zhì)包括多肽生長因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3的方法，其中該生長因子是選自表皮生長因子、胰島素族生長因子及其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3的方法，其中該生長因子包括表皮生長因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3的方法，其中該生長因子包括IGF-Ⅰ。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中該物質(zhì)對(duì)所說的細(xì)胞有類分泌性的致有絲分裂作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中該物質(zhì)包括生長激素和胎盤催乳素。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1-8的任何一項(xiàng)的方法，其中該哺乳動(dòng)物是牛。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1-8的任何一項(xiàng)的方法，其中該哺乳動(dòng)物是綿羊。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1-8的任何一項(xiàng)的方法，其中該哺乳動(dòng)物是山羊。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中在哺乳動(dòng)物懷孕的最后三個(gè)月灌注該物質(zhì)。
13.適用于反芻動(dòng)物乳內(nèi)注射給藥的組合物，它含有一定量的、對(duì)反芻動(dòng)物乳腺實(shí)質(zhì)生長的增加有效的、對(duì)反芻動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞有致有絲分裂作用的物質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13中的組合物，其中該物質(zhì)對(duì)所說細(xì)胞有直接致有絲分裂作用。
15.根據(jù)權(quán)利要求
13中的組合物，其中該物質(zhì)包括多肽生長因子。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15中的組合物，其中該生長因子選自上皮生長因子、胰島素族生長因子及其組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求
15中的組合物，其中該生長因子包括上皮生長因子。
18.根據(jù)權(quán)利要求
15的組合物，其中該生長因子包括IGF-1。
19.根據(jù)權(quán)利要求
13的組合物，其中該物質(zhì)對(duì)所說的細(xì)胞有類分泌性的致有絲分裂作用。
20.根據(jù)權(quán)利要求
13的組合物，其中該物質(zhì)包括生長激素或胎盤催乳素。
21.根據(jù)權(quán)利要求
13-20的任一項(xiàng)的組合物，它包括能增強(qiáng)該物質(zhì)注入乳腺后的擴(kuò)散的載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求
13-20的任一項(xiàng)的組合物，它包括在反芻動(dòng)物體溫下為液態(tài)的載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求
13-20的任一項(xiàng)的組合物，它包括對(duì)該物質(zhì)水溶性好的載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求
13-23的任一項(xiàng)的組合物，其中該反芻動(dòng)物是孕?；虼蠹s在青春期開始到第一次懷孕期間的牛。
25.權(quán)利要求
13-23的任一項(xiàng)的組合物，其中該反芻動(dòng)物是懷孕的綿羊或約在青春期開始到第一次懷孕期間的綿羊。
26.權(quán)利要求
13-23的任一項(xiàng)的組合物，其中該反芻動(dòng)物是懷孕的山羊或約在青春期開始到第一次懷孕期間的山羊。
27.權(quán)利要求
13-23的任一項(xiàng)的組合物的一個(gè)單位劑量，它含有所說物質(zhì)的2微克至約100毫克之間。
28.制備適于給反芻動(dòng)物乳腺內(nèi)注射使其乳腺實(shí)質(zhì)生長增強(qiáng)的組合物的方法，它包括對(duì)該反芻動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞有致有絲分裂作用的物質(zhì)與載體的結(jié)合，該載體能增加該物質(zhì)在反芻動(dòng)物乳腺內(nèi)注射后的擴(kuò)散。
29.根據(jù)權(quán)利要求
28的方法，該載體水溶性好，且在該反芻動(dòng)物體溫下為液體。
專利摘要
給哺乳動(dòng)物乳腺內(nèi)注射一種對(duì)該動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞有促有絲分裂作用的物質(zhì)，可使生理正常的哺乳動(dòng)物的產(chǎn)乳乳腺實(shí)質(zhì)的生長明顯增強(qiáng)。在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)，用很小量的這種物質(zhì)可得到較好的生長增強(qiáng)的效果。
文檔編號(hào)A61K35/30GK87102601SQ87102601
公開日1987年12月16日 申請(qǐng)日期1987年3月6日
發(fā)明者羅伯特·約瑟夫·科利爾, 邁克爾·弗朗西斯·麥格拉斯 申請(qǐng)人:孟山都公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan