專利名稱：一種新的人Fe65L2－2蛋白及編碼它的多核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的人Fe65L2-2蛋白及編碼它的多核苷酸序列，還涉及所述蛋白質(zhì)及其編碼多核苷酸序列在診斷、預(yù)防和治療與該蛋白質(zhì)表達(dá)異常相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
Fe65是一個(gè)基因家族的總稱，目前已發(fā)現(xiàn)的成員都有三個(gè)重要結(jié)構(gòu)域PID1、PID2和WW區(qū)域。Fe65蛋白被認(rèn)為是一個(gè)連接分子，包括有三個(gè)蛋白-蛋白相互作用區(qū)兩個(gè)磷酸酪氨酸作用區(qū)(PID)或磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)(PTB)和一個(gè)含有兩個(gè)保守色氨酸殘基的WW區(qū)。其中，F(xiàn)e65蛋白的PID2區(qū)域可與淀粉樣沉淀前體蛋白(APP)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。Fe65的另一個(gè)PID／PTB區(qū)，即N末端的PID1區(qū)域，它可與CP2、LSF、LBP1等蛋白作用，參與一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程。Fe65還有另一個(gè)區(qū)域-WW區(qū)域。WW區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)由38個(gè)半保守氨基酸組成的特征序列。WW區(qū)域主要功能是介入一系列復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞作用。綜上所述，F(xiàn)e65的兩個(gè)PID／PTB區(qū)域與WW區(qū)域都具有信號(hào)傳遞蛋白的特征，同復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。
已知淀粉樣沉淀是阿爾茨海默癥的主要病理特征(Glenner，G．G．，等人，(1984)，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem．Biophy．Res．Commu．)，120885-890)。淀粉樣沉淀的主要成分Aβ衍生自APP的蛋白質(zhì)水解加工(Goldgaber，D．等人，(1987)，科學(xué)(Science)，235877-880；Kang，J．等人，(1987)，自然(Nature)，325733-736)。至少有三種分泌酶(secretase)即α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶參與了APP的加工(Weidmann，A．等人，(1989)細(xì)胞(Cell)，57115-126；Esch，F(xiàn)．S．等人，(1990)科學(xué)2481122-1124；Seubert，P．等人，(1992)，自然，359325-327)。其中，經(jīng)過(guò)β-分泌酶和γ-分泌酶切割A(yù)PP產(chǎn)生Aβ，而α-分泌酶在形成Aβ之前于APP的Aβ結(jié)構(gòu)域中切割得到APP。大量的Aβ的積累和聚集促進(jìn)了淀粉樣沉淀的形成。Sabo等人于美國(guó)專利5，928，882中指出，膜上APP蛋白的量與最終形成Aβ的量正相關(guān)。而Fe65可通過(guò)結(jié)合APP，增加APP從高爾基體中向質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)牧?，或是增加了在被?nèi)吞后重新回到細(xì)胞表面的APP的量。因此，如果抑制Fe65與APP的結(jié)合，可降低膜上APP的量，從而可減少Aβ的形成和聚集。
最近Tanahashi等人報(bào)道從人胎腦cDNA文庫(kù)中克隆到的hFe65L2基因，它編碼484個(gè)氨基酸，其序列與小鼠的Fe65L2蛋白有86％的同源性，并同時(shí)報(bào)道了一種缺少兩個(gè)氨基酸殘基的剪切變體(Tanahashi，H．等人，(1999)，神經(jīng)科學(xué)通訊(NeuroscienceLetters)261143-146)。
由于如上所述可知，F(xiàn)e65蛋白與APP蛋白的相互作用對(duì)于Aβ的積累和聚集以及淀粉樣沉淀的形成有重要影響，減少Fe65蛋白的含量或抑制其與APP蛋白結(jié)合對(duì)于治療與Aβ的積累和聚集以及淀粉樣沉淀的形成相關(guān)的疾病如阿爾茨海默癥、癡呆等十分重要。因此本領(lǐng)域一直迫切需要更全面的鑒定和了解參與上述結(jié)合過(guò)程的Fe65家族的各個(gè)蛋白質(zhì)成員，特別是鑒定這些蛋白質(zhì)成員的氨基酸序列。本發(fā)明基于對(duì)Fe65家族中的一個(gè)新成員，即本發(fā)明的Fe65L2-2及其編碼基因的分離與表征，為診斷、治療和／或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病如與Aβ的積累和聚集以及淀粉樣沉淀的形成相關(guān)的疾病打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明的蛋白具有針對(duì)上述疾病的診斷、治療和／或用途的前景，因此分離其編碼多核苷酸序列是非常重要的。
本發(fā)明的目的就是提供一種新的人Fe65L2-2蛋白及編碼它的多核苷酸序列。
本發(fā)明涉及一種分離的多肽，它包含具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。
本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)編碼具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少89％相同性的多核苷酸，不包括已報(bào)道的hFe65L2基因。
本發(fā)明另外涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體，特別是表達(dá)載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和回收表達(dá)產(chǎn)物的制備本發(fā)明多肽的方法。
本發(fā)明還涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還涉及一種篩選拮抗或抑制Fe65L2-2蛋白與APP蛋白質(zhì)相互作用的化合物的方法，其包括利用本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及利用所得的化合物治療、檢測(cè)和／或預(yù)防疾病的方法。
本發(fā)明還涉及一種體外檢測(cè)與Fe65L2-2蛋白含量增加或活性升高相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，包括檢測(cè)生物樣品中所述多肽或其編碼多核苷酸序列中的突變，或者檢測(cè)生物樣品中本發(fā)明多肽的量或生物活性。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的多核苷酸作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)、作為探針用于雜交反應(yīng)以及用于制備基因芯片或微陣列的用途。
本發(fā)明也涉及一種藥物組合物，它含有針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體或其免疫活性片段、或者是本發(fā)明多肽的模擬物、拮抗劑或抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及針對(duì)本發(fā)明的多肽的抗體和／或反義多核苷酸在制備用于治療神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥和癡呆等的藥物的用途。
本發(fā)明上述的和其它的方面對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，從本文以下的詳細(xì)描述看應(yīng)該是很清楚的。


圖1為用GCG軟件包中的gap程序?qū)⑷薋E65L2-2的核酸序列(中間)與hFE65L2(下排)的序列作雙序列比較的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多出一段21bp的序列。而在做相似性比較時(shí)可以找到與人FE65L2-2基因完全對(duì)應(yīng)的基因組序列(上排)，其是序列號(hào)為ac005214的BAC。從比較的結(jié)果可看到這段21bp的序列位于內(nèi)含子與外顯子的交界處。其中斜黑體的部分為內(nèi)含子部分。
本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的下列術(shù)語(yǔ)除非特別說(shuō)明具有如下的含義“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因組或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，代表有義鏈或反義鏈。類似地，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分。當(dāng)本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時(shí)，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的天然氨基酸。
蛋白質(zhì)或多核苷酸“變體”是指一種具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的缺失。
“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改變導(dǎo)致與天然存在的分子相比，一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的增加。
“替換”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸。
“生物活性”是指具有天然分子的結(jié)構(gòu)、調(diào)控或生物化學(xué)功能的蛋白質(zhì)。類似地，術(shù)語(yǔ)“免疫學(xué)活性”是指天然的、重組的或合成蛋白質(zhì)及其片段在合適的動(dòng)物或細(xì)胞中誘導(dǎo)特定免疫反應(yīng)以及與特異性抗體結(jié)合的能力。
“拮抗劑”或“抑制物”是指當(dāng)與Fe65L2-2結(jié)合時(shí)，一種可封閉或調(diào)節(jié)Fe65L2-2的生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的分子。拮抗劑和抑制物可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合Fe65L2-2的分子。
“調(diào)節(jié)”是指Fe65L2-2的功能發(fā)生改變，包括蛋白質(zhì)活性的升高或降低、結(jié)合特性的改變及Fe65L2-2的任何其它生物學(xué)性質(zhì)、功能或免疫性質(zhì)的改變。
″基本上純″是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化Fe65L2-2。基本上純的Fe65L2-2在非還原性聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。Fe65L2-2多肽的純度可用氨基酸序列分析。
“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)”是指在允許的鹽濃度和溫度條件下通過(guò)堿基配對(duì)的多核苷酸天然結(jié)合。例如，序列“C-T-G-A”可與互補(bǔ)的序列“G-A-C-T”結(jié)合。兩個(gè)單鏈分子之間的互補(bǔ)可以是部分的或全部的。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度對(duì)于核酸鏈之間雜交的效率及強(qiáng)度有明顯影響。
“同源性”是指互補(bǔ)的程度，可以是部分同源或完全同源?！安糠滞础笔侵敢环N部分互補(bǔ)的序列，其至少可部分抑制完全互補(bǔ)的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過(guò)在嚴(yán)格性程度降低的條件下進(jìn)行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來(lái)檢測(cè)。基本上同源的序列或雜交探針可競(jìng)爭(zhēng)和抑制完全同源的序列與靶序列在的嚴(yán)格性程度降低的條件下的結(jié)合。這并不意味嚴(yán)格性程度降低的條件允許非特異性結(jié)合，因?yàn)閲?yán)格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結(jié)合為特異性或選擇性相互作用。
“相同性百分率”是指在兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同或相似的百分率。可用電子方法測(cè)定相同性百分率，如通過(guò)MEGALIGN程序(Lasergene軟件包，DNASTAR，Inc．，MadisonWis．)。MEGALIGN程序可根據(jù)不同的方法如Cluster法比較兩種或多種序列(Higgins，D．G．和P．M．Sharp(1988)基因73237-244)。Cluster法通過(guò)檢查所有配對(duì)之間的距離將各組序列排列成簇。然后將各簇以成對(duì)或成組分配。兩個(gè)氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率通過(guò)下式計(jì)算 也可以通過(guò)Cluster法或用本領(lǐng)域周知的方法如Jotun Hein測(cè)定核酸序列之間的相同性百分率(Hein J．，(1990)酶學(xué)方法(Methods inenzymology)183625-645)。
“相似性”是指氨基酸序列之間排列對(duì)比時(shí)相應(yīng)位置氨基酸殘基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，帶負(fù)電荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸可包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的頭部基團(tuán)有相似親水性的氨基酸可包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。
“反義”是指與特定的DNA或RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列?！胺戳x鏈”是指與“有義鏈”互補(bǔ)的核酸鏈。
“衍生物”是指Fe65L2-2或編碼其的核酸的化學(xué)修飾物。這種化學(xué)修飾物可以是用烷基、?；虬被鎿Q氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學(xué)特性的多肽。
“抗體”是指完整的抗體分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特異性結(jié)合Fe65L2-2的抗原決定簇。
“分離的”一詞指將物質(zhì)從它原來(lái)的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán)境)之中移出。比如說(shuō)，一個(gè)自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動(dòng)物中就是沒(méi)有被分離出來(lái)，但同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開(kāi)就是分離的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分。既然載體或組合物不是它天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的。
本發(fā)明一方面提供了一種新的人Fe65L2-2蛋白，及其具有生物活性或免疫活性的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一方面，提供了編碼這些多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA和基因組DNA，及其具有生物活性的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的再一方面提供了核酸的探針，它包含足夠長(zhǎng)度的核酸分子以及與Fe65L2-2基因序列進(jìn)行特異性雜交的序列。
依據(jù)本發(fā)明的一方面，它提供了一種分離的多核苷酸，這些核苷酸編碼具有SEQ ID No．2所示的推定的氨基酸序列的多肽。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸可以從許多成人和胎兒的cDNA文庫(kù)中分離，如人胎腦cDNA文庫(kù)。SEQ ID No．1所示的多核苷酸序列全長(zhǎng)為1809個(gè)堿基，具有編碼一個(gè)含491個(gè)氨基酸殘基的多肽的開(kāi)放閱讀框架。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與大鼠Fe65L2-2蛋白有88％的相同性，與已知hFe65L2基因有很高的相同性，只是本發(fā)明的多核苷酸在hFe65L2基因第678位與679位核苷酸之間還存在一段21bp的核苷酸序列。這提示本發(fā)明的多肽是Fe65蛋白家族中的一個(gè)新成員或是一種新的剪切變體。
本發(fā)明的多核苷酸可以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的DNA。DNA可以是雙鏈或者單鏈的，單鏈也可以是有義鏈或者反義鏈。編碼多肽的多核苷酸序列可以與SEQID No．1所示的多核苷酸序列相同，或者可以是一個(gè)由于遺傳密碼的冗余或簡(jiǎn)并性而不同的多核苷酸序列，但它與SEQ ID No．1編碼相同的成熟多肽。
編碼SEQ ID No．2的多肽的多核苷酸可以包括僅僅編碼成熟多肽的多核苷酸序列(如SEQ ID No．1中21-1493位多核苷酸)、包含編碼成熟多肽的多核苷酸序列和任選的其它編碼序列或非編碼序列(例如內(nèi)含子或編碼成熟多肽的多核苷酸序列5’端和／或3’端的非編碼序列)的多核苷酸序列(如SEQ ID No．1中1-1801位多核苷酸)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上面所描述的多核苷酸的各種變體，它們編碼含有SEQ ID No．2所示的推定的氨基酸序列多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸變體可以是天然存在的等位基因變體或非天然存在的多核苷酸變體。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸也可能與特定的標(biāo)記序列在同一讀框中相融合，標(biāo)記序列可幫助本發(fā)明多肽的純化。標(biāo)記序列在使用細(xì)菌宿主時(shí)可以是pQE載體的六聚組氨酸標(biāo)記，以利于融合有標(biāo)記的成熟多肽的純化，或者當(dāng)使用哺乳類宿主(如猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系)時(shí)，標(biāo)記序列可以是一種血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。此外，包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列還可包含同源或異源的特定信號(hào)肽序列，以幫助目的蛋白質(zhì)分泌到原核細(xì)胞或真核細(xì)胞膜外。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，上述標(biāo)記序列和信號(hào)肽序列也可通過(guò)重組方法或化學(xué)法添加在用于表達(dá)本發(fā)明多肽的載體上。
本發(fā)明的多核苷酸序列也包括全長(zhǎng)cDNA的片段，例如含有SEQID NO 1所示序列中連續(xù)的至少10個(gè)，優(yōu)選的至少20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的至少50個(gè)核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及能與上述序列雜交的多核苷酸，這兩個(gè)序列間至少有70％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的同源性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下能與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。這里所用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”意味著兩序列之間有95％，優(yōu)選至少97％同源性才能發(fā)生雜交。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽基本保持了與SEQ ID No．2所示多肽相同的生物功能或活性。
另一選擇是，與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸至少含20個(gè)堿基，優(yōu)選至少30個(gè)堿基，更優(yōu)選至少50個(gè)堿基并且具有上面所描述的同源性，其可以保留或不保留活性。例如，這樣的多核苷酸可以用作為檢測(cè)SEQ ID No．1所示多核苷酸或其同源序列的探針；又如，其可以用于本發(fā)明多核苷酸的回收或者作為一種診斷探針或PCR引物。
本發(fā)明的DNA序列可用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離DNA。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源性多核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。
編碼Fe65L2-2的特異DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所需多肽的雙鏈DNA。
分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞中分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫(kù)。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫(kù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法(Sambrook，等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning，aLaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory．New York，1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫(kù)，如Clontech公司的不同cDNA文庫(kù)。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時(shí)，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫(kù)中篩選本發(fā)明的多核苷酸序列。這些方法包括但不限于(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因的功能出現(xiàn)或喪失；(3)測(cè)定Fe65L2-2的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)或測(cè)定生物學(xué)活性檢測(cè)基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單獨(dú)使用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針可與本發(fā)明多核苷酸的任何一部分具有相同性，其長(zhǎng)度至少是15個(gè)核苷酸，優(yōu)選是20-30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選是50-60個(gè)核苷酸，最優(yōu)選是100個(gè)核苷酸以上。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因DNA序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用做探針。DNA探針可用放射性同位素、熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等標(biāo)記。第(4)種方法中，檢測(cè)Fe65L2-2基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡、放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
由于本申請(qǐng)?zhí)峁┝薋e65L2-2的全長(zhǎng)cDNA序列，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA／RNA的方法(Saiki，等人，科學(xué)1985；2301350-1354)優(yōu)先用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACEcDNA末端快速擴(kuò)增法)，在上述PCR方面所用的引物根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息可適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA／RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段的核苷酸序列的測(cè)定可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，1977，745463-5467)。這類核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。為了獲得全長(zhǎng)的cDNA序列，測(cè)序需反復(fù)進(jìn)行。有時(shí)需要測(cè)定多個(gè)克隆的cDNA序列，以拼接成全長(zhǎng)的cDNA序列。
本發(fā)明的多核苷酸序列的全部或部分也可通過(guò)本領(lǐng)域周知的化學(xué)方法合成(Caruthers，M．H．等人，(1980)Nucl．Acids Res．Symp．Ser．215-223；Horn，T．等人，(1980)Nucl．Acid Res．Symp．Ser． 225-232)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有SEQ ID No．2所示推定氨基酸序列的多肽及其活性片段、類似物和衍生物。SEQ ID No．2所示推定氨基酸序列為含491個(gè)氨基酸殘基的成熟多肽。
SEQ ID No．2所示多肽的“片段”、“衍生物”和“類似物”指能基本保留該多肽的生物學(xué)功能或活性的多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然存在的多肽或合成的多肽，優(yōu)選為重組多肽。SEQ ID No．2所示的多肽的片段、衍生物和類似物可以是(ⅰ)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守性或非保守性氨基酸殘基所取代(優(yōu)選是保守性氨基酸殘基)的多肽，取代的氨基酸殘基是或不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸。例如，可以通過(guò)氨基酸殘基的插入、取代和／或刪除，得到Fe65L2-2的沉默突變體或功能等同物?？苫诎被釟埢g在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和／或兩親性等方面的相似性進(jìn)行保守性氨基酸取代，只要保留Fe65L2-20的活性；或(ⅱ)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基帶有取代基團(tuán)的多肽；或(ⅲ)成熟多肽與其它功能性化合物，如提高多肽半壽期的化合物(例如聚乙二醇)融合在一起的多肽；或(ⅳ)成熟多肽與其它氨基酸序列相融合的多肽，其中所述其它氨基酸序列包括諸如幫助純化成熟蛋白的氨基酸序列或蛋白原序列等。這些幫助純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于金屬鰲合肽，如用于在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊；用于在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域以及用于FLAGS延伸／親和純化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域(IMMUNEX公司，Seattle，Wash．)。特異于因子X(jué)A或腸激酶的斷裂接頭序列也可用于幫助目的蛋白質(zhì)的純化(Porath，J．等人(1992)，Prot．Exp．Purif．3263-281)。從這些公開(kāi)內(nèi)容看，這樣的片段、衍生物和類似物的應(yīng)處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID No．2所示的多肽，即成熟多肽，也包括與SEQ ID No．2多肽至少有70％相似性(優(yōu)選是70％相同性)的多肽，優(yōu)選至少有90％相似性(優(yōu)選是90％的相同性)的多肽，更優(yōu)選至少有95％相似性(優(yōu)選是95％相同性)的多肽，也包括這些多肽的一些部分，通常這些多肽部分至少含有30個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的多肽、其保守性變體和生物活性片段及衍生物可以用常規(guī)的肽合成的方法制備，例如固相肽合成(Merrifield J．(1963)，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J．Am．Chem．Soc．)852149-2154；Roberge，J．Y．等人，(1995)科學(xué)，269202-204)。蛋白質(zhì)合成可以手工完成，也可利用肽自動(dòng)合成儀如Applied Biosystems 431A肽合成儀進(jìn)行(PerkinElmer)。本發(fā)明多肽也可以從天然生物材料中經(jīng)分離純化得到，但優(yōu)選利用本發(fā)明提供的多核苷酸用重組DNA技術(shù)制備。根據(jù)重組生產(chǎn)方法中所用的宿主不同，本發(fā)明中的多肽可能被糖基化或不被糖基化。該多肽也可能具有起始的甲硫氨酸殘基。
根據(jù)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可表達(dá)或制備重組的Fe65L2-2多肽(科學(xué)，1984；2241431)。本發(fā)明因而涉及制備本發(fā)明Fe65L2-2多肽的方法，一般包括以下步驟(1)．用本發(fā)明編碼Fe65L2-2的多核苷酸(或變體)或含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞；(2)．在合適的培養(yǎng)基中及適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3)．從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化目的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明多核苷酸的重組載體、帶有本發(fā)明重組載體的遺傳工程化宿主細(xì)胞和通過(guò)重組技術(shù)制備本發(fā)明多肽的方法。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來(lái)經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生多肽。例如，該多核苷酸可以存在于選自多種用于表達(dá)多肽的表達(dá)載體中的任一載體上，這些載體包括染色體的、非染色體的及合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒、衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA結(jié)合的載體、病毒DNA、桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及偽狂犬病毒，包括但不限于pQE系列(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH系列(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)；pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不過(guò)，只要是能在宿主中復(fù)制和存活，其它質(zhì)粒或載體也可應(yīng)用。
本發(fā)明也包括含有本發(fā)明多核苷酸的重組構(gòu)建體。該構(gòu)建體包括載體，如上述質(zhì)?；虿《据d體，其中可正向或反向插入本發(fā)明的多核苷酸序列。構(gòu)建體中還包含調(diào)節(jié)序列，例如，有效地連接到本發(fā)明多核苷酸序列上的啟動(dòng)子(包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)，介導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。合適的啟動(dòng)子包括但不限于，λ噬菌體的PL啟動(dòng)子、桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子；細(xì)菌啟動(dòng)子如；LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp；真核啟動(dòng)子如CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白I啟動(dòng)子；還包括衍生自植物細(xì)胞基因組中的啟動(dòng)子，如熱休克蛋白、RUBISCO啟動(dòng)子。
表達(dá)載體也包含翻譯起始所需要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子，其還可以具有增強(qiáng)表達(dá)的合適序列，如增強(qiáng)子。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常有大約10-300bp，作用于啟動(dòng)子，提高它的轉(zhuǎn)錄。例如，SV40中位于復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)100-270bp處的增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子及腺病毒增強(qiáng)子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選還包含能提供表型特征的一種或多種選擇性基因、抗性基因和／或標(biāo)記基因，以便于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的篩選。選擇性基因如幫助細(xì)胞利用吲哚或組氨醇的trpB、hisD(Hartman，S．C．，和R．C．Mulligan(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)858047-51)，用于tk-或aprt-細(xì)胞的肝皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M．等人(1977)細(xì)胞11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy，I．等人(1980)細(xì)胞22817-23)；抗性基因如賦予氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶DHFR(Wigler，M．等人(1989)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，773567-70)或賦予新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn)．等人(1981)生物化學(xué)雜志(J．Mol．Biol．)，1501-14)，以及四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。哺乳類表達(dá)載體一般包括復(fù)制起點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷化位點(diǎn)、拼接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位點(diǎn)可用于提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。此外，包含編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的載體還可包含同源或異源的特定信號(hào)肽序列，以幫助目的蛋白質(zhì)分泌到原核細(xì)胞或真核細(xì)胞膜外。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，上述表達(dá)載體及構(gòu)建體中含有的標(biāo)記序列和信號(hào)肽序列也可通過(guò)重組方法或化學(xué)法添加在編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸上。
合適載體和啟動(dòng)子的選擇為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知。細(xì)菌適用的有效表達(dá)載體可以這樣來(lái)構(gòu)建將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列隨同適當(dāng)?shù)姆g起始和終止信號(hào)被插入到帶有一個(gè)功能啟動(dòng)子的可操縱的閱讀框中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知用于構(gòu)建含有本發(fā)明核苷酸序列以及合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控元件的方法。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)遺傳重組技術(shù)(Sambrook，J．(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N．Y．；Ausubel，F(xiàn)．M．(1989)當(dāng)代分子生物學(xué)方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，N．Y．)。
包含上述合適的DNA序列、合適的啟動(dòng)子或控制序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化合適的宿主，讓宿主表達(dá)該蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，根據(jù)本發(fā)明DNA序列所插入的表達(dá)載體或構(gòu)建體的種類和特性選擇合適的宿主以表達(dá)目的蛋白質(zhì)。適于表達(dá)本發(fā)明的多肽的宿主包括但不限于原核宿主，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等；真核宿主，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲(chóng)細(xì)胞，諸如果蠅S2和草地夜蛾Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS(猴腎成纖維細(xì)胞系，Gluzman(細(xì)胞23175，1981)及其它的能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa、BHK、Bowes黑素瘤細(xì)胞；植物細(xì)胞以及腺病毒等等。各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)也能用于表達(dá)重組蛋白。從這些講授看，合適宿主的選擇應(yīng)該在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
帶有如上所述的含有本發(fā)明核苷酸序列之載體或構(gòu)建體能夠通過(guò)傳統(tǒng)的方法導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生重組產(chǎn)物。將構(gòu)建體導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，包括但不限于氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法(Sambrook，J．(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N．Y．；Ausubel，F(xiàn)．M．(1989)當(dāng)代分子生物學(xué)方法，John Wiley & Sons，N．Y．；Hobbs，S．等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)，McGraw Hill，N．Y．191-196；Engelhard，E．K．等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，913224-3227；Logan，J．等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，813655-3659)。
在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件與培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株或細(xì)胞，使其生長(zhǎng)到恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用適當(dāng)?shù)姆椒?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)藥品誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。針對(duì)不同的宿主菌株或細(xì)胞選擇以及所表達(dá)的目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)相應(yīng)的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍之內(nèi)。
在合適的啟動(dòng)子控制下可以在哺乳類細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)成熟蛋白。利用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA，也可以用無(wú)細(xì)胞翻譯體系產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)(Sambrook，J．(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第18章第4節(jié)，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N．Y．)。
通常用離心的方法收獲細(xì)胞或培養(yǎng)液。對(duì)于目的蛋白質(zhì)保留在胞內(nèi)的情況，一般可用任何便捷的物理、化學(xué)方法或酶法，包括凍融循環(huán)、超聲波、機(jī)械破碎，或使用細(xì)胞溶解劑或特定的酶破碎細(xì)胞，將所得粗提物保留以進(jìn)一步純化。對(duì)于對(duì)于目的蛋白質(zhì)分泌到胞外的情況，可直接從培養(yǎng)上清液中利用常規(guī)方法回收目的蛋白質(zhì)。這些方法都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。
將多肽從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化的方法有硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、體積排阻層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。形成成熟蛋白的完整構(gòu)象還需要蛋白質(zhì)的重折疊步驟。通常高效液相層析(HPLC)或毛細(xì)管電泳可應(yīng)用于最后的純化步驟。
本發(fā)明中的多核苷酸和多肽可用作研究試劑和材料，以發(fā)現(xiàn)由于淀粉樣沉淀的產(chǎn)生引起的神經(jīng)退行性疾病的診斷、治療和／或預(yù)防方法。這種多核苷酸和其編碼的多肽也可用于體外的相關(guān)科學(xué)研究，以篩選調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽與APP相互作用的蛋白質(zhì)或化合物分子，還用于設(shè)計(jì)治療、診斷和／或預(yù)防由于淀粉樣沉淀的產(chǎn)生引起的神經(jīng)退行性疾病的方法。
本發(fā)明涉及利用本發(fā)明全長(zhǎng)Fe65L2-2基因的片段作為cDNA文庫(kù)的雜交探針，從而分離出全長(zhǎng)基因和與之有高度序列相似性或相似生物學(xué)活性的其它基因。這種類型的探針一般至少有20個(gè)堿基。但是，這些探針優(yōu)選至少有30個(gè)堿基并且一般不超過(guò)50個(gè)堿基，盡管它們可以具有更多的堿基。該探針也可以用于鑒定相應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆或具有完整基因，包括調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子及內(nèi)含子的基因組克隆。篩選的一種方法是，利用已知的DNA序列合成一個(gè)寡核苷酸探針，用它去分離出基因的編碼區(qū)域。與本發(fā)明的多核苷酸序列互補(bǔ)的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸可用于篩選人類cDNA文庫(kù)、基因組文庫(kù)、mRNA文庫(kù)，以確定文庫(kù)中哪些成員與探針雜交。
本發(fā)明還涉及利用Fe65L2-2基因產(chǎn)物檢測(cè)與Fe65L2-2的多核苷酸序列突變相關(guān)的疾病或?qū)膊〉囊赘行缘脑\斷方法。這些疾病與本發(fā)明的Fe65L2-2基因的mRNA及編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)量或活性升高有關(guān)，例如阿爾茨海默癥和癡呆。
可以用各種技術(shù)在DNA的水平上檢測(cè)出Fe65L2-2基因突變的個(gè)體。用于診斷的核酸可以從病人的細(xì)胞中獲得，例如血液、尿液、唾液、活組織檢查和尸體解剖材料。基因組DNA可以直接用于檢測(cè)，也可以在檢測(cè)分析前用PCR進(jìn)行酶法擴(kuò)增(Saiki等人，自然324163-166，1986)。RNA或cDNA也可用于同樣目的。例如，與編碼Fe65L2-2基因的核酸互補(bǔ)的PCR引物可用來(lái)鑒定和分析Fe65L2-2基因的突變。例如，從擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與正常基因型相比發(fā)生的變化中可以檢出缺失和／或插入突變。將擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的Fe65L2-2 RNA雜交可檢測(cè)點(diǎn)突變，或者使用放射性標(biāo)記Fe65L2-2反義DNA序列來(lái)進(jìn)行雜交。用RNA酶A消化或從解鏈溫度的不同或改變可以區(qū)分完全配對(duì)的序列與錯(cuò)配的雙螺旋。
通過(guò)檢測(cè)DNA片段在含有或不含有變性劑的凝膠中電泳遷移率的變化，可以進(jìn)行基于DNA序列差異的遺傳學(xué)測(cè)試。小序列的缺失和插入可以從高分辨率的凝膠電泳中看出。例如，不同大小的DNA片段可以在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中區(qū)別出來(lái)。含有點(diǎn)突變的DNA序列與正常的DNA序列分別變性后在不含變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中可因構(gòu)象的不同(泳動(dòng)速度不同)而區(qū)別開(kāi)來(lái)。
核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)可以揭示特定位置的序列變化，比如RNA酶和S1酶保護(hù)法或者化學(xué)斷裂法(Cotton等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)854397-4401，1985)。
總之，特異DNA序列可以用下述方法檢測(cè)雜交、RNA酶保護(hù)、化學(xué)斷裂、直接DNA測(cè)序或使用限制性內(nèi)切酶(例如，限制片段長(zhǎng)度的多態(tài)性RFLP)及基因組DNA的Southern印跡技術(shù)。
除了較傳統(tǒng)的凝膠電泳和DNA測(cè)序方法外，突變還可用原位分析檢測(cè)出來(lái)。
本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)各種組織中Fe65L2-2基因的mRNA表達(dá)異常的診斷方法。mRNA水平的變化可用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Northern印跡、點(diǎn)雜交或RNA原位雜交等方法進(jìn)行檢測(cè)。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是周知的。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)各種組織中Fe65L2-2基因蛋白水平改變的診斷方法，與正常對(duì)照組織樣品相比，F(xiàn)e65L2-2蛋白的增加可提示疾病或疾病易感性的存在(如阿爾茨海默癥)。測(cè)定宿主樣品中Fe65L2-2基因蛋白水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括放射性免疫測(cè)定法、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法、Western印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附法和夾心測(cè)定法。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)(Coligan等人，現(xiàn)代免疫學(xué)方法(Current Protocols in Immunology)卷1，No．2，第6章，1991)要預(yù)先準(zhǔn)備針對(duì)Fe65L2-2抗原的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。另外，還要準(zhǔn)備抗單克隆抗體的報(bào)告抗體。報(bào)告抗體上連有一個(gè)可檢測(cè)的試劑，諸如放射性同位素、熒光或辣根過(guò)氧化物酶等標(biāo)記。例如，從宿主取得樣品并在一個(gè)固相載體上溫育，例如聚苯乙烯反應(yīng)板，它能吸附樣品中的蛋白。然后用一種非特異性蛋白如牛血清白蛋白(BSA)溫育，覆蓋板上任何游離的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。第二步，加入單克隆抗體在板中溫育，這時(shí)，單克隆抗體與附著在聚苯乙烯反應(yīng)板上的Fe65L2-2基因蛋白結(jié)合。所有未結(jié)合上的單克隆抗體用緩沖液洗去。與辣根過(guò)氧化物酶相連的報(bào)告抗體此時(shí)加入板中，結(jié)果報(bào)告抗體就與結(jié)合在Fe65L2-2抗原上的單克隆抗體相結(jié)合。未結(jié)合上的報(bào)告抗體也被洗掉。然后加入過(guò)氧化物酶的底物，在一定的時(shí)間內(nèi)所形成的顏色的深淺與標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較，就能測(cè)出一定體積的病人樣品中Fe65L2-2基因蛋白的含量。
競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法也可用于這項(xiàng)檢測(cè)。將Fe65L2-2抗原的特異性抗體連到一個(gè)固相載體上，然后讓標(biāo)記的Fe65L2-2和從宿主獲得的樣品一起通過(guò)固相載體并檢測(cè)標(biāo)記物的數(shù)量，例如用液相閃爍計(jì)數(shù)器。標(biāo)記物的數(shù)量與樣品中的Fe65L2-2的數(shù)量相關(guān)。夾心測(cè)定法類似于酶聯(lián)免疫吸附法，包括雙抗原夾心法和雙抗體夾心法。在雙抗體夾心測(cè)定法中，F(xiàn)e65L2-2通過(guò)固體載體，與吸附在固相載體上的抗體結(jié)合。第二種抗體又結(jié)合到Fe65L2-2上。第三種抗體是被標(biāo)記的并對(duì)第二種抗體有特異性，當(dāng)它通過(guò)固相載體時(shí)就結(jié)合到第二種抗體上，然后檢測(cè)它的數(shù)量。
本發(fā)明還涉及一種篩選可調(diào)節(jié)Fe65L2-2蛋白質(zhì)與APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用的分子，特別是兩者之間相互作用的拮抗劑及抑制劑的方法，包括使用本發(fā)明的多肽或其片段篩選多肽庫(kù)或藥物候選物文庫(kù)，用于尋找能降低、抑制Fe65L2-2蛋白含量或其與APP相互作用的活性的分子。Fe65L2-2與APP相互作用的結(jié)構(gòu)域已有描述(生物化學(xué)雜志(J．Biol．Chem．)，1997，272(10)，6399-6405)。Fe65L2-2的兩個(gè)串聯(lián)的磷酸酪氨酸相互作用／磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PID／PTB)可與APP胞內(nèi)區(qū)域相互作用。本發(fā)明多肽的拮抗劑以及抑制劑的篩選根據(jù)相互作用的測(cè)定以及待測(cè)候選藥物的功效通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知的方法進(jìn)行，如表面胞質(zhì)基因組共振(surfaceplasmon resonance)、能量轉(zhuǎn)移法、共沉淀法、酵母相互作用阱法或重疊雜交法等。本發(fā)明也提供了篩選藥物以鑒定阻遏(拮抗劑)或抑制Fe65L2-2與APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用的藥物的方法。拮抗劑阻止和治療由于淀粉樣沉淀的形成引起的神經(jīng)退行性疾病，包括但不限于阿爾茨海默癥和癡呆。例如，可將同時(shí)表達(dá)Fe65L2-2和APP蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在候選藥物的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知的方法對(duì)Fe65L2-2和APP蛋白相互作用形成的復(fù)合物進(jìn)行標(biāo)記，然后與不存在候選藥物時(shí)所形成的標(biāo)記復(fù)合物的量加以比較。從而判斷待測(cè)藥物是否為Fe65L2-2和APP蛋白相互作用的拮抗劑或抑制劑。Fe65L2-2蛋白的拮抗劑可以與人Fe65L2-2蛋白結(jié)合并消除其與APP蛋白的相互作用功能，或是抑制人Fe65L2-2蛋白的產(chǎn)生，或是與多肽的活性位點(diǎn)結(jié)合使多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。在篩選化合物作為拮抗劑時(shí)，可以將此種新的人Fe65L2-2蛋白加入生物分析測(cè)定中，通過(guò)測(cè)定此種新的人Fe65L2-2蛋白與APP蛋白之間的相互作用來(lái)確定化合物是否是拮抗劑。以上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起抑制物作用的分子。這些通過(guò)本發(fā)明方法獲得的Fe65L2-2或其片段的拮抗劑及抑制劑可如上所述配制成藥物組合物用于上述疾病的治療。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為基因芯片)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。
作為Fe65家族蛋白一員的本發(fā)明Fe65L2-2蛋白，其含量增加或活性升高可能與由于淀粉樣沉淀引起的神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。因此，給予受試者治療有效劑量的Fe65L2-2拮抗劑或活性抑制劑，可治療、緩解和／或預(yù)防由于淀粉樣沉淀引起的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥和癡呆。
Fe65L2-2多肽及其具有生物活性的片段、類似物和衍生物可以與藥學(xué)可接受載體一起在組合物中使用，這樣的組合物中包括有效治療劑量的多肽和藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。這樣的載體有-但并不限制于-鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。配制品應(yīng)該適合給藥方式。
本發(fā)明的藥物組合物還包括利用本發(fā)明的多肽制備的疫苗，其包括本發(fā)明的多肽或其具有生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的片段，其中任選地還含有弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑以及其它藥學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明也提供了一種藥物包裝或試劑盒，包括一個(gè)或多個(gè)裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分的容器。另外，這些多肽及其具有生物活性的片段、類似物和衍生物也可與其它的治療化合物組合使用。
這些藥物組合物可用一種方便的方式給藥，諸如表皮、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑。這些藥物組合物以治療和／或預(yù)防具體適應(yīng)癥的有效劑量使用。
本發(fā)明的Fe65L2-2多核苷酸序列的公開(kāi)為設(shè)計(jì)通過(guò)反義技術(shù)抑制Fe65L2-2基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，從而達(dá)到治療、緩解和／或預(yù)防與本發(fā)明多肽的含量增加或活性升高的疾病的目的。
利用反義技術(shù)是指根據(jù)本發(fā)明Fe65L2-2基因的編碼區(qū)、控制或調(diào)節(jié)區(qū)依照堿基配對(duì)原理設(shè)計(jì)相應(yīng)的反義分子(DNA、RNA、或肽核酸(PNA))。最近，文獻(xiàn)中還報(bào)道了利用三螺旋DNA在治療中的應(yīng)用(Gee，J．E．等人，(1994)Huber，B．E．和B．I．Carr，分子與免疫方法(Molecular and Immunologic Approaches)，F(xiàn)utura PublishingCo．，Mt．Kisco，N．Y．，163-177頁(yè))?；パa(bǔ)序列或反義分子也可通過(guò)防止轉(zhuǎn)錄本與核糖體的結(jié)合以阻止mRNA的翻譯。
其中，“肽核酸”是指一種反義分子或反基因物，其包含與以賴氨酸結(jié)尾的氨基酸殘基之肽骨架連接的寡核苷酸，寡核苷酸的長(zhǎng)度至少為5個(gè)核苷酸。末端的賴氨酸賦予對(duì)組合物的溶解性。肽核酸優(yōu)先結(jié)合互補(bǔ)性單鏈DNA或RNA，終止轉(zhuǎn)錄的延伸，也可延長(zhǎng)其在細(xì)胞中的半壽期(Nielsen，P．E．等人，(1993)抗癌癥藥物研究(AnticancerDrug Res．)，853-63)。
將根據(jù)本發(fā)明多核苷酸設(shè)計(jì)的反義分子用于基因治療方法例如包括，將病人的細(xì)胞在離體情況下通過(guò)特定載體導(dǎo)入治療有效劑量的Fe65L2-2多核苷酸反義分子，再將處理的細(xì)胞供給待治療的病人。導(dǎo)入這些以及其它的反義分子的方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是很清楚的。例如除了逆轉(zhuǎn)錄病毒外，還有別的載體，例如腺病毒，把它與一個(gè)合適的運(yùn)輸載體結(jié)合后可在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
可以衍生出上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒、脾壞死病毒、勞斯氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和哺乳動(dòng)物腫瘤病毒。
上述載體中可包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子?？墒褂玫暮线m啟動(dòng)子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR、SV40啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Miller生物技術(shù)(Biotechniques)，卷7，No．9，980-990頁(yè)，1989)或其它啟動(dòng)子(例如，真核細(xì)胞啟動(dòng)子包括但不限制于組蛋白、polⅢ、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。其它可用的病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。從這里的講授，合適啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍之內(nèi)。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列應(yīng)在合適啟動(dòng)子的控制之下。合適的啟動(dòng)子包括但不限于，腺病毒的啟動(dòng)子，比如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，比如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞體病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，比如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，比如單純性皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR(包括上面所描述的修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；及人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。也可以是控制編碼該多肽的基因的自身啟動(dòng)子。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系而形成生產(chǎn)細(xì)胞系。用于轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞包括，但不限制于，PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAM12和DNA細(xì)胞系，如Miller所描述(人類基因治療(HumanGene Therapy)卷1，5-14頁(yè)，1990)，此處全文引入作為參考?？捎帽绢I(lǐng)域的已知方法用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系。這些方法包括但不限于，電穿孔、使用脂質(zhì)體和磷酸鈣沉淀。一種可選擇的方法是將逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒載體包裹進(jìn)脂質(zhì)體中或與脂類偶聯(lián)，然后注入宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生具感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，此病毒顆粒中包含編碼這些多肽的核酸序列。這樣的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?？捎糜隗w外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼多肽的核酸序列。可用于轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞包括但不限于，胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
利用本發(fā)明的多肽及其免疫原性片段、衍生物或類似物或表達(dá)它們的細(xì)胞可用作免疫原以產(chǎn)生其抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包含了嵌和的、單鏈的和人源化的抗體以及Fab片段、或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的各種方法可用于這樣的抗體和片段的產(chǎn)生。
所產(chǎn)生的針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體可通過(guò)直接將本發(fā)明的多肽或其免疫原性片段注射給動(dòng)物或?qū)⑵鋵?dǎo)入動(dòng)物(最好不是人)而獲得。所得到的抗體可與多肽本身結(jié)合。用這種方法，甚至用只編碼本發(fā)明多肽的片段序列也能獲得結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。然后，抗體可用于檢測(cè)或篩選可調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽與APP蛋白相互作用的檢測(cè)方法中。
制備單克隆抗體可以用連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的技術(shù)。例如，用雜交瘤技術(shù)(Kohle & Milstein自然256495-497，1975)、Trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，今日免疫學(xué)(Immunology Today)472，1983)和EBV-雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生人的單克隆抗體(Cole等人，單克隆抗體與癌癥治療(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，Alan R．Liss，Inc．，77-96頁(yè)，1985)。
單鏈抗體產(chǎn)生技術(shù)(美國(guó)專利4，946，778)適用于產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可用來(lái)表達(dá)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
實(shí)施例本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述。但是本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。所有的份和量，除非另有說(shuō)明都按重量計(jì)。
DNA的“消化”指用限制酶對(duì)DNA進(jìn)行催化性切割，限制酶只作用于DNA序列的特定位點(diǎn)。這里所用的各種限制酶可從商業(yè)獲得，它們的反應(yīng)條件、輔助因子和其它的要求按照一般技術(shù)人員所知的應(yīng)用。為了分析需要，通常在大約20μl的緩沖溶液中加入1μg質(zhì)?；駾NA片段和大約2個(gè)單位的酶。為了分離DNA片段用于質(zhì)粒構(gòu)建，通常在一個(gè)較大的的體積中用20到250個(gè)單位的酶消化5到50μg的DNA。生產(chǎn)廠家會(huì)指明對(duì)特異限制酶合適的緩沖液和底物的量。通常所用的溫育時(shí)間大約是37℃一個(gè)小時(shí)，但根據(jù)廠家的指示可以有所改變。限制性消化之后直接在聚丙烯酰胺膠上進(jìn)行電泳，分離出想要的片段。
根據(jù)所切割成的片段大小進(jìn)行分離可用8％的聚丙烯酰胺凝膠(Goedde等人，Nucleic Acids Research 84057，1980)。
“連接”指在兩個(gè)雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。除非提供了別的方法，連接可以在已知的緩沖液和條件下進(jìn)行，即每0．5mg約等摩爾量的用于連接的DNA片段加10個(gè)單位的T4 DNA連接酶(“連接酶”)。
除非另有說(shuō)明，轉(zhuǎn)化均用Graham & Van der Eb病毒學(xué)(Virology)52456-457，1973中所描述的方法進(jìn)行。實(shí)施例1Fe65L2-2基因的重組表達(dá)及鑒定把PBS-SK質(zhì)粒中裝有的Fe65L2-2基因用PCR(引物兩端酶切位點(diǎn)分別為EcoR I和BamH I，SEQ．ID．No1)方法擴(kuò)增出來(lái)，再連接到pBV220表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到DH5α宿主菌中。通過(guò)測(cè)定在LB板上的生長(zhǎng)能力，鑒定轉(zhuǎn)化體，并篩選出氨芐青霉素抗性菌落。質(zhì)粒DNA通過(guò)限制性分析分離和確定，將含有所需構(gòu)建物的克隆在補(bǔ)充有Amp(100μl／ml)的LB介質(zhì)液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。用過(guò)夜培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的比率來(lái)接種大量的培養(yǎng)物，將細(xì)胞生長(zhǎng)到光密度600(O．D．600)為0．4到0．6之間。42℃誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，12％SDS-PAGE膠鑒定表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果在分子量為58kD附近，出現(xiàn)了一條新的主條帶。分子量大小與我們預(yù)期的Fe65L2-2的分子量吻合，經(jīng)數(shù)次重復(fù)之后得到同樣結(jié)果，將SDS-PAGE膠上的蛋白條帶通過(guò)電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至PVDF膜上，切下膜的蛋白的相應(yīng)條帶，測(cè)定N端15個(gè)氨基酸序列，得到結(jié)果與通過(guò)DNA序列推導(dǎo)出的氨基酸順序是一致的。由此判斷Fe65L2-2基因用pBV220載體成功表達(dá)。實(shí)施例2原核表達(dá)的Fe65L2-2蛋白的初步純化用前述方法大量發(fā)酵含有Fe65L2-2基因的基因工程菌，收集菌體后用超聲波破菌20分鐘，然后取上清和沉淀分別走SDS-PAGE膠，結(jié)果表達(dá)的蛋白條帶主要出現(xiàn)在沉淀中。這表明表達(dá)的Fe65L2-2蛋白主要以包涵體形式存在。然后將沉淀用4M的尿素溶液洗滌4次，再用8M尿素溶液溶解剩余沉淀。將溶解液走SDS-PAGE，可發(fā)現(xiàn)經(jīng)洗滌后已去除大多雜蛋白條帶。將目的蛋白在SDS-PAGE角上相應(yīng)的條帶切下，置于透析袋之中，袋中在灌滿電泳緩沖液。然后把透析袋放于電轉(zhuǎn)印槽中用90V電洗滌6小時(shí)，將膠上藍(lán)色條帶洗脫至緩沖液中。收集透析袋中溶液，SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)已得到單一條帶的蛋白。實(shí)施例3Fe65L2-2蛋白多克隆抗體制備經(jīng)前述方法初步純化的Fe65L2-2蛋白，先冷凍抽干濃縮至100mg／ml。取1mg的蛋白溶液，先用生理鹽水稀釋至1ml，再加入1ml完全弗氏佐劑，反復(fù)混勻制成白色乳濁狀態(tài)。將混好的抗原皮下多點(diǎn)注射，免疫健康的新西蘭大白兔。16天之后，取0．5mg的抗原溶液，加生理鹽水稀釋至0．5ml，再加入0．5ml弗氏不完全佐劑，進(jìn)行第二次免疫。然后在間隔兩周后，按第二次免疫的劑量進(jìn)行第三次免疫。一周后取血，得到抗血清。經(jīng)瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定效價(jià)，證明已得到了Fe65L2-2蛋白的多克隆抗體。實(shí)施例4酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)采用Clontech公司的lex A酵母雙雜交系統(tǒng)，選用EcoR I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，把Fe65L2-2cDNA克隆到含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的plex A載體上，同時(shí)根據(jù)APP基因C端序列設(shè)計(jì)引物從cDNA文庫(kù)中PCR得到編碼APP蛋白胞內(nèi)區(qū)的序列。(兩端加上酶切位點(diǎn)(EcoR I和Xho I)，將此序列克隆到含有活性結(jié)構(gòu)域的pB42AD載體上。測(cè)序驗(yàn)證兩個(gè)重組子序列正確之后，共轉(zhuǎn)化酵母菌EGY48[p80P-lac Z]。用含X-gal的相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基篩選和鑒定。如果APP蛋白能與Fe65L2-2蛋白相結(jié)合，則能篩選到藍(lán)色菌落；否則則不能。但同時(shí)也要把作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到EGY48[p80P-lacZ]，用同樣的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和鑒定，如果出現(xiàn)相應(yīng)的陰性或陽(yáng)性結(jié)果，才可以確定前面的蛋白結(jié)合與否的結(jié)果并非假象。還可以采用ONPG來(lái)定量檢測(cè)兩種蛋白相互作用的強(qiáng)弱。
同時(shí)可將比Fe65L2-2cDNA編碼區(qū)缺少21bp的那種剪接形式的Fe65L2cDNA也克隆到plex A載體上，定量檢測(cè)它與APP蛋白結(jié)合的強(qiáng)弱，并與前面Fe65L2-2與APP結(jié)合強(qiáng)弱的結(jié)果相對(duì)比。以此就可知道21bp的剪接差異對(duì)Fe65L2蛋白與APP的結(jié)合究竟有何種影響了。
另一方案是將Fe65L2-2基因的PID1克隆到plex A載體(BD)中，與構(gòu)建好的融合有AD的cDNA文庫(kù)共轉(zhuǎn)化EGY48酵母，用含X-gal的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選鑒定，并作假陽(yáng)性檢測(cè)。這樣可以篩選到與該基因PID1相互結(jié)合的蛋白。這將有助于進(jìn)一步明確PID1在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的作用，及Fe65L2-2蛋白所多出的7個(gè)氨基酸對(duì)PID1功能的影響。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名上海博容基因技術(shù)有限公司(B)街道中山北路1111號(hào)3號(hào)樓12層(C)城市上海(E)國(guó)家中國(guó)(F)郵政編碼200092(ⅲ)序列數(shù)2(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1809個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特性(A)名稱／關(guān)鍵詞CDS(B)位置21．．1493(ⅹⅰ)SEQ ID NO1的序列描述1 catatggagc agccggggtt atgctgggca aggattacat gctggccatc51 attctggtca actgcgatga tgacttgtgg ggggaccaca gtctggaggt101 ggaggctggc ctgcctcctg gctggaggaa gatccacgat gctgcaggta151 cttactactg gcatgtaccc agcggtagca cccagtggca gcgcccaacc201 tgggaactag gagatgcaga ggacccaggc acgggaacgg aggggatctg251 gggactgcgg ccccccaaag ggagatcctt ctccagcctg gagagttcac301 tggaccggag taactctctg tcctggtatg gtggggaatc ctacatccag351 agcatggagc caggggctaa gtgctttgca gtccgctctc tgggctgggt401 agaggtacct gaagaggacc tggcaccggg gaagagcagt attgcagtca451 ataactgtat ccagcagctg gcccagaccc gcagccggag ccagcctcca501 gatggtgcct ggggtgaggg ccagaacatg ctgatgatcc tgaagaagga551 tgccatgagc ctagtgaatc ccctggacca cagtctgatc cactgccagc601 ctctggtgca catccgtgtg tggggcgtgg ggagctccaa gggccgcccc
651 atctctgcccc tgctagggac ttcgcttttg tggcaagtga caaagatag701 ctgtatgctca agtgccatgt gtttcgctgt gatgtccctg ccaaggcca751 ttgccagtgcc ctacatgggc tttgtgccca gatcttgtca gagcgagta801 gaggtcagtgg tgatgcctct tgctgctccc cagaccccat ctctcctga851 agacctgccac ggcaagtgga gctgctagat gcggtaagcc aagctgctc901 agaagtacgag gcactgtata tggggacact gccagtcacc aaggccatg951 ggcatggatgt gctgaacgag gccattggta ccctcactgc cagggggga1001 ccggaatgcct gggtccccac catgctcagt gtgtctgact ctctcatga1051 ctgcacatccc attcaggcag aggccagtac agaggaggag ccattgtgg1101 cagtgccctgt gcgccttgtg acatttattg gtgttggccg cgacccaca1151 cacctttggcc tcatcgctga cctgggccgt cagagcttcc agtgcgcag1201 ccttctggtgc cagccccatg cagggggact ctctgaagct gtgcaggct1251 gcctgtatggt tcagtaccag aagtgtcttg tggcctctgc agctcgagg1301 caaggcctggg gtgcccaggc ccgtgcccgc ctgcggctca agcggacca1351 gctccatggat tccccaggag gtcccctgcc cctccccctg ctcaaagga1401 ggggttggcgg tgcaggggca acccctcgaa agcggggtgt cttctcttt1451 tcttgatgcct tccggctgaa accctctctg ctccatatgc cctaaactt1501 atctgggaagg ctggggaagt aggctctggg tccatgccta actctgtac1551 cgttttattcc tcaaggccta tagcctgtca ctccttgaag ccttctctg1601 cctgtccctcc gatccttgtc caccgtctat ttattgccca atttattgt1651 ttatacggatg actgggaggc actgcgccac aacgtaggac cctggctcc1701 cctttccttgg gtccttgtgt tccttgcccc tgtccaaccc tggacagtt1751 ggctctacctc agtaacactt tatagcaaaa tcagtgcaaa taaaaatcc1801 ctcagtgac(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度491個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)SEQ ID NO2的序列描述1 MLGKDYMLAI ILVNCDDDLW GDHSLEVEAG LPPGWRKIHD AAGTYYWHVP51 SGSTQWQRPT WELGDAEDPG TGTEGIWGLR PPKGRSFSSL ESSLDRSNSL101 SWYGGESYIQ SMEPGAKCFA VRSLGWVEVP EEDLAPGKSS IAVNNCIQQL
151 AQTRSRSQPP DGAWGEGQNM LMILKKDAMS LVNPLDHSLI HCQPLVHIRV201 WGVGSSKGRP ISAPARDFAF VASDKDSCML KCHVFRCDVP AKAIASALHG251 LCAQILSERV EVSGDASCCS PDPISPEDLP RQVELLDAVS QAAQKYEALY301 MGTLPVTKAM GMDVLNEAIG TLTARGDRNA WVPTMLSVSD SLMTAHPIQA351 EASTEEEPLW QCPVRLVTFI GVGRDPHTFG LIADLGRQSF QCAAFWCQPH401 AGGLSEAVQA ACMVQYQKCL VASAARGKAW GAQARARLRL KRTSSMDSPG451 GPLPLPLLKG GVGGAGATPR KRGVFSFLDA FRLKPSLLHM P
權(quán)利要求
1．一種分離的多肽，它包含具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體或其活性片段或衍生物。
2．如權(quán)利要求1所述的多肽，其包含具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超過(guò)5％且含有SEQ ID No．2中210-216位氨基酸序列的衍生物。
3．如權(quán)利要求2所述的多肽，其包含具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽。
4．一種分離的多核苷酸，其包含一種選自下組的核苷酸序列(a)編碼如權(quán)利要求1、2或3所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；和(c)與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少89％相同性并且包含SEQ ID No．1中647-667位序列的多核苷酸。
5．如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸包含編碼具有SEQ ID No．2所示氨基酸序列的多肽。
6．如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列包含SEQ ID No．1中21-1493位的序列，或者SEQ ID No．1中1-1809位的序列。
7．一種含有權(quán)利要求4、5或6所述多核苷酸的重組載體。
8．如權(quán)利要求7所述的載體，它是質(zhì)粒、粘?；虿《据d體。
9．一種含有權(quán)利要求4、5或6所述多核苷酸或者含有權(quán)利要求7或8所述載體的宿主細(xì)胞。
10．一種Fe65L2-2蛋白的制備方法，該方法包括(a)在適合表達(dá)Fe65L2-2蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有Fe65L2-2蛋白活性的多肽或其片段。
11．一種能與權(quán)利要求1所述的Fe65L2-2蛋白特異性結(jié)合的抗體。
12．一種篩選拮抗或抑制Fe65L2-2的活性或其表達(dá)或其與相關(guān)蛋白相互作用的化合物的方法，其包括利用權(quán)利要求1的多肽或其活性片段。
13．一種拮抗或抑制Fe65L2-2活性或其表達(dá)或其與相關(guān)蛋白相互作用的化合物。
14．一種體外檢測(cè)與權(quán)利要求1、2或3所述多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，其包括檢測(cè)生物樣品中所述多肽或其編碼多核苷酸序列的突變。
15．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述多核苷酸是DNA或mRNA。
16．一種體外檢測(cè)與權(quán)利要求1、2或3所述多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，包括檢測(cè)生物樣品中所述多肽的含量或其生物活性。
17．如權(quán)利要求4、5或6所述多核苷酸或其片段作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)、作為探針用于雜交反應(yīng)或者用于制造基因芯片或微陣列的用途。
18．一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1、2或3所述的多肽的抗體或其免疫活性片段、或者權(quán)利要求1、2或3所述多肽的拮抗劑或抑制物或以上各個(gè)組分的組合，其還含有藥學(xué)上可接受的載體。
19．一種藥物組合物，其含有針對(duì)如權(quán)利要求4所述多核苷酸的反義分子以及藥學(xué)上可接受的遞送載體。
20．權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的藥物組合物在治療由本發(fā)明Fe65L2-2與APP相互作用所引起的神經(jīng)退行性疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了分離的人Fe65L2－2基因的多核苷酸序列及其編碼的多肽,以及制備這種多肽的方法。并且公開(kāi)了通過(guò)檢測(cè)該基因核酸水平的突變及多肽水平的改變,檢測(cè)與該基因的核酸及其編碼多肽異常有關(guān)的疾病的診斷方法,也公開(kāi)了利用該基因的多核苷酸序列和多肽治療與該基因異常有關(guān)的疾病的用途和用于上述治療的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1294193SQ9912336
公開(kāi)日2001年5月9日 申請(qǐng)日期1999年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月26日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請(qǐng)人:上海博容基因開(kāi)發(fā)有限公司