專利名稱：靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)，涉及一種用于抗腫瘤成分的提取及部分純化的生產(chǎn)方法。
應(yīng)用先進的提取技術(shù)對中草藥中有效成分進行提取和初步分離是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要發(fā)展方向之一，一些中草藥的單方或復(fù)方的粗提液經(jīng)粗分后已經(jīng)用于臨床并取得了較好的治療效果，這既承襲了傳統(tǒng)中醫(yī)藥標本兼治的文化思想，同時也體現(xiàn)了西醫(yī)治療中見效快、目的性強的特點，重要的是克服了西藥治療中的各種毒副作用及藥物依賴性的缺憾。靈芝作為一種傳統(tǒng)的中草藥，是中草藥中的上品，已在我國民間及日本、韓國等地應(yīng)用了上千年，目前，對靈芝中有效成分的分析已引起了國際上的關(guān)注。隨著靈芝研究的深入，對靈芝的生殖細胞即孢子的研究也在加強。但靈芝孢子中的抗腫瘤成分進行提取和分離還未見報道。
本發(fā)明的目的在于從靈芝孢子中提取和分離抗腫瘤成分。
該靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)的實施方案如下A．所用原料為靈芝孢子粉；B．有機溶劑浸提，投料比即孢子粉重量g數(shù)與溶劑體積ml數(shù)之比為1∶5～1∶15，浸提3次，每次2-5小時，得浸提液；C．浸提液用普通離心機離心沉淀，轉(zhuǎn)速2000～40000轉(zhuǎn)／分，收集上清液；D．上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干得到油狀物，溫度維持在45～55℃并回收乙醇；E．油狀物用硅膠柱層析進行分離，所用的柱層析填料為無機吸附劑-硅膠，160-200目，在105-110℃恒溫加熱0．5-1小時后備用；層析柱為普通的玻璃柱，內(nèi)徑2．0cm，柱高20cm，使得直徑∶柱高=1∶10，具體操作是1)裝柱 硅膠用石油醚溶脹后直接裝柱，盡量避免氣泡的產(chǎn)生；2)上樣 油狀物用正己烷溶解后上樣，每次上樣約5．0g，相當于20．0g孢子粉；3)洗脫 依次用200ml氯仿、200ml乙酸乙酯和100ml甲醇進行洗脫得到3種洗脫液；F．上述3種洗脫液均用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓蒸干，得到3種樣品；G．細胞毒性檢測，用常規(guī)實驗方法檢測3種樣品對人宮頸癌HeLa細胞的影響。
靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離方法用于浸提的有機溶劑為乙醇或氯仿。本發(fā)明的主要優(yōu)點1 本技術(shù)可得到天然抗腫瘤成分，得率高達1．6％，該成分在很低濃度(0．08mg／ml)時具有明顯的活性，應(yīng)用價值極大。
2 整個工藝過程簡單，所用儀器均為實驗室或藥廠常用的普通儀器，成本低。
實施例1．100g破壁孢子粉用1000ml無水乙醇分3次浸泡提取，每次3小時，得到浸提液；2．浸提液用普通離心機離心沉淀，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)／分，收集上清液；上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓蒸干(50℃)后，得到油狀物重約25g；3．油狀物用硅膠柱層析進行分離。所用的柱層析填料為無機吸附劑-硅膠，160-200目，在105℃恒溫加熱1小時后備用；層析柱為普通的玻璃柱，內(nèi)徑2．0cm，柱高20cm，使得直徑∶柱高=1∶10。具體操作是1)裝柱 硅膠用石油醚溶脹后直接裝柱，盡量避免氣泡的產(chǎn)生；2)上樣 油狀物用正己烷溶解后上樣，每次上樣約5．0g，相當于20．0g孢子粉；3)洗脫 依次用200ml氯仿、200ml乙酸乙酯和100ml甲醇進行洗脫，得到3種洗脫液；各洗脫液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓蒸干，氯仿洗脫液減壓蒸干后重約3．0g，得率為72％(即A101樣品)；乙酸乙酯洗脫部分重約1．2g，得率為24％(即A102樣品)；甲醇洗脫洗脫液減壓蒸干后重約0．08g，得率為1．6％(即A103樣品)。然后用乙醇溶解后可直接用于細胞毒性檢測。
4．細胞毒性檢測 按常規(guī)方法檢測各部分樣品對人宮頸癌HeLa細胞的毒性，以此為依據(jù)確定它們的抗腫瘤活性大小。結(jié)果表明，A101樣品不具有細胞毒性；A102樣品在濃度為2．5mg／ml時有明顯的細胞毒性；A103樣品在濃度為0．08mg／ml時有明顯的細胞毒性。
權(quán)利要求
1．一種靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)，其特征在于A．所用原料為靈芝孢子粉；B．有機溶劑浸提，投料比即孢子粉重量g數(shù)與溶劑體積ml數(shù)之比為1∶5～1∶15，浸提3次，每次2-5小時，得浸提液；C．浸提液用普通離心機離心沉淀，轉(zhuǎn)速2000～4000轉(zhuǎn)／分，收集上清液；D．上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干得到油狀物，溫度維持在45～55℃并回收乙醇；E．油狀物用硅膠柱層析進行分離，所用的柱層析填料為無機吸附劑-硅膠，160-200目，在105-110℃恒溫加熱0．5-1小時后備用；層析柱為普通的玻璃柱，內(nèi)徑2．0cm，柱高20cm，使得直徑∶柱高=1∶10，具體操作是1) 裝柱 硅膠用石油醚溶脹后直接裝柱，盡量避免氣泡的產(chǎn)生；2) 上樣 油狀物用正己烷溶解后上樣，每次上樣約5．0g，相當于20．0g孢子粉；3) 洗脫 依次用200ml氯仿、200ml乙酸乙酯和100ml甲醇進行洗脫得到3種洗脫液；F．上述3種洗脫液均用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓蒸干，得到3種樣品；G．細胞毒性檢測，用常規(guī)實驗方法檢測3種樣品對人宮頸癌HeLa細胞的影響。
2．如權(quán)利要求1所述的靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離方法，其特征在于用于浸提的有機溶劑為乙醇或氯仿。
全文摘要
本發(fā)明是一種靈芝孢子中抗腫瘤成分的分離技術(shù)。靈芝孢子粉用有機溶劑浸泡,浸提液用離心方法得以分離并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃減壓濃縮得油狀物,后者經(jīng)普通的硅膠柱層析進行分離,用氯仿、乙酸乙酯和甲醇依次洗脫,分別蒸干后得一系列的膏狀物,用人宮頸癌HeLa細胞檢測其毒性。本技術(shù)可得到天然抗腫瘤成分,得率高,該成分在很低濃度(0.08mg/ml)時具有明顯的活性,應(yīng)用價值極大。整個工藝過程簡單,成本低。
文檔編號A61P35/00GK1282611SQ99111169
公開日2001年2月7日 申請日期1999年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月29日
發(fā)明者楊新林, 趙東旭, 朱鶴孫, 徐建蘭 申請人:北京理工大學