專利名稱：高效廣譜抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的新型抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和抗體工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一類能夠特異識別大多數(shù)常見的人體腫瘤新生血管并抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的新型抗體。
癌癥是當(dāng)前危害人類生命健康的頭號殺手。我國每年惡性腫瘤的發(fā)病人數(shù)約160萬。死于癌癥者占死亡總?cè)藬?shù)的20％以上，居城市居民死亡原因的第一位(根據(jù)1996年統(tǒng)計資料)。
在腫瘤三大常規(guī)(放療，化療和手術(shù)>治療中，藥物治療是一個重要方面。目前影響腫瘤藥物治療效果的因素是多方面的，包括藥物的特異性、運輸方式、滲透性以及誘發(fā)腫瘤耐藥性。其中藥物的特異性和耐藥性是腫瘤治療學(xué)急需解決的關(guān)鍵問題。
本發(fā)明的特色在于它是一類腫瘤特異的、廣譜的、無或低耐藥性的新型抗癌藥物。本發(fā)明所采取的策略是通過阻斷腫瘤細胞的生命線-營養(yǎng)和血液供應(yīng)，從而使腫瘤細胞缺血壞死。這種抗癌新策略是基于兩點理論①腫瘤依賴于血管而生長的理論。②腫瘤新生血管既不象腫瘤細胞那樣缺乏遺傳穩(wěn)定性，又不同于正常血管。正常血管內(nèi)皮的更新需要100多天，而腫瘤血管僅需數(shù)天，且?guī)в幸恍┱Ｑ軆?nèi)皮所沒有的新標(biāo)志物。這些腫瘤血管特有的標(biāo)志物是腫瘤藥物篩選的新的靶標(biāo)。
本發(fā)明與傳統(tǒng)的抗腫瘤抗體相比，其特點在于廣譜、特異、高效、不易產(chǎn)生耐藥性。作用機理如下，①腫瘤血管內(nèi)皮細胞相對比較穩(wěn)定，突變少，因而不會象腫瘤細胞那樣易于產(chǎn)生耐藥性；②不同類型實體瘤的特異靶分子不同，而它們賴以生存的新生血管結(jié)構(gòu)大致相同，因此抗腫瘤新生血管抗體具有廣譜性；③成千上萬個腫瘤細胞依賴于一條毛細血管獲取氧和營養(yǎng)物質(zhì)，即使少量藥物對于血管的不完全破壞，亦會造成血栓形成，導(dǎo)致大量腫瘤細胞缺血死亡。因此，本發(fā)明用藥量少，效率高；④腫瘤血管藥物直接作用于血管內(nèi)皮，無需穿透到腫瘤深部，避免了腫瘤組織局部高壓所引起的藥物滲透和分布問題。
通過文獻和IBM專利數(shù)據(jù)庫查詢新生血管抑制劑(angiogenesisinhibitor)和新生血管抗體(angiogenesis antibody)，未見與本發(fā)明有關(guān)的文獻和專利發(fā)表。
本發(fā)明涉及一類作用于人體腫瘤血管的新型抗體，包括鼠單克隆抗體AA98和人-鼠嵌合抗體chiAA98以及小分子功能抗體AA98-Fab和AA98-scFv，它們作用于各種腫瘤血管，包括肝癌，胃癌，大腸癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌及平滑肌肉瘤，而對正常組織幾乎不發(fā)生任何反應(yīng)。單克隆抗體本身或抗體結(jié)合物均具有抑制多種人體腫瘤生長的作用。
本發(fā)明與其它抗體比較，具有獨特的優(yōu)點第一，特異抗體識別腫瘤組織而非正常組織，這種高度特異性將在臨床應(yīng)用中大大減少藥物的毒付作用。第二，廣譜不同類型實體瘤細胞含有不同的特異抗原，如乳腺癌抗原不同與結(jié)腸癌抗原；但是腫瘤生長都需要刺激周圍新生血管形成以提供腫瘤瘋狂生長的營養(yǎng)。雖然腫瘤組織不同，而腫瘤刺激增生的新生血管都具有一些共同的特征，本發(fā)明就是針對這些共同特征而研制的，因此它的抗癌作用是廣譜的。第三，高效抗體可根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點分為五類，大多數(shù)僅具有識別功能，少數(shù)不僅具有識別功能還具有殺傷作用。本發(fā)明單克隆抗體屬于IgG2a亞型，是一種罕見的殺傷性抗體。它本身即可單獨殺死癌細胞，其作用機理是由于某些抗體在人體效應(yīng)細胞和血清存在下，具有誘發(fā)抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)和補體依賴性細胞毒作用(CDC)，從而殺死腫瘤細胞。第四，抗體對腫瘤新生血管的高度選擇性是由于它們所識別的靶抗原特異分布于新生血管內(nèi)皮，參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。第五，抗體及其結(jié)合物是一類具有廣譜、高效、低毒、低耐藥性的新型抗腫瘤藥物。第六，抗體可用于腫瘤的診斷及定位，通過體內(nèi)外方法檢測癌癥。第七，抗體作為一種良好的研究工具，用于研究新生血管形成及其與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的相互作用。
本發(fā)明在技術(shù)路線方面的創(chuàng)新之處在于①采用腫瘤細胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，使其成為增殖的血管內(nèi)皮細胞。后者用于免疫小鼠獲得單克隆抗體AA98。這種新方法不僅提高了增生血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志的豐度，維持了細胞膜抗原的天然構(gòu)象，而且還可以發(fā)現(xiàn)新的靶分子。②利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和抗體工程技術(shù)，研制出各種不同結(jié)構(gòu)形式的基因工程抗體。這些抗體比原代鼠單克隆抗體具有更大的應(yīng)用價值，主要表現(xiàn)在免疫源性較低、毒副作用??；易于與其它功能分子結(jié)合形成高效的免疫復(fù)合物；抗體基因易于保存并有利于進行抗體結(jié)構(gòu)與功能的改造，以更好地適應(yīng)于臨床應(yīng)用。
本發(fā)明包括一套識別腫瘤血管的單克隆抗體及基因工程抗體，后者包括嵌合抗體，抗體Fab和單鏈抗體。其中單克隆抗體及嵌合抗體都具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)活性，這是它們體內(nèi)抗癌作用的基礎(chǔ)。這些抗體本身就具有治療作用。而抗體Fab和單鏈抗體在體內(nèi)不顯示ADCC和CDC活性，可用于載體，連接化療藥物、毒素、細胞因子、酶和放射性同位素。因此，這些小分子抗體可作為各種免疫結(jié)合物的成分之一，用于腫瘤的診斷和治療。
為了更全面地理解和應(yīng)用本發(fā)明，提供下列實施例。
實施例一單克隆抗體AA98的制備和鑒定應(yīng)用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體AA98(Kohler and Milstein,Nature2 56:495,1975；Yeh et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1979；Yeh etal.,Int.J.Cancer,1982)。簡述如下采用肝癌細胞的培養(yǎng)上清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增生，以增生的HUVEC作為免疫原對BALB/C小鼠進行五次免疫接種。每次接種部位為腹膜內(nèi)注射和皮下注射。每次注射的細胞總數(shù)大約為107。在最后一次免疫接種三天后，取脾臟，并將脾細胞懸浮于RPMI培養(yǎng)基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，將脾細胞和P3-X63-Ag8.635鼠骨髓瘤細胞進行融合，并用HAT選擇性培養(yǎng)基對雜交瘤進行篩選。
運用Douillard,et al.,Enzyme-linked Immunosorbent Assay forScreening monoclonal antibody production using enzyme-labeledsecond antibody,Meth.Enzymol,.92:168-74,1983介紹的方法，將細胞接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)過夜。用新鮮配置的0.5％的戊二醛固定細胞15分鐘，用PBS洗三遍。加入牛血清白蛋白封閉1小時。然后先后加入分泌抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清，酶標(biāo)抗體和底物。通過ELISA反復(fù)篩選，最后獲得與增生HUVEC發(fā)生特異反應(yīng)的高親和力的抗體。
用稀釋法多次克隆分泌特異抗體AA98的雜交瘤細胞HE2A5。大量培養(yǎng)擴增雜交瘤細胞HE2A5，收集含有抗體AA98的培養(yǎng)上清用于抗體功能鑒定。另外將雜交瘤細胞HE2A5制成細胞懸液，用于制備抗體腹水。
腹水的制備方法簡述如下六周齡BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Pri stane)0.5ml/只。10天后，將雜交瘤細胞懸液接種于BALB/C小鼠腹腔，1×107/ml/只，十天后，收集腹水，離心取上清。
通過蛋白A親和層析，從培養(yǎng)上清或腹水中純化單克隆抗體。將純化單克隆抗體無菌過濾，并冷藏或冷凍保存。
應(yīng)用Zymed公司抗體亞型鑒定試劑盒，ELISA方法鑒定出抗體AA98屬于IgG同型抗體。
利用冷凍組織切片和免疫組化方法(Immunology Methods Manual,Edited by Ivan Lefkovits,1997)鑒定抗體AA98與人體正常組織和腫瘤組織的反應(yīng)，結(jié)果表明抗體AA98與許多腫瘤組織的微血管高特異反應(yīng)，而與正常組織的反應(yīng)十分有限。表1反應(yīng)了抗體AA98對各種腫瘤組織和正常組織的免疫組化染色情況。在免疫組化切片上，清楚可見抗體只對腫瘤組織中的微小血管反應(yīng)，而不與大中血管和正常組織中的血管反應(yīng)。
表1免疫組化鑒定抗體AA98與人體正常組織和腫瘤組織中新生血管的反應(yīng)
采用FACS細胞分類器分析單克隆抗體及其Fab對各種細胞系的結(jié)合活性。將1×106培養(yǎng)細胞懸浮在100μl含10μg/ml抗體AA98的培養(yǎng)基中，浮育1小時。用培養(yǎng)基洗三遍，加入培養(yǎng)液稀釋的FITC-羊抗鼠IgG抗體，浮育45分鐘。洗三遍后，將細胞重新懸浮在200μl-500μlPBS中。在FACS上進行免疫熒光分析并測定平均熒光密度。實驗結(jié)果表明抗體AA98能夠特異結(jié)合增殖的血管內(nèi)皮細胞。
采用MTT方法研究抗體AA98對靶細胞的天然細胞毒作用及補體介導(dǎo)的細胞毒作用。在實驗中觀察到了意想不到的結(jié)果，既抗體AA98不僅具有補體介導(dǎo)的細胞毒作用，而且在未加任何修飾的情況下，抗體本身能夠單獨殺傷靶細胞，其殺傷率隨抗體劑量的增大而增強。加入補體后殺傷效率進一步提高。實驗結(jié)果歸納于表2。
表2．抗體AA98對增生血管內(nèi)皮細胞的殺傷效應(yīng)殺傷率(％)抗體劑量(μg/ml)抗體抗體+補體 補體1.0 4.8351.42 0.0010.015.72 50.76 0.00100.0 35.32 58.33 0.00動物實驗表明，抗體AA98單獨使用或標(biāo)記同位素131I，均能夠抑制人體多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。下面舉例說明抗體AA98在未加任何修飾的情況下抑制人胰腺癌生長的實驗結(jié)果。
荷人胰腺癌(中分化導(dǎo)管腺癌Fwk-3)的BALB/C-NU小鼠40只，給藥前平均瘤體積為130mm3，隨機分組。(1)抗體AA98,(4)人IgG,(5)未治療組。腹腔注射給藥，每周給藥兩次。每三天測量腫瘤最長、最短直徑，依公式(瘤體積=(短徑2×長徑)×π/6)計算腫瘤體積。依下面公式計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率(％)=(1-治療組瘤體積/非治療組瘤體積)×100％。觀察結(jié)果如

圖1所示。
實施例二人-鼠嵌合抗體chiAA98的制備由于鼠單克隆抗體在人體免疫系統(tǒng)中缺乏生物效應(yīng)功能，同時還被識別為外來物質(zhì)，誘發(fā)機體的免疫排斥反應(yīng)，因而不適用于人體治療。為了克服這一缺點。本發(fā)明采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研制出了人/鼠嵌合抗體chiAA98。該抗體的可變區(qū)(抗原結(jié)合區(qū))來自鼠源蛋白(占抗體分子的1/3)，其他不變區(qū)來自人IgG(占抗體分子的2/3)。這種抗體保持了鼠單抗結(jié)合抗原的特異性，能夠競爭抑制單克隆抗體AA98與其靶抗原的結(jié)合；而且降低了抗體分子中的鼠源成分，增加了抗體的生物學(xué)效應(yīng)功能。研制嵌合抗體的操作步驟如下1)從雜交瘤細胞HE2A5中分離純化mRNA，合成第一鏈cDNA；2)設(shè)計引物輕鏈可變區(qū)5’gg tct aga gag ctc gtg atg aca 3’(23mer)和5’at gga tcc agc ccg ttt tat ttc c 3’(24mer)；重鏈可變區(qū)5’ccg ctc gag gag gtg cag ctg ctg gaa tct 3’(30mer)和5’ccc aag ctt tga gga gac ggt ga 3’(23mer)3)用PCR方法克隆和擴增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因；4)序列分析人抗體可變區(qū)基因，推導(dǎo)出該基因所編碼的氨基酸序列；抗體AA98重鏈可變區(qū)是由118個氨基酸組成，序列如下1 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 3233 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 4849 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 6465 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 8081 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 9697 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 112113 Thr Val Thr Val Ser Ser 118抗體AA98輕鏈可變區(qū)是由112個氨基酸組成，序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 1125)把抗體AA98的輕重鏈可變區(qū)基因分別與人的輕重鏈恒定區(qū)基因連接，構(gòu)建可編碼完整嵌合抗體的融合基因；6)將這種融合基因插入到有選擇性標(biāo)記和基因控制區(qū)(如啟動子，增強子，終止子)的表達載體pdHL2.4中；7)在細菌中擴增這種表達載體，分離純化含有嵌合抗體基因的表達載體；8)用lipofectin將含有嵌合抗體基因的表達載體導(dǎo)入哺乳動物細胞CHO中；9)用MTX篩選轉(zhuǎn)化細胞，獲得轉(zhuǎn)基因細胞株CHO-chiAA98；10)用ELISA篩選分泌抗體并鑒定細胞株CHO-chiAA98的穩(wěn)定性；11)檢測嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性和效應(yīng)功能。
實施例三抗體識別功能片段AA98-Fab的制備利用抗體識別腫瘤血管的特異性，將抗體識別功能片段與具有免疫活性或抗腫瘤活性物質(zhì)連接，研制出具有識別和殺傷作用的雙能夠融合蛋白。其中抗體成分主要是Fab。生產(chǎn)抗體Fab功能片段的操作步驟如下1)設(shè)計一套引物5’agg tcc agc tgc tcg agt ctg g3’(mH1)和5’gatatc act agt ggg ccc gct ggg ctc3’(for IgG2a/2b)，抗體輕鏈引物5’primer gat att gag ctc gtg atg ac(c/a) ca(g/a) (t/a)ctcc和3’primer 5’gc tct aga aag ctt a tta aca ctc att cct gttgaa2)用快速制備、純化mRNA試劑盒(Promega)從大約2×107個雜交瘤細胞HE2A5中提取并純化mRNA。
3)以純化的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
4)用PCR方法，以cDNA為模板，在PCR反應(yīng)體系中分別加入引物，進行30個循環(huán)的PCR擴增。每個循環(huán)的條件是94℃變性30s,55℃退火90s,72℃延伸90s，反應(yīng)進行到最后一個循環(huán)后在72℃中保溫10min。反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物。
5)把擴增抗體AA98的Fd(抗體可變區(qū)和恒定區(qū)CH1)基因和輕鏈基因克隆到pComb3H表達載體上。
6)把Fab-pCom3H重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL-Blue(DE3)，用含氨芐青霉素選擇性培養(yǎng)基篩選重組菌。
7)用IPTG誘導(dǎo)重組菌表達可溶性抗體AA98-Fab。
8)從胞周質(zhì)中分離純化抗體AA98-Fab。
9)ELISA和免疫印記鑒定可溶性AA98-Fab抗體片段。
10)核苷酸序列分析抗體AA98-Fab的基因并推導(dǎo)出其氨基酸序列如下抗體AA98輕鏈?zhǔn)怯?17個氨基酸組成，序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 112113 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 128129 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 144145 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 160161 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 176177 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 192193 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 208209 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Trp 217抗體AA98重鏈Fd是由222個氨基酸組成，序列如下1 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 3233 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 4849 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp lle Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 6465 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 8081 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 9697 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 112113 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro 128129 Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 144145 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 160161 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Cys Ala His Leu Pro Ala Val Leu Gln 176177 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Met Thr Val Thr Ser Ser Thr 192193 Trp Ala Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser208209 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Asn Gly Ala Thr Ser222實施例四單鏈抗體AA98-scFv的制備小分子單鏈抗體AA98-scFv的特點是保留著抗體AA98的特異性且分子量小，免疫源性小，穿透力強，有利于作為載體攜帶藥物和毒素。制備方法如下1)設(shè)計引物輕鏈可變區(qū)引物5’primer for VL(25mer) ccg gag ctcgtg atg aca caa tct c和3’primer for VL(26mer) gc tct aga ccgttt tat ttc cag ctt重鏈鏈可變區(qū)引物5’primer for VH(27mer)ccg ctc gag tct gga gct gag ctg gtg和3’primer for VH(26mer)gg act agt tga gga gac ggt gac cgt。
2)以抗體AA98-Fab基因為模板，用PCR方法分別擴增抗體的輕重鏈可變區(qū)基因。PCR反應(yīng)進行30個循環(huán)。每個循環(huán)的條件是94℃變性30s,55℃退火90s,72℃延伸90s，反應(yīng)進行到最后一個循環(huán)后在72℃中保溫10min。反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物。
3)把擴增的抗體可變區(qū)基因克隆到pComb3H表達載體上，構(gòu)建VH-linker-VL融合基因。
4)單鏈抗體AA98核苷酸序列分析以及推導(dǎo)出的氨基酸序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser 112113 Arg Arg Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly GLy Pro Gly Gly GLy GLy Ser 128129 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 144145 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 160161 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 176177 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 192193 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 208209 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 224225 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 240241 Thr Val Thr Val Ser Ser5)構(gòu)建可溶性單鏈抗體高效表達載體。6)氨芐青霉素篩選分泌抗體的重組菌，IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集含有可溶性抗體功能片段的上清。7)ELISA，免疫印記和免疫組化鑒定可溶性抗體AA98-scFv片段。8)層析分離純化單鏈抗體。
權(quán)利要求
1．一類對新生血管具有特異反應(yīng)的抗體及其功能片段，其特征在于這類抗體包含雜交瘤單克隆抗體和基因工程抗體，它們能夠特異識別新生血管內(nèi)皮細胞膜抗原，具有誘發(fā)ADCC和CDC的能力，這類抗體本身及其結(jié)合物均可以抑制新生血管的形成，具有特異而廣譜的抗癌作用。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于這類抗體可以是一種鼠單克隆抗體，命名為AA98。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于抗體可以是一種由雜交瘤HE2A5產(chǎn)生的AA98抗體。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜交瘤HE2A5，其特征在于用腫瘤細胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞增生，并用增生的血管內(nèi)皮細胞免疫小鼠，獲得分泌抗體AA98雜交瘤的方法。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于抗體可以是一種人-鼠嵌抗體ChiAA98，它含有權(quán)利要求2所述抗體AA98的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)，其抗原結(jié)合區(qū)競爭抑制抗體AA98與其靶抗原的特異性結(jié)合。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述抗體ChiAA98，其特征在于該抗體是由CHO-AA98工程細胞系產(chǎn)生。
7．根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的抗體，其特征在于抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因?qū)У陌被嵝蛄??？贵w重鏈可變區(qū)是由118個氨基酸組成，序列如下1 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 3233 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 4849 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 6465 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 8081 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 9697 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 112113 Thr Val Thr Val Ser Ser 118抗體輕鏈可變區(qū)是由112個氨基酸組成，序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 112
8．如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于抗體可以是一種Fab功能片段(AA98-Fab)，該抗體基因推導(dǎo)出的氨基酸序列如下，抗體AA98-Fab輕鏈?zhǔn)怯?17個氨基酸組成，序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 112113 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 128129 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 144145 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp GIy Ser Glu Arg Gln Asn 160161 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 176177 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 192193 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 208209 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Trp 217抗體AA98-Fab重鏈Fd是由222個氨基酸組成，序列如下1 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 3233 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 4849 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 6465 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 8081 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 9697 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 112113 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro 128129 Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 144145 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 160161 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Cys Ala His Leu Pro Ala Val Leu Gln 176177 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Met Thr Val Thr Ser Ser Thr 192193 Trp Ala Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 208209 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Asn Gly Ala Thr Ser 222
9．如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于抗體可以是一種單鏈抗體AA98-scFv，該抗體基因推導(dǎo)出的氨基酸序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser 112113 Arg Arg Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly GLy Pro Gly Gly GLy GLy Ser 128129 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 144145 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 160161 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp lle 176177 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 192193 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 208209 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 224225 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 240241 Thr Val Thr Val Ser Ser 246
10．如權(quán)利要求2、5、8、9中任何一項所述的抗體，其特征在于其中任何一種抗體可以是一種重組蛋白質(zhì)，它含有權(quán)利要求2、5、8、9中任何一項所述的抗體氨基酸序列，及其具有類似功能的抗體衍生物。
11．如權(quán)利要求2、5、8、9、10中任何一項所述的抗體及其衍生物，其特征在于抗體結(jié)合物，其中任何一項所述的抗體與其結(jié)合的物質(zhì)可以是一種抗腫瘤藥物，一種毒素，一種放射活性劑，一種酶或另一種抗體。
12．根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別新生血管抗體，其特征在于這類抗體如權(quán)利要求2、5、8、9、10所述的任何一種抗體及其衍生物可應(yīng)用于人體腫瘤成像定位診斷。
13．如權(quán)利要求2、5、8、9、10所述的任何一種抗體及其衍生物，其特征在于本發(fā)明所述任何一種抗體所識別的相應(yīng)靶分子抗原。
14．如權(quán)利要求13所述的靶抗原，其特征在于本發(fā)明所述任何一種抗體所識別的靶分子抗原可以應(yīng)用于藥物篩選和腫瘤疫苗。
15．如權(quán)利要求2、5、8、9、10所述的任何一種抗體及其衍生物，其特征在于其中任何一種抗體可應(yīng)用于新生血管有關(guān)的免疫效應(yīng)和基礎(chǔ)理論研究。
全文摘要
本發(fā)明是利用生物技術(shù)研制出的一類抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的新型抗體。本發(fā)明包括:鼠單克隆抗體AA98,人－鼠嵌合抗體ChiAA98,和抗體AA98的Fab和Fv功能片段。這類抗體的特點在于特異識別腫瘤新生血管,具有誘發(fā)ADCC和CDC的能力,特異而廣譜地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。這些抗體本身或抗體結(jié)合物都將成為具有廣譜抗癌作用的高效低毒新型藥物。同時也可用于腫瘤的早期診斷,以及腫瘤與其血管相互作用的基礎(chǔ)研究。
文檔編號A61P35/04GK1234405SQ9910758
公開日1999年11月10日 申請日期1999年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月25日
發(fā)明者閻錫蘊, 袁玖, 李力, 吳小平 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所