專利名稱：膽紅素及其衍生物作為抗甲1型流感病毒劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于膽紅素及其衍生物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是涉及膽紅素及其衍生物作為抗甲1型流感病毒劑的用途。
膽紅素是哺乳動物體內(nèi)血紅素代謝的產(chǎn)物，血紅素在血紅素氧化酶的作用下，形成膽綠素IXα，它經(jīng)膽綠素還原酶作用，還原為膽紅素IXα(BilirubinIXα，俗稱膽紅素)。膽紅素在人體內(nèi)的作用，現(xiàn)已明確，它具有抗氧化作用。膽紅素存在于膽汁中，經(jīng)過血液循環(huán)、代謝，可以排出體外。當(dāng)代謝不正常時，會和其他組分一起形成膽結(jié)石。牛膽結(jié)石稱為牛黃，牛黃作為中藥成分在中國已有2000多年的歷史，用牛黃(包括人工牛黃)的中成藥有200余種，如牛黃清心丸、安宮牛黃丸、犀黃丸、六神丸、片仔癀，速效感冒膠囊、感冒通等。這些藥是治療中風(fēng)、腦炎、扁桃體炎、感冒等病的常用藥。牛黃中的膽紅素的含量在50％以上，而我國配制的人工牛黃中僅含膽紅素0.7％，一方面是由于膽紅素的價格太貴，另一方面是由于懷疑膽紅素的藥理作用(張能榮，《膽紅素》，中國醫(yī)藥科技出版社，北京，1994)，所以沒有將膽紅素作為有效成分，而單獨(dú)用于配藥的。牛黃具有清熱解毒、開竅豁痰、安神定驚的作用。膽紅素的藥理作用過去也曾有過一些研究，如可以促進(jìn)紅血球新生，增強(qiáng)血管的收縮作用；解熱作用；抗乙腦病毒；抗癌；消炎作用等(張能榮，《膽紅素》中國醫(yī)藥科技出版社，北京，1994)。國外近年來大量文獻(xiàn)報道了膽色素的抗氧化作用(A.F.McDonagh，臨床圍產(chǎn)學(xué)(Clinics in perinatology)，17(2)359-3691990)、抗HIV(人免疫性缺乏病毒)作用(H.Mari et.al.，日本癌癥研究(Jpn.J.Cancer Res.)，82，755-757，1991)、抗HHV-6(人皰疹病毒-6)作用(T.Nakagami et.al.，微生物免疫學(xué)(Microbiol.Immunal.)，36，381-390，1992)。也有專利報道膽色素可以作為抗補(bǔ)體劑(日本，公開特許公報(A)，特開平6-183969)和抗瘧疾劑(日本，公開特許公報(A)，特開平6-157308)，但至今尚未有用膽紅素及其衍生物作為抗甲1型流感病毒劑。
人體每天可產(chǎn)生、排泄大約300mg的膽紅素，在肝功能實(shí)驗和為了減輕關(guān)節(jié)炎的治療應(yīng)用時，給成人和新生兒靜脈注射劑量達(dá)到20mg/kg，未出現(xiàn)有害的影響。膽紅素具有潛在的毒性，也只有在代謝不正常的特殊情況下才會發(fā)生(張能榮，《膽紅素》中國醫(yī)藥科技出版社，北京，1994)。所以對膽紅素的藥用研究，目前正處于方興未艾。
本發(fā)明的目的旨在表明膽紅素及其衍生物中膽紅素XIII α可以抑制甲1型流感病毒，并可被用來制備預(yù)防和治療由甲1型流感病毒引起的流行性感冒的藥物。
本發(fā)明的技術(shù)方案中所用膽紅素及其衍生物結(jié)構(gòu)為
R1-R8為烷基、乙烯基、脂肪酸取代基。
R1R2R3R4R5R6R7R8膽紅素(膽紅素IXα) M V M P P M M V中膽紅素XIIIα M E M P P M E MM＝CH3，E＝CH2CH3，V＝CH＝CH2，P＝CH2CH2COOHR1、R2、R3、R6、R7、R8還可以為其他烷基、烯基、烷基羰基，R4、R5還可以為脂肪酸基、脂肪酸的鹽、脂肪酸的酰胺、脂肪酸的酯。
膽紅素及其衍生物物理化學(xué)性質(zhì)膽紅素(膽紅素IXα)；分子量584.7，紅色固體粉末，可溶于氯仿、二甲基亞砜，易溶于0.1M的氫氧化鈉水溶液，不溶于水、甲醇、石油醚、正己烷等溶劑，固態(tài)及堿性溶液中穩(wěn)定，溶液中酸性條件下易氧化。
中膽紅素XIIIα分子量588.7，亮黃色固體粉末，其溶解性、穩(wěn)定性與膽紅素相同，310℃開始分解。
膽紅素及其衍生物的制備1.膽紅素(膽紅素IXα)膽紅素來自市場購買的，因純度太低，必須經(jīng)過提純、重結(jié)晶。提純方法參考文獻(xiàn)(A.F.McDonagh and F.Assisi，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)，129797-800，1972)并做改進(jìn)。具體方法如下將市場購得的膽紅素500mg加入500mL脫去穩(wěn)定劑的氯仿中，在氮?dú)饬飨录訜峄亓靼胄r，然后冷卻至室溫。過濾溶液，用0.1M NaHCO3洗氯仿溶液(3×100mL)。然后通過雙層濾紙過濾，以除去氯仿中水。在30℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿溶液。然后往濃縮的氯仿溶液中加甲醇，至出現(xiàn)混濁，放入冰箱，至出現(xiàn)結(jié)晶，過濾。用含少量氯仿的甲醇洗，然后在真空下干燥。根據(jù)原料來源不同，回收率為50-90％，純度為98％以上(以克分子消光系數(shù)為65000計)，整個操作要在暗處進(jìn)行。所有溶劑預(yù)先通氬氣半小時。
2.膽紅素衍生物中膽紅素XIIIα的合成乙酰乙酸乙酯的肟與戊二酮在醋酸-鋅粉還原下縮合成4-乙?；?3，5-二甲基-1氫吡咯-2-羧酸乙酯，進(jìn)一步經(jīng)還原、水解、脫羧、氧化、溴化得到5-溴甲叉基-4-乙基-3-甲基-2-氧代-2，5-二氫吡咯，該吡咯與2，4-二甲基-5-羧基-1氫吡咯-3-丙酸在甲醇中酸催化回流縮合成黃膽紅酸甲酯，再經(jīng)DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-對苯二醌)氧化縮合成中膽綠素XIIIα二甲酯，最后經(jīng)硼氫化鈉還原、水解成最終產(chǎn)物，純度為99％以上。參考文獻(xiàn)(D.A.lightner，J.S.Ma et.al.，雜環(huán)化學(xué)雜志(J.Heterocyclic Chem.)，21 139-144，1984.R.T.Trull，R.W.Franklin and D.A.Lightner，雜環(huán)化學(xué)雜志(J.Heterocyclic Chem.)，24 1573-1579 1987)。
結(jié)構(gòu)參數(shù)IR(液膜)ν 3420，3260，2966，1704，1689，1629cm-1。1HNMR(氘代氯仿)δ 1.12(t，6H，J＝7Hz)，1.85(s，6H，2、18位CH3)，1，85(s，6H，7、13位CH3)，2.48(q，4H，J＝7Hz)，2.78(m，8H，-CH2CH2COOH)，4.06(s，2H，10位-CH2-)，6.04(s，2H，5、10位＝CH)，9.15(s，2H，吡咯NH)，10.52(s，2H，內(nèi)酰胺NH)，13.31(s，2H，COOH)ppm；MSM+587.7。UV-Vis(氯仿)λmax431nm，ε，60,000。13CNMR(氘代氯仿)8.54(q)，9.62(q)，15.29(q)，17.64(t)，19.74(t)，23.96(t)，34.81(t)，98.19(d)，119.72(s)，122.43(s)，123.00(s)，123.39(s)，128.28(s)，130.81(s)，147.67(s)，172.42(s)，174.46(s)。
膽紅素及其衍生物抗甲1型流感病毒試劑的配制膽紅素水溶液的配制準(zhǔn)確稱取上述純的2.790mg膽紅素IXα于一25mL的容量瓶中，用微量注射器加入250μL的分析純二甲基亞砜(DMSO)，接著用移液管準(zhǔn)確移取5mL 0.2M的磷酸二氫鉀(KH2PO4)標(biāo)準(zhǔn)水溶液并加入容量瓶中，振蕩使膽紅素充分溶解；再準(zhǔn)確移取4.28mL 0.2M的氫氧化鈉(NaOH)標(biāo)準(zhǔn)水溶液，用滴管逐滴加入容量瓶中，再用去離子水洗滴管和中轉(zhuǎn)容器一并加入容量瓶中，最后用去離子水定容。最終濃度膽紅素為111.6μg/mL相當(dāng)于190.87μM，DMSO為1％(v/v)。緩沖體系(KH2PO4-NaOH)pH值7.6，濃度0.05M。
中膽紅素XIIIα水溶液的配制樣品量為3.146mg配置成25mL的水溶液(125.8μg/mL相當(dāng)于214μM)，其操作同上，DMSO為0.5％(v/v)，緩沖體系濃度及pH值同上。
膽紅素及其衍生物水溶液的配置還有以下幾種方法1.引入水溶性集團(tuán)，直接溶于水溶液中；a在膽紅素的兩個羧基上引入兩個?；撬徕c鹽，制成二?；撬崮懠t素鈉(DTBR)；b在膽紅素的兩個羧基上引入季銨鹽陽離子(如四乙基銨)，制成膽紅素的季銨鹽。
2.采用藥物載體增加其水溶性a血清白蛋白；b β-環(huán)糊精包結(jié)。
本發(fā)明膽紅素及其衍生物中膽紅素XIIIα的制劑對甲1型流感病毒的抑制作用是明顯的，因此可以作為抑制甲1型流感病毒的藥物使用。膽紅素及衍生物中膽紅素XIIIα的合成簡單，成本較低。這類藥物能夠抑制甲1型流感病毒，而其對生物體及人體低的毒副作用則是經(jīng)過長期的醫(yī)學(xué)臨床觀察證明了的。綜上所述，膽紅素及其衍生物作為一類抗甲1型流感病毒藥物具有極大的進(jìn)一步開發(fā)、研究的價值。


圖1.膽紅素微摩爾濃度的對數(shù)對甲1型流感病毒的平均抑制率作圖；圖2.衍生物微摩爾濃度的對數(shù)對甲1型流感病毒的平均抑制率作圖。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述。
膽紅素及其衍生物體外抗病毒實(shí)驗方法及實(shí)驗結(jié)果實(shí)驗材料1.雞胚10-12日齡雞胚(購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué))2.病毒唑(購自江蘇新沂制藥廠，批號960330)3.菌株甲1型流感病毒株(中國預(yù)防科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供)(一)膽紅素實(shí)驗試劑配制
膽紅素水溶液的配制準(zhǔn)確稱取純度為98％以上的2.790mg的膽紅素IXα于一25mL容量瓶中，用微量注射器加入250μL的分析純二甲基亞砜(DMSO)，接著用移液管準(zhǔn)確移取5mL 0.2M的磷酸二氫鉀(KH2PO4)標(biāo)準(zhǔn)水溶液并加入容量瓶中，振蕩使膽紅素充分溶解；再準(zhǔn)確移取4.28mL 0.2M的氫氧化鈉(NaOH)標(biāo)準(zhǔn)水溶液，用滴管逐滴加入容量瓶中，再用去離子水洗滴管和中轉(zhuǎn)容器一并加入容量瓶中，最后用去離子水定容。最終濃度膽紅素為111.6μg/mL相當(dāng)于190.87μM，DMSO為1％(v/v)。緩沖體系(KH2PO4-NaOH)pH值7.6，濃度0.05M。
實(shí)驗方法用無菌生理鹽水將膽紅素原液稀釋為1∶2、1∶4、1∶8、-----1∶64的溶液，分別取不同稀釋度的藥液1mL與100EID50的病毒液1mL與試管內(nèi)混合，室溫作用1小時；病毒唑按5mg/mL濃度與病毒液等量混合。分別取上述混合物0.2mL接種雞胚尿囊腔，生理鹽水對照組接種生理鹽水0.2mL，病毒對照組接種100EID50病毒液0.1mL。用蠟封好接種孔，置37℃卵育箱培養(yǎng)48小時。收獲雞胚尿囊液，做血凝實(shí)驗。
實(shí)驗結(jié)果膽紅素對甲1型流感病毒繁殖抑制作用結(jié)果組別 病毒 實(shí)驗次數(shù)1 2 3 4原液 甲1- - - -1∶2 甲1- - - +1∶4 甲1- - ++-膽紅素1∶8 甲1++ ++ - -1∶16甲1+ ++ ++-1∶32甲1+ ++ +++++1∶64甲1+++ +++ +++ ++++NS對照組- - - - -病毒對照組 甲1++++++++++++ ++++病毒唑組 甲1- - - -注+代表有病毒繁殖；-代表無病毒繁殖；NS代表正常生理鹽水。(二)膽紅素衍生物中膽紅素XIIIα實(shí)驗試劑的配制
中膽紅素XIIIα水溶液的配制準(zhǔn)確稱取純度為99％以上3.146mg的中膽紅素XIIIα于一25mL的容量瓶中，用微量注射器加入分析純125μL的二甲基亞砜(DMSO)，接著用移液管準(zhǔn)確移取5mL 0.2M的磷酸二氫鉀(KH2PO4)標(biāo)準(zhǔn)水溶液并加入容量瓶中，振蕩使中膽紅素XIIIα充分溶解；再準(zhǔn)確移取4.28mL 0.2M的氫氧化鈉(NaOH)標(biāo)準(zhǔn)水溶液，用滴管逐滴加入容量瓶中，再用去離子水洗滴管和中轉(zhuǎn)容器一并加入容量瓶中，最后用去離子水定容。最終濃度中膽紅素XIIIα為125.8μg/mL相當(dāng)于214μM，DMSO為0.5％(v/v)。緩沖體系(KH2PO4-NaOH)pH值7.6，濃度0.05M。
實(shí)驗方法用無菌生理鹽水將膽紅素衍生物中膽紅素XIIIα原液稀釋為1∶2、1∶4、1∶8、-----1∶64的溶液，分別取不同稀釋度的藥液1mL與100EID50的病毒液1mL與試管內(nèi)混合，室溫作用1小時；病毒唑按5mg/mL濃度與病毒液等量混合。分別取上述混合物0.2mL接種雞胚尿囊腔，生理鹽水對照組接種生理鹽水0.2mL，病毒對照組接種100ElD50病毒液0.1mL。用蠟封好接種孔，置37℃卵育箱培養(yǎng)48小時。收獲雞胚尿囊液，做血凝實(shí)驗。
實(shí)驗結(jié)果中膽紅素XIIIα對流感病毒體外繁殖抑制作用結(jié)果組別病毒實(shí)驗次數(shù)1 2 3 4原液 甲1- - - -1∶2 甲1- - - +1∶4 甲1- - - ++中膽紅素 1∶8 甲1- ++++-XIII α 1∶16甲1+++ +++ ++++ ++++1∶32甲1++++ ++++ ++++ ++++1∶64甲1++++ ++++ ++++ ++++NS對照組 - - - - -病毒對照組 甲1++++ ++++ ++++ ++++病毒唑組甲1- - - -注+代表有病毒繁殖；-代表無病毒繁殖；NS代表正常生理鹽水。
實(shí)驗證明膽紅素及其衍生物中膽紅素XIIIα在實(shí)驗濃度下不影響雞胚的正常生長發(fā)育；保溫培養(yǎng)48小時后進(jìn)行血凝實(shí)驗排除了非特異性抑制的機(jī)制。分析上表數(shù)據(jù)可以看出，原液對甲1型流感病毒有完全的抑制作用；膽紅素及中膽紅素XIIIα具有對甲1型流感病毒50％抑制濃度(IC50)分別為13.95μg/mL(23.86μM)和15.73μg/mL(26.75μM)，均為1/8稀釋的原液濃度。通過附圖也可看出，在實(shí)驗濃度范圍內(nèi)，當(dāng)越過某閥值濃度時，隨著色素濃度的增加，色素對病毒的抑制作用顯著提高，直至完全抑制。所有這些都說明，膽紅素及其衍生物中膽紅素XIIIα在其25μM左右以上濃度的緩沖水溶液中具有明顯的抑制甲1型流感病毒的作用，且無毒副作用。
權(quán)利要求
1.一種膽紅素及其衍生物作為抗甲1型流感病毒劑的用途，其特征在于下述結(jié)構(gòu)的膽紅素及其衍生物用于制備抑制甲1型流感病毒劑
R1R2R3R4R5R6R7R8膽紅素IXα M V M P P M M V中膽紅素XIIIαM E M P P M E MM＝CH3，E＝CH2CH3，V＝CH＝CH2，P＝CH2CH2COOH。
全文摘要
本發(fā)明屬于膽紅素及其衍生物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用,特別是涉及膽紅素及其衍生物作為抗甲1型流感病毒劑的用途。其特征在于下述結(jié)構(gòu)的膽紅素及其衍生物用于制備抑制甲1型流感病毒劑。
文檔編號A61P31/00GK1262928SQ9910066
公開日2000年8月16日 申請日期1999年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月12日
發(fā)明者馬金石, 王鵬, 閻芳 申請人:中國科學(xué)院感光化學(xué)研究所