專利名稱：：馬傳染性貧血病毒代表毒株的全基因克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及馬傳染性貧血病毒的一種強(qiáng)毒株(本文稱為遼系野毒株或LN)和一種經(jīng)過多次馬屬動(dòng)物細(xì)胞傳代得到的減毒疫苗株(本文稱為驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株或FD)的全長(zhǎng)前病毒DNA序列、各功能基因的DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列及各功能基因及蛋白產(chǎn)物的應(yīng)用。所述的兩種毒株是我國(guó)自行分離得到的。馬傳染性貧血病毒(EquineInfectiousAnemiaVirus,EIAV)是引起馬傳染性貧血的病原體，是最早被人類發(fā)現(xiàn)的病毒。馬傳染性貧血于1843年首先在法國(guó)發(fā)現(xiàn)，一個(gè)多世紀(jì)以來對(duì)畜牧業(yè)造成了巨大的危害，因而也是各國(guó)科學(xué)家一直在致力研究和控制的疾病之一。我國(guó)自六十年代起投入巨資對(duì)該病毒的生物學(xué)性狀進(jìn)行了研究，分離并培育出與國(guó)外毒株有明顯差異的強(qiáng)毒株進(jìn)行體外驢白細(xì)胞傳代，逐步馴化該病毒使之成為無致病力，但可以使動(dòng)物在接種之后產(chǎn)生較堅(jiān)強(qiáng)免疫保護(hù)的疫苗株，該疫苗株自1976年開始生產(chǎn)，1978年在全國(guó)大規(guī)模應(yīng)用，至今已接種7000萬匹馬騾驢，已經(jīng)控制了該病在我國(guó)的流行(沈榮顯等，馬傳染性貧血免疫的研究。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，第4期P1-15,1979)。EIAV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬(lentivirus)，與同屬于慢病毒屬的人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodificiencyVirus,HIV)在基因組結(jié)構(gòu)，基因編碼蛋白及基因調(diào)控方式等方面有許多相似之處(J.M.Coffin,ThestructureAndClassficationofRetroviruses,TheRetroviridae,Vol.1,p19,editbyJayA.Levy,PlenumPress),EIAV的逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶、dUTP酶、包膜糖蛋白和核心蛋白的結(jié)構(gòu)和功能與HIV的相應(yīng)組份亦有很高的相似性，而且馬傳染性貧血病毒感染馬屬動(dòng)物后引起急性發(fā)病的馬癥狀特點(diǎn)為周期性發(fā)熱、紅血球減少性貧血和持續(xù)性病毒血癥，易于觀察和研究，因此該病毒成為研究慢病毒感染和致病機(jī)制及病毒酶功能的重要模型(R.C.Montelaroet,alEquineRetroviruses,in:vol.2,p257)。對(duì)EIAV病毒基因組的研究是在70年代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展并得到廣泛應(yīng)用之后才興起的?，F(xiàn)在GenBank中已發(fā)表的馬傳染性貧血病毒的全長(zhǎng)基因組序列均來源于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(Wyoming株)和日本強(qiáng)毒株(Goshun株)，及由它們衍生得到的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株的基因序列。我國(guó)的馬傳染性貧血病毒原始強(qiáng)毒株(遼系野毒株)是我國(guó)自行分離的有代表性的流行毒株，經(jīng)過在驢白細(xì)胞和驢皮膚細(xì)胞中連續(xù)多次傳代分別獲得了驢白細(xì)胞適應(yīng)株和皮膚細(xì)胞適應(yīng)的疫苗株，這些毒株的獲得為我國(guó)成功地研制馬傳染性貧血疫苗并最終控制該病在我國(guó)的流行起決定性作用。但是由于我國(guó)的馬傳染性貧血病毒遼系野毒株、驢白細(xì)胞適應(yīng)株和皮膚細(xì)胞適應(yīng)的疫苗株的均采用經(jīng)典病毒學(xué)的路線進(jìn)行培養(yǎng)和研究，它們的全長(zhǎng)基因序列尚未被闡明，因而無法從基因水平上對(duì)我國(guó)EIAV疫苗的母體毒株進(jìn)行有效的保護(hù)。另外，對(duì)病毒基因組的一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究又是進(jìn)一步研究各功能基因的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，因此遼系野毒株和皮膚細(xì)胞適應(yīng)株全長(zhǎng)基因序列的發(fā)明對(duì)研究該病毒的感染和致病的分子機(jī)制，揭示該病毒在細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程中毒力自然致弱的分子機(jī)理可提供直接有力的證據(jù)。另外，由于遼系野毒株為EIAV白細(xì)胞弱毒疫苗株的母體毒株，其基因序列的闡明將為尋找EIAV毒力基因及比較研究強(qiáng)弱毒株之間在基因水平的差異提供最重要的基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供馬傳染性貧血病毒的一種強(qiáng)毒株(遼系野毒株LN)的全長(zhǎng)前病毒DNA序列、各功能基因的序列及其編碼蛋白的氨基酸序列，及其應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供經(jīng)過多次馬屬動(dòng)物細(xì)胞傳代得到的減毒疫苗株(驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株FD)的全長(zhǎng)前病毒DNA序列、各功能基因的序列及其編碼蛋白的氨基酸序列，及其應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及馬傳染性貧血病毒LN毒株的全長(zhǎng)前病毒DNA序列及其主要結(jié)構(gòu)基因(gag,pol,env)和調(diào)控基因(5’LTR,3’LTR,rev基因，S2基因，tat基因)的DNA序列。其中該毒株的全長(zhǎng)基因組包含8236個(gè)核苷酸，具有如SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。在該毒株的全長(zhǎng)基因組中，核苷酸1-316位為5’LTR，核苷酸7928-8236位為3’LTR，核苷酸457-1917位為gag基因，核苷酸1680-5124位為pol基因，核苷酸5307-7904位為env基因，核苷酸356-454位為tat基因第一外顯子，核苷酸5133-5270位為tat基因第二外顯子，核苷酸5048-5542位為Rev基因第一外顯子，核苷酸7249-7651位為Rev基因第二外顯子，核苷酸5281-5487位為S2基因。gag基因、pol基因、env基因、rev基因、tat基因、s2基因的DNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列分別如SEQIDNOS:2、3、4、5、6、7以及SEQIDNOS:8、9、10、11、12、13所示。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及馬傳染性貧血病毒FD毒株的全長(zhǎng)前病毒DNA序列及其主要結(jié)構(gòu)基因(gag,pol,env)和調(diào)控基因(5’LTR,3’LTR,rev基因，S2基因，tat基因)的DNA序列。其中該毒株的全長(zhǎng)基因組包含8255個(gè)核苷酸，具有如SEQIDNO:14所示的核苷酸序列。在該毒株的全長(zhǎng)基因組中，核苷酸1-328位為5’LTR，核苷酸7919-8255位為3’LTR，核苷酸469-1929位為gag基因，核苷酸1692-5126位為pol基因，核苷酸5319-7448位為env基因，核苷酸368-465位為tat基因第一外顯子，核苷酸5142-5282位為tat基因第二外顯子，核苷酸5460-5552位為Rev基因第一外顯子，核苷酸7256-7657位為Rev基因第二外顯子，核苷酸5293-5496位為S2基因。gag基因、pol基因、env基因、rev基因、tat基因、s2基因的DNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列分別如SEQIDNOS:15、16、17、18、19、20以及SEQIDNOS:21、22、23、24、25、26所示。本發(fā)明通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)首先用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法擴(kuò)增各毒株的基因，分別克隆到質(zhì)粒載體中再進(jìn)行DNA序列的分析，最后得到各毒株的全長(zhǎng)基因序列。EIAV毒株在體外可以感染馬屬動(dòng)物細(xì)胞，病毒在復(fù)制過程中將自身的基因整合到細(xì)胞的染色體上，形成前病毒DNA，可作為PCR的模板。本發(fā)明是以病毒感染的驢白細(xì)胞或驢胎皮膚細(xì)胞為研究材料，首先利用基因組DNA提取試劑盒從細(xì)胞中提取染色體DNA，以此為模板按標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法分3段擴(kuò)增病毒基因；然后分別將各段基因克隆到質(zhì)粒載體上。對(duì)全部克隆基因進(jìn)行序列測(cè)定，最后獲得了兩個(gè)毒株的全基因組序列(分別為SEQIDNOS:1和14)。用含有LN和FD毒株的全基因克隆的質(zhì)粒(分別命名為pCh-LN及pCh-FD)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌已與1999年12月28日在保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)分別為CGMCCNO.0434.2及CGMCCNO.0434.1。將得到的兩個(gè)毒株的全基因組序列與GenBank所發(fā)表的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株(Wyoming株，GenBankAccessionNumber:AF028232)序列進(jìn)行核苷酸序列的比較，并利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)全長(zhǎng)基因序列的開放讀碼框架進(jìn)行分析，得到各個(gè)的結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控基因的完整開放讀碼框架及其它們?cè)诟髯曰蚪M中的位置。遼系野毒株(LN株)主要結(jié)構(gòu)基因(gag,pol,env)的核苷酸序列及氨基酸序列與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株(Wyoming株，GenBankAccessionNumber:AF028232)相應(yīng)序列的同源性比較，核苷酸序列的同源性在74.54％-82.74％之間，氨基酸序列的同源性在75.76％-90.74％之間。驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株(FD株)主要結(jié)構(gòu)基因(gag,pol,env)的核苷酸序列及氨基酸序列與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株(Wyoming株，GenBankAccessionNumber:AF028232)相應(yīng)序列的同源性比較，核苷酸序列的同源性在73.58％-82.44％之間，氨基酸序列的同源性在74.97％-90.13％之間。本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外首次闡明我國(guó)自行分離的有代表性的馬傳染性貧血病毒原始強(qiáng)毒株(遼系野毒株)、經(jīng)過在驢皮膚細(xì)胞中連續(xù)多次傳代獲得的驢皮膚細(xì)胞適應(yīng)的疫苗株的全長(zhǎng)基因序列，以及各個(gè)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因及各自編碼的蛋白質(zhì)，將為其他慢病毒疫苗的研制提供重要的指導(dǎo)。由它們的各主要基因及其編碼的蛋白質(zhì)研制的核酸診斷和血清學(xué)診斷試劑可分別用于EIAV感染的診斷、EIAV野毒株感染與疫苗株接種的鑒別診斷以及基因工程疫苗的研制，擁有巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。因此，根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明的馬傳染性貧血病毒遼系野毒株和驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株全長(zhǎng)DNA克隆及序列可用于構(gòu)建基于EIAV核心蛋白(p26)的基因重組診斷試劑。因EIAV自然感染馬屬動(dòng)物后，動(dòng)物常終身攜帶病毒，血清中抗p26抗體持續(xù)保持陽性終身，因此檢測(cè)血清中的抗p26抗體可以用于確診馬傳染性貧血病毒的感染。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種在大腸桿菌中表達(dá)p26基因的方法，用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法擴(kuò)增各個(gè)毒株的p26基因，在正反向引物中分別設(shè)計(jì)了NcoⅠ和HindⅢ位點(diǎn)，然后將擴(kuò)增的p26基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pRSET系列載體的相應(yīng)位點(diǎn)(NcoⅠ和HindⅢ)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，在0.1-1.0mM的IPTG誘導(dǎo)的條件下可以高效表達(dá)p26蛋白，表達(dá)產(chǎn)物可利用金屬離子親和層析方法(HMAC)進(jìn)行快速的提純，得到的純化蛋白可作為ELISA檢測(cè)的包被抗原。利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方法可以直接從血清中快速檢測(cè)P26抗體，從而對(duì)病毒感染做出診斷。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及用于EIAV自然感染馬中中國(guó)流行株存在的檢測(cè)的特異性引物。根據(jù)已測(cè)定的馬傳染性貧血病毒LN株全基因序列和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Wyoming株全基因序列(WyomingGenebankAccessionNumber:AF028232)設(shè)計(jì)并合成多對(duì)引物，用PCR擴(kuò)增不同毒株的DNA，選擇對(duì)中國(guó)流行株特異性最佳的引物。結(jié)果是針對(duì)LN株全基因克隆的2325-2341位和3046-3028位的命名為RT和POL的一對(duì)引物的特異性最好，這兩個(gè)引物的序列分別為RT:GAgAAgTTATTAggTgCPOL:CCCTgATCTCATCCATgTT根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明的馬傳染性貧血病毒遼系野毒株和驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株全長(zhǎng)DNA克隆及序列可用于構(gòu)建馬傳染性貧血病毒基因減毒疫苗株。具體地，將中國(guó)EIAV強(qiáng)毒株與弱毒株及部分致弱株的全基因組序列分別進(jìn)行比較，并參考國(guó)際上已發(fā)表的各個(gè)EIAV毒株的基因序列，可以發(fā)現(xiàn)EIAV的LTR、env和pol等基因存在較多的點(diǎn)突變。利用人工誘變的方法(AlteredSitesⅡinvittoMutagenesisSystem,Promega公司)對(duì)LTR、env和poi等基因進(jìn)行人工改造，得到多個(gè)基因突變的毒株，分別接種馬屬動(dòng)物(馬或驢)進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，在篩選有免疫保護(hù)作用的毒株的同時(shí)，對(duì)影響EIAV毒力的基因進(jìn)行精確的定位，從而在基因水平上闡明病毒的生物學(xué)表型(如病毒的毒力，免疫原性和免疫保護(hù)性)產(chǎn)生差異的根本原因，為研究逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因調(diào)控和基因功能提供重要的理論基礎(chǔ)。并且運(yùn)用對(duì)影響毒力的基因的研究的結(jié)果來指導(dǎo)EIAV及其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是靈長(zhǎng)類逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV和SIV)的人工減毒疫苗的構(gòu)建。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明的馬傳染性貧血病毒遼系野毒株和驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株全長(zhǎng)DNA克隆及序列可用于構(gòu)建EIAV感染性分子克隆。具體而言，將EIAV的各段基因依次連接，得到全長(zhǎng)的EIAV基因組，并將全長(zhǎng)基因克隆到低拷貝數(shù)質(zhì)粒載體pLin338中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌STABL2菌株，從轉(zhuǎn)化子中篩選陽性克隆。將陽性克隆轉(zhuǎn)染驢胎皮膚細(xì)胞(Lipofectin作為轉(zhuǎn)染試劑)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生明顯病變時(shí)，用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中p26抗原，并用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的RT活性，從而對(duì)感染性分子克隆進(jìn)行篩選。對(duì)陽性的感染性分子克隆進(jìn)行基因改造，用刪除或人工誘變方法使毒力基因失活，從而得到非致病的感染性分子克隆，轉(zhuǎn)染驢胎皮膚細(xì)胞，可獲得毒力減弱的毒株。還可以利用非致病的感染性分子克隆按文獻(xiàn)記載的方法構(gòu)建基因轉(zhuǎn)移載體。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的馬傳染性貧血病毒遼系野毒株和驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株全長(zhǎng)DNA克隆及序列在研制馬傳染性貧血病毒疫苗株和野毒株感染的PCR及基因探針鑒別診斷試劑中的應(yīng)用。根據(jù)序列比較分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在LTR、env和pol等區(qū)域野毒株和疫苗株的基因序列存在差異。針對(duì)EIAV野毒株和疫苗株基因序列差異最大的區(qū)域分別設(shè)計(jì)PCR引物或合成用地高辛或生物素標(biāo)記的特異性基因探針，進(jìn)行PCR或分子雜交檢測(cè)，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的差異(如擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度或有無)或分子雜交的結(jié)果來對(duì)強(qiáng)弱毒株的感染進(jìn)行鑒別診斷。本發(fā)明還可用來研制馬傳染性貧血病毒基因工程疫苗和血清學(xué)鑒別診斷試劑。根據(jù)馬傳染性貧血病毒各強(qiáng)弱毒株全基因克隆和序列研究的結(jié)果，可以分別構(gòu)建表達(dá)gag基因和env基因的原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)gag基因(如p26基因)的原核表達(dá)系統(tǒng)，以原核表達(dá)質(zhì)粒pET9系列質(zhì)粒為載體，將目的基因通過常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增后，克隆到pET9系列質(zhì)粒的NdeⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)之間，以大腸桿菌BL21為宿主細(xì)胞，0.1-1.0MmIPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，可得到分子量為26KD的目的蛋白。表達(dá)env基因(包膜糖蛋白)的真核表達(dá)系統(tǒng)可以選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3為載體，CHO細(xì)胞為宿主細(xì)胞)；或以桿狀病毒為載體在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。將gp90基因經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法擴(kuò)增后克隆到中間轉(zhuǎn)移載體pFastBacl中，轉(zhuǎn)化宿主菌DH10BAC后經(jīng)藍(lán)白斑篩選法挑選外源gp90基因插入的克隆，提取Bacmid，用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectin。48-72小時(shí)后待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE時(shí)收獲培養(yǎng)的上清，作為毒種保留。分別對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行分析，得到的產(chǎn)物為病毒的包膜糖蛋白(gp90)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)離子交換層析、親和層析和分子篩等方法純化后可用于制備血清學(xué)診斷試劑或基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明還涉及利用中國(guó)株馬傳染性貧血病毒疫苗株基因構(gòu)建的用于基因治療的基因轉(zhuǎn)移載體。馬傳染性貧血病毒不能引起人類發(fā)病，構(gòu)建源于該疫苗株的基因轉(zhuǎn)移載體，不但可以克服以往所用的鼠白血病病毒來源的基因轉(zhuǎn)移載體的基因轉(zhuǎn)移效率較低和不能轉(zhuǎn)染未分裂細(xì)胞等缺陷，而且能夠提供安全保障。以下參照附圖和實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中圖1為含有本發(fā)明的FD病毒株全長(zhǎng)基因組克隆的質(zhì)粒pCh-FD的示意圖。圖2為含有本發(fā)明的LN病毒株全長(zhǎng)基因組克隆的質(zhì)粒pCh-LN的示意圖。圖3示出用本發(fā)明的特異性引物對(duì)EIAV自然感染馬中中國(guó)流行株存在的檢測(cè)結(jié)果。泳道1-5為中國(guó)EIAV自然感染馬的外周血樣本，泳道6為健康馬外周血樣本，泳道7為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道8-12為Wyoming株病毒驢白細(xì)胞培養(yǎng)物樣本。實(shí)施例1LN及FD病毒株的全長(zhǎng)基因組克隆及測(cè)序本實(shí)施例分三段擴(kuò)增出這兩個(gè)毒株的全部基因，利用它們序列上156位的MluⅠ和2700位的HindⅢ酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，分別構(gòu)建了我國(guó)馬傳貧野毒株(LN株)和弱毒疫苗株(FD株)的全基因克隆。一．病毒培養(yǎng)和細(xì)胞基因組DNA的提取LN株該毒株是將馬傳染性貧血病毒遼寧分離株通過馬體繼代17代的血漿毒(LN17)接種100％大牛血清37℃培養(yǎng)的健康驢白細(xì)胞(每107細(xì)胞接毒1ml)，至出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)但細(xì)胞未開始脫落時(shí)收毒，棄上清，用QiagenGenomenicDNAKit(M13433,midi)按說明書提供的方法提取細(xì)胞基因組DNA。FD株該毒株是將LN株在驢體內(nèi)繼代至117代后轉(zhuǎn)移到驢白細(xì)胞培養(yǎng)物上繼代至123代，又在驢胎皮膚細(xì)胞上繼代至11代的弱毒疫苗株(D15V11)，病毒滴度108TCID50/ml，接種含10％大牛血清的MEM、37℃培養(yǎng)的30代(D30)驢胎皮膚細(xì)胞(每107細(xì)胞接毒1ml)，至出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)但細(xì)胞未開始脫落時(shí)收毒，用QiagenGenomenicDNAKit(M13433,midi)按說明書提供的方法提取細(xì)胞基因組DNA。二．病毒全基因的分段擴(kuò)增、回收和克隆(兩毒株方法相同)實(shí)驗(yàn)中所有內(nèi)切酶均購(gòu)自Programa公司。T4連接酶購(gòu)自華美生物工程公司。構(gòu)建全基因克隆的引物如下<tablesid="table1"num="001"><table>片段名稱擴(kuò)增區(qū)域引物名稱及位置引物序列(5’-3’)5’LTR1-321第一輪正向LTR-F5反向GR11第二輪正向LTR-F5反向LTR-R5TgTgggATTAATATAAgATTCTAACCTTGCTGCTATGGGAATTgTgggATTAATATAAgATTCTTgTTAgATCTTgAAAACAAgAC3.5K115-3523第一輪正向P26反向PR40第二輪正向732反向PR40GCTGATGCTCTCATAACCTTGGATGTGAATATACCATGTCTGACCGCAATAACCGCATTTGTGACGGATGTGAATATACCATGTCTG7.7K398-8150正向Ev-Fa反向Ev-RaCTggAATTCgTCgACAgCAgAggAGAACTTACAgCAgACTCgAgCAgggACTCAgACCgCAgAATC</table></tables>注所有引物均根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有馬傳貧病毒部分序列設(shè)計(jì)。1、5’LTR(1-321)片段(1)擴(kuò)增第一輪擴(kuò)增所用引物為正向引物L(fēng)TR-F5和反向引物GR11，反應(yīng)體系為10×緩沖液(Mg2+2.5mM)5ul,dNTP(10mM)1ul,LTR-F5(20uM)1ul,GR11(20uM)1ul,Taq(Promega)0.5ul(1.25U)，模板1ul(200ng),H2O40.5ul。反應(yīng)條件為95℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃40秒，52℃30秒，72℃1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。第二輪擴(kuò)增所用引物為正向引物L(fēng)TR-F5和反向引物L(fēng)TR-R5，反應(yīng)體系為10×緩沖液(Mg2+2.5mM)5ul,dNTP(10mM)1ul,LTR-F5(20uM)1ul,LTR-R5(20uM)1ul,Taq(Promega)0.5ul(1.25U)，模板5ul(第一輪產(chǎn)物)，H2O35.5ul。反應(yīng)條件為95℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃40秒，52℃30秒，72℃50秒，30個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。(2)PCR產(chǎn)物的回收和克隆和測(cè)序用QIAEXⅡExtractionKit(QIAGEN)按說明書提供的方法回收PCR產(chǎn)物，使用pGEMR-TEasyVectorSysteml(Programa)按說明書提供方法克隆PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5α，EcoRⅠ酶切鑒定，ABI377測(cè)序儀測(cè)序，選擇正向引物從T7方向插入的克隆，命名為T-easyLTR。2、3.5K片段(115-3523)(1)擴(kuò)增第一輪擴(kuò)增所用引物為正向引物正向P26和反向引物PR40，反應(yīng)體系為10×緩沖液(Mg2+2.5mM)5ul,dNTP(10mM)1ul,P26(20uM)1ul,PR40(20uM)1ul,Taq(Promega)0.5ul(1.25U)，模板1ul(200ng),H2O40.5ul。反應(yīng)條件為95℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃40秒，52℃30秒，72℃4分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。第二輪擴(kuò)增所用引物為正向引物732和反向引物PR40，反應(yīng)體系為10×緩沖液(Mg2+2.5mM)5ul,dNTP(10mM)1ul,732(20uM)1ul,PR40(20uM)1ul,Taq(Promega)0.5ul(1.25U),模板5ul(第一輪產(chǎn)物)，H2O35.5ul。反應(yīng)條件為95℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃40秒，55℃30秒，72℃4分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。(2)PCR產(chǎn)物的回收和克隆和測(cè)序方法同上述5′LTR擴(kuò)增產(chǎn)物所用方法，產(chǎn)物命名為T-easy3.5K。3、7.7K片段(398-8150)(1)擴(kuò)增所用引物為正向引物Ev-Fa和反向引物Ev-Ra，反應(yīng)體系和條件使用ExpandTMLongTemplatePCRSystem(BOEHRINGERMANNHEIM)按說明書提供的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行。(緩沖液使用Buffer3)(2)PCR產(chǎn)物的回收、克隆和測(cè)序方法同上述5′LTR擴(kuò)增產(chǎn)物所用方法，產(chǎn)物命名為T-easy7.7K。三．T-easy8.0K的構(gòu)建1．SacⅡ和HindⅢ酶切T-easy3.5K，用QIAEXⅡExtractionKi(QIAGEN)按說明書提供方法回收2.5K的酶切片段。2．SacⅡ和HindⅢ酶切T-easy7.7K，用QIAEXⅡExtractionKit(QIAGEN)按說明書提供方法回收8.5K的酶切片段。3．連接2.5K和8.5K的酶切片段，轉(zhuǎn)化DH5α,EcoRⅠ酶切和P26、GR11引物PCR鑒定(常規(guī)方法)，命名為T-easy8.0K.四．PTZ18LTR構(gòu)建1．EcoRⅠ酶切T-easyLTR，用QIAEXⅡExtractionKit(QIAGEN)按說明書提供方法回收320bp的酶切片段2．EcoRⅠ酶切PTZ18(PL-Pharmacia)，CIAP處理。3．將320bp的酶切片段和EcoRⅠ酶切的PTZ18連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，EcoRⅠ酶切鑒定，命名為PTZ18LTR。五．pCh-LN和pCh-FD的構(gòu)建1．MluⅠ酶切T-easy8.0K，用QIAEXⅡExtractionKit(QIAGEN)按說明書提供方法回收7.9K的酶切片段。2．MluⅠ酶切PTZ18LTR，CIAP處理。3．將7.9K的酶切片段和MluⅠ酶切的PTZ18LTR連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,EcoRⅠ酶切和P26、GR11引物PCR鑒定(常規(guī)方法)，含有插入正確的LN全基因克隆的質(zhì)粒命名為pCh-LN，含有插入正確的FD全基因克隆的質(zhì)粒命名為pCh-FD，這兩個(gè)質(zhì)粒的示意圖分別見圖1和圖2。實(shí)施例2構(gòu)建的全基因克隆的應(yīng)用體外感染試驗(yàn)將實(shí)施例1中構(gòu)建的LN株和FD株的全基因克隆在體外通過DOTAPLiposomalTransfectionReagent(Roche)按說明書提供方法分別轉(zhuǎn)染驢白細(xì)胞(DLV)和驢胎皮膚細(xì)胞(FDD)，每104細(xì)胞轉(zhuǎn)染10ug質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)病毒陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變或病毒陽性對(duì)照出現(xiàn)明顯CPE時(shí)收獲，凍融2-3次后，差速離心去細(xì)胞沉淀，一部分上清用聚乙二醇濃縮10倍，電鏡觀察病毒粒子，同時(shí)用NonradioactiveMicro-Assay(Cook,1992)測(cè)定RT活性；另一部分上清50000rpm超速離心，沉淀用PBS重懸，采用SDS-PAGE和Western-Blotting檢測(cè)病毒蛋白，來證實(shí)它們對(duì)細(xì)胞的感染性。實(shí)施例3構(gòu)建的全基因克隆的應(yīng)用體內(nèi)感染試驗(yàn)選擇在實(shí)施例2的體外試驗(yàn)中證實(shí)對(duì)細(xì)胞有明顯感染性的全基因克隆分別皮下接種馬和驢，接種量為100ug質(zhì)粒，每周采外周血，分離血清，用已建立的EIAVAGID和ELISA方法檢測(cè)抗體的消長(zhǎng)，同時(shí)定時(shí)測(cè)體溫和各種血常規(guī)指標(biāo)，觀察LN株對(duì)動(dòng)物體的致病力，三個(gè)月后，用104稀釋的LN強(qiáng)毒株攻擊接種FD全基因克隆的馬、驢，同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照，以此來證實(shí)疫苗株全基因克隆對(duì)馬、驢的保護(hù)性。實(shí)施例4構(gòu)建嵌和克隆使用實(shí)施例2和3篩選出的在體內(nèi)外均有良好感染性的全基因克隆，結(jié)合序列比較的結(jié)果，通過有目的性的置換野毒株和疫苗株不同基因和區(qū)域來構(gòu)建不同的嵌和克隆，采用上述實(shí)施例2和3中使用的方法測(cè)定這些克隆在體內(nèi)和體外的感染性區(qū)別，以定位野毒株的致病基因和疫苗株的保護(hù)基因，從而弄清我國(guó)馬傳貧疫苗株的致弱和保護(hù)機(jī)制。實(shí)施例5EIAV自然感染馬中中國(guó)流行株存在的檢測(cè)根據(jù)已測(cè)定的馬傳染性貧血病毒LN株全基因序列和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Wyoming株全基因序列(WyomingGenebankAccessionNumber:AF028232)設(shè)計(jì)并合成多對(duì)引物，用PCR擴(kuò)增不同毒株的DNA，選擇對(duì)中國(guó)流行株特異性最佳的引物。分別以中國(guó)民間自然感染馬外周血白細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和脾臟細(xì)胞中的DNA為模板，采用PROMEGA公司Taq聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR混合體系如下10x緩沖液5ul,2.5mMMgCl25ul,2.5mMdNTP1ul,20uMRTF21ul,20uMRTR201ul,TaqDNA聚合酶2U，H2O34.6ul，模板2ul。充分混勻后，放在PCR儀上，PCR反應(yīng)條件為95℃5分鐘，之后為94℃50s,50℃40s,72℃50s的30個(gè)循環(huán)，最后72℃10分鐘。將反應(yīng)物加到瓊脂糖凝膠，通過電泳，可見到大小約700bp的DNA片段條帶。而在上述相同條件下，以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Wyoming株病毒驢白細(xì)胞培養(yǎng)物DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則沒有相應(yīng)的條帶(圖3)。通過多對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果比較，下表引物為特異性最佳引物。以此對(duì)引物對(duì)國(guó)內(nèi)采集的40份EIAV自然感染馬樣品進(jìn)行DNA擴(kuò)增檢測(cè)，40份樣品全部能擴(kuò)增出700bp的DNA片段，對(duì)國(guó)外的毒株則為陰性。檢測(cè)結(jié)果見圖3所示。該檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)行EIAV血清學(xué)國(guó)家診斷標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果完全一致，并顯示有很高的敏感性。實(shí)施例6EIAV基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的構(gòu)建EIAV基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)主要由以下3個(gè)質(zhì)粒組成，為保證有足夠的表達(dá)，每一質(zhì)粒都使用人巨細(xì)胞病毒(CMV)的立即早期啟動(dòng)子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄1、表達(dá)EIAVgag/pol的質(zhì)粒在EIAV感染性克隆的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行改造。在env基因中，缺失SU編碼區(qū)內(nèi)的736個(gè)核苷酸和TM編碼區(qū)C末端的168個(gè)核苷酸；缺失基因組中對(duì)病毒逆轉(zhuǎn)錄和整合必需的3′區(qū)域(包括多嘌呤區(qū)和整個(gè)3′LTR)。這些突變保證這一質(zhì)粒不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的EIAV。在基因組5′末端的RNA包裝信號(hào)應(yīng)該完整地保留。2、EIAV基因轉(zhuǎn)移載體該質(zhì)粒包括對(duì)載體逆轉(zhuǎn)錄和整合必須的所有順式作用序列和用于插入cDNA的多克隆位點(diǎn)。因?yàn)镋IAV的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列在人細(xì)胞株中活性很低，所以用CMV的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子替換5′LTR中的U3區(qū)。為檢測(cè)構(gòu)建的CMV/R/U5的活性，可在其下游插入β-半乳糖苷酶報(bào)告基因。3、病毒膜蛋白基因表達(dá)載體該質(zhì)粒用于表達(dá)病毒膜蛋白(在第1個(gè)質(zhì)粒中env基因被突變)。用表達(dá)EIAVgag/pol的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞，以neo基因?yàn)檫x擇標(biāo)記篩選，構(gòu)建表達(dá)EIAV蛋白的輔助細(xì)胞系作為EIAV載體的包裝細(xì)胞系。序列表SEQIDNO:1的信息(a)序列特征長(zhǎng)度8236bp類型核酸鏈性雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)(c)來源馬傳染性貧血病毒遼系野毒株全長(zhǎng)克隆(d)序列描述SEQIDNO:1TGTGGGATTAATACAAGATTCTTATAAGTGATTATAAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACC60TTATGTAACCCAAAAGACTAGCTCATGTTGCCAGGCAACTAAACTGTGATAACCTTTTGT120TCCTCATTATAGTTCCGCTTTTGTGACGCGTTAAGTTCCTGTTTTTACAGTATATAAGTA180CTTGTATTCTGACATTTGGACACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCT240AACTCTAGCCTTGGTAATAAATATAATTCTCTGCTCAGTCCCTGTTCTTAGTCTGTCTTG300TTTTCAAGGTCTAACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCAGAGGGCGCAGACCCTGCCTGCT360GAACCTGGCTGATCGTAGGATCCCTAGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGACGTCTTCTGG420AGGTGTTCCTGGCCACAACACAGGAAGACAGGTAAGATGGGAGACTCTTTGACATGGAGC480AAAGCGCTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAAAAGCTAACTAATGGT540AACTGTAATTGGGCGCTGAATTTGGTGGACTTATTCCATGACGCCAATTTTTGTAAAGAA600AAAGACTGGCAATTAAGGGACGACATTCCATTGTTGGAGGACGTTTCTCAGACATTGTCA660GGACAAGAGAGAGAGGCATTTGAAAAAACTTGGTGGGCAATAGCTGCCGTTAAGATGGGC720TTACAAATTAATACTGTGAATGATGCAAAAGCAACATTTACTATATTAAAAGCTAAGTTT780GAAAGAAAGACTGCAAATACTACCAAAAAGCAGTCTGAGCCCATGGAAGAATACCCAATA840ATGATTGATGGGGCTGGAAACCGAAACTTTCGGCCATTAACACCCAGAGGATATACTACC900TGGGTAAATACTATACAGCAAAACAATCTCTTAAATGAAGCTAGTGTGAATCTATTTGGT960ATTTTATCAGTAGACTGTACTTCTGAGGAAATGAATGCATTTTTGGATGTAGTACCAGGA1020CAAGCAGGACAAAAACAAGTACTATTGGATAATCTTGATAAGATTGCAGAAGAATGGGAT1080CGTAGGCACCCGATGCCAAATCCTCCATTGGTGGCACCACCACAAGGGCCTATTCCCATG1140ACAGCAAGGTTCATTAGGGGATTGGGAGTTCCTAGAGAAAGACAGATGGAACCTGCTTTT1200GATCAGTTTAGACAAACTTATAGACAGTGGATAATAGAAGCAATGACAGAGGGGATAAAA1260ATAATGATTGGGAAACCCAAAGCGCAAAATATTAGGCAAGGACCCAAAGAACCCTATCCA1320GAGTTTGTAGACAGATTGCTGTCTCAGATAAAAAGTGAGGGACATCCGGCTGATGTAACT1380AAATTCCTGACAGACACCTTAACTATTCAGAATGCTAATGATGAATGCAAAAGTGCTATG1440AGACATTTGAGGCCAGAAGATACATTAGAAGAAAAAATGTATGCATGTAGAGATATTGGC1500ACTATGAAACAAAAAATGGCATTATTAGCCAAGGCACTTCAAACAGGATTAGCTGGTCCT1560ATGAAGGGAGGAATATTTAAAGGGGGACCCTTAGGGGCGAAGCAGACATGTTATAATTGT1620GGAAAACCAGGACATTTTTCTAGTCAATGTAAAGCACCTAAAGTATGTTTTAAGTGCAAA1680CAGCCAGGACATTTCTCAAAACAATGTATAAATGCTCCAAAAAACGGGAAACAAGGGGCT1740CAGGGGAGGCCCCAAAAACAAACTTTCCCTGTGCAGAAGGAATCAATGAACAAAACACAA1800AAGGAGGAAAAACAGCAAGGGACCTTATATCCAGATTTGAGTCAGATGAAACAGGAGTAC1860AAGATCAAGGAAGAGGAAAATCAAGAGGATCTCAATCTGGACAGTTTGTGGGAGTAACTT1920ATAATTTAGAAAAGAGACCAACTACAATAGTTTTGATTAATGACACACCCTTAAATGTAT1980TATTGGACACAGGAGCAGACACGTCGGTACTAACTATTGCACATTATAATAGGTTAAAGT2040ATAGAGGAAGGAAATATCAAGGTACAGGTATTGTTGGGGTTGGAGGTAATGTAGAAACAT2100TTTCCACTCCTGTTACGGTAAAAAAGAAAGGAAAACAAATTAAAACTAGAATGTTAGTAG2160CAGATATCCCAGTTACTATTTTGGGGCGAGATATCCTTCAAGAATTAGGCGCACAATTAA2220TAATGGCTCAACTTTCAAAAGAAATAACCCCAAGAGAAATTAAATTAAAAACAGGCACAG2280TAGGGCCTAAGGTTCCCCAATGGCCACTTACTAAAGAGAAGTTATTAGGTGCTAAAGAAA2340TAGTCAAAAAATTGTTGGATGAAGGTAAAATATCAGAAGCCAGTGATGATAATCCTTATA2400ATTCTCCTATATTTGTAATAAAAAAGAAATCTGGGAAGTGGAGACTATTGCAAGATTTAA2460GAGAATTAAATAAGGTGGTACAAGTAGGAACTGAAATATCCAGAGGGTTACCTCATCCAG2520GGGGATTAATTAAATGTAATCATATGACAGTATTAGATATTGGAGATGCCTATTTCACTA2580TACCATTAGATCCAAAGTTTAGACAATATACAGCATTTACTGTGCCATCCATTAATCATC2640AGGAACCAGATAAAAGATATGTATGGAATTGCTTGCCACAAGGTTTTGTGTTAAGTCCAT2700ACATATATCAAAAAACATTACAGGACATATTACAAGCTTTTAGAGAAAGGCATCCAGATG2760TACAATTATATCAATATATGGATGATTTATTCATTGGGAGTAATGGATCTAAAAGACAAC2820ATAAGGAACTAGTAGAAGAATTAAGAGCTATTCTTTTAGAAAAGGGCTTTGAGACGCCTG2880AGGATAAATTGCAGGAAGAGGCACCCTATAATTGGCTGGGATATCAACTTAGTCCAGGCA2940ATTGGAAAGTACAAAAGATGCAATTAGAATTGGTAAAAGAACCAACATTAAATGATGTGC3000AAAAATTAATGGGAAATATAACATGGATGAGTTCAGGGGTTCCTGGATTAACAGTGAAGC3060GAATAGCTGCTACCACTAAAGGATGCCTAGATTTAAATCAAAAGGTAGTATGGACGGAAG3120AAGCACAAAAAGAACTAGAGGAAAATAATAAAAAGATTCAGGAAGCTCAGGGATTGCAAT3180ATTATAACCCAGAAGAAGAAGTAATCTGTGAGATTGAAATTACTAAAAATTATGAGGCTA3240CTTATATAATAAAACAGTCCCAAGGAATATTGTGGGCAGGAAAGAAAATTATGAGGGCTA3300ATAAAGGATGGTCCGCAGCAAAAAATCTAATGTTATTGTTACAACATGTAGCCACAGGAA3360GTATTGTTAGAATTGGAACATGTCCAAAATTTAAAGTACCTTTTACTAAAGAACAAGTCA3420AATGGGAAATGGAAAAGGGATGGTATTATTCATGGCTACCAGATATGGTATATTCACATC3480AAGTTGTTCATGATGATTGGAAACTGAAATTAGTAGAGCAACCAACATCTGGTATAACAA3540TTTACACTGATGGGGGTAAACAGAATGAAGAAGGAGTTGCGGCTTATGTGACTAGTAATG3600GGAAAACTAAACAAAAAAGGTTAGGACCTGTTACTCATCAAACTGCTGAGAGGATAGCAA3660TACAAATGGCATTAGAAGATACTGAAGAGACACTGGTAAATATAGTAACTGATAGTTACT3720ACTGTTGGAAAAATATTACAGAAGGATTAGGGTTAGAAGGACCAGACAGCCCCTGGTGGC3780CAATAATTCAAAATATTAGGGCTAAAGAAATGGTTTATTTTGCTTGGGTACCAGGTCACA3840AGGGAATATATGGCAATCAATTGGCAGATGAGGCTACTAAAATAACAGAGGACATTATGT3900TAGCATATCAAGGCACACAGATTAAGGAAAAAAGAGATGAAGATGCAGGGTTTGACTTGT3960GTATTCCTTATGACATAATAATACCTGTCTCTGAGACAAAGGTTATACCCACAGATGTAA4020AAATACAGGTACCTCATAAATGTTTTGGATGGGTAACTGGTAAGTCATCGGTGGCTAAGC4080AAGGGTTATTAATCAATGGGGGAATAATTGATGAAGGATACACAGGTGAAATACAGGTAA4140TTTGTATTAACATTGGAAAGAGTAACATTAAACTCTGGGAAGGACAAAAGTTTGCACAAT4200TAATCATATTACAGCATCGATCAAATGATAAACAAATCTGGGATGAAAATAAAGCATC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AAATGGAAAAGGGGTGGTATTATTCATGGCTACCAGACATGATATATTCACAT1800CAAGTTGTTCATGATGATTGGAGACTGAAATTAGTAGAGCAACCAACATCTGGTATAACA1860ATTTACACTGATGGAGGTAAACAGGATGAAGAAGGAGTTGCAGCTTATGTGACTAGTAAT1920GGGAAAACTAAACAAAAAAGGTTAGGACCTGTTACTCATCAAACTGCTGAGAGGATAGCA1980ATACAAATGGCATTAGAAGATACTGAAGAGACATTGGTAAATATAGTAACTGATAGTTAC2040TATTGTTGGAAAAATATTACAGAAGGATTAGGGTTAGAAGGACCAGACAGCCCCTGGTGG2100CCAATAATTCAAAATATTAGGGCTAAAGAAATGGTTTATTTTGCTTGGGTACCAGGTCAT2160AAAGGAATATATGGCAATCAATTGGCAGATGAGGCTACTAAAATAACTGAGGAAATTATG2220TTAGCATATCAAGGCACACAGATTAAGGAAAAAAGAGATGAAGATGCAGGGTTTGACTTG2280TGTATTCCTTATGACATGATAATACCTGTCTCTGAGACAAAAGTTATACCCACAGATGTA2340AAAATACAGGTACCTCACAAATGTTTTGGATGGGTAACTGGTAAGTCATCAATGGCTAAG2400CAAGGGTTATTAATCAATGGGGGAATAATTGATGAAGGATATACAGGTGAAATACAGGTA2460ATTTGTACTAACATTGGAAAGAGTAACATGAAACTCAGGGAAGGACAAAAGTTTGCACAA2520TTAATCATATTACAGCATCGATCAAATGATAAACAAATCTGGGATGAAAATAAAACATCT2580CAAAGGGGAGATAAAGGGTTTGGAAGCACAGGTATATTTTGGGTAGAGAATATCCAAGAG2640GCACAAGATGAACATGAAAACTGGCATACATCTCCAAAGATATTGGCAAAAAGATATGGG2700TTACCATTGACAGTAGCTAAACAGATAACTCAAGAATGCCCTCATTGTACTAAACAAGGA2760TCTGGACCAGCAGGTTGTGTAATGAGATCTCCTAATCATTGGCAGGCTGATTGTACACAT2820TTAGAAAACAGGATAATAATGACATTTGTAGAGTCTAATTCAGGATACATTCATGCTACT2880CTATTGTCTAAAGAAAATGCCTTGTGTACTTCATTGGCTATTTTGGAATGGGTGAGGTTA2940TTTTCTCCTAAATCTTTACATACAGACAATGGTACTAATTTTGTAGCAGAGTCAGTAGCA3000AATCTGTTGAAATTCCTGAAGGTGACACATACTACAGGAATACCTTATCACCCAGAGAGC3060CAAGGCATTGTGGAAAGAGCAAACAGGACATTAAAAGAAAAAATTAAAAGTCATAGAGAA3120AATACTCAGACACTTGAAGCAGCATTACAACTTGCTCTCATTACTTGTAACAAAGGGAGG3180GAAAGTATGGGAGGACAAACTCCATGGGAAGTATTTATTACTAATCAGGCTCAAACAATA3240CATGAAGAACTTCTATTACAACAAGCACAATCTTCTAAAAAATTTTGTTTTTATAAAATT3300CCTGGTGAGCATAATTGGAAGGGGCCCACCAGAGTGTTGTGGAAAGGTGATGGAGCAGTA3360GTGGTCAATGATGAGAAAAAAGGAATAATTGCTGTGCCTTTAACTAGGACTAAATTATTA3420ATAAGACCAAATTGA3435SEQIDNO:17的信息(a)序列特征長(zhǎng)度2130bp類型核酸鏈性雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株env基因(d)序列描述SEQIDNO:17ATGGTCAGCATTGCATTCTATGGGGGTATCCCAGGGGGAATATCAACCCCTATCACCCAA60CAAACAGAATCAACAGACACACAGAAAGGGGATCATATGGTATATCAACCCTATTGTTAT120AATGATAGCCATAAAGAAGAAATGGCAGAGGCAAGAGACACAAGATACCAAGAAGAAATG180AACCGGAAAGAAGATAAAGAAGATAAAAGAAGAAATAACTGGTGGAAGATAGGTATGTTC240CTATTGTGTCTGTTAGGGACCACTGGAGGATTCCTCTGGTGGTATGAGAGGCAACAACAT300TCATATTATATAGGATTGGTTACAATAGGAGGTAGACTAAATGGTTCAGGAATGACTAGT360GCCATAGAATGTTGGGGTTCATTTCCTGGGTGTAGGTCATTTACTAACTATTTCAGTTAT420GACACTAATAGGACTGTTAGTACAGATAATAATACTGCCACTCTGTTAGATGCTTATCAA480AGAGAAATAACAAACATATACAGGACATCTTGTGTGGATAGTGATCACTGTCAAAAATAT540AAATGTAACCAAGTACAGTTGGAGAAGAACAGCAATAACATTATAATGAATAATTGTAGT600AACAATAGTTGTGAAGAGTTTTGGGGGTTTAGCTGGTTAGAATGTAATCAGACAGAAAAT660GCAATAACTATATTGGTCCCAGAAGTAGAAATGCAGCAAAGTAAAAACACTTGGATTCCA720AAAGGGTGTAATGAAACTTGGGCTAGGGTAAAACATTGTCCAATGGATTTATTATATGGT780ATAAATAGAATAAGAATGTGTGTCCAACCTCCATTCTTTTTGTTTAAACAGGATGATACT840TCTAATAATACTGGTATTCTCAGTAATTGTGGACCTTTAGTATTTCTTGGAATATTGGAG900GACAACAAGGCAGCAATACAGAATGGGAGTTGCACTCTTCACAGGACAAATATTGAAAGG960CCAGATTATAGTGGATTTTACCAAGTGCCTATATTTTATATATGCAACTTGACAGGACTT1020CAGAGTTGTAATAATGGATCAATAATTAGTATAATTATGTCTGAGCCTAATAATGTTCAA1080TACTTGTTATGCAACACTAGTAATACTAATAGTACCAGTAATGCTAATGTCTCTTGTGTG1140GTACAAAGTTTTGGAGTGATAGGACAGGCACATGTGGCGCTGCCCAGAAAAAATAAGAGG1200TTACAATCTCCAAAGTTTGCTCAATATAATTGCACCATAAATAATAAAACAGAATTAAGG1260CAATGGCAATTGGTGAAAACATCAGGCATCACTCCTTTACCCATTTCCTCTACAGCTAAT1320ACTGGATTAGTCAGACACAAGAGAGACTTTGGTATATCTGCTATAATAGCTGCCATTGTA1380GCTGCTACTGCTATTGCTGCTAGTGCTACTATGTCTTATATTGCTTTGACAGAAGTCAAC1440AAATTAGATAGTGTACAAAATCATACATTTAAAGTAGAGAACAATACTATCAATAGCATG1500GAGTTAACAGAAGAGCAAATTCATATATTATATGCTATGGTCCTCCAAACACATGCAGAT1560GTTCAATTGTTAAAAGAACAACAAAAGATTGAGGAAACATTTAATTTGATTGGATGTATA1620GAAAGATCACATACATTTTGTCATACTGGGCATCCCTGGAATGAATCATGGGGTCAGCTA1680AATGATTCTACACAGTGGGATGACTGGGTAGATAAGATGGAAAATTTAAATCATGATATA1740TTAACAACACTTCATACTGCTAGAAATAATCTAGAACAATCTATGATAACTTTTAATACA1800CCTGACAGTATAGCACAATTTGGTAAAAATATTTGGAGTCATGTTGCAAATTGGATTCCT1860GGATTAGGAGCTTCCATAATTAAATATATAGTGTTATTATTACTTGTATATGTGCTACTA1920ACCTCTGCACCTAAGATCCTCAGAGGCCTCTTGACAACGATGAGTGGTGCAGGATCCTCC1980GCCAGTCGCTACCTGAGGAAAAGGTACCATCACAGACATGCATCGCGAGGAGACATCTGG2040GCCCAGGTCCAGTATCATGCGTACCTGGCAGACGAGACTCATGGATCAGGGGACAAGTCC2100AACATGCGGAAGTTCTCCAGGAACAACTGA2130SEQIDNO:18的信息(a)序列特征長(zhǎng)度495bp類型核酸鏈性雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株rev基因(d)序列描述SEQIDNO:18ATGGCAGAGGCAAGAGACACAAGATACCAAGAAGAAATGAACCGGAAAGAAGATAAAGAA60GATAAAAGAAGAAATAACTGGTGGAAGATAGGTCCTCAGAGGCCTCTTGACAACGATGAG120TGGTGCAGGATCCTCCGCCAGTCGCTACCTGAGGAAAAGGTACCATCACAGACATGCATC180GCGAGGAGACATCTGGGCCCAGGTCCAGTATCATGCGTACCTGGCAGACGAGACTCATGG240ATCAGGGGACAAGTCCAACATGCGGAAGTTCTCCAGGAACAACTGAAATGGCGAATCAGA300GGAGTACAACAGACGGCAAAAGAATTGGAAAAGGTTAATAAAGAGATCTGGAGAGAATTA360CAATACACACGAAGACAACATGGGGACTATGGGTCGTTTGGTGACTACCGCCGCCGAGAA420GAAGAACGTTGGGGTGAATCCTCACCAAGGGTCCTTAAACCTGGAGATTCCAAGCGAAGG480AGGAAACATCTATGA495SEQIDNO:19的信息(a)序列特征長(zhǎng)度237bp類型核酸鏈性雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株tat基因(d)序列描述SEQIDNO:19CTGCTGAACCTGGCTGATCATAGGATCCCTAGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCT60TCTGGAGGTGTTACTGGCCACAACACAGGAAGACAGGTACCACCAGTCAGCTATCATTGT120CAACTGTGTTTCCTGAGATCATTGGGAATTGACTACCTTGACAGCTCTCTAAAGAAGAAG180AACAAACAAAGACAGAAGGCCATCAGGGAGGGAAGACCACCTCAATATCTGTTGTAA237SEQIDNO:20的信息(a)序列特征長(zhǎng)度207bp類型核酸鏈性雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株s2基因(d)序列描述SEQIDNO:20ATGGGATTATTTGGTAAAGGGGTAACATGGTCAGCATTGCATTCTATGGGGGTATCCCAG60GGGGAATATCAACCCCTATCACCCAACAAACAGAATCAACAGACACACAGAAAGGGGATC120ATATGGTATATCAACCCTATTGTTATAATGATAGCCATAAAGAAGAAATGGCAGAGGCAA180GAGACACAAGATACCAAGAAGAAATGA207SEQIDNO:21的信息(a)序列特征長(zhǎng)度487個(gè)氨基酸類型氨基酸鏈性拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株gag蛋白(d)序列描述SEQIDNO:21MGDSLTWSKALKKLEKVTVQGSQKLTSGNCNWALNLVDLFHDTNFCKEKDWQLRDVIPLLEDVSQTLSGQEREAFEKTWWAIAAVKMGLQINTVNGAKSTFSILKAKFERKTANTTKKQSEPEEEYPIMIDGAGNRNFRPLTPRGYTTWVNTIQQNNLLNEASVNLFGILSVDCTSEEMNAFLDVVPGQAGQKQVLLDNLDKIAEEWDRRHPMPNPPLVAPPQGPIPMTARFIRGLGVPRERQMEPAFDQFRQTYRQWIIEAMTEGIKIMIGKPKAQNIRQGPKEPYPEFVDRLLSQIKSEGHPADITKFLTDTLTIQNANDECKNAMRHLRPEDTLEEKMYACRDIGTMKQKMALLAKALQTGLAGPMKGGIFKGGPLGAKQTCYNCGKPGHLSSQCKAPKVCFKCKQPGHFSKQCRNAPKNGKQGAQGRPQKQTFPVQKGSMDKTQMEEKQQGTLYPDLSQMKQEYKIREEENQEDLNLNSLWE*SEQIDNO:22的信息(a)序列特征長(zhǎng)度1145個(gè)氨基酸類型氨基酸鏈性拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株pol蛋白(d)序列描述SEQIDNO:22TARTLLKTMYKCSKKRETRGSGEAPETNFPCAEGVNGQNTNGGETARDLISRFESDETGVQDQGRGKSGGSQSEQFVGVTYNLEKRPTTIVLINDTPLNVLLDTGADASVLTIAHYNRLKYRGRKYQGTGIVGVGGNVETFSTPVTAKKKGKQIKTRMLVADIPVTILGRDILQELGAQLIMAQLSKEITPREIKLKTGTVGPKVPQWPLTKEKLLGAKEIVKKLLDEGKISEASDDNPYNSPIFVIKKKSGKWRLLQDLRELNKVVQVGTEISRGLPHPGGLIKCNHMTVLDIGDAYFTIPLDPKFRQYTAFTVPSINHQEPDKRYVWNCLPQGFVLSPYIYQKTLQDILQAFRERHPDVQLYQYMDDLFIGSNESKRQHKELVEELRAILLEKGFETPEDKLQEEAPYNWLGYQLSPGNWKVQKMQLELVKEPTLNDVQKLMGNITWMSSGVPGLTVKQIAATTKGCLDLNQKVVWTEEAQKELEENNKKIQEAQGLQYYNPEEEVICEIEITKNYEATYIIKQSQGILWAGKKIMRANKGWSAAKNLMLLLQHVATESIVRIGTCPKFKVPFTKEQVKWEMEKGWYYSWLPDMIYSHQVVHDDWRLKLVEQPTSGITIYTDGGKQDEEGVAAYVTSNGKTKQKRLGPVTHQTAERIAIQMALEDTEETLVNIVTDSYYCWKNITEGLGLEGPDSPWWPIIQNIRAKEMVYFAWVPGHKGIYGNQLADEATKITEEIMLAYQGTQIKEKRDEDAGFDLCIPYDMIIPVSETKVIPTDVKIQVPHKCFGWVTGKSSMAKQGLLINGGIIDEGYTGEIQVICTNIGKSNMKLREGQKFAQLIILQHRSNDKQIWDENKTSQRGDKGFGSTGIFWVENIQEAQDEHENWHTSPKILAKRYGLPLTVAKQITQECPHCTKQGSGPAGCVMRSPNHWQADCTHLENRIIMTFVESNSGYIHATLLSKENALCTSLAILEWVRLFSPKSLHTDNGTNFVAESVANLLKFLKVTHTTGIPYHPESQGIVERANRTLKEKIKSHRENTQTLEAALQLALITCNKGRESMGGQTPWEVFITNQAQTIHEELLLQQAQSSKKFCFYKIPGEHNWKGPTRVLWKGDGAVVVNDEKKGIIAVPLTRTKLLIRPN*SEQIDNO:23的信息(a)序列特征長(zhǎng)度710個(gè)氨基酸類型氨基酸鏈性拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株env蛋白(d)序列描述SEQIDNO:23MVSIAFYGGIPGGISTPITQQTESTDTQKGDHMVYQPYCYNDSHKEEMAEARDTRYQEEMNRKEDKEDKRRNNWWKIGMFLLCLLGTTGGFLWWYERQQHSYYIGLVTIGGRLNGSGMTSAIECWGSFPGCRSFTNYFSYDTNRTVSTDNNTATLLDAYQREITNIYRTSCVDSDHCQKYKCNQVQLEKNSNNIIMNNCSNNSCEEFWGFSWLECNQTENAITILVPEVEMQQSKNTWIPKGCNETWARVKHCPMDLLYGINRIRMCVQPPFFLFKQDDTSNNTGILSNCGPLVFLGILEDNKAAIQNGSCTLHRTNIERPDYSGFYQVPIFYICNLTGLQSCNNGSIISIIMSEPNNVQYLLCNTSNTNSTSNANVSCVVQSFGVIGQAHVALPRKNKRLQSPKFAQYNCTINNKTELRQWQLVKTSGITPLPISSTANTGLVRHKRDFGISAIIAAIVAATAIAASATMSYIALTEVNKLDSVQNHTFKVENNTINSMELTEEQIHILYAMVLQTHADVQLLKEQQKIEETFNLIGCIERSHTFCHTGHPWNESWGQLNDSTQWDDWVDKMENLNHDILTTLHTARNNLEQSMITFNTPDSIAQFGKNIWSHVANWIPGLGASIIKYIVLLLLVYVLLTSAPKILRGLLTTMSGAGSSASRYLRKRYHHRHASRGDIWAQVQYHAYLADETHGSGDKSNMRKFSRNN*SEQIDNO:24的信息(a)序列特征長(zhǎng)度165個(gè)氨基酸類型氨基酸鏈性拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株rev蛋白(d)序列描述SEQIDNO:24MAEARDTRYQEEMNRKEDKEDKRRNNWWKIGPQRPLDNDEWCRILRQSLPEEKVPSQTCIARRHLGPGPVSCVPGRRDSWIRGQVQHAEVLQEQLKWRIRGVQQTAKELEKVNKEIWRELQYTRRQHGDYGSFGDYRRREEERWGESSPRVLKPGDSKRRRKHL*SEQIDNO:25的信息(a)序列特征長(zhǎng)度79個(gè)氨基酸類型氨基酸鏈性拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株tat蛋白(d)序列描述SEQIDNO:25LLNLADHRIPRTAEENLQKSSGGVTGHNTGRQVPPVSYHCQLCFLRSLGIDYLDSSLKKKNKQRQKAIREGRPPQYLL*SEQIDNO:26的信息(a)序列特征長(zhǎng)度69個(gè)氨基酸類型氨基酸鏈性拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)來源馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株s2蛋白(d)序列描述SEQIDNO:26MGLFGKGVTWSALHSMGVSQGEYQPLSPNKQNQQTHRKGIIWYINPIVIMIAIKKKWQRQETQDTKKK*權(quán)利要求1.馬傳染性貧血病毒遼系野毒株的全基因組序列，包括SEQIDNO:1所示的序列。2.如權(quán)利要求1所述的序列，其中所述的全基因組包括位于全基因組核苷酸1-316位的5’LTR，位于全基因組核苷酸7928-8236位的3’LTR，位于全基因組核苷酸457-1917位的gag基因，位于全基因組核苷酸1680-5124位的pol基因，位于全基因組核苷酸5307-7904位的env基因，位于全基因組核苷酸356-454位的tat基因第一外顯子，位于全基因組核苷酸5133-5270位的tat基因第二外顯子，位于全基因組核苷酸5048-5542位的rev基因第一外顯子，位于全基因組核苷酸7249-7651位的rev基因第二外顯子，位于全基因組核苷酸5281-5487位的s2基因。3.馬傳染性貧血病毒遼系野毒株gag基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:8所示的序列。4.馬傳染性貧血病毒遼系野毒株pol基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:9所示的序列。5.馬傳染性貧血病毒遼系野毒株env基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:10所示的序列。6.馬傳染性貧血病毒遼系野毒株rev基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:11所示的序列。7.馬傳染性貧血病毒遼系野毒株tat基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:12所示的序列。8.馬傳染性貧血病毒遼系野毒株s2基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:13所示的序列。9.馬傳染貧血性病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株的全基因組序列，包括SEQIDNO:14所示的序列。10.如權(quán)利要求9所述的序列，其中所述的全基因組包括位于全基因組核苷酸1-328位的5’LTR，位于全基因組核苷酸7919-8255位的3’LTR，位于全基因組核苷酸469-1929位的gag基因，位于全基因組核苷酸1692-5126位的pol基因，位于全基因組核苷酸5319-7448位的env基因，位于全基因組核苷酸368-465位的tat基因第一外顯子，位于全基因組核苷酸5142-5282位的tat基因第二外顯子，位于全基因組核苷酸5460-5552位的rev基因第一外顯子，位于全基因組核苷酸7256-7657位的rev基因第二外顯子，位于全基因組核苷酸5293-5496位的s2基因。11.馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株gag基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:21所示的序列。12.馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株pol基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:22所示的序列。13.馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株env基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:23所示的序列。14.馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株rev基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:24所示的序列。15.馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株tat基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:25所示的序列。16.馬傳染性貧血病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株s2基因編碼的氨基酸序列，其包括如SEQIDNO:26所示的序列。17.含有權(quán)利要求1所述的馬傳染貧血性病毒遼系野毒株的全基因組序列的質(zhì)粒載體，命名為pCh-LN。18.含有權(quán)利要求14所述的馬傳染貧血性病毒驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株的全基因組序列的質(zhì)粒載體，命名為pCh-FD。19.用權(quán)利要求17的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，其于1999年12月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO.0434.2。20.用權(quán)利要求18的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，其于1999年12月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO.0434.1。21.權(quán)利要求1-16所述的序列在制備基因工程亞單位疫苗，基因缺失疫苗，DNA疫苗和診斷試劑中的應(yīng)用。22.權(quán)利要求1-16所述的序列在制備用于基因治療的馬傳染性貧血病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的應(yīng)用，所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括表達(dá)gag/pol的質(zhì)粒、馬傳染性貧血病毒基因轉(zhuǎn)移載體以及馬傳染性貧血病毒膜蛋白基因表達(dá)載體。23.基于權(quán)利要求1和9的馬傳染性貧血病毒遼系野毒株和驢胎皮膚適應(yīng)株的全基因組序列構(gòu)建的感染性分子克隆。24.一種引物序列，選自如下序列GAgAAgTTATTAggTgC以及CCCTgATCTCATCCATgTT。全文摘要本發(fā)明涉及馬傳染性貧血病毒的稱為遼系野毒株的一種強(qiáng)毒株和稱為驢胎皮膚細(xì)胞適應(yīng)株的一種經(jīng)過多次馬屬動(dòng)物細(xì)胞傳代得到的減毒疫苗株的全長(zhǎng)前病毒DNA序列。各功能基因的DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列及各功能基因及蛋白產(chǎn)物的應(yīng)用。所述的兩種毒株是我國(guó)自行分離得到的。文檔編號(hào)A61K39/21GK1301866SQ9912753公開日2001年7月4日申請(qǐng)日期1999年12月30日優(yōu)先權(quán)日1999年12月30日發(fā)明者邵一鳴,沈榮顯,陳剛,于康震,潘品良,賈斌,范秀娟,王曉鈞,相文華,馮毅,呂曉玲,薛飛申請(qǐng)人:衛(wèi)生部艾滋病預(yù)防與控制中心,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所