專利名稱：一種免疫抑制藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由雷公藤多甙和白芍總甙組合成的主要用于自身免疫性疾病和器官移植排斥反應(yīng)的治療藥物。
目前臨床常用的植物提取的免疫抑制劑為雷公藤多甙(GTW),GTW對自身免疫性疾病、過敏性疾病及器官移植后的排異反應(yīng)均有顯著療效。但是GTW存在的嚴(yán)重缺陷是對消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和骨髓造血系統(tǒng)均有不同程度的毒副作用，并有致死的報道。GTW的毒副作用與治療效果都隨服用劑量的增加而增強。而如何保持或增強雷公藤的療效，并且減少其使用劑量和降低毒副作用是個一直未能解決的難題。白芍總甙(TGP)具有雙向調(diào)節(jié)免疫功能的作用，在高劑量時具有免疫抑制作用，而在低劑量時主要表現(xiàn)為免疫增強作用，在臨床上具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的功能，大劑量對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效果，且安全低毒，在改善疾病癥狀的同時尚能糾正病人的一般狀況。因而，TGP對免疫應(yīng)答的作用特點和臨床應(yīng)用的情況均與GTW有很大差異，但又存在著作用的互補性。并且，二者免疫應(yīng)答的作用部位、作用環(huán)節(jié)和性質(zhì)也各有特點。與本發(fā)明相同的組合物目前尚未見有報導(dǎo)。
本發(fā)明的主要目的是，將TGP與GTW進行組合，提供一種較單純GTW治療作用強，且毒副作用小的免疫抑制藥物。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟體內(nèi)實驗時，將雷公藤多甙片研為粉末，溶于1％羧甲基纖維素中成混懸液；白芍總甙(TGP)由中藥白芍提取，其中芍藥甙含量不低于350μg/mg,TGP用生理鹽水直接配制；合并組藥物在動物給藥前按1∶5～10充分混合即可。給藥體積為0.2ml/kg。對照組灌服等量的生理鹽水。體外實驗時，雷公藤多甙的制備是用少許蒸餾水崩解藥片，然后加入乙酸乙酯萃取三次，去除乙酸乙酯，使用時加少許Tween-80助溶后用完全RPMI-1640稀釋，微孔濾膜過濾后-20℃冰箱保存，使用時用含10％FCS的RPMI-1640稀釋。TGP直接用完全1640液配制，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實驗研究證明，雷公藤多甙和白芍總甙結(jié)合物的免疫抑制作用明顯比其單獨成分的作用強，即二者有協(xié)同抑制機體免疫應(yīng)答的作用，而無毒副作用方面的協(xié)同作用。主要的藥理實驗結(jié)果包括1．TGP與小劑量的GTW體內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制整體免疫應(yīng)答的作用，其作用效果超過它們被單獨應(yīng)用時的效應(yīng)。具體實驗為1.1GTW和TGP二者合用對小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)的抑制作用DTH是由致敏的淋巴細(xì)胞與抗原特異反應(yīng)而引起的組織損傷，其反應(yīng)原理是遲發(fā)型過敏反應(yīng)細(xì)胞與抗原結(jié)合，引起相應(yīng)特異細(xì)胞活化，釋放出多種淋巴因子，導(dǎo)致局部組織以單核細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)。2,4-二硝基氯苯(DNCB)是一種半抗原，可與機體的蛋白質(zhì)載體結(jié)合成完全抗原誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生皮膚的DTH反應(yīng)。TGP和小劑量GTW口服七天對正常小鼠DTH均有一定抑制作用，但效能較弱。而小劑量的GTW和TGP合用的效果明顯增強，超過大劑量GTW的作用強度。結(jié)果見表1。
表1GTW,TGP及其二者合用對BALB/c小鼠DTH的影響
結(jié)果由均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本數(shù)=10，與對照組比較，*P＜0.05,**P＜0.01與GTW(10mg/kg)組比較，a∶P＜0.05。
1.2GTW和TGP及其二者合用對小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞(PFC)的影響結(jié)果見表2，一定劑量的GTW和TGP對小鼠特異性抗體產(chǎn)生細(xì)胞均有抑制作用，而小劑量GTW和TGP合用則可明顯抑制PFC，與大劑量的GTW效果一致。
表2GTW,TGP及其合用對脾臟細(xì)胞PFC數(shù)量的影響
結(jié)果由均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本數(shù)=10，與對照組相比，*P＜0.05,**P＜0.01。
1.3GTW和TGP及其二者合用對同種異體皮膚移植排斥反應(yīng)的影響B(tài)ALB/c小鼠分為5組，即對照組、GTW小劑量組(10mg/kg)、GTW大劑量組(30mg/kg)、TGP組(50mg/kg)和藥物協(xié)同治療組(GTW10mg/kg+TGP50mg/kg)。于移皮前5天開始口服給藥，每日一次，直至皮膚被排斥死亡。第6天進行皮膚移植手術(shù)。結(jié)果顯示GTW30mg劑量組皮膚存活期延長62.96％，小劑量GTW組和TGP組的皮膚存活期與對照組無顯著差異(P＞0.05)。但二者組合后可明顯抑制移植排斥反應(yīng)，協(xié)同治療組的皮膚存活期延長56.79％，基本接近大劑量GTW組的效果，但均不能完全防止移植物的排斥反應(yīng)，使其長期存活，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明單獨GTW和TGP的抑制移植排斥反應(yīng)的作用有限，通過聯(lián)合使用TGP等不同的藥物，可提高GTW對移植排斥的抑制作用。
表3GTW和TGP及其二者合用對小鼠同種異體皮膚移植C57BL/6→BALB/c排斥反應(yīng)的影響
與對照組相比，**P＜0.01。
1.4GTW和TGP及其二者合用對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響B(tài)ALB/c小鼠口服給藥，每日一次，連續(xù)7天。于第8天取脾臟制備細(xì)胞懸液分別測定其對有絲分裂原ConA和LPS刺激的增殖反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GTW和TGP對ConA和LPS刺激的淋巴細(xì)胞增殖均有較明顯的抑制作用，GTW的作用以大劑量組的效果更加顯著，小劑量GTW(10mg/kg)和TGP合用(50mg/kg)后其抑制作用與大劑量GTW相近，見表4。
表4GTW,TGP及其組合在體內(nèi)對淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響
結(jié)果由均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本數(shù)=10，與GTW組比較，a∶P＜0.05，*與對照組比較，*P＜0.05,**P＜0.01。
1.5GTW,TGP及其二者組合對混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)(MLR)的作用MLR是T淋巴細(xì)胞對同種異體細(xì)胞的主要組織相溶性(MHC)抗原的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，相當(dāng)于移植排斥反應(yīng)的體外模型。本發(fā)明用BALB/c(H-2d)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠的脾臟細(xì)胞測定雙向和單向MLR。發(fā)現(xiàn)GTW可明顯抑制MLR，其作用呈劑量依賴性小劑量TGP對MLR無明顯作用，但25-50μg/ml的TGP對MLR有一定的抑制作用。GTW與TGP(25μg/ml)合用時對MLR的抑制作用顯著增強，結(jié)果見表5。表明GTW與TGP合用對MLR有協(xié)同抑制作用。
表5GTW,TGP及其組合在體內(nèi)對混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)的抑制作用
n=3，與對照相比，*P＜0.05,**P＜0.01；與相應(yīng)的GTW劑量相比，a∶P＜0.05,b∶P＜0.01。
2．GTW,TGP及其二者合用對骨髓造血功能的影響GTW對骨髓造血系統(tǒng)有一定的毒性作用，因而在研究GTW和TGP免疫藥理的同時，觀察了它們對造血系統(tǒng)的作用，以了解它們在協(xié)同抑制免疫應(yīng)答功能的同時是否對造血系統(tǒng)的毒性作用也有相應(yīng)的增強趨勢。
GTW,TGP及其二者組合在體內(nèi)應(yīng)用對脾臟集落CFU-S形成的作用脾臟集落CFU-S是體內(nèi)檢測髓系干細(xì)胞數(shù)目的指標(biāo)，CFU-S可進一步分化為紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞。將LACA小鼠用850Rad的60Coγ射線照射，在4hr之內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸注同品系小鼠的骨髓細(xì)胞5×104/鼠，隨機分組給藥，連續(xù)7天。實驗結(jié)果表明在本研究的劑量范圍內(nèi)，小劑量GTW和TGP及二者合用組均未見對CFU-S數(shù)有明顯影響，但GTW在大劑量時對CFU-S有減少作用(P＜0.05)。TGP與小劑量和大劑量GTW合用的結(jié)果與單獨GTW組的結(jié)果無明顯變化，提示TGP對GTW體內(nèi)抑制造血系統(tǒng)髓系干細(xì)胞的作用無明顯影響。
表6GTW和TGP及其二者合用對小鼠脾臟CFU-S的影響
結(jié)果由均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本數(shù)=5，與對照組相比，*P＜0.05。
3．GTW和TGP合用對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的防治作用實驗性變自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)是一種由中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘自身抗原堿性蛋白(MBP)與福氏完全佐劑一起皮下注射于實驗動物而誘發(fā)的一種自身免疫病模型，其疾病的本質(zhì)是由CD4+自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)產(chǎn)生的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，由于在癥狀表現(xiàn)，病理特征和發(fā)病機制等方面與人類自身免疫性疾病一多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)極為相似，而被公認(rèn)為是MS的極為理想的實驗動物模型，本發(fā)明應(yīng)用這一模型觀察了GTW和TGP及其合用對EAE的預(yù)防和治療作用。主要結(jié)果如下3.1GTW,TGP及其合用對大鼠EAE發(fā)病的預(yù)防作用用CFA-GPSCH免疫Wistar大鼠誘導(dǎo)EAE，動物隨機分為5組，每組9只，于誘導(dǎo)當(dāng)日開始口服給藥，每天1次，連續(xù)7天，每日定時觀察動物，記錄結(jié)果。實驗結(jié)果表明GTW15mg/kg,30mg/kg,TGP50mg/kg,GTW+TGP(15mg/kg+50mg/kg)均有預(yù)防EAE發(fā)病的作用，發(fā)病動物數(shù)減少，發(fā)病時間延遲，病情減輕。其中以大劑量GTW組及小劑量GTW和TGP合用的效果最好，二者的作用效果基本相同。結(jié)果見表7。
表7GTW,TGP及其合用對大鼠EAE的預(yù)防作用
與對照組相比，*P＜0.05,**P＜0.01，樣本數(shù)=93.2GTW,TGP及其合用對大鼠EAE的治療作用免疫誘導(dǎo)動物EAE的大鼠開始出現(xiàn)癥狀后，將所有動物隨機分組，灌胃給藥，進行治療，連續(xù)7天，并每日觀察記錄動物病情，直至癥狀消失，結(jié)果見表8。GTW和TGP能使大鼠的EAE癥狀明顯減輕，病程也明顯縮短，大劑量GTW的作用最明顯，TGP與小劑量GTW合用的效果基本與大劑量GTW相同。
表8GTW,TGP及其合用對Wistar大鼠的治療作用
與對照組相比，*P＜0.05,**P＜0.01。
3.3GTW,TGP及其合用對EAE大鼠特異性免疫應(yīng)答的作用由于EAE是由CD4+Th1細(xì)胞介導(dǎo)的一種CNS器官特異性的自身免疫性疾病，對CNS髓鞘堿性蛋白(MBP)抗原特異性的自身反應(yīng)性T細(xì)胞在EAE疾病的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，是EAE發(fā)生的主要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，因而，研究藥物對自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的作用，對探討藥物治療自身免疫病的機理有重要價值。本發(fā)明研究了GTW,TGP及其二者組合體內(nèi)給藥對MBP刺激的EAE大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的整體作用。動物分組及給藥方式同3.1項。于免疫誘導(dǎo)EAE后第20天處死動物，取脾臟淋巴細(xì)胞測定其對MBP刺激的增殖反應(yīng)，結(jié)果見表9。
表9GTW,TGP及其合用體內(nèi)給藥對MBP刺激的EAE大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響
與正常對照組相比，*P＜0.01，與EAE對照組相比，**P＜0.01，樣本數(shù)=9。
本發(fā)明的優(yōu)點是效果肯定，可明顯降低雷公藤的毒副作用，但不降低其療效，部分解決了雷公藤在臨床運用中主要面臨的難題，藥物來源方便、易得，治療方法簡便，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，運用現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)方法和手段創(chuàng)造性地研究得到的一個較為理想的免疫抑制劑。
權(quán)利要求
1．一種免疫抑制藥物，其特征是將預(yù)先配制好的雷公藤多甙(GTW)和白芍總甙(TGP)按比例混合，通過體內(nèi)外途徑給藥，可治療自身免疫病和防治器官移植排斥反應(yīng)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫抑制藥物，其特征在于體外給藥時，將GTW用乙酸乙酯萃取三次，除去乙酸乙酯，加少量助溶劑溶解，用RPMI-1640稀釋過濾，TGP直接用RPMI-1640配制，均在-20℃下保存。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫抑制藥物，其特征在于體內(nèi)給藥時，將GTW溶解于1％羧甲基纖維素中成混懸液；TGP直接用生理鹽水配制。
4．根據(jù)權(quán)利要求1,2或3所述的免疫抑制藥物，其特征在于雷公藤多甙和白芍總甙組合的適合重量比例為1∶5～10。
5．根據(jù)權(quán)利要求1,2,3或4所述的免疫抑制藥物，其特征在于采用CFA-GPSCH免疫Wistar大鼠誘導(dǎo)實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型給藥，可觀察到大劑量GTW組及小劑量GTW與TGP組合給藥效果最佳；采用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)(MLR)作為移植排斥反應(yīng)體外模型，可觀察到隨GTW劑量增加，其抑制MLR的作用明顯增強的結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫抑制類新藥,按照一定比例配制雷公藤多甙和白芍總甙,體內(nèi)外實驗證實,不僅它的免疫抑制效果明顯優(yōu)于單純的雷公藤多甙和白芍總甙,而且其毒副作用也明顯減輕,對自身免疫性疾病和器官移植后的免疫排斥反應(yīng)都有明顯的防治作用。
文檔編號A61K31/70GK1236617SQ9910618
公開日1999年12月1日 申請日期1999年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月10日
發(fā)明者肖培根, 馮璞, 曹麗, 卞慶亞, 羅崇念 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所