專利名稱：?jiǎn)捂湹亩嗫乖Y(jié)合性分子,其制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單鏈的多抗原結(jié)合性分子，所述分子具有免疫球蛋白重鏈和輕鏈多變區(qū)，這些區(qū)域以VH-VL構(gòu)建體的形式相互連接，它們又通過一種肽而連接在一起，本發(fā)明還涉及所述分子的制備及其作為藥物或診斷輔助物的用途。
識(shí)別兩種不同抗原，例如腫瘤細(xì)胞表面抗原和效應(yīng)物分子的雙特異性抗體被廣泛用于實(shí)驗(yàn)免疫療法中(Fanger等，免疫學(xué)評(píng)述，12,101-124(1992)；van de Winkel等，今日免疫學(xué)，18,562-564(1997))。由雙特異性抗體募集的效應(yīng)物功能包括在體內(nèi)天然存在的那些效應(yīng)物分子，例如細(xì)胞毒性細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，補(bǔ)體成分，細(xì)胞因子，溶栓酶和纖維蛋白溶酶，以及外源效應(yīng)物分子，例如毒素、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和放射性核素。因此，例如，在異種移植的腫瘤中注射針對(duì)Hodgkin腫瘤相關(guān)抗原CD30和T細(xì)胞抗原CD3和CD28的雙特異性抗體會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞的募集和刺激，并誘導(dǎo)殺腫瘤活性(Renner等，科學(xué)，264,833,1994)。在另一方法中，使用了針對(duì)CD30和堿性磷酸酶的雙特異性抗體將酶募集至腫瘤位點(diǎn)，從而將無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸镜乃幬?Sahin等，癌癥研究，50,6944-6948,1990)。
注射純化的雙特異性抗體的替代方法是由體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)和分泌這些雙特異性抗體。此策略的優(yōu)點(diǎn)是由經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生雙特異性抗體的過程發(fā)生在體內(nèi)，因此無需在注射前費(fèi)力地生產(chǎn)和純化雙特異性抗體。另外，有可能通過選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)來控制雙特異性抗體在器官或腫瘤中局部表達(dá)或在全身表達(dá)。
通過例如化學(xué)交聯(lián)(Nisonoff等，自然，194,355,1962)可制備雙特異性抗體。動(dòng)物來源的單克隆或多克隆抗體分子經(jīng)化學(xué)交聯(lián)后，大部分可能失去活性，另外，還產(chǎn)生了異型二聚體和同型二聚體，必需通過復(fù)雜的過程將同型二聚體與所需的異型二聚體分開。僅可以通過相對(duì)費(fèi)力的方法制備能產(chǎn)生雙特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞(被稱為雜合雜交瘤)，因?yàn)槠渲行枰獙煞N不同的雜交瘤融合在一起(Milstein等，自然，305,537,1983)。功能性異型二聚體的比例相對(duì)較低，理論上僅為10％，因?yàn)閮煞N抗體分子的重鏈和輕鏈可以任何方式彼此結(jié)合。所用的起始物質(zhì)主要包括鼠單克隆抗體，它對(duì)于人而言是有免疫原性的。
也可重組制備和在細(xì)菌或真核細(xì)胞中表達(dá)多種二價(jià)或雙特異性抗體分子(WO 93/06217)。所有重組抗體分子的共同點(diǎn)是可使用始于鼠和人的分子制備它們。已開發(fā)了多種方法以盡可能有效地制備雙特異性重組抗體分子。使用這些方法可制備多組分子。
在一組分子中，抗體的可變部分與免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc,CH3,CL)融合以達(dá)到二聚體化(Hu等，癌癥研究，56,3055-3061(1994)；Hayden等，ther.Immunol,1,3-15(1994))。然而，在這種情況下，沒有對(duì)異型二聚體分子的選擇，使得以這種方法主要產(chǎn)生的是二價(jià)同型二聚體。另外，只有真核細(xì)胞能以功能形式表達(dá)這些分子。
在另一組分子中，抗體的可變部分與其它蛋白質(zhì)的肽或蛋白質(zhì)區(qū)域融合以制備二價(jià)或雙特異性分子(Pluckthun和Pack，免疫技術(shù)，3,83-105(1997))。在這種情況下，由于隨機(jī)結(jié)合，通常也會(huì)形成同型和異型二聚體。另外，這些分子含有一定比例(有時(shí)是相當(dāng)大比例)的外源序列，因此估計(jì)有顯著的免疫原性。
在第三組分子中，對(duì)重組Fv片段，通常為單鏈Fv片段(scFv)的少量修飾被用于制備二價(jià)或雙特異性分子(Holliger和Winter,Curr.Opin.Biotechnol,4,446-449(1993))。這些修飾包括通過scFv鏈C末端額外的半胱氨酸進(jìn)行二聚體化(MacCartney等，蛋白質(zhì)工程，8,301-314(1994))。然而，這會(huì)導(dǎo)致同型和異型二聚體，并且，當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，將產(chǎn)生無功能的聚集體。可以在細(xì)菌和真核細(xì)胞中表達(dá)結(jié)構(gòu)為scFv(A)-接頭-scFv(B)的串聯(lián)scFv分子(Mallender和Voss，生物化學(xué)雜志，269,199-206,1994)。然而，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)四個(gè)可變區(qū)的無功能的結(jié)合。
最近幾年，重組抗體技術(shù)導(dǎo)致產(chǎn)生了一些新型的、小的二價(jià)或雙特異性抗體片段。這種類型分子的例子例如有“間體”(diabody)(Holliger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，90,6444-6448,1993)。這些分子含有免疫球蛋白的VH和VL可變區(qū)域，所述區(qū)域通過很短的接頭連接在一起。所述接頭非常短以致于不會(huì)導(dǎo)致單鏈Fv片段中會(huì)出現(xiàn)的一條鏈的VH和VL區(qū)域的結(jié)合。這意味著是兩條鏈的VH和VL區(qū)域結(jié)合形成二聚體，從而產(chǎn)生具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的分子(Perisic等，結(jié)構(gòu)，2,1217-1226,1994)。通過在一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)結(jié)構(gòu)為VH(A)-VL(B)和VH(B)-VL(A)的兩條鏈可產(chǎn)生雙特異性的“間體”。在這種情況下，VL指的是免疫球蛋白輕(L)鏈的可變(V)區(qū)，VH指的是免疫球蛋白重(H)鏈的可變區(qū)(V)，這些可變區(qū)可結(jié)合抗原(A)或(B)。VH部分與VL部分的結(jié)合產(chǎn)生了具有功能活性結(jié)合位點(diǎn)的異型二聚體片段。細(xì)菌表達(dá)的雙特異性“間體”已被成功用于募集多種效應(yīng)物分子，免疫球蛋白，Clq或酶，或者效應(yīng)細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Kontermann等，自然生物技術(shù)，15,629(1997)；Holliger等，蛋白質(zhì)工程，9,299(1996)；自然生物技術(shù)，15,632(1997)；Zhu等，生物技術(shù)，14,192(1996)；FitzGerald等，蛋白質(zhì)工程，10,1221(1997)；Krebs等，生物化學(xué)雜志，273,2858(1998))。
然而，“間體”具有下列缺點(diǎn)由于VH(A)-VL(B)和VH(B)-VL(A)這兩條鏈在物理上不再連接在一起，故同等程度地產(chǎn)生同型和異型二聚體，這使得必需對(duì)異型二聚體進(jìn)行很費(fèi)力的純化過程。另外，也會(huì)出現(xiàn)二聚體解離現(xiàn)象，正如已在scFv片段中看到的那樣(Glockshuber等，生物化學(xué)，29,1362-1367(1990))。為了解決此問題，已開發(fā)了二硫鍵穩(wěn)定化的“間體”(FitzGerald等，蛋白質(zhì)工程，10,1221-1225,1997)或“球入穴(knobinto hole)間體”(Zhu等，蛋白質(zhì)科學(xué)，6,781-788,1997)，然而，它們的制備相當(dāng)復(fù)雜。另外，雙特異性“間體”的基因工程表達(dá)中每條鏈均需要信號(hào)序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，這很難實(shí)現(xiàn)。另外，有可能表達(dá)非等摩爾量的可變區(qū)，這可增加無功能的同型二聚體的比例。
因此，本發(fā)明的目的是找出不具有所謂的“間體”的上述缺點(diǎn)，并可經(jīng)簡(jiǎn)單的方法以基本上均一的形式制備的多抗原結(jié)合性分子。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是單鏈的多抗原結(jié)合性分子，所述分子含有下列組分a)具有第一特異性(A)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)及其功能性部分，b)具有第二特異性(B)的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)及其功能性部分，c)具有特異性(B)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)及其功能性部分，和d)具有特異性(A)的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)及其功能性部分。
其中VH和VL區(qū)域以VH-VL構(gòu)建體或VL-VH構(gòu)建體的形式連接，而這兩種VH-VL構(gòu)建體經(jīng)由肽(P)連接。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子含有兩個(gè)以上所述的VH-VL構(gòu)建體(如VH(B)-肽-VL(B))。這使得有可能得到含有幾種特異性(A)，(B),(C)等的分子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，各個(gè)VH-VL構(gòu)建體經(jīng)由其具有相同特異性的可變區(qū)結(jié)合在一起。本發(fā)明分子的特別優(yōu)選的結(jié)構(gòu)示于

圖1。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的各種特異性實(shí)質(zhì)上相同。本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上相同”指的是區(qū)域的分子結(jié)構(gòu)很有可能不同，但它們的特異性，即特異性結(jié)合抗原的功能仍保持不變。結(jié)果是本發(fā)明的分子不僅可含有一種免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的完整可變區(qū)，也可含有其功能性部分，即保留了其抗原結(jié)合特異性的部分。例如，本發(fā)明也包括人工構(gòu)建體，所述構(gòu)建體由免疫球蛋白可變區(qū)的各個(gè)CDR部分(“互補(bǔ)決定區(qū)”)組成(Jones,P.T等，自然，321,522,1986；Riechmann,L等，自然，332,323,1988；Verhoeyen,M等，科學(xué)，239,1534,1988)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過肽接頭(L)以VH-L-VL構(gòu)建體或VL-L-VH構(gòu)建體的形式連接VH和VL區(qū)域。此時(shí)接頭一般應(yīng)盡可能地短，優(yōu)選約為1-20個(gè)氨基酸，尤其是約1-5個(gè)氨基酸長(zhǎng)，特別優(yōu)選序列為GGGGS的接頭。
與接頭(L)形成對(duì)照的是，連接肽(P)可具有任何適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度。然而，優(yōu)選肽(P)具有約12-40個(gè)氨基酸，尤其是約12-20個(gè)氨基酸，特別是約14個(gè)氨基酸。特別優(yōu)選的肽(P)含有氨基酸序列GGGGSGGRASGGGS或GGGGSGGRASGGGGS，尤其優(yōu)選由所述氨基酸序列組成的肽(P)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子含有效應(yīng)物(E)作為另外的組分。所述效應(yīng)物可直接，或適當(dāng)時(shí)經(jīng)由連接物(B)與本發(fā)明的分子連接。特別優(yōu)選連接物(B)含有蛋白酶切割序列，尤其優(yōu)選含有PSA(前列腺特異性抗原)、組織蛋白酶、纖溶酶原和/或纖溶酶原激活子切割序列。
蛋白酶切割序列是特別優(yōu)選的，因?yàn)檫@使得可以通過使用蛋白酶而將效應(yīng)物從本發(fā)明的分子上脫離下來。當(dāng)效應(yīng)物的活性因效應(yīng)物直接地或通過連接物間接地與本發(fā)明的分子結(jié)合而受到抑制時(shí)，這種分離尤其有利。
由于蛋白酶特別地存在于炎癥區(qū)或腫瘤中，效應(yīng)物，優(yōu)選因通過蛋白酶切割序列與本發(fā)明的分子結(jié)合而被滅活的效應(yīng)物，在此得到了廣泛的局部釋放。另外，通過選擇本發(fā)明分子的適當(dāng)靶結(jié)構(gòu)，例如對(duì)腫瘤細(xì)胞上的抗原，腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞上的抗原或者炎癥細(xì)胞如淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上的抗原具有特異性的靶結(jié)構(gòu)，也可能使本發(fā)明的分子與效應(yīng)物累積于諸如炎癥或腫瘤區(qū)域中。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的分子也可以直接或間接地與幾種效應(yīng)物結(jié)合。
蛋白酶或相關(guān)切割序列詳細(xì)描述于例如DE1970430.1中。
圖2圖示了本發(fā)明優(yōu)選分子的一個(gè)例子，其具有通過連接物而與該分子結(jié)合的效應(yīng)物。
對(duì)本發(fā)明分子中各個(gè)組分的選擇一般取決于應(yīng)用領(lǐng)域。
如果本發(fā)明的分子將被用作診斷輔助物，那么，例如在另外的實(shí)施方案中，第一特異性(A)針對(duì)的是待分析的分子，第二特異性(B)直接或間接針對(duì)分析物。分析物可以是例如放射性分子、熒光分子或者通過其酶活性而將分析物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚苑治鑫锏拿浮?br> 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一特異性(A)針對(duì)待分析的分子，第二特異性(B)針對(duì)待分析的另一分子，而效應(yīng)物(E)是一種分析物，例如放射性分子、熒光分子和/或已在上文詳細(xì)說明的一種酶。
然而，本發(fā)明的分子也可用作病毒或非病毒載體之靶細(xì)胞特異性結(jié)合的配體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子也可用作所謂的多功能配體。如果肽(P)和/或效應(yīng)物(E)含有融合肽，則對(duì)于此目的是有利的?？蓪⒍喙δ芘潴w用于核苷酸序列的靶細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移，它一般是一種含有靶細(xì)胞特異性配體、基因構(gòu)建體特異性配體和融合肽的蛋白質(zhì)?？墒褂眠@種類型的多功能配體使基因構(gòu)建體(即核酸構(gòu)建體)與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，而融合肽可使該核酸構(gòu)建體有可能穿過細(xì)胞膜滲透至細(xì)胞核內(nèi)，從而也從內(nèi)體中釋放出來。
將本發(fā)明的分子用作載體的配體或用作多功能配體時(shí)，第一特異性(A)針對(duì)靶細(xì)胞、第二特異性(B)針對(duì)載體是有利的。載體一般是核酸、陽(yáng)離子肽或蛋白質(zhì)、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陽(yáng)離子肽或陽(yáng)離子卟啉。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體是得自例如腺病毒(AdV)，腺相關(guān)病毒(AAV)、痘苗病毒、RSV、HSV、流感病毒或慢病毒的病毒載體。
靶細(xì)胞上膜結(jié)構(gòu)的靶細(xì)胞特異性配體，衍生自免疫球蛋白(即含有VH和VL區(qū)域)的靶細(xì)胞特異性配體和基因構(gòu)建體特異性配體，以及具有融合特性的肽的例子詳細(xì)描述于DE19649645.4。
本發(fā)明的分子也適用于預(yù)防和/或用作治療劑。
為了這些目的，例如，第一特異性(A)可以是針對(duì)細(xì)胞膜，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、支持組織的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜，或者是針對(duì)胞外基質(zhì)、補(bǔ)體系統(tǒng)、凝結(jié)系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、血漿、支持組織的蛋白質(zhì)，或者是針對(duì)細(xì)胞因子或趨化因子，或者針對(duì)內(nèi)源或外源毒素，或者針對(duì)如毛地黃之類的藥物，和/或針對(duì)病原體如細(xì)菌、病毒和/或寄生蟲病原體。
第二特異性(B)例如可針對(duì)諸如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞或粒細(xì)胞的細(xì)胞膜，結(jié)果是它與靶結(jié)構(gòu)的交聯(lián)可在該處導(dǎo)致細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)或炎癥過程。
它也可針對(duì)細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子，結(jié)果是它與靶結(jié)構(gòu)的交聯(lián)可在該處誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)或增殖過程。它也可針對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可啟動(dòng)、增強(qiáng)或抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。取決于對(duì)蛋白質(zhì)的選擇，這種類型的蛋白質(zhì)與靶結(jié)構(gòu)的交聯(lián)可在該處誘導(dǎo)炎性和細(xì)胞裂解反應(yīng)或者抗炎性反應(yīng)和細(xì)胞保護(hù)性反應(yīng)。它也可以針對(duì)凝結(jié)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可啟動(dòng)、增強(qiáng)或抑制凝結(jié)系統(tǒng)的激活。取決于對(duì)蛋白質(zhì)的選擇，這種類型的蛋白質(zhì)與靶結(jié)構(gòu)的交聯(lián)可誘導(dǎo)或防止血栓形成。另外，它也可以針對(duì)可導(dǎo)致靶結(jié)構(gòu)上血纖蛋白塊溶解的纖溶蛋白，針對(duì)能將靶結(jié)構(gòu)上無活性的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚?例如有細(xì)胞毒性)的藥物的酶，針對(duì)肽激素或類固醇激素，針對(duì)免疫球蛋白的恒定部分，針對(duì)介體，如組胺、5-羥色胺、白三烯、前列環(huán)素或激肽，針對(duì)病原體，如細(xì)菌、病毒和/或寄生蟲病原體，或針對(duì)腫瘤細(xì)胞。
細(xì)胞因子作為靶結(jié)構(gòu)，或者單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞作為靶結(jié)構(gòu)可被具有感染或腫瘤抗原的本發(fā)明分子交聯(lián)，從而在體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)該抗原的有所增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。在此方面，在本發(fā)明的分子中加入病原體或腫瘤的特定抗原，在適當(dāng)時(shí)也加入細(xì)胞因子，并局部施用或注射該交聯(lián)復(fù)合物是有利的。
第二特異性(B)也可針對(duì)內(nèi)源或外源毒素以使靶結(jié)構(gòu)上可發(fā)生毒素的中和作用和吞噬作用或者發(fā)生毒性反應(yīng)。另外，它還可針對(duì)如毛地黃之類的藥物以造成藥物的絡(luò)合和消除。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有效應(yīng)物的本發(fā)明分子允許兩個(gè)相同或不同的靶結(jié)構(gòu)與一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)物交聯(lián)。
適當(dāng)效應(yīng)物的例子是跨膜區(qū)域，糖磷脂錨，受體的與配體結(jié)合的部分；受體的配體或配體的與受體結(jié)合的部分；肽激素；細(xì)胞因子；生長(zhǎng)因子；生長(zhǎng)因子抑制劑；趨化因子；干擾素；介體；對(duì)循環(huán)起作用的肽；將藥物的無活性前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚运幬锏拿?；激活或抑制凝結(jié)作用的蛋白質(zhì)；激活或抑制纖溶作用的蛋白質(zhì)；激活或抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)；免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)；細(xì)胞毒性肽，另一種單鏈的單或多抗原(尤其是雙抗原)結(jié)合分子；腫瘤抗原或病原體抗原，如細(xì)菌抗原或病毒抗原；含有半胱氨酸以產(chǎn)生本發(fā)明分子之二聚體的肽；和/或二聚體化或多聚體化的肽(Pluckthun和Pack，免疫技術(shù)，3,83-105(1997))。
本發(fā)明的另一方面是編碼本發(fā)明分子的核酸。該核酸一般為DNA或RNA，優(yōu)選為雙鏈DNA。
為了分泌本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物(這在適當(dāng)時(shí)是需要的)，本發(fā)明的核酸在其5’末端含有編碼信號(hào)或跨膜序列的核苷酸序列(例見DE19639103.2或DE 19651443.6)。適當(dāng)信號(hào)或跨膜序列的一個(gè)例子是免疫球蛋白的信號(hào)序列(DNA位置≤63至≥107),CEA的信號(hào)序列(DNA位置≤33至≥134)，或人呼吸道合胞病毒糖蛋白的信號(hào)序列(氨基酸序列≤38至≥50或48至65的cDNA)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸在其5’末端含有啟動(dòng)子和/或激活子(activator)。優(yōu)選激活子可被細(xì)胞特異性地、細(xì)胞周期特異性地、代謝特異性地和/或被藥物激活或抑制。這種類型的激活子序列(包括其組合)被描述于EP97101507.8,DE19617851.7,DE19639103.2,DE19651443.6,DE19704301.1,EP97102547.3和DE19710643.9。本發(fā)明特別優(yōu)選的核酸構(gòu)建體示于圖3和4。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸在其起始密碼子5’末端含有序列GCCACC或GCCGCC，這有可能導(dǎo)致翻譯的增強(qiáng)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及含有本發(fā)明核酸的載體。在這種情況下，載體可以是病毒或非病毒載體，優(yōu)選為非病毒載體，尤其是選自陽(yáng)離子脂質(zhì)、陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子肽或陽(yáng)離子卟啉的非病毒載體。
為了制備本發(fā)明的分子，將所述核酸克隆至表達(dá)載體，例如適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒中，并導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞，例如細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，培養(yǎng)以此方式轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并在適當(dāng)時(shí)分離表達(dá)產(chǎn)物。方法一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，詳細(xì)描述于例如Sambrook J等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989。
在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些細(xì)胞表達(dá)具有效應(yīng)物的本發(fā)明分子，該效應(yīng)物優(yōu)選為一種跨膜區(qū)。
因此，例如，編碼人巨噬細(xì)胞集落刺激因子之跨膜序列的DNA序列(DNA位置≤1485至≥1554)或編碼人呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G之信號(hào)和跨膜區(qū)(氨基酸1至63，或其部分序列氨基酸38至63)的DNA序列或編碼流感病毒神經(jīng)氨酸酶之信號(hào)和跨膜區(qū)(氨基酸7至35，或部分序列氨基酸7至27)的DNA序列可被插入到啟動(dòng)子序列和本發(fā)明分子之DNA序列之間或該基因的3’末端。
然而，為了將藥物錨定在表達(dá)本發(fā)明分子之細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)，也可以將編碼糖磷脂錨的核苷酸序列插入到核酸構(gòu)建體中。
糖磷脂錨的插入一般是在編碼本發(fā)明分子之核苷酸序列的3’末端，并且可與信號(hào)序列的插入同時(shí)發(fā)生。
已描述了例如CEA、N-CAM和其它膜蛋白如Thy-1的糖磷脂錨。
由于存在這種跨膜區(qū)，該特定細(xì)胞在細(xì)胞膜上表達(dá)本發(fā)明的分子，因此獲得了特異于靶或效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的“受體”，所述結(jié)構(gòu)由本發(fā)明分子中與抗原結(jié)合的部分所識(shí)別。
另一種優(yōu)選的受體是受體(例如T細(xì)胞受體或M-CSF受體)的跨膜或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域。這使得在細(xì)胞膜上表達(dá)本發(fā)明分子的細(xì)胞有可能被靶結(jié)構(gòu)與特異性功能的結(jié)合所激活。這種類型的特異性功能可以是例如T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)，巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的吞噬反應(yīng)，或者粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的胞吐反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的另一方面是含有本發(fā)明核酸或本發(fā)明載體的細(xì)胞，尤其是細(xì)菌、昆蟲、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。除了通常已知的可用于表達(dá)核酸的細(xì)胞(例如CHO或BHK細(xì)胞)外，適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞也可以是淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞，上皮細(xì)胞，肝細(xì)胞，腎細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌或橫紋肌細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞。
最后提及的細(xì)胞特別適用于基因治療應(yīng)用，因?yàn)楹斜景l(fā)明核酸構(gòu)建體的這些細(xì)胞可被局部或非腸道地(如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi))注射到體腔、器官內(nèi)，或者皮下注射入患者體內(nèi)以預(yù)防或治療疾病。
然而，為了通過基因療法治療疾病，也可將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體經(jīng)皮下或肌內(nèi)局部直接施用于患者體腔、器官、循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)。
因此，本發(fā)明的另一方面是含有本發(fā)明分子、本發(fā)明核酸、本發(fā)明載體或本發(fā)明細(xì)胞的藥物，以及含有本發(fā)明分子的診斷輔助物，所述分子也針對(duì)上文已詳細(xì)描述的分析物。
因此，本發(fā)明分子、本發(fā)明核酸、本發(fā)明載體或本發(fā)明細(xì)胞適用于治療、預(yù)防或診斷諸如癌癥，自身免疫疾病，炎性疾病，血液病，尤其是血液凝結(jié)和/或循環(huán)系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病和/或傳染病。
在此方面，對(duì)各個(gè)組分的選擇一般取決于本發(fā)明項(xiàng)目的用途。下文一般性地和以舉例方式詳細(xì)描述了各個(gè)組分及其用途為了制備本發(fā)明的項(xiàng)目，如圖3和4中的例子所說明，可以將本發(fā)明核酸構(gòu)建體的5’末端與編碼信號(hào)序列的核酸的3’末端連接，再將后者的5’末端與啟動(dòng)子序列的3’末端連接。
選定的啟動(dòng)子序列包括例如能無限制地激活的啟動(dòng)子和激活子序列，如RNA聚合酶Ⅲ的啟動(dòng)子，RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，SV40啟動(dòng)子；或病毒啟動(dòng)子和激活子序列，如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、HIV等的啟動(dòng)子和激活子序列。
使用HIV啟動(dòng)子時(shí)，優(yōu)選將包括TAR序列的完整LTR序列[位置≤-453至≥-80,Rosen等，細(xì)胞，41,813(1985)]用作病毒特異性啟動(dòng)子。
可選的其它啟動(dòng)子序列是例如能被代謝地激活的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，如能被低氧誘導(dǎo)的增強(qiáng)子，能被細(xì)胞周期特異性地激活的啟動(dòng)子，如cdc25C基因、cdc25B基因，細(xì)胞周期蛋白A基因、cdc2基因、B-myb基因、DHFR基因或E2F-1基因的啟動(dòng)子，或者細(xì)胞周期特異性地出現(xiàn)或被激活的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列。這些結(jié)合序列包括例如c-myc蛋白的結(jié)合序列。被稱為Myc E-Box的核苷酸序列[5’-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3’]的單體或多體也包括在這些結(jié)合序列中。
可選的其它啟動(dòng)子序列是例如能被四環(huán)素激活的啟動(dòng)子，如與相應(yīng)的阻抑子聯(lián)合的四環(huán)素操縱基因，或嵌合啟動(dòng)子。嵌合啟動(dòng)子是位于上游的、能被細(xì)胞特異性地、代謝或病毒特異性地激活的激活子序列與位于下游、并含有CDE-CHR或E2FBS-CHR核苷酸序列的啟動(dòng)子元件的聯(lián)合，在細(xì)胞周期G0和G1期，抑制蛋白與之結(jié)合從而抑制位于上游的激活子序列的激活(WO96/06943；Lucibello等，EMBO J,14,132(1995))。
可選的其它啟動(dòng)子序列是例如能被細(xì)胞特異性地激活的啟動(dòng)子，優(yōu)選例如得自編碼優(yōu)選在選定細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)之基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的啟動(dòng)子或激活子序列。
例如，為本發(fā)明目的，在下述細(xì)胞中優(yōu)選使用下列蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子在內(nèi)皮細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活子序列是編碼例如下列蛋白質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)序列腦特異性內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，endoglin,VEFG受體1(flt-1),VEFG受體2(flk-1,KDR),til-1或til-2,B61受體(Eck受體)，B61，內(nèi)皮素，尤其是內(nèi)皮素B或內(nèi)皮素1，內(nèi)皮素受體，尤其是內(nèi)皮素B受體，甘露糖-6-磷酸受體，vonWillebrand受體，IL-1α,IL-1β,IL-1受體，血管細(xì)胞粘著分子(VCAM-1)或合成的、由在內(nèi)皮細(xì)胞中優(yōu)先或選擇性地具有活性之轉(zhuǎn)錄因子的寡聚化結(jié)合位點(diǎn)組成的激活子序列。一個(gè)例子是轉(zhuǎn)錄因子GATA-2，它在內(nèi)皮素1基因中的結(jié)合位點(diǎn)是5’-TTATCT-3’。
在與已被激活的內(nèi)皮細(xì)胞相鄰的細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子或激活子序列是編碼例如下列蛋白質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)序列VEGF，此時(shí)VEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列是5’側(cè)翼區(qū)，3’側(cè)翼區(qū)，c-Src基因或v-Src基因，或類固醇激素受體；以及它們的啟動(dòng)子元件，尤其是小鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子。
在肌肉細(xì)胞，尤其是平滑肌細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子或激活子序列是編碼例如下列蛋白質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)序列原肌球蛋白，α-肌動(dòng)蛋白，α-肌球蛋白，PDGF受體，F(xiàn)GF受體，MRF-4，果糖磷酸激酶A，磷酸甘油酸變位酶，肌鈣蛋白C，肌漿蛋白，內(nèi)皮素A受體，結(jié)蛋白，VEGF(見上文)，“人工”啟動(dòng)子或肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子，所述轉(zhuǎn)錄因子如螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)家族的因子(MyoD,Myf-5，肌漿蛋白，MRF4)或鋅指蛋白GATA-4。
不僅肌肉特異性基因的啟動(dòng)子可使HLH蛋白和GATA-4顯示出肌肉特異性轉(zhuǎn)錄，異源啟動(dòng)子也可使上述蛋白質(zhì)顯示出肌肉特異性轉(zhuǎn)錄，因此人工啟動(dòng)子也可做到這一點(diǎn)。這種類型的人工啟動(dòng)子的例子是肌肉特異性HLH蛋白的多拷貝(DNA)結(jié)合位點(diǎn)，如E盒(MyoD)(例如4×AGCAGGTGTTGGGAGGC)或α-肌球蛋白重鏈基因的GATA-4多拷貝DNA結(jié)合位點(diǎn)(如5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3’)。
在膠質(zhì)細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活子序列是例如來自編碼下列蛋白質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)序列Schwann細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)periaxin，谷氨酰胺合成酶，膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)=GFAP)，膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)S100b,IL-6,CNTF,5-HT受體，TNFα,IL-10,胰島素樣生長(zhǎng)因子受體Ⅰ和Ⅱ或VEGF(見上文)。
在血液形成細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活子序列是例如在血液形成細(xì)胞或相鄰細(xì)胞(如基質(zhì))中表達(dá)的細(xì)胞因子或其受體的基因的啟動(dòng)子序列。
這些啟動(dòng)子序列包括編碼例如下列細(xì)胞因子及其受體之基因的啟動(dòng)子序列干細(xì)胞因子受體，干細(xì)胞因子，IL-1α,IL-1受體，IL-3,IL-3受體(α亞基)，IL-3受體(β亞基)，IL-6,IL-6受體，GM-CSF,GM-CSF受體(α鏈)，干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)(IL-6激活I(lǐng)RF-1啟動(dòng)子的水平與IFNγ或IFNβ激活I(lǐng)RF-1啟動(dòng)子的水平相同)，促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素受體。
在淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活子序列是例如編碼諸如下列細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體和粘附分子及抗體Fc片段受體之類的基因的啟動(dòng)子和激活子序列IL-1受體，IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-2受體，IL-3,IL-3受體(α亞基)，IL-3受體(β亞基)，IL-4,IL-4受體，IL-5,IL-6,IL-6受體，干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)(IL-6激活I(lǐng)RF-1啟動(dòng)子的水平與IFNγ或IFNβ激活I(lǐng)RF-1啟動(dòng)子的水平相同)，IFNγ反應(yīng)性啟動(dòng)子，IL-7,IL-8,IL-10,IL-11,IFNγ,GM-CSF,GM-CSF受體(α鏈)，IL-13,LIF，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)受體，Ⅰ型和Ⅱ型巨噬細(xì)胞清除受體，MAC-1(白細(xì)胞功能相關(guān)抗原)，LFA-1α(白細(xì)胞功能相關(guān)抗原)或p150,95(白細(xì)胞功能相關(guān)抗原)。
在滑膜細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活子序列例如是編碼諸如下列基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)之類的基因的啟動(dòng)子序列MMP-1(間質(zhì)膠原酶)，MMP-3(溶基質(zhì)素/transin)或金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)，如TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3。
在白血病細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活子序列是例如編碼下列蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子HSP-70,bcl-1/細(xì)胞周期蛋白D-1,bcl-2,IL-6,IL-10,TNFα,TNFβ,HOX-11,BCR-Abl,E2A-PBX-1,PML-RAR(早幼粒細(xì)胞白血病視黃酸受體)或c-myc，其中c-myc蛋白結(jié)合并激活被稱為Myc E盒的核苷酸序列(5’-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3’)的多體。
在腫瘤細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活子序列是例如基因調(diào)節(jié)核苷酸序列，所述序列與在腫瘤細(xì)胞中形成的或具有活性的轉(zhuǎn)錄因子可相互作用。
為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選的啟動(dòng)子或激活子序列包括編碼特別地產(chǎn)生于癌細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞中之蛋白質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)序列或元件。因此，優(yōu)選用于小細(xì)胞支氣管癌中的是N-CAM蛋白啟動(dòng)子，用于卵巢癌中的是肝炎生長(zhǎng)因子受體或L-絲束蛋白的啟動(dòng)子，用于胰腺癌中的是L-絲束蛋白或多形上皮粘蛋白(PEM)的啟動(dòng)子。
本發(fā)明一個(gè)相當(dāng)大的優(yōu)點(diǎn)在于各個(gè)組分的連接有利于異型二聚體化結(jié)合，從而大量形成單鏈的多抗原結(jié)合性分子。二聚體的解離現(xiàn)象也有所減少，scFv片段已顯示出這一點(diǎn)(例見Glockshuber等，生物化學(xué)，29,1362-1367,1990)，因此，相對(duì)于所謂的“間體”而言，可以較簡(jiǎn)便地并以更均一的形式制備本發(fā)明的分子，即便是前者為二硫鍵穩(wěn)定化的或“球入穴”的形式也是如此。
另外，制備本發(fā)明的分子僅需要一個(gè)信號(hào)序列和一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，與之形成對(duì)照的是在本發(fā)明的“間體”中每條鏈都需要信號(hào)序列和RBS。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，就本發(fā)明的分子，表達(dá)的是等摩爾量的可變區(qū)，而至于“間體”的兩條鏈的表達(dá)，可能是以非等摩爾量進(jìn)行的，因此后者中無功能的同型二聚體的比例有所增加。
本發(fā)明分子的另一優(yōu)點(diǎn)是可以在細(xì)菌和酵母、桿狀病毒和真核細(xì)胞中簡(jiǎn)單地并以功能形式表達(dá)本發(fā)明的分子。另外，除了對(duì)本發(fā)明的分子進(jìn)行分泌表達(dá)外，也可以將它們表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)或與膜聯(lián)合的形式(例見Biocca & Cattaneo，細(xì)胞生物學(xué)動(dòng)態(tài)，5,248-252(1995))。
本發(fā)明分子的另一優(yōu)點(diǎn)是它們象雙特異性抗體一樣，可以廣泛用作診斷輔助物以及預(yù)防和/或治療疾病的藥物。
選擇效應(yīng)物基因和啟動(dòng)子序列應(yīng)考慮所需的用途和欲轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞。例如，就下列疾病，可選擇的啟動(dòng)子序列和效應(yīng)物基因的組合如下所述腫瘤治療腫瘤治療的靶細(xì)胞是例如增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞，或與內(nèi)皮細(xì)胞相鄰的基質(zhì)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞，或者腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞，所用啟動(dòng)子是例如內(nèi)皮細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，或細(xì)胞非特異性或肌肉細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，或腫瘤細(xì)胞特異性(實(shí)體腫瘤，白血病)和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，所用效應(yīng)物是例如下列基因細(xì)胞增殖抑制劑基因是例如成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRb=p110)或相關(guān)的p107和p130蛋白的基因。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRb/p110)和相關(guān)的p107和p130蛋白可通過磷酸化而失活。應(yīng)優(yōu)選使用的細(xì)胞周期抑制劑基因是在所表達(dá)蛋白質(zhì)的失活位點(diǎn)具有突變、而其功能未因此受損害的那些基因。已描述了p110中這些突變的例子。p107蛋白或p130蛋白的DNA序列可以類似的方式突變。p53蛋白的基因也是合適的。p53蛋白在細(xì)胞中或者通過與特定蛋白質(zhì)(如MDM2)結(jié)合而失活，或者通過經(jīng)由去磷酸化的C-末端絲氨酸使p53寡聚體化而失活。因此，最好使用C末端截短至絲氨酸392的p53蛋白的DNA序列。其它的合適基因是p21(WAF-1)、p16蛋白、其它c(diǎn)dk抑制劑、GADD45蛋白或bak蛋白的基因。
凝結(jié)誘導(dǎo)因子和血管生成抑制劑的基因是例如纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1),PAI-2,PAI-3，制管張素，干擾素(IFNα,IFNβ或IFNγ)，血小板因子4,IL-12,TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3，白血病抑制因子(LIF)或組織因子(TF)及其促進(jìn)凝結(jié)的片斷的基因。
細(xì)胞靜止蛋白和細(xì)胞毒性蛋白的基因是例如穿孔素，粒酶，IL-2,IL-4,IL-12，如IFNα、IFNβ或IFNγ之類的干擾素，如TNFα或TNFβ之類的TNF，制癌蛋白M，鞘磷脂酶或爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物的基因。
炎癥誘導(dǎo)物的基因是例如下列物質(zhì)的基因IL-1,IL-2,RANTES(MCP-2)，單核細(xì)胞趨化和激活因子(MCAF),IL-8，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1(MIP-1α,-β)，嗜中性白細(xì)胞活化蛋白-2(NAP-2),IL-3,IL-5，人白血病抑制因子(LIF),IL-7,IL-11,IL-13,GM-CSF,G-CSF,M-CSF,在功能上相當(dāng)于人補(bǔ)體因子C3b的眼鏡蛇毒因子(CVF)或CVF的部分序列(即它能與補(bǔ)體因子B結(jié)合，經(jīng)D因子切割后，代表一種C3轉(zhuǎn)變酶)，人補(bǔ)體因子C3或其部分序列C3b(C3b是人補(bǔ)體因子C3的切割產(chǎn)物，它在功能和結(jié)構(gòu)上與CVF相似)，或者能激活補(bǔ)體或誘導(dǎo)炎癥的細(xì)菌蛋白質(zhì)，例如鼠傷寒沙門氏菌的孔蛋白，金黃色葡萄球菌的聚集因子，革蘭氏陰性細(xì)菌所特有的調(diào)節(jié)蛋白(modulin)，軍團(tuán)菌或乙型流感嗜血桿菌或克雷伯氏桿菌的主要外膜蛋白，或G類鏈球菌的M分子。
激活細(xì)胞靜止因子前體的酶的基因是例如將無活性的前體(前體藥物)裂解為有活性的細(xì)胞靜止因子(藥物)的酶。這種類型的物質(zhì)以及與它們中的每一個(gè)相關(guān)的前體藥物和藥物已由Deonarain等人(英國(guó)癌癥雜志，70,786(1994)),Mullen(藥物療法，63,199(1994))和Harris等人(基因療法，1,170(1994))進(jìn)行了評(píng)述。例如，可使用下列酶之一的DNA序列單純皰疹病毒胸苷激酶，水痘帶狀疤疹病毒胸苷激酶，細(xì)菌硝基還原酶，細(xì)菌β-葡糖醛酸糖苷酶，得自黑麥的植物β-葡糖醛酸糖苷酶，人β-葡糖醛酸酶，人羧肽酶(CB)，例如肥大細(xì)胞CB-A、胰腺CB-B或細(xì)菌羧肽酶，細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶，細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶，人過氧化氫酶或過氧化物酶，磷酸酶，尤其是人堿性磷酸酶，人前列腺酸性磷酸酶或5型酸性磷酸酶，氧化酶，尤其是人賴氨酰氧化酶或人D-氨基酸氧化酶，尤其是人谷胱甘肽過氧化物酶，人嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶或人甲狀腺過氧化物酶，β-半乳糖苷酶或α-半乳糖苷酶。將前體藥物道諾霉素β-D-半乳糖吡喃糖苷轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞靜止因子道諾霉素(daunomycin)時(shí)特別優(yōu)選β-半乳糖苷酶。自身免疫疾病和炎癥的治療自身免疫疾病和炎癥治療的靶細(xì)胞是例如增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞或滑膜細(xì)胞，所用啟動(dòng)子是例如內(nèi)皮細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，或巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞特異性和/或細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，或滑膜細(xì)胞特異性和/或細(xì)胞周期特異性的啟動(dòng)子，所用效應(yīng)物是例如下列基因用于變態(tài)反應(yīng)治療的基因是例如IFNβ,IFNγ,IL-10，針對(duì)IL-4的抗體或抗體片斷，可溶性的IL-4受體，IL-12或TGFβ的基因。
用于預(yù)防移植器官排斥反應(yīng)的基因是例如IL-10,TGFβ，可溶性的IL-1受體，可溶性的IL-2受體，IL-1受體拮抗劑或可溶性IL-6受體的基因。
用于抗體介導(dǎo)的自身免疫疾病的治療的基因是例如TGFβ,IFNα,IFNβ,IFNγ,IL-12，可溶性IL-4受體，可溶性IL-6受體，免疫抑制劑抗體或其含有VH和VL的片斷的基因。
用于細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的治療的基因是例如IL-6,IL-9,IL-10,IL-13,TNFα或TNFβ,IL-13，免疫抑制劑抗體或其含有VH和VL的片斷的基因。
上文已詳細(xì)描述了細(xì)胞增殖抑制劑、細(xì)胞靜止蛋白或細(xì)胞毒性蛋白和可激活細(xì)胞靜止因子前體的酶的基因。
用于關(guān)節(jié)炎治療的基因是例如所表達(dá)的蛋白質(zhì)能直接或間接地抑制如關(guān)節(jié)中的炎癥和/或促進(jìn)關(guān)節(jié)中胞外基質(zhì)(軟骨，結(jié)締組織)的重建的結(jié)構(gòu)基因。
這些結(jié)構(gòu)基因包括例如下述的基因IL-1受體拮抗劑(IL-1-RA)，因?yàn)镮L-1-RA能抑制IL-1α,β的形成；可溶性的IL-1受體，因?yàn)榭扇苄缘腎L-1受體能與IL-1結(jié)合并使其失活；IL-6，因?yàn)镮L-6可使滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增加TIMP和超氧化物的分泌并減少IL-1和TNFα的分泌；可溶性TNF受體，因?yàn)榭扇苄訲NF受體能與TNF結(jié)合并使其失活；IL-4，因?yàn)镮L-4抑制IL-1,TNFα和MMP的形成和分泌；IL-10，因?yàn)镮L-10抑制IL-1,TNFα和MMP的形成和分泌，并增加TIMP的分泌；胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)，因?yàn)镮GF-1刺激胞外基質(zhì)的合成；TGFβ，尤其是TGFβ1和TGFβ2，因?yàn)門GFβ刺激胞外基質(zhì)的合成；超氧化物歧化酶或TIMP，尤其是TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3。血液形成系統(tǒng)的治療血液細(xì)胞形成缺陷之治療的靶細(xì)胞是例如血液形成系統(tǒng)的增殖中的未成熟細(xì)胞或與血液形成細(xì)胞相鄰的基質(zhì)細(xì)胞；所用啟動(dòng)子是例如血液形成細(xì)胞特異性和/或細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子或細(xì)胞非特異性和細(xì)胞周期特異性的啟動(dòng)子，所用效應(yīng)物是例如下列基因用于貧血癥治療的基因是例如促紅細(xì)胞生成素的基因。
用于白細(xì)胞減少癥治療的基因是例如G-CSF,GM-CSF或M-CSF的基因。
用于血小板減少癥治療的基因是例如IL-3，白血病抑制因子(LIF),IL-11或血小板生成素的基因。神經(jīng)系統(tǒng)治療對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療的靶細(xì)胞是例如膠質(zhì)細(xì)胞或增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞，所用啟動(dòng)子是例如膠質(zhì)細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子或內(nèi)皮細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，或細(xì)胞非特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，所用效應(yīng)物是例如下列基因神經(jīng)元生長(zhǎng)因子的基因是例如FGF，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4(NT-4)或睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)的基因。
酶的基因是例如酪氨酸羥化酶或多巴脫羧酶的基因。
細(xì)胞因子及其抑制或中和TNFα之神經(jīng)毒性作用的抑制劑的基因是例如編碼下述的基因TGFβ；可溶性TNF受體，因?yàn)門NF受體可中和TNFα；IL-10，因?yàn)镮L-10可抑制IFNγ、TNFα、IL-2和IL-4的形成；可溶性IL-1受體，如IL-1受體Ⅰ或IL-1受體Ⅱ，因?yàn)榭扇苄訧L-1受體能中和IL-1的活性；IL-1受體拮抗劑或可溶性IL-6受體。血液凝結(jié)和循環(huán)系統(tǒng)的治療血液凝結(jié)和循環(huán)系統(tǒng)障礙的治療的靶細(xì)胞是例如內(nèi)皮細(xì)胞，增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞相鄰的體細(xì)胞；或巨噬細(xì)胞，所用啟動(dòng)子是例如細(xì)胞非特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，或者內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子；所用效應(yīng)物是例如下列基因用于抑制凝結(jié)或促進(jìn)纖溶的基因是例如組織纖溶酶原激活物(tPA)，尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA),tPA和uPA的雜合體，C蛋白，水蛭素，絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)，如C-1S抑制劑，α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶Ⅲ，或組織因子途徑抑制劑(TFPI)的基因。
用于促進(jìn)凝結(jié)的基因是例如F Ⅷ,F Ⅸ,von Willebrand因子，F(xiàn) ⅩⅢ,PAI-1,PAI-2或組織因子及其片斷的基因。
血管生成因子的基因是例如VEGF或FGF的基因。
用于降低血壓的基因是例如激肽釋放酶或內(nèi)皮細(xì)胞“氧化氮合酶”的基因。
用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞層受傷后的平滑肌細(xì)胞增殖的基因是例如抗增殖性、細(xì)胞靜止性或細(xì)胞毒性蛋白的基因，或上文所述的將細(xì)胞靜止因子的前體裂解為細(xì)胞靜止因子的酶的基因，或這些藥物之一與配體(如特異于肌肉細(xì)胞的抗體或抗體片斷)的融合蛋白的基因。
其它血漿蛋白的基因是例如白蛋白、C1滅活劑、血清膽堿酯酶、運(yùn)鐵蛋白或1-抗胰蛋白酶的基因。預(yù)防和/或治療傳染病用于接種的靶細(xì)胞是例如肌肉細(xì)胞或巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞，所用啟動(dòng)子是例如非特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，或靶細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，所用效應(yīng)物是例如可用于預(yù)防傳染病的基因。
選定的活性物質(zhì)一般是蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)是由病原體產(chǎn)生的，并且通過注射可引起免疫應(yīng)答，即通過抗體結(jié)合和/或通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可導(dǎo)致病原體被中和和/或殺死。這種類型的所謂中和性抗原已被用作疫苗抗原(例見Ellis，高等實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)(Adv.Exp.Med.Biol.),327,263(1992))。
本發(fā)明優(yōu)選編碼下列病原體之中和性抗原的核酸甲型流感病毒，HIV，狂犬病毒，HSV(單純皰疹病毒)，RSV(呼吸道合胞病毒)，副流感病毒，輪狀病毒，VZV(水痘帶狀皰疹病毒)，CMV(巨細(xì)胞病毒)，麻疹病毒，HPV(人乳頭狀瘤病毒)，HBV(乙型肝炎病毒)，HCV(丙型肝炎病毒)，HDV(丁型肝炎病毒)，HEV(戊型肝炎病毒)，HAV(甲型肝炎病毒)，霍亂弧菌抗原，布氏疏螺旋體，幽門螺桿菌或瘧疾抗原。
用于本發(fā)明的這種類型的活性物質(zhì)也包括抗獨(dú)特型抗體或其與抗原結(jié)合之片段的DNA，所述抗體的結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)(互補(bǔ)決定區(qū))代表病原體的中和性抗原的多拷貝蛋白質(zhì)或糖類結(jié)構(gòu)(見上文)。
這種類型的抗獨(dú)特型抗體及其裂解產(chǎn)物可特別地代替細(xì)菌病原體的糖類抗原，Hawkins等人(免疫療法雜志，14,273(1993))和Westerink和Apicella(Springer Seminars in Immunopathol,15,227(1993))對(duì)此進(jìn)行了綜述。
其它效應(yīng)物的例子是“腫瘤疫苗”的基因，它們包括腫瘤細(xì)胞上的抗原，Sedlacek等(腫瘤學(xué)成就，32,Karger Verlag,Munich(1988)和腫瘤學(xué)成就，43,Karger Verlag,Munich(1992))對(duì)此也進(jìn)行了綜述。
其它例子是下列抗原或下列抗獨(dú)特型抗體的基因sialyl-Lewis；腫瘤上由T細(xì)胞識(shí)別的肽；癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)；血型抗原及其前體；多形上皮粘蛋白上的抗原；或熱激蛋白上的抗原。
慢性傳染病治療的靶細(xì)胞是例如肝細(xì)胞,淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞，上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，所用啟動(dòng)子是例如病毒特異性或細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，所用效應(yīng)物是例如下列基因編碼具有細(xì)胞靜止效應(yīng)、細(xì)胞編程性死亡效應(yīng)或細(xì)胞毒性效應(yīng)的蛋白質(zhì)或編碼將抗病毒或細(xì)胞毒性物質(zhì)的前體切割為活性物質(zhì)的酶的基因。
已描述了編碼抗病毒蛋白質(zhì)，如有抗病毒活性的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子(如IFNα,IFNβ,IFNγ,TNFβ,TNFα,IL-1或TGFβ)，或具有滅活特定病毒之特異性的抗體或其含有VH和VL的片段或其經(jīng)接頭而連接的VH和VL片段的基因。針對(duì)病毒抗原的抗體的例子是抗HBV、抗HCV、抗HSV、抗HPV、抗HIV、抗EBV、抗HTLV、抗柯薩奇病毒或抗?jié)h坦病毒抗體。
另一種有抗病毒活性的蛋白質(zhì)是rev-結(jié)合蛋白。這些蛋白質(zhì)與revRNA結(jié)合并抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)中依賴于rev的轉(zhuǎn)錄后階段。rev-結(jié)合蛋白的例子是RBP9-27,RBP1-8U,RBP1-8D或RBP1-8的假基因。
編碼抗細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因例如是可中和細(xì)菌毒素或調(diào)理細(xì)菌的抗體的基因。這些抗體的例子是針對(duì)腦膜炎球菌C或B，大腸桿菌，疏螺旋體，假單胞菌，幽門螺桿菌或金黃色葡萄球菌的抗體。
下列圖和實(shí)施例旨在詳細(xì)闡明本發(fā)明，而并非將本發(fā)明局限于此。圖的描述圖1圖解描述了單鏈的雙抗原結(jié)合性分子的結(jié)構(gòu)。
圖2圖解描述了具有效應(yīng)物的單鏈的雙抗原結(jié)合性分子。
圖3和圖5圖解描述了編碼單鏈的雙抗原結(jié)合性分子的核酸構(gòu)建體。
圖4圖解描述了編碼具有效應(yīng)物的單鏈的雙抗原結(jié)合性分子的核酸構(gòu)建體。
圖6顯示出與針對(duì)CEA和大腸桿菌β-半乳糖苷酶的間體(CEAGal)相比，β-半乳糖苷酶通過本發(fā)明的單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白而在結(jié)合于塑料的CEA上的募集(scDb-CEAGal)，用BSA包被一塊微量滴定板以用作陰性對(duì)照。
圖7顯示出由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的scDb-CEAGal對(duì)β-半乳糖苷酶的募集，其中在被CEA包被的微量滴定板上使用了不同量的scDb-CEAGal和β-半乳糖苷酶。所用底物是鄰硝基苯基β-D-半乳糖吡喃糖苷，用BSA包被微量滴定板以用作陰性對(duì)照。
圖8A顯示出LoVo細(xì)胞在本發(fā)明的單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白(scDb),β-半乳糖苷酶(β-Gal)，道諾霉素β-D-半乳糖吡喃糖苷(前體藥物)和/或道諾霉素(藥物)存在下的死亡情況。
圖8B顯示出用CEA陰性細(xì)胞系(A549)進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例實(shí)施例1單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的制備和細(xì)菌表達(dá)以識(shí)別抗原癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和大腸桿菌β-半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)為例來描述單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的制備。
在5’至3’方向上依次將下列DNA序列連接在一起-LacZ啟動(dòng)子-細(xì)菌核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)(AAGGAG)-細(xì)菌信號(hào)序列pelB(Power等，基因，113,95-99(1992))-抗CEA的VH(Kontermann等，免疫技術(shù)，3,137(1997))-接頭GGGS(Kontermann等，(1997))-抗β半乳糖苷酶的VL(Kontermann等，(1997))-連接肽GGGGSGGRASGGGGS-抗β半乳糖苷酶的VH(Kontermann等，(1997))-接頭GGGGS-抗CEA的VL(Kontermann等，(1997))-抗體9E10 EQKLISEEDLN的Myc表位(Munro & Pelham，細(xì)胞，46,291-300(1986))-可用于通過固定化金屬親和層析(IMAC)進(jìn)行純化的多組氨酸HHHHHH(Kontermann等，(1997))通過經(jīng)PCR擴(kuò)增而在各個(gè)DNA序列的末端引入的適當(dāng)限制性位點(diǎn)可以進(jìn)行構(gòu)建體的連接(Kontermann等，免疫技術(shù)，3,137(1997))中。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的特異于限制性位點(diǎn)的酶和DNA連接酶進(jìn)行連接。酶可以商購(gòu)，將構(gòu)建體克隆至細(xì)菌表達(dá)載體pAB1(Kontermann等，(1997))。
使用寡核苷酸引物L(fēng)MB2和LMB3(Kontermann,R.E.(1997)，文獻(xiàn)同上)和VK-NotFor:5′-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGTGCC AGC ACC-3′,scDb-AscBack:5′-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC GGA GGT GGCTCA CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GG-3′,scDb-AscForK:GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC ACC GCCTCC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3′和pelB-Metminus:5′-TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAGGT-3′.進(jìn)行克隆。
為此，使用引物L(fēng)MB2和LMB3擴(kuò)增得自間體CEAGal(Kontermann,R.E.(1997))的片段VHB-VLA(片段1)和VHA-VLB(片段2)并凝膠純化所述片段。然后使用引物VK-NotFor和scDb-AscBack擴(kuò)增片段1以導(dǎo)入一個(gè)AscⅠ位點(diǎn)和7個(gè)氨基酸的接頭。使用引物L(fēng)MB3和scDb-AscForλ擴(kuò)增片段2以導(dǎo)入一個(gè)AscⅠ位點(diǎn)和8個(gè)氨基酸的接頭。用AscⅠ和NotⅠ(片段1)與SfiⅠ和AscⅠ(片段2)水解兩種片段并克隆至細(xì)菌表達(dá)載體pAB1(Kontermann,R.E.(1997))。所得的插入片段編碼一種單鏈多肽，其中VHA-VLB經(jīng)由15個(gè)氨基酸長(zhǎng)、序列為GGGGSGGRASGGGGS的接頭與VHB-VLA連接。
然后將質(zhì)粒插入TG1細(xì)菌，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法培養(yǎng)所述細(xì)菌(Kontermann,R.E.(1997))。
破碎細(xì)菌，通過固定化金屬親和層析(IMAC)(Hochuli等，生物/技術(shù)，6,1321-1325(1988))從壁膜間隙制品中純化單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白，此方法的細(xì)節(jié)由Kontermann等人(1997)作了描述。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠過濾結(jié)果表明純化的蛋白質(zhì)的分子量為60KDa。每升細(xì)菌培養(yǎng)物可以純化出約200至300微克這種分子。在ELISA中，細(xì)菌表達(dá)的單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白能與CEA和β-半乳糖苷酶反應(yīng)，并能將這種酶募集至結(jié)合于塑料的CEA上，通過鄰硝基苯基β-D-半乳糖吡喃糖苷的轉(zhuǎn)變可以說明這一點(diǎn)(圖6)。另外，這種單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白通過募集β-半乳糖苷酶并轉(zhuǎn)變底物5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-Gal)而能對(duì)活的和被固定的表達(dá)CEA的LoVo細(xì)胞進(jìn)行染色。為此，將LoVo細(xì)胞與10μg/ml適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合蛋白，10μg/mlβ-半乳糖苷酶和X-Gal(0.8mg/ml，于PBS,3mM鉀鐵(Ⅲ)氰化物，3mM鉀鐵(Ⅱ)氰化物中)一起保溫。在多種對(duì)照細(xì)胞(A549,HEK293)中或用針對(duì)雞蛋溶菌酶和β-半乳糖苷酶的間體(HELGal；Kontermann等，(1997))未觀察到染色。實(shí)施例2單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的真核細(xì)胞表達(dá)為了在真核細(xì)胞中表達(dá)，將單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的編碼區(qū)克隆至真核表達(dá)載體pSecTagA(Invitrogen)中，其中的細(xì)菌信號(hào)序列已被載體中存在的Ig-κ信號(hào)序列所取代。
為此，使用引物L(fēng)MB2和pelB-Metminus擴(kuò)增單鏈構(gòu)建體，籍此，pelB前導(dǎo)序列中的甲硫氨酸(第21位)被蘇氨酸所取代。接著用SfiⅠ和EcoRⅠ消化并克隆至載體pSecTagA中。成熟的單鏈抗原結(jié)合蛋白在VHA區(qū)域的N末端含有7個(gè)額外的氨基酸(AAQPATA)。
用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco)將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至真核HEK293細(xì)胞中。在zeocin的存在下選擇穩(wěn)定的細(xì)胞。在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中用這些細(xì)胞可以檢測(cè)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER和高爾基體的染色。另外，通過60KDa蛋白質(zhì)從35S-Met標(biāo)記的細(xì)胞的上清液中的免疫沉淀和通過用固定化金屬親和層析(IMAC)進(jìn)行的純化還可能檢測(cè)到單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的分泌。該純化蛋白質(zhì)在與β-半乳糖苷酶和包被有CEA的微量滴定板結(jié)合方面和將β-半乳糖苷酶募集至結(jié)合于塑料的CEA上這一方面是有功能活性的(圖7)。實(shí)施例3通過與分泌單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的細(xì)胞共培養(yǎng)在體外募集酶通過將產(chǎn)生單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的HEK293細(xì)胞與CEA陽(yáng)性的LoVo細(xì)胞共培養(yǎng)而在體外研究募集現(xiàn)象。為此，首先在Transwell細(xì)胞培養(yǎng)皿(Costar)中將產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞與LoVo細(xì)胞一起培養(yǎng)，其中通過膜將兩種細(xì)胞系分隔開。2天后，加入β-半乳糖苷酶(10μg/ml)，再通過加入底物X-Gal檢測(cè)募集現(xiàn)象。在與產(chǎn)生單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的細(xì)胞的共培養(yǎng)物上發(fā)現(xiàn)了特異性的染色，而用未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)未顯示出染色。
其中LoVo細(xì)胞被A549細(xì)胞(CEA陰性)替代的實(shí)驗(yàn)中，和其中產(chǎn)生單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的細(xì)胞與酶和底物一起保溫的實(shí)驗(yàn)中同樣都是負(fù)結(jié)果。后者闡明了僅僅是產(chǎn)生單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的細(xì)胞本身不能結(jié)合酶。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，按1∶4至1∶24的接種比例將分泌單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的HEK293細(xì)胞和LoVo細(xì)胞直接共培養(yǎng)。為了將HEK293細(xì)胞和LoVo細(xì)胞區(qū)分開，加入LoVo細(xì)胞之前用CM-Dil(分子探針)(紅色熒光)將HEK293細(xì)胞染色。2天后，加入β-半乳糖苷酶，再通過加入底物X-Gal(10μg/ml)和用抗β-半乳糖苷酶抗體(Biotrend)直接進(jìn)行免疫熒光術(shù)可檢測(cè)與細(xì)胞的結(jié)合。這些實(shí)驗(yàn)也顯示出酶特異性地被募集至LoVo細(xì)胞，而HEK293細(xì)胞未被染色。用未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)為負(fù)結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)證明單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白能特異性地和選擇性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，研究了無毒性的道諾霉素β-D-半乳糖吡喃糖苷向細(xì)胞毒性的道諾霉素的轉(zhuǎn)變。通過將LoVo細(xì)胞與純化的單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白(10μg/ml)一起保溫1小時(shí)，隨后于37℃與β-半乳糖苷酶(1μg/ml)和道諾霉素β-D-半乳糖吡喃糖苷(2μM)一起保溫1小時(shí)，就有可能通過所得道諾霉素的自身熒光而檢測(cè)到該物質(zhì)在核中的特異性定位，所述熒光比得上因直接與道諾霉素保溫而致的染色。在缺乏單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白或β-半乳糖苷酶時(shí)，和用對(duì)照細(xì)胞(HEK293；產(chǎn)生單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的HEK)時(shí)未檢測(cè)到核染色。這些實(shí)驗(yàn)證明該單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白能將酶募集至腫瘤細(xì)胞，并且該酶可被用于將無毒性的前體轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中此效應(yīng)可被用于特異性地殺死腫瘤細(xì)胞。
為此，在96孔培養(yǎng)板中將LoVo細(xì)胞與一種單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白(10μg/ml)一起保溫，然后于37℃與道諾霉素β-D-半乳糖吡喃糖苷(5μM)一起保溫1小時(shí)。2天后，使用WST試驗(yàn)(Boehringer Mannheim)分析細(xì)胞的死亡情況(圖8)。在這種情況下，前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬飼r(shí)細(xì)胞的死亡情況幾乎和藥物存在時(shí)效果一樣好(圖8A)。在缺乏一個(gè)組分時(shí)或用CEA陰性的A549細(xì)胞基本上未發(fā)現(xiàn)上述效應(yīng)。實(shí)施例4用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白的構(gòu)建體的制備為了在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白，用多個(gè)引物擴(kuò)增單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白基因的DNA-跨膜的單鏈雙抗原結(jié)合性蛋白(TM-scDAP)。對(duì)它使用了能在該基因3’末端插入PDGFR跨膜區(qū)的引物-(LPFKVVVISAIIALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYES)-位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白(ER-scDAP)。對(duì)它使用了能在該基因3’末端插入ER保留信號(hào)(SEKDEL)的引物。-位于細(xì)胞質(zhì)中的單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白(cyto-scDAP)。對(duì)它使用了用最適于翻譯起始的甲硫氨酸和Kozak序列替代基因5’末端信號(hào)序列的引物。-位于核中的單鏈的雙抗原結(jié)合性蛋白(nuc-scDb)。對(duì)它使用了用最適于翻譯起始的甲硫氨酸和Kozak序列替代基因5’末端信號(hào)序列、并在基因3’末端插入核定位序列(PKKKRKVGGGT；下劃線的是核定位序列)的引物。
將這些片段克隆至適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)載體(pSecTagA和pcDNA3；Invitrogen)中。然后將所得構(gòu)建體(TM-scDAP,ER-scDAP,cyto-scDAP,nuc-scDAP和sec-scDAP(=分泌的蛋白質(zhì)；見實(shí)施例2))瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞(3T3)中，通過使用抗Myc表位的抗體進(jìn)行免疫熒光分析來研究所表達(dá)的蛋白質(zhì)的定位。在構(gòu)建體sec-scDAP,ER-scDAP和TM-scDAP中可檢測(cè)到分泌途徑典型的染色，而cyto-scDAP顯示出在細(xì)胞質(zhì)中的擴(kuò)散定位，nuc-scDAP顯示出定位于核中。
權(quán)利要求
1．單鏈的多抗原結(jié)合性分子，所述分子含有下列組分a)具有第一特異性(A)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)及其功能性部分，b)具有第二特異性(B)的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)及其功能性部分，c)具有特異性(B)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)及其功能性部分，和d)具有特異性(A)的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)及其功能性部分，其中VH和VL區(qū)域以VH-VL構(gòu)建體或VL-VH構(gòu)建體的形式連接在一起，而這兩個(gè)VH-VL構(gòu)建體經(jīng)由肽(P)連接。
2．權(quán)利要求1的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，所述分子含有兩個(gè)以上VH-VL構(gòu)建體。
3．權(quán)利要求1或2的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中VH-VL構(gòu)建體經(jīng)由具有相同特異性的區(qū)域而連接。
4．權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中特異性(A)和(B)基本上相同。
5．權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中通過肽接頭(L)以VH-L-VL構(gòu)建體或VL-L-VH構(gòu)建體的形式連接VH和VL區(qū)域。
6．權(quán)利要求5的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中接頭(L)長(zhǎng)約為1-20個(gè)氨基酸，優(yōu)選約為1-5個(gè)氨基酸。
7．權(quán)利要求5的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中接頭(L)含有氨基酸序列GGGGS。
8．權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中肽(P)約為12-40個(gè)氨基酸，優(yōu)選約為12-20個(gè)氨基酸，特別是約14個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
9．權(quán)利要求8的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中肽(P)含有氨基酸序列GGGGSGGRASGGGS或GGGGSGGRASGGGGS。
10．權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中所述分子含有一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)物(E)作為另外的組分。
11．權(quán)利要求10的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中所述效應(yīng)物(E)是經(jīng)由連接物(B)與所述分子連接。
12．權(quán)利要求11的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中連接物(B)含有一個(gè)蛋白酶切割序列，優(yōu)選含有PSA、組織蛋白酶、纖溶酶原和/或纖溶酶原激活物切割序列。
13．權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中第一特異性(A)針對(duì)待分析的分子，第二特異性(B)針對(duì)分析物。
14．權(quán)利要求13的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中所述分析物是一種放射性分子，熒光分子和/或酶。
15．權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中第一特異性(A)針對(duì)待分析的分子，第二特異性(B)針對(duì)待分析的另一分子，效應(yīng)物(E)是一種分析物。
16．權(quán)利要求15的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中所述分析物是放射性分子，熒光分子和/或酶。
17．權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中肽(P)和/或效應(yīng)物(E)含有融合肽。
18．權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中第一特異性(A)針對(duì)靶細(xì)胞，第二特異性(B)針對(duì)載體。
19．權(quán)利要求18的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中所述載體是核酸，陽(yáng)離子肽或蛋白質(zhì)，陽(yáng)離子脂質(zhì)，陽(yáng)離子聚合物，陽(yáng)離子卟啉或選自AdV、AAV、痘苗病毒、RSV、HSV、流感病毒或慢病毒載體的病毒載體。
20．權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中第一特異性(A)針對(duì)細(xì)胞膜，特別是針對(duì)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、支持組織的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜，或針對(duì)胞外基質(zhì)、補(bǔ)體系統(tǒng)、凝結(jié)系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、血漿、支持組織的蛋白質(zhì)，或針對(duì)細(xì)胞因子或趨化因子，或針對(duì)內(nèi)源或外源毒素，或針對(duì)藥物，特別是毛地黃，和/或針對(duì)病原體，特別是例如細(xì)菌，病毒和/或寄生蟲病原體。
21．權(quán)利要求1至12和20中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中第二特異性(B)是針對(duì)細(xì)胞膜，特別是針對(duì)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞或粒細(xì)胞的細(xì)胞膜，針對(duì)細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子，針對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，針對(duì)凝結(jié)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，針對(duì)纖溶蛋白，針對(duì)能將靶結(jié)構(gòu)上無活性的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?、特別是有細(xì)胞毒性的藥物的酶，針對(duì)肽激素或類固醇激素，針對(duì)免疫球蛋白的恒定部分，針對(duì)介體，特別是例如組胺、5-羥色胺、白三烯、前列環(huán)素或激肽，針對(duì)病原體，針對(duì)腫瘤細(xì)胞，針對(duì)內(nèi)源性或外源性毒素，針對(duì)藥物，特別是毛地黃。
22．權(quán)利要求1至12、20和21中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，其中效應(yīng)物(E)選自跨膜區(qū)域，糖磷脂錨，受體上的與配體結(jié)合的部分；受體的配體或配體的與受體結(jié)合的部分；肽激素；細(xì)胞因子；生長(zhǎng)因子；生長(zhǎng)因子抑制劑；趨化因子；干擾素；介體；對(duì)循環(huán)起作用的肽；將藥物的無活性前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚运幬锏拿福患せ罨蛞种颇Y(jié)的蛋白質(zhì)；激活或抑制纖溶作用的蛋白質(zhì)；激活或抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)；免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)；細(xì)胞毒性肽，另一種單鏈的單抗原或多抗原、尤其是雙抗原結(jié)合性分子；腫瘤抗原或病原體抗原，如細(xì)菌抗原或病毒抗原；含有半胱氨酸的肽；和/或二聚體化或多聚體化的肽。
23．編碼權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子的核酸。
24．權(quán)利要求23的核酸，其中所述核酸在其5’末端含有編碼信號(hào)或跨膜序列的核苷酸序列。
25．權(quán)利要求23或24的核酸，其中所述核酸在其5’末端含有啟動(dòng)子和/或激活子。
26．權(quán)利要求25的核酸，其中激活子可被細(xì)胞特異性地、細(xì)胞周期特異性地、代謝特異性地和/或被藥物激活或抑制。
27．權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸在其起始密碼子5’末端含有序列GCCACC或GCCGCC。
28．含有權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的核酸的載體。
29．權(quán)利要求28的載體，其中所述載體是病毒或非病毒載體。
30．權(quán)利要求29的載體，其中所述非病毒載體選自陽(yáng)離子脂質(zhì)、陽(yáng)離子聚合物，陽(yáng)離子肽或陽(yáng)離子卟啉。
31．含有權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求28或29的載體的細(xì)胞。
32．權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中細(xì)胞是細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
33．權(quán)利要求32的細(xì)胞，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌或橫紋肌細(xì)胞，或成纖維細(xì)胞。
34．制備單鏈的多抗原結(jié)合性分子的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求31或32的細(xì)胞并適當(dāng)?shù)胤蛛x表達(dá)產(chǎn)物。
35．含有權(quán)利要求1至12和17至22中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子、權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的核酸、權(quán)利要求28至30中任一項(xiàng)的載體或權(quán)利要求31至33中任一項(xiàng)的細(xì)胞的藥物。
36．含有權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子的診斷輔助物。
37．權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的單鏈的多抗原結(jié)合性分子，權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的核酸，權(quán)利要求28至30中任一項(xiàng)的載體或權(quán)利要求31至33中任一項(xiàng)的細(xì)胞用于治療、預(yù)防或診斷癌癥、自身免疫疾病、炎性疾病、血液病，尤其是血液凝結(jié)和/或循環(huán)系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng)障礙和/或傳染病的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及單鏈的多抗原結(jié)合性分子,所述分子具有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的多變區(qū),所述區(qū)域以VH－VL構(gòu)建體的形式相互連接,它們又通過肽而連接在一起,本發(fā)明還涉及所述分子的制備及其作為藥物或診斷輔助物的用途。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1234406SQ99104958
公開日1999年11月10日 申請(qǐng)日期1999年4月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月9日
發(fā)明者R·科特曼, H－H·薩德拉克, R·穆勒 申請(qǐng)人:德國(guó)赫徹斯特馬里奧羅塞爾有限公司