專利名稱：一種包含il－6拮抗劑活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種包含白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。本發(fā)明還涉及一種包含IL-6拮抗劑活性成分的節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結腸炎的預防或治療劑。
IL-6通過細胞上兩種蛋白質(zhì)傳遞其生物學信號。其中一種是IL-6受體，其為分子量約為80kD的IL-6結合蛋白(Taga,T等人，實驗醫(yī)學雜志(1987)166,967-981;Yamasaki,K等人，科學(Science)(1987)241,825-828)。IL-6受體不僅以膜結合形式存在，具有表達于細胞表面的跨膜結構域，而且可以是主要包括胞外區(qū)的可溶性IL-6受體。
另外一種蛋白質(zhì)為分子量約130kD的膜結合蛋白gp130，它參與非配體結合的信號傳導。IL-6和IL-6受體形成IL-6/IL-6受體復合物，在與gp130結合之后傳遞其生物學信號給細胞(Taga,7等人，細胞(Cell)(1989)58,573-581)。
IL-6的拮抗劑是指抑制IL-6生物學活性傳導的物質(zhì)。到目前為止已知的IL-6拮抗劑有抗IL-6抗體(抗-IL-6抗體)、抗IL-6受體的抗體(抗-IL-6受體抗體)、抗gp130抗體(抗-gp130抗體)以及抗改構的IL-6、IL-6或IL-6受體的部分肽段的抗體等。
抗-IL-6受體的抗體已有幾篇報道描述(Novick D.等人，雜交瘤(Hybridoma)(1991)10,137-146;Huang,Y.W.等人，雜交瘤(1993)12,621-630；國際專利公開文本W(wǎng)O 95/)09673；法國專利申請FR 2694767；美國專利US 5216287)。已知人源化PM-1抗體可通過將小鼠PM-1抗體的互補決定區(qū)(CDR)(Hirata,Y等人，免疫學雜志(J.Immunology)(1989)143,2900-2906)移植到一種人模板抗體中獲得(國際專利公開文本W(wǎng)O 92-19759)。
炎性腸道疾病(IBD)是一種非特異的炎癥，表現(xiàn)為潰瘍性結腸炎和節(jié)段性回腸炎。在疾病初期已有免疫學紊亂介入，但這并不能闡明其病原學。然而可以認為，聚集在損害部位的單核細胞和淋巴細胞也參與了粘膜的損害，并且炎性介質(zhì)尤其是細胞因子(如IL1β、TNFα和IL-6)引起特別的關注。
由于IL-6屬于炎性介質(zhì)，因而它與疾病程度的關系或與是否可作為IBD的特異指數(shù)的關系已經(jīng)引起關注。在節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎病人中IL-6的血清水平均有增長，并且該水平與疾病的狀態(tài)有關(Holtkamp,W.等人，臨床胃腸病學雜志(J.Clin.Gastroenterology)(1995)20,1230126;Niederau,C.等人，肝-胃腸病學(Hepto-Gastroenterdogy)(1997)44,90-107)。以PCR(聚合酶鏈式反應)產(chǎn)物作為對組織中IL-6 mRNA含量的測定表明，其含量與潰瘍性結腸炎和節(jié)段性回腸炎的疾病程度密切相關(Stevens,C等人，Dig.Dis.Sci.(1992)37,818-826)。關于IBD活動期IL-6的增長，分析其機制發(fā)現(xiàn)，當固有層的單核細胞受到商陸細胞分裂原的刺激之后，其產(chǎn)量與疾病狀況有很好的相關性。(Reinecker,H-C等人，臨床實驗免疫學(Clin.Exp.Immunol.)(1993)94,174-181)。
隨后，在來自固有層的單核細胞培養(yǎng)物中以及病人粘膜的組織培養(yǎng)物中觀察到IL-6產(chǎn)量與疾病程度的相關性。在前者的觀察中還顯示出粘膜組織產(chǎn)生IL-6的細胞數(shù)目也有所增加。單核細胞中最重要的產(chǎn)IL-6的細胞為巨噬細胞，并且證實有大量的CD68陽性巨噬細胞在IBD病人活動期在固有層中大量產(chǎn)生IL-6(Kusugami,K.等人,Dig.Dis.Sci.(1995),40,949-959)。
此外還發(fā)現(xiàn)IL-6的產(chǎn)生與節(jié)段性回腸炎病人的內(nèi)窺鏡觀察相關(Reinund,J.-M.等人，腸道(Gut)(1996)39,684-689)。此外，還有一些報道血清中不僅IL-6而且可溶性IL-6受體的濃度與疾病程度密切相關(Mitsuyma,K等人，腸道(1995)36,45-49)。
至于除了IL-6的其它炎性介質(zhì)，IL-1β的產(chǎn)量也已知與疾病狀況相關。另一方面，這并不總是正確，因為TNF-α可能在疾病處于低活性時產(chǎn)量往往較高。(Reinecker,H.-C等人，臨床實驗免疫學(1993)94,174-181;Reimund,J.-M.等人，腸道(1996)39,684-639)。
當今治療IBD的方法包括將飲食和所開的藥物相結合，如水楊酰偶氮磺胺吡啶、腎上腺皮質(zhì)激素等。然而一些病人由于副作用無法耐受這些藥物，就長期用藥而言會由此產(chǎn)生一些問題。
另一方面，通過抑制細胞因子活性改善疾病狀況作為一種新的IBD治療方法正在進行嘗試。其主要靶標為IL-1和TNF-α(Van Deventer,S.J.H.腸道(1997)40,443-448)；對于IL-1，一種IL-1受體拮抗劑(Comineui F.等人，胃腸病學(1992)103,65-71)和一種IL-1抑制劑CGP 47969A(Casini-Raggi等人，胃腸病學(1995)109,812-818)等正在進行臨床或實驗動物水平的研究。對于TNF-α，已經(jīng)給節(jié)段性回腸炎病人施用了特異的單克隆抗體，并觀察到細胞因子活性減弱以及潰瘍治愈。(VanDullemen,H.M.等人，胃腸病學(1995)109,129-135)。然而，IL-6拮抗劑能夠治療IBD，以特異地抑制IL-6的生物學活性并不為人所知。
因此，本發(fā)明提供(1)一種包含IL-6拮抗劑作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。
本發(fā)明也提供(2)一種包含針對IL-6受體的抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。
本發(fā)明也提供(3)一種包含針對IL-6受體的單克隆抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。
本發(fā)明也提供(4)一種包含針對人IL-6受體的單克隆抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。該針對人IL-6受體的單克隆抗體優(yōu)選為PM-1抗體。
本發(fā)明也提供(5)一種包含針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。該針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體優(yōu)選為MR16-1抗體。
本發(fā)明也提供(6)一種包含針對IL-6受體的重組抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。該針對IL-6受體的重組抗體優(yōu)選為具有人抗體的恒定區(qū)(C區(qū))。
本發(fā)明也提供(7)一種包含針對IL-6受體的嵌合或人源化抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。
本發(fā)明也提供(8)一種包含人源化PM-1抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。
本發(fā)明也提供(9)一種包含以上(1)-(8)描述的IL-6拮抗劑作為活性成分的節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結腸炎的預防或治療劑。
本發(fā)明也提供(10)一種包含以上(1)～(8)所述的IL-6拮抗劑作為活性成分的抑制炎性腸道疾病病人體重減輕的藥物。
本發(fā)明也提供(11)一種包含以上(3)～(8)所述的IL-6拮抗劑作為活性成分的抑制炎性腸道疾病病人體重減輕的藥物。本發(fā)明的實施方案本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑可以是任何來源、任何種類、任何形式，只要它們具有對炎性腸道疾病的預防或治療效果，或者具有控制炎性腸道疾病病人體重減輕的效果。
IL-6拮抗劑阻抑IL-6介導的信號傳導，抑制IL-6的生物學活性。作為IL-6拮抗劑，優(yōu)先提到的為抗-IL-6抗體、抗-IL-6受體抗體、抗-gP130抗體、改構IL-6、改構的可溶性IL-6受體、IL-6或IL-6受體的部分肽段、以及具有以上相同活性的低分子量物質(zhì)。
本發(fā)明中使用的抗-IL-6抗體可作為多克隆或單克隆抗體采用已知方法獲得。用作本發(fā)明的抗-IL-6抗體，優(yōu)選特別是哺乳動物來源的單克隆抗體。哺乳動物來源的單克隆抗體包括雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體，以及由包含基因工程抗體基因的表達載體轉化的宿主細胞生產(chǎn)的重組抗體。這些抗體通過與IL-6結合，阻斷IL-6和IL-6受體的結合，并由此阻斷IL-6生物學活性的信號傳導至細胞內(nèi)。
這些抗體的實施例包括MH 166(Matsuda等人，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.(1988)18,951-956)和SK2抗體(Sato,K等人，The 21stNihon Mennekigakkai Soukai(日本免疫學會年會)，學術記錄(1991)21,166)等抗體。
生產(chǎn)抗-IL-6抗體的雜交瘤可基本上采用以下已知的方法進行構建。因此，IL-6可用作免疫的傳統(tǒng)方法中的致敏抗原。由此獲得的免疫細胞在傳統(tǒng)的細胞融合方法中與已知的親本細胞融合，然后通過常規(guī)的篩選方法篩選出生產(chǎn)單克隆抗體的細胞，制備所需雜交瘤。
特別地，抗-IL-6抗體可按以下方式獲得。例如，為獲得抗體用作致敏抗原的人IL-6可運用IL-6基因/氨基酸序列獲得，該序列發(fā)表在歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem(1987)168,543-550;免疫學雜志(1988)140,1534-1541；或農(nóng)業(yè)生物化學(Agr.Biol.Chem.)(1990)54,2685-2688)。
通過將IL-6基因插入一已知的表達載體系統(tǒng)，轉化適宜的宿主細胞后，IL-6蛋白質(zhì)可從宿主細胞或其培養(yǎng)上清液中純化出來。純化的IL-6蛋白質(zhì)可用作致敏抗原。或另外選擇IL-6蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白用作致敏抗原。
本發(fā)明中使用的抗-IL-6受體的抗體可作為多克隆或單克隆抗體采用已知的方法獲得。用作本發(fā)明的抗-IL-6抗體，優(yōu)選單克隆抗體尤其是哺乳動物來源的單克隆抗體。哺乳動物來源的單克隆抗體包括那些雜交瘤生產(chǎn)的，以及那些由包含基因工程抗體基因的表達載體轉化的宿主細胞所生產(chǎn)的單克隆抗體。這些抗體通過與IL-6受體結合，抑制IL-6與IL-6受體的結合，由此阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)傳導。
這種抗體的實例包括MR16-1抗體(Tamura,T.,等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,11924-11928),PM-1抗體(Hirata等人，免疫學雜志(1989)143,2900-2906)，或AUK12-20抗體，AUK 64-7抗體或AUK 146-15抗體(國際專利公開號WO 92-19759)等等。其中PM-1抗體最為優(yōu)選。
生產(chǎn)PM-1抗體的雜交瘤細胞系已遵照布達佩斯協(xié)議的條款于1990年7月10日以PM-1國際保藏于國家生物科學和人類技術研究所，工業(yè)科學和技術機構1～3 Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki pref.日本，保藏號BP-2998。此外，生產(chǎn)MR16-1抗體的雜交瘤細胞系已經(jīng)遵照布達佩斯協(xié)議條款于1997年3月13日以MR16-1國際保藏于國家生物科學和人類技術研究所，工業(yè)科學和技術機構1～3 Higashi 1-chome、Tsukuba-shi、Ibaraki pref.日本保藏號BP-5875。
生產(chǎn)抗-IL-6受體的單克隆抗體的雜交瘤基本上可按照下面描述的已知方法進行構建。因此IL-6受體可按照免疫的常規(guī)方法用作致敏抗原。由此獲得的免疫細胞以常規(guī)的細胞融合方法與親本細胞融合，然后通過常規(guī)的篩選方法篩選出單克隆抗體生產(chǎn)細胞，以制備所需的雜交瘤。
特別地，抗-IL-6受體的抗體可按以下方式進行制備。例如，為獲得抗體用作致敏抗原的人IL-6受體可以采用歐洲專利申請?zhí)朎P 325474公開的IL-6受體基因序列/氨基酸序列而獲得，小鼠IL-6受體可采用日本未審的專利公開號3(1991)-155795所公開的小鼠IL-6受體基因序列/氨基酸序列而獲得。
有兩種類型的IL-6受體蛋白質(zhì)表達在細胞膜上的IL-6受體和脫離于細胞膜的IL-6受體(可溶性IL-6受體)(YasukaWa,K.等人，生物化學雜志(J.Biochem.)(1990)108,673-676)。可溶性IL-6受體主要包括與細胞膜結合的IL-6受體的胞外區(qū)，因此不同于膜結合的IL-6受體，因為后者缺乏跨膜區(qū)或跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。任何IL-6受體均可用作IL-6受體蛋白質(zhì)，只要它可用于本發(fā)明中生產(chǎn)IL-6受體抗體的致敏抗原。
當IL-6受體的基因序列插入一已知的表達載體系統(tǒng)轉化適宜的宿主細胞后，所需的IL-6受體蛋白質(zhì)可由已知方法從宿主細胞或其培養(yǎng)上清液中純化出來。因而純化的IL-6受體蛋白質(zhì)可用作致敏抗原。另外可選擇地，表達IL-6受體或IL-6受體蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)之融合蛋白的細胞可用作致敏抗原。
具有包含編碼人IL-6受體的cDNA之質(zhì)粒pIBIBSF2R的大腸桿菌，已遵照布達佩斯協(xié)議的條款于1989年1月9日以HB101-pIBIBSF2R國際保藏于國家生物科學和人類技術研究所，保藏于工業(yè)科學和技術機構1～3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki pref.日本，保藏號BP-2232。
本發(fā)明采用的抗-gp 130抗體可作為多克隆或單克隆抗體使用已知方法獲得。用作本發(fā)明的抗-gp130的抗體優(yōu)選單克隆抗體尤其是哺乳動物來源的單克隆抗體。哺乳動物來源的單克隆抗體包括那些雜交瘤生產(chǎn)的，以及那些經(jīng)包含基因工程抗體基因的表達載體所轉化的宿主細胞生產(chǎn)的單克隆抗體。這些抗體經(jīng)與gp130結合，抑制IL-6/IL-6受體復合物與gp130的結合，由此阻斷IL-6生物學活性向細胞內(nèi)傳導。
這樣的抗體包括AM64抗體(日本未審專利公開號(kokai)3(1991)-219894)、4B11抗體和2H4抗體(US 5571513)、B-S12抗體和B-P8抗體(日本未審專利公開號(kokai)B(1996)-291199)。
生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤基本上可采用下面描述的方法建立。因而gp130可用作致敏抗原并以常規(guī)免疫方法用于免疫。由此獲得的免疫細胞在常規(guī)細胞融合過程中與已知的親本細胞融合，然后通過常規(guī)篩選方法篩選出所需的生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤。
特別地，單克隆抗體可通過以下方式獲得。例如，用作生產(chǎn)抗體的致敏抗原的gp130可通過歐洲專利申請?zhí)朎P 411946公開的gP130基因序列/氨基酸序列獲得。
當gp130基因插入一已知的表達載體系統(tǒng)后，轉化一適宜的宿主細胞，gp130蛋白質(zhì)即可從宿主細胞或其培養(yǎng)上清液中純化出來。純化的gp130蛋白質(zhì)可用作致敏抗原。另外可選擇地，gp130蛋白質(zhì)和另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白可用作致敏抗原。
盡管對由致敏抗原免疫的哺乳動物并沒有特別的限制，但選擇應優(yōu)先考慮其與用于細胞融合的親本細胞的相容性，它們通常包括嚙齒類動物例如小鼠、大鼠、倉鼠等等。
用致敏抗原免疫動物通常采用已知的方法進行。例如，一般的方法包括給哺乳動物腹膜內(nèi)或皮下注射致敏抗原。特別地，已稀釋并懸浮于適量磷酸緩沖鹽液(PBS)或生理鹽水中的致敏抗原，按需要與適宜量的傳統(tǒng)佐劑混合，例如福氏完全佐劑。乳化后，優(yōu)選地將其每4至21天分幾次施用于哺乳動物。另外可選擇地，在致敏抗原免疫哺乳動物時采用一種合適的載體。
免疫后證實血清中的所需抗體滴度確有增加，便從哺乳動物中取出免疫細胞進行細胞融合。優(yōu)選的免疫細胞特別包括脾細胞。
與上述的免疫細胞進行細胞融合的另一種親本細胞哺乳動物骨髓瘤細胞，優(yōu)選地包括多種已知的細胞系，例如p3X63Ag8.653(Kearney,J.F等人，免疫學雜志(1979)1231548-1550)、p3X63Ag BU.1(當今微生物學與免疫學專題(1978)811-7)、NS-1(Kohler,G．和Milstein,C.,歐洲免疫學雜志(1976)6511-519)、MPC-11(Margulies,D.H.等人，細胞(1976)8405～415)、SP2/0(Shulman,M.等人，自然(1978)276269-270)、FO(de st.Groth,S.F.等人，免疫學方法(Immunal.Methods)(1980)351～21,S194(TroWbridge,I.S.實驗醫(yī)學雜志，(1978)148313-323)、R210(Galfre,G等人，自然(1979)277131-133)等等。
上述經(jīng)免疫的細胞和骨髓瘤細胞之間的細胞融合基本上可根據(jù)已知的方法進行，例如Milstein等人描述的方法(Kohler,G.和Milstein,C.,酶學方法(Methods Enzymol.)(1981)733-46)等等。
更為特別地，上述的細胞融合在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行，例如添加有細胞融合促進劑的液體培養(yǎng)基。可以用作細胞融合促進劑的例如聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等等。此外，可根據(jù)需要添加例如二甲基亞砜之類的佐劑以加強融合的效率。
采用的免疫細胞與骨髓瘤細胞優(yōu)選的比例為，例如免疫細胞比骨髓瘤細胞多1至10倍。用于上述細胞融合的培養(yǎng)基包括例如適宜以上骨髓瘤細胞系生長的RPMI 1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基，以及用于此類細胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基，并且可添加如胎牛血清(FCS)的血清添加劑。
細胞融合時，將上述指定量的免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)基中充分混勻，并加入預熱至約37℃的PEG溶液，例如平均分子量約1000至6000的PEG溶液，加至終濃度30％至60％(w/v)并混勻，以獲得所需的融合細胞(雜交瘤)。然后通過重復順序添加適宜的培養(yǎng)基并離心，可以去除不適合雜交瘤生長的上清液、融合劑等因素。
該雜交瘤通過在常規(guī)的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)進行選擇，例如，選擇培養(yǎng)基HAT培養(yǎng)基(一種包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)。一般在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)一段時期，通常幾天至幾星期，這期間足以殺死除所需雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)。采用常規(guī)的有限稀釋法篩選并克隆產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。
除了通過用抗原免疫除人以外的動物獲得上述雜交瘤，還可能用所需抗原或表達所需抗原的細胞體外致敏人淋巴細胞，所得的致敏B淋巴細胞與人骨髓瘤細胞(例如U266)融合，以獲得具有結合所需抗原或表達所需抗原細胞的活性的所需人抗體。(見日本已審專利公開號(kokoku)1(1989)-59878)。此外，一種具有一整套人抗體基因的轉基因動物經(jīng)抗原或表達抗原的細胞免疫后，可獲得上述方法中的所需人抗體。(見國際專利公開號WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO96/34096和WO 96/33735)。
由此建立的生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤可以在常規(guī)培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)，或可在液氮中長期保存。
為了從該雜交瘤中獲得單克隆抗體，可采用以下方法以常規(guī)方法培養(yǎng)該雜交瘤并從上清液中獲得抗體，或者將該雜交瘤注入與其相容的哺乳動物腹腔中生長并從腹水中獲得抗體。前者方法適于獲得高純度的抗體，而后者方法適于大批量生產(chǎn)抗體。
特別地，生產(chǎn)抗-IL-6受體的抗體的雜交瘤可通過使用日本未審專利公開號(kokai)3(1989)-139293中的方法建立。一種方法為，將生產(chǎn)PM-1抗體的雜交瘤腹膜內(nèi)注射BALB/C小鼠，以獲得從腹水中純化的PM-1抗體，其雜交瘤已于1990年7月10日遵照布達佩斯協(xié)議的條款國際保藏于日本國家生物科學和人類技術研究所、工業(yè)科學和技術機構，1-3Higashi 1-chome，Tsukuba-shi,Ibaraki pref.,保藏號為BP-2998。另一種方法為該雜交瘤培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)基，例如含10％胎牛血清和5％BM-Condimed H1(寶靈曼公司生產(chǎn))的RPMI 1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL公司生產(chǎn))、PFHM-Ⅱ培養(yǎng)基(GIBCO-BRL公司生產(chǎn))等等，然后從上清液中純化PM-1抗體。
通過基因重組技術生產(chǎn)的重組抗體可以用作本發(fā)明中的單克隆抗體，該技術中來自雜交瘤的抗體基因克隆并整合入一適合的載體中，重組的載體再轉化宿主細胞。參見(例如BorrebaeckC.A.K.和Larrick J.W.著作的“治療用的單克隆抗體”，由MACMILLAN出版有限公司1990年發(fā)表于英國)。
特別地，編碼所需抗體可變區(qū)(Ⅴ)的mRNA從生產(chǎn)抗體的細胞如雜交瘤中分離出來。通過采用例如胍－超離心方法(ChirgWin,J.M.等人，生物化學(1979)18,5294-5299)、AGPC方法(Chomczynski,P.等人，分析生物化學(Anal.Biochem.)(1987(162,156-159)制備總RNA，然后用mRNA純化試劑盒等(Pharmacia生產(chǎn))從總RNA中純化分離mRNA。另外可選擇地，mRNA可直接用快速制備mRNA純化試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))制備。
抗體可變區(qū)cDNA可用反轉錄酶由mRNA合成。cDNA可用AMV反轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等進行合成。另外可選擇地，為合成和擴增cDNA，可使用應用聚合酶鏈反應(PCR)的5’－擴增RACE試劑盒(Clontech生產(chǎn))和5’-RACE方法(Frohman,M.A.等人，美國國家科學院院報(1988)85,8998-9002；Belyavsky,A等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1989)17,2919-2932)。目的DNA片段從獲得的PCR產(chǎn)物中純化出并可與載體DNA連接。此外，由此構建重組載體并轉化大腸桿菌，并從中挑選克隆以制備所需的重組載體。目的DNA的核苷酸序列可通過已知方法如雙脫氧法確定。
一旦獲得編碼所需抗體可變區(qū)的DNA，就可與編碼所需抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連，然后整合入一表達載體中。另外可選擇地，編碼抗體Ⅴ區(qū)的DNA整合入一個已經(jīng)包含編碼抗體C區(qū)的DNA的表達載體中。
為了生產(chǎn)本發(fā)明中使用的抗體，將抗體基因如下述方法整合入一表達載體中，以便在表達調(diào)控區(qū)例如增強子和/或啟動子的控制下表達。隨后，表達載體可以轉化宿主細胞并在其中進行表達。
根據(jù)本發(fā)明，人工改構的重組抗體，例如嵌合抗體和人源化抗體可用于降低對人的異源抗原性。這些改構抗體可用已知方法生產(chǎn)。
獲得嵌合抗體可通過，如下方法，將由此獲得的編碼抗體可變區(qū)的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，然后整合入一表達載體中并轉化宿主細胞從中生產(chǎn)抗體(參見歐洲專利申請?zhí)朎P125023和國際專利申請?zhí)朩O 92/19759)。使用這種已知方法可獲得本發(fā)明中有用的嵌合抗體。
例如，包含編碼嵌合PM-1抗體的L鏈V區(qū)或H鏈V區(qū)DNA的質(zhì)粒分別命名為pPM-K3或pPM-h1，含有質(zhì)粒的大腸桿菌已遵照布達佩斯協(xié)議的條款于1991年2月11日分別以保藏號NCIMB40366和NCIMB 40362國際保藏于國家工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司。
人源化抗體也稱為重構人抗體，已通過將除人以外哺乳動物抗體(如小鼠抗體)的互補決定區(qū)(CDR)移植入一人抗體的CDR制造出來。制備這種抗體的一般重組DNA技術也已所知(參見歐洲專利申請?zhí)朎P 125023和國際專利公開號WO 92-19759)。
特別地，設計用于將鼠抗體的CDR和人抗體的框架區(qū)(FR)連接起來的DNA序列已經(jīng)合成，該序列來自幾段分開的寡核苷酸，并含有與另一段末端重疊的部分。如此獲得的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后整合入表達載體中，再轉化宿主細胞以生產(chǎn)抗體(參見歐洲專利申請?zhí)朎P 239400和國際專利公開號WO92-19759)。
針對連接CDR的人抗體的框架區(qū)，選擇形成有利的抗原結合結構的互補決定區(qū)。如果需要，抗體可變區(qū)的框架區(qū)氨基酸可被替換，以便重構人抗體的互補決定區(qū)可形成適宜的抗原結合結構(Sato,K等人，癌癥研究(Cancer Res.(1993)53,851-856)。
例如，嵌合抗體或人源化抗體均采用了人抗體的C區(qū)。作為人抗體的C區(qū)可能提到Cγ，例如，可采用Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4。修飾人抗體的C區(qū)可促進抗體的穩(wěn)定性及產(chǎn)率。
嵌合抗體由除人以外哺乳動物抗體的可變區(qū)和人抗體的C區(qū)構成，而人源化抗體由來源于除人以外哺乳動物抗體的互補決定區(qū)和來源于人抗體的框架區(qū)和C區(qū)構成。因此，這些抗體在人體中的抗原性降低，以便用作本發(fā)明中的抗體。
本發(fā)明中應用的人源化抗體的優(yōu)選實施方案包括人源化的PM01抗體。(參見國際專利公開號WO 92-19759)。
上述構建的抗體基因可用已知的方法表達并獲得產(chǎn)物。對于哺乳動物細胞，完成表達可采用，包含常規(guī)使用的有用的啟動子、待表達的抗體基因和3’下游有效連接多聚A信號的DNA載體或者包含上述DNA的載體。啟動子/增強子的實例包括人巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子。
此外，可用于本發(fā)明的表達抗體的啟動子/增強子有病毒啟動子/增強子，例如逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和類人猿病毒40(SV40)，以及來源于哺乳動物細胞的啟動子/增強子，例如人延伸因子α(HEF1α)。
例如，通過Mulligan等人的方法動物SV40啟動子/增強子(Mulligan,R.C.等人，自然，(1979)277,108-114)，或者Mizushima等人的方法使用HEF1α啟動子/增強子(Mizushima,S和Nagata,S.,核酸研究(1990)18,5322)，可容易地完成表達。
對于大腸桿菌，通過有效地連接常規(guī)使用的有用的啟動子，抗體分泌的信號序列和將要表達的抗體基因進行表達。作為啟動子，例如，可能會提到LacZ啟動子和araB啟動子。當使用LacZ啟動子時，可采用Ward等人的方法(Ward,E.S.等人，自然，(1989)341,544-546；Ward,E.S.等人，F(xiàn)ASEB J.(1992)6,2422-2427)；當使用araB啟動子時，可采用Better等人的方法(Better,M.等人，科學(1988)240,1041～1043)。
當抗體分泌并產(chǎn)生于大腸桿菌周質(zhì)空間時，可采用pelB信號序列(Lei,s.p.等人，細菌學雜志(1987)169,4379-4383)。分離出聚集于周質(zhì)空間的抗體之后，抗體結構在使用前適當?shù)刂匦抡郫B(例如參見WO 96/30394)。
那些來源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復制起點可用作復制起點。此外，關于宿主細胞系統(tǒng)中基因拷貝數(shù)的擴增，表達載體可包括氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇性標記。
至于本發(fā)明使用的抗體的生產(chǎn)，可使用任何生產(chǎn)體系?？贵w制品的生產(chǎn)體系包括體外或體內(nèi)生產(chǎn)體系。作為體外生產(chǎn)體系，可能提及使用真核細胞的生產(chǎn)體系和使用原核細胞的生產(chǎn)體系。
當使用真核細胞時，有選用了動物細胞、植物細胞和真菌細胞的生產(chǎn)體系。已知的動物細胞包括(1)哺乳動物細胞例如CHO細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、Hela細胞和Vero細胞；(2)兩棲類動物細胞，例如非洲爪蟾屬(Xenopus)卵細胞，或(3)昆蟲細胞例如sf9、sf21和Tn5。已知的植物細胞包括例如煙草(Nicotiana tabacum)，其可經(jīng)受愈傷組織培養(yǎng)。已知的真菌細胞包括酵母，例如酵母屬，更具體的釀酒酵母(Saccharomyces cereviceae)，或絲狀真菌，例如曲霉屬(Aspergillus)，更具體的黑曲霉(Aspergillus niger)。
當使用原核細胞時，有選用了細菌細胞的生產(chǎn)體系。已知的細菌細胞包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
通過將所需抗體基因轉化進這些細胞，并體外培養(yǎng)轉化細胞，便可獲得抗體。按已知方法進行培養(yǎng)。例如，DMEM、MEM、RPMI1640和IMDM可以用作培養(yǎng)基，并且血清添加劑如胎牛血清(FCS)可結合使用。此外，還可通過將抗體基因轉化的細胞注入動物等腹腔以體內(nèi)方式生產(chǎn)抗體。
作為體內(nèi)生產(chǎn)體系，將提及那些使用動物和使用植物的生產(chǎn)體系。當使用動物時，有采用哺乳動物和昆蟲的生產(chǎn)體系。
山羊、豬、綿羊、小鼠和牛可用作哺乳動物生產(chǎn)體系(VickiGlaser，生物技術應用(SPE CTRUM Biotechnology Applications)(1993))。同樣蠶可以用作昆蟲。
當使用植物時，例如可采用煙草。
抗體基因轉入這些動物或植物，并從這些動物或植物中產(chǎn)生抗體并回收。例如，抗體基因插入編碼乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白(如山羊β酪蛋白)的基因中間，制備融合基因。將包含插入抗體基因的融合基因之DNA片段注入山羊胚，胚轉變成一只母山羊。接受胚產(chǎn)生的轉基因山羊或其后代，從其乳汁中可獲得所需的抗體。為了增加轉基因山羊生產(chǎn)的包含所需抗體的乳汁量，可給轉基因山羊適量的激素(Ebert,K.M.等人，生物/技術(Bio/Technology)(1994)12,699-702)。
當使用蠶時，用插入所需抗體基因的桿狀病毒感染蠶，便可從蠶的體液中獲得所需的抗體(Maeda,S.等人，自然(1985)315,592-594)。而且，當使用煙草時，所需的抗體基因插入植物表達載體，例如pMON 530，并且載體感染細菌如根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。然后細菌感染煙草(如Nicotianatabacum)煙草并從煙草葉中獲得所需抗體(Julian,K.-C.Ma等人，歐洲免疫學雜志(1994)24.131-138)。
當體外或體內(nèi)生產(chǎn)體系生產(chǎn)抗體時，如上所述，編碼抗體的重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA可分別整合入一個表達載體并同時轉化宿主，或者編碼H鏈和L鏈的DNA可整合入單個表達載體中并以此轉化宿主(參見國際專利公開號WO 94-11523)。
本發(fā)明中使用的抗體可以是抗體片段或是其修飾的版本，只要它們可優(yōu)選使用即可。例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2、Fv，或是Fv的H鏈和L鏈由一適合的連接物連接的單鏈Fv(ScFv)，都可作為抗體片段提及。
特別地，抗體由酶處理(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)產(chǎn)生抗體片段，或者編碼這些抗體片段的基因構建后整合入表達載體中，并在適合的宿主細胞中表達(參見，例如CO,M.S.等人，免疫學雜志(1994)152,2968-2976；Better,M.和Horwitz,A.H.,酶學方法(1989)178,476-496；Plueckthun,A.和Skerra,A.,酶學方法(1989)178,476-496；Lamoyi,E.,酶學方法(1986)121,652-663；Rousseaux,J.等人，酶學方法(1986)123,663-669；Bird,R.E.等人，TIBTECH(1991)9,131-137)。
scFv可通過連接抗體的H鏈V區(qū)與L鏈V區(qū)獲得。scFv中H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)優(yōu)選地由連接物連在一起，這連接物優(yōu)選為肽連接物(Huston,J.S.等人，美國國家科學院院報(1988)85，5879-5883)。scFv中H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)可來源于任何上述的抗體。任何包含12～19個氨基酸殘基的單鏈肽都可以用作連接V區(qū)的肽連接物。
編碼ScFv的DNA可以這樣獲得使用編碼上述抗體H鏈或H鏈V區(qū)的DNA和編碼上述抗體L鏈或L鏈V區(qū)的DNA作為模板；通過PCR技術使用與其兩末端相特異的引物對，擴增上述序列中編碼目的氨基酸序列的部分DNA；進一步擴增編碼肽連接的部分的DNA，以及確定了該DNA的兩端可分別與H鏈和L鏈連接的引物對。
一旦建立了編碼scFv的DNA，就可通過常規(guī)方法獲得包含該DNA的表達載體和由該表達載體轉化的宿主，并且可利用常規(guī)方法使用轉化的宿主獲得scFv。
通過與上述的方法相似的方式獲得抗體基因并允許在宿主中表達，即可獲得的這些抗體片段。在本申請的權利要求書中使用的“抗體”包括這些抗體片段。
與例如聚乙二醇(PEG)的多種分子結合的抗體可用作修飾抗體。本申請的權利要求書中使用的“抗體”包含這些修飾抗體。這些修飾抗體可通過對如此獲得的抗體進行化學修飾而獲得。本領域中已經(jīng)建立了這些方法。
如上述生產(chǎn)和表達的抗體可從宿主細胞內(nèi)部或外部分離出來，并可純化至均一。本發(fā)明中使用的抗體的分離和純化可通過親和層析完成。這種親和層析使用的柱可以是蛋白A柱和蛋白G柱。蛋白A柱使用的載體范例為Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等等?；蛘?，可無任何限制地使用常規(guī)應用的分離純化蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明中使用的抗體的分離和純化，可適當?shù)亟Y合除上述親和層析以外的層析、過濾、超濾、鹽析、透析等方法來完成。層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等等。這些層析可應用于高效液相層析(HPLC)?；蛘?，可應用反相HPLC。
以上獲得抗體的濃度可通過測定光吸收值或者酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等方法確定。因此，當進行測定光吸收值時，將樣品用PBS(-)適當?shù)叵♂?，然后測定280nm時的光吸收值，并用光吸收系數(shù)1.35 OD=1mg/ml進行計算。當使用ELISA方法時，按以下方法進行測定。因此，100μl由0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAGO生產(chǎn))加至96孔板(Nunc生產(chǎn))，4℃孵育過夜以固定抗體。封閉后，每孔加入100μl適當稀釋的本發(fā)明的抗體或包含抗體的樣品，或100μl作為標準物的人IgG(CAPPEL生產(chǎn))，室溫孵育1小時。
清洗后，加入100μl稀釋5000倍的堿性磷酸酶標記的抗－人IgG抗體(BIO SOURCE生產(chǎn))，室溫孵育1小時。清洗后加入底物溶液并孵育，隨后用3550型微板讀數(shù)儀(Bio-Rad生產(chǎn))測定405nm時的光吸收值，并計算目的抗體的濃度。
本發(fā)明中改構的IL-6具有與IL-6受體結合的活性，但并不傳遞IL-6的生物學活性。因而，盡管改構的IL-6與IL-6競爭性結合IL-6受體，卻并不傳遞IL-6的生物學活性，由此便阻斷了IL-6的信號傳導。
通過替換IL-6氨基酸序列中的氨基酸殘基引入突變可以構建改構的IL-6。改構IL-6的來源IL-6可以具有任何起源，但考慮到其抗原性，優(yōu)選人IL-6。
特別地，使用已知的氨基酸序列分子建模程序，例如WHATIF(Vriend等人，分子圖譜雜志(J.Mol.Graphics(1990),8,52-56)預測IL-6的二級結構，并評價待替換的氨基酸殘基的整體效果。當適宜的氨基酸殘基確定之后，通過常規(guī)的聚合酶鏈式反應(PCR)方法，使用包含編碼人IL-6基因的核苷酸序列的載體，并由此獲得編碼改構IL-6的基因。該基因然后在需要時整合進適宜的表達載體，根據(jù)上述重組抗體的表達、生產(chǎn)和純化方法從中獲得改構的IL-6。
改構IL-6的具體實例公開于Brakenhoff等人，生物化學雜志(1994)269,86-93和Savino等人，EMBO雜志(1994)13,1357-1367,WO 96-18648和WO 96-17869。
本發(fā)明中使用的IL-6或IL-6受體的部分肽段分別具有與IL-6受體結合或與IL-6結合的活性，但不能傳遞IL-6的生物學活性。因此IL-6或IL-6受體分別與IL-6受體或IL-6結合并由此將其捕捉。結果，它們并不傳遞IL-6的生物學生，并阻斷IL-6的信號傳導。
IL-6或IL-6受體的部分肽是這樣的肽，其包含IL-6或IL-6受體氨基酸序列中參與結合IL-6受體和IL-6的區(qū)域中的部分或全部氨基酸序列。這種肽段一般包含10～80、優(yōu)選20～50、更優(yōu)選20～40個氨基酸殘基。
IL-6或IL-6受體的部分肽段的構建可通過明確IL-6或IL-6受體氨基酸序列中參與結合IL-6受體和IL-6的區(qū)域，并通過如遺傳工程技術或肽合成方法等常規(guī)方法生產(chǎn)一些或全部氨基酸序列來完成。
為了用遺傳工程技術生產(chǎn)IL-6或IL-6受體的部分肽，將編碼目的肽之DNA序列整合入表達載體，并通過表達、生產(chǎn)和純化該重組抗體獲得其肽段。
IL-6或IL-6受體部分肽的生產(chǎn)可通過肽合成方法實現(xiàn)，即使用肽合成普遍使用的方法例如固相合成或液相合成。
特別地，可使用的方法參見Zoku-Iyakuhin no Kaihatsu(藥品進展序集，14卷，Peputido Gousei(肽合成)，Haruaki Yajima、Hirokawa Shoten編著，1991。例如，使用的固相合成方法包括例如一個反應，其中待合成肽C末端相應的氨基酸與一個不溶于有機溶劑的支持物結合，然后氨基酸(其中α-氨基基團或側鏈官能團由一個適宜的保護基團保護)每次從C-末端向N-末端方向縮合一個氨基酸。另一個反應中與樹脂結合的氨基酸或肽的α-氨基基團的上述保護基團被去除。這兩個反應交替重復以延伸肽鏈。依賴使用的保護基團的類型可將固相肽合成方法分為Boc方法和Fmoc方法。
完成目的肽合成之后，進行去保護反應和從支持物上切除肽鏈的反應。關于肽鏈的切除，通常在Boc方法中使用氟化氫或三氟甲烷磺酸，在Fmoc方法中使用TFA。例如在Boc方法中，上述肽樹脂在存在苯甲醚時在氟化氫中處理。隨后，去除保護基團，通過從支持物上切除回收合成肽。通過凍干合成的肽可獲得粗肽。另一方面，例如在Fmoc方法中，按照同上相似的方式完成去保護反應和從支持物上切除肽的反應。
由此獲得的粗肽可應用HPLC進行分離和純化。肽的洗脫可在優(yōu)化條件下在通常用于蛋白質(zhì)純化的水－乙腈溶劑體系中進行。將色譜曲線中峰值所對應的級分收集并凍干。如此純化的肽級分通過質(zhì)譜分析分子量、分析氨基酸組分、或分析氨基酸序列等進行鑒定。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽的具體實施例公開于日本未審專利公開號(kokai)7(1995)-324097、日本未審專利公開號(kokai)8(1996)-311098和美國專利US 5210075。
本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑的活性可用已知的常規(guī)方法進行評價。特別地，培養(yǎng)IL-6依賴型細胞MH 60.BSF2，加入IL-6，并在與IL-6拮抗劑共存條件下通過向IL-6依賴型細胞中摻入H3-胸苷以評價其活性。或者，同時向表達IL-6受體的U266細胞中加入125I標記的IL-6和IL-6拮抗劑，通過測定與IL-6受體表達細胞所結合的125I標記的IL-6，評價其活性。在以上分析系統(tǒng)中，除了有IL-6受體拮抗劑的實驗組以外，還建立了不包含IL-6拮抗劑的陰性對照組，并且比較它們獲得的結果以評價IL-6受體拮抗劑抑制IL-6的活性。
為了證實本發(fā)明完成的效果，將本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑施用于形成了炎性腸道疾病的動物，炎性腸道疾病的形成是通過注射CD4陽性和CD45RB強陽性的細胞(CD4+CD45RBhigh細胞)，并可評價IL-6拮抗劑抑制體重減輕和改善炎性腸道疾病病情得分的效果。作為本發(fā)明額外的效果，其可抑制厭食，減輕腹痛，改善腹瀉，或防止炎性腸道疾病的復發(fā)。
使用例如以下實施例描述的方法，可以分離通過IL-6拮抗劑轉入動物的CD4+CD45RBhigh細胞。CD4+CD45RBhigh細胞來源的動物可以是實驗中普遍使用的動物，如小鼠和大鼠。
如下面實施例所述，在形成炎性腸道疾病的動物中施用IL-6受體抗體，導致體重減輕的抑制和改善炎性腸道疾病程度得分，因此表明如抗-IL-6受體抗體的IL-6拮抗劑發(fā)揮了治療炎性腸道疾病的效果。
本發(fā)明處理的對象為哺乳動物。處理對象優(yōu)選為人。
本發(fā)明的預防或治療劑可以口服或非腸道途徑、系統(tǒng)地或局部地施用。例如，靜脈注射如滴注、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射、栓劑、洗腸劑、口服腸溶衣藥片等以及給藥方式可以根據(jù)病人的年齡和狀況適當?shù)剡x擇。選擇有效劑量的范圍為每次每kg體重給藥0.01mg～100mg?；蛘呖蛇x擇劑量范圍為每個病人1～1000mg，優(yōu)選5～50mg。
本發(fā)明的炎性腸道疾病的預防或治療劑依據(jù)給藥途徑可包含藥學可接受的載體或添加劑。這些載體或添加劑的例子包括水、藥物可接受的有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油二脂、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、十八烷醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、藥物可接受的表面活性劑等等。根據(jù)劑型可選擇上述的添加劑或其組合，但不局限于此。
本發(fā)明治療的疾病對象為炎性腸道疾病。炎性腸道疾病包括潰瘍性結腸炎和節(jié)段性回腸炎。這些疾病主要發(fā)生于20歲左右的青年，但至今對其致病抗原或炎癥病理學機制了解很少。然而，目前正在采用多種細胞和細胞因子進行廣泛的研究以闡明其機制。
過去的幾年中在對引起炎性腸道疾病的細胞的分析中觀察到一些進展。因此，很顯然通過將純化的CD4陽性、CD45RB強陽性細胞(CD4+CD45RBhigh)轉入免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)就可建立炎性腸道疾病的動物模型。(Morrissey,P.J.等人，實驗醫(yī)學雜志(1993)178,237-244；Leach,M.W.等人，美國病理學雜志(Am.J.Pathol.)(1996)148,1503-1515；Aranda,R等人，免疫學雜志(1997)158,3464-3473)。
另一方面已有顯示，CD4陽性、CD45RB弱陽性細胞(CD4+CD45RBlow)不能誘導炎性腸道疾病，反而抑制由CD4陽性、CD45RB強陽性細胞誘導產(chǎn)生的炎性腸道疾病(Powrie,F.R.等人，實驗醫(yī)學雜志(1994)179,589-600)。已知每個細胞CD45RB的表達與細胞因子產(chǎn)生模式有關。因此認為，CD4陽性、CD45RB強陽性細胞為1型輔助(Th1)樣細胞，產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α,而CD4陽性、CD45RB弱陽性細胞為2型輔助(Th2)樣細胞，產(chǎn)生IL-4、IL-10等等(Lee,W.等人，免疫學雜志(1990)144,3288-3295)。
因此認為炎性腸道疾病的發(fā)病主要與Th1和Th2的平衡紊亂有關，并由另一事實所證實，即由基因打靶方法生產(chǎn)的IL-10缺陷小鼠產(chǎn)生類似于人潰瘍性結腸炎的慢性炎性腸道疾病(Kuhn,R.等人，細胞(1993)75,263-274)。
實施例中使用的動物模型其結腸的組織學特征非常類似于潰瘍性結腸炎和節(jié)段性回腸炎病人(Leach,M.W.等人，美國病理學雜志，(1996)148,1503-1515)。潰瘍性結腸炎中經(jīng)?？煽吹綇闹蹦c開始大面積連續(xù)損傷，并且粘膜上皮也特別地受到損傷。本發(fā)明的模型中臨床病理學非常相似，即盡管損傷主要位于結腸和延伸腺體里但其損傷部位覆蓋廣泛。
另一方面，節(jié)段性回腸炎是一種深度炎癥，并不定位于粘膜，而是分散于消化道任何部位，從口腔到肛門。從組織學角度其特征為非干酪性壞死肉芽腫炎癥。這一模型非常類似于節(jié)段性回腸炎，即發(fā)現(xiàn)炎癥并不定位于巨噬細胞、淋巴細胞和多核巨細胞聚集的粘膜層，并且通常為肉芽腫形式，很少發(fā)現(xiàn)隱窩囊腫。
因此，臨床研究早已報道了有關潰瘍性結腸炎和節(jié)段性回腸炎特征共存的病例(Tanaka,M.等人，肝臟-胃腸病學(1990)37,18-31)。在炎性腸道疾病中發(fā)現(xiàn)上皮內(nèi)主要組織相容性復合體Ⅱ的表達增強(Trejdosiewicz,L.K.等人，Dig.Dis.Sci.,(1989)34,1449-1456)，并且本發(fā)明模型情況也如此。本模型中，出現(xiàn)上皮組織特征性加厚，并認為與潰瘍性結腸炎病人中所見的細胞生長增強有關(Serafini,E.P.等人，腸(1981)22,648-652)。
本模型與臨床炎性腸道疾病非常相似，嚴重病例中可誘發(fā)體重減輕。在使用本模型的實驗中，組織學損壞顯著好轉并且未觀察到體重減輕，表明IL-6拮抗劑對炎性腸道疾病(如潰瘍性結腸炎或節(jié)段性回腸炎)有治療效果。
將洗過的小鼠脾細胞懸浮于含2％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，細胞計數(shù)后調(diào)整為1.1×108/ml。向其中加入1/9體積抗鼠CD4抗體(L3T4微珠，Miltenyi Biotec生產(chǎn))，并在冰上與細胞結合15分鐘(細胞密度1×108ml)。下一步使用Mini MACS分離系統(tǒng)(Miltenyi Biotec生產(chǎn))進行柱處理，收集CD4陽性細胞級分。細胞計數(shù)后懸浮于加有2％FCS的磷酸緩沖鹽液中，并調(diào)節(jié)細胞密度為4×107/ml。
在CD4陽性細胞懸液中加入1/100體積PE標記的大鼠抗－小鼠CD4(L3T4)抗體(0.2mg/ml.克隆RM4-5,Pharmingen生產(chǎn))和1/100體積FITC標記的大鼠抗－小鼠CD45RB抗體(0.5mg/ml，克隆16A,Pharmingen生產(chǎn))。冰上保持20分鐘后使抗體結合到細胞上。向標記細胞中加入加有2％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，離心沖洗后重懸于含2％FCS的磷酸緩沖鹽液中，貯存于陰冷黑暗處。
從標記的CD4陽性細胞中使用流式細胞儀(FACS Vantage，Becton Dickinson生產(chǎn))選出CD4陽性和CD45RB強陽性細胞群(CD4+CD45RBhigh細胞)。該細胞群相應于在CD4和CD45RB陽性細胞中相應具有CD45RB的高表達的上50％細胞群。離心后獲得的細胞重懸于磷酸緩沖鹽液至濃度4×106/ml。CD45RB陽性細胞的純度為97％，其存活率為98％。
將這種高度純化的細胞以4×105/ml(4×106/ml，每只100μl)濃度腹膜內(nèi)注射入C.B-17scid小鼠以制備炎性腸道疾病模型(Leach,M.W.等人，美國病理學雜志(1996)148,1503-1515,Aranda,R.等人，免疫學雜志(1997)158,3464,3473)。按照處理方法分以下三組進行實驗(1)細胞轉移、未施用抗-IL-6受體抗體組，5只小鼠；(2)細胞轉移、施用抗-IL-6受體抗體組，3只小鼠；(3)細胞非轉移組，3只小鼠。
抗-IL-6受體抗體MR16-1如下給藥。首先，用磷酸緩沖鹽液將抗體調(diào)至20mg/ml，在注射上述細胞前15～30分鐘腹膜內(nèi)注射抗體，每只小鼠100μl。一星期以后，用磷酸緩沖鹽液調(diào)至10mg/ml，每只小鼠腹膜內(nèi)給藥100μl。每星期重復一次直到細胞轉移后第8個星期。未施用抗體組以相似方式注射磷酸緩沖鹽液。
細胞轉移8至9周后給小鼠稱重，取出結腸組織(降結腸部分)浸入OCT化合物中。樣品于-80℃冷凍。用切片機(cytostat)將樣品塊切成6μm厚的冷凍片，固定于10％福爾馬林溶液。固定部分由蘇木精-伊紅方法雙重染色用于組織學分析。
通過在細胞轉移導入以誘導炎性腸道疾病之前和細胞轉移8～9星期之后測定體重變化(細胞轉移前后比率)和組織學分析，進行藥效的評價。關于組織學分析，根據(jù)以下4階段炎性腸道疾病的得分對每只小鼠的組織進行評估(這里指腸道疾病的得分)(Ito,H.等人，自身免疫學雜志(J.Autoimmunity)(1997)10,455-459)。
炎性腸道疾病的得分
0級(無病癥)與正常BALB/C小鼠無顯著差別，1級(輕度)觀察到上皮組織輕微肥大，2級(中度)介于1級和3級之間，3級(重度)上皮組織明顯肥大，伴隨大范圍炎性細胞浸潤和杯形細胞缺陷。


圖1顯示了體重變化和炎性腸道疾病得分的結果。
植入CD4陽性和CD45RB強陽性細胞的小鼠產(chǎn)生炎性腸道疾病，并觀察到明顯的組織學炎癥。它們還顯示出與疾病開始有關的乏力，平均體重減少11％。另一方面，抗-IL-6受體抗體施用組中觀察到統(tǒng)計學上明顯的抑制體重減輕，并且維持與細胞轉移前相同的體重。此外，炎性腸道疾病的組織學得分也顯示出炎性腸道疾病的改善。
關于體重變化的統(tǒng)計學檢驗首先進行ANOVA(方差分析，SPSS for Windows版本6,SPSS公司)分析，以確證顯著性，隨后用Bonferroni方法進行多重比較，其中觀察到顯著性水平為5％。
這種模型與人炎性腸道疾病非常相似，因此表明抗-IL-6受體的抗體作為炎性腸道疾病(如潰瘍性結腸炎或節(jié)段性回腸炎)的預防或治療劑是有效的。
表1抗-IL-6受體的抗體抑制體重減輕和炎性腸道疾病惡化

體重變化由均值=群體標準差表示。
炎性腸道疾病分值由群體均值表示參考實施例1.人可溶性IL-6受體的制備通過PCR方法，使用包含編碼根據(jù)Yamasaki等人方法獲得的IL-6受體(Yamaski,K.等人，科學(1988)241,825-828)的cDNA之質(zhì)粒pBSF2R.236，制備可溶性IL-6受體。質(zhì)粒pBSF2R.236由限制酶SphI消化，獲得IL-6受體的cDNA，然后插入mp18(Amersham公司生產(chǎn))。使用設計插入IL-6受體cDNA一個終止密碼子的合成寡聚引物，采用體外突變系統(tǒng)(Amershan生產(chǎn))通過PCR方法，在IL-6受體cDNA中產(chǎn)生一個突變。該方案導致在氨基酸345位插入一個終止密碼子。并產(chǎn)生編碼可溶性IL-6受體的cDNA。
為了在CHO細胞中表達可溶性IL-6受體的cDNA，將其連接到質(zhì)粒pSV(Pharmacia生產(chǎn))中獲得質(zhì)粒pSVL 344。由HindⅢ-SalⅠ酶切的可溶性IL-6受體cDNA插入包含dhfr cDNA的質(zhì)粒pECEdhfr中，以獲得能在CHO細胞中表達的質(zhì)粒pECEdhfr 344。
使用磷酸鈣沉淀法(Chen C.等人，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)(1987)7,2745-2751)將10μg質(zhì)粒pECEdhfr 344轉染到dhfr-CHO細胞系DXB-11(Urland等人，美國國家科學院院報(1980)77,4216-4220)。轉染的CHO細胞在無核苷的αMEM選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)3星期，該培養(yǎng)基中含有1mM谷氨酰胺、10％透析的FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。
選擇的CHO細胞通過有限稀釋法篩選獲得單個CHO細胞克隆。CHO細胞克隆在20nM-200nM氨甲喋呤(MTX)中擴增獲得生產(chǎn)人可溶性IL-6受體的CHO細胞系5E27。CHO細胞系5E27培養(yǎng)在含5％FBS的Iscov改良Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM，Gibco生產(chǎn))中。收集培養(yǎng)上清液，并用ELISA測定培養(yǎng)上清液中可溶性IL-6受體的濃度。結果證實培養(yǎng)上清液中含有可溶性IL-6受體。參考實施例2.人IL-6抗體的制備用10μg重組IL-6(Hirano等人，免疫學信件(Immunol.Lett.)1741,1988)和福氏完全佐劑免疫BALB/C小鼠，并且每星期重復一次直到血清中可檢測出抗-IL-6抗體。從局部淋巴結中取出免疫細胞，然后用聚乙二醇1500與骨髓瘤細胞系P3U1融合。根據(jù)Oi等人應用HAT培養(yǎng)基的方法(細胞免疫學中的篩選方法，W.H.Freeman和Co.,舊金山，351，1980)篩選雜交瘤，建立生產(chǎn)人IL-6抗體的雜交瘤。
生產(chǎn)人IL-6抗體的雜交瘤按以下方法進行IL-6結合實驗。因此，由柔韌的聚乙烯制造的96孔微量滴定板(Dynatech實驗室公司，Alexandra,VA)包被100μl山羊抗小鼠Ig(10μl/ml,Cooper生物醫(yī)學公司生產(chǎn)，Malvern,PA)，4℃過夜。隨后用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS室溫處理2小時。
PBS沖洗后每孔加入100μl雜交瘤培養(yǎng)上清液，4℃孵育過夜。洗板后每孔加入125I標記的重組IL-6至濃度為2000cpm/0.5ng/孔，然后用γ計數(shù)儀(Beckman Gamma 9000,Beckman儀器，F(xiàn)ullerton,CA)在洗板后測定每孔的放射性。216個雜交瘤克隆中32個為IL-6結合實驗陽性。最終從這些克隆中獲得穩(wěn)定的MH166.BSF2。由該雜交瘤生產(chǎn)的抗-IL-6抗體MH166具有IgG1κ亞型。
然后采用IL-6依賴型小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2檢測MH166抗體對雜交瘤生長的中和活性。分散MH60.BSF2細胞至1×104/200μl/孔，并加入含MH166抗體的樣品，培養(yǎng)48小時，加入0.5μCi/孔3H-胸苷(New Engliand Nuclear，波士頓，MA)繼續(xù)培養(yǎng)6小時。將細胞置于玻璃濾紙上用自動收獲器(LaboMash科學公司，Tokyo,Japan)處理。兔抗-IL-6抗體用作對照。
結果，MH166抗體以劑量依賴的方式抑制了由IL-6誘導的MH60.BSF2細胞對3H-胸苷的摻入。由此表明MH166抗體中和了TT-6的活性。參考實施例3.人抗-IL-6受體的抗體的制備由Hirata等人的方法(Hirata,Y.等人，免疫學雜志143,2900-2906,1989)制備的抗-IL-6受體的抗體根據(jù)吸附原則與CNBr活化的Sepharose 4B(Pharmacia精細化工生產(chǎn)，Piscataway,NJ)結合，IL-6受體(Yamasaki,K.等人，科學(1988)241,825-828)獲得純化。人骨髓瘤細胞系U266用含1％毛地黃皂苷(Wako化工生產(chǎn))、10mM三乙醇胺(pH7.8)和0.15M NaCl(毛地黃皂苷緩沖液)的1mM鹽酸對氨基苯甲烷磺酸氟溶解，并與結合在Sepharose 4B珠上的MT18抗體混合。然后用毛地黃皂苷緩沖液沖洗珠體6次以制備部分純化的IL-6受體。
用以上從3×109U266細胞中獲得的部分純化的IL-6受體每隔10天免疫一次BALB/C小鼠，共免疫4次，然后用標準方法制備雜交瘤。根據(jù)以下描述的方法檢測陽性生長孔雜交瘤培養(yǎng)上清液與IL-6受體結合的活性。5×107U266細胞用35S－蛋氨酸(2.5mCi)標記，并用以上毛地黃皂苷緩沖液溶解。溶解的U266細胞與0.04ml與Sepharose 4B珠結合的MT18抗體混合，然后用毛地黃皂苷緩沖液洗6次。用0.25ml毛地黃皂苷緩沖液(pH3.4)洗脫35S-蛋氨酸標記的IL-6受體，并用0.025ml 1M Tris(pH7.4)中和。
0.05ml雜交瘤培養(yǎng)上清液與0.01ml蛋白G Sepharose(Pharmacia生產(chǎn))混合。沖洗后Sepharose與上述制備的0.005ml35S-標記的IL-6受體溶液孵育。用SDS-PAGE方法分析免疫沉淀，并查找與IL-6受體反應的雜交瘤培養(yǎng)上清液。結果建立了陽性雜交瘤克隆PM-1。由PM-1雜交瘤生產(chǎn)的抗體具有IgG1κ亞型。
使用人骨髓瘤細胞系U266研究雜交瘤PM-1生產(chǎn)的抗體其抑制IL-6與人IL-6受體結合的活性。從大腸桿菌制備的人重組IL-6(Hirano等人，免疫學通信(741-45,1988)采用Bolton-Hunter試劑(New England Nuclear,Boston,MA)(Taga,T.等人，實驗醫(yī)學雜志(1987)166,967-981)用125I標記。4×105U266細胞與70％(V/V)PM-1雜交瘤培養(yǎng)上清液以及14,000cmp125I-標記的IL-6室溫共培養(yǎng)1小時。70μl樣品鋪在一個400μl聚乙烯微量離心管中300μl FCS上。離心后測定細胞的放射性。
結果顯示雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體抑制IL-6與IL-6受體的結合。參考實施例4.小鼠抗-IL-6受體的抗體制備根據(jù)Saito，等人，免疫學雜志(1993)147,168-173中描述的方法制備抗小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
生產(chǎn)小鼠可溶性IL-6受體的CHO細胞培養(yǎng)于包含10％FCS的IMDM培養(yǎng)基。用小鼠可溶性IL-6受體抗體RS12(參見Saito等人，出處同上)和裝有Affigel 10凝膠(Biorad生產(chǎn))的親和柱從培養(yǎng)上清液中純化小鼠可溶性IL-6受體。
小鼠可溶性IL-6受體(50μg)與福氏完全佐劑混合后注射到Wistar大鼠的腹腔內(nèi)。施用2星期后用福氏不完全佐劑對動物增強免疫。45天時處死大鼠，以約2×108脾細胞與1×107小鼠骨髓瘤細胞P3U1用50％的PEG1500(Boehringer Mannheim)按常規(guī)方法融合，然后用HAT培養(yǎng)基篩選。
將雜交瘤培養(yǎng)上清液加至用兔抗大鼠IgG抗體(Cappel生產(chǎn))包被的板上之后，加入小鼠可溶性IL-6受體。隨后用兔抗小鼠IL-6受體的抗體和堿性磷酸酶標記的綿羊抗兔IgG，通過ELISA篩選出生產(chǎn)抗-小鼠可溶性IL-6受體的抗體的雜交瘤。當確證生產(chǎn)目的抗體后，對雜交瘤克隆亞篩選2次，直到獲得單一雜交瘤克隆。該克隆命名為MR16-1。
雜交瘤生產(chǎn)的抗體對小鼠IL-6信號轉導的中和活性，通過摻使用MH60.BSF2細胞檢測3H-胸苷的摻入(Matsuda,T.等人，免疫學雜志(1988)18,951-956)得到檢驗。MH60.BSF2細胞以1×104細胞/200μl/孔在96孔微量板上制備。10pg/ml小鼠IL-6和MR16-1抗體或RS12抗體以12.3～1000ng/ml加至每孔，然后在5％CO2及37℃條件下培養(yǎng)44小時，之后加入1μCi/孔3H-胸苷。4小時后測定摻入的3H-胸苷。結果MR16-1抗體抑制了MH60.BSF2細胞對3H-胸苷的摻入。
因此證明雜交瘤MR16-1生產(chǎn)的抗體抑制IL-6與IL-6受體的結合。
工業(yè)應用性根據(jù)本發(fā)明，表明IL-6拮抗劑如抗-IL-6受體的抗體對炎性腸道疾病有治療效果。因此表明IL-6拮抗劑可用作對節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎的治療劑。
權利要求
1．一種包含白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為活性成分的炎性腸道疾病的預防或治療劑。
2．根據(jù)權利要求1的預防或治療劑，其中IL-6拮抗劑為針對IL-6受體的抗體。
3．根據(jù)權利要求2的預防或治療劑，其中針對IL-6受體的抗體為一種針對IL-6受體的單克隆抗體。
4．根據(jù)權利要求3的預防或治療劑，其中針對IL-6受體的抗體為一種針對人IL-6受體的單克隆抗體。
5．根據(jù)權利要求3的預防或治療劑，其中針對IL-6受體的抗體是一種針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
6．根據(jù)權利要求2～5中任何一項的預防或治療劑，其中針對IL-6受體的抗體是一種重組抗體。
7．根據(jù)權利要求4的預防或治療劑，其中針對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
8．根據(jù)權利要求5的預防或治療劑，其中針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
9．根據(jù)權利要求2～4中任何一項的預防或治療劑，其中針對IL-6受體的抗體為針對IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
10．根據(jù)權利要求9的預防或治療劑，其中針對IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
11．根據(jù)權利要求1～10中任何一項的預防或治療劑，其中炎性腸道疾病為節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結腸炎。
12．一種抑制炎性腸道疾病中體重減輕的藥劑，所述藥劑包含IL-6拮抗劑作為活性成分。
13．一種抑制炎性腸道疾病中體重減輕的藥劑，所述藥劑包含針對IL～6受體的抗體作為活性成分。
14．一種預防或治療炎性腸道疾病的方法，該方法包含給對象施用白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑。
15．根據(jù)權利要求14的方法，其中IL-6拮抗劑為針對IL-6受體的抗體。
16．根據(jù)權利要求15的方法，其中針對IL-6受體的抗體為一種針對IL-6受體的單克隆抗體。
17．根據(jù)權利要求16的方法，其中針對IL-6受體的抗體為一種針對人IL-6受體的單克隆抗體。
18．根據(jù)權利要求16的方法，其中針對IL-6受體的抗體為一種針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
19．根據(jù)權利要求15～18中任何一項的方法，其中針對IL-6受體的抗體是一種重組抗體。
20．根據(jù)權利要求17的方法，其中針對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
21．根據(jù)權利要求18的方法，其中針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體為MR16-1抗體。
22．根據(jù)權利要求15～17中任何一項的方法，其中針對IL-6受體的抗體為針對IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
23．根據(jù)權利要求22的方法，其中針對IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
24．根據(jù)權利要求14～23中任何一項的方法，其中炎性腸道疾病為節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結腸炎。
25．一種抑制炎性腸道疾病中體重減輕的方法，該方法包含給對象施用IL-6拮抗劑。
26．一種抑制炎性腸道疾病體重減輕的方法，該方法包含給對象施用針對IL-6受體的抗體。
27．白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑用于制備炎性腸道疾病預防或治療劑的用途。
28．根據(jù)權利要求27的用途，其中IL-6拮抗劑為針對IL-6受體的抗體。
29．根據(jù)權利要求28的用途，其中針對IL-6受體的抗體為針對IL-6受體的單克隆抗體。
30．根據(jù)權利要求29的用途，其中針對IL-6受體的抗體為針對人IL-6受體的單克隆抗體。
31．根據(jù)權利要求29的用途，其中針對IL-6受體的抗體為針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
32．根據(jù)權利要求28～31中任何一項的用途，其中針對IL-6受體的抗體是一種重組抗體。
33．根據(jù)權利要求30的用途，其中針對人IL-6受體的單克隆抗體為PM-1抗體。
34．根據(jù)權利要求31的用途，其中針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體為MR16-1抗體。
35．根據(jù)權利要求28～30中任何一項的用途，其中針對IL-6受體的抗體為針對IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
36．根據(jù)權利要求35的用途，其中針對IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
37．根據(jù)權利要求27～36中任何一項的用途，其中炎性腸道疾病為節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結腸炎。
38．IL-6拮抗劑用于生產(chǎn)抑制炎性腸道疾病中體重減輕的藥劑的用途。
39．針對IL-6受體的抗體用于生產(chǎn)抑制炎性腸道疾病中體重減輕的藥劑的用途。
全文摘要
一種炎性腸道疾病如節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎的預防或治療劑,該藥劑包含作為活性成分的白細胞介素－6(IL－6)拮抗劑,如針對IL－6受體的抗體。
文檔編號A61K39/395GK1297357SQ99805209
公開日2001年5月30日 申請日期1999年3月16日 優(yōu)先權日1998年3月17日
發(fā)明者岸本忠三, 伊藤裕章, 山本光成 申請人:中外制藥株式會社, 岸本忠三