專利名稱：：肝炎治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及肝炎治療劑。在本說明書中，“I”表示肌苷酸，“C”表示胞苷酸，“A”表示腺苷酸，“U”表示尿苷酸。錯(cuò)配的poly(I)·poly(C)、錯(cuò)配的poly(A)·poly(U)是本領(lǐng)域公知的術(shù)語，表示在構(gòu)成雙鏈的核酸堿基中含有部分非互補(bǔ)的堿基的poly(I)·poly(C)、poly(A)·poly(U)。
背景技術(shù)：
：poly(I)·poly(C)是由聚肌苷酸聚胞苷酸組成的雙鏈RNA，是一種周知的具有干擾素誘導(dǎo)活性和免疫增強(qiáng)作用的藥物?，F(xiàn)有報(bào)道，干擾素自身對治療丙型肝炎有效(例如，肝膽膵，9(4)，p611(1984)、13(1)，p123(1986)、12(5)，p809(1986)、23(5)，p1065(1991))。但將可誘導(dǎo)干擾素的上述poly(I)·poly(C)用通常的方法給予以期治療肝炎，則從其誘導(dǎo)量的程度和毒性等考慮，被認(rèn)為是困難的。另一方面，已知有Lipofectin等通常稱作陽離子性脂質(zhì)體的藥物載體和以下述結(jié)構(gòu)式〔I〕的2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油?；视偷雀视脱苌锖土字|(zhì)為必需構(gòu)成成分而形成的藥物載體等(例如參見WO91／17424和WO94／19314)。上述陽離子性脂質(zhì)體被認(rèn)為是由脂質(zhì)雙分子膜組成的、在水溶液中帶正電荷的小囊泡。由于陽離子性脂質(zhì)體在水溶液中帶正電荷，而poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA在水溶液中帶負(fù)電荷，因此，可用通常的方法進(jìn)行分散處理，使陽離子性脂質(zhì)體和poly(I)·poly(C)等容易地形成復(fù)合體。上述藥物載體與poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA的復(fù)合體對治療肝炎等有效是迄今未知的。發(fā)明的公開本發(fā)明的目的是提供新的可有效治療或預(yù)防肝炎的藥劑。本發(fā)明者首先發(fā)現(xiàn)陽離子性脂質(zhì)體之類的藥物載體與poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA的復(fù)合體在肝臟和脾臟特異性地集聚，可長時(shí)間地誘導(dǎo)對治療肝炎等有效的干擾素，并由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個(gè)內(nèi)容是提供以含有陽離子性脂質(zhì)體與poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA的復(fù)合體(以下稱“本復(fù)合體”)為特征的肝炎治療劑或預(yù)防劑(以下稱“本發(fā)明制劑”)。下面對本發(fā)明作詳細(xì)說明。可用于本發(fā)明的“陽離子性脂質(zhì)體”的例子有Lipofectin、Lipofectamine、Lipofectace、DMRIE-C和WO94／19314中公開的藥物載體(如以上述化學(xué)式〔I〕的2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油?；视?以下稱“化合物A”)和磷脂質(zhì)為必需構(gòu)成成分而形成的藥物載體等)。在本發(fā)明中，較佳的陽離子性脂質(zhì)體的例子有以化合物A和磷脂質(zhì)為必需構(gòu)成成分而形成的藥物載體(以下稱該藥物載體為“本載體”)。可用于本發(fā)明的雙鏈RNA的例子有poly(I)poly(C)、錯(cuò)配的poly(I)poly(C)、poly(A)·poly(U)、錯(cuò)配的poly(A)·poly(U)。其中，以poly(I)·poly(C)為宜。對上述雙鏈RNA的鏈長無特別限定，但宜為50-2，000bp(bp堿基對)，較好地為100-500堿基對，更好地為200-400bp。若小于50bp，則有效性可能不足，而若大于2，000bp，則可能會(huì)有安全性問題。在本發(fā)明中，鏈長100-500bp被認(rèn)為能取得有效性和安全性的平衡。對于poly(I)·poly(C)，也是較好地為100-500bp，更好地為200-400bp。由于poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA通常是以由各種鏈長組成的一定的分布存在的，因此，上述各鏈長表示最大分布的堿基對數(shù)，在此是指“平均鏈長”。對本載體中的磷脂質(zhì)無特別限定，只要是藥用磷脂質(zhì)即可，其具體例子有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂和卵磷脂等。此外，還可使用氫化的磷脂質(zhì)。較佳的磷脂質(zhì)的例子有卵黃磷脂酰膽堿、卵黃卵磷脂、大豆卵磷脂和卵黃磷脂?？蓪⒍N以上的磷脂質(zhì)合用。作為與化合物A合用的磷脂質(zhì)，磷脂酰膽堿或卵磷脂優(yōu)于通常用于陽離子性磷脂質(zhì)的磷脂酰乙醇胺。在本發(fā)明的較佳實(shí)例中，本發(fā)明提供包含磷脂質(zhì)為卵磷脂的本載體與平均鏈長為100-500bp(尤其是200-400bp)的poly(I)·poly(C)的復(fù)合體的本發(fā)明藥劑。陽離子性脂質(zhì)體與雙鏈RNA的構(gòu)成比率根據(jù)陽離子性脂質(zhì)體和雙鏈RNA的種類和鏈長、肝炎的種類和程度等而異，但對于陽離子性脂質(zhì)體10重量份，雙鏈RNA宜為0．05-10重量份，較好地為0．1-4重量份，更好地為0．5-2重量份。本載體與poly(I)·poly(C)的構(gòu)成比率也同樣是，對于本載體10重量份，poly(I)·poly(C)宜為0．05-10重量份，較好地為0．1-4重量份，更好地為0．5-2重量份。在本載體中，化合物A與磷脂質(zhì)的構(gòu)成比率根據(jù)雙鏈RNA的種類和鏈長、用量及磷脂質(zhì)而異，但對于化合物A1重量份，磷脂質(zhì)宜為0．1-10重量份，較好地為0．5-5重量份，更好地為1-2重量份。本發(fā)明制劑例如可以是本復(fù)合體分散在水溶液中的液劑(注射劑、滴注劑等)或凍干制劑的形式。當(dāng)為液劑時(shí)，本復(fù)合體的濃度宜為0．001-25％(w／v)，較好地為0．01-5％(w／v)，更好地為0．1-1％(w／v)。本發(fā)明制劑可適量地含有任意的藥用添加劑，如乳化助劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、pH調(diào)節(jié)劑。具體地說，可含有6-22個(gè)碳原子的脂肪酸(如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸)或其藥用鹽(如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽)、白蛋白、葡聚糖等乳化助劑；膽甾醇、磷脂酸等穩(wěn)定劑；氯化鈉、甘油、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖等等滲劑；鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺等pH調(diào)節(jié)劑等。本發(fā)明制劑例如可用與脂質(zhì)體的通常制法相同的方法制造。例如，可通過將陽離子性脂質(zhì)體或其原料(例如，化合物A和磷脂質(zhì))和poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA在水溶液中分散處理而加以制造。水溶液可以是例如注射用水、注射用蒸餾水、生理鹽水等電解質(zhì)液、萄萄糖液等。分散處理使用適當(dāng)?shù)姆稚⑵?如均相混合器、勻漿器、超聲波分散器、超聲波勻漿器、高壓乳化分散器、Microfluidizer、Nanomizer、Ultimizer或Manton-Gaulin型高壓勻漿器)進(jìn)行。此外，該分散處理也可分成包括例如粗分散在內(nèi)的數(shù)階段進(jìn)行。在本發(fā)明中可直接使用市售的陽離子性脂質(zhì)體或者適當(dāng)加工后使用。用陽離子性脂質(zhì)體的原料制造本發(fā)明的制劑時(shí)，除可在該原料中加入poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA、一起分散處理之外，也可先將該原料分散處理，形成陽離子性脂質(zhì)體，然后加入poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA，再分散處理，制造本發(fā)明的制劑。任意的藥用添加劑可以在分散前、也可以在分散后以適當(dāng)?shù)牟襟E添加。然后，將經(jīng)過上述分散處理而得到的本發(fā)明制劑凍干處理，即可得到本發(fā)明的凍干制劑。凍干處理可用常法進(jìn)行。例如，將經(jīng)過上述分散處理而得到的本發(fā)明制劑滅菌后以規(guī)定量分注至管瓶中。在約-40℃至-20℃的條件下預(yù)冷凍約2小時(shí)，減壓下在約0-10℃一次干燥，然后減壓下在約15-25℃二次干燥，進(jìn)行凍干。并且，一般地用氮?dú)庵脫Q管瓶內(nèi)部，加塞，由此得到本發(fā)明的凍干制劑。本發(fā)明的凍干制劑一般可通過加入任意的適當(dāng)溶液(再溶解液)進(jìn)行再溶解后使用。所述再溶解液可以是注射用水、生理鹽水等電解質(zhì)液、葡萄糖液和其他一般輸液。對再溶解液的量無特別限定，根據(jù)用途等而異，但宜為凍干前的液量的0．5-2倍，或者在500mL以下。由于與單獨(dú)給予poly(I)·poly(C)等雙鏈RNA的情況相比，本發(fā)明制劑可在肝臟和脾臟中特異性地集聚，并長時(shí)間地大量誘導(dǎo)β-干擾素，因此，可有效地用于包括人在內(nèi)的動(dòng)物的肝炎的治療或預(yù)防。此外，包含磷脂質(zhì)為卵磷脂的本載體與平均鏈長為100-500bp(尤其是200-400bp)的poly(I)·poly(C)的復(fù)合體的本發(fā)明制劑由于在保持有效性的同時(shí)毒性極低，因此，特別優(yōu)異。本發(fā)明制劑例如可靜脈內(nèi)注射、經(jīng)粘膜給予或肝動(dòng)脈內(nèi)注射。本發(fā)明制劑的肝炎治療量根據(jù)雙鏈RNA和磷脂質(zhì)的種類、肝炎的種類和階段、患者年齡、動(dòng)物種差、給藥途徑、給藥方法等而異，但雙鏈RNA的給予量通常一次宜為1μg-50mg／人，較好地為10μg-10mg／人。poly(I)·poly(C)的給予量通常也一次宜為1μg-50mg／人，較好地為10μg-10mg／人。本發(fā)明制劑可每日1-3次，每日、隔日、每周、隔周進(jìn)行注射或滴注。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例和試驗(yàn)例對本發(fā)明作更詳細(xì)的說明。在各實(shí)施例和試驗(yàn)例中，本發(fā)明制劑的濃度均以制劑中的poly(I)·poly(C)的濃度表示。實(shí)施例1將化合物A2g和精制卵黃卵磷脂2g加入到溶解在100mL注射用水中的麥芽糖40g中，攪拌、混合，用勻漿器分散處理5分鐘，得到本載體的粗分散液。將該分散液再用實(shí)驗(yàn)用小型乳化分散器分散處理1小時(shí)，加入注射用水，使其達(dá)到250mL，回收本載體分散液。攪拌下往本載體分散液250mL中加入含有500mgpoly(I)·poly(C)(平均鏈長約200bp)的150mL水溶液，再用實(shí)驗(yàn)用小型乳化分散器分散處理1小時(shí)，得到本發(fā)明制劑。然后，將本發(fā)明制劑分注至管瓶中(每瓶1mL)，按常法制成凍干制劑。圖1表明，備試樣均濃度依存性地表達(dá)β-干擾素mRNA并誘導(dǎo)β-干擾素，但與僅poly(I)·poly(C)的制劑相比，本發(fā)明制劑的誘導(dǎo)效果更強(qiáng)。試驗(yàn)例2肝臟以外的臟器中的β-干擾素的誘導(dǎo)效果(invivo)按與試驗(yàn)例1相同的方法測定肝臟以外的臟器中的β-干擾素的mRNA表達(dá)量。結(jié)果見圖2。圖2表明，本發(fā)明制劑在腎臟、肺和腦中不表達(dá)β-干擾素mRNA，對β-干擾素?zé)o明顯的誘導(dǎo)效果。上述試驗(yàn)例1和2的結(jié)果顯示，單獨(dú)給予poly(I)·poly(C)，沒有臟器特異性，而本發(fā)明制劑在肝臟和脾臟中對β-干擾素有明顯的誘導(dǎo)效果。試驗(yàn)例3小鼠血清中的干擾素量(invivo)以雄性Balb／c小鼠(5周齡)為試驗(yàn)動(dòng)物，一組3只，在小鼠的靜脈內(nèi)注射本發(fā)明實(shí)施例4的制劑或注射僅poly(I)·poly(C)的制劑作為對照。3小時(shí)后采血得血清。根據(jù)病毒(VSV)感染所致L929細(xì)胞變性的抑制效果測定血清中的干擾素量。結(jié)果見表1。表1小鼠血清中的干擾素量<tablesid="table1"num="001"><table>給予量(μg／kg)干擾素量(IU／ml)對照＜3實(shí)施例4103010013±241±163±18僅poly(I)·poly(C)1030100＜35±218±6</table></tables>表1表明，在各試驗(yàn)組中，均劑量依存性地檢測出血清中的干擾素，但在本發(fā)明制劑組中，檢測出更多干擾素。本發(fā)明制劑的100μg／kg組在注射3小時(shí)后的干擾素量為63IU／ml，即使在注射24小時(shí)后，也達(dá)到30IU／ml。而根據(jù)報(bào)道，臨床上給人注射3×106IU的β-干擾素時(shí)，剛注射后的血中濃度為67IU／ml，45分鐘后就檢測不出了。因此，本試驗(yàn)的結(jié)果提示，本發(fā)明制劑在臨床上也能持續(xù)誘導(dǎo)足夠量的干擾素。試驗(yàn)例4毒性試驗(yàn)(1)單次給予后大鼠肝毒性的出現(xiàn)(急性毒性試驗(yàn))在8只6周齡的SD雄性大鼠的靜脈內(nèi)單次注射實(shí)施例4的本發(fā)明制劑，20小時(shí)后測定血清氨酰轉(zhuǎn)移酶濃度。結(jié)果，即使劑量達(dá)到5mg／kg，也未觀察到死亡例。劑量為5mg／kg時(shí)僅觀察到血清氨酰轉(zhuǎn)移酶濃度的略有上升。劑量為1mg／kg時(shí)，血清氨酰轉(zhuǎn)移酶濃度基本上未上升。(2)限于2周的大鼠亞急性毒性試驗(yàn)在6只SD雄性大鼠(6周齡)的靜脈內(nèi)連續(xù)14日注射本發(fā)明實(shí)施例4的制劑。結(jié)果，在1mg／kg以下劑量，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性癥狀。(3)抗原性試驗(yàn)用雄性豚鼠(hartley，5周齡)進(jìn)行本發(fā)明實(shí)施例4的制劑的抗原性試驗(yàn)。結(jié)果，在50μg／豚鼠的劑量，未發(fā)現(xiàn)抗原性。(4)簡易誘變性試驗(yàn)對本發(fā)明實(shí)施例4的制劑進(jìn)行了簡易回復(fù)突變試驗(yàn)和簡易染色體畸變試驗(yàn)。結(jié)果，在10μg／ml，未發(fā)現(xiàn)誘變性。圖面的簡單說明圖1表示小鼠肝臟中的β-干擾素mRNA的表達(dá)量。左端的1欄表示對照組。中央的3欄表示本發(fā)明實(shí)施例4的制劑的給予結(jié)果，從左依次是10μg／kg、30μg／kg和100μg／kg給予組。右端的3欄表示僅給予poly(I)·poly(C)的結(jié)果，從左依次是10μg／kg、30μg／kg和100μg／kg給予組?？v軸表示藥物給予組與對照組的β-干擾素mRNA表達(dá)量之比。圖2表示小鼠各臟器(從上依次是脾臟、腎臟、肺、腦)中的β-干擾素mRNA的表達(dá)量。各左端的1欄表示對照組。各中央的3欄表示本發(fā)明實(shí)施例4的制劑的給予結(jié)果，從左依次是10μg／kg、30μg／kg和100μg／kg給予組。各右端的3欄表示僅給予poly(I)·poly(C)的結(jié)果，從左依次是10μg／kg、30μg/kg和100μg/kg給予組。縱軸表示藥物給予組與對照組的β-干擾素mRNA表達(dá)量之比。權(quán)利要求1．肝炎治療劑或預(yù)防劑，其特征在于，它含有陽離子性脂質(zhì)體與選自poly(I)·poly(C)、錯(cuò)配的poly(I)·poly(C)、poly(A)·poly(U)和錯(cuò)配的poly(A)·poly(U)的雙鏈RNA的復(fù)合體。2．肝炎治療劑或預(yù)防劑，其特征在于，它含有以2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油酰基甘油和磷脂質(zhì)為必需構(gòu)成成分而形成的藥物載體與poly(I)·poly(C)或錯(cuò)配的poly(I)·poly(C)的雙鏈RNA的復(fù)合體。3．如權(quán)利要求2所述的肝炎治療劑或預(yù)防劑，其中，所述磷脂質(zhì)是卵磷脂。4．如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的肝炎治療劑或預(yù)防劑，其中，所述雙鏈RNA的平均鏈長為100-500bp。5．肝炎治療劑或預(yù)防劑，其特征在于，它含有以2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油酰基甘油和卵磷脂為必需構(gòu)成成分而形成的藥物載體與平均鏈長為100-500bp的poly(I)·poly(C)的復(fù)合體。全文摘要本發(fā)明的目的是提供可有效治療和預(yù)防肝炎的新的藥劑。本發(fā)明的肝炎治療劑或預(yù)防劑的特征在于,含有例如以2－O－(2－二乙基氨基乙基)氨基甲?；?,3－O－二油?；视秃土字|(zhì)為必需構(gòu)成成分而形成的藥物載體與poly(I)·poly(C)的復(fù)合體。文檔編號A61K47/48GK1294518SQ99804333公開日2001年5月9日申請日期1999年3月23日優(yōu)先權(quán)日1998年3月24日發(fā)明者平林加壽子,關(guān)純造申請人:日本新藥株式會(huì)社