專利名稱：抗幽門螺桿菌雞卵黃免疫球蛋白產(chǎn)品及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及了一種具有抗體活性的卵黃免疫球蛋白產(chǎn)品，并涉及其應用，特別是一種抗幽門螺桿菌的抗體產(chǎn)品及應用。
近年來研究表明幽門螺桿菌(HP)與慢性胃炎、消化性潰瘍的發(fā)生關系密切。目前HP已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為第一類導致胃癌的危險因子，HP傳播具有世界性，我國各地自然人群中的HP感染率(成年人)均在50％以上。HP的治療方法的發(fā)展為單一抗菌素治療→兩種藥物治療→鉍劑三重治療→抗分泌藥物及抗菌素聯(lián)合根治HP。但單一抗菌素或兩種藥物治療療效較差，鉍劑三重治療副作用大，依從性差。近年來抗分泌藥物及抗菌素聯(lián)合根治存在耐受性差的問題，且無足夠的臨床實踐。而且，在我國因動物模型的限制，HP菌苗研究進展緩慢。因此采用被動免疫保護為防治HP感染提供了一條新的途徑。
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗體活性的抗幽門螺桿菌卵黃免疫球蛋白(抗-HPIgY)產(chǎn)品，并將所得產(chǎn)品配制成保健品、生物制劑或臨床檢測試劑，用于因幽門螺桿菌感染引起的相關疾病的防治以及幽門螺桿菌的臨床診斷或檢測。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的具有抗體活性的抗幽門螺桿菌卵黃免疫球蛋白(抗-HPIgY)產(chǎn)品。該產(chǎn)品可以從以下步驟獲得制備幽門螺桿菌菌苗，將幽門螺桿菌菌苗免疫母雞，然后收集其所產(chǎn)雞卵，從中提取卵黃免疫球蛋白。
為有效制備幽門螺桿菌苗可采用下述步驟首先從HP感染者病灶部位分離得到HP，繼而涂布于血瓊脂板上，37℃厭氧培養(yǎng)72小時，將HP檢測為陽性的平板劃線連續(xù)培養(yǎng)，收集菌體得HP菌液，超聲波粉碎，加入福氏佐劑，乳化得HP菌苗。
從卵黃中提取卵黃免疫球蛋白，采用水稀釋法或聚乙二醇法較優(yōu)越。其浸提效率高。成本低。是一種無污染的提取方法。其中水稀釋法步驟為從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋蛋液，調整適當PH值，靜置過夜，離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到抗-HPIgY。
聚乙二醇兩步沉淀法步驟為從免疫雞卵中分離得蛋黃，以2倍PBS稀釋蛋黃，加入3.5％聚乙二醇6000，攪拌靜置1-4小時，離心取上清，加入8.5％聚乙二醇，攪拌靜置1-4小時，離心得沉淀，將沉淀冷凍干燥，得到抗-HPIgY。
本發(fā)明所提供的抗-HPIgY產(chǎn)品是由幽門螺桿菌菌苗免疫產(chǎn)卵母雞而得的。具有很強的特異性，對防治幽門螺桿菌感染引起的相關疾病具有良好的效果，而且免疫球蛋白類制品能增強人體免疫機能。本發(fā)明采用母雞所產(chǎn)雞卵為載體，安全無毒。母雞易飼養(yǎng)和管理，便于產(chǎn)業(yè)化。
下面結合實施例詳細說明本發(fā)明。
實施例1具有抗體活性的幽門螺桿菌雞卵黃免疫球蛋白(抗-HPIgY)的產(chǎn)品，可以通過以下步驟獲得制備幽門螺桿菌(HP)菌苗，將HP菌苗免疫產(chǎn)蛋母雞，收集其連續(xù)產(chǎn)出雞卵，再從中提取抗-HPIgY。
實施例2HP菌苗的制備，取胃炎或胃潰瘍患者的胃粘膜組織塊涂布于血瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)72小時，將HP檢測陽性的平板劃線連續(xù)培養(yǎng)，超聲波粉碎，加入福氏佐劑，乳化得HP菌苗。
實施例3收集所得免疫蛋采用如下方式分離提取抗-HPIgY分離蛋黃以4-10倍蒸餾水稀釋蛋黃，調整適當?shù)腜H值，4℃靜置過夜，離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，得抗-HPIgY。
實施例4以2倍PBS稀釋蛋黃，加入3.5％聚乙二醇6000(PEG6000)，攪拌靜置1-4小時，離心取上清，加入8.5％PEG6000，攪拌靜置1-4小時，離心得沉淀，將沉淀冷凍干燥，得抗-HPIgY。
實施例5取實施例1-4中任何一種產(chǎn)品進行間接血凝或間接ELISA實驗測其活性。
間接血凝試驗將抗-HPIgY稀釋液加入間凝板小孔中，再加入HP致敏鞣化血球一滴，然后置板于血凝微量振蕩器上振搖五分鐘，37℃保溫30分鐘，可見孔中呈卷邊狀沉淀，即強陽性結果。
間接ELISA試驗將HP抗原包被于聚乙烯微量反應板各孔中，4℃過夜，加入PBS-T洗板，加入BSA封閉，37℃溫育30分鐘洗板將抗-HPIgY稀釋液滴于反應孔中，37℃溫育2小時，洗板加入抗-IgYHRP，37℃溫育1小時，洗板將OPD底物加入反應孔，再加入30％過氧化氫，顯色5-10分鐘，加入2.5N鹽酸終止顯色反應，酶標儀檢測，OD值越大即抗體活性越好。
實施例6將粗提抗-HPIgY過DEAE-Sephadex A50凝膠色譜柱，再過SephadexG200凝膠色譜柱，冷凍干燥即可得純抗-HPIgY。
實施例7取健康小鼠30只，并設對照組，給藥前禁食不禁水12小時，15％的抗-HPIgY溶液按每次0.4毫升/10克灌胃，每隔8小時給一次藥，二十四小時共給抗-HPIgY3次，動物最大耐受量為18克/公斤/天。相當于臨床劑量3750倍。以上結果表明抗-HPIgY制劑安全無毒。
實施例8采集抗-HPIgY免疫蛋50個，分離得到800毫升蛋黃，加水稀釋至5000毫升，離心得到清液4000毫升，采用中空纖維超濾提取，最后濃縮至400毫升待用，其中含有粗提抗-HPIgY12克。將蔗糖10g中加入5ml水溶解，100℃滅菌30分鐘，將處理過的輔料與50毫升超濾液混合均勻，冷凍干澡，無菌粉碎包裝成袋，每小袋內(nèi)含0.5克，用于治療因HP感染引起的慢性胃炎以及消化性潰瘍。
實施例9采集抗-HPIgY免疫蛋100個，得到蛋黃1600毫升，加2倍PBS稀釋蛋液，并加入3.5％ PEG6000攪拌靜置2小時，離心得到清液3500毫升，再加PEG6000至終濃度為12％，靜置2小時，離心收集沉淀。以100ml蒸餾水溶解IgY沉淀，通過細菌過濾器除菌，冷凍干燥，以每個普通膠囊裝200mg粗提抗-HPIgY進行灌裝，所得產(chǎn)品用于預防幽門螺桿菌感染，人體服用方法每天2-3次，每次3粒膠囊。
權利要求
1.一種抗幽門螺桿菌雞卵黃免疫球蛋白(抗-HPIgY)產(chǎn)品。該產(chǎn)品可以從以下步驟獲得制備幽門螺桿菌(HP)菌苗，將幽門螺桿菌(HP)菌苗免疫健康母雞，然后收集其所產(chǎn)卵，再從其所產(chǎn)卵中提取抗-HPIgY。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗-HPIgY產(chǎn)品，其特征在于為了有效制備幽門螺桿菌(HP)菌苗，可采用下述步驟首先從HP感染者病灶部位分離得到HP，繼而涂布于血瓊脂板上，37℃厭氧培養(yǎng)72小時，將HP檢測為陽性的平板劃線連續(xù)培養(yǎng)，收集菌體得HP菌液，超聲波粉碎，加入福氏佐劑，乳化得HP菌苗。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗-HPIgY產(chǎn)品，其特征在于采用水稀釋法提取卵黃免疫球蛋白，其步驟從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋蛋液，調整適當PH值，靜置過夜，離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到抗-HPIgY。
4.根據(jù)權利要求1所述的抗-HPIgY產(chǎn)品，其特征在于采用聚乙二醇兩步沉淀法提取卵黃免疫球蛋白，其步驟從免疫雞卵中分離得蛋黃，以2倍PBS稀釋蛋黃，加入3.5％聚乙二醇6000，攪拌靜置1-4小時，離心取上清，加入8.5％聚乙二醇，攪拌靜置1-4小時，離心得沉淀，將沉淀冷凍干燥，得到抗-HPIgY。
5.由權利要求1-4項中任何一項所述的抗-HPIgY產(chǎn)品組成的用于防治腫引起的慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍病以及胃癌的保健品或生物制劑。
6.應用權利要求1-4項中任何一項所述的抗-HPIgY產(chǎn)品制備防治HP引起的慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍病以及胃癌的保健品或生物制劑。
7.含有權利要求1-4項中任何一項所述的抗-HPIgY產(chǎn)品用于防治幽門螺桿菌引起的慢性胃炎，胃潰瘍，十二指腸潰瘍病以及胃癌的保健品或生物制劑。
8.由權利要求1-3項中任何一項所述的抗-HPIgY產(chǎn)品用做幽門螺桿菌的檢測診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗幽門螺桿菌雞卵黃免疫球蛋白(抗－HPIgY)的產(chǎn)品及其應用,用幽門螺桿菌(HP)菌苗免疫產(chǎn)卵母雞,并從其產(chǎn)出的卵中提取抗－HPIgY。應用本發(fā)明將抗－HPIgY制成保健食品或生物制劑,可用于防治因幽門螺桿菌感染引起的相關疾病:純化后的抗－HPIgY可應于幽門螺桿菌的臨床檢測以及診斷。本產(chǎn)品具有良好的活性和特異性。
文檔編號A61P1/04GK1250056SQ99117588
公開日2000年4月12日 申請日期1999年9月8日 優(yōu)先權日1999年9月8日
發(fā)明者許楊, 魏華, 孫紅斌, 傅金衡, 熊勇華, 陳紅兵, 楊榮鑒, 鐘青萍 申請人:中德聯(lián)合研究院