專(zhuān)利名稱(chēng)：Hcve的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于多肽，尤其是關(guān)于丙型肝炎病毒(HCV)的推定外殼糖蛋白E2高變區(qū)1(HVR1)擬表位(mimotopes)的多肽。本發(fā)明的發(fā)明者綜合應(yīng)用了許多技術(shù)，在天然存在的HVR1序列的共有序列分析以及通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定與抗不同分離群的抗體的交叉反應(yīng)性的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了大量多肽，這些多肽中沒(méi)有一個(gè)在自然界中被發(fā)現(xiàn)過(guò)。這些多肽可彼此獨(dú)立用于免疫和制備抗體，用于體外用途(如診斷)和體內(nèi)用途，而這些多肽的肽庫(kù)則可用于鑒別與能結(jié)合大量不同HCV株HVR1的抗體具有特殊交叉反應(yīng)性的多肽。這些多肽可以獨(dú)立使用或作為融合蛋白的一部分，如作為重組HCV E2多肽的一部分，使用。上述重組HCV E2多肽可被結(jié)合入重組的HCV病毒顆粒中。
HCV HVR1區(qū)是整個(gè)病毒基因組中最為可變的抗原片段，其主要負(fù)責(zé)感染病毒的大的個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)異體性。其包含一個(gè)主要的中和表位，該中和表位被認(rèn)為是病毒逃避宿主免疫應(yīng)答機(jī)制的主要因素。因?yàn)橛捎诳笻VR1抗體是目前為止證明具有保護(hù)性效應(yīng)唯一抗體，所以發(fā)展有效的防治療法非常困難。
在設(shè)計(jì)本發(fā)明時(shí)，發(fā)明者從源自不同病毒分離物的兩百多個(gè)HVR1序列中得到了一個(gè)共有分布型(consensus profile)并用此作為模板得到了一個(gè)大的完整的合成HVR1代用品庫(kù)，借此解決了HVR1的可變性的問(wèn)題。上述代用品庫(kù)是以M13噬菌體主要外殼蛋白III融合蛋白的形式提供的，以使其位于噬菌體顆粒表面。這個(gè)庫(kù)利用源自不同感染病人的血清進(jìn)行親和選擇。這樣就可鑒別出與病人血清反應(yīng)頻率高但與未感染的對(duì)照血清不反應(yīng)的噬菌體。上述選出的表現(xiàn)出與大量從天然HCV變株重復(fù)產(chǎn)生HVR1的多肽具有交叉反應(yīng)的血清抗體結(jié)合。
從這些“擬表位”中鑒定出了一種引起上述觀察到的交叉反應(yīng)性序列模式。當(dāng)注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)時(shí)，具有最高交叉反應(yīng)性的擬表位誘導(dǎo)出能識(shí)別同一系列天然HVR1變型的抗體。丙型肝炎病毒(HCV)是全世界范圍內(nèi)輸血相關(guān)的以及零星的非甲非乙型肝炎的主要致病因，估計(jì)在輸出血人群中流行率為0.4％-2％(Choo et al.，1989)。在至少70％的病例中HCV感染導(dǎo)致持久的病毒性和慢性疾病，其中相當(dāng)大一部分最終發(fā)展成肝硬化和肝癌。(綜述見(jiàn)H.Alter，1995)。盡管可以對(duì)HCV診斷進(jìn)行可靠的血清學(xué)測(cè)定，在世界范圍內(nèi)由于群落傳染導(dǎo)致的感染仍然很普遍并導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率(Mast and Alter，1993)。并且，干擾素治療，目前唯一可行的抗病毒療法，僅對(duì)20-30％的病人有效(Fried and Hoofnagle，1995)。因此，發(fā)展HCV疫苗是此領(lǐng)域中高度優(yōu)先考慮的項(xiàng)目。
盡管宿主產(chǎn)生了一系列體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這種病毒仍然經(jīng)常導(dǎo)致永久感染，這種現(xiàn)象過(guò)去引起了對(duì)存在抗HCV的保護(hù)性免疫力的關(guān)注(Farci et al.，1992)。事實(shí)上，可通過(guò)用推定的包膜蛋白E1和E2的重組形式免疫黑猩猩(除人外唯一的受HCV感染的物種)，誘導(dǎo)得到抗同源性病毒攻擊的保護(hù)性免疫力(Choo et al.，1994)。但是這種反應(yīng)對(duì)異源病毒感染具有多大效力還有待深入研究。
在受感染病人的血液中，HCV以準(zhǔn)種的形式存在(Weiner等，1991；Martell等，1992；Martell等，1994；Kurosaki等，1994；Bukh等，1995)，其在主要作為免疫壓力結(jié)果的病期中變動(dòng)(Weiner et al.，1992；Kato et al.，1993；Kojima et al.，1994；Shimizu et al.，1994；van Doorn et al.，1995 Weiner et al.，1995).目前逐漸形成的觀點(diǎn)是HCV慢性感染并不是因?yàn)槿鄙袤w液反應(yīng)或細(xì)胞反應(yīng)，而是因?yàn)樵摬《镜母咄蛔兟适沟眠@些反應(yīng)不起作用，因?yàn)楦咄蛔兟蕦?dǎo)致一些變株幸存。
通過(guò)在注射到黑猩猩體內(nèi)之前對(duì)來(lái)源清楚的病毒接種體的來(lái)自體內(nèi)的中和作用證明中和抗體的存在以及它們?cè)诒Ｗo(hù)宿主不受病毒感染中的作用(Farci et al.，1994)。盡管如此，中和抗體是隔離種群特異性的，并且似乎只能阻止在相應(yīng)體液反應(yīng)開(kāi)始之前已經(jīng)出現(xiàn)的病毒變株(Farciet al.，1994)。盡管這種中和抗體的特異性尚未被很好地界定，免疫學(xué)和分子生物學(xué)證據(jù)都表明被中和抗體識(shí)別的表位位于HCV基因組的高變區(qū)1(HVR1)區(qū)(Farci et al.，1994)。該區(qū)由E2糖蛋白N末端的27個(gè)氨基酸組成，是整個(gè)HCV多蛋白中可變性最大的區(qū)域(Weiner et al.，1991)?？?HVR1抗體在清除病毒中作用的直接證據(jù)來(lái)自最近的來(lái)自體內(nèi)的中和實(shí)驗(yàn)。制備兔抗HVR1超免疫血清以抗一種具感染性的HCV接種體的特優(yōu)種變種，從而在一只黑猩猩中廢除了其感染性，并且通過(guò)阻斷接種物中存在的主要變株的繁殖而部分保護(hù)了第二只動(dòng)物(Farci etal.，1996)。
因此，證據(jù)表明HVR1含有HCV的主要中和決定簇，并且如果能克服變異性問(wèn)題，那么它還應(yīng)組成無(wú)細(xì)胞HCV疫苗的一個(gè)重要成分。與此相關(guān)，有人觀察到來(lái)自人血清的抗HVR1抗體表現(xiàn)出對(duì)不同HVR1變型具有一定程度的交叉反應(yīng)性(Scarselli et al.，1995)。
WO94/26306(Chiron Corporation)在比較了90多株據(jù)稱(chēng)在1993年5月12日已知病毒株序列的基礎(chǔ)上公布了鑒定HCV HVR1區(qū)共有序列的嘗試。公布的式是一包括以下序列的多肽aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6，其中aa1是S，G，A，D，K，R或T；aa2是L，F(xiàn)，I，M，或W；aa3是F或L；aa4是任何氨基酸；aa5是任何氨基酸；aa6是G或A。上述式的前提是1993年五月12日之前的已知HCV分離物的天然存在的E2HV域的31個(gè)氨基酸序列中不得含有以上序列。在更深入的實(shí)施例中，存在aa7并且緊連aa6，aa7是A，P，或S。這6個(gè)氨基酸的序列代表約55,000個(gè)不同序列，而所述7個(gè)氨基酸的序列代表165,000個(gè)不同序列。
本發(fā)明的特點(diǎn)部分基于對(duì)HVR1可變性的細(xì)致研究。我們的研究表明HVR1的一些部位相對(duì)另一些部位可變性要小一些，這意味著真實(shí)的結(jié)構(gòu)可變性以及免疫學(xué)可變性要比一級(jí)序列所暗示的異源性更要有限。本發(fā)明在多個(gè)方面涉及提供一種HCV HVR1的“合成變型”，該變型在免疫學(xué)上與許多，優(yōu)選地，非常大量的天然HVR1變型相似，從而可以利用上述合成變型誘導(dǎo)與不同HCV變型，優(yōu)選地，大部分或全部變株，交叉反應(yīng)的中和抗體。本發(fā)明得到的多肽式與WO94/26306中提供的不同，本發(fā)明提供的是基于真正的交叉反應(yīng)性比數(shù)，而不僅僅是基于序列比較，這一點(diǎn)還將在以下進(jìn)一步解釋。
噬菌體多肽庫(kù)獨(dú)一無(wú)二地為利用循環(huán)篩選/rescue/擴(kuò)增程序快速調(diào)查大量多肽序列(108或更多)提供了可能。它們?cè)试S鑒定任何類(lèi)型的連接物，包括從線性多肽到折疊蛋白域，甚至碳水化合物，的配基(Cortese et al.，1994，Cortese et al.，1996)。這些配基是真正的擬表位，因?yàn)樗鼈儾灰欢ê统跏急砦痪哂邢嗤陌被嵝蛄校鼈兡７铝嗽急砦坏慕Y(jié)合特性。一種用于鑒定疾病特異的噬菌體表達(dá)擬表位的策略已有報(bào)道，這種策略只能利用源自免疫以及未免疫個(gè)體的已經(jīng)過(guò)臨床鑒定的血清。(Folgori et al.，1994，在此作為參考文獻(xiàn)結(jié)合于本發(fā)明中)。進(jìn)而，疾病特異的擬表位已被證明是天然抗原的良好免疫原性模擬物，因?yàn)樽⑸淙氩煌瑒?dòng)物中時(shí)它們能誘導(dǎo)針對(duì)天然抗原的特異性免疫應(yīng)答(Folgori et al.，1994；和Meola et al.，1995；(都作為參考文獻(xiàn)結(jié)合于本發(fā)明中)Prezzi et al.，1996；Mecchia et al.，1996)。因此，噬菌體庫(kù)可用作疾病特異抗體所識(shí)別的人工配基源，其優(yōu)點(diǎn)是如果在庫(kù)的富集過(guò)程中能被篩選出的話，可另外引入的合乎需要的特性。
在本發(fā)明的發(fā)明過(guò)程中，發(fā)明者通過(guò)與M13噬菌體主要外殼蛋白(pVIII)融合的方法得到一個(gè)很大的完整的HVR1代用品庫(kù)來(lái)解決HVR1的可變性問(wèn)題。利用選擇和許多經(jīng)臨床鑒定的感染HCV病人的血清分離得到了顯示出是具有良好抗原性和免疫原性的大量天然存在的HCV變株的模擬物的多肽。
以下是實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)根據(jù)本發(fā)明的不同方面，本方面提供了含有大量不同多肽的多肽庫(kù)、含有與許多HCV HVR1表位交叉反應(yīng)的表位的單一多肽、以及這些不同的多肽的混合物。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了與下列共有分布型一致的多肽庫(kù)Q T H V T G G S A A R T T S G L T S L F S P G A S Q NT T T V V Q G H A A H S V G R L P K KR Q V S Q V R R R S S QQ此分布型代表了總共9×107個(gè)獨(dú)立的序列，這個(gè)數(shù)字與目前的DNA克隆和轉(zhuǎn)化技術(shù)實(shí)踐上的上限大約108非常接近。如以下所描述，通過(guò)克隆簡(jiǎn)并合成寡聚核苷酸并在M13的噬粒載體上與編碼主要外殼蛋白(pVIII)的基因的5’-末端融合，此共有分布型被用于構(gòu)建一個(gè)27氨基酸的多肽庫(kù)。用人血清對(duì)該多肽庫(kù)進(jìn)行了充分的篩選并得到了一百個(gè)多個(gè)能特定識(shí)別人類(lèi)抗HCV-HVR1抗體的不同克隆(擬表位)。幾乎所有的這些擬表位都具有不同的氨基酸序列并且發(fā)現(xiàn)沒(méi)有一個(gè)與已發(fā)表的天然HVR1序列(截至1998一月)相應(yīng)。
在根據(jù)本發(fā)明的多肽庫(kù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中存在至少具有約105個(gè)不同的多肽，優(yōu)選地至少約106個(gè)不同的多肽，更為優(yōu)選地至少約107個(gè)不同的多肽，例如約9×107個(gè)不同的多肽。
多肽庫(kù)可在噬菌體表面，尤其是線狀噬菌體如fd或M13的表面，例如以與這些噬菌體的主要外殼蛋白(pVIII)融合的形式表達(dá)。表達(dá)多肽的噬菌體在本領(lǐng)域中是常規(guī)技術(shù)，其效力取決于噬菌體顆粒的構(gòu)建。噬菌體顆粒應(yīng)被構(gòu)建為在每個(gè)包裝好的病毒顆粒內(nèi)是編碼噬菌體表面表達(dá)的多肽的核酸。在選出表達(dá)感興趣的多肽，如能結(jié)合一種或多種抗體(例如能結(jié)合許多不同HCV株的HVR1表位的抗體)，的噬菌體顆粒后能重新找到編碼該多肽的核酸并用該核酸進(jìn)一步生產(chǎn)具有那種氨基酸序列的多肽。
在以下描述的實(shí)驗(yàn)工作中，發(fā)明者用一系列人血清測(cè)試了一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的多肽庫(kù)中的擬表位。各個(gè)擬表位的特性用和血清反應(yīng)的整體頻率上的差異來(lái)描述。24個(gè)僅能與3種以下血清反應(yīng)的克隆被定義為“弱”，而27個(gè)能與11種以上的血清反應(yīng)的克隆被定義為“強(qiáng)”。
通過(guò)對(duì)“強(qiáng)”和“弱”克隆的共有序列的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)了HVR1中與人血清高頻反應(yīng)性、與人抗HVR1抗體的交叉反應(yīng)性以及與在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)高交叉反應(yīng)性血清相關(guān)的序列基序。
根據(jù)本發(fā)明的多肽和它們的混合物可如下定義，進(jìn)一步的解釋將在以下的實(shí)驗(yàn)部分給出(1)-完全由以下式(“式I”)定義的多肽庫(kù)Q T H V T G G S A A R T T S G L T S L F S P G A S Q NT T T V V Q G H A A H S V G R L P K KR Q V S Q V R R R S S QQ也可寫(xiě)成(aa1)T (aa3) (aa4) (aa5)GG (aa8) (aa9) (aa10) (aa11) (aa12)(aa13) (aa14) (aa15)L(aa17) (aa18)LF (aa21) (aa22)G (aa24)(aa25)Q (aa27)
其中aa1是Q或T；aa3是H，T或R；aa4是V或T；aa5是T或V；aa8是S、V或Q；aa9是A、Q或V；aa10是A，G或S；aa11是R或H；aa12是T、A或Q；aa13是T、A或V；aa14是S、H或R；aa15是G、S或R；aa17是T或V；aa18是S、G或R；aa21是S或R；aa22是P、L、S或Q；aa24是A、P或S；aa25是S、K或Q；aa27是N或K。
(2)-27種可從此多肽庫(kù)得到的“強(qiáng)”多肽是根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)方面的優(yōu)選多肽，其氨基酸序列如下2.11 QT H TVGGVQG R QAHSLT S LF S P G A SQND6 QT T TTGGQVS H ATHGLT G LF S L G P QQKD18 QT H TTGGSAS H QASGLT R LF S Q G P SQNF63 QT H VVGGQQG R QVSSLV S LF S P G A SQKG31 TT H TVGGSVA R QVHSLT G LF S P G P QQKL13 QT H TVGGSQA H AAHSLT R LF S P G S SQNM69 QT T VVGGSQA R AAHGLV S LF S L G S KQNZ61 QT H VVGGVQG R QTSGLV G LF S P G S KQNR9 QT T VVGGSQS H TVRGLT S LF S P G A SQNB26 TT T TTGGQAG H QAHSLT S LF S P G A SQKB22 QT H VVGGVQS H QTSGLT S LF S P G A SQKB35 QT H TTGGVQG H QTSRLT S LF S P G P SQND29 TT T VVGGQAA H QTHSLT S LF S P G A KQND33 TT T TTGGQQS H TVHGLV G LF S P G S KQNE26 QT H TVGGVQA H TVRGLT S LF S P G S SQNF80 QT H TTGGQAG H TASSLT G LF S P G A KQNF19 QT T TVGGVAS H QAHSLT G LF S P G A KQKF78 QT H TTGGQAG H QAHSLT G LF S P G A KQNH1 QT H TTGGVVG H ATSGLT S LF S P G P SQK
L76 TT T TVGGQAS H QTSSLT G LF S P G S KQNM27 QT T TTGGVAS H AAHRLT S LF S P G P QQKM122 QT T TTGGSAS H AVSSLT G LF S P G S KQNM129 QT T VVGGSAG H TASSLV G LF S P G S KQNM119 TT T TVGGQAS H TTSSLT G LF S P G S QQNR5 QT H TTGGQAS H QVSSLV S LF S P G A KQKR6 TT T TTGGQVG H QTSGLT G LF S P G A QQNR27 TT H VVGGSAS H AVRGLT S LF S P G S SQN根據(jù)本發(fā)明進(jìn)而優(yōu)選的多肽具有以下序列中的任何一個(gè)B14 QT T VTG_QAS H TTSSLT G LF S P G A SQKB33 aT H aTGGQAA H STHSLT S LF S P G A SQKF81 QT H VTGGSAA H QTgGLT G LF S P G P KQNB18 QT T VVGGQAS H _VSRLT G LF S P G S SQKL72 QT T T____AA H TTSGLT G LF S P G A KQND20 QT H VTG_VAG R QTSGLV S LF S P G S SQND30 Q_ _ __GGVQG H TTSSLV G LF S P G S QQNE19 TT H T_GGQQA H TTSRLV S LF S P G A SQKB24 TT T TVGGQAS H TTSSLT G LF S P G A SQKM63 QT H TTGGVVS H QTRSLV G LF S P G P QQN小寫(xiě)字母表示與式I不同的氨基酸殘基，而下劃線則強(qiáng)調(diào)表示從式I中缺失的氨基酸，當(dāng)然，在相應(yīng)多肽中側(cè)翼的氨基酸是連續(xù)的。
這些是可從根據(jù)本發(fā)明的多肽庫(kù)得到的多肽的變體，它們本身與式I不一致。它們?cè)诙嚯膸?kù)的擴(kuò)增過(guò)程中由于PCR錯(cuò)誤而產(chǎn)生并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到鑒定(見(jiàn)材料與方法，“構(gòu)建HVR1多肽庫(kù))。
(3)-源自以上(2)的高交叉反應(yīng)性多肽共有序列的一段“強(qiáng)共有序列”(“式II”)。
對(duì)27個(gè)“強(qiáng)”多肽的任何位置氨基酸出現(xiàn)頻率的統(tǒng)計(jì)分析以及與25個(gè)“弱”多肽頻率的比較見(jiàn)表II，并且在下面的實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)一步討論。
式IIQT(aa3)TVGGQQS(aa11)QVHSLT(aa18)LF(aa21)(aa22)G(aa24)SQN其中aa3是H或T；aa11是H或R；aa18是G、S或R；aa21是S；aa22是P、L或Q；aa24是A、S或P。
也可寫(xiě)成QT H TVGGQAS H QASSLT S LF S P G A KQNT RG L SR Q P斜體字表示的殘基也包括在內(nèi)。因?yàn)楸M管這些殘基出現(xiàn)的頻率較小，但它們出現(xiàn)在一些測(cè)試中反應(yīng)性最好的擬表位中(在以上的II的27個(gè)“強(qiáng)”多肽中用星號(hào)強(qiáng)調(diào))。
27個(gè)用于得到式II的擬表位不包括在其中。
108種多肽與式II一致，每種多肽都是本發(fā)明的一個(gè)方面。這些序列是1 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SPGAK QN2 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SPGSK QN3 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SPGPK QN4 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SLGAK QN5 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SLGSK QN6 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SLGPK QN7 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SQGAK QN8 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SQGSK QN9 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SQGPK QN10 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SPGAK QN11 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SPGSK QN12 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SPGPK QN13 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SLGAK QN14 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SLGSK QN15 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SLGPK QN16 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SQGAK QN17 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SQGSK QN18 QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SQGPK QN19 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SPGAK QN20 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SPGSK QN21 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SPGPK QN22 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SLGAK QN23 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SLGSK QN24 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SLGPK QN25 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SQGAK QN26 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SQGSK QN27 QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SQGPK QN28 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SPGAK QN29 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SPGSK QN30 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SPGPK QN31 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SLGAK QN32 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SLGSK QN33 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SLGPK QN34 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SQGAK QN35 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SQGSK QN36 QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SQGPK QN37 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SPGAK QN38 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SPGSK QN39 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SPGPK QN40 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SLGAK QN41 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SLGSK QN42 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SLGPK QN43 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SQGAK QN44 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SQGSK QN45 QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SQGPK QN46 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SPGAK QN47 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SPGSK QN48 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SPGPK QN49 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SLGAK QN50 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SLGSK QN51 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SLGPK QN52 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SQGAK QN53 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SQGSK QN54 QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SQGPK QN55 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SPGAK QN56 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SPGSK QN57 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SPGPK QN58 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SLGAK QN59 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SLGSK QN60 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SLGPK QN61 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SQGAK QN62 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SQGSK QN63 QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SQGPK QN64 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SPGAK QN65 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SPGSK QN66 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SPGPK QN67 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SLGAK QN68 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SLGSK QN69 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SLGPK QN70 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SQGAK QN71 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SQGSK QN72 QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SQGPK QN73 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SPGAK QN74 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SPGSK QN75 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SPGPK QN76 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SLGAK QN77 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SLGSK QN78 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SLGPK QN79 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SQGAK QN80 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SQGSK QN81 QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SQGPK QN82 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SPGAK QN83 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SPGSK QN84 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SPGPK QN85 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SLGAK QN86 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SLGSK QN87 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SLGPK QN88 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SQGAK QN89 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SQGSK QN90 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SQGPK QN91 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SPGAK QN92 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SPGSK QN93 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SPGPK QN94 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SLGAK QN95 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SLGSK QN96 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SLGPK QN97 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SQGAK QN98 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SQGSK QN99 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SQGPK QN100 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SPGAK QN101 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SPGSK QN102 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SPGPK QN103 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SLGAK QN104 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SLGSK QN105 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SLGPK QN106 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SQGAK QN107 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SQGSK QN108 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SQGPK QN(4)-比式I肽庫(kù)中多肽更進(jìn)一步的肽庫(kù)，它包括了式II中的序列，定義了2.5×106個(gè)序列并且與以下的式III一致Q T H T V G G Q A S H Q A S S L T S L F S P G A K Q NT T V T S Q G A T H G V G S S KV V A T V R R P Q根據(jù)本發(fā)明的多肽可以與其它氨基酸融合的形式提供。其它氨基酸可融合到多肽的N末端或C末端中的一端或兩端。上述其它氨基酸可是非HCV E2蛋白質(zhì)片段的氨基酸序列或也可是該蛋白的一部分氨基酸序列。進(jìn)而，包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的融合肽可以包括具有處于HVR1位置的多肽的氨基酸的HCV E2/NS1蛋白，即根據(jù)本發(fā)明的HVR1擬表位多肽取代了天然HVR1序列。這種方式的另一種表達(dá)方式是“HVR1為根據(jù)本發(fā)明的多肽所取代的HCV E2/NS1重組蛋白”。如下文所述，編碼根據(jù)本發(fā)明的肽、多肽和融合蛋白的核酸將被作為本發(fā)明的一些方面進(jìn)一步給出。同樣也將給出重組的HCV基因組，該基因組包括了編碼根據(jù)本發(fā)明多肽的核苷酸序列。例如E2/NS1編碼序列之內(nèi)包括了上述核苷酸序列以產(chǎn)生重組HCV E2/NS1蛋白，其中本發(fā)明的肽取代3HVR1，并且將重組的蛋白結(jié)合入組裝的HCV病毒顆粒中。此處公布的包含一種或多種肽或多肽的重組HCV病毒顆粒將作為本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)一步加以說(shuō)明。
總體而言，根據(jù)本發(fā)明的多肽是具有免疫原性或者在對(duì)個(gè)體施用后能引起免疫應(yīng)答或者含有與許多株HCV的表位具有免疫交叉反應(yīng)的表位。
本發(fā)明另一方面提供了一種得到一種或多種多肽的方法。上述多肽含有免疫學(xué)上與HCV株的HVR1上的表位發(fā)生交叉反應(yīng)的表位。該方法包括使一個(gè)公布的多肽庫(kù)與一種能結(jié)合HCV株的上述HVR1的抗體分子接觸，然后從多肽庫(kù)中選出能結(jié)合上述抗體分子的一種或多種多肽。上述選出的多肽可能含有免疫學(xué)上與多株HCV HVR1發(fā)生交叉反應(yīng)的表位。
這樣的方法包括使一個(gè)多肽庫(kù)與多種都能結(jié)合多株HCV的HVR1的抗體分子接觸，在一個(gè)實(shí)施方案中，上述多種抗體分子源自感染HCV的個(gè)體的血清。
如上所述，上述多肽庫(kù)可表達(dá)在噬菌體顆粒的表面上，每一顆粒含有編碼在其表面表達(dá)的多肽的核酸。進(jìn)行選擇之后，核酸可被從表達(dá)上述被選多肽的噬菌體顆粒中得到。具有從表達(dá)上述選出多肽的噬菌體顆粒中得到的核酸序列的核酸可用于通過(guò)表達(dá)的方法生產(chǎn)(使用本領(lǐng)域中常規(guī)的重組DNA技術(shù)，下文還將進(jìn)一步討論)這樣的多肽。
具有上述選出多肽氨基酸序列的多肽可以分離的形式提供，例如在通過(guò)表達(dá)編碼核酸生產(chǎn)之后。如下文所進(jìn)一步描述，可通過(guò)多肽合成的方式提供一種或多種根據(jù)本發(fā)明的多肽。
可以分離的形式單獨(dú)提供或以混合物提供多種多肽。上述多種多肽分別具有不同的選出的多肽的氨基酸序列。
選出的一種或多種多肽可分別具有上文式II的氨基酸序列。式II中所有108種不同多肽可以混合物的形式提供，并且它們分別獨(dú)立地代表了本發(fā)明的一個(gè)方面。這108種多肽中每一種與許多HCV株的E2/NS2蛋白HVR1的表位發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性都很高，因此對(duì)于得到抗體或引起免疫反應(yīng)尤為有用。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可包括多種可由式II的108種肽混合物得到的多肽。這樣的組合物可包含有從2至約20，15，10，9，8，7，6，5，4，或3種不同的可由上述混合物得到的多肽。
可以混合物形式提供或單獨(dú)提供的優(yōu)選多肽包括G31，F(xiàn)78，R9，D6，M122和H1，它們的氨基酸序列如圖7(A)所示。優(yōu)選混合物包括多肽R9，F(xiàn)78，H1和D6(MIX1)，包括多肽M122和G31(MIX32)，或包括多肽G31，F(xiàn)78，R9，D6，M122，和H1(MIX3)。
如以下所舉的例子所表明，本發(fā)明的每種多肽與HCV株HVR1的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性可由實(shí)驗(yàn)測(cè)量。這些多肽的不同混合物也可制備并進(jìn)行類(lèi)似測(cè)量，這一點(diǎn)也將在下文中實(shí)驗(yàn)性例示。
根據(jù)本發(fā)明的線性的或分支(如MAP)的肽和多肽(如上文討論的包含一段肽的融合分子)可在本領(lǐng)域技術(shù)人員的布置下利用多種技術(shù)手段得到。
線性的或分支的肽可利用常規(guī)多肽化學(xué)的方法合成，如可通過(guò)使用Fmoc(芴甲氧羰基)t-Bu(叔丁基)的通用方法，如文獻(xiàn)Atherton andSheppard(1989)，Solid Phase Peptide Synthesis，a practicalApproach，IRL PressOxford中所描述。
生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽的簡(jiǎn)便方法是在表達(dá)系統(tǒng)中利用核酸表達(dá)編碼該肽或多肽的核酸。
相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及制造肽或多肽的方法(如所公開(kāi)的)。該方法包括從編碼肽或多肽的核酸(通常是根據(jù)本發(fā)明的核酸)表達(dá)。這可簡(jiǎn)便地通過(guò)在導(dǎo)致或允許表達(dá)多肽的適當(dāng)條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有這樣的載體的宿主細(xì)胞而完成。肽和多肽也可在體外系統(tǒng)-如網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中-表達(dá)。
編碼根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽的多聚核苷酸進(jìn)而代表本發(fā)明的一些方面。
在一個(gè)方面中，提供了編碼如所公開(kāi)的肽的多聚核苷酸。進(jìn)而在一個(gè)方面中提供了編碼如所公開(kāi)的融合蛋白-尤其是在HVR1位置包含有本發(fā)明的肽的氨基酸序列的HCV E2/NS1蛋白-的多聚核苷酸。進(jìn)而在一個(gè)方面中提供了包含有編碼如所公布的本發(fā)明肽或融合蛋白-尤其是在HVR1的位置含有相應(yīng)氨基酸序列的肽的HCV E2/NS1蛋白-的核苷酸序列的重組HCV基因組。
進(jìn)而在更進(jìn)一步的一個(gè)方面中提供的多聚核苷酸包括多個(gè)編碼根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽的核苷酸序列。這允許在一個(gè)單一表達(dá)反應(yīng)中產(chǎn)生肽或多肽的混合物。
編碼根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽的核酸可用于免疫動(dòng)物以在動(dòng)物體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，如免疫人以達(dá)到治療或預(yù)防的目的，或用于免疫非人哺乳動(dòng)物以達(dá)到同樣的目的或以產(chǎn)生抗體進(jìn)行后續(xù)操作或應(yīng)用(例如在診斷或治療的背景下，如下文所進(jìn)一步討論)。
編碼根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽的核酸可用于基因治療，防止和/或治療HCV感染的方法中。這要求應(yīng)用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)節(jié)元件以及適當(dāng)載體將表達(dá)單位(編碼序列和調(diào)控元件)運(yùn)送到宿主細(xì)胞。在本領(lǐng)域中已知有很多載體，包括病毒載體和質(zhì)粒載體，例子見(jiàn)US Patent No.5,252,479和WO 93/07282。尤其值得一提的是很多病毒已被用作基因轉(zhuǎn)染載體，包括乳多空病毒(如SV40)，牛痘病毒，皰疹病毒(包括HSV和EBV)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒。在先前工藝中許多基因治療方法使用無(wú)致病能力的鼠科逆轉(zhuǎn)錄病毒。目前已發(fā)展了許多腺病毒以及腺病毒相關(guān)病毒載體?？商娲《据d體的包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、DNA的直接吸收以及受體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。
含有編碼根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽(或其混合物)的核酸的宿主細(xì)胞可直接用于治療或預(yù)防個(gè)體的HCV感染(即治療感染了HCV的個(gè)體或在感染HCV之前對(duì)個(gè)體進(jìn)行預(yù)防性治療)。
核酸通常是以DNA或RNA的形式提供的，但可能包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸類(lèi)似物，并可能整個(gè)或部分是合成的。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和載體可以分離和/或純化的形式(例如相當(dāng)純或均一的形式)提供。術(shù)語(yǔ)“分離”可用于反應(yīng)所有的這些可能性。當(dāng)DNA序列是特定時(shí)(例見(jiàn)圖)除非上下文要求，否則以U代替T的對(duì)應(yīng)的RNA等價(jià)物也包含在其中。
當(dāng)需要從編碼核酸表達(dá)肽或多肽時(shí)，核酸包括適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列?？梢赃x擇或構(gòu)建包含有適當(dāng)調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子序列、終止序列、poly-A序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因序列、和其它適當(dāng)序列的合適的載體。載體可以是適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒、病毒如噬菌體或噬菌體質(zhì)粒。更詳細(xì)的細(xì)節(jié)可參考，如，Molecular cloninga Laboratory Manual2ndedition，Sambrooket al.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press.核酸操作的很多已知的技術(shù)和方法，如構(gòu)建核酸的制備，突變，測(cè)序，將DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)，以及蛋白分析，在Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel et al.Eds.，John Wiley & Sons，1992中都有描述。
在多種不同的宿主細(xì)胞中克隆表達(dá)多肽的系統(tǒng)是眾所周知的。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括細(xì)菌、真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域中可用來(lái)表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、Hela細(xì)胞、嬰兒倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞、COS細(xì)胞和許多其它細(xì)胞。一種常見(jiàn)優(yōu)選的細(xì)菌宿主是E.Coli。
如此處所公開(kāi)的，本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)而提供了含有核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的核酸可被整合到宿主細(xì)胞的基因組中(例如，染色體)。與常規(guī)技術(shù)一致，整合可通過(guò)促進(jìn)與基因組重組的序列的內(nèi)含物而得以促進(jìn)。核酸也可處于細(xì)胞內(nèi)染色體外的載體中。
更進(jìn)一步的一個(gè)方面提供了包括將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。上述導(dǎo)入可應(yīng)用任何可行技術(shù)，并且上述導(dǎo)入(尤其是體外導(dǎo)入)一般不受限制地被稱(chēng)為“轉(zhuǎn)化”。對(duì)真核細(xì)胞而言，適合的技術(shù)包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒、如牛痘病毒、進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞而言可用桿狀病毒。對(duì)細(xì)菌細(xì)胞而言，適當(dāng)?shù)募夹g(shù)包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體轉(zhuǎn)染。直接注入核酸也可作為一種替代手段?？墒褂脴?biāo)記基因如抗生素抗性或敏感基因以鑒定含有感興趣核酸的克隆，這在本領(lǐng)域中是廣為人知的。
導(dǎo)入之后可通過(guò)誘導(dǎo)或允許核酸的表達(dá)而產(chǎn)生其所編碼的肽或多肽，例如通過(guò)在該基因的表達(dá)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞(宿主細(xì)胞可以包括真正的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，但更可能是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代)。如果肽或多肽被偶聯(lián)到適當(dāng)?shù)男盘?hào)前導(dǎo)肽上一起表達(dá)，那么它可從細(xì)胞中分泌到培養(yǎng)基中。在通過(guò)表達(dá)生產(chǎn)后，肽或多肽可從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離和/或純化，然后根據(jù)需要隨后使用，如配制可含有一種或多種另加成分的組合物，如包含一種或多種藥用賦形劑、媒介或載體(例子見(jiàn)下文)的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽可用作免疫原或用于得到結(jié)合抗體?？贵w可用于肽或多肽的純化和其它操作、診斷篩選和藥用、包括被動(dòng)免疫。這將在下文進(jìn)一步討論。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)而提供了得到一種或多種抗體分子的方法，上述抗體分子含有一個(gè)能結(jié)合多種HCV株HVR1上一個(gè)表位的結(jié)合位點(diǎn)。該方法包括將一系列抗體分子和根據(jù)本發(fā)明的多肽接觸，然后從該系列中選出能結(jié)合上述肽的一種或多種抗體分子。
該方法可能涉及使該系列抗體與許多根據(jù)本發(fā)明的肽接觸。
如所述，肽可以與另外的氨基酸融合的形式提供。
肽或多肽可施用到非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物上以使它們與該哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一系列抗體分子接觸，然后可從該哺乳動(dòng)物中得到一種或多種能結(jié)合肽或多肽的抗體分子或從該哺乳動(dòng)物中得到能產(chǎn)生這樣抗體分子的細(xì)胞。
該動(dòng)物可被殺死。
如果從該動(dòng)物中取出的是細(xì)胞，可從上述細(xì)胞或其后代得到抗體分子。這樣的后代尤其應(yīng)包括雜交瘤細(xì)胞。
如所公布的一種得到抗體的方法可包括在噬菌體顆粒表面表達(dá)抗體種群，每個(gè)顆粒含有編碼其表面所表達(dá)的抗體分子的核酸，上述方法可用于取代免疫動(dòng)物或與之并存?？蓮谋磉_(dá)能結(jié)合感興趣的肽或多肽的抗體分子的噬菌體顆粒中得到核酸，該核酸可用于操作或用于生產(chǎn)所編碼的抗體分子或其衍生物(如融合蛋白、包括不變區(qū)或其它氨基酸的分子，等等)?？捎煤颂求w或多聚核糖體代替噬菌體表達(dá)，例子如US-A-5643768，US-A-5658754，WO95/11922中所公開(kāi)的。
抗體分子可以分離的形式分別提供或以混合物提供。多種抗體分子可以分離形式提供。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選抗體在不含有其它污染物如能與其它多肽結(jié)合的抗體和/或不含其它血清成分的意義上被分離。對(duì)一些目的而言單克隆抗體是優(yōu)選的，但多克隆抗體也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如下文所討論，事實(shí)上能結(jié)合一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽的多克隆混合物在一些實(shí)施方案中是優(yōu)選的。因此本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)而針對(duì)能結(jié)合一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽的不同抗體的混合物。這樣的混合物可以含有至少一種附加成分，如藥用上可接受的賦形劑或載體的組合物來(lái)提供。
本發(fā)明還擴(kuò)展到得到和/或引起針對(duì)一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽的抗體的方法。這樣的方法可包括對(duì)一哺乳動(dòng)物施用肽或多肽或肽或多肽的混合物以引起抗體應(yīng)答。在治療或預(yù)防的意義上哺乳動(dòng)物可以是人類(lèi)或非人類(lèi)。在生產(chǎn)抗體或要分離抗體的細(xì)胞或在多種目的的任何應(yīng)用中可包括一步殺死非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的步驟。這樣的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物可以是，如，小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬、馬、驢、山羊、綿羊、駱駝、old world monkey、黑猩猩或其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。可用任何本領(lǐng)域中已知的多種技術(shù)從已免疫的哺乳動(dòng)物中得到抗體，抗體的篩選優(yōu)選使用抗體與感興趣的肽或多肽的結(jié)合。例如，可使用Western blotting技術(shù)或免疫沉淀技術(shù)(Armitage et al，Nature，35780-82，1992)。
本領(lǐng)域中生產(chǎn)單抗和多抗的技術(shù)已經(jīng)很好地建立起來(lái)了。單抗可用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)保留初始抗體特異性的其它抗體和嵌合分子。這樣的技術(shù)可能涉及將編碼抗體的免疫球蛋白的可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)的DNA結(jié)合到另一不同免疫球蛋白的不變區(qū)或不變區(qū)加構(gòu)架區(qū)。例子見(jiàn)EP-A-184187、GB-A-2188638、或EP-A-239400。本發(fā)明還包括將源自非人類(lèi)的CDRs區(qū)嫁接到人的構(gòu)架區(qū)的人源化抗體，這樣通常改變了構(gòu)架區(qū)的一些氨基酸殘基，從而得到了免疫原性比初始的非人類(lèi)抗體小的抗體。產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可進(jìn)行基因突變或其它變化，這可能改變也可能不改變產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。克隆與表達(dá)嵌合抗體的技術(shù)在EP-A-0120694和EP-A-0125023中有描述。
作為用肽免疫哺乳動(dòng)物的替代或補(bǔ)充方法，對(duì)蛋白特異的抗體可由表達(dá)免疫球蛋白可變區(qū)的重組產(chǎn)生的文庫(kù)得到，例如使用在表面上表達(dá)免疫球蛋白的功能性結(jié)合片段的噬菌體-例子見(jiàn)WO92/01047-或如上所述的核糖體/多聚核糖體。該文庫(kù)可以是天然的，即由未經(jīng)任何該蛋白(或片段)免疫的有機(jī)體得到的序列構(gòu)建的文庫(kù)，或也可以是由已用感興趣的抗原免疫的有機(jī)體得到的序列構(gòu)建的文庫(kù)。
根據(jù)本發(fā)明的抗體可用很多方法進(jìn)行修飾。事實(shí)上術(shù)語(yǔ)“抗體”應(yīng)被解釋為包括任何具有要求的特異性的結(jié)合域的結(jié)合物質(zhì)。這樣本發(fā)明覆蓋了抗體片段、衍生物、功能性對(duì)等物和同源抗體，包括合成分子和模擬抗體使其能結(jié)合抗原或表位的分子。
能結(jié)合抗原或其它結(jié)合配對(duì)的抗體片段的例子是由VL、VH、C1和CH1域組成的Fab片段；VH和CH1域組成的Fd片段；由抗體一條臂的VL和VH域組成的Fv片段；由VH域組成的dAb片段；分離的CDR區(qū)域和F(ab’)2片段，在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段。單鏈Fv片段也包括在內(nèi)。
能產(chǎn)生具有所需的結(jié)合特性的抗體的雜交瘤也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，這是含有編碼抗體(包括抗體片段)的核酸并能表達(dá)的真核的或原核的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生抗體的方法，包括在產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng)能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，優(yōu)選地上述抗體是分泌的。
樣品中(如在診斷測(cè)試中的樣品)抗體的反應(yīng)性可用任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)試。其中一種可能的方法是用單個(gè)的報(bào)告分子標(biāo)記。報(bào)告分子可以直接或間接地產(chǎn)生可探測(cè)的，優(yōu)選地是可測(cè)量的信號(hào)。報(bào)告分子的連接可以是直接的或間接的，共價(jià)的，例如通過(guò)肽鍵，或非共價(jià)的。通過(guò)肽鍵的連接可以是編碼抗體與報(bào)告分子的融合基因重組表達(dá)的結(jié)果。
一種優(yōu)選的方式是單個(gè)抗體與單一的熒光生色基，磷或激光染料共價(jià)連接。上述報(bào)告基團(tuán)具有光譜學(xué)上獨(dú)立的吸收或發(fā)射特征。適合的熒光生色基包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、和德克薩斯紅。合適的顏色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。
其它報(bào)告基團(tuán)包括大分子膠體顆?；蛱厥獠牧先鐜ь伾娜槟z顆粒、或帶磁性或順磁性的乳膠顆粒，以及生物學(xué)上或化學(xué)上具有活性的物質(zhì)，上述物質(zhì)能直接或間接產(chǎn)生可探測(cè)信號(hào)，上述信號(hào)可通過(guò)視覺(jué)觀察到或可通過(guò)電子手段探測(cè)到或者其它方法記錄到。比如，上述分子可以是能催化反應(yīng)的酶，所述反應(yīng)例如能顯影或改變顏色或引起電子性質(zhì)改變。它們可以是可激活的分子，在能量狀態(tài)之間發(fā)生電子躍遷之后導(dǎo)致特征性光譜吸收或發(fā)射。它們可以包括與生物傳感器聯(lián)合使用的化學(xué)實(shí)體。可以使用生物素/親和素或生物素/鏈親和素以及堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)。
探測(cè)結(jié)合的方式并不是本發(fā)明的特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)他們的喜好和常規(guī)知識(shí)選擇適當(dāng)?shù)姆绞健?br> 根據(jù)本發(fā)明的抗體可用于探測(cè)肽或多肽的存在，例如在含所討論的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物的樣品中，也可用于純化和/或分離根據(jù)本發(fā)明的肽或多肽，如在從編碼核酸表達(dá)多肽進(jìn)行生產(chǎn)之后的分離純化。
在治療中抗體也可通過(guò)被動(dòng)免疫用于預(yù)防。當(dāng)抗體被施用時(shí)，優(yōu)選地包括抗體-如整體上能與許多根據(jù)本發(fā)明的肽交叉反應(yīng)的抗體-的混合物。
能與根據(jù)本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體本身可作為抗原生產(chǎn)抗獨(dú)特型抗體。上述抗獨(dú)特型抗體可用于模擬肽表位在個(gè)體中引起免疫應(yīng)答，從而達(dá)到例如治療和/或預(yù)防目的。
抗體可在試劑盒中提供，試劑盒中可含有抗體使用(例如探測(cè)樣品中特定物質(zhì)的存在)的說(shuō)明。試劑盒中可含有一種或幾種其它的試劑，如標(biāo)記分子、緩沖液、洗脫液等等。提供的試劑可裝在保護(hù)試劑不受外界環(huán)境影響的容器(如密封的小瓶)中。
診斷方法使用源自可能含有一種或多種HCV株的個(gè)體的生物樣品。生物樣品的例子包括液體如血液、原生質(zhì)、血清、尿液和唾液，以及組織樣品。
檢測(cè)測(cè)試樣品中是否存在特定肽或多肽有多種方法，包括其中待探測(cè)的多肽為抗體時(shí)的方法。
可探測(cè)樣品中是否存在特定的結(jié)合單位，如針對(duì)一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽的抗體或抗體混合物。
根據(jù)本發(fā)明的肽可用于探測(cè)測(cè)試樣品中是否存在抗HCV株的抗體。如果樣品中存在抗體的話，上述探測(cè)可通過(guò)分析肽與抗HCV E2 HVR1抗體的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。
理論上可鑒定樣品中是否存在特定結(jié)合單位-如針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一種或多種肽的抗體或抗體混合物-的結(jié)合配對(duì)體。然而，目前還沒(méi)有人成功地從人類(lèi)樣品中分離出HCV病毒粒體。將來(lái)應(yīng)該能證明可能從人類(lèi)樣品中鑒定HCV病毒粒體和/或在免疫學(xué)上探測(cè)這樣的HCV病毒粒體，則根據(jù)本發(fā)明的肽以及針對(duì)它們的特定抗體可用于這樣的探測(cè)。
在已由，如，上文所討論的報(bào)告系統(tǒng)確定結(jié)合之前先將生物樣品或其它樣品與一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽在適合于特異性結(jié)合的條件下接觸以探測(cè)抗HCV樣品的存在。當(dāng)使用一系列肽時(shí)，可使用不同的報(bào)告標(biāo)記每個(gè)肽，從而使每個(gè)肽的結(jié)合都能被探測(cè)到。
特異性的結(jié)合單位如肽可用于分離和/或純化測(cè)試樣品中的配對(duì)物結(jié)合抗體，從而對(duì)該抗體進(jìn)行序列和/或生化分析。用自動(dòng)化序列分析儀進(jìn)行氨基酸序列分析是本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。
典型的免疫分析包括將測(cè)試樣品與根據(jù)本發(fā)明的肽或抗獨(dú)特型抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下溫育以使免疫復(fù)合物形成(如果樣品中存在適合的抗體)，以及探測(cè)免疫復(fù)合物是否存在。
如上文所述，盡管目前技術(shù)上還不可行，通過(guò)分析抗體與可能存在的E2HVR1表位的結(jié)合，原理上可用根據(jù)本發(fā)明的抗體測(cè)定待測(cè)樣品中是否存在HCV株。
典型的免疫分析包括將待測(cè)樣品與根據(jù)本發(fā)明的肽或抗獨(dú)特型抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下溫育以使免疫復(fù)合物形成(如果樣品中存在適合的抗體)，以及探測(cè)免疫復(fù)合物的存在。
可應(yīng)用一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽(或含有這樣的肽的多肽)，或一種或多種抗獨(dú)特型抗體測(cè)試樣品中是否存在針對(duì)本發(fā)明的一種或多種肽的抗體。
通過(guò)在測(cè)定結(jié)合之前，例如使用所討論的報(bào)告體系，在適合特異性結(jié)合的條件下，用一種肽或多肽或抗獨(dú)特型抗體接觸，可以測(cè)定生物樣品或其它樣品。
免疫分析中可應(yīng)用任何可行的技術(shù)探測(cè)結(jié)合復(fù)合物的形成而不必限于本發(fā)明的范圍。關(guān)于標(biāo)記抗體的一些合適的技術(shù)在上文已有描述。分析測(cè)試可能涉及將抗體或多肽交聯(lián)到例如適當(dāng)?shù)墓滔嗷蛑С治锷?如乳膠顆粒、磁性或非磁性的小珠、膜、芯片、塑料、金屬、硅膠或玻璃表面，或任何熟練人士認(rèn)為適當(dāng)?shù)钠渌牧?。測(cè)定可以是定性或定量的。根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，應(yīng)設(shè)置一個(gè)或幾個(gè)合適的對(duì)照。
如上文所述，根據(jù)本發(fā)明的肽、多肽、抗體和核酸可配制成組合物并用于藥物治療。這些組合物可以除了上述物質(zhì)外還另外包括藥物上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)無(wú)毒并且不影響上述活性物質(zhì)的效力。載體或其它材料的具體性質(zhì)取決于施用途徑，如口服、靜脈注射、皮膚施用、皮下施用、鼻腔施用、肌肉注射或腹腔內(nèi)施用。
口服的組合物可以是藥片、膠囊、粉末或液體。藥片可含有固體載體如明膠或一種輔劑。液體藥用組合物通常包括液體載體如水、源自石油，動(dòng)物或植物的油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}水、葡萄糖或其它糖溶液、或二醇類(lèi)如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
對(duì)于靜脈皮膚或皮下注射，活性成分可以是非腸道施用可接受的含水溶液，上述溶液應(yīng)無(wú)熱原并具有合適的pH值，等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域中具有相關(guān)技術(shù)的人士能制備適當(dāng)溶液，使用如等滲載體(如氯化鈉注射液、Ringer注射液、乳酸鹽Ringer注射液)。如果需要，還可含有防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑抗氧化劑和/或其它添加劑。
分支多肽如MAP(Tam，J.P.1988)可單獨(dú)或與載體連接在一起用于制備免疫原。
用于引起免疫應(yīng)答的線性多肽也可與適當(dāng)?shù)妮d體連接在一起。將肽與其它分子偶聯(lián)在一起的多種方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括二硫鍵形成試劑(如果肽含有半胱氨酸-或?yàn)榇四康膶?duì)肽加入半胱氨酸的話)、硫醚鍵形成偶聯(lián)試劑等等。載體包括人血清白蛋白(HSA)、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、其它在生理?xiàng)l件下具有合理的半衰期的大蛋白和穩(wěn)定的非蛋白分子如多糖和氨基酸的共聚物。
可含有佐劑如礬、水包油乳劑或Freund佐劑(完全或不完全)。可使用細(xì)胞因子增強(qiáng)肽或多肽組合物的免疫原性。
可在HCV包膜(E2)蛋白中克隆鑲嵌擬表位序列以使用天然的折疊環(huán)境從而正確地遞呈給免疫系統(tǒng)以一個(gè)表位或多表位。
裸DNA(Naked DNA)可用于免疫接種(例子見(jiàn)Cohen，J，1993)并且一個(gè)或多個(gè)擬表位序列可被克隆到合適載體中(例子見(jiàn)Major etal.，1995)?？衫弥苯幼⑸浠蚧驑?Yang等，1990)或任何其它合適的技術(shù)送達(dá)。
不管給予個(gè)體的是多肽、抗體、肽、核酸分子、小分子還是其它根據(jù)本發(fā)明在藥用上有用的化合物，施用劑量都可以是免疫原性劑量，即足以在個(gè)體中引起免疫(尤其是抗體)應(yīng)答的劑量，或者是“預(yù)防效應(yīng)劑量”或“治療效應(yīng)劑量”(根據(jù)具體情況，但預(yù)防可以被認(rèn)為是治療)。預(yù)防效應(yīng)足以增強(qiáng)個(gè)體對(duì)隨后的HCV、E2HV多肽、或HVR1肽刺激或?qū)﹄S后的HCV感染的免疫應(yīng)答，優(yōu)選地在后一種情況中(HCV感染)足以完全或部分抵抗感染。最優(yōu)選地，該效應(yīng)足以防止個(gè)體由于隨后的HCV感染而出現(xiàn)一種或多種臨床癥狀和/或保護(hù)個(gè)體不得丙型肝炎。治療效應(yīng)足以增強(qiáng)個(gè)體對(duì)預(yù)先存在的HCV感染的免疫應(yīng)答，優(yōu)選地足以部分或全部抵抗該感染。最優(yōu)選地，該效應(yīng)足以減輕個(gè)體的一種或幾種臨床癥狀，和/或治愈丙型肝炎和/或減小病毒質(zhì)。真正的施用劑量以及施用的速率和時(shí)間過(guò)程取決于所治療對(duì)象的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療處方，如劑量的決定等等，是一般實(shí)踐者和其它醫(yī)生的責(zé)任，通常應(yīng)考慮待治療的病情、病人個(gè)體的情況、施用的部位、施用的方法和其它實(shí)踐者已知的因素。上述技術(shù)和步驟的例子可參見(jiàn)Remington’s PharmaceuticalSciences，16thedition，Osol，A.(ed)，1980。
本發(fā)明的一些方面進(jìn)而提供了治療方法，包括肽、肽混合物、抗體分子或抗體分子混合物、包括這樣的肽、肽混合物、抗體分子或抗體分子混合物的藥用組合物以及用這樣的肽、肽混合物、抗體分子或抗體分子混合物制造施用藥劑的用途，例如在一種制造藥劑或藥用組合物的方法中包括用特異的結(jié)合單位與制藥上可接受的賦形劑配制。
組合物可單獨(dú)施用或與其它療法聯(lián)合使用，根據(jù)待治療條件和替代或另加的療法的可用性，上述聯(lián)合使用可以是同時(shí)進(jìn)行或先后進(jìn)行。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了使用公開(kāi)的肽制造藥物以在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生能結(jié)合HCV HVR1表位的抗體。
本發(fā)明的另一方面提供了對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫使之抗HCV感染的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用肽或肽混合物。
本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)而提供了(被動(dòng))免疫哺乳動(dòng)物使之抗HCV的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗體混合物。
類(lèi)似地，本發(fā)明的一些方面進(jìn)而提供了治療已感染了HCV的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用根據(jù)本發(fā)明的肽、肽混合物、抗體或抗體混合物。
上述抗體可以是抗獨(dú)特型抗體。
現(xiàn)在進(jìn)一步闡明本發(fā)明的這些方面和實(shí)施方案并參照各種圖用實(shí)驗(yàn)舉例說(shuō)明。本發(fā)明更進(jìn)一步的方面和實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的人士是顯而易見(jiàn)的。
在圖中

圖1(A)示明從本研究所用的234種天然變株的HCV HVR1序列得到共有分布型?？蛑袩o(wú)陰影的殘基大約占80％觀察到的可變性。殘基按觀察到的頻率減小的順序從上到下排列。
圖1(2)示明噬菌體中表達(dá)的初始HVR1肽庫(kù)的成分。
圖2示明第一輪親和篩選得到的噬菌體庫(kù)與選用的血清中存在的抗體發(fā)生反應(yīng)的反應(yīng)性。對(duì)每個(gè)血清樣品(σ1、σ4R、σ3、σ2P、σ2R、σ3R、σN)測(cè)量了抗體識(shí)別的噬菌體庫(kù)(噬菌體庫(kù)1、4R、3、2P、2R、3R和N)、野生型噬菌體和未選中的庫(kù)(HVR1 lib)。測(cè)量了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(A405nm)。
圖3示明從HVR1庫(kù)選出的HCV特異的噬菌體作為與感染病人血清發(fā)生反應(yīng)的頻率的函數(shù)的分布。示明了經(jīng)過(guò)一輪(上圖)或兩輪(下圖)親和篩選富集的噬菌體與20種人類(lèi)血清(與篩選所用的血清不同)中抗體的結(jié)合。對(duì)每種血清測(cè)量了對(duì)選出的噬菌體和野生型噬菌體的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(A405nm)。與野生型噬菌體中觀察到的背景信號(hào)的差別超過(guò)3σmax(p＜0.003)的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)柱狀圖代表與所示數(shù)量的血清(橫坐標(biāo)，用總測(cè)試樣品數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示)反應(yīng)的噬菌體的數(shù)量(縱坐標(biāo))。
圖4示明經(jīng)常為HCV感染病人人類(lèi)血清中存在的抗體所識(shí)別的選擇的擬表位。選出的擬表位與人血清中抗體的結(jié)合用固定化噬菌體的ELISA測(cè)試。擬表位的名稱(chēng)在每列頂端標(biāo)明。對(duì)每種血清(在每行的左邊標(biāo)明)測(cè)試了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(A405nm)。結(jié)果用測(cè)試噬菌體表位的平均值與野生型噬菌體的值之間的差異表示。陽(yáng)性值用黑體表示。與在野生型噬菌體上觀察到的背景信號(hào)的差異大于3σmax(p＜0.003)時(shí)的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)擬表位的反應(yīng)性頻率以及從所有的四個(gè)擬表位觀察到的反應(yīng)性的總和在每個(gè)表的下端標(biāo)明。
圖4(A)示明選出的擬表位與一系列20種用于篩選步驟的HCV病人血清的反應(yīng)性。
圖4(B)示明選出的擬表位與另一系列源自HCV感染病毒血癥病人的血清的反應(yīng)性。
圖4(C)示明與來(lái)自非病毒血癥病人血清的反應(yīng)性。用可由商業(yè)途徑購(gòu)得的試劑盒檢測(cè)表明上述非病毒血癥病人抗HCV抗體陽(yáng)性。
圖5表明S-值與選出的擬表位的反應(yīng)性頻率之間的相關(guān)性。直線表示數(shù)據(jù)的線性最小方差擬合。相關(guān)性系數(shù)為0.79。
圖6示明選中的擬表位是對(duì)大量天然存在的HVR1的抗原性模擬物。用復(fù)制選中的擬表位(在圖的頂端標(biāo)明)序列的MAP免疫純化了源自HCV感染病人血清庫(kù)的抗體。用以MAP形式合成的有代表性的一系列HVR1序列(在左邊標(biāo)明)，通過(guò)ELISA測(cè)試了等量的免疫純化的抗體的反應(yīng)性。得到了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。當(dāng)同時(shí)滿(mǎn)足兩個(gè)條件時(shí)數(shù)值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1)數(shù)值與兩種非相關(guān)多肽上觀察到的背景信號(hào)的差別大于3σmax(p＜0.003)；(2)數(shù)值與用10種未感染個(gè)體血清與每個(gè)代表天然HVR1的肽反應(yīng)而觀察到的平均信號(hào)的差別大于3σmax(p＜0.003)?；疑虼砼c不相關(guān)MAP多肽上觀察到的信號(hào)的差別在0.15到0.5OD(405nm)之間；黑框代表值的差別大于0.5OD(405nm)。免疫純化的抗體每個(gè)庫(kù)的交叉反應(yīng)性水平在每列底部表示。
圖7示明擬表位序列和交叉反應(yīng)性之間的相關(guān)性。
圖7(A)示明分析中所用的擬表位的序列。
圖7(B)示明免疫純化的人抗體與一系列43種天然HVR1序列的交叉反應(yīng)性與擬表位S-值之間的相關(guān)性。直線表示數(shù)據(jù)的線性最小方差擬合。相關(guān)性系數(shù)為0.86。
圖8示明選出的擬表位是對(duì)大量天然存在的HVR1的免疫原性模擬物。通過(guò)對(duì)天然HVR1序列系列(在左邊標(biāo)明)的ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)試了源自用單一HVR1形式的擬表位(圖8(A))和擬表位混合物(圖8(B))免疫的小鼠的血清的反應(yīng)性。免疫的擬表位在第一行標(biāo)出。MIX1包括擬表位R9、F78、H1和D6；MIX2包含M122和G31肽；MIX3由所有的6種MAP組成。滴定度(定義為ELISA中達(dá)到最大信號(hào)的一半所需的均一多肽的稀釋倍數(shù))在第二行標(biāo)出。血清按1∶100稀釋。測(cè)定了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。與在兩種不相關(guān)多肽上觀察到的背景信號(hào)差異大于3σmax(p＜0.003)時(shí)，數(shù)值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；疑虼砼c不相關(guān)MAP多肽上觀察到的信號(hào)的差別在0.15到0.5OD(405nm)之間；黑框代表值的差別大于0.5OD(405nm)。每種血清的交叉反應(yīng)性在每列的底部標(biāo)明。
圖9示明例子6中描述的體內(nèi)核酸免疫實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)粒。
例1-設(shè)計(jì)與構(gòu)建模擬HVR1可變性的特定噬菌體庫(kù)利用從序列數(shù)據(jù)庫(kù)得到的234種獨(dú)特HVR1序列進(jìn)行多次序列比較(sequence alignment)以表征每個(gè)HCV E2糖蛋白的N末端27個(gè)位置的殘基組分的變化。利用此分析得到的序列模式(圖1A)可定義簡(jiǎn)并共有序列。在其它位置重復(fù)產(chǎn)生觀察到的天然可變性時(shí)設(shè)計(jì)了HVR1序列的合成庫(kù)以保留這些保守殘基。
通過(guò)選擇每個(gè)位置最經(jīng)常出現(xiàn)的殘基得到了大約占總序列可變性80％的“共有分布型”。當(dāng)一個(gè)給定位置出現(xiàn)類(lèi)似氨基酸時(shí)，每個(gè)位置僅選擇一個(gè)作為可變性的代表。優(yōu)選地，被選中的殘基能更有效地形成相互作用。例如天然庫(kù)中Ser和Thr都出現(xiàn)在位置5，但設(shè)計(jì)文庫(kù)時(shí)僅選擇Thr(圖1)。在一些情況下，未出現(xiàn)在共有序列中的殘基也被包括在文庫(kù)中以更好地反應(yīng)整體可變性。例如位置3中包括了Thr以反應(yīng)天然HVR1庫(kù)中Ser、Thr、Asn的存在。最終得到的共有分布型(圖18)的復(fù)雜性為9×107，與目前DNA克隆和轉(zhuǎn)化技術(shù)的實(shí)踐上限(大約108)非常接近。除了位置1外總是包含了天然庫(kù)中最經(jīng)常觀察到的氨基酸。雖然最經(jīng)常觀察到的氨基酸是Glu，但卻選擇了Gln和Thr。八個(gè)位置(2、6、7、16、19、20、23和26)保持恒定，因?yàn)樵?34種天然HVR1變型中它們具有高的局部序列保守性。值得注意的是幾乎沒(méi)有帶負(fù)電荷的殘基。例外的是位置1上選擇了Gln代表His、Glu、Asp、Gln、Asn。在80％的部分沒(méi)有酸性殘基存在。該分布型可描述為鑲嵌在含有保守元素的N末端和C末端之間的總體上更為可變的中心區(qū)域。
通過(guò)克隆了合成的簡(jiǎn)并寡核苷酸來(lái)構(gòu)建文庫(kù)，上述克隆是與用于M13表達(dá)的噬菌體質(zhì)粒載體中編碼主要外殼蛋白(pVIII)基因的5’端融合物(見(jiàn)材料與方法)?？梢缘玫酱蠹s2×108個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體。為了確證文庫(kù)(HVR1文庫(kù))質(zhì)量和復(fù)雜性，隨機(jī)選取了56個(gè)插入的獨(dú)立克隆進(jìn)行測(cè)序。此分析得到了以下結(jié)果(1)所有的克隆表達(dá)不同的序列；(2)63％的克隆含有全長(zhǎng)的插入序列而剩下的具有一些小缺失；(3)根據(jù)1998年3月15日的檢索，沒(méi)有一個(gè)編碼肽的克隆序列與已知病毒分離物的HVR1相對(duì)應(yīng)。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)可推論文庫(kù)具有與獨(dú)立轉(zhuǎn)化體數(shù)目相近的復(fù)雜性。
例2-鑒別與HCV病人血清經(jīng)常反應(yīng)的HVR1擬表位用于篩選的抗體庫(kù)越復(fù)雜越多變，富集為多種抗HVR1表位的不同抗體所識(shí)別的噬菌體的可能越大。源自長(zhǎng)期感染的病毒血癥病人的血清似乎符合上述條件，因?yàn)檫@些個(gè)體具有較長(zhǎng)的病毒存在史，在此時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了大量HCV變株并刺激免疫系統(tǒng)，這可能導(dǎo)致大量異源抗HVR1抗體種群的積累。
利用源自感染了五種不同基因型1a、1b、2a、2b、3a(Simmonds etal.，1993)病毒的慢性病人的八種血清對(duì)HVR1文庫(kù)進(jìn)行6次親和篩選(表1)。使用了源自未感染個(gè)體的血清作為對(duì)照。擴(kuò)增了所有七次篩選得到的噬菌體庫(kù)并測(cè)試了它們與ELISA中每種篩選血清的反應(yīng)性。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明為選擇抗體識(shí)別的噬菌體被大大富集了，證據(jù)是與未選擇的文庫(kù)相比反應(yīng)性升高了(圖2)。在大多數(shù)情況下，HCV血清富集的噬菌體庫(kù)與一種以上的病人血清反應(yīng)。文庫(kù)中為與HCV感染不相關(guān)的抗體所識(shí)別的肽也得到了富集。事實(shí)上由對(duì)照血清選出的噬菌體庫(kù)比未選擇的文庫(kù)具有更高的與該血清的反應(yīng)性(圖2)。但是病人血清使選擇趨向HCV相關(guān)的擬表位，因?yàn)橛媒】祩€(gè)體的血清未探測(cè)到對(duì)HCV血清富集的噬菌體庫(kù)的反應(yīng)性(圖2以及未列出的數(shù)據(jù))。
為了深入理解選出的擬表位與不同病人血清反應(yīng)性的頻率，從兩個(gè)庫(kù)(4R和2R，表1)中隨機(jī)選出了40個(gè)獨(dú)立克隆并用ELISA測(cè)定了它們與一系列20種源自HCV感染病人的血清的反應(yīng)性。上述血清與用于篩選的血清不同。同樣數(shù)量的源自未感染健康對(duì)照的血清被用于測(cè)試抗HCV抗體的特異性。最終24個(gè)克隆是HCV特異的。它們作為與它們病人血清反應(yīng)頻率的函數(shù)的分布見(jiàn)圖3(上圖)。從它們中鑒定了與一種以上的血清反應(yīng)的噬菌體；一些噬菌體被高達(dá)55％的測(cè)試血清識(shí)別。
為了進(jìn)一步改進(jìn)與多種不同的抗HVR1抗體反應(yīng)的擬表位的分離，用與第一輪不同的病人血清對(duì)富集的噬菌體庫(kù)進(jìn)行了第二輪親和篩選。用這種方法產(chǎn)生了9個(gè)新庫(kù)(表1)并用ELISA進(jìn)行了分析。與前一輪相同，觀察到了與選擇抗體反應(yīng)性的整體上升。并且所有的第二輪噬菌體庫(kù)與源自感染HCV病人的一系列血清的反應(yīng)比第一輪選出的噬菌體庫(kù)更為頻繁。上述血清與篩選中所用的血清不同。這反映了分離的肽具有更高的認(rèn)別頻率。比較了從第一輪親和篩選得到的噬菌體中隨機(jī)篩選后得到的克隆的HCV血清的反應(yīng)性(圖3，上圖)與這些利用第二種不同的血清重篩選后得到的噬菌體(圖3，下圖)與HCV血清的反應(yīng)性，結(jié)果證實(shí)了上述結(jié)論。進(jìn)行第二篩選步驟后不僅反應(yīng)頻率而且反應(yīng)性分布都發(fā)生了顯著變化。從第一輪篩選得到的噬菌體的識(shí)別較為分散，而通過(guò)兩輪分離得到的克隆的反應(yīng)頻率分布呈鐘型，平均值為60％(圖3，下圖)，這表明整個(gè)噬菌體群確實(shí)獲得了更多的合乎需要的結(jié)合特性。為了避免在生物學(xué)上優(yōu)選的噬菌體在擴(kuò)增中引入偏差，決定省略進(jìn)一步篩選周期。
通過(guò)篩選所有第二輪噬菌體庫(kù)鑒定總共171個(gè)與HCV血清專(zhuān)一反應(yīng)的克隆。它們作為與HCV血清認(rèn)別頻率的函數(shù)的分布圖類(lèi)似于圖3下圖，最好的克隆與80％待測(cè)樣品反應(yīng)。更為重要的是，選出擬表位反應(yīng)性的分布圖突出了另一相關(guān)特性。盡管它們?cè)贖CV血清識(shí)別的整體頻率上相似，不同的克隆顯示出特征反應(yīng)模式，結(jié)果是少數(shù)擬表位能鑒別所有待測(cè)血清中抗HVR1抗體的存在(圖4A)。
下一步是確證觀察到的HCV血清的高識(shí)別頻率否限于測(cè)試的病人群體還是反應(yīng)了選出的擬表位的內(nèi)在特性。為此用ELISA測(cè)試了另一組源自感染病人的血清，結(jié)果表明每個(gè)噬菌體個(gè)體的反應(yīng)頻率和血清的總平均值都未改變(圖4B)。
與長(zhǎng)期感染的病人相比，感染已消除的HCV感染個(gè)體最可能接觸病毒變株的數(shù)量較少，并且可能產(chǎn)生的變株特異的抗HVR1抗體譜較窄。源自后一種群的血清與重復(fù)產(chǎn)生天然分離物HVR1的合成肽的反應(yīng)要比源自長(zhǎng)期感染病毒血癥病人的血清稀少得多，此發(fā)現(xiàn)支持了上述推論(Scarselli et al.，1995)。因此，非病毒血癥病人的血清在檢測(cè)HVR1擬表位與不同抗HVR1抗體的交叉反應(yīng)性上是更好和更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。HCV血清陽(yáng)性但血液中病毒RNA經(jīng)重復(fù)測(cè)試均為陰性的個(gè)體的41種樣品被用于測(cè)試一些選出的擬表位。同樣，這些擬表位與這些血清中的多數(shù)發(fā)生反應(yīng)，但反應(yīng)頻率比和源自病毒血癥病人的血清低(比較圖4(A)、4(B)和4(C))。
這些數(shù)據(jù)意味著選出的擬表位具有與大量不同抗HVR1抗體交叉反應(yīng)的能力。
例3-測(cè)定選出的HVR1擬表位序列與其HCV血清反應(yīng)頻率之間的關(guān)系本發(fā)明者希望證實(shí)選出克隆的氨基酸序列是否與其反應(yīng)頻率相關(guān)。由于對(duì)序列的目測(cè)比較并未得到明顯的模式，所以決定分別分析反應(yīng)頻率最小的克隆與最大的克隆的序列模式。
定義為“弱”的24個(gè)克隆只與3種以下的血清發(fā)生反應(yīng)而定義為“強(qiáng)”的27個(gè)克隆與11種以上的血清發(fā)生反應(yīng)。弱和強(qiáng)克隆的各個(gè)位置的氨基酸頻率見(jiàn)以下的材料和方法部分和表II。
在強(qiáng)系列和弱系列克隆的一些位置被不同的氨基酸占據(jù)具有明顯的趨勢(shì)，這使得我們可以啟發(fā)性地定義材料與方法中所描述的以位置為基礎(chǔ)的評(píng)分系統(tǒng)(見(jiàn)下文)?？寺〉姆?jǐn)?shù)(S值)越高，其序列與強(qiáng)克隆的序列的越相近，并且與弱序列的差別越大。如圖5所示明，S值與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各個(gè)克隆的反應(yīng)頻率較為相關(guān)(相關(guān)性系數(shù)＝0.75)。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是S值的計(jì)算只用了“弱”和“強(qiáng)”克隆的序列(171個(gè)中的51個(gè))，但它與所有克隆的反應(yīng)頻率很好地相關(guān)。有趣的是，可僅用弱和強(qiáng)擬表位差別最大的6個(gè)位置(位置3、11、18、21、22、24)即可得到類(lèi)似的鑒定結(jié)果(相關(guān)性系數(shù)＝0.72)。
例4-HVR1擬表位在抗原性上模擬源自HCV分離物的大量HVR1變型本發(fā)明者開(kāi)始測(cè)量識(shí)別擬表位的人抗體與代表天然存在的HVR1的序列的交叉反應(yīng)性。為此目的擬表位被用作免疫吸附劑以從感染病人血清中的大量抗HVR1中純化特定抗體。擬表位R9、F78、M122、R6、B14、G31、H1和D6(圖7)被選用于此實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼈儗儆谂cHCV血清具有最高反應(yīng)性頻率的那些擬表位。與平均的“好”擬表位相比為明顯低得多的百分比的HCV血清認(rèn)別的百分比擬表位N5也被選用(反應(yīng)頻率分別為60-80％和35％)。
盡管有報(bào)道顯示一些淋巴細(xì)胞系支持HCV的限制性復(fù)制(Shimizu etal.，1992)，這些系統(tǒng)不適于病毒增殖和細(xì)致研究抗HVR1抗體的交叉反應(yīng)性。因此測(cè)定了免疫純化的抗體與一系列復(fù)制了天然HVR1變型的合成多肽的交叉反應(yīng)性。上述HVR1變型幾乎覆蓋了所有觀察到的序列可變性。
至此，對(duì)234種用于構(gòu)建本文庫(kù)的經(jīng)過(guò)序列對(duì)比的同一系列天然HVR1序列進(jìn)行了多維簇分析(Casari et al.，1995)。從這些序列中選擇并合成了(見(jiàn)下文的材料與方法)43個(gè)幾乎均一地分布在HVR1“序列空間”的多抗原性肽段(MAP；Tam，J.P，1988；Pessi et al.，1990)。源自感染病人含八種血清并與整個(gè)系列的43種MAP集體反應(yīng)的血清庫(kù)被用作抗體源。免疫純化的抗體與用于純化的擬表位的反應(yīng)性與總血清相同。與此相反，純化后不再保留有與重組HCV核心抗原或者與商業(yè)試劑盒中的抗原的反應(yīng)性，這證實(shí)了純化的效率和特異性。
所有免疫純化的抗體與大量天然HVR1序列發(fā)生反應(yīng)，其中擬表位R9產(chǎn)生的抗體與79％的天然HVR1交叉反應(yīng)(圖6)。由于大多數(shù)免疫純化的抗體都表現(xiàn)出與天然序列的一些不重疊的反應(yīng)性，加入僅由三種不同的擬表位(R9、F78和M122，圖6)純化的抗體的個(gè)體貢獻(xiàn)后可達(dá)到甚至更高的整體交叉反應(yīng)性(88％)。從這些數(shù)據(jù)可以得出以下結(jié)論有限的一系列HVR1擬表位可以在抗原性上模擬大量天然HCV HVR1變型。
由具有較高S值的擬表位免疫純化得到的從而具有更高反應(yīng)頻率的抗體也表現(xiàn)出更高的交叉反應(yīng)性。如圖7B所示，使用了八種擬表位，序列相關(guān)的S值與相應(yīng)抗體的交叉反應(yīng)性之間的關(guān)聯(lián)很好(r＝0.86，圖7B)。
例5-HVR1擬表位誘導(dǎo)產(chǎn)生識(shí)別多種天然HVR1變型的抗體在本工作之前的一個(gè)問(wèn)題是得到能誘導(dǎo)出與最大數(shù)量的HCV HVR1天然變型交叉反應(yīng)的抗體的免疫原。通過(guò)將純化的整個(gè)噬菌體和位于所選出的初始環(huán)境之外的MAP注射入小鼠中研究了一些最好的HVR1擬表位(R9、F78、M122、G31、H1和D6)的免疫原性。
結(jié)果表明MAP是更有效的免疫原，這可能是由于各噬菌體上HVR1肽表達(dá)不夠充分，如質(zhì)譜分析所表明(小于總pVIII含量的1％)，的緣故。滴定度不同表明擬表位之間在免疫效率上具有差異。用于免疫的同一多肽的ELISA測(cè)量表明F78能誘導(dǎo)出滴定度大于1/100,00的抗體(圖8A)。然后利用一系列43種復(fù)制來(lái)自天然分離物的HCV序列的MAP通過(guò)ELISA測(cè)試了抗HVR1擬表位血清識(shí)別異源HVR1變型的能力。大多數(shù)MAP都為這些免疫血清所識(shí)別(圖8A)，而在不相關(guān)的對(duì)照肽上沒(méi)有觀察到反應(yīng)性。
擬表位免疫小鼠的血清的交叉反應(yīng)性與用同種擬表位免疫純化得到的人類(lèi)抗體的交叉反應(yīng)性并不對(duì)應(yīng)。然而擬表位N5在兩種測(cè)試類(lèi)型中都表現(xiàn)出明顯較低的反應(yīng)性，這些結(jié)果表明該抗原是相當(dāng)?shù)托У拿庖咴?，該擬表位導(dǎo)致的抗HVR1應(yīng)答只能識(shí)別少量天然HVR1序列(圖8A)。
免疫血清的交叉反應(yīng)程度通常反映了MAP個(gè)體的免疫原性。大多數(shù)情況下高滴定度對(duì)應(yīng)高交叉反應(yīng)性(圖8A)。但是僅憑滴定度并不總是能解釋所有交叉反應(yīng)性以及擬表位誘導(dǎo)的血清表現(xiàn)出的反應(yīng)模式上的差異，這在抗G31血清的情況下表現(xiàn)得尤為明顯。G31抗血清的滴定度比F78抗血清低，但它與更多的天然HVR1肽發(fā)生反應(yīng)。類(lèi)似地，D6抗血清的滴定度是R9抗血清的三倍但交叉反應(yīng)性與之處于同一水平(圖8A)。
每種抗血清表現(xiàn)出的反應(yīng)性模式僅與其它抗血清部分重疊，并且在一些情況下觀察到了獨(dú)特的反應(yīng)性。誘導(dǎo)血清的這種性質(zhì)的結(jié)果是將所有的反應(yīng)性相加后幾乎所有的天然HVR1多肽都能被識(shí)別(91％，圖8A)。如果用擬表位混合物進(jìn)行一次免疫也能類(lèi)似地得到交叉反應(yīng)性的提高，那么此發(fā)現(xiàn)是朝向得到廣反應(yīng)譜抗體的目標(biāo)前進(jìn)了一大步。因此用擬表位混合物對(duì)三組Balb/c小鼠進(jìn)行免疫?；旌衔?含有擬表位R9、F78、H1和D6；混合物2由擬表位M122和G31組成；而混合物3含有所有的六種擬表位。所有的這三種混合物都是免疫原性的并且誘導(dǎo)具有高交叉反應(yīng)性的抗血清(圖8B)。與包含在混合物中的每種擬表位誘導(dǎo)的抗血清的反應(yīng)性相加得到的交叉反應(yīng)性相比，所有的三種抗血清的每一種表現(xiàn)出相同或更高的交叉反應(yīng)性(混合物184％對(duì)84％；混合物284％對(duì)81％；混合物395％對(duì)91％，圖8B)。這些血清的滴定度雖然很高，但并不比單獨(dú)的MAP得到的血清的滴定度更高。因此得到以下結(jié)論誘導(dǎo)高交叉反應(yīng)性應(yīng)答的能力并不僅僅是免疫效率的結(jié)果。
材料與方法人血清用第二代的HCV ELISA檢測(cè)系統(tǒng)(Ortho-HCV ELISA，OrthoDiagnostic Systems，Bersee，Belgium)和第一代的點(diǎn)印跡免疫分析(RIBA-HCV test，Chiron Co.，Emeryville，CA)檢測(cè)了源自感染HCV個(gè)體和健康個(gè)體的人血清中抗HCV抗體的存在。如先前描述(Silini etal.，1995)用位于病毒基因組5’非編碼區(qū)的保守引物和從100μl血清提取得到的總RNA作為模板進(jìn)行嵌套反轉(zhuǎn)錄PCR探測(cè)了HCV RNA的存在。
HVR1文庫(kù)的建立為了將上文參照?qǐng)D1B描述的共有分布型反翻譯成相應(yīng)的核苷酸序列，利用E.coli密碼子使用表選擇了在高表達(dá)基因中最經(jīng)常出現(xiàn)的密碼子。為了便于將該文庫(kù)插入噬菌體質(zhì)粒載體，在81bp片段的5’端和3’端分別加入了含有PacI和NotI限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的兩個(gè)另外的恒定序列，分別得到了總長(zhǎng)116bp的片段。計(jì)算機(jī)輔助序列分析證實(shí)了共有分布型反翻譯得到的序列中不含有NotI和PacI識(shí)別位點(diǎn)。在化學(xué)合成中應(yīng)用了以密碼子為基礎(chǔ)的“split-and-pool”方法(Cormack etal.，1993)以保持文庫(kù)組成和復(fù)雜度處于需要的水平。用與側(cè)翼恒定序列互補(bǔ)的引物在9600 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Cetus，F(xiàn)oster City CA)上對(duì)116bp的寡聚核苷酸進(jìn)行了擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用PacI和NotI消化后用凝膠電泳純化?；厥盏玫降腄NA片段被克隆到pel8PN噬菌體質(zhì)粒載體(pc89的衍生物；Felici et al.，1991)的PacI和NotI位點(diǎn)之間。上述位點(diǎn)位于pelB分泌前導(dǎo)序列的下游和VIII全基因編碼序列的上游。重組噬菌體質(zhì)粒用電穿孔轉(zhuǎn)化入DH10B感受態(tài)細(xì)胞中。由于DH10B細(xì)胞不能為絲狀噬菌體所感染，所以不能進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選，所以收集轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并提取質(zhì)粒DNA。這些DNA被用于電穿孔轉(zhuǎn)化XL1-藍(lán)感受態(tài)細(xì)胞。氨芐青霉素抗性的菌落被從平板上刮下并懸浮于LB/100μg氨芐青霉素/ml與10％(v/v)甘油中。在O.D.600nm為0.05時(shí)該細(xì)菌懸浮液的一部分被用于接種6升LB/100μg氨芐青霉素/ml并劇烈搖晃培養(yǎng)至O.D.600nm達(dá)到0.25。然后用M13K07輔助噬菌體對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行超級(jí)感染(superinfect)并且再培養(yǎng)5小時(shí)以在上清中得到噬菌體顆粒。如所描述，噬菌體用聚乙二醇沉淀兩次并用CsCl平衡離心純化(Felici et al.，1991)。DNA測(cè)序按文獻(xiàn)描述用Applied Biosystem373 DNA測(cè)序儀進(jìn)行(Bartoli et al.，1996)。
文庫(kù)親和篩選用0.5μg/ml抗人(Fc片段特異)多克隆抗體(Immunopure goatanti-human IgG Fc-specific；Pierce，Rockford，IL)50mM NaHCO3 pH9.6在4℃過(guò)夜包被ELISA多孔板(Nunc Maxisorp，Roskilde，Denmark)。上述板用PBS/0.1％ Tween 20(洗滌液)洗滌后與100μl/孔封閉液(5％脫脂無(wú)水牛奶，PBS/0.05％ Tween 20)37℃保溫1小時(shí)。每孔加入1μl用PBS/0.1％ BSA 1∶100稀釋的人血清并4℃保溫過(guò)夜。洗澡之后，向每個(gè)孔中加入用PBS/0.1％ Tween 20，0.01％ BSA稀釋的1012個(gè)U.V.killedM13K07顆粒，并且在4℃保溫4小時(shí)。此預(yù)保溫之后，按1012顆粒/孔加入HVR1文庫(kù)并4℃保溫過(guò)夜。未結(jié)合的噬菌體被除去并進(jìn)行幾次洗滌。結(jié)合的噬菌體用200μl洗脫液(0.1MHCl用甘氨酸調(diào)pH至2.5，1mg/mlBSA)洗脫然后用2M Tris-HCl pH9中和。洗脫的噬菌體通過(guò)感染XL1-藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行滴定，含有有效插入序列的克隆的百分比通過(guò)將感染的細(xì)菌涂布到X-gal/IPTG指示平板上確定(Felice et al.，1991)。在擴(kuò)增之后(見(jiàn)上文)富集的噬菌體以相同的步驟進(jìn)行第二輪親和篩選。
擬表位的序列分析和S值的確定總共193個(gè)選出的克隆中171個(gè)沒(méi)有點(diǎn)突變(相對(duì)最初的文庫(kù)設(shè)計(jì)而言)或缺失，并被分成三組24個(gè)弱克隆(與20種測(cè)試血清中的3種以下反應(yīng))，27個(gè)強(qiáng)克隆(與至少12種血清反應(yīng))和中等克隆(其它克隆)。
對(duì)位于27單體氨基酸序列的位置i的每個(gè)氨基酸我們稱(chēng)Fs(i，aa)和Fw(i，aa)分別為觀察到的同一氨基酸在強(qiáng)克隆組或弱克隆組的i位置出現(xiàn)的頻率。
頻率值見(jiàn)表II。
S值(i)被定義為Fs(i，aa)和Fw(i，aa)平方根之間的差異。序列的所有27單體序列的S值(i)的總和為序列的S值。實(shí)踐中S值＝∑i(Fs(i，aa)1/2-Fw(i，aa)1/2)其中aa是所計(jì)算S值的序列處于位置i的觀察到的氨基酸。使用了頻率的平方根以放大差異。對(duì)于發(fā)生了點(diǎn)突變或缺失的克隆，在計(jì)算S值時(shí)相應(yīng)位置被省略。
選擇天然HVR1序列的代表源自HCV BK株的NS1 HVR1序列(殘基384-411)，包括蛋白序列和核酸序列，被用于檢索不同的數(shù)據(jù)庫(kù)(1995年12月13日)。蛋白序列搜索了SwissProt、Pir和Genpept，后者代表源自Genbank和EMBL的開(kāi)放閱讀框；核酸序列搜索了EMBL、Genbank和EST。從匹配的序列中除去重復(fù)的和不完全的序列，得到了由234種天然HVR1序列組成的一組獨(dú)特的序列。
用主要成分分析選出了均一地分步在整個(gè)組中的40個(gè)序列。首先用Sequencespace(Casari et al.，1995)計(jì)算了最初的六個(gè)本征值，利用這些本征值成對(duì)計(jì)算了234個(gè)序列之間的距離。逐步除去與相鄰序列之間距離最小的序列，最后只剩下40種序列。沿著所有可能的本征載體(Eigenvector)對(duì)的二維映射表明該系列的40個(gè)序列均一分布并不成簇。
序列和檢索號(hào)如下1 GenbankD12967 QTRTVGGQMGHGVRGLTSLFSAGSARN bp 46-bp 1262 PIRPC1193 STHVTGALQGRAAYGITSFLSHGPSQK aa 16-aa 423 GenbankD00574 HTRVTGGVQGHVTSTLTSLFRPGASQK bp1240-bp13204 GenbankL19383 ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGAKQN bp 46-bp 1265 GenbankM62381 ETHVTGGSAGRTTAGLVGLLTPGAKQN bp1426-bp15066 GenbankU24616 ATYTTGGSAAKTAHRLASFFTVGPKQD bp 22-bp 1027 PIRC48776 DTHVVGGATERTAYSLTGLFTAGPKQN aa 13-aa 398 GenbankU24607 GTTCQGGVYARGAGGIASLFSVGANQK bp 22-bp 1029 PIRD48766 RTLSFGGLPGHTTHGFASLSAPGAKQN aa 13-aa 3910 GenbankX60573 RTILMAGRQAEVTQSFPGLFSLAPSQK bp 46-bp 12611 GenbankD43650 NTHAMGGVVARSAYRITSFLSPGAAQN bp 1-bp 8112 PIRPQ0835 STRITGGSMARDVYRFTGFFARGPSQN aa 6-aa 3213*GenbankS73387 GTHTIGGSQAQQANRFVSMFSRGPSQK aa 190-aa 21614 GenbankD10934 NTYVTGGAAARGASGITSLFSRGPSQK bp1491-bp157115 GenbankD31972 NTYASGGAVGHQTASFVRLLAPGPQQN bp1409-bp148916 GenbankU14231 ETHTTGGEAARTTLGIASLFTSGANQK bp 103-bp 18317 GenbankU24602 ETHTTGGSAARATFGIANFFTPGAKQN bp 22-bp 10218 GenbankL19380 ETYTSGGSAAHTTSGFVSFFSPGAKQN bp 46-bp 12619 GenbankM74888 GTTRVGGAAARTTSSFASLLTHGPSQN bp1147-bp122720 GenbankL12354 NTHTVGAAASRSTAGLTSLFSIGRSQK bp1468-bp154821 GenbankX79672 NTRVTGGVQSRTTGTFVGLFTPGPSQR bp 1-bp 81
22 PIRA48776 NTHVSGGRVGHTTRSLTSFFTPGPQQK aa 13-aa 3923 GenbankD12952 STRVSGGQQGRAAHSLTSLFTLGASQN bp 46-bp 12624 GenbankD16566 STRITAQAEGRGASTLTSLFTSGASQK bp 8-bp 8825 GenbankM84754 STIVSGGTVARTTHSLASLFTQGASQK bp1491-bp157126 GenbankD14853 ETRVTGGAAGHTAFGFASFLAPGAKQK bp1491-bp157127 GenbankS24080 NTYVTGGSAGRAVAGFAGLLQPGAKQN bp 46-bp 12628 GenbankS35631 ETHSVGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQN bp 580-bp 66029 GenbankS62395 ETHVTGGSAASTTSTLTKLFMPGASQN bp 43-bp 12330 GenbankS70291 QTRTVGGANARNTYGLTTLFTTGPKQN bp 1-bp 8131 GenbankD88472 GTTTVGSAVSSTTYRFAGMFSQGAQQN bp1485-bp156532 GenbankD10687 NTHTVGGTEGFATQRLTSLFALGPSQK bp1180-bp126033 GenbankD43651 NTHVTGGVVARNAYRITTFLNPGPAQN bp 39-bp 11934 GenbankD14305 HTYTTGGTASRHTQAFAGLFDIGPQQK bp1427-bp150735 GenbankX60590 KTHVTGMVAGKNAHTLSSIFTSGPSQN bp 46-bp 12636 GenbankD30613 GTHVTGGKVAYTTQGFTSFFSRGPSQK bp1491-bp157137 GenbankX53131 ETYTSGGNAGHTMTGIVRFFAPGPKQN bp 802-bp 88238 GenbankU24619 STYSMGGAAAHNARGLTSLFSSGASQR bp 22-bp 10239 GenbankM62382 ETHVTGGSAGRSVLGIASFLTRGPKQN bp1426-bp150640 GenbankD88474 ETYIIGAATGRTTAGLTSLFSSGSQQN bp1488-bp1568*序列13對(duì)應(yīng)于Genbank entry s73387的CDS feature所報(bào)道的翻譯的氨基酸序列(aa190-aa216)。
還另外合成了三種序列作為MAP兩個(gè)序列源自HCV家族的H77接種體(Faci et al.，1994中的圖2)41(H77-1) ETHVTGGNAGRTTAGLVGLLTPGAKQN bp 1-bp 8142(H79)ETHVTGGSAGHTAAGIASFFAPGPKQN bp 1-bp 81另一序列源自免疫反應(yīng)已鑒定的病人的主要分離物(Scarselli etal.，1995)；
43 Genbankx79669 NTRVTGGVQSHTTRGFVGMFSLGPSQR bp 1-bp81噬菌體制備與ELISA如文獻(xiàn)先前所描述(Folgori et al.，1994)，噬菌體上清制備自XL-1藍(lán)感染細(xì)胞。ELISA用每孔25μl噬菌體上清根據(jù)Dente et al.，(1994)的方法進(jìn)行。如果沒(méi)有特別說(shuō)明，血清按1∶100稀釋并加入堿性磷酸酶標(biāo)記的種屬特異的抗IgG(Fc特異)二抗(Sigma A-9544；用ELISA封閉液1∶5000稀釋)顯示。結(jié)果用自動(dòng)化的ELISA讀數(shù)器(LabsystemsMultiskan Bichromatic，Helsinki，F(xiàn)inland)記錄O.D.405nm和O.D.620nm之間的差異。
噬菌體庫(kù)的ELISA用相同量的(1010氨芐青霉素轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)CsCl純化之后的擴(kuò)增噬菌體按同樣的方法進(jìn)行(見(jiàn)上文)。
100μl溶于包被液(50mM NaHCO3，pH9.6)終濃度為10mg/ml的代表天然HVR1序列的MAP被用于包被ELISA板(Nunc Maxisorp，Roskilde，Denmark)。封閉自由結(jié)合位點(diǎn)之后加入100μl/孔血清或親和純化的抗體。鼠和兔血清的測(cè)量以封閉液1∶100最終稀釋?zhuān)挥H和純化抗體的測(cè)量在150ng/ml最終濃度下進(jìn)行。平板4℃保溫過(guò)夜。洗滌后加入100μl/孔堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(山羊抗鼠IgG Sigma A-74341∶2000倍稀釋?zhuān)簧窖蚩雇肐gG Sigma A-8025 1∶5000倍稀釋?zhuān)簧窖蚩谷薎gG Sigma A-9544 1∶5000倍稀釋)并在室溫溫育一小時(shí)。板洗滌后堿性磷酸酶如上文所描述揭示結(jié)果。
從人血清中親和純化抗體使用了重復(fù)產(chǎn)生不同擬表位序列多抗原性肽，因?yàn)楹鲜鲭脑贓LISA中表現(xiàn)出的HCV結(jié)合譜與噬菌體相同，但在抗體的親和篩選上卻更為有效。以1g干Sepharose比1mg溶于交聯(lián)緩沖液(0.1M NaHCO3pH8/0.5MNaCl)的MAP的比例將感興趣的MAP偶聯(lián)到激活的CH Sepharose4B柱(pharmacia Biotech 17-0490-01)上。交聯(lián)之后用0.1M Tris-HCl，pH8封閉自由氨基。含8種HCV血清的血清庫(kù)的樣品按1∶5用交聯(lián)緩沖液稀釋后上樣。在室溫吸附用PBS充分洗滌后結(jié)合的抗體用補(bǔ)充了終濃度10μg/ml的BSA的0.1M甘氨酸-HCl pH2.7洗脫下來(lái)。然后立即用2M Tris pH9.4中和。洗脫下的抗體的濃度用標(biāo)準(zhǔn)人IgG(Sigma I-2511)通過(guò)ELISA測(cè)定。使用用于純化的擬表位(MAP形式以及噬菌體形式)和作為對(duì)照的HCV不相關(guān)的MAP通過(guò)ELISA確認(rèn)親和純化的抗體的反應(yīng)性。利用洗脫的抗體和細(xì)菌表達(dá)的重組HCV核心蛋白(Prezzi et al.，1996)以及第二代的HCV ELISA檢測(cè)(Ortho Diagnostic Systems，BerseeBelgium)通過(guò)ELISA進(jìn)一步證實(shí)了純化的特異性。從血清庫(kù)的1ml標(biāo)準(zhǔn)量的血清中各親和純化得到的免疫球蛋白的總量是可比的，大約在0.8到1.5μg之間。每次ELISA中測(cè)試MAP的濃度都調(diào)成150ng/ml。
動(dòng)物免疫免疫用噬菌體制備自XL1-藍(lán)感染細(xì)胞并經(jīng)CsCl純化，如上文所述(Felici et al.，1991)。在0、21和42天對(duì)三至五星期大的Balb/c雌性小鼠(Charles River，Como，Italy)腹膜內(nèi)注射100μl抗原溶液進(jìn)行免疫，并于52天(三次)和148天(四次)放血。注射的噬菌體為0.9％ NaCl懸浮液，濃度為約0.3mg/ml(2.5×1013噬菌體顆粒/ml)，沒(méi)有另加佐劑。
對(duì)于肽免疫，MAP溶于PBS，總的終濃度為400μg/ml并用完全Freund佐劑(第一次注射)或不完全Freund佐劑(加強(qiáng)注射)1∶2稀釋后注射。在0、3和6星期對(duì)四至七星期大的Balb/c雌性小鼠(Charles River，Como，Italy)腹膜內(nèi)注射100μl抗原溶液進(jìn)行免疫并于0天(放血前)和其它每次注射10天后放血。當(dāng)用一種以上肽進(jìn)行免疫時(shí)，將等量的每種擬表位混合并使用100μl 400μg/ml的溶液。
例6-肽和E2重組蛋白的免疫原性特性。體內(nèi)DNA免疫研究了一些選出的HVR1擬表位或其與E2蛋白外域N末端融合蛋白的免疫原性特性。
hcv/E2肽的鑒定通常用HCV多蛋白從384至809位氨基酸的肽段。HVR1區(qū)域通常認(rèn)為是從384位至410位的氨基酸。下文例子中ΔE2鑒定肽相應(yīng)于HCV多蛋白的aa411至aa683。
重組質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建了三種類(lèi)型的質(zhì)粒，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖9(i)pΔE2-用于HVR1和C-末端疏水區(qū)缺失的E2蛋白片段(HCVstain N，Nishihara et al.，Gene；1993；129pp207-214；從HCV多蛋白的aa411到aa683)的合成。
(ii) 第二種質(zhì)粒pF78表達(dá)HVR1擬表位中的一種。
(iii) 構(gòu)建的一系列11種構(gòu)建物(pMim.E2)，在質(zhì)粒pΔE2中編碼11種不同的HVR1擬表位的DNA序列融合于ΔE2編碼序列的5’端。
所有的重組體都克隆在組織血纖維蛋白溶酶原激活因子(TPA)信號(hào)序列框的下游以加強(qiáng)抗原的分泌。
以含載體的E2 N株(Nishihara et al.；Gene；1993；129 pp207-214)作為PCR模板克隆了ΔE2基因(編碼從aa411到aa683的肽段)。以合成的寡聚核苷酸(oligo fwd＝GCGAGATCTTAATTAACGATATCCAGCTTATAAAColigo rev＝TCCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGGLAG)為引物得到PCR片段。
利用此引物，得到的PCR產(chǎn)物除了ΔE2基因、5’端的BglII、PacI和EcoRV限制性酶切位點(diǎn)外還包括編碼六個(gè)組氨酸殘基的序列(His標(biāo)記)以及TAA終止密碼子和隨后的3’端BamHI限制性酶切位點(diǎn)。此PCR產(chǎn)物然后用BglII和BamHI消化并連接到V1JnsTPA載體(J.J.Donnellyet al.The Journal of Infect.Di seases；1996；713；pp314-320)的BglII位點(diǎn)處的TPA前導(dǎo)框以得到質(zhì)粒V1JnsTPA-ΔE2(圖9中稱(chēng)為pΔE2)。
HVR1擬表位序列被亞克隆到pΔE2的ΔE2基因的5’端。HVR1片段直接由PCR擴(kuò)增自選出的噬菌體上清。5’引物含有PacI限制性位點(diǎn)并與HVR1擬表位序列的恒定部分的5’序列(GGCGGCCGTTTAATTAAC)互補(bǔ)；3’引物與最后的15個(gè)核苷酸互補(bǔ)并根據(jù)待克隆的擬表位序列而不盡相同。PCR-擴(kuò)增的片段被PacI消化并連接到pΔE2質(zhì)粒中。這樣就得到了總共11種pMimoE2質(zhì)粒(圖9)。
進(jìn)而通過(guò)對(duì)F78序列的PCR擴(kuò)增構(gòu)建F78(圖9)質(zhì)粒(oligo fwd＝GCGAGATCTTAATTAACCAGACCCATACCACC；oligorev＝TCCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGTTTCGCGCC)并克隆到V1JnsTPA載體的BglII位點(diǎn)。得到了pF78(圖9)質(zhì)粒。大批量DNA的制備用Qiagen 2500-Tip columns按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行(Qiagen，Hilden，Germeny)。
擬表位/E2重組蛋白特性的鑒定在哺乳動(dòng)物中系體中通過(guò)對(duì)293細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染研究了pF78、pΔE2和pMimoE2質(zhì)粒使重組蛋白表達(dá)的能力。用識(shí)別HVR1下游表位的抗E2單克隆抗體(mAb-185)探測(cè)時(shí)，pΔE2和pMimoE2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)且特異的染色。mF78的表達(dá)也為轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)所證明。上述免疫細(xì)胞化學(xué)用的是以復(fù)制擬表位F78氨基酸序列的MAP免疫的小鼠血清。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的全細(xì)胞抽提物的ELISA確認(rèn)了以上結(jié)果。轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)物的上清的ELISA表明所有的重組蛋白也大量分泌到培養(yǎng)基中。
細(xì)胞內(nèi)的和分泌的蛋白在SDS PAGE上都呈現(xiàn)為一簇遷移較慢的帶，這表明它們都有不均一的糖基化。細(xì)胞外蛋白級(jí)分呈現(xiàn)較高的分子量，這意味著不同程度的糖基化并證實(shí)了蛋白是活性分泌的而不僅僅是細(xì)胞裂解釋放的。在兩種情況下，內(nèi)切糖苷酶處理都隨遷移率升高到從氨基酸組合物估計(jì)的遷移率。
所有的重組擬表位/E2融合蛋白及ΔE2突變蛋白都為兩種不同的構(gòu)象敏感的單克隆抗體所有效識(shí)別。并且各種克隆的細(xì)胞部分或分泌部分的非還原SDS PAGE的Western blot結(jié)果表明沒(méi)有產(chǎn)生通過(guò)半胱氨酸橋連接的多聚體聚合物。對(duì)小鼠的棒狀肌肉瘤(rabdomyosarcoma)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染得到類(lèi)似的結(jié)果，這表明對(duì)小鼠肌肉細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)染可得到有效的表達(dá)。
質(zhì)粒DNA免疫免疫用4星期大的雌性Balb/c小鼠(Charles River，Como，Italy)。完全麻醉的小鼠接受了100μg溶于100μl鹽溶液(PBS)的質(zhì)粒DNA。用胰島素注射器(B-D，U-100 28 G1/2微細(xì)針頭(microfine needle))在四頭肌的兩邊注入59微升DNA。小鼠進(jìn)行三或四次注射，每次間隔3個(gè)星期，并在每次注射后兩個(gè)星期放血。血清進(jìn)行抗體滴定度和交叉反應(yīng)性分析。
αΔE2和αHVR1抗體的血清學(xué)用溶于50mM NaHCO3 pH9.6的GNA(Sigma L8275)1μg/孔包被ELISA96孔板(Immunoplate Maxisorp；Nunc，Roskilde，Denmark)并4℃保溫過(guò)夜。板洗滌(PBS/0.1％Tween 20)后與250μl/孔封閉液(2％BSA，1×PBS，0.1％ Tween 20)在37℃保溫1小時(shí)。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞產(chǎn)生F78E2和ΔE2蛋白。ELISA中用10×濃縮的上清作為目標(biāo)抗原。在GNA包被的板上每孔加入飽和量的溶于封閉液的蛋白在室溫溫育3小時(shí)。連續(xù)稀釋的免疫血清(從1∶100到1∶72900)與1μl/孔的源自封閉液中模擬轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的10×上清室溫預(yù)保溫2小時(shí)。血清溫育在4℃進(jìn)行。與二抗(α小鼠IgG Fc-特異AP標(biāo)記，Sigma 7434，封閉液1∶2000稀釋)室溫溫育1小時(shí)后，板在37℃顯色30min。
用MAP形式的同源肽序列通過(guò)ELISA滴定了抗HVR1擬表位抗體(血清從1∶100到1∶72900稀釋)在所有的情況下血清滴定度定義為吸收值為0.3O.D.時(shí)的最高血清稀釋倍數(shù)(大約為背景值的6倍)。
交叉反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用材料與方法中描述的一組43種代表性MAP測(cè)定了血清對(duì)不同HVR1天然變型的交叉反應(yīng)性。
肌肉注射編碼擬表位的構(gòu)建載體誘導(dǎo)出強(qiáng)體液應(yīng)答質(zhì)粒pΔE2和pF78E2被用于建立誘導(dǎo)體液應(yīng)答的最佳條件。用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞表達(dá)的ΔE2蛋白通過(guò)ELISA監(jiān)測(cè)了抗HVR1外表位抗體的誘導(dǎo)。免疫了Balb/C和C57black小鼠以測(cè)試編碼擬表位的構(gòu)建載體在不同的遺傳環(huán)境的免疫原性。注射的次數(shù)(1至4次)和注射的DNA的量直接與抗體應(yīng)答的強(qiáng)度相關(guān)。每只小鼠用50或100微克pΔE2 DNA，分三次注射，間隔3星期，這樣在3次注射后得到對(duì)ΔE2蛋白的抗體滴定度最高。進(jìn)一步的注射并不提高滴定度。在用pF78E2質(zhì)粒免疫小鼠后觀察到了類(lèi)似的誘導(dǎo)抗ΔE2蛋白抗體的時(shí)間過(guò)程。用MAPF78通過(guò)ELISA測(cè)試了后一組動(dòng)物的抗HVR1抗體的誘導(dǎo)。在最佳免疫條件下進(jìn)行研究的兩株小鼠之間并無(wú)明顯的不同。但C57black小鼠的平均應(yīng)答更好。
用僅表達(dá)F78 HVR1擬表位(pF78)的構(gòu)建載體免疫的小鼠的抗血清也能產(chǎn)生特異性反應(yīng)，但滴定度要比源自用相關(guān)的pF78E2構(gòu)建載體得到的血清低得多。幾個(gè)因素，如表達(dá)水平、重組產(chǎn)物的折疊、強(qiáng)T輔助表位的存在，可能解釋融合構(gòu)建載體得到的應(yīng)答比單一F78擬表位載體得到的高這一現(xiàn)象。
抗擬表位血清與不同的天然HVR1變型交叉反應(yīng)在ELISA中利用復(fù)制天然分離物HVR1序列的一系列43種合成肽段作為包被抗原(見(jiàn)材料與方法)測(cè)試了在以DNA免疫為基礎(chǔ)的擬表位/E2融合蛋白誘導(dǎo)交叉免疫應(yīng)答的能力。
表III列出了用不同的各個(gè)質(zhì)粒和質(zhì)?；旌衔锩庖連alb/c小鼠(上圖)和C57Black小鼠(下圖)后得到的平均滴定度。交叉反應(yīng)性用43種測(cè)試多肽中表現(xiàn)陽(yáng)性的數(shù)目表示。
盡管在相應(yīng)的免疫血清中存在大量針對(duì)具有同源擬表位序列的肽的特異性抗體，pB14E2和pB24E2質(zhì)粒并不誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答(表III)。所有的其它構(gòu)建載體引起與一些天然HVR1序列發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清，其中抗F78血清能識(shí)別高達(dá)28％的測(cè)試多肽(表III)。
免疫血清的交叉反應(yīng)程度通常反映了質(zhì)粒個(gè)體的免疫原性，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下高滴定度與高交叉反應(yīng)性水平相對(duì)應(yīng)(表III)。但是僅憑滴定度并不總能解釋所有的交叉反應(yīng)性上的差異，如表所示，從用pR6E2質(zhì)粒免疫的小鼠得到的血清的滴定度比構(gòu)建載體pD6E2、PH1E2和pM63E2得到的低但，pR6E2血清與更多天然HVR1肽段反應(yīng)。類(lèi)似地從用pF7E2、pM122E2和pR9E2免疫的小鼠得到的血清的交叉反應(yīng)性比pG31E2免疫血清的高兩倍，但它們的滴定度相似(表III)。
對(duì)C57Black小鼠注射pF78E2嵌合基因?qū)е卤菳alb/c小鼠強(qiáng)的應(yīng)答從而導(dǎo)致更大的交叉反應(yīng)性(49％對(duì)28％)。
用質(zhì)粒混合物免疫提高應(yīng)答的交叉反應(yīng)性用編碼擬表位/E2嵌合蛋白的質(zhì)粒的混合物免疫3組Balb/c小鼠，每只小鼠每次注射接受總量100μg DNA。
混合物A含有編碼D6、F78、G31、H1、M122和R6的E2融合蛋白的質(zhì)粒?；旌衔顱還包括其它三種誘導(dǎo)交叉反應(yīng)抗體的構(gòu)建載體pE19E2、pM63E2和pR9E2。而混合物C含有所有的11種質(zhì)粒。(肽的混合物、根據(jù)混合物A、混合物B、混合物C編碼肽的核酸代表本發(fā)明的進(jìn)一步的方面。)所有的3種混合物都是免疫原性的并誘導(dǎo)高交叉反應(yīng)性的抗血清(表III)。源自用混合物A免疫的動(dòng)物的抗體的交叉反應(yīng)性并不比通過(guò)單獨(dú)注射混合物中所包含的各個(gè)質(zhì)粒得到的更高。然而，應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是前者的滴定度比后者低約50倍，這暗示著如果免疫效率提高的話混合物A有誘導(dǎo)出交叉反應(yīng)應(yīng)答更廣泛的抗體的潛力。從混合物B得到的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)假說(shuō)。接受第二種質(zhì)?；旌衔锏男∈蟊憩F(xiàn)出交叉反應(yīng)性的凈提高，它們產(chǎn)生的抗血清能識(shí)別約50％的用于測(cè)試的天然HVR1序列。在此例中平均滴定度仍然比從質(zhì)粒個(gè)體單獨(dú)免疫的動(dòng)物中得到的交叉反應(yīng)性最強(qiáng)的血清的滴定度低一個(gè)數(shù)量級(jí)(表III)。
含有編碼擬表位/E2嵌合蛋白的所有質(zhì)粒的最復(fù)雜的混合物的肌肉注射并未進(jìn)一步提高所產(chǎn)生的免疫血清的交叉反應(yīng)性。用上述混合物中兩種另加的構(gòu)建載體(pB14E2和pB24E2)免疫動(dòng)物并未觀察到交叉反應(yīng)性，這與上述結(jié)果相一致。
對(duì)C57black小鼠的免疫得到類(lèi)似的數(shù)據(jù)。
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表I-篩選圖解表的頂部表示用HCV感染病人的血清對(duì)HVRl文庫(kù)的第一輪和第二輪富集。血清的名稱(chēng)與相應(yīng)的感染病毒的基因型(括號(hào)中)在左邊標(biāo)明。右邊表示得到的噬菌體庫(kù)的名稱(chēng)。
表II-在“強(qiáng)”和“弱”交叉反應(yīng)性系列擬表位中觀察到的氨基酸頻率i表示氨基酸位置(1到27)；aa表示氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼；Fs(i，aa)是“強(qiáng)”擬表位中氨基酸aa在位置i出現(xiàn)的頻率；Fw(i，aa)是“弱”擬表位中氨基酸aa在位置i出現(xiàn)的頻率。
表I
表IIFsFwFs Fwiaa i aa(i，aa)(i，aa)(i，aa)(i，aa)
表III質(zhì)粒 滴定度 陽(yáng)性肽段數(shù)pB14E2 270 0pB24E2 189 0pD6E2 4222 3pE19E2 990 2pF78E2 3181212pG31E2 312515pH1E2 2977 1pM63E2 3888 2pM122E24136010pR6E2 1923 6pR9E2 2109211mF78 110 2MIX684 11MIX1224 19MIX610 18質(zhì)粒 滴定度 陽(yáng)性肽段數(shù)pF78E2 4154721MIX203812權(quán)利要求
1.由至少105種不同的肽組成的文庫(kù)，每種肽都具有與下式(“式I”)相符的氨基酸序列Q T H V T G G S A A R T T S G L T S L F S P G A S Q NT T T V V Q G H A A H S V G R L P K KR Q V S Q V R R R S S QQ
2.根據(jù)權(quán)利要求1的文庫(kù)，包括至少106種不同的肽，每種肽具有與上述式相符的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的文庫(kù)，包括至少107種不同的肽，每種肽具有與上述式相符的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的文庫(kù)，其中的每種肽具有下式(“式III”)的氨基酸序列Q T H T V G G Q A S H Q A S S L T S L F S P G A K Q NT T V T S Q G A T H G V G S S KV V A T V R R P Q
5.根據(jù)權(quán)利要求4的文庫(kù)，包括至少106種不同的肽，每種肽具有與式III相符的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)的在噬菌體顆粒的表面表達(dá)的文庫(kù)。
7.獲得一種或多種肽的方法，上述肽含有與HCV株HVR1表位發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的表位，該方法包括使根據(jù)權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的肽文庫(kù)與能結(jié)合上述HCV株HVR1的抗體分子相接觸，并從上述文庫(kù)中選出一種或多種能結(jié)合上述抗體分子的肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中選出的肽或多肽含有免疫學(xué)上與許多株HCV的HVR1發(fā)生交叉反應(yīng)的表位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，包括使根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)的肽文庫(kù)與許多抗體分子相接觸，上述抗體分子整體上能與大量HCV株的HVR1結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的許多抗體分子源自感染了HCV個(gè)體的血清。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的文庫(kù)是表達(dá)在噬菌體顆粒的表面的，每個(gè)顆粒含有編碼其表面表達(dá)的肽的核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的核酸來(lái)自表達(dá)上述選出的肽的噬菌體顆粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，包括通過(guò)從核酸表達(dá)生產(chǎn)肽，上述核酸的序列來(lái)自表達(dá)選出的肽的噬菌體顆粒的核酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求7至13中任何一項(xiàng)的方法，其中具有上述選出肽的氨基酸序列的肽是以分離形式提供的。
15.根據(jù)權(quán)利要求7至13中任何一項(xiàng)的方法，其中各自具有上述選出肽的氨基酸序列的許多肽是以分離形式提供的。
16.根據(jù)權(quán)利要求7至13中任何一項(xiàng)的方法，其中上述許多肽的混合物是以分離形式提供的。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任何一項(xiàng)的方法，其中所述具有上述選出肽的氨基酸序列的肽，所述的以分離形式提供的許多肽或許多肽的混合物是通過(guò)從編碼核酸表達(dá)而提供的。
18.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任何一項(xiàng)的方法，其中所述具有上述選出肽的氨基酸序列的肽，所述的分離形式的許多肽或許多肽的混合物是通過(guò)肽合成而提供的。
19.根據(jù)權(quán)利要求14至18中任何一項(xiàng)的方法，其中所述具有上述選出肽的氨基酸序列的肽，所述的分離形式的許多肽或許多肽的混合物被配制成含有至少一種另加成分的組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的一種方法，其中所述的組合物包括制藥上可接受的賦形劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的一種方法，其中所述的組合物包括佐劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求7至17中任何一項(xiàng)的方法，其中所述選出肽的氨基酸序列是以與其它另加氨基酸形成融合物的形式提供的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的一種方法，其中所述的融合物包括在HVR1部位具有所述氨基酸序列的HCV E2/NS1蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的一種方法，其中所述的融合物被配制成至少含有一種另加成分的組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的一種方法，其中所述的組合物包括制藥上可接受的賦形劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的一種方法，其中所述的組合物包括佐劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的一種方法，其中所述的融合物包括在重組的HCV中。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的一種方法，其中所述的重組HCV被配制成至少含有一種另加成分的組合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的一種方法，其中所述的組合物包括制藥上可接受的賦形劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的一種方法，其中所述的組合物包括佐劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求7至30中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的選出的那個(gè)肽具有或選出的那些肽每個(gè)具有根據(jù)下式(“式II”)的氨基酸序列Q T H T V G G Q A S H Q A S S L T S L F S P G A K Q NT R G L SR Q P
32.可從根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的肽文庫(kù)得到的108種不同肽的混合物，其中108種不同肽中每種都具有與下式(“式II”)相符的氨基酸序列Q T H T V G G Q A S H Q A S S L T S L F S P G A K Q NT R G L SR Q P
33.一種組合物，包括可從根據(jù)權(quán)利要求32的混合物中得到的式II的多種肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的一種組合物，包含2至約10種可從上述混合物中得到的不同的肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的一種組合物，包含肽G31、F78、R9、D6、M122和H1中的一種或多種，上述肽的氨基酸序列在圖7(A)中列出。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的一種組合物，包含上述肽R9、F78、H1和D6(“MIX1”)。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的一種組合物，包含上述肽M122和G31(“MIX2”)。
38.根據(jù)權(quán)利要求35的一種組合物，包含上述肽G31、F78、R9、D6、M122和H1(“MIX3”)。
39.根據(jù)權(quán)利要求33到38中任何一項(xiàng)的一種組合物，其中一種或多種上述肽與另加的氨基酸形成融合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的一種組合物，其中所述的融合物包括在HVR1位置具有上述肽的HCV E2/NS1蛋白。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的一種組合物，其中所述的融合物包括在重組HCV中。
42.根據(jù)權(quán)利要求33至41中任何一項(xiàng)的一種組合物，包含至少一種另加成分。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的一種組合物，其中所述的組合物包含制藥上可接受的賦形劑。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的一種組合物，其中所述的組合物包含佐劑。
45.式II中的一種肽，可從根據(jù)權(quán)利要求32的混合物得到。
46.可從根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)的文庫(kù)得到的一種肽。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的肽，其氨基酸序列選自包含下列序列的一組序列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
48.具有任何下列氨基酸序列的肽B14QTTVTGQASHTTSSLTGLFSPGASQKB33ATHATGGQAAHSTHSLTSLFSPGASQKF81QTHVTGGSAAHQTGGLTGLFSPGPKQNB18QTTVVGGQASHVSRLTGLFSPGSSQKE19TTHTGGQQAHTTSRLVSLFSPGASQKL72QTTTAAHTTSGLTGLFSPGAKQND20QTHVTGVAGRQTSGLVSLFSPGSSQND30QGGVQGHTTSSLVGLFSPGSQQN
49.一種組合物，含有根據(jù)46至48中任何一項(xiàng)的一種肽。
50.一種組合物，含有根據(jù)46至48中任何一項(xiàng)的多種肽。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，含有2至約10種根據(jù)權(quán)利要求46至48中任何一項(xiàng)的不同的肽。
52.根據(jù)權(quán)利要求49至51的組合物，其中所述的一種或多種肽與另加的氨基酸形成融合物。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的組合物，其中所述的融合物包括在HVR1位置具有上述肽的HCV E2/NS1蛋白。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的組合物，其中所述的融合物包括在重組HCV中。
55.根據(jù)權(quán)利要求49至54的組合物，包含至少一種另加成分。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的組合物，其中所述的組合物包括制藥上可接受的賦形劑。
57.根據(jù)權(quán)利要求55的組合物，其中所述的其中所述的組合物包括佐劑。
58.編碼根據(jù)權(quán)利要求45至48中任何一項(xiàng)的一種肽的核酸。
59.編碼根據(jù)權(quán)利要求45至48中任何一項(xiàng)的多種肽的核酸。
60.根據(jù)權(quán)利要求58或59的核酸可操作地與調(diào)節(jié)編碼一種或多種肽表達(dá)的調(diào)控序列連接。
61.含有根據(jù)權(quán)利要求60的核酸的宿主細(xì)胞。
62.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求45至48中任何一項(xiàng)的一種或多種肽的方法，該方法包括使根據(jù)權(quán)利要求60的核酸表達(dá)。
63.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求45至48中任何一項(xiàng)的一種或多種肽的方法，該方法包括在使上述肽或多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求61的宿主細(xì)胞。
64.根據(jù)權(quán)利要求62或63的方法，包括分離和/或純化所述的一種或多種肽。
65.根據(jù)權(quán)利要求62至64中任何一項(xiàng)的方法，包括將所述一種或多種肽配制成含有至少一種附加成分的組合物。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述的組合物包括制藥上可接受的賦形劑。
67.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述的組合物包括佐劑。
68.得到一種或多種抗體分子的方法，上述抗體分子含有能結(jié)合大量HCV株HVR1上的表位的結(jié)合位點(diǎn)，該方法包括使一系列抗體分子與根據(jù)權(quán)利要求45至48中任何一項(xiàng)的一種肽接觸，并從該系列中選出能與上述肽結(jié)合的一種或多種抗體分子。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，包括使一系列抗體與根據(jù)權(quán)利要求45至48中任何一項(xiàng)的多種肽接觸。
70.根據(jù)權(quán)利要求68或69的方法，其中所述的肽以與另加氨基酸形成融合物的形式提供。
71.根據(jù)權(quán)利要求68至70中任何一項(xiàng)的方法，其中的一種或多種肽被施用到非人類(lèi)哺乳動(dòng)物上并使它或它們與由上述哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一系列抗體分子接觸，然后從上述哺乳動(dòng)物中得到能結(jié)合上述一種或多種肽的一種或多種抗體分子。
72.根據(jù)權(quán)利要求68至70中任何一項(xiàng)的方法，其中的一種或多種肽被施用到非人類(lèi)哺乳動(dòng)物上并使它們與由上述哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一系列抗體分子接觸，然后從上述哺乳動(dòng)物中得到能產(chǎn)生結(jié)合上述一種或多種肽的抗體分子的細(xì)胞。
73.根據(jù)權(quán)利要求72的方法，其中所述的抗體分子是從上述細(xì)胞或其后代得到的。
74.根據(jù)權(quán)利要求71至73任一項(xiàng)的方法，其中殺死所述的哺乳動(dòng)物。
75.根據(jù)權(quán)利要求68至70中任何一項(xiàng)的方法，其中的一系列抗體分子在噬菌體顆粒的表面表達(dá)，每種噬菌體顆粒含有編碼其表面表達(dá)的抗體分子的核酸。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中的核酸是從表達(dá)能結(jié)合上述一種或多種肽的抗體分子的噬菌體顆粒中得到的。
77.根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)從核酸表達(dá)產(chǎn)生抗體分子，上述核酸具有從噬菌體顆粒中得到的核酸的序列，上述噬菌體顆粒表達(dá)能結(jié)合上述一種或多種肽的抗體。
78.根據(jù)權(quán)利要求68至77中任何一項(xiàng)的方法，其中能結(jié)合一種或多種上述肽的一種抗體分子以分離的形式提供。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中能結(jié)合一種或多種上述肽的多種抗體分子以分離的形式提供。
80.根據(jù)權(quán)利要求79的方法，其中所述的多種抗體分子的混合物以分離的形式提供。
81.根據(jù)權(quán)利要求78至80中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的分離形式的抗體分子、多種抗體分子或多種抗體分子的混合物是通過(guò)從編碼核酸表達(dá)而提供的。
82.根據(jù)權(quán)利要求78至81中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的分離形式的抗體分子、多種抗體分子或多種抗體分子的混合物被配制成至少含有一種另加成分的組合物。
83.根據(jù)權(quán)利要求82的方法，其中所述的組合物包括制藥上可接受的賦形劑。
84.根據(jù)權(quán)利要求68至83中任何一項(xiàng)的方法得到的抗體分子。
85.根據(jù)權(quán)利要求33至44中任何一項(xiàng)的組合物在用于制備能結(jié)合HCV HVR1表位的哺乳動(dòng)物抗體的藥物生產(chǎn)中的用途。
86.根據(jù)權(quán)利要求45至48中任何一項(xiàng)的肽在用于制備能結(jié)合HCVHVR1表位的哺乳動(dòng)物抗體的藥物生產(chǎn)中的用途。
87.根據(jù)權(quán)利要求49至57中任何一項(xiàng)的組合物在用于制備能結(jié)合HCV HVR1表位的哺乳動(dòng)物抗體的藥物生產(chǎn)中的用途。
88.根據(jù)權(quán)利要求58至60中任何一項(xiàng)的核酸在用于制備能結(jié)合HCVHVR1表位的哺乳動(dòng)物抗體的藥物生產(chǎn)中的用途。
89.根據(jù)權(quán)利要求84的抗體分子在用于提高哺乳動(dòng)物中能結(jié)合HCVHVR1表位的抗體水平的藥物生產(chǎn)中的用途。
90.在哺乳動(dòng)物中制備能結(jié)合HCV HVR1表位的抗體的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求33至44中任何一項(xiàng)的組合物。
91.在哺乳動(dòng)物中制備能結(jié)合HCV HVR1表位的抗體的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求45至48中任何一項(xiàng)的肽。
92.在哺乳動(dòng)物中制備能結(jié)合HGV HVR1表位的抗體的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求49至57中任何一項(xiàng)的組合物。
93.在哺乳動(dòng)物中能結(jié)合HCV HVR1表位的抗體的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求58至60的任一項(xiàng)的核酸。
94.提高哺乳動(dòng)物中能結(jié)合HCV HVR1表位的抗體水平的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求84的一種抗體。
95.根據(jù)權(quán)利要求90至94中任何一項(xiàng)的方法，其是預(yù)防性的。
96.根據(jù)權(quán)利要求90至94中任何一項(xiàng)的方法，其中的哺乳動(dòng)物具有HCV感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及是C型肝炎病毒(HCV)的推斷的包膜蛋白E2的高變區(qū)1(HVR1)的擬表位的肽,其在獲得抗不同HCV株的抗體和產(chǎn)生免疫應(yīng)答交叉—反應(yīng)中的用途。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1274387SQ99801173
公開(kāi)日2000年11月22日 申請(qǐng)日期1999年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月19日
發(fā)明者A·尼科西亞, A·拉姆, A·特拉蒙塔諾, R·科爾泰瑟 申請(qǐng)人:P·安杰萊蒂分子生物學(xué)研究所