專利名稱：Il－12對新生兒免疫的刺激的制作方法
相關(guān)申請本申請是一個基于申請日為1998年3月5日的美國專利09/035，593的部分繼續(xù)申請，該在先申請的全部內(nèi)容在此通過引用被合并于本文。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上新生兒的免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是未發(fā)育完全的且在功能上依賴母親的抗體來用于保護以抵抗致病生物。事實上，伯涅特和芬乃爾(Burnet，F(xiàn).M.and Fenner，F(xiàn).，Macmillan，Melbourne)在《抗體的生產(chǎn)》中[The Production of antibodies，102-105(1949)]認(rèn)為對人類新生兒接觸包括傳染性因子在內(nèi)的抗原，將誘導(dǎo)產(chǎn)生一種對這些抗原的特殊的免疫耐受狀態(tài)。在后來麥德瓦爾和其同事[Medawar and colleagues，Billingham，R.E.et.al，Nature，172603(1952)]通過暴露于外源白細(xì)胞的新生小鼠能夠如同成年鼠一樣從相同的供體中接受外源組織從而為這個假說提供了實驗證據(jù)。
在新生兒的免疫系統(tǒng)中誘導(dǎo)對病原體的免疫性的有效的方法是急切需要的。
發(fā)明的概述本發(fā)明涉及一種增強新生宿主(例如誘導(dǎo))的免疫應(yīng)答的方法，在一個實施例中，本發(fā)明涉及一種在新生宿主(哺乳動物，包括人類)中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其包括向宿主給藥有效量的IL-12和病原體的抗原(例如蛋白，碳水化合物，脂類，重組DNA，所有的生物，毒素，有機分子)。在另一個實施例中，本發(fā)明涉一種新生宿主增強對病原體免疫應(yīng)答的方法，其包括給藥宿主有效量的IL-12和病原體的抗原。如同這里所述，新生兒的被誘導(dǎo)或增強的免疫應(yīng)答可以是，例如一種細(xì)胞因子免疫應(yīng)答和/或一種體液免疫應(yīng)答(例如抗原-特異性)。
本發(fā)明也涉及一種在宿主中誘導(dǎo)細(xì)胞因子應(yīng)答抵抗病原體的方法，其包括給宿主給藥有效量的IL-12和病原體的抗原。
本發(fā)明也包括一種克服干擾素-γ(IFN-γ)在新生宿主中表達(dá)的抑制的方法，其包括給宿主給藥有效量的IL-12和病原體的抗原。
本發(fā)明也涉及一種增強新生宿主的細(xì)胞因子表達(dá)或?qū)Σ≡w的應(yīng)答的方法，其包括給宿主給藥有效量的IL-12和病原體的抗原。
在新生宿主中誘導(dǎo)對病原體的免疫應(yīng)答的方法和組合物是急切需要的。本發(fā)明提供了在新生宿主中增強免疫性和誘導(dǎo)保護應(yīng)答的方法及組合物。


圖ⅠA-ⅠC是血清稀釋度相對于光密度(O.D.)的對數(shù)曲線，其顯示IL-12對新生兒DNP結(jié)合不完全Freund｀s佐劑(IFA)中的DNP-OVA加上IL-12(黑色三角形)或IFA中的DNP-OVA加上磷酸鹽緩沖液生理鹽水(PBS)載體(空心的環(huán))或僅在PBS載體(空心的方形)中的DNP-OVA注射的小鼠中的接觸卵清蛋白(DNP-OVA)后的血清抗-二硝基半抗原(DNP)水平的影響；每一曲線代表來自各自小鼠的血清的集合；小鼠在5-6周齡后用帶有DNP-OVA的完全Freund佐劑(CFA)攻擊，然后七天后通過ELISA檢測血清的抗DNP抗體；用DNP-OVA和IL-12接觸抗原與用DNP-OVA和PBS接觸抗原的小鼠的IgG2a以及IgG2b在p＜0.05時的差別是顯著的。
圖1D-1F是血清稀釋度相對于O.D的對數(shù)曲線。顯示了在用帶有HEL的IFA加上IL-12(實三角)，帶有HEL的IFA加上PBS載體(空圓環(huán))或僅PBS載體(空方形)感染的小鼠的接觸+/-IL-12的HEL后，其IL-12對血清抗-雞白蛋溶菌酶(HEL)的影響；每一曲線代表來自各自小鼠的血清的集合；小鼠5-6周齡后用帶有HEL的CFA攻擊然后七天后通過ELISA檢測血清的抗HEL抗體；用HEL與IL-12和用HEL與PBS接觸過抗原的小鼠之間的集合的差異其IgG1在p＜0.05是顯著的。
圖2A-2C是血清稀釋度相對于O.D的對數(shù)曲線。顯示了在用帶有DNP-OVA的明礬加上IL-12(實三角)，帶有DNP-OVA的明礬加上PBS載體(空圓環(huán))或僅PBS載體(空方形)感染的小鼠的DNP-OVA經(jīng)過接觸+/-IL-12后，其IL-12對血清抗-DNP水平的影響；每一曲線代表來自各自小鼠的血清的集合；小鼠5-6周齡后用帶有DNP-OVA的CFA攻擊然后七天后通過ELISA檢測血清的抗-DNP抗體；用DNP-OVA與IL-12和用DNP-OVA與PBS接觸過抗原的小鼠之間的集合的差異對于所有的同位型在p＜0.05是顯著的。
圖3A-3B是血清稀釋度相對于405nm O.D.的對數(shù)曲線。顯示了皮下在用帶有DNP-OVA的明礬加上IL-12(實三角)，帶有DNP-OVA的明礬加上PBS載體(空圓環(huán))或僅PBS載體(空鉆石形)感染懷孕的小鼠的影響；小鼠9-10周齡后用帶有DNP-OVA的明礬攻擊，七天后通過ELISA檢測血清的抗-DNP抗體；每一曲線代表來自各自小鼠的血清的集合。
圖4A-4B是血清稀釋度相對于405nm O.D.的對數(shù)曲線。顯示了在新生兒HANA接觸+/-IL-12后，IF-12對得自流感病毒(HANA)的血清抗-純化血球凝集素和神經(jīng)氨酸苷酶的水平的影響，小鼠在1天齡時用帶有HANA的明礬加上IL-12(實三角)，帶有HANA的明礬加上PBS載體(空圓環(huán))或僅PBS載體(空方形)注射；所有的小鼠5-6周齡后用帶有HANA的明礬攻擊然后七天后通過ELISA檢測血清的抗-HANA抗體；每一曲線代表來自各自小鼠的血清的集合。
圖5A-5D曲線顯示了在用帶有H1N1的明礬加上IL-12(實三角)，帶有H1N1的明礬加上PBS載體(空圓環(huán))或僅PBS載體(空方形)感染的小鼠的H1N1經(jīng)過接觸+/-IL-12后，IF-12對血清抗-H1N1水平的影響；所有的小鼠5-6周齡后用帶有H1N1的明礬攻擊，然后七天后使用H1N1包被的微滴度平板通過特異性同型ELISA來檢測血清。血清稀釋液的相應(yīng)滴度給出了50％的最大集合。每一符號代表各自小鼠的結(jié)果。出生時用H1N1±IL-12接觸抗原的小鼠與僅用PBS載體接觸抗原的小鼠在p＜0.05時其總Ab，IgM，IgG1和IgG2的差異是很明顯的。出生時用H1N1和IL-12接觸抗原的小鼠與用H1N1與PBS載體接觸抗原的小鼠在p＜0.05時的IgG2的差異是很明顯的。
圖6A-6B曲線顯示在出生時用流感亞疫苗加IL-12共同給藥增強了隨后流感病毒感染的保護。一天齡的小鼠用帶有H1N1的明礬加上IL-12(實三角)、疫苗加上PBS載體(空圓環(huán))或僅PBS載體(空方形)免疫。所有的小鼠(每組7-8只)用103 pfu的MPRI8/345流感病毒鼻內(nèi)攻擊4-5周。每天監(jiān)測小鼠精神和體重的減輕。在出生后即嚴(yán)格共同給藥帶有H1N1的明礬加上IL-12h和那些嚴(yán)格的在出生后只給H1N1或只給PBS載體的小鼠相比其生存力的差別在p＜0.05時是顯著的。
圖7曲線顯示了從出生時即用流感病毒亞基加IL-12對小鼠進行免疫的血清進行被動轉(zhuǎn)移增強了對流感病毒攻擊的保護。收集分別用帶有H1N1的流感病毒疫苗亞基加IL-12(閉三角)，疫苗加PBS(閉環(huán))或只用PBS載體(空心方形)免疫小鼠的血清?；旌涎逵脽o菌PBS進行1∶5的稀釋，然后用0.1ml/每鼠的劑量i.p.注射。所有的小鼠(每組8只)用A/PR/8/34的103 pfu流感病毒鼻內(nèi)攻擊6小時。
本發(fā)明的詳細(xì)描述如上所述，將IL-12給藥于新生宿主加強(例如誘導(dǎo))了生命早期的免疫功能并且誘導(dǎo)了對保護反應(yīng)的記憶。因此本發(fā)明涉及到增強新生宿主對病原體或抗原免疫功能的方法。在一個實施例中，本發(fā)明涉及了一種誘導(dǎo)新生宿主對一種病原體免疫應(yīng)答的方法，其包括對新生宿主給藥有效劑量的IL-12及一種病原體的抗原。另外一個實施例中，本發(fā)明涉及了一種增強了對新生宿主一種病原體免疫應(yīng)答的方法，其包括對新生宿主給藥有效劑量的IL-12和一種病原體的抗原。
如上所述，術(shù)語“增強”和/或“增強了”指增強(增加)一種新生宿主對一種病原菌的現(xiàn)存免疫應(yīng)答。本術(shù)語也指刺激(誘導(dǎo))一個新生兒對一種病原體的一種免疫應(yīng)答。
用于本發(fā)明的抗原(一個或多個)包括，但不限于，蛋白質(zhì)或片段(例如蛋白水解的片段)，肽(例如合成肽，多肽)，糖蛋白，碳水化合物(例如，多糖)，脂類，糖脂，半抗原偶合物，重組DNA，整個有機體(滅活或減毒)或部分，毒素及類毒素(例如，破傷風(fēng)，白喉，霍亂)和/或有機分子。用于本發(fā)明的抗原的特別實施例包括得到或衍生于流感病毒的血球凝集素及神經(jīng)氨酸苷酶。
抗原可以得自或衍生于多種病原體或有機體，例如細(xì)菌(例如，桿菌屬，B組鏈球菌屬，博代氏桿菌屬，李司忒氏菌屬，anthracis芽胞桿菌屬，S.pneumoniae，N.mening～itzs，Hinfluenza)，病毒(例如肝炎，麻疹，脊髓灰質(zhì)炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸合胞體病毒)，分支桿菌目(M.tubercu′osis)，寄生蟲(利什曼原蟲屬，血吸蟲，Tranpanosomes，弓形體屬，卡氏肺囊蟲)及真菌(例如，念珠菌屬，隱球菌屬，球孢子菌的，曲霉屬)，在宿主中希望有免疫反應(yīng)來抵抗它們，病原體抗原可利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來獲得。例如，抗原可以直接從病原體，利用重組技術(shù)得到或利用化學(xué)和成衍生被分離(純化，本質(zhì)上純)。另外，抗原可以從商業(yè)來源獲得。用于本發(fā)明的合適的抗原是一種至少含有一種B或T細(xì)胞抗原決定簇(例如，T輔助細(xì)胞或殺傷T細(xì)胞抗原決定簇)。其他合適的用于本發(fā)明的抗原組分可以由本領(lǐng)域熟知來測定。
IL-12是一種近來鑒定的異源二聚體細(xì)胞因子，分子量75kDa，由二硫鍵連接40 kDa和35 kDa兩個亞基。其由抗原呈遞細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞，與受體連接激活T、B、以及NK細(xì)胞[Desai，B.B.，et aL，J ImmunoL，1483125-3132(1992)；Vogel，L.A～，et a1.，Int.Immuno1.，81955-1962(1996)]。其具有很多功能，包括1)增強T細(xì)胞及NK細(xì)胞的增殖，2)提高T細(xì)胞，NK細(xì)胞，以及巨噬細(xì)胞的溶解細(xì)胞活性，3)誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，以及少量的TNF-α和GM-CSF，以及4)TH1細(xì)胞的激活[“Trinchieri，G.，etal.，Blood，8440084027(1994)]。已顯示IL-12是Th1的克隆增殖中一個重要的協(xié)同刺激因子(Kennedy et al.，Eur.J.Immunol.242271-2278，1994)并且導(dǎo)致在血清中IgG2a抗體產(chǎn)量的增加[Morris，S.C.，et al.，J.Immunol 1521047-1056(1994)；Germann，T.M.，et al.，Eur.J.Immunol，25823-829(1995)；Sher，A.，et al.，Ann.NY Acad.Sci，795202-207(1996)；Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol，71519-1528(1995)；Metzger，D.W.et al.，Eur.J.Immunol.，271958-1965(1997)]。IL-12的給藥可以暫時減少IgG1抗體的產(chǎn)量[Morris，S.C.，et al.，J.Immunol.，1521047-1056(1994)；McKnight，A.J.，J.Immunol.，1522172-2179(1994)；Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]，表明對Th2應(yīng)答的抑制。IL-12的純化與克隆公開在PCT申請WO92/05256和WO 90/05147以及歐洲專利申請公開EP 322，827上(被稱為“CLMF”)。所有上述功能均用成年動物觀察。
此處所用的“白介素-12”和“IL-12”是指白介素12蛋白，其單個的亞基，單個亞基的多聚體，IL-12的功能片段，及其功能等價物和/或“白介素-12”和“IL-12”的類似物。如同這里所定義的，IL-12的功能片段是指例如當(dāng)用一種抗原給藥時，在新生宿主中誘導(dǎo)對抗原的免疫反應(yīng)。同樣如同這里所定義的，“白介素-12”和“IL-12”的功能片段或等價物包括被修飾的IL-12蛋白以致于結(jié)果IL-12產(chǎn)物具有類似于此處所述的IL-12的活性(例如，當(dāng)用一種抗原給藥時，新生宿主中誘導(dǎo)對抗原的免疫反應(yīng)的能力)。“白介素-12”的功能等價物或片段也包括核苷酸序列(例如，DNA，RNA)及其一部分，它們編碼一種具有此處所述的IL-12活性的蛋白或肽(例如，當(dāng)用一種抗原給藥時，新生宿主中誘導(dǎo)對抗原的免疫反應(yīng)的能力)。此外，此術(shù)語包括一段核苷酸序列其通過遺傳密碼的兼并編碼如同IL-12和具有此處所述的IL-12活性的相似肽基因產(chǎn)物。例如，“白介素-12”和“IL-12”的功能等價物包括一段核苷酸序列其含有一個“靜止”密碼子代替物(例如，一個編碼一個氨基酸的密碼子代替另一個編碼相同氨基酸的密碼子)或一段氨基酸其含有一個“靜止”氨基酸代替物(例如，一個氨基酸的密碼子對另一個相同氨基酸的替代)。
適用于本發(fā)明方法的IL-12可被通過不同的來源獲得或利用已知的技術(shù)合成。例如，IL-12可從自然資源(例如，哺乳動物，如人資源)中純化(分離，純化)得到，通過化學(xué)合成產(chǎn)生或通過重組DNA技術(shù)獲得。此外，本發(fā)明所用的IL-12可通過商業(yè)途徑獲得。
本發(fā)明方法中IL-12給藥的有效量是指在新生宿主中能增強對抗原的免疫應(yīng)答的量。特定地，“IL-12的有效量”是這樣的量當(dāng)對新生宿主給藥時，相對于沒有給藥的新生宿主產(chǎn)生基本的免疫調(diào)控；并且當(dāng)用抗原給藥時，相對于沒有給藥IL-12的新生宿主其誘導(dǎo)和/或增強在新生宿主中對抗原的免疫應(yīng)答。也就是說，IL-12的“有效量”是在新生宿主中調(diào)節(jié)免疫性的量，和/或當(dāng)用抗原給藥時，相對于沒有給藥IL-12的新生宿主，誘導(dǎo)和/或增強在新生宿主中對抗原的免疫應(yīng)答。
此處所用的“新生宿主”是一種哺乳動物宿主，例如一種靈長目動物(例如，人類)，鼠科動物，貓科動物，犬科動物，?；蜇i宿主。此外，術(shù)語包括一種新生宿主且其生命期延伸為出生前7個月到出生后2年。一些疫苗對宿主是無效的直到其大約2歲齡。在另一個實施例中，新生宿主是指其生命期延伸為出生前1周到出生后1年的宿主。在本發(fā)明的方法中，IL-12或IL-12和抗原可被直接給藥或間接給藥。也就是說，IL-12或IL-12和抗原可被直接給藥于子宮內(nèi)或出生后的宿主。可選擇地，IL-12或IL-12和抗原可被間接給藥，其中的組分被給藥于懷孕的母體，通過胎盤被間接傳遞至新生宿主。
IL-12和/或抗原可被給藥作為一種預(yù)防疫苗或治療疫苗。也就是說，IL-12給藥可在病原體在新生宿主中出現(xiàn)和/或顯示顯然的作用之前(用于預(yù)防)或之后(用于治療)。因此，IL-12和/或抗原可被給藥于新生宿主其顯示出由從其中獲得或得到抗原的病原體引起的疾病，或仍未顯示出由從其中獲得或得到抗原的病原體引起的疾病。因此，IL-12和/或抗原可被給藥于新生宿主在顯示出疾病的癥狀之前或之后，并且導(dǎo)致在由其中獲得或得到抗原的病原體引起的疾病狀態(tài)的起始起到保護，改善，消除或延遲的作用。
IL-12和/或抗原可被通過不同的途徑給藥于新生宿主。給藥的路徑包括真皮內(nèi)的，經(jīng)眼的(例如，緩慢釋放多聚體)，肌內(nèi)的，腹膜內(nèi)的，靜脈內(nèi)的，皮下用的，口服.的，硬膜外的以及鼻內(nèi)的途徑。其它的任意的合宜的途徑均可被使用，例如，浸劑或大丸藥注射，或通過上皮的或粘膜皮lining的吸收。此外，IL-12和/或抗原可被給藥同其它的組分或生物活性因子一起，例如，佐劑(明礬)，藥學(xué)上可接受的表面活性劑(例如，甘油酯)，賦形劑(例如，乳糖)，脂質(zhì)體，載體，稀釋劑和載體。如需要，也可加入一定的甜味劑，調(diào)味料和/或著色劑。
此外，IL-12和/或抗原在一個實施例中，其中的抗原是一種蛋白(肽)，可被通過體內(nèi)編碼此蛋白的多核苷酸的表達(dá)來給藥。例如，IL-12或抗原給藥于新生宿主通過使用一個活性載體，其中含有IL-12和/或抗原核苷酸序列的活性載體在IL-12和/或抗原在體內(nèi)表達(dá)的條件下給藥。新生宿主也可被注射聯(lián)合IL-12蛋白或肽，或聯(lián)合一個在體內(nèi)編碼和表達(dá)IL-12蛋白的載體的在體內(nèi)編碼與表達(dá)抗原的載體?？蛇x擇地，新生宿主可被聯(lián)合注射蛋白或肽形式的抗原，或聯(lián)合一個在體內(nèi)編碼和表達(dá)抗原的載體的在體內(nèi)編碼與表達(dá)IL-12的載體。單獨的載體和IL-12蛋白在本發(fā)明的方法中也是有用的。
一些表達(dá)載體系統(tǒng)可通過商業(yè)的途徑獲得或通過重組DNA與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到。例如，載體系統(tǒng)例如酵母或牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)，或病毒載體可被用于本發(fā)明的方法和組成[Kaufinan，R.J.，A Jof Meth.in Cell and Molec.Biol，2221-236(1990)]。其它利用無修飾質(zhì)?；駾NA，包被在靶脂質(zhì)體或紅血球細(xì)胞中的克隆基因的技術(shù)在可被用于導(dǎo)入IL-12多核苷酸到宿主中[Freidman，T.，Science，2441275-1281(1991)；Rabinovich，N.R.，et al.，Science，2651401-1404(1994)]。表達(dá)載體的構(gòu)建以及載體和核苷酸的轉(zhuǎn)移到宿主中可通過利用基因工程技術(shù)來完成，如《分子生物學(xué)中的分子克隆和當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)手冊》(Molecular Cloning and CurrentProtocols in Molecular Biology)所述，其內(nèi)容通過在此引用被合并于本文，或通過商業(yè)途徑獲得的試劑盒(Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning，冷泉港出版社，1989；Ausubel，F(xiàn).M.，et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience，1989)。
如此處所述的，對新生宿主的L-12和抗原的給藥引起或增強在接受者新生宿主的免疫應(yīng)答。在一個實施例中，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)細(xì)胞因子(例如，類Th1)在新生宿主內(nèi)抵抗病原體的反應(yīng)的方法，其包括給藥于新生宿主有效量的IL-12和一種病原體的抗原。在另一個實施例中，本發(fā)明涉及一種在新生宿主中克服其取決于新生宿主對病原體或抗原的暴露的干擾素-γ表達(dá)抑制的方法，其包括給藥于新生宿主有效量的IL-12和抗原。本發(fā)明包括一種增強細(xì)胞因子表達(dá)在新生宿主內(nèi)抵抗或?qū)Σ≡w反應(yīng)的方法，其包括給藥于新生宿主有效量的IL-12和一種病原體的抗原。
例如，在新生宿主中用IL-12和抗原處理引起一種免疫反應(yīng)其中增強了IFN-γ和/或IL-10的表達(dá)。此外，用IL-12和抗原處理體液免疫應(yīng)答在新生宿主中(例如，特異性抗原)被誘導(dǎo)和/或增強。在一個實施例中，通過IL-12和一種抗原給藥產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答導(dǎo)致接受者新生宿主和未接受IL-12和抗原的新生宿主相比其總抗體的水平增強了。在一個特定地實施例中，抗體反應(yīng)在受體新生宿主中產(chǎn)生特異性IgG1、IgG2a和/或IgG2b。
在增強新生宿主內(nèi)對抗原的免疫應(yīng)答的方法中，有效量的IL-12被給藥于宿主，其為增強新生宿主內(nèi)對抗原的免疫應(yīng)答的量并且產(chǎn)生新生宿主的改良的條件(例如，由其獲得抗原的病原體引起的疾病或機能紊亂被預(yù)防，消除或減少)。用于誘導(dǎo)或增強對新生宿主內(nèi)的抗原的免疫應(yīng)答的IL-12的量依據(jù)因素的不同而變化，因素包括宿主的大小，年齡，體重，健康狀況，性別和日常飲食以及給藥的時間，持續(xù)時間或疾病的特性。合適的IL-12d的劑量范圍一般大約為0.5μg到大約150μg每公斤體重。在一個實施例中，劑量范圍一般大約為2.75μg到大約100μg每公斤體重。在另一個實施例中，劑量范圍一般大約為5μg到大約50μg每公斤體重。有效劑量可從由體外或在動物實驗?zāi)Ｊ降贸龅膭┝繎?yīng)答曲線外推而得到。
在本發(fā)明的方法中，有效量的IL-12被聯(lián)合一種抗原給藥。也就是說，在涉及帶有抗原的新生宿主的免疫的時候IL-12被給藥，因此，相對于沒有IL-12給藥的新生宿主的免疫，在新生宿主中對抗原的免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)產(chǎn)生或增強。因此，IL-12可被給藥早于，優(yōu)選恰好早于免疫；在免疫時(例如同時發(fā)生)；或免疫后(隨后)。此外，IL-12可被早于用抗原免疫隨后在用抗原免疫后用IL-12給藥。
如同此處所證明的，IL-12的給藥于新出生的老鼠重新引導(dǎo)小鼠的細(xì)胞因子表達(dá)和啟動動物增強抗體象成年的個體一樣應(yīng)答。因此，新生兒接種IL-12對于在生命早期增強免疫和在新生兒中幫助誘導(dǎo)保護應(yīng)答的記憶是一種有用的方式。
最近的成果顯示只要在適當(dāng)?shù)臈l件下進行接觸抗原，新生的小鼠能夠被啟動去識別外源抗原。Matzinger和其同事[Ridge，J.E.et.Al.，Science，2711723-1726(1996)]發(fā)現(xiàn)了在無論抗原接毒的結(jié)果是新生兒忍受或免疫時被檢測的呈遞抗原細(xì)胞的特性。特別地，它們發(fā)現(xiàn)如果新生兒的樹狀細(xì)胞允許它們?nèi)ケ粏佣荒褪芡N異基因的脾細(xì)胞。最近H.Influenzae菌結(jié)合疫苗的成功論證了非響應(yīng)能力可被克服如果對新生兒的B細(xì)胞提供適當(dāng)?shù)膸椭?，但是疫苗偶?lián)物抵抗其它的TI抗原仍未被有效的克服。此外，用偶聯(lián)疫苗誘導(dǎo)的抗-多糖應(yīng)答仍保留許多TI應(yīng)答的特征[Mond，J.J.et a1.，Annu.Rev.Immunol，13655～92(1995)]。Sarzotti，M.等人在《Science》2711726-1728(1996)報道了新生兒接毒少量的抗原，即假設(shè)其沒有超越動物自己的樹枝狀的細(xì)胞，事實上導(dǎo)致免疫而不是耐受。Lfhmann和同事[Forsthuber，T.et.al.，Science，2711728-1730(1996)]證明了新生兒的對蛋白抗原的“耐受”實際上誘導(dǎo)免疫偏差并且引起對的限制，Th2應(yīng)答是通過IL-4，IL-5，IL-6，以及IgG1抗體的表達(dá)來表征的。Th2記憶的建立將因此顯現(xiàn)在誘導(dǎo)對外源移植物耐受上，從而Th2應(yīng)答抑制涉及IFN-γ產(chǎn)物和激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞的特異性Th1應(yīng)答，基本的原理認(rèn)為是可能對移植物排斥起主要作用。有其它的類似報告新生兒免疫系統(tǒng)顯示Th2細(xì)胞因子和抗體同位型的極化表達(dá)[Adkins，B.et.Al.，J.Immunol.，1516617-6626(1993)；Coutinho，G.et.al.，Eur.J.Immunol，241858-1862(1994)；Early，E.M.and Reen，D.J.，Eur.J.Immunol.，262885-2889(1996)；Barrios，C.et.Al.，Eur.J.Immunol，261489-1496(1996)and Barrios，C.et.al.，Eur.J.Immunol，26266～2670(1996)]。
Th1途徑的起始誘導(dǎo)物IL-12是一個70kD的異源二聚體蛋白質(zhì)，其對免疫有多向性的作用。已顯示IL-121)增強T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖，2)增加T細(xì)胞，NK細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性，3)激活Th1細(xì)胞，和4)誘導(dǎo)IFN-γ和其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生[參見Trinchieri G.，Blood，8440084027(1994)和Buchanan J.M.et.Al.，Int J.Pediat Hematol.Oncol，3123-131(1996)的最近的綜述]。
如同此處所描述的，IL-12在新生兒周圍淋巴系統(tǒng)組織中的表達(dá)是不足的。此外，給藥或重組IL-12重新引導(dǎo)新生兒的免疫系統(tǒng)為Th1-型細(xì)胞因子分布并且增強了抗體記憶應(yīng)答的開發(fā)。
在成年個體中，IL-12刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖，增加CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性，并且增加IFN-γ和其它細(xì)胞因子的產(chǎn)量[Trinchieri，G.，Res.ImmunoL，146423431(1995)；Trinchieri，G.，Immunol.，Today，14335-338(1993)]。新生兒的IL-12的表達(dá)的不足因此對弱的響應(yīng)能力和向Th2應(yīng)答的偏差起主要作用。不足的原因尚不知道，盡管其可能涉及事實即樹突細(xì)胞是IL-12的主要來源[Macstonia，S.E.，et al.，J.Immunol.，1545071-5079(1995)]，并且樹突細(xì)胞在新生兒中的數(shù)目是很低的。事實上，樹突細(xì)胞直到3-4周齡才達(dá)到成人的水平[Steinman，R.，et al.，J.Exp.Med.，1391431-1445(1974)]。通過證實了新生動物的樹突細(xì)胞允許其成為免疫應(yīng)答的Matzinger及其同事的發(fā)現(xiàn)可以理解樹突細(xì)胞的重要性[Ridge，P.G.，et al.，Science，2711723-1726(1996)]。IL-12的增強涉及新生兒的用體內(nèi)需要代替樹突細(xì)胞的免疫能力的原理是可能的。
盡管在周邊缺少IL-12，新生的小鼠明顯地能夠?qū)ν庠吹腎L-12注射應(yīng)答，增加IFN-γ和IL-10的表達(dá)。在對照中，在接受單獨抗原或載體的小鼠中觀察不到IFN-γ轉(zhuǎn)錄物的水平。IFN-γ是一種有效的Th亞效應(yīng)功能免疫調(diào)節(jié)劑并且在激活巨噬細(xì)胞和轉(zhuǎn)化B細(xì)胞為IgG2a產(chǎn)物的同位型中起到關(guān)鍵的作用，其特性為Th1免疫應(yīng)答[Snapper，C.M.，et a1.，Science，236944～947(1987)；Finkelman，F(xiàn).D.，et al.，J.Immunol.，1401022-1027(1988)；Snapper，C.M.，et al.，J.Immunol，1402121-2127(1988)]。類似地，另一個T細(xì)胞應(yīng)答的重要的調(diào)節(jié)劑是IL-10，其通過IL-12被誘導(dǎo)[Gerosa，F(xiàn).，et al.，J.Exp.Med，1832559-2569(1996)；Sher，A.，et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，795202-207(1996)；Meyaard，L.，et al.，J.Immunol.，1562776-2782(1996)；Dafiarian，P.M.，et al.，J.Immunol.，15712-20(1996)]，并且被認(rèn)為涉及到設(shè)計來調(diào)整Th1途徑和減小IFN-γ的影響的負(fù)反饋原理，該觀點完全地與此處所述的結(jié)果相符。當(dāng)增加了IFN-γ和IL-10的產(chǎn)物時，IL-12對新生兒的IL-4與IL-5的表達(dá)沒有什么影響。這些結(jié)果用Shu等[Shu，U.，et al.J.Clin.Invest.，941352-1358(1994)]和Sornasse等人[Sornasse，T.，et al.，J.Exp.Med.，184473-483(1906)]的結(jié)果相反，他們發(fā)現(xiàn)用IL-12對人類新生兒的T細(xì)胞的體外治療刺激了IFN-γ和IL-4的表達(dá)。不同結(jié)果的原因尚不知曉，但也許能和體內(nèi)對體外IL-12接毒以及靶細(xì)胞的不同來源等聯(lián)系起來(脾對臍帶的血，小鼠對人，等等)。
在出生時IL-12給藥也可以增加新生兒的B細(xì)胞響應(yīng)能力。特別地，在出生時用抗原和IL-12接觸，當(dāng)成年時用同源抗原加強免疫的小鼠和僅在成年接觸抗原的小鼠相比，顯示出IgG1、IgG2a和IgG2b的抗體水平的明顯增加。這些結(jié)果通過使用兩種不同的模型蛋白抗原和兩種不同的佐劑而獲得的。以前揭示了IL-12的改變成年小鼠的同位型受限制的抗體對HEL的反應(yīng)能力[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]。具體地講，IL-12加HEL的非腸道的注射明顯增加特異性HEL血清IgG2a的產(chǎn)量且暫時抑制IgG1抗體的產(chǎn)量。此外，其他人[McKnight，A.J.，et al.，J.Immunol.，1522172-2179(1994)；Morris，S.C.，et al.，J.ImmunoL，1521047-1056(1994)；Germann，T.，et al.，Eur.J.Immunol.，25823-829(1995)；Wynn，T.A.，et al.，J.Immunol.，1574068-4078(1996)]已經(jīng)證明了IL-12給藥增強了血清IgG2a、IgG2b和IgG3抗體對蛋白抗原的應(yīng)答。因此，IL-12對成年體液免疫的作用被很好地建立了。此處描述的結(jié)果顯示出新生小鼠對IL-12治療的應(yīng)答在相似的形式下通過重新引導(dǎo)抗體應(yīng)答于Th1，增強了IgG2a和IgG2b抗體。已知同型IgG2a的鼠科動物抗體在調(diào)理素作用以及補體的固定上是非常有效的，且實際上IL-12增強這種同型對包括這種保護機理的新生兒免疫策略是特別有效的。
由于正常新生兒免疫系統(tǒng)的TH2偏差以及新生兒對傳染性試劑的獨特的易損性，人們繼續(xù)發(fā)展刺激Th1的免疫策略和免疫佐劑[Van Regenmortel，M.，ASM News，63136-139(1996)]。目前可接受的人用佐劑例如明礬缺乏產(chǎn)生細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫(Th1)的應(yīng)答的容量，而這正是宿主抵抗病原體變種的必要的組分[Gupta，R.K.，et al.，Novel Strategies in Design and Production ofVaccines，eds.Cohen，S.&Shafferman，A.(Plenum Press，NewYork)，pp.105-113]。最近，Martinez等人[Martinez，X.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，948726-8731(1998)]論證了新生小鼠用基于DNA的疫苗免疫導(dǎo)致了以增加IFN-γ和IgG2a產(chǎn)量為特性的Th1免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生。新生動物的帶有一個表達(dá)流感血球凝集素質(zhì)粒的DNA接種疫苗也被顯示誘導(dǎo)Th1應(yīng)答和賦予抵抗流感病毒致死攻擊的保護[Bot，A.，et al.，Int.J.Immunol.，91641-1650(1998)]。此外，也顯示了用抗原加帶有CpG序列的合成寡脫氧核苷酸免疫誘導(dǎo)通過IL-12產(chǎn)物刺激的Th1應(yīng)答[Chu，R.S.，et al.，J.Exp.Med.，1861623-1631(1997)]。因此，IL-12給藥是一種用于刺激人類新生兒免疫系統(tǒng)的強烈與直接的方法。
新生動物通常對外源抗原顯示出弱響應(yīng)能力，并且已知顯示類Th2細(xì)胞因子的極化表達(dá)以及抗體反應(yīng)。如此處所述，新生小鼠對誘導(dǎo)Th1的細(xì)胞因子，即對IL-12的外周表達(dá)是不足的。對用IL-12在出生時進行免疫和治療來克服這種不足所進行的嘗試，使得和僅用抗原接毒的動物相比小鼠脾臟中的IFN-γ和IL-10mRNA水平提高了。此外，這樣的動物和用單獨抗原接觸的小鼠相比，在成年時進行攻擊則獲得了其成年個體的IgG2a和IgG2b抗體水平的顯著性的增強。IgG1抗體的水平，即Th2活性的大小，不受影響甚至通過新生兒IL-12治療被增強?？偟膩碚f，這些結(jié)果提供了第一證據(jù)，即IL-12給藥在新生兒中誘導(dǎo)了Th1類cytokine應(yīng)答，并且引起在體內(nèi)的對接觸抗原的增強了的應(yīng)答記憶。此處描述的發(fā)現(xiàn)證明了IL-12可被用作新生兒疫苗的佐劑來誘導(dǎo)產(chǎn)生抵抗普通兒童期病原體的保護。
因此，此處所描述的方法可被用于治療和/或預(yù)防在新生宿主中的與帶有一個或多個抗原的病原體相關(guān)的疾病。此處所描述的方法可利用有效量的IL-12，結(jié)合一個單一抗原，或從相同的病原體衍生的多個抗原，或從一種病原體的不同菌株或從不同的病原體中獲得的多個抗原，將它們結(jié)合起來使用。因此，IL-12和一種或多種抗原可被用來治療和/或預(yù)防與從其中獲得抗原的病原體相關(guān)的疾病。
本發(fā)明通過下面的實施例來舉例說明，這些實施例不以任何的方式限制本發(fā)明。
實施例實施例1IL-12是一種有效的疫苗佐劑材料與方法小鼠BALB/c小鼠從國家癌癥研究所(Bethesda，MD)獲得，4～6周齡，且在俄亥俄州醫(yī)學(xué)院飼養(yǎng)。食物和水充足提供。動物照料和實驗步驟都遵從于俄亥俄醫(yī)學(xué)院的公共動物照料和使用委員會(IACUC)的標(biāo)準(zhǔn)。
新生兒免疫步驟一天齡的小鼠被腹膜內(nèi)(i.p.)注射100μg DNA-OVA(Biosearch Technologies，San Raphael，CA)或100μg HEL。抗原在不完全Freund｀s佐劑中被乳化(IFA；Life Technologies，Gaithersburg，MD)通過Forsthuber等人的方法[Forsthuber et al.，Science，2711728-1730(1996)]，或與2 mg/ml的明礬混合(Rehydrogel Low Viscosity Gel，Reheis，Inc.，Berkeley Heights，NJ)并且總注射體積為25μl/小鼠。實驗小鼠在一天齡時被用1μg在含有1％正常BALB/c小鼠血清(PBS-NMS)PBS中稀釋的重組鼠IL-12來腹膜內(nèi)注射；對照小鼠僅接受PBS-NMS。小鼠被允許長到成年期，然后在5-6周齡時，它們被用乳化在完全Freund｀s佐劑(CFA；Gibco-BRL)或明礬中的相同抗原量加強。小鼠被以一周的間隔從后orbital帕尼扎氏叢取血。在子宮內(nèi)治療的情況下，在分娩前大約7天時，懷孕的小鼠被皮下注射在明礬中+/-IL-12的相同量的抗原。
RNA分離3天齡小鼠的速凍的脾臟，肝臟，以及胸腺中總RNA的分離用Trizol試劑(Gibco-BRL Gaithersburg，MA)依據(jù)制造商的說明書來進行。簡言之，冰凍的組織被用研缽和研棒勻漿，并立即轉(zhuǎn)入含有1ml Trizol試劑的聚苯乙烯管。勻漿的樣品在室溫下培養(yǎng)5分鐘使得核蛋白復(fù)合物分離并在12000g，4℃下離心10分鐘。上清液然后與0.2ml的氯仿混合15秒，在冰中培養(yǎng)15分鐘，12000g，4℃下離心15分鐘，離心后，液相中的RNA通過在-20℃加入1.0ml的異丙醇被沉淀，樣品以12，000g離心15分鐘，并且RNA顆粒用1.0ml 75％乙醇洗滌兩次。顆粒在空氣中干燥2-5分鐘，溶解在DEPC處理的水中，并保存在-80℃。總RNA的濃度通過用于單鏈RNA的A260值來計算(1A260單位=40μg的單鏈RNA/ml)?？俁NA的終濃度的260/280比率為1.7-2.0。
第一條cDNA鏈的合成第一條cDNA鏈的合成是依據(jù)制造商的說明書(Gibco-BRL)來進行的。簡言之，1μg的o1igo(dT)，3μg的總RNA，以及用DEPC處理的無菌水被加至eppendoff管至終體積為11μl?；旌衔镌?0℃溫浴10分鐘，然后在冰中冷卻。隨后，依次添加下列組分4.0μl的5X第一鏈緩沖液，2μl的0.1M DTT，1μl的dNTP混合物(dATP，dGTP，dCTP，和dTTP各10mM)。試管的內(nèi)容物被輕輕地混合并溫浴在42℃下2分鐘，接著加入1μl(200U)的Supersciript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)。反應(yīng)混合物輕輕地混合并溫浴在42℃1小時。通過70℃溫浴15分鐘終止反應(yīng)。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)50μl的反應(yīng)混合物是在無菌的eppendorf管中加入下列成分來制備的31.3μl的DEPC處理的水，10.0μl 5X的Tris-HCl緩沖液(對每套引物確定其最佳鎂含量和pH)，2μl第一鏈合成的cDNA，2μl引物(原液濃度為20μm)，5.0μl的dNTP混合物(2.5mM dATP，2.5mM dCTP，2.5mM dGTP，和2.5mMdTTP，pH8.0)(Invitrogen Corporation)，以及0.5μl(2.5U)的Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)。管被置入Pericin Elmer ThermalCycler 480的反應(yīng)池中(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)，95℃溫浴5分鐘，然后繼續(xù)下面的擴增方案95℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘，持續(xù)35個循環(huán)。接著72℃溫浴10分鐘，然后在4℃浸泡一個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2.5％瓊脂糖凝膠上分離并用EB進行染色。用UV透照法觀察并拍照條帶。次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPRT)被用作一種常用對照以確保所有的梯度上相等的RNA的加樣量，以及一個100 bp DNA梯度(Gibco-BRL)被用作一個分子量標(biāo)記。
引物序列HPRT5′GTT GGA TAC AGG CCA GAC TTT GTT G3′(SEQ ID NO1)5′GAT TCA ACT TGC GCT CAT CTT AGG C3′(SEQ IDNO2)IL-45′GTT GTC ATC CTG CTC TTC TTT 3′(SEQ ID NO3)
5′CTC TCT GTG GTG TTC TTC GTT 3′(SEQ ID NO 4)IL-55′GAC AAG CAA TGA GAC GAT GAG 3′(SEQ ID NO 5)5′GTT ATC CTT GGC TAC ATT ACC 3′(SEQ ID NO6)IL-105′ATG CAG GAC TTT AAG GGT TAC TTG GGT T3′(SEQ IDNO7)5′ATT TCG GAG AGA GGT ACA AAC GAG GTT T3′(SEQID NO8)IL-12p405′CTC ACA TCT GCT GCT CCA CAA 3′(SEQ ID NO9)5′CTC CTT CAT CTT TTC TTT CTT 3′(SEQ ID NO10)IFN-γ5′TGA ACG CTA CAC ACT GCA TCT TGG 3′(SEQ ID NO11)5′CGA CTC CTT TTC CGC TTC CTG AG 3′(SEQ ID NO12)抗體和同型的水平通過ELISA方法的檢測抗-DNP和抗-HEL抗體水平通過所述的特異性同型ELISA被檢測[Buchanan，J.M.et.Al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)和Metzger，D.W.et.al.，Eur.J.Immunol.，271958-1965(1997)]。簡言之，微量滴定板(Nalge Nunc International，Rochester，NY)用10μg/ml DNP-牛血清白蛋白(BSA)或100μg/ml帶HEL的PBS過夜包被。滴定板用含0.1％(W/V)明膠以及0.05％(V/V)吐溫20的PBS沖洗。加入系列稀釋的血清，滴定板在室溫下培養(yǎng)2個小時。滴定板再次沖洗，用山羊抗-鼠IgG1、IgG2a或IgG2b偶聯(lián)堿性磷酸鹽共培養(yǎng)1小時(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)。沖洗滴定板，并且加入ρ-硝基酚磷酸鹽底物獲得最佳色層。在405nm波長下用ELISA微板讀數(shù)儀讀數(shù)(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)?？?HEL抗體用除板被包被100μg/ml的HEL不同的類似的方式檢測[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]。在所有的情況下，適當(dāng)?shù)墓ぷ飨♂屢约岸慰贵w偶合物的同型特異性都利用已知同型的純化骨髓瘤蛋白來檢測(Sigma，St.Louis，MO)。本方法中的特異性抗原是由PBS包被的滴定板來制備的。統(tǒng)計分析利用Mann-Whitney U試驗來進行的。如果p＜0.05則認(rèn)為數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的。
結(jié)果新生小鼠在脾臟中的IL-12的表達(dá)是不充分的利用RT-PCR法來進行在兩天前用DNP-OVA免疫的三天齡和成年小鼠IL-12 p40 mRNA的檢測。只接受PBS-NMS，只接受抗原或加入IL-12的抗原的新生小鼠被發(fā)現(xiàn)在脾臟中都缺乏IL-12 p40 mRNA的表達(dá)。相反，只接受PBS-NMS或只接受抗原的成年小鼠在脾臟中確實表達(dá)了IL-12 p40 mRNA，并且通過IL-2處理被進一步加強。
與上述得到的結(jié)果相比，未免疫的新生小鼠和接觸抗原的新生小鼠的胸腺中都顯著地表達(dá)了IL-12 p40 mRNA。此外，在接種IL-12后的胸腺中IL-12 p40 mRNA的表達(dá)顯著加強了。免疫的成年小鼠在胸腺中以同樣的方式顯示了IL-12表達(dá)的相似模式。同時HPRT mRNA的擴增證實每一次RT-PCR反應(yīng)利用了相同量的RNA。這些結(jié)果表明，盡管新生兒能夠在胸腺這種主要的淋巴器官中表達(dá)IL-12，但是在周邊淋巴器官中卻不能表達(dá)IL-12。
IL-12在新生小鼠中誘導(dǎo)類Th1細(xì)胞因子反應(yīng)為了進一步鑒定新生兒免疫反應(yīng)的特異性，在接觸DNP-OVA或HEL后，IFN-γ以及IL-10 mRNA的表達(dá)被檢測。發(fā)現(xiàn)接受了PBS-NMS或抗原的小鼠在其脾臟中并沒有表達(dá)可測的IFN-γ或IL-10 mRNA的水平。然而，用DNP-OVA或HEL免疫的同時用IL-12處理的小鼠的確表現(xiàn)出顯著地誘導(dǎo)IFN-γ以及IL-10 mRNA的表達(dá)。已知通過IL-12處理在成年小鼠中IFN-γ和IL-10被誘導(dǎo)產(chǎn)生[Gerosa，F(xiàn).，et al.，J.Exp.Med.，1832559-2569(1996)；Sher，A.，et al.，Ann.NY Acad.Sci.，795202-207(1996)]，并且在實驗中對成年小鼠脾臟mRNA的分析得到預(yù)料的結(jié)果。尤其地，與新生小鼠比較，只用抗原處理的成年小鼠的確在脾臟中誘導(dǎo)了低水平但可檢測的IFN-γmRNA。這些結(jié)果表明新生小鼠中IL-12以與成年小鼠中可觀察的相同的方式調(diào)節(jié)抗原推動的細(xì)胞因子的反應(yīng)，結(jié)果顯著加強了IFN-γ以及IL-10 mRNA的表達(dá)。
在出生時用抗原和IL-12接觸的小鼠顯示出類Th1血清抗體反應(yīng)IL-12對B細(xì)胞的接觸作用通過用帶有抗原的CFA加強免疫在新生時期處理過的成年小鼠并通過特異性ELISA檢測抗體的水平被測得。在出生時用DNP-OVA免疫并用同源抗原在成年期加強免疫的小鼠與只在成年期接觸抗原的動物比較顯示出IgG1、IgG2a和IgG2b抗體水平的提高(圖1A-1C)。因此，新生期DNP-OVA免疫導(dǎo)致小鼠的接觸抗原增強了抗-DNP抗體對于成年時攻擊的應(yīng)答，這個結(jié)果肯定了Forsthuber等人[ForsthuberT.et al.，Science，2711728-1730(1996)]的結(jié)果。出生時用抗原加IL-12處理的動物顯示出相對于只用抗原免疫的小鼠對成年時攻擊其抗體水平顯著地加強了。然而用抗原和IL-12接種的小鼠和只用抗原(對照組)接種的小鼠之間的IgG1抗體的水平?jīng)]有區(qū)別。
這些結(jié)果通過使用另一個模型抗原，即HEL而被證實，HEL在成年小鼠中通常誘導(dǎo)通過IL-12給藥可被顯著改變的IgG限制性同型反應(yīng)[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]。用HEL攻擊的在其出生時并未免疫的成年小鼠顯示出低水平的IgG1應(yīng)答，該應(yīng)答可以通過在新時期免疫而被加強(圖1D-1F)。同前面的工作一樣，兩種情況下產(chǎn)生的IgG2a或IgG2b很少[Buchanan，J.M.，et a1.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]。然而，在出生時用HEL和IL-12接觸抗原的三個小鼠中的兩個對成年攻擊顯示出強烈的IgG2a和IgG2b抗體應(yīng)答。進一步，用IL-12處理的小鼠其IgG1的抗體量增加，再一次與前面的發(fā)現(xiàn)一致，即經(jīng)過最初的抑制期IL-12可以加強成年小鼠IgG1抗體的水平[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)；Metzger，D.W.，et al.，Ann.N.Y Acad.Sci.，79510～115(1996)]。用DNP-OVA或HEL免疫后，IgG3血清抗體水平檢測不到。
由于Freund｀s佐劑是高度炎癥性的并且限制于動物應(yīng)用，利用DNP-OVA在鉀鋁明礬中沉淀制備出一種人用的已被許可的佐劑的實驗被實施。在用IFA免疫后利用明礬得到的結(jié)果進一步證實前面的結(jié)果(圖2A-2C)。用抗原加IL-12處理的動物與只用抗原免疫的小鼠相比顯示出更顯著的IgG2a和IgG2b的水平。另外，相對于僅用抗原免疫的小鼠，IL-12處理的小鼠中IgG1抗體的水平得到了加強。
子宮內(nèi)DNP-OVA+/-IL-12免疫后IL-12對血清抗-DNP水平的影響懷孕的小鼠用明礬中的DNP-OVA加IL-12，DNP-OVA加PBS載體，或單獨的PBS載體皮下注射。出生的小鼠在9-10周齡時用明礬中的DNP-OVA攻擊并在7天后通過ELISA來檢測血清中的抗-DNP抗體。參見圖3A-3B。結(jié)果顯示出新生的小鼠相對于用DNP-OVA加IL-12處理的母鼠IgG2a抗-DNP抗體水平顯著增加。如果說對IgG1抗體的水平有影響也是很小的。
因此，IL-12對新生兒與成年個體的體液免疫的影響是相似地。此處所述的發(fā)現(xiàn)表明，出生時給藥IL-12能夠誘導(dǎo)強烈的Th1型細(xì)胞因子和抗體對T細(xì)胞依賴的抗原的反應(yīng)。由于新生兒對多種疫苗抗原的反應(yīng)趨向于Th2方式[Forsthuber，T.，et al.，Science，2711728-1730(1996)；Adkins，B.，et al.，J.Immunol.，1533378-3385(1994)；Coutinho，G.，et al.，Eur.J.Immunol.，241858-1862(1994)；Early，E.M.，et al.，Eur.J.Immunol.，262885-2889(1996)；Barrios，C.，et al.，Eur.J.Immunol.，261489-1496(1996)；Kobayashi，M.，et al.，J.Exp.Med.，170827-845(1989)]，在幼兒免疫期給藥的IL-12為一種有效的佐劑。
在新生小鼠的脾臟中表達(dá)IFN-γ和IL-10 mRNA在1天齡時用明礬中的HANA加IL-12或PBS載體腹腔內(nèi)注射新生小鼠。對照小鼠只接受沒有抗原的PBS載體。處理兩天后，小鼠被處死，并且從3-4池的新生小鼠脾臟中分離總RNA。通過RT-PCR測定IFN-γ(459 bp)，IL-10(455 bp)和HPRT(162 bp)的表達(dá)。
新生和成年小鼠脾臟和胸腺中IL-12 p40 mRNA的表達(dá)在1天齡時用明礬中的HANA加IL-12或PBS載體腹腔內(nèi)注射新生小鼠。對照小鼠只接受沒有抗原的PBS載體。處理兩天后，小鼠被處死，并且從3-4池的新生小鼠脾臟和胸腺中分離總RNA。通過RT-PCR測定IL-12 p40(525 bp)和HPRT(162 bp)和HPRT(162 bp)的表達(dá)。
新生小鼠接種HANA+\-IL-12后，IL-12對血清中來源于流感病毒(HANA)的抗-純化的血球凝集素以及神經(jīng)氨酸苷酶的影響新生小鼠接種HANA+\-IL-12后IL-12對血清抗-HANA水平的影響被檢測。小鼠在1天齡時用明礬中的HANA加IL-12，明礬中的HANA加PBS載體，或單獨的PBS載體注射。所有的小鼠在5-6周齡時用明礬中的HANA攻擊并在7天后通過ELISA來檢測血清中的抗-HANA抗體。參見圖4A-4B。
實施例2新生兒給藥白介素-12增強了抗病毒疫苗的保護效力材料和方法小鼠BALB/c小鼠從國家癌癥研究所(Bethesda，MD)獲得，4～6周齡且飼養(yǎng)在俄亥俄州醫(yī)學(xué)院。食物和水充分提供。動物照料和實驗步驟遵從于俄亥俄醫(yī)學(xué)院的公共動物照料和使用委員會(IACUC)的標(biāo)準(zhǔn)。
新生兒免疫步驟一天齡的小鼠被腹腔內(nèi)注射1μg的亞流感病毒，其中亞流感病毒含有由Dons Bucher博士提供的(Dr.Dons Bucher，NewYork Medical College，New York，NY)流感病毒A/PR8/34純化得到的可溶性血球凝集素亞型1(H1)和神經(jīng)氨酸苷酶亞型1(N1)?？乖c100μg的明礬混合(Rehydrogel Low Viscosity Gel，ReheisInc.，Berkeley Heights，NJ)。第一天時，對實驗小鼠腹腔內(nèi)注射1μg在含有1％正常BALB/c小鼠血清(PBS-NMS)的PBS中稀釋的重組鼠IL-12；對照小鼠僅接受PBS-NMS。小鼠被允許長到成年期然后在5-6周齡時，它們被用混合在明礬中的相同量的抗原加強。用該處理方法沒有觀察到毒性。在加強后7天通過眼眶取血制備小鼠的血清。
RNA分離和RT-PCR通過制造商的說明書利用Ambion總RNA分離試劑盒(Austin，TX)從速凍的脾臟分離總RNA。扼要地，冰凍的組織被用研缽和研棒勻漿，并立即轉(zhuǎn)入含有1.0ml變性溶液的管中。通過酚-氯仿抽提，勻漿的樣品在在10000g，4℃下離心10分鐘。上清液進行另一個酚-氯仿抽提并且得到的RNA用異丙醇沉淀，用75％乙醇洗滌兩次并溶解于DEPC處理的水中。
通過分光光度分析在260 nm下檢測總RNA的濃度。3微克的總RNA被通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies，Gaithersburg，MD)用oligo(dT)16-18引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用IFN-γ和IL-10特異性引物擴增cDNA，以次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPRT)引物做為對照。正義引物和反義引物具有如下的序列
IFN-γ5′-TGAACGCTACACACTGCATCTTGG-3′(SEQ ID NO11)，5′-CGACTCCTTTTCCGCTTCCT-GAG-3′(SEQ ID NO12)；IL-105′-ATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTT-3′(SEQ ID NO7)，5′-ATTTCGGAGAGAGGTACAAACGAGGTT-3′(SEQ IDNO8)；HPRT5′-GTTGGATACAG-GCCAGACTTTGTT-3′(SEQ IDNO1)，5′-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3′(SEQ ID NO2).
通過混合2μl的cDNA，0.25 mM dNTPs(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)，0.8μM 引物與2.5U的Taq DNA聚合酶(Life Technologies)，加入60 mM Tris-HCI(pH8.5)，15 mM(NH4)2SO4，0.4 mM MgCl2，直至終體積為50μl來進行PCR擴增?；旌衔餃卦≡?5℃5分鐘，然后進行下列的擴增方案95℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘，持續(xù)35個循環(huán)。接著72℃溫浴10分鐘。PCR產(chǎn)物在2.5％瓊脂糖凝膠上分離并用EB進行染色。用UV透照法觀察。核糖核酸酶保護的檢測細(xì)胞因子mRNA的水平通過利用RiboQuant多探針核糖核酸酶保護測定系統(tǒng)(Pharmingen，San Diego，CA)依據(jù)制造商的說明書來檢測。簡言之，10μg的總RNA與32p標(biāo)記的RNA探針雜交56℃過夜。核苷酸用核糖核酸酶處理30℃45分鐘以降解單鏈RNA，并且剩下的核苷酸進行酚-氯仿抽提并且溶解在6％的變性聚丙烯酰胺凝膠中。轉(zhuǎn)錄水平利用Storm 840PhosphorImager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)進行定量測定?？俁NA被標(biāo)準(zhǔn)化為管家基因甘油醛3-磷酸脫氫酶并且相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平以任意值表達(dá)?？贵w和同型水平通過ELISA的檢測通過經(jīng)微小修改的ELISA[Buchanan，J.M.，et a1.，Int.Immuno1.，7159(1995)；Buchanan，R.M.，J.Immunol.，1615525(1998)]檢測血清中抗H1N1的水平。簡言之，微量滴定板(NalgeNunc International，Rochester，NY)用PBS中的1μg/ml H1N1過夜包被。用含有0.3％Brij-35(Sigma，St.Louis，MO)的PBS沖洗并在室溫下用含5％的胎牛血清{Hyclone實驗室，Logan，UT)以及0.1％的Brij-35的PBS阻遏1小時。加入血清的系列稀釋液且滴定板在室溫下培養(yǎng)2個小時。滴定板再次沖洗，用山羊抗-鼠所有的Ig、IgM、IgG1或IgG2偶聯(lián)堿性磷酸鹽(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)培養(yǎng)。共培養(yǎng)1小時后，沖洗滴定板，并且加入ρ-硝基酚磷酸鹽底物獲得色層。在405 nm波長下用ELISA微板讀數(shù)儀讀數(shù)(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)。在所有的情況下，適當(dāng)?shù)墓ぷ飨♂屢约岸慰贵w偶合物的同型特異性都利用已知同型的純化骨髓瘤蛋白來檢測(Sigma，St.Louis，MO)。統(tǒng)計分析利用Mann-Whitney U試驗來進行的。如果p＜0.05則認(rèn)為數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的。
病毒攻擊為了研究保護，一天齡的小鼠用1μg的混合了明礬的H1N1亞病毒疫苗接種免疫。小鼠也接受1μg的在PBS-NMS中的IL-12或單獨的PBS-NMS。一些小鼠僅接受PBS-NMS(無H1N1亞疫苗)。在最初的免疫后大約4-5周后，利用40μl的無菌PBS中的傳染性A/PR8/34流感病毒(由Dr.Doris Bucher提供)對產(chǎn)期內(nèi)被麻醉的小鼠給藥進行病毒攻擊。每天對小鼠進行稱重并監(jiān)測發(fā)病率和死亡率。
血清的被動轉(zhuǎn)移在被動轉(zhuǎn)移實驗中，血清從在出生時僅用PBS-NMS，疫苗或疫苗加IL-12接觸抗原的成年小鼠中獲得。正常的成年受體用100μl的1∶5稀釋的混合血清注射而后用傳染性流感病毒鼻內(nèi)攻擊6小時。
結(jié)果HIN1亞疫苗加IL-12對新生小鼠給藥加強Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)IL-12對免疫系統(tǒng)有很強的作用，通過其優(yōu)先激活Th1和NK細(xì)胞的能力，并且誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生[Trinchieri，G.，and Scott，P.，Res.Immunol.，146423(1995)and Gately，M.K.，et al.，Annu.Rev.Immunol.，16495-521(1998)]。為了檢測疫苗和IL-12給藥對新生小鼠的影響，在兩天前用HIN1亞疫苗混合凝膠免疫的3天齡小鼠的脾臟的細(xì)胞因子的基因表達(dá)被檢測。新生小鼠脾臟的IFN-γ和IL-10的mRNA的表達(dá)。新生小鼠在1天齡時用明礬的HIN1加IL-12或PBS載體注射。對照小鼠只接受不帶抗原的PBS載體。處理后兩天小鼠被處死并且從3-4池新生小鼠的脾臟中分離總RNA。用RT-PCR檢測IFN-γ(459 bp)，IL-10(455 bp)以及HPRT(162 bp)的表達(dá)。
發(fā)現(xiàn)出生后24小時接觸PBS-NMS或抗原的新生小鼠并不表達(dá)相當(dāng)水平的脾臟IFN-γmRNA。然而用HIN1亞疫苗接觸免疫同時用IL-12處理的新生小鼠表現(xiàn)出顯著誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)。
在實施例1中，已知通過IL-12處理在新生小鼠和成年小鼠中被誘導(dǎo)的IL-10的表達(dá)被檢測[Gerosa，F(xiàn).，et al.，J.Exp.Med.，1832559(1996)；Sher，A.，et al.，Ann.NY Acad.Sci.，795202(1996)]。新鮮脾臟mRNA的分析顯示，只接受疫苗或只接受PBS的動物中沒有IL-10的表達(dá)。而用IL-12處理的動物脾內(nèi)的IL-10mRNA明顯增加。HPRT mRNA的同時擴增確保了在所有RT-PCR中使用了相同量的核酸。
為了定量和進一步檢測用流感疫苗初次免疫后細(xì)胞因子的特性，通過多核苷酸酶保護實驗來測定細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。給第一天的新生小鼠皮內(nèi)注射H1N1混合明礬加IL-12，或者PBS賦形劑。對照小鼠只給予不含抗原的PBS賦形劑。給藥兩天后處死小鼠，從3-4個新鮮的脾臟中提取總RNA并通過多核苷酸酶保護實驗進行分析。在6％的聚丙烯酰胺凝膠上分離被保護的mRNA，通過放射自顯影來顯像。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)在出生時給予H1N1加IL-12的動物比只給予疫苗的動物IFN-γmRNA水平增加25倍。而且，給予IL-12后IL-10mRNA水平增加50倍。同時給予流感疫苗和IL-12能夠使IL-10mRNA水平增加15倍。新生動物接種后未檢測到其他細(xì)胞因子比如IL-4或IL-5的明顯表達(dá)。出生時注射HIN1亞單位疫苗和IL-12的小鼠會產(chǎn)生Th1類的血清抗體反應(yīng)此前已經(jīng)證明腹腔內(nèi)注射IL-12能夠改變雞溶解酵素受同型體限制的抗體反應(yīng)[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519(1995)and Metzger，D.W.，et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，795100(1996)]。如實施例1中所敘述的，給予新生動物IL-12能夠增強DNP半抗原和溶解酵素的血清抗體水平。該實施例也表明，給予新生動物IL-12對于抗HIN1抗體的表達(dá)具有同樣的效果。在出生時用H1N1免疫的動物在成年時用同種抗原加強免疫后，比只在成年時施以抗原的動物顯示出抗HIN1血清抗體滴度的明顯增加(圖5A-5B)。實施例1中，在出生時用疫苗處理的小鼠的IgM、IgG和IgG2a的水平都有明顯的增加，驗證了模式蛋白和半抗原載體系統(tǒng)的的結(jié)果。重要的是，在出生時用H1N1加IL-12處理，會使在成年時用抗原處理后IgG2a的水平有更明顯的增加。然而，在出生時接種H1N1和IL-12，與那些只接種H1N1的小鼠的IgM及IgG1抗體水平?jīng)]有明顯的差別。在所有動物的血清中都沒有檢測到IgA。在出生時給予IL-12能夠增加流感亞單位接種的保護性作用在出生時同時給予H1N1和IL-12對于用流感病毒感染后存活率和臨床效果的影響，將通過給予一天齡的小鼠HIN1疫苗和12μgIL-12或者PBS賦形劑作進一步的評定。免疫5周后，小鼠鼻內(nèi)接種A/PR8/34流感病毒，然后每天檢測感染率和死亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只在出生時用PBS-NMS(不含HIN1亞單位疫苗)處理的小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的體重減輕并在病毒感染的13天內(nèi)死亡(圖6A-6B)。
在出生時只接種H1N1的小鼠具有55％的存活率。然而，在新生動物免疫時加入IL-12的會產(chǎn)生100％的存活率。通過體重的恢復(fù)來證明存活小鼠的感染恢復(fù)。因此，將IL-12結(jié)合到免疫療法中能夠提高疫苗的效果并且對隨后的流感病毒感染產(chǎn)生明顯的保護作用。在出生時接種H1N1和IL-12后的所增加的抗流感感染的保護作用是由抗體介導(dǎo)的為了確定在接種H1N1和IL-12的新生小鼠中所觀察到的抗流感病毒的保護作用是血清抗體來介導(dǎo)的，將從這些小鼠中所收集的血清轉(zhuǎn)移到未感染小鼠的體內(nèi)，然后用A/PR8/34流感病毒感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)接受從在出生時只用疫苗免疫的小鼠的血清的動物表現(xiàn)出60％的存活率，而除了一只以外所有的接受從用IL-12處理的小鼠的血清的動物都從病毒感染中存活過來。
表用流感亞單位疫苗免疫的新生小鼠脾的細(xì)胞因子mRNA水平*

*用明礬中的H1N1加上IL-12或者PBS賦形劑皮下注射的一天齡小鼠。對照小鼠只給予不含抗原的PBS賦形劑。給藥兩天后處死小鼠，從3-4個收集的新生小鼠脾中分離總RNA并用多核苷酸酶保護實驗進行分析。在磷酸鹽測定儀上測定RNA的相對水平，并使之符合甘油醛-3-磷酸脫氫酶的規(guī)格。細(xì)胞因子的mRNA水平用arbritary單位來表示。
討論新生兒和幼兒有很高的遭受感染的危險，缺乏一種合適的可以安全施予嬰兒并激發(fā)強烈的Th1類免疫反應(yīng)的抗病毒疫苗佐劑。如本專利所述，在出生時同時給予IL-12和流感亞單位疫苗會誘導(dǎo)Th1類細(xì)胞因子增加，使動物提高IgGa抗體反應(yīng)，增加以后在成年時抗病毒感染的保護作用。
具體地，在出生時注射流感亞單位疫苗和IL-12并在成年時只用疫苗免疫的小鼠，比起在出生時只用疫苗免疫的小鼠，血清IgGa抗體的滴度具有明顯的增加。實施例1中敘述的發(fā)現(xiàn)顯示出在出生時給予IL-12能夠明顯增加B細(xì)胞對模式T-依賴型抗原的記憶反應(yīng)，這些結(jié)果證實并擴展到臨床相關(guān)的抗原。如實施例1所敘述的，在出生時給予動物IL-12和蛋白或半抗原載體，并在成年后只用抗原加強，比只注射抗原的動物顯示出IgG1、IgG2a和IG2b抗體水平的增加。
本發(fā)明描述的一個主要的發(fā)現(xiàn)是，在出生時同時給予IL-12和流感亞單位疫苗提高了疫苗的保護作用，顯示為在流感病毒感染后存活率提高。例如IL-12介導(dǎo)的保護可以通過血清向未感染動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移，表明了這種保護作用是由抗體介導(dǎo)的。應(yīng)相信，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫作用對于病毒感染的恢復(fù)是重要的，而體液反應(yīng)在防止病毒感染中起到中樞作用[Palladino，G.K.，et al.，J.Virol，692075(1995)]。盡管如此，有幾組B細(xì)胞在小鼠從流感病毒感染的恢復(fù)中也發(fā)揮了重要作用[Graham，M.B.，and Braciale，T.J.，J.Exp.Med.，1862063(1997)；Mozdzanowska，K.，et al.，Virol，239217(1997)；Gerhard，W.K，et al.，Immunol.Rev.，15995-103(1997)and Topham，D.J.and Doherty，P.C.，J.Virol.，72882(1998)]。IL-12增加保護性新生動物B細(xì)胞記憶的能力顯示出IL-12能夠用作很有效的疫苗佐劑。等同物盡管通過相關(guān)的優(yōu)選實施方案具體展示和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，其中的形式和細(xì)節(jié)可以作不同的改變而不偏離本申請權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明的內(nèi)涵和范圍。僅僅使用常規(guī)的實驗方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以辨認(rèn)或者能夠確定本發(fā)明中描述的具體實施方案的同等物。這些等同物已經(jīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種誘導(dǎo)在新生動物宿主中誘導(dǎo)對病原的免疫反應(yīng)的方法，包括給藥新生動物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的抗原選自細(xì)菌，病毒，寄生物，真菌和酵母。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的細(xì)菌選自；芽孢桿菌屬(bacillus)，B群鏈球菌(Group B streptococcus)，博代菌屬(Bordetella)，李斯特菌屬(Listeria)，Bacillus anthaacis，肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)，腦炎病菌(N.Meningiditis)和流感病毒(H.Influenza)。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的免疫應(yīng)答是細(xì)胞因子反應(yīng)。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中的細(xì)胞因子反應(yīng)導(dǎo)致干擾素-γ和白介素-10的增強表達(dá)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的免疫反應(yīng)是體液反應(yīng)。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的體液反應(yīng)導(dǎo)致宿主IgG1、IgG2a和IgG2b抗體水平的增強表達(dá)。
8．一種在新生動物宿主中增強免疫反應(yīng)的方法，包括給藥新生動物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
9．權(quán)利要求8的方法，其中的抗原選自細(xì)菌，病毒，寄生物，真菌和酵母。
10．權(quán)利要求9的方法，其中的細(xì)菌選自；芽孢桿菌屬(bacillus)，B群鏈球菌(Group B streptococcus)，博代菌屬(Bordetella)，李斯特菌屬(Listeria)；Bacillus anthaacis，肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)，腦炎病菌(N.Meningiditis)和流感病毒(H.Influenza)。
11．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的免疫反應(yīng)是細(xì)胞因子反應(yīng)。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的細(xì)胞因子反應(yīng)導(dǎo)致干擾素-γ和白介素-10的增強表達(dá)。
13．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的免疫反應(yīng)是體液反應(yīng)。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中的體液反應(yīng)導(dǎo)致宿主IgG1、IgG2a和IgG2b抗體水平的增強表達(dá)。
15．一種在新生動物宿主中誘導(dǎo)對于抗原的細(xì)胞因子反應(yīng)的方法，包括給予新生動物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的抗原選自細(xì)菌，病毒，寄生物，真菌和酵母。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的細(xì)菌選自；芽孢桿菌屬(bacillus)，B群鏈球菌(Group B streptococcus)，博代菌屬(Bordetella)，李斯特菌屬(Listeria)，Bacillus anthaacis，肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)，腦炎病菌(N.Meningiditis)和流感病毒(H.Influenza)。
18．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的細(xì)胞因子反應(yīng)導(dǎo)致干擾素-γ和白介素-10的增強表達(dá)。
19．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，還包括體液免疫反應(yīng)。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中的體液反應(yīng)導(dǎo)致宿主IgG1，IgG2a and IgG2b抗體水平的增強表達(dá)。
21．一種對由于新生動物宿主接觸抗原而使干擾素-γ在新生動物宿主中的表達(dá)被抑制的克服方法，包括給予新生動物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的抗原選自蛋白質(zhì)，肽，糖蛋白，糖，脂質(zhì)，糖脂，半抗原化合物，重組DNA，整個有機體，毒素和有機分子。
23．一種在新生動物宿主中增強抵抗病原的細(xì)胞因子反應(yīng)的方法，包括給予新生動物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中的抗原選自細(xì)菌，病毒，寄生物，真菌和酵母。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的細(xì)菌選自；芽孢桿菌屬(bacillus)，B群鏈球菌(Group B streptococcus)，博代菌屬(Bordetella)，李斯特菌屬(Listeria)，Bacillus anthaacis，肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)，腦炎病菌(N.Meningiditis)和流感病毒(H.Influenza)。
26．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中干擾素-γ和白介素-10在宿主細(xì)胞中的表達(dá)增強。
27．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的病毒是流感病毒。
28．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的病毒是流感病毒。
29．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的病毒是流感病毒。
30．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的病毒是流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)產(chǎn)生抵抗新生兒宿主的病原體的類Th1應(yīng)答的方法,其包括給藥新生宿主有效量的IL－12和病原體的抗原。本發(fā)明也包括一種克服暴露于病原體或抗原的新生宿主中干擾素－γ(IFN－γ)表達(dá)抑制的方法,其包括給藥新生宿主有效量的IL－12和抗原。本發(fā)明也涉及一種增強細(xì)胞因子表達(dá)抵抗或在新生宿主中對病原體進行應(yīng)答的方法,其包括給藥新生宿主有效量的IL－12和病原體的抗原。
文檔編號A61P37/04GK1296415SQ99803680
公開日2001年5月23日 申請日期1999年3月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月5日
發(fā)明者丹尼斯·W·梅特澤杰, 伯納德·P·阿魯蘭達(dá)姆 申請人:俄亥俄醫(yī)學(xué)院