專利名稱：通過異種間的核移植產(chǎn)生的胚細胞或干細胞樣細胞系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及通過將動物或人細胞的細胞核植入與供體核不同種的動物的去核卵母細胞而產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞。本發(fā)明更具體地涉及通過將靈長類動物或人細胞的核植入去核的動物卵母細胞，如靈長類動物或具爪動物的卵母細胞，在優(yōu)選的實施方案中為牛去核卵母細胞而產(chǎn)生靈長類動物或人胚細胞或干細胞樣細胞。
本發(fā)明還涉及所得的胚細胞或干細胞樣細胞，優(yōu)選為靈長類動物或人的胚細胞或干細胞樣細胞用于治療，診斷，產(chǎn)生可用于治療或診斷的分化細胞，和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的胚或轉(zhuǎn)基因的分化細胞，細胞系，組織和器官的用途。另外，本發(fā)明所得的胚細胞或干細胞樣細胞本身也可在用于產(chǎn)生嵌合體或無性系，優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因的克隆或嵌合動物的核移植或核轉(zhuǎn)移方法中用作核供體。
據(jù)報道，ES細胞具有多種用途，例如，ES細胞可用作體外分化模型，尤其是可用作研究參與早期發(fā)育調(diào)節(jié)之基因的體外模型。當將小鼠ES細胞導入植入前的小鼠胚胎時可產(chǎn)生種系嵌合體，從而闡明了其多能性(Bradley等，自然，309255-256(1984))。
由于ES細胞能將其基因組轉(zhuǎn)移至下一代，因此，ES細胞具有潛在的實用性，通過使用具有或不具有所需基因修飾的ES細胞可以對家畜進行種系操作。另外，對家畜，如具爪動物而言，從諸如植入前的家畜胚胎中得到的核能支持去核卵母細胞的按期發(fā)育(Smith等，生物繁殖，401027-1035(1989)；Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994))。這與得自小鼠胚胎的核相反，據(jù)報道得自小鼠胚胎的核在轉(zhuǎn)移后的8-細胞階段后仍不能支持去核卵母細胞的發(fā)育(Cheong等，生物繁殖，48958(1993))。因此，得自家畜的ES細胞非常合乎需要，因為它們可提供潛在的經(jīng)基因操作的或要不然可用于核轉(zhuǎn)移法的全能性供體核來源。
一些研究小組已報道了據(jù)稱為多能性的胚細胞系的分離。例如，據(jù)Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl,43255-260(1991)報道，由豬和綿羊胚泡建立了據(jù)稱為穩(wěn)定的，多能性的細胞系，其中所述胚泡表現(xiàn)出的一些形態(tài)學和生長特性類似于通過免疫切除由綿羊胚泡分離出的內(nèi)細胞團原代培養(yǎng)物的細胞。另外，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl,41:51-56(1990)公開了得自豬胚泡的推定的多能性胚細胞系的維持和分化。另外，Gerfen等，動物生物技術，6(1)1-14(1995)公開了由豬胚泡分離胚細胞系。無需使用條件培養(yǎng)基，這些細胞可在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上穩(wěn)定維持。據(jù)報道，這些細胞在培養(yǎng)的過程中分化為幾個不同的細胞類型(Gerfen等，文獻同上)。
另外，Saito等，Roux’s Arch.Dev.Biol.,201134-141(1992)報道了經(jīng)培養(yǎng)的牛胚胎干細胞-樣細胞系，該細胞系可存活3代，但第4代后即消失。Handyside等，Roux’s Arch.Dev.Biol.,196185-190(1987)公開了在允許分離得自小鼠ICM的小鼠ES細胞系的條件下培養(yǎng)經(jīng)免疫切除分離的綿羊胚胎內(nèi)細胞團。據(jù)Handyside等，(1987)(文獻同上)報道，在上述條件下，綿羊ICM附著，擴散和產(chǎn)生ES細胞樣和內(nèi)胚層樣細胞區(qū)域，但經(jīng)延長培養(yǎng)之后，只有內(nèi)胚層樣細胞清晰可見。
最近，Cherny等，Theriogenology,41175(1994)報道了可在長期培養(yǎng)物中維持的據(jù)稱為多能性的衍生自牛原生殖細胞的細胞系。培養(yǎng)約7天之后，這些細胞產(chǎn)生了ES樣集落，其堿性磷酸酶(AP)的染色為陽性，所述細胞還表現(xiàn)出形成胚狀體并自動分化成至少兩種不同細胞類型的能力。據(jù)報道，這些細胞還表達了轉(zhuǎn)錄因子OCT4,OCT6和HES1的mRNA，而據(jù)信只有ES細胞能表達該同源框基因模式。
最近，據(jù)Campbell等，自然，38064-68(1996)報道，對經(jīng)培養(yǎng)的胚盤(ED)細胞進行核轉(zhuǎn)移之后產(chǎn)生了活的羔羊，其中所述ED細胞得自在促使分離小鼠ES細胞系的條件下培養(yǎng)的9天齡綿羊胚胎，作者根據(jù)實驗結(jié)果得出下列結(jié)論即通過核轉(zhuǎn)移，得自9天齡綿羊胚胎的ED細胞是全能性的，并且該全能性能在培養(yǎng)中維持。
Van Stekelenburg-Hamers等，Mol.Reprod.Dev.,40444-454(1995)報道了得自牛胚泡內(nèi)細胞團細胞的據(jù)稱為永久細胞系的分離和鑒定。作者在不同的條件下分離并培養(yǎng)了得自8或9天齡牛胚泡的ICM以確定何種飼養(yǎng)細胞和培養(yǎng)基能最有效地支持牛ICM細胞的附著和過度生長。他們根據(jù)實驗結(jié)果得出結(jié)論使用STO(小鼠成纖維細胞)飼養(yǎng)細胞(以替代牛子宮上皮細胞)和使用炭-剝離的血清(而不是正常血清)添加至培養(yǎng)基中可以增強經(jīng)培養(yǎng)的ICM細胞的附著和過度生長。然而，據(jù)Van Stekelenburg等報道，上述細胞系更類似于上皮細胞而不是多能性的ICM細胞。
另外，Smith等(WO94/24274,1994年10月27日公開)，Evans等(WO90/03432,1990年4月5日公開)和Wheeler等(WO94/26889,1994年11月24日公開)報道了動物干細胞的分離，選擇和增殖，據(jù)稱該干細胞可用于得到轉(zhuǎn)基因動物。Evans等(WO90/03432,1990年4月5日公開)還報道了由豬和牛衍生得到據(jù)稱為多能性的胚胎干細胞，該胚胎干細胞據(jù)稱可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。另外，Wheeler等(WO94/26884,1994年11月24日公開)公開了據(jù)稱可用于制備嵌合和轉(zhuǎn)基因的具爪動物的胚胎干細胞。因此，根據(jù)上述，很多研究小組顯然想嘗試產(chǎn)生ES細胞系，因為ES細胞系能潛在地用于產(chǎn)生克隆的或轉(zhuǎn)基因的胚胎并可用于核移植。
也有人報道了使用具爪動物的ICM細胞進行核移植。例如，Collas等，Mol.Reprod.Dev.,38264-267(1994)公開了通過將經(jīng)裂解的供體細胞微量注射至去核的成熟卵母細胞而對牛ICM進行核移植。該文獻公開了在體外將胚胎培養(yǎng)7天以產(chǎn)生15個胚泡，通過轉(zhuǎn)移至牛受體，導致4個妊娠和2個出生。Keefer等.，生物繁殖，50935-939(1994)公開了在核轉(zhuǎn)移方法中使用牛ICM細胞為供體核以產(chǎn)生胚泡，通過移植至牛受體，導致產(chǎn)生幾個活的后代。另外，Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,906143-6147(1993)公開了通過將經(jīng)短期體外培養(yǎng)的牛ICM細胞的核轉(zhuǎn)移至去核的成熟卵母細胞中而產(chǎn)生小牛。
另外，也有人報道了對經(jīng)培養(yǎng)的胚盤細胞進行核轉(zhuǎn)移之后產(chǎn)生了活的羔羊(Campbell等，自然，38064-68(1996))。還有人報道在核轉(zhuǎn)移中使用牛多能性胚細胞并產(chǎn)生嵌合的胎兒(Stice等，生物繁殖，54100-110(1996)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.,38264-267(1994))。
另外，也有人嘗試產(chǎn)生異種間的(cross species)NT單位(Wolfe等，Theriogenology,33350(1990))。具體地說，是將牛胚細胞與野牛的卵母細胞融合以產(chǎn)生一些可能具有內(nèi)細胞團的異種間的NT單位。然而，在核轉(zhuǎn)移方法中使用的供體核源自胚細胞而不是成年細胞。理論上，胚細胞比成年細胞更易于重編程序。該項研究與早期在蛙中進行的NT研究屬于同一個時期(參見Diberardino，分化，1717-30(1980))。該項研究包括在系統(tǒng)發(fā)育上非常類似的動物(牛細胞核和野牛的卵母細胞)。與此相反，當在NT過程中融合更具多樣性的種時(牛細胞核移植至倉鼠卵母細胞)，未得到內(nèi)細胞團結(jié)構(gòu)。另外，以前無人報道得自NT單位的內(nèi)細胞團能用于形成可被增殖的ES細胞樣集落。
Collas等(文獻同上)教導了使用顆粒細胞(成年體細胞)產(chǎn)生牛核轉(zhuǎn)移胚胎。然而，與本發(fā)明不同的是，這些實驗不涉及異種間的核轉(zhuǎn)移，而且與本發(fā)明不同的是，未得到ES樣細胞集落。
最近，美國專利5,843,780(1998年12月1日授權于James A.Thomson，隨后轉(zhuǎn)讓于Wisconsin Alumni研究基金會)聲稱公開了純化的靈長類動物胚胎干細胞制品，它能(ⅰ)在體外培養(yǎng)中增殖1年以上；(ⅱ)保持核型，其中靈長類動物的所有染色體特性都存在并且在延長培養(yǎng)的過程中沒有顯著的變化；(ⅲ)在培養(yǎng)過程中保持分化成內(nèi)胚層，中胚層和外胚層組織衍生物的潛力；和(ⅳ)當在成纖維細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)時不能分化。據(jù)以前的報道，這些細胞的SSEA-1標記為陰性，SEA-3標記為陽性，SSEA-4標記為陽性，而現(xiàn)在這些細胞可表達堿性磷酸酶活性，是多能性的，并具有包括靈長類動物的所有染色體特性的存在且其中無一染色體有所變化的核型。另外，這些細胞的TRA-1-60和TRA-1-81標記為陽性。據(jù)稱，當注射至SCID小鼠時，該細胞可分化成內(nèi)胚層，中胚層和外胚層細胞。Thomson等在科學，2821145-1147和Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 927844-7848(1995)中也討論了據(jù)稱衍生自人或靈長類動物胚細胞的胚胎干細胞系。
因此，Thomson公開了據(jù)稱為非人靈長類動物和人的胚細胞或干細胞樣細胞及其生產(chǎn)方法。然而，目前仍需要研究移植受體自身的人胚細胞或干細胞樣細胞的生產(chǎn)方法，因為所述細胞具有顯著的治療和診斷潛力。
在此方面，已鑒定出多種可由細胞移植治療的人類疾病。例如，帕金森氏病是由黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元退化引起的。帕金森氏病的標準療法包括施用L-DOPA，這可以暫時緩解多巴胺的損失，但可導致嚴重的副作用，最終并不能逆轉(zhuǎn)疾病的進程。另一種治療帕金森氏病的不同方法據(jù)稱在治療很多腦病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面有廣泛的用途，該方法包括將胎兒或新生動物的細胞或組織植入成年的腦中。得自胎兒多個腦區(qū)的神經(jīng)元可摻入成年腦中。這種移植物可以緩解實驗室動物經(jīng)實驗誘導的行為缺陷，包括復雜的認知功能缺陷。由人臨床試驗得到的最初的試驗結(jié)果也是有希望的。然而，由流產(chǎn)得到的人胎兒細胞或組織供給十分有限，另外，由流產(chǎn)胎兒得到細胞或組織引起了人們廣泛的爭論。
目前，還沒有由患者產(chǎn)生“胎兒-樣”細胞的方法。另外，同種異體移植組織也不容易得到，同種異體移植和異種移植的組織都要遭受移植物排斥。另外，在某些情況下，在移植前對細胞或組織進行基因修飾是有利的。然而，很多經(jīng)過必需的基因修飾的細胞或組織在培養(yǎng)過程中不能較好地分裂，而大多數(shù)的基因轉(zhuǎn)化類型需要快速分裂的細胞。
因此，本領域中顯然需要供應人胚細胞或干細胞樣非分化的細胞以用于移植以及細胞和基因治療。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供新的和改良的產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞的方法。
本發(fā)明更具體的目的是提供新的產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞的方法，所述方法包括將哺乳動物或人細胞的核植入異種去核卵母細胞中。
本發(fā)明的另一個更具體的目的是提供新的產(chǎn)生非人靈長類動物或人胚細胞或干細胞樣細胞的方法，所述方法包括將非人靈長類動物或人細胞的核植入去核的動物或人卵母細胞中，如具爪動物，人或靈長類動物去核的卵母細胞中。
本發(fā)明的另一個更具體的目的是提供新的產(chǎn)生譜系-缺損的非人靈長類動物或人胚細胞或干細胞樣細胞的方法，所述方法包括將非人靈長類動物或人細胞，如成人細胞的核植入去核的非人靈長類動物或人卵母細胞中，其中該細胞經(jīng)基因改造而不能分化成特定的細胞譜系，或者通過例如表達反義DNA或核酶端粒酶基因進行修飾而使細胞變?yōu)椤八劳龅摹?，從而不能產(chǎn)生存活的后代。
本發(fā)明的另一個目的是增強核轉(zhuǎn)移的效力，尤其是通過對核轉(zhuǎn)移所用的供體體細胞進行基因工程改造以提供增強胚胎發(fā)育之基因(如MHC Ⅰ家族的基因，尤其是Ped基因，如Q7和/或Q9)的表達從而增強通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的植入前胚胎的發(fā)育。
本發(fā)明的另一個目的是通過IVP增強核轉(zhuǎn)移胚胎的產(chǎn)生，更具體地為通過對核轉(zhuǎn)移所用的供體細胞進行基因改造而使細胞對細胞凋亡具有抗性以增強核轉(zhuǎn)移胚胎的產(chǎn)生，例如通過導入可提供抑制細胞凋亡之基因(如Bcl-2或Bcl-2家族成員)表達的DNA構(gòu)建體和/或通過表達特異于可在胚胎早期發(fā)育過程中誘導細胞凋亡之基因的反義核酶以增強核轉(zhuǎn)移胚胎的產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一個目的是通過對供體細胞進行基因改造而使它們表達編碼與可測標記(如肉眼可見的熒光標記蛋白)相連的特定細胞周期蛋白的DNA構(gòu)建體，從而改善對特定細胞周期，如G1期的供體細胞的選擇而最終改善核轉(zhuǎn)移的效力。
本發(fā)明的另一個目的是通過在一種或多種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選為一種或多種capsase抑制劑的存在下培養(yǎng)體外產(chǎn)生的胚胎，從而抑制細胞凋亡以增強所述胚胎的發(fā)育。
本發(fā)明的另一個目的是提供通過將動物或人細胞的核植入異種去核卵母細胞中而產(chǎn)生的胚細胞或干細胞樣細胞。
本發(fā)明的另一個更具體的目的是提供通過將靈長類動物或人細胞的核植入去核的動物卵母細胞，如人，靈長類動物或具爪動物的去核卵母細胞中而產(chǎn)生的靈長類動物或人胚細胞或干細胞樣細胞。
本發(fā)明的另一個目的是將所述胚細胞或干細胞樣細胞用于治療或診斷。
本發(fā)明的具體目的是使用所述靈長類動物或人胚細胞或干細胞樣細胞治療或診斷任何進行細胞，組織或器官移植對其治療或診斷有利的疾病。
本發(fā)明的另一個具體的目的是使用本發(fā)明產(chǎn)生的胚細胞或干細胞樣細胞產(chǎn)生分化的細胞，組織或器官。
本發(fā)明更具體的目的是使用本發(fā)明產(chǎn)生的靈長類動物或人胚細胞或干細胞樣細胞產(chǎn)生分化的人細胞，組織或器官。
本發(fā)明的另一個具體的目的是使用本發(fā)明產(chǎn)生的胚細胞或干細胞樣細胞產(chǎn)生經(jīng)基因工程改造的胚細胞或干細胞樣細胞，該細胞可用于產(chǎn)生經(jīng)基因工程改造的或轉(zhuǎn)基因的分化的人細胞，組織或器官，例如用于基因治療。
本發(fā)明的另一個具體的目的是將本發(fā)明體外產(chǎn)生的胚細胞或干細胞樣細胞用于例如研究細胞分化和檢測用途(如用于藥物研究)。
本發(fā)明的另一個目的是提供改良的移植療法，所述方法包括使用由本發(fā)明產(chǎn)生的胚細胞或干細胞樣細胞產(chǎn)生的等基因或同基因細胞，組織或器官。所述療法可以治療的疾病包括例如帕金森氏病，杭廷頓氏舞蹈病，早老性癡呆，ALS，脊髓損傷，多發(fā)性硬化，肌營養(yǎng)不良，糖尿病，肝病，心臟病，軟骨替換，燒傷，血管病，泌尿道病，以及免疫缺損，骨髓移植，癌癥等疾病。
本發(fā)明的另一個目的是將本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因的或經(jīng)基因改造的胚細胞或干細胞樣細胞用于基因治療，尤其是用于治療和/或預防上述疾病和損傷。
本發(fā)明的另一個目的是將本發(fā)明產(chǎn)生的胚細胞或干細胞樣細胞或本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因的或經(jīng)基因改造的胚細胞或干細胞樣細胞用作核移植中所用的核供體。
本發(fā)明的另一個目的是使用本發(fā)明產(chǎn)生的經(jīng)基因改造的ES細胞來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，如非人靈長類動物，嚙齒類動物，具爪動物等。所述轉(zhuǎn)基因動物可用于產(chǎn)生例如研究人類疾病或生產(chǎn)所需多肽，如治療劑或營養(yǎng)藥物所需的動物模型。
本發(fā)明的上述和其它目的，優(yōu)點和特征將在下文中具體體現(xiàn)，因此，參照下列有關本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述和所附權利要求書將會更清楚地理解本發(fā)明的特征。
圖2至5是得自

圖1所示NT單位的胚胎干細胞樣細胞的照片。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過核轉(zhuǎn)移或核移植產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞，更具體地為非人靈長類動物或人的胚細胞或干細胞樣細胞的新方法。在本申請中，核轉(zhuǎn)移或核移植或NT可以互換使用。
如上所述，通過核轉(zhuǎn)移或核移植分離真正的胚細胞或干細胞樣細胞尚無人報道。相反，以前報道的ES-樣細胞分離自受精的胚胎。另外，從未有人報道過包括基因不相似的種的細胞或DNA，更具體地為包括一個種(如人)的成年細胞或DNA和另一個不相關種的卵母細胞的成功的核轉(zhuǎn)移。相反，盡管有人報道通過融合密切相關種的細胞產(chǎn)生了胚胎，如牛-山羊和牛-野牛，但它們不能產(chǎn)生ES細胞(Wolfe等，Theriogenology,33(1)350(1990))。另外，也無人報道過由非胎兒組織來源產(chǎn)生靈長類動物或人的ES細胞的方法。相反，目前可以得到的有限的人胎兒細胞和組織必須得自或衍生自自發(fā)流產(chǎn)的組織和流產(chǎn)的胎兒。
在本發(fā)明之前，無人可通過異種間的核移植得到胚細胞或于細胞樣細胞。
本發(fā)明人十分出乎意料地發(fā)現(xiàn)通過將人細胞(如成年分化的人細胞)的核植入去核的動物卵母細胞中，用于產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移(NT)單位，其中的細胞通過培養(yǎng)可產(chǎn)生人胚細胞或干細胞樣細胞和細胞集落，即可得到人胚細胞或干細胞樣細胞和細胞集落。此結(jié)果非常令人驚奇，因為該結(jié)果首次闡明了有效的異種間核移植，它包括將分化的供體細胞或核導入基因上不相似的種的去核卵母細胞，例如將分化的動物或人細胞，如成年細胞的細胞核植入不同動物種的去核卵中以產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移單位，當在適當條件下培養(yǎng)其中所含的細胞時即可產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞和細胞集落。
優(yōu)選將用于產(chǎn)生ES樣細胞的NT單位培養(yǎng)至大小至少為2至400個細胞，更優(yōu)選為4至128個細胞，最優(yōu)選大小至少約為50個細胞。
在本發(fā)明中，胚細胞或干細胞樣細胞指的是本發(fā)明產(chǎn)生的細胞。本申請中將這些細胞稱為干細胞樣細胞而不是干細胞的原因是它們一般是通過異種間的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的。盡管預期這些細胞具有與正常干細胞相似的分化能力，但由于它們產(chǎn)生的方式的特殊性而使它們也具有一些不顯著的差異。例如，這些干細胞樣細胞具有核轉(zhuǎn)移所用卵母細胞的線粒體，因此，其行為方式與常規(guī)的胚胎干細胞不同。
本發(fā)現(xiàn)基于下列觀察結(jié)果將成人細胞，尤其是得自人供體口腔的人上皮細胞的細胞核植入去核的牛卵母細胞時，導致形成核轉(zhuǎn)移單位，通過培養(yǎng)其中的細胞可產(chǎn)生人干細胞樣細胞或胚細胞和人胚細胞或干細胞樣細胞集落。最近，通過將成人角質(zhì)細胞植入去核的牛卵母細胞中，成功地產(chǎn)生了胚泡和ES細胞系而再現(xiàn)了上述結(jié)果。根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明人提出下列假說，即牛卵母細胞和人卵母細胞和可能是普遍的哺乳動物卵母細胞在胚胎發(fā)育過程中必須經(jīng)過成熟的過程，該成熟過程足夠相似或保守以使牛卵母細胞能用作人卵母細胞的有效替代物。顯然，卵母細胞實際上普遍含有蛋白質(zhì)或核酸類因子，可在適當條件下誘導胚胎發(fā)育，不同種中的這些功能相同或非常類似。這些因子可含有物質(zhì)RNA和/或端粒酶。
根據(jù)人細胞核可有效植入牛卵母細胞這一事實，可合理地預期人細胞可植入其它非相關種，如其它具爪動物以及其它動物的卵母細胞中。尤其是，其它具爪動物的卵母細胞應該是適合的，例如豬，綿羊，馬，山羊等。另外，其它來源的卵母細胞應該是適合的，例如得自其它靈長類動物，兩棲類動物，嚙齒類動物，兔，豚鼠等的卵母細胞。另外，使用類似的方法，應該可以將人細胞或細胞核轉(zhuǎn)移至人卵母細胞中并使用所得的胚細胞產(chǎn)生人ES細胞。
因此，在最寬的實施方案中，本發(fā)明包括通過注射或融合將動物或人細胞核或動物或人細胞植入不同于供體核之動物種的去核卵母細胞中以產(chǎn)生NT單位，該NT單位中所含的細胞可用于得到胚細胞或干細胞樣細胞和/或細胞培養(yǎng)物。例如，本發(fā)明包括通過注射或融合將具爪動物的細胞核或具爪動物的細胞植入另一種，如另一種具爪動物或非具爪動物的去核卵母細胞中，細胞和/或核混合產(chǎn)生NT單位，在適當條件下培養(yǎng)NT單位的細胞可得到多細胞的NT單位，優(yōu)選其含有至少約2至400個細胞，更優(yōu)選為4至128個細胞，最優(yōu)選至少約為50個細胞。該NT單位的細胞經(jīng)培養(yǎng)后可用于產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞或細胞集落。
然而，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括通過將供體人細胞的核或人細胞植入去核的人，靈長類動物或非靈長類動物的卵母細胞，如具爪動物的卵母細胞，在優(yōu)選實施方案中為牛去核的卵母細胞中而產(chǎn)生非人靈長類動物或人胚細胞或干細胞樣細胞。
通常，可通過包括下列步驟的核轉(zhuǎn)移方法產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞(ⅰ)得到所需的人或動物細胞以用作供體核的來源(可對其進行基因修飾)；(ⅱ)從適當來源，如哺乳動物和最優(yōu)選為靈長類動物或具爪動物來源，如牛得到卵母細胞；(ⅲ)使所述卵母細胞去核；(ⅳ)通過融合或注射將人或動物細胞或核轉(zhuǎn)移至不同于供體細胞或核之動物種的去核的卵母細胞中；(ⅴ)培養(yǎng)所得的NT產(chǎn)物或NT單位以產(chǎn)生多細胞結(jié)構(gòu)；和(ⅵ)培養(yǎng)得自所述胚胎的細胞以得到胚細胞或干細胞樣細胞和干細胞樣細胞集落。
核轉(zhuǎn)移技術或核移植技術已在文獻中公開并描述于發(fā)明背景中提及的很多參考文獻中。例見Campbell等，Theriogenology,43181(1995)；Collas等，Mol.Report Dev.,38264-267(1994)；Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994)；Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,906143-6147(1993)；WO94/26884；WO94/24274和WO90/03432(皆全文列入本文作為參考)。另外，美國專利4,944,384和5,057,420中描述了牛核移植的方法，該方法也見Cibelli等，科學，Vol.2801256-1258(1998)。
通過眾所周知的方法可得到和培養(yǎng)人或動物細胞，優(yōu)選為哺乳動物細胞?？捎糜诒景l(fā)明的人和動物細胞包括例如上皮細胞，神經(jīng)細胞，表皮細胞，角質(zhì)細胞，造血細胞，黑素細胞，軟骨細胞，淋巴細胞(B和T淋巴細胞)，其它免疫細胞，紅細胞，巨噬細胞，黑素細胞，單核細胞，成纖維細胞，心肌細胞和其它肌細胞等。另外，用于核轉(zhuǎn)移的人細胞可得自不同器官，如皮膚，肺，胰腺，肝臟，胃，腸，心臟，生殖器官，膀胱，腎臟，尿道和其它泌尿器官等。這些只是適當供體細胞的例子。適當供體細胞，即可用于本發(fā)明的細胞可得自身體的任何細胞或器官，它包括所有體細胞或生殖細胞。優(yōu)選地，供體細胞或核可含有活躍分裂的，即非休眠的細胞，因為據(jù)報道這樣可以增強克隆效力。另外，也優(yōu)選這種供體細胞處于G1細胞周期。
根據(jù)Thomson等，科學，2821145-1147(1998)和Thomson等.，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 927544-7848(1995)(皆全文列入本文作為參考)報道的培養(yǎng)方法，可使用所得的胚細胞得到胚胎干細胞系。
可用作核轉(zhuǎn)移供體的細胞的例子是得自人供體口腔的上皮細胞和成人角質(zhì)細胞。然而，如上文所討論的，公開的方法也適用于其它人細胞或核。另外，細胞核可得自人體細胞和生殖細胞。
也可以在核轉(zhuǎn)移之前，使用本領域已知的適當技術使供體細胞停滯于有絲分裂階段。將細胞周期終止于不同階段的方法詳細描述于美國專利5,262,409(列入本文作為參考)。具體地說，盡管據(jù)報道環(huán)己酰亞胺對有絲分裂具有抑制作用(Bowen和Wilson(1995)J.Heredity453-9)，但當其與電脈沖處理聯(lián)合使用時，仍可用于改善對成熟的牛泡內(nèi)卵母細胞的激活(Yang等(1992)，生物繁殖，42(Suppl.1)117)。
接合子基因激活與組蛋白H4的超乙?；嘘P。與其它化合物一樣，制滴菌素-A能以可逆的方式抑制組蛋白脫乙?；?Adenot等，在1-細胞小鼠胚胎的原核中，父本和母本染色質(zhì)的差異性的H4乙酰化優(yōu)先于DNA復制和示差轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)育(1997,11)124(22)4615-4625；Yoshida等，制滴菌素A和trapoxin探測組蛋白乙?；瘜θ旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之作用的新的化學探針(1995,5)17(5)423-430)。
例如，據(jù)信丁酸也可通過抑制組蛋白脫乙?；付鴮е陆M蛋白的超乙?；?。一般說來，丁酸似乎能修飾基因表達，在幾乎所有的情況下，在培養(yǎng)的細胞中加入丁酸似乎能抑制細胞生長。丁酸在此方面的用途描述于美國專利5,681,718(列入本文作為參考)。因此，在融合之前可將供體細胞暴露于制滴菌素A或另一種適當?shù)拿撘阴；敢种苿┲?，或者在激活基因組之前將這種化合物加入培養(yǎng)基中。
另外，據(jù)認為，轉(zhuǎn)錄因子適當接近DNA調(diào)節(jié)序列也需要DNA的脫甲基化。已有人描述了DNA從植入前胚胎的8細胞階段至胚泡階段的完全脫甲基化(Stein等，Mol.Reprod.＆ Dev.47(4)421-429)。另外，據(jù)Jaenisch等(1997)報道，可使用5-氮胞苷降低細胞中的DNA甲基化水平，潛在地導致轉(zhuǎn)錄因子更易于接近DNA調(diào)節(jié)序列。因此，可在融合前將供體細胞暴露于5-氮胞苷(5-Aza)，或從8細胞階段至胚泡階段在培養(yǎng)基中加入5-Aza。或者，也可使用其它已知的方法來實現(xiàn)DNA的脫甲基化。
用于核轉(zhuǎn)移的卵母細胞可得自包括哺乳動物和兩棲類動物的動物。卵母細胞適當?shù)牟溉閯游飦碓窗ㄑ颍?，綿羊，豬，馬，兔，山羊，豚鼠，小鼠，倉鼠，大鼠，靈長類動物，人等。在優(yōu)選的實施方案中，卵母細胞得自靈長類動物或具爪動物，如牛。
分離卵母細胞的方法是本領域眾所周知的。實質(zhì)上，該方法包括從哺乳動物或兩棲類動物，如牛的卵巢或生殖道中分離卵母細胞。牛卵母細胞易于獲得的來源是屠宰場。
為了成功地使用諸如基因工程，核轉(zhuǎn)移和克隆的技術，一般必須在將卵母細胞用作核轉(zhuǎn)移的受體細胞之前，或在卵母細胞與精細胞受精以發(fā)育成胚胎之前，在體外使卵母細胞成熟。該方法一般需要從動物卵巢(如在屠宰場得到的牛卵巢)中收集不成熟(前期Ⅰ)的卵母細胞，并于受精或去核之前在成熟培養(yǎng)基中使卵母細胞成熟直至卵母細胞達到中期Ⅱ階段，對牛卵母細胞而言，該階段一般發(fā)生在吸出后約18至24小時。本發(fā)明中將這段時間稱為“成熟期”。為了計算時間，本文所用的“吸出”指的是從卵泡中吸出不成熟的卵母細胞。
另外，核轉(zhuǎn)移技術中成功使用了已在體內(nèi)成熟的中期Ⅱ階段的卵母細胞。實質(zhì)上，可通過外科手術從開始發(fā)情后或注射人絨膜促性腺激素(hCG)或類似激素之后35至48小時的未超排卵或超排卵的奶?；蛐∧概ｓw內(nèi)采集成熟的中期Ⅱ卵母細胞。
據(jù)報道，去核和核轉(zhuǎn)移時使卵母細胞成熟對NT法的成功意義重大(例見Prather等，分化，481-8,1991)。一般說來，以前成功的哺乳動物胚胎克隆實踐使用中期Ⅱ階段的卵母細胞作為受體卵母細胞，因為據(jù)信在此階段，卵母細胞可以被或足以被“激活”以象處理受精的精子一樣處理導入的核。對家畜，尤其是牛而言，卵母細胞的激活期一般在吸出后約16-52小時，優(yōu)選約28-42小時。
例如，可按Seshagine等，生物繁殖，40,544-606,1989所述用HEPES緩沖的倉鼠胚胎培養(yǎng)基(HECM)洗滌不成熟的卵母細胞，然后于39℃，將卵母細胞置于數(shù)滴成熟培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由50μl含有10％胎牛血清的組織培養(yǎng)基(TCM)199組成，其中還含有適當?shù)拇傩韵偎?，如促黃體素(LH)和促濾泡激素(FSH)和雌二醇，所述培養(yǎng)基上覆蓋了一層輕量石蠟或硅。
在時間固定不變的成熟期之后，一般約為10至40小時，優(yōu)選約為16至18小時之后，使卵母細胞去核。在去核之前，優(yōu)選取出卵母細胞，并在取出一堆細胞之前將其置于含有1mg透明質(zhì)酸酶/ml的HECM中。通過重復地用孔非常細的移液管進行移液或通過短暫地渦旋可以實現(xiàn)此目的。然后篩選剝離的卵母細胞的極體，選擇通過極體的存在測定的中期Ⅱ卵母細胞，然后用于核轉(zhuǎn)移。按下述進行去核。
通過如美國專利4,994,384(列入本文作為參考)所述的已知方法可進行去核。例如，將中期Ⅱ卵母細胞置于任選含有7.5μg松胞菌素B/ml的HECM中立即去核，或者將所述卵母細胞置于含有10％發(fā)情期奶牛血清的適當培養(yǎng)基，如CRlaa中，隨后再進行去核，優(yōu)選不超過24小時之后，更優(yōu)選在16至18小時之后進行去核。
使用顯微外科技術，用微型移液管除去極體和鄰近的胞質(zhì)即可實現(xiàn)去核的目的，然后進行篩選以鑒定出已被成功去核的卵母細胞。通過用1μg 33342 Hoechst染料/ml HECM染色卵母細胞以進行篩選，然后在紫外光照射(少于10秒)下觀察卵母細胞，將已成功去核的卵母細胞置于適當培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明中，優(yōu)選在體外成熟開始之后約10小時至約40小時，更優(yōu)選在體外成熟開始之后約16小時至約24小時，最優(yōu)選在體外成熟開始之后約16至18小時使受體卵母細胞去核。
然后將一般異源于去核卵母細胞的單個動物或人細胞或細胞核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞的卵周隙，以用于產(chǎn)生NT單位?？筛鶕?jù)本領域已知的方法，使用動物或人細胞或細胞核和去核的卵母細胞產(chǎn)生NT單位。例如，可通過電融合融合細胞。通過提供足以導致質(zhì)膜瞬時擊穿的電脈沖即可完成電融合。質(zhì)膜的擊穿非常短暫，因為膜能快速地重新形成。實質(zhì)上，如果兩個鄰接的膜被誘導擊穿的話，通過重新形成脂質(zhì)雙層混合體，兩個細胞之間的小通道即可開放。由于小開口在熱動力學上的不穩(wěn)定性，它會擴大直至兩個細胞變成一個細胞。有關此方法的進一步討論可參照Prather等的美國專利4,997,384(全文列入本文作為參考)。可使用多種電融合介質(zhì)，包括例如蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇和磷酸鹽緩沖溶液。也可使用仙臺病毒為融合劑進行融合(Graham,Wister Inot.Symp.Monogr.,9,19,1969)。
在某些情況下(如供體核較小)，優(yōu)選將核直接注射至卵母細胞而不是使用電穿孔融合。該技術公開于Collas和Barnes,Mol.Reprod.Dev.,38264-267(1994)(全文列入本文作為參考)。
優(yōu)選地，在卵母細胞開始成熟之后約24小時，通過使用90-120V的電脈沖約15微秒，在500μm的槽中電融合人或動物細胞和卵母細胞。融合之后，將所得融合的NT單位置于適當培養(yǎng)基中直至激活，如下文所鑒定的激活。一般很快即可激活，一般在少于24小時之后，優(yōu)選約在4至9小時之后即可激活。
通過已知方法可激活NT單位，所述方法包括例如在低于生理溫度下培養(yǎng)NT單位，實質(zhì)上是對NT單位實施冷的，或?qū)嶋H上涼的溫度休克。通過在室溫下培養(yǎng)NT單位可最方便地實現(xiàn)這一目的，因為室溫比胚胎正常暴露的生理溫度條件更低。
或者，使用已知的激活劑進行激活。例如，已證實精子在受精過程中穿入卵母細胞可激活預融合的卵母細胞，在核轉(zhuǎn)移之后產(chǎn)生更多數(shù)目的活的妊娠和多個基因相同的小牛。諸如電和化學休克的處理或環(huán)己酰亞胺處理也可用于激活融合后的NT胚胎。適當?shù)穆涯讣毎せ罘ㄊ荢usko-Parrish等的美國專利5,496,720(列入本文作為參考)的主題。
例如，通過同時或依次進行下列步驟即可激活卵母細胞(ⅰ)增加卵母細胞中的二價陽離子水平，和(ⅱ)降低卵母細胞中的細胞蛋白質(zhì)的磷酸化。
通過以離子載體的形式，將二價陽離子，如鎂，鍶，鋇或鈣導入卵母細胞的胞質(zhì)中一般即可實現(xiàn)上述目的。增加二價陽離子水平的其它方法包括使用電休克，乙醇處理和籠形螯合劑處理。
通過已知方法可降低磷酸化，例如通過加入激酶抑制劑，如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，如6-二甲基-氨基-嘌呤，星形孢菌素，2-氨基嘌呤和鞘氨醇。
或者，通過將磷酸酶，如磷酸酶2A和磷酸酶2B導入卵母細胞中也可抑制細胞蛋白質(zhì)的磷酸化。
可在適當?shù)捏w外培養(yǎng)基中培養(yǎng)激活的NT單位直至產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞和細胞集落。適于培養(yǎng)和使胚胎成熟的培養(yǎng)基是本領域眾所周知的?？捎糜谂囵B(yǎng)和維持牛胚胎的已知培養(yǎng)基的例子包括Ham’sF-10+10％胎牛血清(FCS)，組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)+10％胎牛血清，Tyrodes-白蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽(TALP)，Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，Eagle’s和Whitten’s培養(yǎng)基。用于收集卵母細胞并使其成熟的一個最常用的培養(yǎng)基是TCM-199，其中添加的1至20％血清包括胎牛血清，新生兒血清，發(fā)情期的奶牛血清，羔羊血清或小公牛血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括含有Earl鹽，10％胎牛血清，0.2MM Ma丙酮酸鹽和50μg/ml硫酸慶大霉素的TCM-199。上述任何培養(yǎng)基也包括與多種細胞類型的共培養(yǎng)，所述細胞如顆粒細胞，輸卵管細胞，BRL細胞，子宮細胞和STO細胞。
尤其是，人子宮內(nèi)膜的上皮細胞可在植入前期和植入期分泌白血病抑制因子(LIF)。因此，在培養(yǎng)基中加入LIF對于增強重構(gòu)胚胎的體外發(fā)育至關重要。給胚細胞或干細胞樣細胞培養(yǎng)物使用LIF描述于美國專利5,712,156(列入本文作為參考)。
另一種維持培養(yǎng)基描述于Rosenkrans,Jr等的美國專利5,096,822(列入本文作為參考)。被稱為CR1的該胚胎培養(yǎng)基含有支持胚胎所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。CR1含有L-乳酸半鈣，其量為1.0mM至10mM，優(yōu)選為1.0mM至5.0mM。L-乳酸半鈣是其中摻有半鈣鹽的L-乳酸鹽。
在培養(yǎng)中維持人胚細胞的適當培養(yǎng)基描述于Thomson等，科學2821145-1147(1998)和Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 927844-7848(1995)。
隨后，優(yōu)選用適當培養(yǎng)基洗滌經(jīng)培養(yǎng)的一個或多個NT單位，然后將細胞置于該培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基如CRIaa培養(yǎng)基，Ham’s F-10，組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)，Tyrodes-白蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽(TALP)，Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，Eagle’s或Whitten’s培養(yǎng)基，優(yōu)選上述培養(yǎng)基中還含有約10％FCS。優(yōu)選在含有適當?shù)匿仢M飼養(yǎng)層的孔板中進行培養(yǎng)。適當?shù)娘曫B(yǎng)層包括例如成纖維細胞和上皮細胞，如得自具爪動物的成纖維細胞和子宮上皮細胞，雞成纖維細胞，鼠(如小鼠或大鼠)成纖維細胞，STO和SI-m220飼養(yǎng)細胞系和BRL細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，飼養(yǎng)細胞含有小鼠胚胎成纖維細胞。制備適當成纖維細胞飼養(yǎng)層的方法描述于下文實施例中，并且是本領域技術人員眾所周知的。
在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)NT單位直至NT單位的大小適于得到可用于產(chǎn)生胚胎干細胞樣細胞或細胞集落的細胞。優(yōu)選將這些NT單位培養(yǎng)至大小至少約為2至400個細胞，更優(yōu)選約為4至128個細胞，最優(yōu)選至少約為50個細胞?？稍谶m當條件下，即在約38.5℃和5％CO2中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時可更換培養(yǎng)基以使生長最優(yōu)化，一般每隔2至5天，優(yōu)選約每隔3天更換1次培養(yǎng)基。
對使用人細胞/去核的牛卵母細胞得到的NT單位而言，約在開始激活卵母細胞之后12天得到足以產(chǎn)生ES細胞集落的細胞，一般約為50個細胞。然而，隨著用作核供體的特定細胞，特定卵母細胞的種和培養(yǎng)條件的不同，上述情況會有所不同。本領域技術人員根據(jù)經(jīng)培養(yǎng)的NT單位的形態(tài)學，易于通過肉眼確定何時已得到所需的足夠數(shù)目的細胞。
對人/人核轉(zhuǎn)移胚胎而言，使用已知可用于維持組織培養(yǎng)中的人細胞的培養(yǎng)基是有利的。適用于培養(yǎng)人胚胎的培養(yǎng)基的例子包括Jones等，人類生殖.，13(1)169-177(1998)報道的培養(yǎng)基，P1-目錄號為#99242的培養(yǎng)基和P-1目錄號為#99292的培養(yǎng)基(這兩種培養(yǎng)基都可得自Irvine Scientific,Santa Ana,California)，以及Thomson等(1998)和(1995)(文獻同上)所用的培養(yǎng)基。
如上所述，本發(fā)明所用的細胞優(yōu)選包括哺乳動物體細胞，最優(yōu)選包括得自活躍增殖(非休眠)的哺乳動物細胞培養(yǎng)物的細胞。在特別優(yōu)選的實施方案中，一般通過添加，缺失或取代所需的DNA序列而對供體細胞進行基因修飾。例如，可用提供所需基因產(chǎn)物，如治療性多肽表達的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化來源于例如人，靈長類動物或牛的供體細胞，如角質(zhì)細胞或成纖維細胞。所述治療性多肽的例子包括淋巴因子，如IGF-Ⅰ,IGF-Ⅱ，干擾素，集落刺激因子，結(jié)締組織多肽(如膠原)，遺傳因子，凝血因子，酶，酶抑制劑等。
如上所述，在核轉(zhuǎn)移之前可對供體細胞進行修飾以獲得其它所需的效果，例如破壞細胞譜系發(fā)育，增強胚胎發(fā)育和/或抑制細胞凋亡。下文將進一步討論合乎需要的修飾的例子。
本發(fā)明一方面包括對供體細胞，如人細胞進行基因修飾以使其譜系存在缺陷，因此當用于核轉(zhuǎn)移時不能產(chǎn)生存活的后代。這對于人核轉(zhuǎn)移胚胎尤其有用，因為出于倫理學的原因，產(chǎn)生存活的胚胎不是人們想要的結(jié)果。通過對人細胞進行基因工程改造，使其用于核轉(zhuǎn)移時不能分化成特定的細胞譜系即可實現(xiàn)上述目的。具體地說，可對細胞進行基因修飾，以使當該細胞用作核轉(zhuǎn)移供體時，所得“胚胎”不含有或基本上缺乏中胚層，內(nèi)胚層或外胚層組織中的至少一個。
希望通過敲除或破壞一個或多個中胚層，內(nèi)胚層或外胚層特定基因的表達來實現(xiàn)上述目的，所述基因的例子包括中胚層SRF,MESP-1,HNF-4,β-l整聯(lián)蛋白，MSD；內(nèi)胚層GATA-6,GATA-4；外胚層RNA解旋酶A,H β58。
上面列出的是參與中胚層，內(nèi)胚層和外胚層發(fā)育之已知基因的非限制性例子。以前的文獻中報道了中胚層缺損，內(nèi)胚層缺損和外胚層缺損細胞和胚胎的產(chǎn)生。例見Arsenian等，EMBO J.,Vol.17(2)6289-6299(1998)；Saga Y,Mech.Dev.,Vol.75(1-2)53-66(1998)；Holdener等，發(fā)育，Vol1 120(5)1355-1346(1994)；Chen等，Genes Dev.Vol.8(20)2466-2477(1994)；Rohwedel等，發(fā)育生物學，201(2)167-189(1998)(中胚層)；Morrisey等，Genes Dev.Vol.12(22)3579-3590(1998)；Soudais等，發(fā)育，Vol.121(11)3877-3888(1995)(內(nèi)胚層)；和Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.95(23)13709-13713(1998)；和Radice等，發(fā)育，Vol.111(3)801-811(1991)(外胚層)。
一般說來，可對所需體細胞，如人角質(zhì)細胞，上皮細胞或成纖維細胞進行基因工程改造以使一個或多個特異于特定細胞譜系的基因被“敲除”和/或所述基因的表達被顯著削弱。通過已知方法，如同源重組可實現(xiàn)此目的?！扒贸彼杌蛩玫膬?yōu)選基因系統(tǒng)公開于Capecchi等的美國專利5,631,153和5,464,764，其中報道了正-負選擇(PNS)載體，該載體能靶向修飾所需哺乳動物基因組中的DNA序列。這種基因修飾可導致細胞當用作核轉(zhuǎn)移供體時不能分化成特定的細胞譜系。
經(jīng)基因修飾的細胞可用于產(chǎn)生譜系-缺損的核轉(zhuǎn)移胚胎，即該胚胎不能產(chǎn)生至少一個功能性的中胚層，內(nèi)胚層或外胚層。因此，即使將所得胚胎植入例如人子宮中，也不會產(chǎn)生存活的后代。然而，由這種核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的ES細胞仍是有用的，因為它們能產(chǎn)生一個或兩個殘留的未被破壞的譜系的細胞。例如，外胚層缺損的人核轉(zhuǎn)移胚胎仍可產(chǎn)生得自中胚層和內(nèi)胚層的分化細胞。通過缺失和/或破壞RNA解旋酶A或H β58基因中的一個或兩個可產(chǎn)生外胚層缺損的細胞。
也可對這些譜系缺損的供體細胞進行基因修飾以表達另一種所需的DNA序列。
因此，經(jīng)基因修飾的供體細胞可產(chǎn)生譜系缺損的胚泡，當鋪平生長時，最多能分化成兩個胚原基層。
或者，可修飾供體細胞以使其“死亡”。通過表達反義DNA或核酶端粒酶基因可實現(xiàn)此目的。通過提供反義DNA或核酶表達的已知基因工程方法或通過基因敲除可實現(xiàn)此目的。當這些“死亡”細胞用于核轉(zhuǎn)移時不能分化成存活的后代。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是產(chǎn)生能在組織培養(yǎng)中更有效生長的核轉(zhuǎn)移胚胎。它之所以有利的原因是它應該能減少產(chǎn)生ES細胞和/或后代(如果將胚泡植入雌性替代物的話)所需的時間和必需的融合。它之所以合乎需要的另一個原因是據(jù)觀察，核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的胚泡和ES細胞具有被削弱的發(fā)育潛力。盡管通過改變組織培養(yǎng)條件經(jīng)?？梢跃徑膺@些問題，但另一種解決辦法是通過增強參與胚胎發(fā)育之基因的表達來增強胚胎發(fā)育。
例如，據(jù)報道，MHC Ⅰ家族成員Ped型基因產(chǎn)物對胚胎發(fā)育非常重要。更具體地說，據(jù)報道，對小鼠植入前胚胎而言，Q7和Q9基因負責“快速生長”表型。因此，希望將提供這些和相關基因，或其人或其它哺乳動物對應物之表達的DNA導入供體細胞會產(chǎn)生生長更加快速的核轉(zhuǎn)移胚胎。相對于通過融合同種細胞或細胞核而產(chǎn)生的核轉(zhuǎn)移胚胎而言，異種間核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的胚胎在組織培養(yǎng)中發(fā)育得較慢，因此，上述方法對其特別有用。
尤其是，可在核轉(zhuǎn)移之前將含有Q7和/或Q9基因的DNA構(gòu)建體導入供體體細胞。例如，可構(gòu)建表達構(gòu)建體，其含有與Q7和/或Q9基因可操作相連的強組成型哺乳動物啟動子，IRES，一個或多個適當?shù)倪x擇標記(如新霉素，ADA,DHFR)和poly-A-序列，如bGH polyA序列。另外，通過包含隔離物(insulate)而進一步增強Q7和Q9基因的表達也是有利的。希望能在胚泡發(fā)育的早期表達這些基因，因為不同種(如牛，山羊，豬，狗，貓和人)中的這些基因是高度保守的。也希望對供體細胞進行改造以插入能增強胚胎發(fā)育的其它基因。因此，這些經(jīng)基因修飾的供體細胞應該能更有效地產(chǎn)生胚泡和植入前期的胚胎。
本發(fā)明的另一方面包括構(gòu)建對細胞凋亡，即編程性細胞死亡具有抗性的供體細胞。據(jù)文獻報道，與細胞死亡相關的基因存在于植入前期的胚胎中(Adams等，科學，281(5381)1322-1326(1998))。據(jù)報道可誘導細胞凋亡的基因包括例如Bad,Bok,BH3,Bik,Hrk,BNIP3,BimL,Bad,Bid和EGL-1。相反，據(jù)報道可保護細胞免受編程性細胞死亡的基因包括例如BcL-XL,Bcl-w,Mcl-1,A1,Nr-13,BHRF-1,LMW5-HL,ORF16,Ks-Bel-2,E1B-19K和CED-9。
因此，可構(gòu)建供體細胞，其中誘導細胞凋亡的基因被“敲除”或其中保護細胞免受細胞凋亡的基因的表達在胚胎發(fā)育過程中被增強或開啟。
例如，通過導入DNA構(gòu)建體即可實現(xiàn)此目的，該構(gòu)建體可在胚胎發(fā)育過程中提供上述保護性基因，如Bcl-2或相關基因的調(diào)控表達。因此，通過在特定的生長條件下培養(yǎng)胚胎即可“開啟”基因?；蛘?，也可將上述基因與組成型啟動子相連。
更具體地說，可構(gòu)建含有與可調(diào)節(jié)的或組成型的啟動子(如PGK,SV40,CMV，遍在蛋白或β-肌動蛋白)，IRES，適當選擇標記和poly-A序列可操作相連的Bcl-2基因的DNA構(gòu)建體，并將其導入所需的供體哺乳動物細胞，如人角質(zhì)細胞或成纖維細胞中。
當這些供體細胞用于產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移胚胎時，它們應該對細胞凋亡具有抗性，從而能在組織培養(yǎng)中更有效地分化，因而，由核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的適當植入前胚胎的速度和/或數(shù)目有所增加。
另一種可得到相同結(jié)果的方法是破壞可誘導細胞凋亡的一個或多個基因的表達。通過敲除這些基因或通過使用針對在胚胎發(fā)育早期表達并誘導細胞凋亡之基因的反義DNA或核酶即可實現(xiàn)此目的，其例子見上文?；蛘?，可構(gòu)建供體細胞，使其含有兩種修飾，即破壞能誘導細胞凋亡的基因和增強可阻止或防止細胞凋亡之基因的表達。影響細胞凋亡之基因的構(gòu)建和選擇，和表達所述基因的細胞系公開于發(fā)明人為Craig B.Thompson等，受讓人為密執(zhí)根大學的美國專利5,646,008(列入本文作為參考)。
增強核轉(zhuǎn)移效力的一種方法是選擇處于特定細胞周期階段的細胞為供體細胞。據(jù)報道，這對核轉(zhuǎn)移效力有顯著影響(Barnes等，Mol.Reprod.Devel.,36(1)33-41(1993))。選擇處于特定細胞周期階段的細胞的不同方法已有人報道，所述方法包括血清饑餓法(Campbell等，自然，38064-66(1996)；Wilmut等，自然，385810-813(1997))和化學同步化(Urbani等，Exp.Cell Res.,219(1)159-168(1995))。例如，可將特定的細胞周期蛋白DNA與調(diào)節(jié)序列以及可測標記，如綠色熒光蛋白(GFP)可操作相連，后面再連接細胞周期蛋白破壞盒，并任選連接有隔離序列以增強細胞周期蛋白和標記蛋白的表達。籍此，易于用肉眼檢測和選擇所需細胞周期的細胞并將其用作核轉(zhuǎn)移供體。例如，為了選擇處于G1期的細胞，需使用細胞周期蛋白D1基因。然而，任何細胞周期蛋白基因都應適用于本發(fā)明(例見King等，細胞分子生物學，Vol.7(9)1343-1357(1996))。
然而，需要以侵害性較小或更有效的方法來產(chǎn)生處于所需細胞周期階段的細胞。希望通過對供體細胞進行基因修飾，使其在可測的條件下表達特定的細胞周期蛋白來實現(xiàn)上述目的。籍此，易于從其它細胞周期中分辨出特定細胞周期的細胞。
細胞周期蛋白是僅在特定的細胞周期階段表達的蛋白質(zhì)。它們包括G1期的細胞周期蛋白D1,D2和D3,G2/M期的細胞周期蛋白B1和B2和S期的細胞周期蛋白E,A和H。這些蛋白質(zhì)易于在cytogolcytosol中被翻譯和破壞。所述蛋白質(zhì)的“瞬時”表達部分歸功于“破壞盒”的存在，此破壞盒是短的氨基酸序列，是可用作標記物以介導經(jīng)由遍在蛋白途徑迅速破壞上述細胞周期蛋白的蛋白質(zhì)的一部分(Adams等，科學，281(5321)1322-1326(1998))。
在本發(fā)明中，可構(gòu)建供體細胞，使其在易于檢測的條件下(優(yōu)選肉眼可見，如通過使用熒光標記)表達一個或多個上述細胞周期蛋白基因。例如，可將特定的細胞周期蛋白DNA與調(diào)節(jié)序列以及可測標記，如綠色熒光蛋白(GFP)可操作相連，后面再連接細胞周期蛋白破壞盒，并任選連接有隔離序列以增強細胞周期蛋白和/或標記蛋白的表達。籍此，易于用肉眼檢測和選擇所需細胞周期的細胞并將其用作核轉(zhuǎn)移供體。例如，為了選擇處于G1期的細胞，需使用細胞周期蛋白D1基因。然而，任何細胞周期蛋白基因都應適用于本發(fā)明(例見King等，細胞分子生物學，Vol.7(9)1343-1357(1996))。
本發(fā)明的另一方面是增強核轉(zhuǎn)移效力的方法，優(yōu)選為增強異種間核轉(zhuǎn)移效力的方法。盡管本發(fā)明人已闡明當將一個種的細胞核或細胞插入或融合于另一個種的去核卵母細胞時可得到能產(chǎn)生胚泡的核轉(zhuǎn)移胚胎，所述胚胎能產(chǎn)生ES細胞系，此方法的效力十分低。因此，一般需要進行很多次融合來產(chǎn)生胚泡，培養(yǎng)所述胚泡的細胞才能產(chǎn)生ES細胞和ES細胞系。
另一種增強核轉(zhuǎn)移胚胎之體外發(fā)育的方法是使培養(yǎng)條件最優(yōu)化。獲得此結(jié)果的一個方法是在阻止細胞凋亡的條件下培養(yǎng)NT胚胎。關于本發(fā)明的此實施方案，已發(fā)現(xiàn)諸如capsases的蛋白酶可通過類似于其它細胞類型的細胞凋亡導致卵母細胞死亡(例見Jurisicosva等，Mol.Reprod.Devel.,51(3)243-253(1998))。
希望通過在用于核轉(zhuǎn)移和維持胚泡或培養(yǎng)植入前期的胚胎的培養(yǎng)基中加入一種或多種capsase抑制劑來增強胚泡的發(fā)育。所述抑制劑包括例如capsase-4抑制劑Ⅰ，capsase-3抑制劑Ⅰ，capsase-6抑制劑Ⅱ，capsase-9抑制劑Ⅱ和capsase-1抑制劑Ⅰ，其量是能有效抑制細胞凋亡的量，如占培養(yǎng)基重量的0.00001至5.0％；更優(yōu)選占培養(yǎng)基重量的0.01％至1.0％。因此，可使用上述方法，通過增強胚泡和胚胎隨后在組織培養(yǎng)中的發(fā)育來提高核轉(zhuǎn)移的效力。
得到所需大小的NT單位之后，用器械從區(qū)帶(zone)中取出細胞，然后用于產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞和細胞系。優(yōu)選通過下列步驟實現(xiàn)此目的，即取出含有NT單位的細胞團，其一般含有至少約50個細胞，洗滌該細胞，將細胞鋪于飼養(yǎng)層，如經(jīng)照射的成纖維細胞上。用于得到干細胞樣細胞或細胞集落的細胞一般得自經(jīng)培養(yǎng)的NT單位的內(nèi)層絕大部分，其大小優(yōu)選為至少50個細胞。然而，細胞數(shù)目較小或較大的NT單位以及得自NT單位其它部分的細胞也可用于得到ES-樣細胞和細胞集落。
將供體細胞DNA在卵母細胞的胞質(zhì)溶膠中暴露較長時間將有利于去分化的過程。在此方面，通過從重構(gòu)的胚胎中取出卵裂球并將其與新去核的卵母細胞融合即可實現(xiàn)再克隆。或者，可將供體細胞與去核的卵母細胞融合，4至6小時之后，無需激活，取出染色體并與較年幼的卵母細胞融合，隨后再進行激活。
在適當生長培養(yǎng)基，如添加有10％FCS和0.1mmβ-巰基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的αMEM中的飼養(yǎng)層中維持細胞。按需要經(jīng)常更換生長培養(yǎng)基以使生長最優(yōu)化，如約每隔2至3天更換一次培養(yǎng)基。
這種培養(yǎng)方法可以形成胚細胞或干細胞樣細胞或細胞系。對衍生自人細胞/牛卵母細胞的NT胚胎而言，在αMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)約1天多即可觀察到集落。然而，隨著特定的核供體細胞，特定的卵母細胞和培養(yǎng)條件的不同，培養(yǎng)時間也有所不同。本領域技術人員在必要時可改變培養(yǎng)條件以使特定胚細胞或干細胞樣細胞的生長最優(yōu)化。
所得胚細胞或干細胞樣細胞和細胞集落表現(xiàn)出來的外觀與用作核細胞供體之種而不是用作供體卵母細胞之種的胚細胞或干細胞樣細胞類似。例如，對于通過將人核供體細胞轉(zhuǎn)移至去核的牛卵母細胞得到的胚細胞或干細胞樣細胞而言，細胞現(xiàn)出的形態(tài)更類似于小鼠胚胎干細胞而不是牛ES-樣細胞。
更具體地說，尚未較詳盡地定義人ES-系細胞集落的各個細胞，所述集落的周邊可以折射且外表光滑。另外，細胞集落的倍增時間較長，約為小鼠ES細胞的兩倍。與衍生自牛和豬的ES細胞不同的是，所述集落不具有上皮細胞樣外觀。
如上所述，據(jù)Thomson在美國專利5,843,780中的報道，靈長類動物干細胞是SSEA-1(-),SSEA-4(+),TRA-1-60(+),TRA-1-81(+)和堿性磷酸酶(+)。希望根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的人和靈長類動物ES細胞能表現(xiàn)出類似的或相同的標記物表達。
或者，可根據(jù)細胞產(chǎn)生所有中胚層，外胚層和內(nèi)胚層組織的能力證實該細胞確實是人或靈長類動物胚胎干細胞。通過在適當條件下培養(yǎng)本發(fā)明產(chǎn)生的ES細胞即可闡明這一點，所述培養(yǎng)條件公開于例如Thomson的美國專利5,843,780(列入本文作為參考)。
所得的胚細胞或干細胞樣細胞和細胞系，優(yōu)選為人胚細胞或干細胞樣細胞和細胞系具有多種治療和診斷應用。最特別的是，所述胚細胞或干細胞樣細胞可用于細胞移植療法。人胚細胞或干細胞樣細胞可用于治療多種疾病。
在此方面，已知小鼠胚胎干(ES)細胞幾乎能分化成任何細胞類型，如造血干細胞。因此，本發(fā)明產(chǎn)生的人胚細胞或干細胞樣細胞應該具有類似的分化能力。可根據(jù)已知方法誘導本發(fā)明的胚細胞或干細胞樣細胞以分化得到所需的細胞類型。例如，通過在分化培養(yǎng)基中并在允許細胞分化的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的胚細胞或干細胞樣細胞，即可誘導其分化產(chǎn)生造血干細胞，肌細胞，心肌細胞，肝細胞，軟骨細胞，上皮細胞，尿道細胞等。導致胚胎干細胞分化的培養(yǎng)基和方法是本領域的已知方法，適當?shù)呐囵B(yǎng)條件也是本領域眾所周知的。
例如，Palacios等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,927530-7537(1995)公開了通過對干細胞進行誘導而由胚細胞系產(chǎn)生造血干細胞，所述誘導法包括起初在缺乏視黃酸的懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞聚集體，接著在含有視黃酸的相同培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后將細胞聚集體轉(zhuǎn)移至可提供細胞附著的底物中。
另外，Pedersen.J.Reprod.Fertil.Dev.,6543-552(1994)是一篇綜述，該文中提到的多篇論文公開了體外分化胚胎干細胞以產(chǎn)生多種分化細胞類型的分化，所述細胞類型包括造血細胞，肌細胞，心肌細胞，神經(jīng)細胞等。
另外，Bain等，發(fā)育生物學，168342-357(1995)公開了體外分化胚胎干細胞以產(chǎn)生具有神經(jīng)元特性的神經(jīng)細胞的方法。這些參考文獻是已報道的由胚細胞或干細胞樣細胞獲得分化細胞的方法的例子。這些參考文獻，尤其是其中公開的有關分化胚胎于細胞之方法的內(nèi)容都全文列入本文作為參考。
因此，本領域技術人員使用已知方法和培養(yǎng)基可培養(yǎng)本發(fā)明的胚細胞或干細胞樣細胞以得到所需的分化細胞類型，如神經(jīng)細胞，肌細胞，造血細胞等。
另外，使用可誘導的Bcl-2或Bcl-xl對增強特定細胞譜系的體外發(fā)育可能是有用的。在體內(nèi)，Bcl-2可防止淋巴和神經(jīng)發(fā)育過程中的很多(但不是全部的)細胞凋亡型細胞死亡。美國專利5,646,008(列入本文作為參考)中詳細討論了在轉(zhuǎn)染供體細胞之后，如何將Bcl-2的表達用于抑制相關細胞譜系的細胞凋亡。
可使用本發(fā)明的胚細胞或干細胞樣細胞得到任何所需的分化細胞類型。這種分化的人細胞的治療用途是無與倫比的。例如，在需要骨髓移植的治療過程中可使用人造血干細胞?？墒褂迷摲椒ㄖ委熀芏喾N疾病，例如晚期癌癥(卵巢癌和白血病)以及危及免疫系統(tǒng)的疾病，如AIDS。通過例如將癌癥或AIDS患者的成年體細胞，如上皮細胞或淋巴細胞與去核的卵母細胞，如牛卵母細胞融合，得到上文所述的胚細胞或干細胞樣細胞，并在有利于分化的條件下培養(yǎng)該細胞直至獲得造血干細胞，籍此可得到造血干細胞?？墒褂眠@種造血干細胞治療包括癌癥和AIDS的疾病。
或者，可將神經(jīng)病患者的成年體細胞與去核的動物卵母細胞，如靈長類動物或牛卵母細胞融合，從中得到人胚細胞或干細胞樣細胞，在分化條件下培養(yǎng)該細胞以產(chǎn)生神經(jīng)細胞系。通過移植這種人神經(jīng)細胞可以治療的特定疾病包括例如帕金森氏病，早老性癡呆，ALS和大腦麻痹等。具體到帕金森氏病，已闡明植入的胎兒腦神經(jīng)細胞可與周圍的細胞建立良好的聯(lián)系并可產(chǎn)生多巴胺，這樣就可以長期逆轉(zhuǎn)帕金森氏病的癥狀。
為了特異性選擇分化細胞，可用經(jīng)由誘導型啟動子表達的選擇標記轉(zhuǎn)染供體細胞，當誘導分化時即可選擇或富集特定的細胞譜系。例如，可使用CD34-neo選擇造血干細胞，Pw1-neo選擇肌細胞，Mash-1-neo選擇交感神經(jīng)元，Mal-neo選擇人大腦皮層灰質(zhì)的CNS神經(jīng)元等。
本發(fā)明的一大優(yōu)點是實質(zhì)上可無限量地供應適于移植的等基因或同基因的人細胞。因此，可以避免目前的移植方法所帶來的嚴重問題，即由于宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而發(fā)生的對移植組織的排斥現(xiàn)象。通常，通過施用諸如環(huán)孢菌素的抗排斥藥物即可預防或減輕排斥現(xiàn)象。然而，所述藥物具有顯著有害的副作用，如免疫抑制，致癌特性并且非常昂貴。本發(fā)明應該能消除或至少大大降低對抗排斥藥物的需求。
等基因細胞療法可以治療的其它疾病和病癥包括例如脊髓損傷，多發(fā)性硬化，肌營養(yǎng)不良，糖尿病，肝病，即高膽固醇血癥，心臟病，軟骨替換，燒傷，足潰瘍，胃腸病，血管病，腎病，泌尿道病和與年齡增大有關的疾病和病癥。
本發(fā)明產(chǎn)生的人胚細胞或干細胞樣細胞可用于產(chǎn)生經(jīng)基因工程改造的或轉(zhuǎn)基因的人分化細胞。實質(zhì)上，通過導入所需的一個或多個基因(所述基因可以是異源基因)，或除去本發(fā)明產(chǎn)生的人胚細胞或干細胞樣細胞的全部或部分內(nèi)源性基因，使該細胞分化成所需的細胞類型即可達到上述目的。獲得這種修飾的優(yōu)選方法是通過同源重組，因為可使用該技術插入，缺失或修飾干細胞樣細胞基因組之一個或多個特定位點處的一個或多個基因。
可使用該方法學取代缺損基因，例如缺損的免疫系統(tǒng)基因，囊性纖維化基因，或?qū)雽е戮哂兄委熥饔弥鞍踪|(zhì)的表達的基因，所述蛋白質(zhì)如生長因子，淋巴因子，細胞因子，酶等。例如，可將編碼得自腦的生長因子的基因?qū)肴伺呒毎蚋杉毎麡蛹毎毎只缮窠?jīng)細胞，將該細胞植入帕金森氏病患者體內(nèi)可阻止患病過程中神經(jīng)細胞的損失。
以前，被BDNF轉(zhuǎn)染的細胞類型從原代細胞到無限增殖細胞系各不相同，可以是得自神經(jīng)的細胞，也可以不是得自神經(jīng)的細胞(成肌細胞和成纖維細胞)。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用BDNF基因轉(zhuǎn)染星形細胞，并將細胞植入帕金森氏病的大鼠模型中(Yoshi-moto等，腦研究，69125-36(1995))。
這一體內(nèi)療法可在轉(zhuǎn)移后32天將大鼠的帕金森氏病-樣癥狀減輕45％。另外，將酪蛋白羥化酶基因置于星形細胞也能得到類似的結(jié)果(Lundberg等，Develop.Neurol.,13939-53(1996)和其中提及的參考文獻)。
然而，這種體內(nèi)系統(tǒng)也存在問題。尤其是，目前使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)被下調(diào)，轉(zhuǎn)基因僅能瞬時表達(Mulligan，科學，260926-932(1993))。而且，該項研究使用的原代細胞，星形細胞壽命有限，復制緩慢。這些特性對轉(zhuǎn)染速率有不利影響，并阻礙了對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之細胞的選擇。另外，幾乎不可能增殖同源重組技術所用的大的基因靶向原代細胞群體。
相反，通過使用人胚細胞或干細胞樣細胞應該能消除與逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)相關的問題。本發(fā)明的受讓人以前已闡明牛和豬的胚細胞系可被轉(zhuǎn)染并選擇用于穩(wěn)定整合異源DNA。該方法也描述于1996年4月1日提交的共同受讓的美國流水號08/626,054(全文列入本文作為參考)。因此，使用該方法或其它已知的方法可將所需基因?qū)氡景l(fā)明的人胚細胞或干細胞樣細胞中，細胞分化成所需的細胞類型，如造血細胞，神經(jīng)細胞，胰腺細胞，軟骨細胞等。
可導入本發(fā)明的人胚細胞或干細胞樣細胞的基因包括例如表皮生長因子，堿性成纖維細胞生長因子，得自神經(jīng)膠質(zhì)的神經(jīng)營養(yǎng)生長因子，胰島素-樣生長因子(Ⅰ和Ⅱ)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4/5，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，AFT-1，細胞因子基因(白細胞介素，干擾素，集落刺激因子，腫瘤壞死因子(α和β)，等)，編碼治療性的酶，膠原，人血清白蛋白的基因等。
另外，必要時也可以使用本領域目前已知的一個負選擇系統(tǒng)以清除患者的治療性細胞。例如，被胸苷激酶(TK)基因轉(zhuǎn)染的供體細胞可導致產(chǎn)生含有TK基因的胚細胞。這些細胞的分化可導致也表達TK基因的所需治療性細胞的分離。通過施用9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤可在任何時間從患者體內(nèi)選擇性清除治療性細胞。該負選擇系統(tǒng)描述于美國專利5,698,446(列入本文作為參考)。
本發(fā)明的胚細胞或干細胞樣細胞，優(yōu)選為人細胞也可用作體外分化模型，尤其是用于研究參與調(diào)節(jié)早期發(fā)育的基因。
使用本發(fā)明的胚細胞或干細胞樣細胞得到的分化細胞組織和器官也可用于藥物研究。
另外，本發(fā)明的胚細胞或干細胞樣細胞可用作核供體以產(chǎn)生其它胚細胞或干細胞樣細胞和細胞集落。
為了更清楚地描述本發(fā)明，特給出下列實施例。
用于人工激活卵母細胞的方法已描述于別處。NT單位激活于28hpm進行。激活方法的簡單描述如下將NT單位暴露于添加有1mg/ml BSA的TL-HEPES中的離子霉素(5μM；CalBiochem,La Jolla,CA)達4分鐘，然后用添加有30mg/ml BSA的TL-HEPES洗滌5分鐘。再將NT單位轉(zhuǎn)移至含有0.2mM DMAP(Sigma)的CRlaa培養(yǎng)基微滴中，于38.5℃，5％CO2中培養(yǎng)4至5小時。洗滌NT單位，然后將其置于含有鋪滿的小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層(將在下文描述)的4孔培養(yǎng)板中的CRlaa培養(yǎng)基+10％FCS+6mg/ml BSA中。于38.5℃，5％CO2中將NT單位培養(yǎng)3天以上。每隔3天更換一次培養(yǎng)基直至激活期第12天為止。此時，用器械從帶中取出達到所需細胞數(shù)目，即約50個細胞數(shù)目的NT單位，并用于產(chǎn)生胚細胞系。按上述得到的NT單位的照片示于圖1。成纖維細胞飼養(yǎng)層胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)物得自14至16天齡的胎鼠。無菌取出頭，肝臟，心臟和消化道之后，將胚胎鉸碎，于37℃在預溫的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO,Grand Island,NY)中保溫30分鐘。將成纖維細胞鋪于組織培養(yǎng)瓶中，在添加有10％胎牛血清(FCS)(Hyclone,Logen,UT)，青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(50μl/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker,Walkersville,MD)中培養(yǎng)。傳代后3至4天，照射35×10Nunc培養(yǎng)皿(Baxter Scientific,McGaw Park,IL)中的胚胎成纖維細胞。于37℃，在含有5％CO2的潮濕空氣中培養(yǎng)和維持經(jīng)照射的成纖維細胞。然后使用具有均一細胞單層的培養(yǎng)板培養(yǎng)胚細胞系。產(chǎn)生胚細胞系洗滌按上述得到的NT單位細胞，將其直接鋪于經(jīng)照射的飼養(yǎng)成纖維細胞上。這些細胞包括NT單位的內(nèi)層部分。在由添加有10％FCS和0.1mM β巰基乙醇(Sigma)的α MEM組成的生長培養(yǎng)基中維持細胞，每隔2至3天更換一次生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)1天多即可觀察到最初的集落。集落不斷增殖，并表現(xiàn)出與以前公開的小鼠胚胎干(ES)細胞相似的形態(tài)。尚未較詳盡地定義集落中的各個細胞，所述集落的周邊可以折射且外表光滑。另外，細胞集落的倍增時間比小鼠ES細胞的慢。與衍生自牛和豬的ES細胞不同的是，所述集落至今仍不具有上皮細胞樣外觀。圖2至5是按上述得到的ES樣細胞集落的照片。產(chǎn)生分化的人細胞將所得的人胚細胞轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，并進行培養(yǎng)直至得到分化的人細胞類型。結(jié)果表1.在NT單位的產(chǎn)生和發(fā)育中以人細胞為供體核
將發(fā)育成具有大于16細胞的結(jié)構(gòu)的一個NT單位鋪于成纖維細胞飼養(yǎng)層上。此結(jié)構(gòu)附著于飼養(yǎng)層，并開始增殖形成具有ES細胞樣形態(tài)的集落(例見圖2)。另外，盡管未嘗試使用4至16細胞階段的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生ES細胞集落，但前人已證明此階段能產(chǎn)生ES或ES樣細胞系(小鼠，Eistetter等，Devel.Growth and Differ.,31275-282(1989)；牛，Stice等，1996)。因此，預期4至16細胞階段的NT單位應該也能產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞和細胞集落。
通過將成人角質(zhì)細胞的細胞系與在含有ACM，尿苷，葡萄糖和1000IU LIF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的去核牛卵母細胞融合也可得到相似的結(jié)果。在50個重構(gòu)的胚胎中，有22個被裂解，有1個在約第12天發(fā)育成胚泡，將該胚泡鋪平，即開始產(chǎn)生ES細胞系。
盡管參照多種特定的材料，方法和實施例描述和闡明了本發(fā)明，但應理解本發(fā)明并不局限于特定的材料，材料組合和為此選定的方法。多種如此詳細的變化是本領域技術人員可以預見和了解的。
權利要求
1．產(chǎn)生胚細胞或干細胞樣細胞的方法，所述方法包括下列步驟(ⅰ)在適于形成核轉(zhuǎn)移(NT)單位的條件下，將所需的分化的人或哺乳動物細胞或細胞核插入去核的動物卵母細胞中，其中所述卵母細胞得自與人或哺乳動物細胞不同的動物種；(ⅱ)激活所得的核轉(zhuǎn)移單位；(ⅲ)培養(yǎng)所述經(jīng)激活的核轉(zhuǎn)移單位直至大于2細胞發(fā)育階段；和(ⅳ)培養(yǎng)得自所述經(jīng)培養(yǎng)的NT單位的細胞以獲得胚細胞或干細胞樣細胞。
2．權利要求1的方法，其中插入去核動物卵母細胞的細胞是人細胞。
3．權利要求2的方法，其中所述人細胞是成年細胞。
4．權利要求2的方法，其中所述人細胞是上皮細胞，角質(zhì)細胞，淋巴細胞或成纖維細胞。
5．權利要求2的方法，其中卵母細胞得自哺乳動物。
6．權利要求5的方法，其中動物卵母細胞得自具爪動物。
7．權利要求6的方法，其中所述具爪動物選自牛，綿羊，豬，馬，狗和野牛。
8．權利要求1的方法，其中去核卵母細胞在去核之前已成熟。
9．權利要求1的方法，其中融合的核轉(zhuǎn)移單位在體外被激活。
10．權利要求1的方法，其中在飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上培養(yǎng)激活的核轉(zhuǎn)移單位。
11．權利要求10的方法，其中飼養(yǎng)層含有成纖維細胞。
12．權利要求1的方法，其中的步驟(ⅳ)是在飼養(yǎng)細胞層上培養(yǎng)具有16個或更多細胞的NT單位中的細胞。
13．權利要求12的方法，其中所述飼養(yǎng)細胞層含有成纖維細胞。
14．權利要求13的方法，其中所述成纖維細胞含有小鼠胚胎成纖維細胞。
15．權利要求1的方法，其中所得胚細胞或干細胞樣細胞經(jīng)誘導可以分化。
16．權利要求2的方法，其中所得胚細胞或干細胞樣細胞經(jīng)誘導可以分化。
17．權利要求1的方法，其中融合是通過電融合實現(xiàn)的。
18．根據(jù)權利要求1的方法得到的胚細胞或干細胞樣細胞。
19．根據(jù)權利要求2的方法得到的人胚細胞或干細胞樣細胞。
20．根據(jù)權利要求3的方法得到的人胚細胞或干細胞樣細胞。
21．根據(jù)權利要求4的方法得到的人胚細胞或干細胞樣細胞。
22．根據(jù)權利要求6的方法得到的人胚細胞或干細胞樣細胞。
23．根據(jù)權利要求7的方法得到的人胚細胞或干細胞樣細胞。
24．通過權利要求16的方法得到的分化的人細胞。
25．權利要求24的分化的人細胞，其選自神經(jīng)細胞，造血細胞，胰腺細胞，肌細胞，軟骨細胞，尿道細胞，肝細胞，脾細胞，生殖細胞，皮膚細胞，腸細胞和胃細胞。
26．治療方法，所述方法包括給需要細胞移植療法的患者施用權利要求24的同基因分化的人細胞。
27．權利要求26的方法，其中實施所述細胞移植療法可治療的疾病或病癥選自帕金森氏病，杭廷頓氏舞蹈病，早老性癡呆，ALS，脊髓缺陷或損傷，多發(fā)性硬化，肌營養(yǎng)不良，囊性纖維化，肝病，糖尿病，心臟病，軟骨缺陷或損傷，燒傷，足潰瘍，血管病，泌尿道病，AIDS和癌癥。
28．權利要求26的方法，其中分化的人細胞是造血細胞或神經(jīng)細胞。
29．權利要求26的方法，其中的治療方法可治療帕金森氏病，分化的細胞是神經(jīng)細胞。
30．權利要求26的方法，其中的治療方法可治療癌癥，分化的細胞是造血細胞。
31．權利要求24的分化的人細胞，其含有并表達插入的基因。
32．權利要求1的方法，其中在所述胚細胞或干細胞樣細胞中插入，除去或修飾所需基因。
33．權利要求32的方法，其中所需基因編碼治療性的酶，生長因子或細胞因子。
34．權利要求32的方法，其中所述胚細胞或干細胞樣細胞是人胚細胞或干細胞樣細胞。
35．權利要求32的方法，其中通過同源重組除去，修飾或缺失所需基因。
36．權利要求1的方法，其中對供體細胞進行基因工程改造以破壞內(nèi)胚層，外胚層和中胚層中的至少一個的發(fā)育。
37．權利要求1的方法，其中對供體細胞進行基因修飾以增強分化效力。
38．權利要求36的方法，其中在含有至少一種capsase抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)培養(yǎng)的核轉(zhuǎn)移單位。
39．權利要求1的方法，其中供體細胞表達能顯示出特定細胞周期蛋白表達的可測標記。
40．權利要求36的方法，其中供體細胞經(jīng)修飾后改變了選自下列的基因的表達SRF,MESP-1,HNF-4,β-1整聯(lián)蛋白，MSD,GATA-6,GATA-4,RNA解旋酶A和H β58。
41．權利要求37的方法，其中已對所述供體細胞進行基因修飾以導入可提供Q7和/或Q9基因表達的DNA。
42．權利要求41的方法，其中所述基因與可調(diào)節(jié)的啟動子可操作相連。
43．權利要求1的方法，其中供體細胞經(jīng)基因修飾后可抑制細胞凋亡。
44．權利要求43的方法，其中通過改變選自下列的一個或多個基因的表達可提供減少的細胞凋亡Bad,Bok,BH3,Bik,Blk,Hrk,BNIP3,GimL,Bid,EGL-1,Bcl-XL,Bcl-w,Mcl-1,A1,Nr-13,BHRF-1,LMW5-HL,ORF16,Ks-Bcl-2,E1B-19K和CED-9。
45．權利要求44的方法，其中至少一個所述基因與誘導型啟動子可操作相連。
46．哺乳動物體細胞，所述細胞表達編碼可測標記的DNA，所述可測標記的表達與特定細胞周期蛋白相連。
47．權利要求46的細胞，其中細胞周期蛋白選自細胞周期蛋白D1,D2,D3,B1,B2,E,A和H。
48．權利要求46的細胞，其中可測標記是熒光多肽。
49．權利要求48的細胞，其中所述哺乳動物細胞選自人，靈長類動物，嚙齒類動物，具爪動物，狗和貓細胞。
50．權利要求48的細胞，其中所述細胞是人，?；蜢`長類動物的細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了改良的核轉(zhuǎn)移方法,所述方法包括將分化的供體細胞核植入與供體細胞不同種的去核卵母細胞中。所得的核轉(zhuǎn)移單位可用于產(chǎn)生同基因的胚胎干細胞,尤其是人同基因的胚細胞或干細胞。這些胚細胞或干細胞樣細胞可用于產(chǎn)生所需的分化細胞,并可用于通過同源重組在所述細胞基因組的特定位點處導入,除去或修飾所需基因?？珊挟愒椿虻倪@些細胞對細胞移植療法和體外細胞分化研究特別有用。本發(fā)明還提供了通過對供體細胞進行基因修飾而抑制細胞凋亡,選擇特定的細胞周期和/或增強胚胎生長和發(fā)育而改善核轉(zhuǎn)移效力的方法。
文檔編號A61K35/12GK1299408SQ9980569
公開日2001年6月13日 申請日期1999年3月2日 優(yōu)先權日1998年3月2日
發(fā)明者J·羅貝爾, J·西柏利, S·L·史蒂斯 申請人:馬薩諸塞大學