專(zhuān)利名稱(chēng)：新的多肽激素磷酸鹽沉著因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種參與磷酸鹽代謝調(diào)節(jié)的多肽。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種新的多肽，即轉(zhuǎn)移性腫瘤分泌的磷酸鹽沉著因素(MEPE)或“phosphatonin”。本發(fā)明還涉及編碼phosphatonin多肽的基因和聚核苷酸，以及載體，宿主細(xì)胞，phosphatonin多肽的抗體，及其重組生產(chǎn)方法。本發(fā)明還提供檢測(cè)磷酸鹽代謝相關(guān)性疾病的診斷方法，治療此類(lèi)疾病的治療方法。本發(fā)明還涉及鑒定phosphatonin活性的激動(dòng)劑和拮抗劑的篩選方法。
本發(fā)明所引用的文獻(xiàn)(包括生產(chǎn)商的說(shuō)明等)都為本發(fā)明所參考。
背景技術(shù)：
在細(xì)胞基本活動(dòng)和骨礦化所必需的許多過(guò)程中，磷酸鹽具有重要作用。尤其是，骨骼礦化依賴(lài)于體內(nèi)磷酸鹽和鈣的調(diào)節(jié)，一旦體內(nèi)磷酸鹽-鈣平衡被破壞，就會(huì)對(duì)骨骼健康造成嚴(yán)重影響。在腎內(nèi)，磷酸鹽被動(dòng)進(jìn)入腎小球?yàn)V液而流失，并由一種鈉(Na+)依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者積極地重吸收。在小腸內(nèi)，磷酸鹽是從食物中吸收的。已發(fā)現(xiàn)小腸內(nèi)表達(dá)一種鈉(Na+)依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者，目前已被克隆(Hilflker,PNAS 95(24)(1998),14564-14569)。肝、皮膚和腎與維生素D3轉(zhuǎn)化為其活性代謝產(chǎn)物鈣三醇有關(guān)，鈣三醇對(duì)維持磷酸鹽代謝平衡和骨礦化具有積極作用。
缺乏維生素D會(huì)造成兒童佝僂病和成人骨軟化。這兩種情況都以前骨質(zhì)即骨的基質(zhì)鈣化不全為特征。還有一些飲食以外的情況會(huì)導(dǎo)致如下佝僂病，包括X染色體聯(lián)鎖的耐維生素D性血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病(HYP)，遺傳性伴有尿鈣過(guò)多的血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病(HHRH),Dent＇s病，包括某些類(lèi)型的腎病性Fanconi綜合癥，腎病性1-α-羥化酶缺乏(VDDRⅠ),1,25-二羥基維生素D3受體缺陷(終末器官抗性，VDDRⅡ)，和瘤原性血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化(OHO)。因此，許多病的特征被歸結(jié)為磷酸鹽吸收紊亂、維生素D代謝紊亂和骨礦化紊亂。最近，克隆了一個(gè)基因(PHEX)，并發(fā)現(xiàn)X染色體聯(lián)鎖的磷酸鹽過(guò)少性佝僂病患者的該基因有缺陷(Francis，自然遺傳(Nat.Genet.)11(1995),130-136；Rowe，人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)97(1996),345-352；Rowe，人類(lèi)遺傳6(1997),539-549)。PHEX基因是一種Ⅱ型糖蛋白，并屬于Zn金屬內(nèi)肽酶家族(M13)。PHEX的功能是加工一種參與磷酸鹽體內(nèi)平衡和骨骼礦化的因子(Rowe，實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟學(xué)(Exp.Nephrol).5(1997),355-363；Rowe，當(dāng)前腎臟學(xué)和高血壓領(lǐng)域的觀點(diǎn)(Current Opinion in Nephrology&Hypertension)7(4)(1998),367-376)。和瘤原性血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化(OHO)與HYP有許多類(lèi)似之處，兩者的病理生理有重迭之處，但原發(fā)性缺陷不同(Rowe，實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟學(xué)(Exp.Nephrol).5(1997),355-363；Rowe，當(dāng)前腎臟學(xué)和高血壓領(lǐng)域的觀點(diǎn)(Current Opinion inNephrology&Hypertension)7(4)(1998),367-376；Drezner在礦物質(zhì)代謝性單寫(xiě)性骨病的原因(Primer on Metabolic Bone Disease and Disorders of Mineral Metabolism)(Favus,M.J.編)184-188(美國(guó)骨礦物質(zhì)研究協(xié)會(huì)(Am.Soc.Bone and Min.Res.),Kelseyville,CA,1990)。成人骨軟化相當(dāng)于佝僂病，腫瘤-獲得性骨軟化的一個(gè)重要特征是骨的軟化。軟化后的骨發(fā)生變形，造成弓形腿及其他家族性佝僂病相關(guān)的變化。磷酸鹽血清含量低和維生素D代謝異常也是HYP的重要特征。腫瘤獲得性骨軟化很少見(jiàn)，而且這些腫瘤大多是間質(zhì)源腫瘤，雖然也曾報(bào)道過(guò)一些其他類(lèi)型的腫瘤(Rowe，實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟學(xué)(Exp.Nephrol.)5(1997),355-363；Francis,Baillieres臨床內(nèi)分泌學(xué)與代謝(Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism)11(1997),145-163；Ioakimides，類(lèi)風(fēng)濕雜志(The J.Rheumatology)21(6)(1994),1162-1164；Lyles，國(guó)際醫(yī)學(xué)報(bào)(Ann.Intern.Med.)93(1980),275-278；Rowe,Hum.Genet.94(1994),457-467；Shane，骨礦物質(zhì)研究雜志(Journal of Bone and MineralResearch)12(1997),1502-1511；Weidner，癌癥(Cancer)59(1987),1442-1442)。在可能時(shí)手術(shù)摘除腫瘤后癥狀消失而且骨愈合，這提示了循環(huán)磷酸鹽沉著因子在發(fā)病中的作用。而且，裸鼠腫瘤異種移植(Miyauchi，臨床內(nèi)分泌與代謝雜志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)67(1988),46-53)，給大鼠和狗輸注鹽溶液提取物(Aschinberg,兒科雜志(J.Pediatr.)91(1977),56-60；Popovtzer，臨床研究(Clin.Res.)29(1981),418A(Abstract))和使用人和動(dòng)物腎細(xì)胞系的腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)，都證實(shí)這種腫瘤分泌一種循環(huán)磷酸鹽沉著因子。
雖然已證實(shí)X聯(lián)鎖性佝僂病的原發(fā)性缺陷是突變的Zn金屬內(nèi)肽酶(PHEX)，但存在與循環(huán)磷酸鹽沉著因子相關(guān)的證據(jù)(Ecarot，骨礦物質(zhì)研究雜志(J.BoneMiner.Res.)7(1992),215-220；Ecarot，骨礦物質(zhì)研究雜志(J.Bone Miner.Res.)10(1995),424-431；Morgan，國(guó)際醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)(Arch.Intern.Med.)134(1974),549-552；Nesbitt，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)89(1992),1453-1459；Nesbitt，骨礦物質(zhì)研究雜志(J.Bone Miner.Res.)10(1995),1327-1333；Nesbitt，內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)137(1996),943-948；Qiu，基因研究(Genet.Res.),Camb.62(1993),39-43；Lajeunesse，腎臟研究(Kidney Int.)50(1996),1531-1538；Meyer，骨礦物質(zhì)研究雜志(J.Bone Miner.Res.)4(4)(1989),523-532；Meyer，骨礦物質(zhì)研究雜志(J.BoneMiner.Res.)4(1989),493-500)。HYP與OHO的病理生理有重迭，提出了這樣一種可能性，即，在正常機(jī)體內(nèi)，腫瘤因子受到PHEX基因產(chǎn)物的加工。而且，蛋白酶解加工可能通過(guò)降解這尚未確定的磷酸鹽沉著因子或通過(guò)激活磷酸鹽保存級(jí)聯(lián)發(fā)揮作用(Carpenter，北美兒科臨床學(xué)(Pediatric Clinics of North America)44(1997),443-466；Econs，美國(guó)生理學(xué)雜志(Am.J.Physiol.)273(1997),F489-498；Glorieux，兒科文獻(xiàn)(Arch.Pediatr.)4(1997),102s-105s；Grieff，當(dāng)前腎臟學(xué)和高血壓領(lǐng)域的一些觀點(diǎn)(Current Opinion in Nephrology&Hypertension)6(1997),15-19；Hanna，當(dāng)前內(nèi)分泌學(xué)和代謝中的治療方法(Current Therapy in Endocrinology&Metabolism)6(1997),533-540；Kumar，腎臟移植(Nephrol.Dial.Transplant.)12(1997),11-13；Takeda，Ryoikibetsu Shokogun Shirizu(1997),656-659)。因此，克隆并揭示腫瘤-磷酸鹽沉著因子的特征是確立腫瘤性骨軟化與家族性X聯(lián)鎖性佝僂病以及其他磷酸鹽代謝疾病之間聯(lián)系的前提條件。
Rowe等(1996)曾報(bào)道過(guò)56和58kDa的候選蛋白，它們可能介導(dǎo)了OHO中的腎缺陷(Rowe，骨(Bone)18(1996),159-169)。一名OHO患者接受腫瘤摘除治療，用其術(shù)前和術(shù)后的抗血清進(jìn)行Western印跡鑒定腫瘤條件培養(yǎng)基蛋白。然而，公眾尚不能得到所述腫瘤細(xì)胞和抗血清。
在實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟學(xué)(Exp.Nephrol.)5(1997)，335-363的一篇論文中，Rowe論述了前述疾病與PHEX基因的作用(過(guò)去稱(chēng)PEX基因)。PHEX基因的產(chǎn)物經(jīng)鑒定是一種Zn金屬蛋白酶。在家族性佝僂病等疾病中，缺陷PHEX產(chǎn)生不剪切的phosphatonin，后者下調(diào)鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者，上調(diào)腎線(xiàn)粒體24-羥化酶。然而，Rowe(1997)未報(bào)道phosphatonin的純化。因此，公眾無(wú)法獲得phosphatonin的原料。而且，此前從未能進(jìn)行過(guò)phosphatonin的純化、鑒定和特征描述。
因此，需要一種調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的多肽，因?yàn)檫@種調(diào)節(jié)的失調(diào)可能與血磷酸鹽過(guò)少或過(guò)多性疾病有關(guān)，這些疾病包括骨軟化，特別是骨質(zhì)疏松和腎衰竭。而且，需要對(duì)此類(lèi)多肽進(jìn)行鑒定和特征描述，它們可能參與所述紊亂的檢測(cè)、預(yù)防和/或矯正，因而可能對(duì)這些疾病的診斷有用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的phosphatonin多肽，和編碼它的聚核苷酸。而且，本發(fā)明涉及載體、宿主細(xì)胞、抗體，和重組生產(chǎn)多肽和聚核苷酸的方法。本發(fā)明還提供檢測(cè)與所述肽相關(guān)的疾病的診斷方法，治療這些疾病的治療方法。本發(fā)明還涉及鑒定phosphatonin結(jié)合伙伴的篩選方法。


圖1(a)和(b)分別顯示伴刀豆蛋白A柱上的低親和性和高親和性蛋白峰的層析圖。
圖2伴刀豆蛋白A柱上的陽(yáng)離子交換層析。
圖3計(jì)算機(jī)對(duì)PHOSPHATONIN上親水性和疏水性的預(yù)測(cè)。
圖4計(jì)算機(jī)對(duì)PHOSPHATONIN上抗原性的預(yù)測(cè)。
圖5計(jì)算機(jī)對(duì)PHOSPHATONIN上柔性(flexibility)的預(yù)測(cè)。
圖6計(jì)算機(jī)對(duì)PHOSPHATONIN二級(jí)結(jié)構(gòu)表面可能情況的預(yù)測(cè)。
圖7計(jì)算機(jī)對(duì)PHOSPHATONIN二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。
圖8分離到的最大MEPE克隆(pHO11.1)的完整cDNA序列(SEQ ID NO.1)和氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。分離到的其余5個(gè)克隆包括在這個(gè)最大克隆中，全部克隆都與克隆載體pBSCPT SKⅡ-同框。用于PCR的引物加深表示，共430個(gè)殘基和1655bp。原核表達(dá)載體pCal-n-EK含有全部框內(nèi)殘基，從MEPE的V殘基到1291-93bp處的MEPE終止密碼子TAG。單個(gè)聚腺苷酸化序列AA{T/U}AAA下加有雙劃線(xiàn)。波浪線(xiàn)表示的是與DMA-1、DSSP和OPN共有的局部同源性區(qū)域(MEPE基序C末端)，橢圓包圍的是RGD殘基，實(shí)線(xiàn)框內(nèi)的是糖胺聚糖結(jié)合位點(diǎn)，單下劃線(xiàn)表示的是酪氨酸激酶位置，虛線(xiàn)框內(nèi)的是N-糖基化基序。有關(guān)包括酪蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶C等在內(nèi)的基序全表，參見(jiàn)表1。
圖9MEPE的二級(jí)結(jié)構(gòu)GCG-肽-結(jié)構(gòu)。一級(jí)氨基酸骨架用中間的線(xiàn)條表示，曲折處表示預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)角區(qū)。分別以橢圓和菱形表示親水性和疏水性，標(biāo)出了RGD基序。用帶莖的橢圓表示N-糖基化位置(C末端)，一級(jí)骨架上的波形區(qū)表示α螺旋。
圖10不同量MEPE存在下，磷酸鹽吸收的直方圖A:92ng/ml,B:300ng/ml,C:500ng/ml,D:1000ng/ml。膽堿框代表以膽堿氯代替NaCl得到的作為對(duì)照的非Na依賴(lài)性結(jié)果。誤差線(xiàn)表示SEM,C和D中MEPE與對(duì)照之間差異的P值＜0.001。實(shí)驗(yàn)A(92ng/ml)中，P＜0.05，實(shí)驗(yàn)B300ng/ml中，P＜0.01。A和B中的N是4,C和D中的N分別是5和6。在Newman-Keuls多重比較試驗(yàn)后采用Anova。
圖11給予MEPE與磷酸鹽吸收的劑量曲線(xiàn)，帶有SEM誤差線(xiàn)。
圖12用“sim”和Ilanview算法和軟件工具進(jìn)行序列相似性分析(Duret,Comput.Appl.Biosci.12(1996),507-510)。每次計(jì)算中，空距扣分設(shè)定為12，延伸扣分設(shè)定為4。A的比較基質(zhì)是“PAM40”，B和C的分別是BLOSUM62(參見(jiàn)，Duret,Comput.Appl.Biosci.12(1996),507-510；Huang,Comput.Appl.Biosci.8(1992),155-165；Huang,Comput.Appl.Biosci.(1990)6,373-381)。A中的相似性閾值是70％,B和C中是40％。各蛋白質(zhì)圖上加深表示的塊在A中代表80％以上序列同源性，在B和C中表示62％以上同源性。注意，在MEPE與DSSP的比較中(A),DSSP中有5個(gè)塊與MEPE中的一個(gè)基序(DSSESSDSGSSSES)序列同源性超過(guò)80％。在DMA-1和OPN與MEPE的比較中(B和C)也有類(lèi)似的序列同源性，MEPE是這三種蛋白質(zhì)的共同特征。
圖13DSSP與MEPE的Antheprot數(shù)據(jù)分析點(diǎn)陣比較(Deleague,G.蛋白質(zhì)分析軟件Antheroplot V2.5e.Microsoft group.(7 Passage du Vercours 69-367 VercorsLyon Cedex 07,1997))。在嚴(yán)謹(jǐn)性較低的比較(A)中，閱讀窗設(shè)定為13作為篩選參數(shù)，B中閱讀窗設(shè)定為15。顏色顯示的是單一矩陣(unity matrix)分值，坐標(biāo)圖所示。MEPE基序的C末端殘基具有80％以上的同源性，并由條紋形式顯示了該基序的重復(fù)特征。
圖14含有phosphatonin融合結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒p1BL21和p6XL1。Lacl:lac啟動(dòng)子；LIC不依賴(lài)于連接的克隆序列)；EK腸激酶剪切位點(diǎn)；Thrombin(凝血酶靶序列)；Amp氨芐青霉素抗性；Cal肽鈣調(diào)肽序列；phosphatonin:phosphatonin編碼序列。
本發(fā)明的詳細(xì)描述因?yàn)樾枰\斷和治療與人體內(nèi)磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)的疾病的方法，本發(fā)明的課題提供調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的工具與方法，這對(duì)于治療骨礦質(zhì)和腎臟性疾病特別有用。
上述課題是通過(guò)以權(quán)利要求書(shū)所述為特征的實(shí)施方案而解決的。因此，本發(fā)明內(nèi)容之一是關(guān)于分離的具有phosphatonin活性的多肽。
除非另作說(shuō)明，本發(fā)明術(shù)語(yǔ)的定義參見(jiàn)“多語(yǔ)種生物技術(shù)術(shù)語(yǔ)匯編(IUPAC推薦)”,Leuenberger,H.G.W.,Nagel,B．和Kolbu,H.編，(1995),Helvetica ChimicaActa,CH-4010 Basle,Switzerland,ISBN 3-906 390-13-6。為了幫助理解本說(shuō)明書(shū)中的某些術(shù)語(yǔ)，提供以下定義。
“治療”在此指獲得所需的藥理學(xué)或生理學(xué)效果。所述的效果可能是完全或部分預(yù)防疾病或癥狀的發(fā)生，和/或是部分或完全治愈某疾病和/或該疾病所致的副作用?！爸委煛痹诖税▽?duì)哺乳動(dòng)物尤其是人進(jìn)行的對(duì)某疾病的各種治療方式(a)在易患病但尚未診斷出患病的個(gè)體中防止疾病的發(fā)生；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或(c)緩解疾病，即引起疾病的消退。本發(fā)明的目的是治療患有磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)疾病的患者。因此，本發(fā)明的治療包括預(yù)防、抑制或緩解各種與磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)的病癥。
本發(fā)明中，“分離的”表示從其源環(huán)境(例如，天然物質(zhì)所在的天然環(huán)境)中分離出的物質(zhì)，因此通過(guò)“人的加工”而不同于其天然狀態(tài)。例如，一段分離的聚核苷酸可以是相關(guān)載體或組合物的一部分，或者可以包含在細(xì)胞內(nèi)但仍是“分離的”，因?yàn)橄嚓P(guān)載體、組合物或具體細(xì)胞并非該聚核苷酸原來(lái)所在的環(huán)境。
本發(fā)明的分離的phosphatonin多肽的分子量一般約53-60kDa,58-60kDa更好，這是用SDS-PAGE測(cè)定的，具體地說(shuō)是用12.5％的凝膠，pH8.6,TRIS-甘氨酸SDS緩沖液測(cè)定的，參見(jiàn)實(shí)施例1。pH7,4-12％梯度凝膠，MOPS電泳緩沖液進(jìn)行的bis-tris-SDS-PAGE可能測(cè)得約200kDa的分子量。在這樣的凝膠上也可能看到53-60kDa的低分子量條帶。多肽一般己糖基化，最好包含基本純的phosphatonin。
出人意料的是，我們發(fā)現(xiàn)可以按照實(shí)施例1所述的方案從Saos-2細(xì)胞(ECACC 89050205，歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)獲得。因此，本發(fā)明的另一方面提供了Saos-2細(xì)胞或HTB-96細(xì)胞用于生產(chǎn)phosphatonin的用途。其他轉(zhuǎn)化或無(wú)限繁殖細(xì)胞系可能能夠過(guò)表達(dá)phosphatonin，例如轉(zhuǎn)化的成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞系。
本發(fā)明還描述并克隆了一個(gè)基因，它可能編碼上述來(lái)自腫瘤的磷酸鹽沉著因子(即phosphatonin或MEPE)(轉(zhuǎn)移性腫瘤分泌的磷酸鹽沉著因子)。為了概括，用對(duì)腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)磷酸鹽沉著因子特異的抗血清，對(duì)抽提自O(shè)HO腫瘤的mRNA構(gòu)建的λZAPⅡ-cDNA文庫(kù)進(jìn)行表達(dá)篩選。該蛋白是糖基化的，在SDS-PAGE電泳中分為兩條帶(58-60kDa)，表明可能發(fā)生拼接或翻譯后剪切。所克隆的cDNA編碼一個(gè)430殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:2)，長(zhǎng)1655bp(SEQ ID NO:1)。該基因有完整的3＇末端，部分5＇末端缺失。含有10個(gè)β-半乳糖苷酶殘基的該融合蛋白在人腎細(xì)胞系(CL8)中強(qiáng)效抑制Na+依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)證實(shí)，該蛋白具有高度親水性，具有很小的疏水區(qū)，不含半胱氨酸殘基。其中有許多螺旋區(qū)域，在羧基端有兩個(gè)不同的N-糖基化基序。一個(gè)重要特征是具有與骨橋蛋白中發(fā)現(xiàn)的相同結(jié)構(gòu)的一段細(xì)胞結(jié)合序列。該基序毗鄰的蛋白酶解位點(diǎn)可能造成對(duì)特定整聯(lián)蛋白(例如骨橋蛋白中的那些)受體特異性的改變。MEPE序列篩選震顫數(shù)據(jù)庫(kù)(tremble database)還顯示與牙質(zhì)phosphoryn(DPP)的序列同源性。具體地說(shuō)，MEPE與DPP、牙質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMA-1)和骨橋蛋白(OPN)C末端的部分殘基具有驚人的同源性。MEPE的該區(qū)域含有成串的天冬氨酸和絲氨酸殘基重復(fù)(DDSSESSDSGSSSESD)，與DPP、DMA-1和OPN的同源性分別為80％、65％和62％。而且，如果考慮殘基的理化特征，同源性上升至93％，表明彼此具有相同或相關(guān)的生物功能。需要注意的還有，MEPE中該結(jié)構(gòu)基序與酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化基序重疊。佝僂病中骨骼酪蛋白激酶Ⅱ活性缺陷，造成骨橋蛋白磷酸化不良(Rifas,Calcif.Tissue Int.61(1997),256-259)。因此，目前認(rèn)為酪蛋白激酶Ⅱ缺陷與骨基質(zhì)礦化不良有關(guān)(Rifas,Ioc.cit.)。
牙質(zhì)phosphoryn(DPP)是牙質(zhì)唾液酸磷酸蛋白(DSSP)剪切產(chǎn)物的一部分，另一部分是牙質(zhì)唾液酸蛋白(DSP)(MacDougall,J.Biol.Chem.272(1997),835-842)。特別有意義的是，DSSP、MDA-1、OPN和MEPE的是含RGD的磷酸-糖蛋白，具有特有的結(jié)構(gòu)相似性，并在骨-齒礦化中起主要作用(Linde,Crit.Rev.Oral Biol.Med.4(1993),679-728)。
本發(fā)明所述新的OHO腫瘤產(chǎn)生的磷酸鹽沉著因子(又名phosphatonin或MEPE)通過(guò)調(diào)節(jié)Na+依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者、維生素D代謝和骨的礦化來(lái)維持骨礦質(zhì)的體內(nèi)平衡。
誠(chéng)如后文的詳細(xì)描述，我們分離到一段聚核苷酸，它編碼本發(fā)明的多肽；參見(jiàn)實(shí)施例2。phosphatonin的氨基酸序列和核苷酸序列參見(jiàn)圖8(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。因此，本發(fā)明多肽具有圖8所示的氨基酸序列，或選性地包括不影響其活性的突變或缺失。這樣的突變包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，尤其是同系氨基酸取代，一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加，特別是在N或C末端。缺失包括N或C末端的缺失。以天然氨基酸或合成氨基酸取代都可以。還包括經(jīng)化學(xué)修飾或酶修飾的多肽。而且，片段肽，化學(xué)合成或生物方法獲得的，修飾或非修飾的，都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明是關(guān)于phosphatonin多肽或其免疫活性和/或生物學(xué)活性片段，編碼其所含氨基酸序列的聚核苷酸選自(a)編碼至少含氨基酸序列SEQ ID NO:2(圖8)的該多肽成熟形式的聚核苷酸；(b)含編碼序列SEQ ID NO:1(圖8)，編碼至少該多肽成熟形式的聚核苷酸；(c)聚核苷酸(a)或(b)所編碼的多肽因其氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或增加而衍生得到的多肽的編碼聚核苷酸；(d)含有與(a)至(c)中任一聚核苷酸雜交的互補(bǔ)鏈的聚核苷酸；(e)所編碼的多肽與(a)至(d)中任一聚核苷酸所編碼的多肽具有60％或更高氨基酸序列一致性的聚核苷酸；(f)所編碼的多肽能夠調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的聚核苷酸，該多肽含有(a)至(e)中任一聚核苷酸所編碼多肽的片段或帶表位部分；(g)編碼phosphatonin多肽的帶表位部分的聚核苷酸，所述的帶表位部分包含SEQ ID NO:2(圖8)中的1-40,141-180和/或401-429氨基酸殘基；(h)包含(a)至(g)任一聚核苷酸中至少15個(gè)核苷酸，并編碼一段能調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的多肽的聚核苷酸；(i)編碼能調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的多肽的聚核苷酸，該多肽含有(a)至(h)中任一聚核苷酸所編碼多肽的細(xì)胞和/或糖胺聚糖結(jié)合基序和/或骨礦化基序；(j)因遺傳密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生的(a)至(i)中任一聚核苷酸的簡(jiǎn)并性聚核苷酸。
在此，phosphatonin“聚核苷酸”表示具有SEQ ID NO:1中核酸序列的分子，或編碼本發(fā)明phosphatonin多肽的分子。例如，phosphatonin聚核苷酸可含有全長(zhǎng)cDNA，包括5＇端和3＇端的非翻譯區(qū)和編碼區(qū)，該核酸序列的片段、表位、結(jié)構(gòu)域和變異體。
此外，phosphatonin“多肽”在此指具有以上廣義聚核苷酸經(jīng)翻譯產(chǎn)生的氨基酸序列的分子。
phosphatonin“聚核苷酸”還包括能在嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與SEQ ID NO:1中的序列或其互補(bǔ)序列雜交的聚核苷酸?！皣?yán)謹(jǐn)性雜交條件”指在溶液(50％甲酰胺，5×SSC(750mM NaCl,75mM檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt＇s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切鮭魚(yú)精子DNA)中42℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后約65℃在0.1×SSC中洗滌濾膜。其他合適的雜交條件參見(jiàn)實(shí)施例。
本發(fā)明還考慮在低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與phosphatonin“聚核苷酸”雜交的核酸分子。通過(guò)調(diào)節(jié)甲酰胺濃度(甲酰胺百分比越低，嚴(yán)謹(jǐn)性越低)、鹽條件或溫度來(lái)改變雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和信號(hào)檢測(cè)。例如，低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件包括在含6×SSPE(20×SSPE=3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA,pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鮭魚(yú)精子覆蓋DNA的溶液中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后約50℃在1×SSPE、0.1×SDS中洗滌濾膜。此外，為了進(jìn)一步降低嚴(yán)謹(jǐn)性，嚴(yán)謹(jǐn)性雜交后可在更高的鹽濃度(例如，5×SSC)下進(jìn)行洗滌。注意，可通過(guò)在雜交試驗(yàn)中加入和/或換用其他降低背景的覆蓋劑來(lái)改變上述條件。典型的覆蓋劑包括Denhardt＇s試劑，BLOTTO，肝素，變性鮭魚(yú)精子DNA和市售專(zhuān)利制劑。加入特定的封閉劑可能需要改變前述雜交條件，因?yàn)橛邢嗳菪詥?wèn)題。當(dāng)然，僅與polyA+序列(例如序列表中cDNA的3＇端polyA+段)或其T(或U)殘基互補(bǔ)延伸雜交的聚核苷酸不包括在“聚核苷酸”定義內(nèi)，因?yàn)榇祟?lèi)聚核苷酸會(huì)與任一含polyA延伸段或其互補(bǔ)序列的核酸分子雜交(例如，雙鏈cDNA克隆)。
所述phosphatonin聚核苷酸可由各種聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸構(gòu)成，可以是非修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。例如，phosphatonin聚核苷酸可以是單鏈和雙鏈DNA，單鏈區(qū)與雙鏈區(qū)混合的DNA，單鏈與雙鏈RNA，單鏈區(qū)與雙鏈區(qū)混合的RNA,DNA與RNA的雜交分子，該分子可以是單鏈，更多情況下是雙鏈或單鏈區(qū)與雙鏈區(qū)混合。此外，phosphatonin聚核苷酸可以具有包含RNA或DNA或以上兩者的三鏈區(qū)。phosphatonin聚核苷酸還可以包含出于穩(wěn)定性或其他原因修飾過(guò)的堿基或DNA或RNA骨架?！靶揎棥眽A基包括，例如，三苯甲基堿基和肌苷等罕見(jiàn)堿基。可對(duì)DNA或RNA進(jìn)行多種修飾；因此，“聚核苷酸”包括化學(xué)、酶法或代謝修飾形式。
phosphatonin多肽可由氨基酸通過(guò)肽鍵或修飾肽鍵彼此連接而成，即，肽等電子排列體，并可含有20個(gè)基因編碼氨基酸以外的氨基酸。所述的phosphatonin多肽可通過(guò)天然過(guò)程修飾，例如翻譯后加工，或用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法修飾。上述修飾的描述可參見(jiàn)基礎(chǔ)教科書(shū)和更詳細(xì)的專(zhuān)論，以及大量研究文獻(xiàn)中。修飾可以在phosphatonin多肽內(nèi)任意位置進(jìn)行，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基末端或羧基末端?？梢岳斫?，在一給定phosphatonin多肽內(nèi)，可能在幾個(gè)位點(diǎn)存在相同或不同程度的同類(lèi)型的修飾。而且，一給定phosphatonin多肽可能含有許多類(lèi)型的修飾。phosphatonin多肽可以經(jīng)(例如)遍在蛋白化而分支，或者是有或沒(méi)有分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支或分支環(huán)狀phosphatonin多肽可能來(lái)自翻譯后的天然加工，或由合成法制造。修飾包括乙?；?、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共價(jià)連接黃素、共價(jià)連接血紅素、共價(jià)連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價(jià)連接脂類(lèi)或脂類(lèi)衍生物、共價(jià)連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、去甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸鹽、配制、γ-羧化、糖基化、形成GPI錨、羥化、碘代、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、pegylation、蛋白酶解、磷酸化、異戊二烯基化、外消旋化、硒代、硫酸鹽化、通過(guò)RNA介導(dǎo)在蛋白質(zhì)中加入氨基酸例如精氨酸化，和遍在蛋白化；參見(jiàn)，例如，PROTEINS-STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；蛋白質(zhì)的翻譯后共價(jià)修飾(POST-TRANSLATION COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS),B.C.Johnson編，Academic Press,NewYork(1983),ps.1-12；Seifter,Meth.酶(Enzymol.)182(1990):626-646,Rattan，紐約科學(xué)協(xié)會(huì)學(xué)報(bào)(Ann.NY Acad.Sci.)663(1992)；48-62。例如，phosphatonin可能先表達(dá)成蛋白前體，然后經(jīng)過(guò)對(duì)前體序列的加工，前體序列可被切成兩段或更多段，并因(例如)形成了例如氫鍵而仍然結(jié)合在一起。對(duì)phosphatonin多肽前體蛋白甚至其成熟形式的加工和/或剪切可通過(guò)剪切位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢岳斫猓猩鲜鲂问降膒hosphatonin蛋白都包括在術(shù)語(yǔ)“phosphatonin多肽”、“多肽”或“蛋白質(zhì)”內(nèi)。
“SEQ ID NO:1”是phosphatonin聚核苷酸序列，“SEQ ID NO:2”是phosphatonin多肽序列。
“具有生物學(xué)活性”的phosphatonin多肽指，在后文特定生物試驗(yàn)(劑量依賴(lài)或非劑量依賴(lài))中測(cè)定，表現(xiàn)出的生物學(xué)活性與phosphatonin多肽相似但不一定完全相同的多肽。如果存在劑量依賴(lài)，不要求與phosphatonin多肽活性完全相同，而是某一活性具有與phosphatonin多肽基本相同的劑量依賴(lài)性(即，與phosphatonin多肽相比，候選肽表現(xiàn)出更高的活性，或者，活性不低于75％，不低于90％更好，最好不低于97％)。
“免疫活性”或“生物學(xué)活性”本發(fā)明phosphatonin多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物，保留了主要的免疫學(xué)特征，即，本發(fā)明的聚核苷酸包括編碼如下蛋白質(zhì)或肽的所有核苷酸序列，所述的蛋白質(zhì)或肽具有一個(gè)或多個(gè)表位的至少部分一級(jí)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)像，所述表位能特異性地與前述聚核苷酸所編碼的phosphatonin蛋白的獨(dú)特抗體反應(yīng)。較好的是，本發(fā)明聚核苷酸編碼的肽和蛋白被與phosphatonin多肽上一表位特異性反應(yīng)的抗體所識(shí)別，所述表位包含SEQ IDNO:2中的氨基酸殘基20-30、100-130、145-160、300-310、320-340或380-430，或如后文所述的phosphatonin多肽上的一個(gè)表位。殘基380-430肽/抗體對(duì)于研究礦化過(guò)程特別有用，殘基145-160用于研究受體配體相互作用，殘基20-30和100-130用于研究磷酸鹽調(diào)節(jié)。
較好的是，本發(fā)明phosphatonin多肽的免疫活性phosphatonin肽片段、類(lèi)似物和衍生物能夠在哺乳動(dòng)物，特別是小鼠或大鼠內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，phosphatonin多肽的生物學(xué)活性在于能夠調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝，即具有“phosphatonin活性”。phosphatonin活性“能夠調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝”在此表示對(duì)象內(nèi)有無(wú)本發(fā)明的phosphatonin多肽(即其水平)調(diào)節(jié)著Na+依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者、維生素D代謝和/或骨礦化。根據(jù)所述活性被本發(fā)明多肽上調(diào)還是下調(diào)，“能夠調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝”分為“phosphatonin活性”和“反phosphatonin活性”。
phosphatonin活性可用常規(guī)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，例如下調(diào)鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者和/或上調(diào)腎25-羥基維生素D3-24-羥化酶和/或下調(diào)腎25-羥基-D-1α羥化酶。各種情況下，相關(guān)酶活性的調(diào)節(jié)可直接或間接受到phosphatonin的影響；例如，測(cè)定磷酸鹽的放射性Na依賴(lài)性吸收。這些活性可用合適的腎細(xì)胞系，例如CL8或OK(ECACC 91021202，歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)進(jìn)行試驗(yàn)。一種合適的實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)Rowe等(1996)。phosphatonin活性還可以通過(guò)在組織培養(yǎng)物內(nèi)促進(jìn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的礦化的能力來(lái)衡量；參見(jiàn)，例如，Santibanez,Br.J.Cancer 74(1996),418-422；Stringa,Bone 16(1995),663-670；Aronow,J.Cell Physiol.143(1990),213-221；或參見(jiàn)后文實(shí)施例。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供一種上述多肽的生物學(xué)活性片段。不管理論上如何，phosphatonin被認(rèn)為可能以聚合激素的形式發(fā)揮作用，它可以在體內(nèi)被切成一段或多段片段，至少其中部分片段具有生物學(xué)活性，例如激素活性?！绑w內(nèi)”被認(rèn)為表示phosphatonin可被蛋白酶解剪切，例如被PHEX基因產(chǎn)物剪切，產(chǎn)生至少一種功能片段。在一優(yōu)選實(shí)施例中，包含生物學(xué)活性片段的多肽能夠因具有(例如)前述phosphatonin活性或后文所述的反phosphatonin活性而調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝。所述生物活性片段可以是N末端、C末端或中間片段。含生物學(xué)活性片段的多肽還可以含有其他氨基酸序列，只要其生物學(xué)活性不受影響。
較好的是，所述生物學(xué)活性片段具有一個(gè)細(xì)胞結(jié)合基序，宜含RGD。如后文所述，該基序可能參與受體和/或骨礦化基質(zhì)相互作用。較好的是，生物學(xué)活性片段具有糖胺聚糖結(jié)合基序，最好具有SGDG(SEQ ID NO:3)。糖胺聚糖的結(jié)合使片段類(lèi)似于蛋白聚糖。已知蛋白聚糖與骨的生物學(xué)活性，特別是細(xì)胞信號(hào)傳遞有關(guān)。后文將對(duì)這些基序進(jìn)行詳細(xì)論述。
本發(fā)明實(shí)施例之一中，含生物學(xué)活性片段的多肽具有phosphatonin活性。不管理論上如何，該活性據(jù)推斷存在于未經(jīng)PHEX金屬蛋白酶剪切的phosphatonin和攜有PHEX金屬蛋白酶剪切位點(diǎn)例如ADAVDVS(SEQ ID NO:4)的生物學(xué)活性片段，估計(jì)剪切發(fā)生在殘基VD(殘基235和236之間)。生物學(xué)活性片段可能包含圖8氨基酸序列的至少前236個(gè)殘基，該P(yáng)HEX金屬蛋白酶剪切位點(diǎn)因而包含在該片段中。此類(lèi)具有phosphatonin活性的多肽及其片段可用于治療血磷酸鹽過(guò)多。相關(guān)蛋白本發(fā)明的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，phosphatonin(MEPE)、牙質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(DMP1)、牙質(zhì)唾液酸磷酸蛋白(DSSP；更具體地說(shuō)是牙質(zhì)phosphoryn的C末端)、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨橋蛋白(OPN)之間具有許多獨(dú)特的相似性。具體地說(shuō)，上述基質(zhì)蛋白都具有RGD基序，都被糖基化，天冬氨酸和絲氨酸含量異常高。酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化基序是他們的共同特征并有彼此同源的局部區(qū)域。Lanview-sim分析Swissport軟件(Duret,LALNVIEW用于配對(duì)序列對(duì)齊的圖象觀察器。Computi.Biosci.12(1996),507-510)，通過(guò)phosphatonin與DSSP之間的點(diǎn)陣比較圖形顯示了高同源性區(qū)域。該基序在DSSP的牙質(zhì)phosphoryn(DP)部分重復(fù)了5次(圖12)，與phosphatoninC末端具有80％的同源性。根據(jù)理化參數(shù)，同源性預(yù)測(cè)可達(dá)93％，該序列同系物也存在于所述的其他骨/牙質(zhì)分子中，序列類(lèi)似性分別為60-65％。在該同一區(qū)域，DMA-1和phosphatonin之間還具有延伸的序列同源性，如表2和以下序列比較所示408 SSRRRDDSSESSDSGSSSESDG 429 MEPE(SEQ ID NO:5)
443 SSRSKEDSN-STESKSSSEEDG 463 DMA-1(SEQ ID NO:6)牙質(zhì)唾液酸磷酸蛋白(DSSP)是一種含RGD的大糖蛋白，體內(nèi)經(jīng)剪切產(chǎn)生牙質(zhì)唾液酸蛋白(DSP)和牙質(zhì)phosphoryn(DP)兩種蛋白(MacDougall,J.Biol.Chem.272(1997),853-842)。DSP是N末端的肽，DP是C末端的肽，兩者原先被認(rèn)為來(lái)自不同的基因。phosphatonin與DSSP的高嚴(yán)謹(jǐn)性和低嚴(yán)謹(jǐn)性統(tǒng)計(jì)點(diǎn)陣比較顯示在圖13中?！盎?同源物”(DSSESSDSGSSSES(SEQ ID NO:7)在DSSP中的重復(fù)特征及其驚人的同源性清楚地顯示在兩張圖中。該基序在MEPE中只在C末端出現(xiàn)1次。而且，清楚地顯示DSSP(或DP部分)的C末端總體序列相似性較低。因此認(rèn)為現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的“獨(dú)特”特征，該特征可能與骨-齒基質(zhì)類(lèi)蛋白內(nèi)的骨-礦質(zhì)相互作用有關(guān)。
總之，所述各蛋白都似乎與骨礦質(zhì)或齒胞外基質(zhì)形成完整的結(jié)合，并且，這些相互作用據(jù)信是通過(guò)整聯(lián)蛋白/RGD結(jié)合介導(dǎo)的。而且，新的區(qū)域性基序(富含絲氨酸和天冬氨酸)對(duì)磷酸鈣相互作用有利。所以，這支持這一假設(shè)，phosphatonin的C末端參與骨礦質(zhì)的體內(nèi)平衡，N末端影響腎磷酸鹽調(diào)節(jié)?？傊?，這些蛋白質(zhì)的共同特征包括1．相似結(jié)構(gòu)中的RGD基序；2．糖蛋白；3．富含絲氨酸和天冬氨酸；4．酪氨酸激酶和蛋白激酶基序；5．獨(dú)特的富含天冬氨酸-絲氨酸的MEPE基序(在DPP內(nèi)重復(fù))；6．大量磷酸化基序和肉豆蔻酸化基序；7．表明剪切和/或不同拼接的證據(jù)；8．都與骨或齒胞外基質(zhì)相結(jié)合。
因此，在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，phosphatonin多肽具有上述骨礦質(zhì)基序，較好的是，氨基酸序列SEQ ID NO:5或7，或DMP1、DSSP、BSP、OPN或DMA-1蛋白中與此對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
生物學(xué)活性片段本發(fā)明另一實(shí)施例中，含生物學(xué)活性片段的多肽具有與phosphatonin相反的活性，可能適合治療血磷酸鹽過(guò)少性情況。該實(shí)施例中，多肽能夠直接或間接上調(diào)鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者和/或下調(diào)25-羥基維生素D3-24羥化酶和/或上調(diào)腎25-羥基-D-1α羥化酶。該活性又稱(chēng)“反phosphatonin活性”。然而，“反phosphatonin活性”并不排除所述活性是真phosphatonin在磷酸鹽代謝中的主要活性之一的可能性。此類(lèi)“反phosphatonin活性”也可用合適的腎細(xì)胞系例如CL8或OK(ECACC91021202，歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)和Rowe等(1996)的方法方便地試驗(yàn)測(cè)定；還可參見(jiàn)前文所述和后文實(shí)施例中的方法。因此，根據(jù)前文或后文(例如實(shí)施例)所述的的方法，可方便地測(cè)定本發(fā)明phosphatonin多肽的phosphatonin活性或“反phosphatonin活性”。較好的是，片段是PHEX金屬蛋白酶酶解剪切phosphatonin而得到的。如Rowe等所述(1997)，已經(jīng)克隆了PHEX基因，并發(fā)現(xiàn)它編碼一種Zn金屬肽酶。同樣，不管理論上如何，具有上述活性的生物學(xué)活性片段據(jù)信缺失圖8氨基酸序列的至少部分N末端或C末端，較好的是至少缺失C末端起至推定的殘基235/236處的PHEX金屬蛋白酶剪切位點(diǎn)。因此，該多肽含有最好不超過(guò)圖8氨基酸序列的前235個(gè)氨基酸殘基。
根據(jù)實(shí)施例4的解釋?zhuān)景l(fā)明的phosphatonin多肽是用一個(gè)表達(dá)文庫(kù)克隆的，其中靶cDNA與β半乳糖苷酶的一部分融合。在由此獲得的cDNA中不包括N末端的甲硫氨酸。然而，據(jù)推斷，真phosphatonin的氨基酸序列具有N末端的甲硫氨酸。因此，在本發(fā)明phosphatonin多肽實(shí)施例之一中，多肽的氨基酸序列具有加到N末端的Met。
另一實(shí)施例中，本發(fā)明多肽可以是融合蛋白的一部分。后文有該實(shí)施例的詳細(xì)描述。
本發(fā)明還提供編碼所述phosphatonin多肽的聚核苷酸。這樣的聚核苷酸可以是DNA，例如cDNA，或RNA，例如mRNA，或任何其他形式的核酸，包括合成或修飾的衍生物，它們可以以一段連續(xù)序列編碼多肽，也可以以被插入序列打斷的多段序列編碼多肽。不論以何種形式存在，所述聚核苷酸都是分離的聚核苷酸，因?yàn)樗褟奶烊凰幍臓顟B(tài)中分離出來(lái)。本發(fā)明這部分內(nèi)容的基礎(chǔ)是人phosphatonin基因的克隆。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述的聚核苷酸包含圖8的核苷酸序列，并或選性地包含不影響所編碼多肽活性的一個(gè)或多個(gè)突變或缺失。這樣的突變包括因遺傳密碼子簡(jiǎn)并性造成的突變，和前文所述造成氨基酸突變或缺失的各種核苷酸突變。因此，運(yùn)用分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)，可利用圖8的核苷酸序列產(chǎn)生編碼本發(fā)明所用多肽的合適的聚核苷酸序列。如前文所述，本發(fā)明還包括缺失C末端或N末端后續(xù)核苷酸的phosphatonin聚核苷酸，后文對(duì)此有詳細(xì)描述。本發(fā)明聚核苷酸序列的延長(zhǎng)如實(shí)施例4所述，用表達(dá)文庫(kù)所得的phosphatonin聚核苷酸可能不是完整5＇末端的全長(zhǎng)序列。因此，用部分核苷酸序列和各種本領(lǐng)域已知的檢測(cè)例如啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件等上游序列的方法，可延長(zhǎng)編碼phosphatonin多肽的聚核苷酸序列。Gobinda,(PCR Methods Applic.2(1993),318-322)揭示了用通用引物，通過(guò)“限制性位點(diǎn)”聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，直接檢索與已知基因座毗鄰的未知序列。首先，用接頭序列的引物和已知區(qū)的特異性引物擴(kuò)增基因組DNA。用同一接頭序列的引物和比前一引物更靠?jī)?nèi)的另一個(gè)特異性引物對(duì)擴(kuò)增所得片段進(jìn)行第二輪PCR。用合適的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄各輪PCR的產(chǎn)物，并用逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)序。
可用反向PCR，用根據(jù)已知區(qū)域的不同引物擴(kuò)增或延長(zhǎng)序列(Triglia,NucleicAcids Res.16(1988),8186)。可用OLIGO4.06引物分析軟件(1992,NationalBiosciences Inc.,Plymouth MN)或其他合適的程序來(lái)設(shè)計(jì)引物，長(zhǎng)度以22-30個(gè)核苷酸為宜，GC含量最好不低于50％，與靶序列退火結(jié)合的溫度以約68-72℃為宜。該方法在基因已知區(qū)域內(nèi)用多種限制性酶產(chǎn)生一段合適片段。然后通過(guò)分子內(nèi)連接反應(yīng)環(huán)化，用作PCR的模板。
捕捉PCR(Lagerstrom,PCR Methods Applic.1(1991),111-119)是一種PCR擴(kuò)增(例如)人酵母人造染色體DNA中與已知序列毗鄰的DNA片段的方法。捕捉PCR也需要在PCR前通過(guò)限制性酶消化和連接將一段工程化的雙鏈序列插入DNA分子的未知部分內(nèi)。
檢索未知序列的另一方法是Parker所述的方法(Nucleic Acids Res.19(1991),3055-3060)。此外，可用PCR，套組引物和PromoterFinder文庫(kù)進(jìn)行基因組DNA的行軍PCR(PromoterFinderTMClontech(Palo Alto CA))。該方法不需要篩選文庫(kù)，并可用于尋找內(nèi)含子/外顯子接頭。用于篩選全長(zhǎng)cDNA的文庫(kù)最好經(jīng)大小選擇而包含較大的cDNA。而且，優(yōu)選隨機(jī)引發(fā)文庫(kù)，因?yàn)樗鼈兒懈喟?＇和上游區(qū)域的序列。如果寡聚d(T)文庫(kù)不能獲得全長(zhǎng)cDNA，則隨機(jī)引發(fā)的文庫(kù)特別有用。而且，還可直接檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物的序列?；蚪M文庫(kù)可用于延伸到5＇非翻譯調(diào)控區(qū)內(nèi)。可用毛細(xì)管電泳分析大小或證實(shí)測(cè)序結(jié)果或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列；參見(jiàn)，例如，Sambrook，同上?？焖贉y(cè)序系統(tǒng)可獲自Perkin Elmer,BeckmannInstruments(Fullerton CA)，以及其他公司。計(jì)算機(jī)輔助鑒定phosphatonin多肽及其編碼基因可用BLAST2，即基本局部對(duì)比查找工具(Basic Local Alignment SearchTool)(Altschul,Nucleic Acids Res.,25(1997),3389-3402；Altschul,J.Mol.Evol.,36(1993),290-300；Altschul,J.Mol.Biol.215(1990),403-410)，查找局部序列對(duì)比。BLAST既可找到核苷酸對(duì)比也可找到氨基酸對(duì)比，由此確定序列相似性。因?yàn)閷?duì)比的局部性，BLAST在確定確切匹配或鑒定同系物中特別有用。BLAST算法輸出結(jié)果的基本單位是高分節(jié)段對(duì)(HSP)。一個(gè)HSP包括任意但等長(zhǎng)的兩個(gè)序列片段，它們的局部對(duì)比率最大，其對(duì)比分值符合或超過(guò)使用者設(shè)定的閾值或限值。BLAST搜索查詢(xún)序列和數(shù)據(jù)庫(kù)序列之間的HSP，估算找到的任意匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，只報(bào)道滿(mǎn)足使用者選定顯著性閾值的匹配。參數(shù)E確立報(bào)道數(shù)據(jù)庫(kù)序列匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性閾值。E是一個(gè)HSP(或一組HSP)在全數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中出現(xiàn)頻率的期望上限。任一匹配性滿(mǎn)足E的數(shù)據(jù)庫(kù)序列報(bào)道在程序的輸出結(jié)果中。
使用BLAST(Altschul,1997,1993和1990，同上)的類(lèi)似計(jì)算機(jī)技術(shù)被用于在核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，例如GenBank或EMBL中搜索全同或相關(guān)的分子。該方法比基于多層膜的雜交法快得多。而且，計(jì)算機(jī)搜索的靈敏度可調(diào)節(jié)，以確定任一具體的匹配是精確匹配還是類(lèi)似。搜索的基礎(chǔ)是如下得出的乘積分值 而且還考慮兩序列的相似程度和匹配序列的長(zhǎng)度。例如，乘積分值40，是誤差1-2％以?xún)?nèi)的精確匹配；70，則是精確匹配。類(lèi)似分子的鑒定通常是選擇乘積分值15-40之間的那些，更低的分值可作為相關(guān)序列。
有關(guān)本發(fā)明phosphatonin聚核苷酸和多肽及其分子衍生物的其他應(yīng)用，將在后文詳細(xì)論述。phosphatonin聚核苷酸和多肽參見(jiàn)實(shí)施例4，從癌源性血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化患者體內(nèi)摘取腦膜磷酸鹽沉著-間充質(zhì)-腫瘤，從中抽提mRNA建立cDNA文庫(kù)，從中分離出phosphatonin。
phosphatonin核苷酸序列SEQ ID NO:1由獲自相關(guān)DNA克隆的部分同源(“重疊”)序列組裝而成。重疊序列被拼裝成一段高豐余性(各核苷酸位置有3-5段重疊序列)的連續(xù)序列，最后得到序列SEQ ID NO:1。因此，SEQ ID NO:1和翻譯得到的SEQ ID NO:2足夠準(zhǔn)確，適合許多本領(lǐng)域已知和后文所述的用途。例如，SEQ ID NO:1可用于設(shè)計(jì)核酸雜交探針，檢測(cè)包含在SEQ ID NO:1內(nèi)的核酸序列。此類(lèi)探針還可以與生物樣品中的核酸分子雜交，因而可進(jìn)行本發(fā)明所述的法醫(yī)鑒定和診斷方法。同理，多肽SEQ ID NO:2可用于產(chǎn)生與phosphatonin特異性結(jié)合的抗體。但是，測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生的DNA序列會(huì)含有測(cè)序誤差。這些誤差是所得DNA序列中的誤鑒定核苷酸，或是核苷酸的插入或缺失。錯(cuò)誤插入或缺失的核苷酸會(huì)改變推定氨基酸序列的讀碼框。此時(shí)，推定氨基酸序列將不同于實(shí)際氨基酸序列，即使產(chǎn)生的DNA序列與實(shí)際DNA序列的一致性可能超過(guò)99.9％(例如，一個(gè)1000堿基開(kāi)放式讀碼框內(nèi)一個(gè)堿基的插入或缺失)。
因此，對(duì)于那些要求核苷酸序列或氨基酸序列準(zhǔn)確性的應(yīng)用來(lái)說(shuō)，本發(fā)明不僅提供所得的核苷酸序列SEQ ID NO:1和推定的翻譯所得氨基酸序列SEQ IDNO:2，而且提供了克隆核苷酸序列SEQ ID NO:1對(duì)應(yīng)的cDNA和基因組DNA的有用工具。所得phosphatonin克隆的核苷酸序列可用已知方法進(jìn)行克隆測(cè)序方便地進(jìn)行鑒定。然后，可由這些cDNA或基因組克隆驗(yàn)證推定的phosphatonin氨基酸序列。而且，要直接確定所得克隆編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，還可以通過(guò)肽測(cè)序，或在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白，收集蛋白，根據(jù)本發(fā)明所述方法測(cè)定其序列和功能。
本發(fā)明還涉及對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的phosphatonin基因。phosphatonin基因可用已知方法，用本文公開(kāi)的序列信息來(lái)分離。此類(lèi)方法包括根據(jù)所揭示的序列制備探針和引物，鑒定或擴(kuò)增來(lái)自相應(yīng)基因組原料的phosphatonin基因。
本發(fā)明還提供phosphatonin的同種類(lèi)似物?？捎帽景l(fā)明所提供的序列制備合適的探針或引物，在合適的核酸來(lái)源中篩選所需的類(lèi)似物。
因此，由于提供了編碼氨基酸序列SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:1及其他核苷酸序列，所以能夠從其他物種分離到全同或相似的編碼phosphatonin蛋白的核酸分子，尤其是從人以外的哺乳動(dòng)物分離直向同源phosphatonin基因。“直向同源”在此表示，來(lái)自同一始祖基因，經(jīng)特化過(guò)程得到的存在于不同物種的同源序列。直向同源基因所負(fù)責(zé)的功能可能相同，可能不同；參見(jiàn)，例如，“生物信息學(xué)導(dǎo)引”匯編，Trends Suppliment 1989,Elsevier Science。
可用任意合適的方式制備phosphatonin多肽。所述多肽包括分離的天然存在的多肽，重組產(chǎn)生的多肽，合成的多肽，綜合以上方法產(chǎn)生的多肽。制備所述多肽的方法是本領(lǐng)域所熟知的。
所提供的phosphatonin多肽最好呈分離的形式，而且最好是基本純的。重組產(chǎn)生的多肽，包括分泌多肽，可用Smith和Johnson,Gene 67(1988),31-40中所述的一步法基本純化。也可以用已知方法產(chǎn)生抗phosphatonin蛋白的本發(fā)明抗體，用該抗體從天然或重組來(lái)源中純化phosphatonin多肽。聚核苷酸與多肽變異體“變異體”指與phosphatonin聚核苷酸或多肽不同，但保留了其主要活性例如前述免疫學(xué)或(更好的是)生物學(xué)活性的聚核苷酸或多肽。一般，從總體上說(shuō)，變異體與phosphatonin聚核苷酸或多肽十分相似，并在許多區(qū)域全同。
這樣的聚核苷酸包括編碼前述phosphatonin蛋白片段、類(lèi)似物或衍生物的那些，尤其是直向同源基因，它們通過(guò)分別或綜合的氨基酸和/或核苷酸缺失、插入、取代、增加和/或重組，或本領(lǐng)域已知的任意其他修飾而不同于前述氨基酸序列或其核苷酸序列。本發(fā)明在核酸分子內(nèi)引入這些修飾的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的。所有這些本發(fā)明蛋白的片段、類(lèi)似物和衍生物只要前述主要免疫學(xué)和/或生物學(xué)特性未受影響，它們都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本文中的“變異體”表示，所述聚核苷酸的核苷酸及其編碼的氨基酸序列在一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置不同于前述phosphatonin的聚核苷酸和多肽，但與所述核酸分子高度同源。同源性理解為指序列一致性至少40％,50％以上為佳，60％以上更好，70％以上，80％以上，90％以上，甚至95％則還要好。與前述核酸分子序列的差異來(lái)自于，例如核苷酸取代、缺失、增加、插入和/或重組；參見(jiàn)前述文獻(xiàn)。同源性可能還表示相關(guān)核酸分子或其編碼的蛋白在功能和/或結(jié)構(gòu)上是相當(dāng)?shù)?。與前述核酸分子同源或由其衍生的核酸分子是，例如，所述核酸分子的變異，代表著具有相同生物學(xué)功能，尤其是編碼生物學(xué)功能相同或基本相同的蛋白的功能的修飾。它們可以是天然變異，例如來(lái)自其他哺乳動(dòng)物的序列，或是突變。所述突變可自然發(fā)生，或用誘變技術(shù)獲得。等位變異可以是自然發(fā)生的等位變異體和合成或基因工程產(chǎn)生的變異體；參見(jiàn)文獻(xiàn)同上。
核苷酸序列與本發(fā)明參照核苷酸序列的“一致性”在95％以上的聚核苷酸表示，該聚核苷酸序列中相對(duì)編碼phosphatonin多肽的參照核苷酸序列的每100個(gè)核苷酸有至多5處突變，除此之外，其核苷酸序列與參照序列相同。換言之，要獲得與參照序列一致性在95％以上的聚核苷酸，參照序列中至多5％的核苷酸可被缺失或替代，或者，可在參照序列中插入至多其核苷酸總數(shù)5％的核苷酸。查詢(xún)序列可以是完整的SEQ ID NO:1序列，或是本文所述的ORF(開(kāi)放讀碼框)或任一片段。
實(shí)踐中，某特定核酸分子或多肽與本發(fā)明核酸序列的一致性至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％還是99％，一般可用已知的計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定。測(cè)定查詢(xún)序列(本發(fā)明序列)與研究序列之間最佳整體匹配性，又稱(chēng)總體序列對(duì)比的一種優(yōu)選方法可采用根據(jù)Brutlag等的算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序(Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)。在序列對(duì)比中，查詢(xún)序列和研究序列都是DNA序列。RNA序列可通過(guò)將U轉(zhuǎn)換成T來(lái)比較。所述總體序列對(duì)比的結(jié)果是一致性百分比。用于DNA序列FASTDB對(duì)比法中計(jì)算一致性百分比的優(yōu)選參數(shù)是矩陣=一元，k-重?cái)?shù)=4，錯(cuò)配扣分=1，連接扣分=30，隨機(jī)化組長(zhǎng)度=0，截?cái)喾种?1，空距扣分=5，空距大小扣分=0.05，閱讀窗大小=500或研究核苷酸序列長(zhǎng)度，取兩者中較短者。
如果研究序列因?yàn)?＇或3＇缺失而不是因?yàn)閮?nèi)部缺失而比查詢(xún)序列短，必須對(duì)結(jié)果進(jìn)行人工校正。這是因?yàn)?，F(xiàn)ASTDB程序在計(jì)算一致性百分比時(shí)不將5＇或3＇的截?cái)嘤?jì)算在內(nèi)。對(duì)于相對(duì)查詢(xún)序列在5＇或3＇截短的研究序列來(lái)說(shuō)，一致性百分比的校正為計(jì)算查詢(xún)序列中對(duì)應(yīng)于研究序列5＇和3＇的、沒(méi)有參與匹配和對(duì)比的堿基數(shù)占查詢(xún)序列堿基總數(shù)的百分比。一個(gè)核苷酸是否匹配/對(duì)正，由FASTDB序列對(duì)比結(jié)果來(lái)確定。然后從前文用FASTDB程序和特定參數(shù)計(jì)算的一致性百分比中扣除這一百分比，從而得到最終一致性百分比分值。本發(fā)明采用這一校正后的分值。為了人工校正本發(fā)明一致性分值，只計(jì)算FASTDB對(duì)比所顯示的，沒(méi)有與查詢(xún)序列匹配/對(duì)比的研究序列5＇和3＇以外的堿基。
例如，一段90堿基的研究序列與一段100堿基的查詢(xún)序列對(duì)比，以測(cè)定一致性百分比。缺失發(fā)生在研究序列的5＇末端，因此，F(xiàn)ASTDB對(duì)比不顯示這5＇前10個(gè)堿基的匹配/對(duì)比。這10個(gè)沒(méi)有配對(duì)的堿基代表著序列的10％(5＇和3＇端沒(méi)有匹配的堿基數(shù)/查詢(xún)序列總堿基數(shù))，因此從FASTDB程序算得的一致性百分比中扣除10％。如果剩余的90％堿基完全匹配，最終的一致性百分比就將是90％。另一實(shí)施例中，一段90堿基的研究序列與一段100堿基的查詢(xún)序列比較。這次，缺失是內(nèi)部缺失，所以研究序列的5＇和3＇端沒(méi)有未與查詢(xún)序列匹配/對(duì)比的堿基。此時(shí)，不對(duì)FASTDB算得的一致性百分比進(jìn)行人工校正。在此重申，只有研究序列5＇和3＇端沒(méi)有與查詢(xún)序列匹配/對(duì)比的堿基要進(jìn)行人工校正。本發(fā)明不進(jìn)行其他校正。
氨基酸序列與本發(fā)明問(wèn)詢(xún)氨基酸序列的“一致性”在95％以上的多肽表示，該研究多肽的氨基酸序列中相對(duì)問(wèn)詢(xún)氨基酸序列的每100個(gè)氨基酸有至多5處氨基酸改變，除此之外，其氨基酸序列與查詢(xún)序列相同。換言之，要獲得氨基酸序列與查詢(xún)序列一致性在95％以上的多肽，研究序列中至多5％的氨基酸可被插入、缺失、增加或替代。參照序列的這些改變可以發(fā)生在氨基末端或羧基末端，或在兩末端之間的任意位置，它們或者各自分散在參照序列殘基之中，或者形成一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的組。
實(shí)踐中，某特定多肽或多肽與(例如)氨基酸序列SEQ ID NO:2的一致性至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％還是99％，一般可用已知的計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定。測(cè)定查詢(xún)序列(本發(fā)明序列)與研究序列之間最佳整體匹配性，又稱(chēng)總體序列對(duì)比的一種優(yōu)選方法可采用根據(jù)Brutlag等的算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序(Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)。在序列對(duì)比中，查詢(xún)序列和研究序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述總體序列對(duì)比的結(jié)果是一致性百分比。用于氨基酸序列FASTDB對(duì)比法中計(jì)算一致性百分比的優(yōu)選參數(shù)是矩陣=PAM0,k-重?cái)?shù)=2，錯(cuò)配扣分=1，連接扣分=20，隨機(jī)化組長(zhǎng)度=0，截?cái)喾种?1，閱讀窗大小=序列長(zhǎng)度，空距扣分=5，空距大小扣分=0.05，閱讀窗大小=500或研究核苷酸序列長(zhǎng)度，取兩者中較短者。
如果研究序列因?yàn)镹或C末端缺失而不是因?yàn)閮?nèi)部缺失而比查詢(xún)序列短，必須對(duì)結(jié)果進(jìn)行人工校正。這是因?yàn)?，F(xiàn)ASTDB程序在計(jì)算總體一致性百分比時(shí)不將N或C末端的截短計(jì)算在內(nèi)。對(duì)于相對(duì)查詢(xún)序列在N或C末端截短的研究序列來(lái)說(shuō)，一致性百分比的校正為計(jì)算查詢(xún)序列中對(duì)應(yīng)于研究序列N或C末端的、沒(méi)有與對(duì)應(yīng)研究殘基匹配和對(duì)比的殘基數(shù)占查詢(xún)序列殘基總數(shù)的百分比。一個(gè)殘基是否匹配/對(duì)正，由FASTDB序列對(duì)比結(jié)果來(lái)確定。然后從前文用FASTDB程序和所述參數(shù)計(jì)算的一致性百分比中扣除這一百分比，從而得到最終一致性百分比分值。本發(fā)明采用這一校正后的分值。為了人工校正本發(fā)明一致性分值，只計(jì)算FASTDB對(duì)比所顯示的，沒(méi)有與查詢(xún)序列匹配/對(duì)比的研究序列N或C末端以外的堿基。
例如，一段90氨基酸殘基的研究序列與一段100殘基的查詢(xún)序列對(duì)比，以測(cè)定一致性百分比。缺失發(fā)生在研究序列的N末端，因此，F(xiàn)ASTDB對(duì)比不顯示這N末端前10個(gè)殘基的匹配/對(duì)比。這10個(gè)沒(méi)有配對(duì)的殘基代表該序列的10％(N或C末端沒(méi)有匹配的殘基數(shù)/查詢(xún)序列總殘基數(shù))，因此從FASTDB程序算得的一致性百分比中扣除10％。如果剩余的90％殘基完全匹配，最終的一致性百分比就將是90％。另一實(shí)施例中，一段90殘基的研究序列與一段100殘基的查詢(xún)序列比較。這次，缺失是內(nèi)部缺失，所以研究序列的N或C末端沒(méi)有未與查詢(xún)序列匹配/對(duì)比的殘基。此時(shí)，不對(duì)FASTDB算得的一致性百分比進(jìn)行人工校正。在此重申，只有研究序列N或C末端沒(méi)有與查詢(xún)序列匹配/對(duì)比的殘基要進(jìn)行人工校正。本發(fā)明不進(jìn)行其他校正。
phosphatonin變異體可包括編碼區(qū)、非編碼區(qū)或以上兩區(qū)中的改變。特別好的是，聚核苷變異體包含產(chǎn)生沉默取代、增加或缺失，但不改變所編碼多肽的特性或活性。優(yōu)選的是遺傳密碼子簡(jiǎn)并性造成沉默取代而產(chǎn)生的核苷酸變異體。而且，優(yōu)選的還包括具有任意方式組合的5-10、1-5或1-2個(gè)氨基酸取代、缺失或增加的變異體。產(chǎn)生phosphatonin聚核苷酸變異體可出于許多目的，例如，為了優(yōu)化特定宿主內(nèi)的表達(dá)(將人RNA中的密碼子改變成大腸桿菌等細(xì)菌宿主所偏好的密碼子)。
天然phosphatonin變異體又稱(chēng)“等位基因變異體”，指占據(jù)生物體染色體上特定位置的某基因多種不同形式中的一種。(GeneⅡ,Lewin,B.ed.,John Wiley &Sons,New Youk(1985)及更新版)。這些等位基因變異體可具有聚核苷酸和/或多肽水平上的差異?；蛘?，可用誘變技術(shù)或直接合成產(chǎn)生非天然變異體。
用已知的蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)方法，可產(chǎn)生變異體以改善或改變phosphatonin多肽的特性。例如，可缺失蛋白質(zhì)N或C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而不損失其生物學(xué)功能。Ron.J.Biol.Chem.268(1993),2984-2988的作者報(bào)道了突變KGF蛋白，即使在缺失了3、8或27個(gè)氨基末端氨基酸殘基后，它們?nèi)员Ａ袅烁嗡亟Y(jié)合活性。與此相似，γ干擾素在缺失了羧基端的8-10個(gè)氨基酸殘基后，活性升高10倍(Dobeli,J.Biotechnology 7(1988),199-216)。
而且，大量證據(jù)表明，變異體一般都保留與天然蛋白相似的生物學(xué)功能。例如，Gayle及其同事(J.Biol.Chem.268(1993)；22105-22111)對(duì)人細(xì)胞因子IL-1a進(jìn)行了全面的突變研究。他們以隨機(jī)誘變產(chǎn)生了超過(guò)3500種IL-1a變異體，每個(gè)變異體總長(zhǎng)中平均約2.5個(gè)氨基酸改變。對(duì)每一個(gè)可能的氨基酸位置檢測(cè)到多種突變，研究者發(fā)現(xiàn)，“大多數(shù)分子可以被改變而對(duì)兩種(結(jié)合或生物學(xué))活性幾乎沒(méi)有影響”；參見(jiàn)Abstract。實(shí)際上，在被檢測(cè)的3500種氨基酸序列中只有23種獨(dú)特氨基酸序列產(chǎn)生了活性與野生型明顯不同的蛋白質(zhì)。
而且，即使N或C末端一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失改變或損失了一種或多種生物學(xué)功能，其他生物學(xué)功能仍然能夠被保留。例如，如果沒(méi)有從N末端或C末端缺失掉該蛋白的大多數(shù)殘基，缺失變異體可能保留誘導(dǎo)和/或結(jié)合識(shí)別該蛋白的抗體的能力。某蛋白缺失了N或C末端的特定多肽是否保留這樣的免疫活性可通過(guò)本發(fā)明所述和本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來(lái)測(cè)定。而且，用PESTFIND程序(Rogers，科學(xué)(Science)234(1986),364-368)可鑒定到PEST序列(富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)，他們特征性地存在于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)中?？扇コ齪hosphatonin蛋白質(zhì)中的這些序列以提高其穩(wěn)定性和該蛋白的某些活性。本發(fā)明在核酸分子內(nèi)引入這些修飾的方法是本領(lǐng)域所熟知的。
因此，本發(fā)明還包括表現(xiàn)出主要生物學(xué)活性的phosphatonin多肽變異體。這類(lèi)變體包括根據(jù)本領(lǐng)域已知通用規(guī)則的缺失、插入、反向、重復(fù)和取代，對(duì)活性幾乎沒(méi)有影響。例如，有關(guān)如何制造表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)可參見(jiàn)Bowie科學(xué)(Sience)247(1990),1306-1310，作者在其中指出，有兩種主要策略用于研究一段氨基酸序列對(duì)改變的耐受性。第一種策略靠自然選擇在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)氨基酸取代的耐受性。通過(guò)比較不同物種的氨基酸序列，可以發(fā)現(xiàn)保守的氨基酸。這些保守氨基酸可能對(duì)蛋白質(zhì)的功能十分重要。相比之下，氨基酸位置發(fā)生的取代能被自然選擇所耐受，說(shuō)明這些位置對(duì)蛋白質(zhì)的功能不重要。因此，耐氨基酸取代的位置可被修飾，而仍然維持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。
第二種策略利用基因工程在某克隆基因的特定位置引入氨基酸改變，以鑒定對(duì)蛋白質(zhì)功能來(lái)說(shuō)的重要區(qū)域。例如，可采用定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(在分子內(nèi)每個(gè)殘基處引入一個(gè)單丙氨酸突變)。(Cunningham和Wells，科學(xué)(Science)244(1989),1081-1085)。然后可測(cè)定所得突變分子的生物學(xué)活性。
如作者所述，這兩種策略揭示，蛋白質(zhì)對(duì)氨基酸取代具有驚人的耐受性。作者還說(shuō)明了蛋白質(zhì)內(nèi)某氨基酸位置上哪種氨基酸改變可能被允許。例如，大多數(shù)隱蔽氨基酸殘基(蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中)需要非極性側(cè)鏈，而極少數(shù)表面?zhèn)孺湹奶卣魇瞧毡楸Ｊ氐?。而且，可耐受的保守性氨基酸取代包括脂族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替換；羥基殘基Ser和Thr的替換；酸性殘基Asp和Glu的替換；酰胺殘基Asn和Gln的替換；堿性殘基Lys、Arg和His的替換；芳族殘基Phe、Tyr和Trp的替換；和小氨基酸殘基Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替換。
除保守性氨基酸取代之外，phosphatonin變異體還包括(ⅰ)一個(gè)或多個(gè)非保守性氨基酸取代，所取代的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼子所編碼的，或(ⅱ)用一個(gè)或多個(gè)有取代基的氨基酸殘基取代，或(ⅲ)成熟多肽與其他化合物，例如提高多肽穩(wěn)定性和/或溶解度的化合物(例如聚乙二醇)的融合體，或(ⅳ)多肽與附加氨基酸(例如IgG Fc融合區(qū)肽、前導(dǎo)序列或分泌序列、或協(xié)助純化的序列)的融合體。根據(jù)本文說(shuō)明，這些變異多肽都是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。例如，phosphatonin多肽變體中帶電氨基酸殘基被其他帶電或中性氨基酸殘基取代，可產(chǎn)生特性被改良(例如凝聚減少)的蛋白質(zhì)。藥物制劑的凝聚因?yàn)槟垠w的免疫原性既降低活性又加速清除；參見(jiàn)，例如，Pinckard，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)2(1967),331-340；Robbins，糖尿病(Diabetes)36(1987),838-845；Cleland,Crit.Rev．藥物載體系統(tǒng)(Therapeutic Drug Carrier Systems)10(1993),307-377。聚核苷酸和多肽片段本發(fā)明中，“聚核苷酸片段”指具有SEQ ID NO:1所含核酸序列的短聚核苷酸。短聚核苷酸片段的長(zhǎng)度最好至少15nt，至少20nt更好，至少30nt，甚至至少40nt還要好?！伴L(zhǎng)至少20nt”的片段指包含核苷酸序列SEQ ID NO:1所含cDNA序列中20或20個(gè)以上相鄰堿基。這些核苷酸片段可用作診斷探針或引物，如本文所述。當(dāng)然，更大的片段(例如，50、150、500、600、1000核苷酸)更好。
而且，phosphatonin聚核苷酸片段的代表性例子包括序列為SEQ ID NO:1中約核苷酸1-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、551-600、601-650、651-700、701-750、751-800、801-850、851-900、901-950、951-1000、1001-1050、1051-1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、1251-1300或1301-1350的片段?！凹s”包括比上述范圍在各末端或兩末端大或小幾個(gè)(5、4、3、2或1個(gè))核苷酸。較好的是，這些片段編碼具有生物學(xué)活性的多肽。更好的是，這些聚核苷酸可用作本發(fā)明所述的探針或引物。
本發(fā)明中，“多肽片段”指包含在SEQ ID NO:2中的短氨基酸序列。蛋白質(zhì)片段可以是“獨(dú)立”的，或者包含在一個(gè)較大的多肽內(nèi)作為該多肽的一部分或一個(gè)區(qū)域，最好是一個(gè)單獨(dú)的連續(xù)區(qū)。本發(fā)明多肽片段的代表性例子包括從約1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280、281-300、301-320、321-340、341-360、361-380、381-400和401-421號(hào)氨基酸至編碼序列區(qū)的片段。而且，多肽片段可以長(zhǎng)約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150個(gè)氨基酸?！凹s”包括比上述范圍在各末端或兩末端大或小(幾個(gè)(5、4、3、2或1個(gè))氨基酸。
優(yōu)選的多肽片段包括氨基或羧基末端或兩末端連續(xù)缺失殘基的phosphatonin蛋白。例如，可從phosphatonin多肽的氨基末端缺失1-60間任意數(shù)量的氨基酸。同理，可從phosphatonin多肽的羧基末端缺失1-30間任意數(shù)量的氨基酸。而且，上述氨基和羧基末端缺失的各種組合更好。同理，也優(yōu)選編碼這些phosphatonin多肽片段的聚核苷酸片段。
特別是，phosphatonin多肽的N末端缺失可表示為通式m-430，其中m是整數(shù)2-416，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:2中氨基酸殘基的位置。
優(yōu)選的還有以結(jié)構(gòu)域或功能域?yàn)樘卣鞯膒hosphatonin多肽或聚核苷酸片段。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例包括具有α螺旋和α螺旋形成區(qū)(“α區(qū)”)，β平面和β平面形成區(qū)(“β區(qū)”)，轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)(“轉(zhuǎn)角區(qū)”)，卷曲或卷曲形成區(qū)(“卷曲區(qū)”)，親水區(qū)，疏水區(qū)，α兩親區(qū)，β兩親區(qū)，柔性區(qū)，表面形成區(qū)，底物結(jié)合區(qū)和高抗原性指數(shù)區(qū)的片段。如附圖所示，這些優(yōu)選區(qū)域包括Garnier-Robson α區(qū)、β區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)和卷曲區(qū)，Chou-Fasmanα區(qū)、β區(qū)和轉(zhuǎn)角區(qū)，Kyte-Doolittle親水區(qū)和疏水區(qū)，Eisenberg α和β兩親區(qū)，Karplus-Sehulz柔性區(qū)，Emini表面形成區(qū)，和Jameson-Wlof高抗原性指數(shù)區(qū)。本發(fā)明特別重視屬于保守區(qū)的SEQ ID NO:2的多肽片段，并在附圖中給予顯示。而且，本發(fā)明還包括編碼這些區(qū)域的聚核苷酸片段。
其他優(yōu)選的是生物學(xué)活性的phosphatonin片段。生物學(xué)活性片段是那些表現(xiàn)出與phosphatonin多肽相似但不一定全同的生物學(xué)活性的片段。生物學(xué)活性片段可增強(qiáng)某一需要的活性，或減弱某一不需要的活性。
然而，許多聚核苷酸序列，例如EST序列，是公眾能夠得到的，并可通過(guò)序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。其中某些可能與SEQ ID NO:1相關(guān)，并在本發(fā)明構(gòu)思前已為公眾所知。較好的是，這些相關(guān)片段被分別排除在本發(fā)明范圍之外。列出每條相關(guān)序列是十分麻煩的。
因此，排除在本發(fā)明之外的一段或多段聚核苷酸含有通式a-b表示的核苷酸序列，其中的a是對(duì)應(yīng)SEQ IDNO:1中1-1655的任一整數(shù)，b是整數(shù)15-1655，a和b都對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1所示核苷酸殘基的位置，b≥a+14。表位和抗體本發(fā)明中，“表位”指動(dòng)物(例如大鼠、家兔、人、小鼠(包括攜帶人免疫球蛋白基因并產(chǎn)生人抗體分子的轉(zhuǎn)基因小鼠)等)體內(nèi)具有抗原性或免疫原性的phosphatonin多肽片段。本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例是關(guān)于包含一個(gè)表位的phosphatonin多肽片段，以及編碼該片段的聚核苷酸。蛋白質(zhì)分子上可被抗體結(jié)合的區(qū)域稱(chēng)為“抗原性表位”。相比之下，“免疫原性表位”指蛋白質(zhì)上激發(fā)抗體應(yīng)答反應(yīng)的部分；參見(jiàn)，例如，Geysen，美國(guó)科學(xué)協(xié)會(huì)年報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81(1983)；3998-4002。起表位作用的片段可用各種已知方法來(lái)產(chǎn)生；參見(jiàn)，例如，Houghten,美國(guó)科學(xué)協(xié)會(huì)年報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82(1985),5131-5135和美國(guó)專(zhuān)利4,631.211。
本發(fā)明中，抗原性表位的序列宜包含至少7個(gè)氨基酸，9個(gè)更好，最好是約15-30個(gè)?？乖员砦豢捎糜诋a(chǎn)生與之特異性結(jié)合的抗體，包括單克隆抗體；參見(jiàn)，Wilson，細(xì)胞(Cell)37(1984),767-778；Sutcliffe，科學(xué)(Science)219(1983)，660-666。
同樣，免疫原性表位也可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法用于誘生抗體；參見(jiàn)，例如，Sutcliffe，同上；Wilson，同上；Chow，美國(guó)科學(xué)協(xié)會(huì)年報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82(1985),910-914；和Bittle，遺傳病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)66(1985),2347-2354。較好的免疫原性表位包括可溶性蛋白。免疫原性表位可與一載體蛋白，例如白蛋白，一起提供給動(dòng)物系統(tǒng)(例如家兔或小鼠)，或者，如果它足夠長(zhǎng)(至少約25個(gè)氨基酸)則不需要載體。然而，已有顯示，短至8-10個(gè)氨基酸的免疫原性表位足以產(chǎn)生抗體，該抗體至少能夠結(jié)合變性多肽內(nèi)的線(xiàn)性表位(例如，在Western印跡中)。
用獲自人類(lèi)基因組來(lái)源中心(http://www.hgmp.mrc.ac.uk/homepage.html)的計(jì)算機(jī)程序GCG-肽-結(jié)構(gòu)(Rice,EGCG包的程序手冊(cè)，Cambridge,CB10 1RQ England:Hinxton Hall；1995)發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO:2在圖4所示的氨基酸區(qū)域具有抗原性。因此，這些區(qū)域可用作表位來(lái)產(chǎn)生抗SEQ ID NO:1所編碼蛋白的抗體。
本發(fā)明中，“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(Mab)包括完整的分子和抗體片段(例如，F(xiàn)ab和F(ab＇)2片段)，它們能特異性地結(jié)合蛋白。Fab和F(ab＇)2片段沒(méi)有完整抗體的Fc片段，與完整抗體相比，從循環(huán)中被清除更快，非特異性組織結(jié)合較少；參見(jiàn)，例如，Wahl,J.Nucl.Med.24(1993),316-325。因此，優(yōu)選這些片段，以及FAB或其他免疫球蛋白表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本發(fā)明的抗體還包括嵌合、單鏈、人源化抗體和人抗體，來(lái)自噬菌體展示、攜帶人免疫球蛋白基因和/或人染色體的轉(zhuǎn)基因小鼠、分離自人體的免疫細(xì)胞、人免疫細(xì)胞的體外或活體免疫，或任何其他可行的方法。
另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與本發(fā)明phosphatonin聚核苷酸互補(bǔ)鏈雜交的核酸分子，它編碼所述蛋白的突變體，該突變體喪失了蛋白的免疫活性，更好的是喪失了生物學(xué)活性。該實(shí)施例可能對(duì)于產(chǎn)生所述phosphatonin蛋白的顯性等位突變體有用。所述突變體最好來(lái)自前述野生型蛋白氨基酸序列中氨基酸殘基1-5或5-10的取代、缺失和/或增加。載體、宿主細(xì)胞和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生本發(fā)明還涉及含phosphatonin聚核苷酸的載體，宿主細(xì)胞，和多肽的重組生產(chǎn)。載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以是能夠復(fù)制的或是復(fù)制缺陷的。后一種情況中，病毒只有在互補(bǔ)性宿主細(xì)胞內(nèi)才能增殖。
phosphatonin聚核苷酸可與帶有選擇標(biāo)記的載體連接而在宿主內(nèi)增殖。通常，通過(guò)例如磷酸鈣沉淀或與帶電脂類(lèi)形成復(fù)合體而將質(zhì)粒載體引入。如果載體是病毒，可用合適的包裝細(xì)胞系進(jìn)行體外包裝，然后引入宿主細(xì)胞。
插入的phosphatonin聚核苷酸應(yīng)與合適的啟動(dòng)子，例如λ噬菌體的PL啟動(dòng)子、大腸桿菌的lac、trp、phoA和tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子等操作性連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道還有其他合適的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建物還含有轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建物所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的編碼部分宜包括開(kāi)始處的翻譯起始密碼子和位于待譯多肽終端的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
如前所述，表達(dá)載體最好具有至少一個(gè)選擇標(biāo)記。這類(lèi)標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，和用于大腸桿菌及其他細(xì)菌內(nèi)培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。合適的宿主例如但不限于細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如果蠅S2和Spodoptera Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞合適的培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。用于細(xì)菌的優(yōu)選載體包括pQE70、pQE60和pQE-9，購(gòu)自QIAGEN,Inc.；pBluescript載體、Phagescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，購(gòu)自Stratagene Cloning Systerms,Inc.；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，購(gòu)自Pharmacia Biotech,Inc.。優(yōu)選的真核載體包括pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI和pSG，購(gòu)自Stratagene；和pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，購(gòu)自Pharmacia。其他合適的載體是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知道的。
而且，還可以用這樣哺乳動(dòng)物細(xì)胞其基因組已經(jīng)含有一個(gè)前述編碼phosphatonin多肽的核酸分子，但因?yàn)?例如)啟動(dòng)子弱而不表達(dá)或表達(dá)方式不佳，在該哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引入一段表達(dá)調(diào)控序列，例如強(qiáng)啟動(dòng)子，使之緊靠編碼所述phosphatonin多肽的內(nèi)源核酸分子，從而誘導(dǎo)多肽的表達(dá)。
本文中，“表達(dá)調(diào)控序列”指這樣的核酸分子它可以因整合到細(xì)胞基因組內(nèi)緊靠phosphatonin編碼基因而增加該phosphatonin多肽的表達(dá)。此類(lèi)調(diào)控序列包括能誘導(dǎo)或啟動(dòng)phosphatonin基因表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、失活靜息子內(nèi)含子序列、3＇UTR和/或5＇UTR編碼區(qū)、蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件、編碼調(diào)節(jié)蛋白的核酸分子(例如轉(zhuǎn)錄因子)，或其他已知可激活基因表達(dá)和/或增加基因產(chǎn)物量的基因表達(dá)調(diào)控元件。所述表達(dá)調(diào)控序列的引入增強(qiáng)和/或誘導(dǎo)了phosphatonin多肽的表達(dá)，結(jié)果增加了細(xì)胞內(nèi)phosphatonin多肽的含量。因此，本發(fā)明旨在更始和/或增加phosphatonin多肽表達(dá)。
可用磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子性脂類(lèi)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其他方法將構(gòu)建物引入宿主細(xì)胞。此類(lèi)方法可參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，例如Davis，分子生物學(xué)基本方法(Basic Methods In MolecularBiology)(1986)。特別注意的是，實(shí)際上，phosphatonin多肽可由不含重組載體的宿主細(xì)胞表達(dá)。
可用眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化phosphatonin多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸萃取，陰離子或陽(yáng)離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水性相互作用層析，親和性層析，羥基磷灰石層析和外源凝集素層析。最好，采用高壓液相層析(HPLC)進(jìn)行純化。
還可以從以下物質(zhì)中回收phosphatonin多肽天然原料的純化產(chǎn)物，包括體液、組織和細(xì)胞，可以是直接分離的或是培養(yǎng)的；化學(xué)合成產(chǎn)物；重組法由細(xì)菌、酵母、高級(jí)植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等原核或真核宿主產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)重組生產(chǎn)所用的宿主，phosphatonin可能糖基化，可能非糖基化。此外，有時(shí)因?yàn)樗拗鹘閷?dǎo)的加工，phosphatonin可能含有一個(gè)起始(修飾的)甲硫氨酸。因此，本領(lǐng)域眾所周知的是，由翻譯起始密碼子編碼的N末端的甲硫氨酸在真核細(xì)胞內(nèi)翻譯后被高效率地從各種蛋白上去除。雖然，在大多數(shù)原核細(xì)胞內(nèi)，有些蛋白N末端的甲硫氨酸也能被去除，但是原核細(xì)胞的這種去除過(guò)程效率不高，取決于N末端甲硫氨酸所共價(jià)連接的氨基酸的性質(zhì)。
一個(gè)特別好的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及分離phosphatonin多肽的方法，包括以下步驟(a)培養(yǎng)腫瘤-條件培養(yǎng)基或骨肉瘤細(xì)胞，在血清補(bǔ)充培養(yǎng)基(DMEMEagles/10％FCS/谷胺酰胺/抗真菌素(DMFCS))中培養(yǎng)至鋪滿(mǎn)；(b)上述細(xì)胞隔天在無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM Eagles/谷胺酰胺/抗真菌素(DM)中培養(yǎng)5小時(shí)；(c)收獲無(wú)血清條件培養(yǎng)基，與細(xì)胞分離，在pH7.2,0.06M磷酸鈉和0.5MNaCl(PBS)中平衡條件培養(yǎng)基；(d)將(c)獲得的培養(yǎng)基上樣到平衡過(guò)的伴刀豆蛋白A瓊脂糖柱上；(e)用PBS徹底洗柱；(f)用加有0.5Mα-甲基-D吡喃葡萄糖的PBS洗伴刀豆蛋白A柱；(g)對(duì)(f)得到的洗脫物質(zhì)進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析；(h)用0.5M NaCl洗脫含phosphatonin多肽的組份。
實(shí)施例1描述了以上方法。
本發(fā)明的另一主題是制備phosphatonin多肽的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞，它們因?yàn)楹斜景l(fā)明的載體或聚核苷酸或外源調(diào)控序列而能夠在許可多肽表達(dá)的條件下表達(dá)所述多肽，和從培養(yǎng)物中回收由此產(chǎn)生的多肽?？梢岳斫猓美绫绢I(lǐng)域已知的體外翻譯實(shí)驗(yàn)，可在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)所述蛋白。
于是，本發(fā)明的另一實(shí)施例是關(guān)于本發(fā)明聚核苷酸所編碼，或用以上方法產(chǎn)生的phosphatonin多肽或其免疫活性和/或生物學(xué)活性片段。PHEX金屬肽酶酶解剪切以上phosphatonin多肽得到的類(lèi)似phosphatonin多肽也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以看出，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以與前述其他部分相偶連，用于例如藥物制導(dǎo)和造影。這樣的偶連可以是在蛋白表達(dá)后與結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)偶連，或者，偶連產(chǎn)物可以通過(guò)基因工程在DNA水平引入本發(fā)明蛋白內(nèi)。然后在合適的宿主系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)此類(lèi)DNA，收集表達(dá)的蛋白，并根據(jù)需要進(jìn)行復(fù)性。磷酸鹽代謝的調(diào)節(jié)如前所述，本發(fā)明的phosphatonin多肽能以不同方式調(diào)節(jié)磷酸鹽的代謝。因此，實(shí)施例之一中，本發(fā)明涉及至少具有以下活性之一的phosphatonin多肽(a)能夠下調(diào)鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)。
(b)能夠上調(diào)腎25-羥基維生素D3-24-羥化酶；和/或(c)能夠下調(diào)腎25-羥基-D-1-α-羥化酶。
另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及至少具有以下活性之一的反-phosphatonin活性的phosphatonin多肽(a)能夠上調(diào)鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)；(b)能夠下調(diào)腎25-羥基維生素D3-24-羥化酶；和/或(c)能夠上調(diào)腎25-羥基-D-1-α-羥化酶。
在本發(fā)明一特別優(yōu)選的實(shí)施例中，phosphatonin多肽含有前述骨礦質(zhì)基序，并上調(diào)骨的礦化。
本發(fā)明另一實(shí)施例涉及喪失至少上述活性之一的phosphatonin多肽。這樣的多肽可以是本發(fā)明phosphatonin多肽的突變體，并可用于(例如)研究phosphatonin編碼基因內(nèi)突變的影響。具體地說(shuō)，此類(lèi)突變體可用于開(kāi)發(fā)能夠補(bǔ)償野生型phosphatonin生物學(xué)活性之一喪失所致缺陷的藥物。最好用后文所述的篩選法來(lái)研究此類(lèi)phosphatonin多肽的突變體。phosphatonin抗體而且，如前所述，本發(fā)明提供phosphatonin多肽，這樣就能夠產(chǎn)生phosphatonin特異性抗體。在這方面，用雜交瘤能夠產(chǎn)生分泌各種抗體的細(xì)胞系，所述抗體針對(duì)所需的各種產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。然后可從雜交瘤的細(xì)胞質(zhì)中獲取編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈的RNA。mRNA的5＇末端部分可用于制備用來(lái)插入表達(dá)載體的cDNA。然后，編碼抗體或其免疫球蛋白鏈的DNA可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，最好是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的宿主細(xì)胞，可能需要用復(fù)性技術(shù)來(lái)獲得正確的抗體構(gòu)像。如有必要，可用常規(guī)的盒式誘變或本文所述的其他蛋白質(zhì)工程方法在DNA內(nèi)制造點(diǎn)突變來(lái)優(yōu)化結(jié)合。
因此，本發(fā)明還涉及特異性識(shí)別本發(fā)明phosphatonin多肽的抗體。
本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述抗體是單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、人抗體或人源化抗體、靈長(zhǎng)源化抗體、嵌合抗體，或它們的片段，它們特異性結(jié)合所述的肽或多肽，還包括雙特異性抗體、合成抗體、抗體片段，例如Fab、Fv或scFv片段等，或以上所述抗體的化學(xué)修飾衍生物。產(chǎn)生抗體的一般方法是本領(lǐng)域熟知的，并可參見(jiàn)，例如，Kohler和Milstein，自然(Nature)256(1975)，494和J.G.R.Hurrel編的“單克隆雜交瘤抗體方法與應(yīng)用”，CRC Press Inc.,Boco Raron,FL(1982)，和L.T.Mimms等，病毒學(xué)(Virology)176(1990),604-619。而且，前述肽的抗體或其片段可用以下文獻(xiàn)中的方法獲得Harlow和Lane“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，CSH Press,Cold Spring Harbor,1988。
為了在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生抗體，可通過(guò)注射本發(fā)明多肽或具有免疫原性的其片段或寡肽或衍生物免疫山羊、家兔、大鼠、小鼠等宿主。產(chǎn)生和加工多克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并可參見(jiàn)，例如，Mayer和Walker編輯的“細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法”("Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology"),Academic Press,London(1987)。還可以從動(dòng)物，最好是哺乳動(dòng)物中獲得多克隆抗體。純化抗體的方法在本領(lǐng)域眾所周知，包括，例如，免疫親和性層析。根據(jù)宿主種類(lèi)，各種佐劑或免疫學(xué)載體可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。此類(lèi)佐劑包括但不限于Freund氏完全或不完全佐劑，例如氫氧化鋁等礦物膠，和表面活性劑，例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油性乳液和二硝基酚。本發(fā)明肽可與之交聯(lián)的載體的例子是匙孔蛭血藍(lán)蛋白(KLH)。
嵌合抗體的生產(chǎn)參見(jiàn)，例如，WO89/09622。人源化抗體的產(chǎn)生參見(jiàn)，例如，EP-A1-0239400和WO90/07861。本發(fā)明所用的另一種抗體來(lái)源是異基因抗體。產(chǎn)生異基因抗體(例如在小鼠內(nèi)產(chǎn)生人抗體)的一般原理參見(jiàn)，例如，WO91/10741、WO94/02602、WO96/3409和WO96/33735。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明抗體的親和力至少約10-7M，至少約10-8M為佳，至少約10-9M更好，至少約10-10M最好。另一方面，如果要激發(fā)phosphatonin活性，phosphatonin抗體的結(jié)合親和性約10-5M-1，最好不超過(guò)107M-1，如果要抑制phosphatonin活性，最好高至1010M-1或以上。phosphatonin聚核苷酸的用途上述phosphatonin聚核苷酸可以多種方式用作反應(yīng)試劑。以下描述是舉例，使用的是已知技術(shù)。
由于目前根據(jù)實(shí)際序列信息(重復(fù)多態(tài)性)幾乎得不到新的染色體標(biāo)記試劑，所以不斷需要鑒定新的染色體標(biāo)記。phosphatonin相關(guān)聚核苷酸(基因組和/或cDNA)可用于進(jìn)行限制性分析，參見(jiàn)Rowe，人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)94:5(1994)，457-467；Benham，基因組(Genomics)12(1992),368-376；Gillett，人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)60(3)(1996),201-211；Rowe，核酸研究(Nucleic Acids Res.)22(23)(1994),5135-5136。具體地說(shuō)，使用微衛(wèi)星DNA(Rowe，人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)94:5(1994)，457-467；Rowe，核酸研究(Nucleic Acids Res.)22(23)(1994),5135-5136；Rowe，人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)93(1994),291-294；Rowe，人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)91(1993),571-575；Rowe，人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)97(1996),345-352；Rowe，人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)89(1992),539-542)，用放射性-融合-基因-轉(zhuǎn)移雜交體和ALU-PCR(Benham，基因組(Genomics)12(1992),368-376)分離信息標(biāo)記，可作為高信息性方法進(jìn)行快速分離而篩選出phosphatonin及其衍生物遺傳病。以上方法已經(jīng)在PHEX(MEPE被認(rèn)為是PHEX的底物)基因圖譜和定位中獲得成功，大量的突變分析已經(jīng)揭示了PHEX生物活性所必需的結(jié)構(gòu)區(qū)和基序(Rowe,Hum．分子遺傳(Mol.Genet.)6(1997),539-549；Rowe，實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟學(xué)(Exp.Nephrol.)5(1997),355-363；Rowe，當(dāng)前腎臟學(xué)與高血壓領(lǐng)域內(nèi)的一些觀點(diǎn)(Current Opinion in Nephrology&Hypertension)7(4)(1998),367-376；Rowe，臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟學(xué)(Clinical andExperimental Nephrology)2(3)(1998),183-193)，同樣的方法也可用于phosphatonin。最近已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了高效的基因組寬聯(lián)鎖和篩選技術(shù)，它們依賴(lài)于單核苷酸多態(tài)性(SNP)，并將凝膠測(cè)序與高密度變異檢測(cè)DNA芯片聯(lián)用(Wang，科學(xué)(Science)280(1998),1077-1082)。最近，Cambridge,Massachusetts,USA的Whitehead Institute的基因組研究中心在英特網(wǎng)上公開(kāi)了SNP數(shù)據(jù)(http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html)。這一基于新的寡核苷酸陣列的高效方法將成為分子表達(dá)分析、多態(tài)性和基因分型以及疾病治療的未來(lái)途徑(Wang，科學(xué)(Science)280(1998),1077-1082；Chee.科學(xué)(Science)274(1996)，610-614；Gentalen，核酸研究(Nucleic Acids Res.)27(1999),1485-1491；Hacia，核酸研究(Nucleic Acids Res.)26(1998),3865-3866；Lipshutz，自然遺傳(Nat.Genet.)21(1999),20-24；Fan,Eur.J．人類(lèi)遺傳(Hum.Genet.)6(1998),134)。有了本發(fā)明MEPE的序列信息，就可用以上新方法和新技術(shù)來(lái)確定所述區(qū)域的位置?？捎贸Ｒ?guī)技術(shù)確定序列在哪一特定染色體上，或染色體上哪一特定區(qū)域。這包括，與染色體展開(kāi)的原位雜交，流式分選染色體制備，或人工染色體構(gòu)建，如酵母人工染色體，細(xì)菌人工染色體，細(xì)菌P1構(gòu)建或單個(gè)染色體cDNA文庫(kù)，參見(jiàn)Price(血液學(xué)綜述(Blood Rev.)7(1993),127-134)和Trask(現(xiàn)代遺傳學(xué)(Trends Genet.)7(1991),149-154)。染色體展開(kāi)熒光原位雜交技術(shù)參見(jiàn)Verma,(1998)人染色體基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)(Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques),Pergamon Press,NewYork NY，等。染色體制劑的熒光原位雜交及其他物理染色體圖譜技術(shù)可與其他基因圖譜信息相關(guān)聯(lián)?？蒲薪缈蓮囊韵戮W(wǎng)址獲得詳細(xì)的圖譜信息人類(lèi)基因組圖譜工程UK負(fù)責(zé)的http://www.hgmp.mrc.ac.uk/homepge.html，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)負(fù)責(zé)的國(guó)家生物信息中心(NCBI)http://www.ncbi.him.nih.gov/,Cambridge,Massachusetts,USA的生物醫(yī)學(xué)研究Whitehead Institute(Whitehead-MIT)的基因組研究中心(http://www.genome.wi.mit.edu/)。而且，還可以通過(guò)Genethon(法國(guó)政府建立)的http://www.genethon.fr./genethon.en.html獲得覆蓋整個(gè)人類(lèi)基因組的全面的微衛(wèi)星圖譜和相關(guān)譜圖工具。性染色體圖譜(seminal map)已公開(kāi)在科學(xué)(Science)和自然(Nature)上(參見(jiàn)，例如，Dib,Nature 380(1996),152-154)，但有關(guān)最新信息，需查詢(xún)網(wǎng)上。確定編碼phosphatonin多肽的基因在染色體物理圖譜上的位置與特定特征(例如磷酸鹽過(guò)少或過(guò)多性疾病)之間的關(guān)聯(lián)有助于界定與該特征相關(guān)的DNA區(qū)域。本發(fā)明的核苷酸序列可用于檢測(cè)正常、攜帶或病發(fā)個(gè)體基因序列間的差異。而且，本發(fā)明所述的工具和方法還可用于標(biāo)記協(xié)助的動(dòng)物繁殖。本發(fā)明的核苷酸序列還可用于檢測(cè)正常、攜帶或病發(fā)個(gè)體間因轉(zhuǎn)位、顛倒等產(chǎn)生的染色體位置差異。
至少，本發(fā)明的phosphatonin聚核苷酸可用作Southern凝膠上的分子量標(biāo)記，檢測(cè)某細(xì)胞類(lèi)型中有無(wú)特定mRNA的診斷探針，尋找新聚核苷酸時(shí)“扣除”已知序列的探針，用于挑選和制造與“基因芯片”或其他支持體連接的寡聚物，用DNA免疫技術(shù)產(chǎn)生抗DNA抗體，和作為抗原激發(fā)免疫反應(yīng)。phosphatonin多肽和抗體的用途以上phosphatonin多肽和抗體具有多種用途。以下僅是舉例，使用的是已知技術(shù)。
phosphatonin多肽可通過(guò)基于抗體的技術(shù)檢測(cè)生物樣品中的蛋白質(zhì)水平。例如，可用經(jīng)典免疫組織學(xué)方法研究蛋白在組織內(nèi)的表達(dá)；參見(jiàn)，例如，Jalkanen，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)101(1985),976-985；Jalkanen，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)105(1987),3087-3096)。用于檢測(cè)蛋白基因表達(dá)的其他基于抗體的方法包括免疫試驗(yàn)，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和放射性免疫試驗(yàn)(RIA)。合適的抗體試驗(yàn)標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，包括酶標(biāo)記，例如葡萄糖氧化酶，放射性同位素，例如碘(125I,121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)和锝(99m Tc)，熒光標(biāo)記，如熒光素和羅丹明，以及生物素。
除了檢測(cè)生物樣品內(nèi)蛋白質(zhì)水平外，還可以體內(nèi)造影檢測(cè)蛋白質(zhì)。用于體內(nèi)蛋白造影的抗體標(biāo)記包括可被X光攝影、NMR或ESR測(cè)得的那些。拿X攝影來(lái)說(shuō)，合適的標(biāo)記包括放射性同位素，例如鋇和銫，它們能發(fā)出可被測(cè)得的射線(xiàn)，但對(duì)研究對(duì)象沒(méi)有明顯損傷。NMR和ESR的合適標(biāo)記包括具有可測(cè)特性射線(xiàn)的那些，例如锝，它可以通過(guò)標(biāo)記相關(guān)雜交瘤的營(yíng)養(yǎng)物(nutrients)而攙入抗體。
將用合適的可測(cè)造影分子(例如131I、112In、99m Tc等放射性同位素，放射性-半透明物質(zhì)，或可被核磁共振測(cè)知的物質(zhì))標(biāo)記的蛋白特異性抗體或抗體片段引入(例如，胃腸外，皮下或腹膜內(nèi))哺乳動(dòng)物?？梢岳斫?，研究對(duì)象的大小和所用的造影系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷圖象所需的造影分子的量。如果是放射性同位素用于人，照射的發(fā)射量一般是約5-20毫居里的99m Tc。然后標(biāo)記抗體或抗體片段將優(yōu)勢(shì)性地在含特定蛋白的細(xì)胞部位累積。體內(nèi)腫瘤造影參見(jiàn)，例如，Burchiel，“放射性標(biāo)記的抗體及其片段的免疫藥學(xué)動(dòng)力學(xué)”，第13章，腫瘤造影癌癥的放射學(xué)檢測(cè)(Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer),Burchiel和Rhodes編，Masson Publishing Inc.(1992)。
因此，本發(fā)明提供一種疾病的診斷方法，它包括(a)檢測(cè)phosphatonin多肽在細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá)，或檢測(cè)個(gè)體體液中phosphatonin或其活性片段或表位的水平；(b)將上述基因表達(dá)水平與一標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平比較，被測(cè)phosphatonin多肽基因表達(dá)水平相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平提高或降低指示某種疾病。
而且，phosphatonin多肽可用于治療疾病。例如，可給予患者phosphatonin多肽，試著提高或降低血清磷酸鹽水平和/或改善受損的骨形成(X-聯(lián)鎖的血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病，癌源血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化，腎衰竭，骨質(zhì)疏松、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良，等)。它能夠激活或抑制其受體，從而上調(diào)或下調(diào)鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者的表達(dá)。此外，phosphatonin基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可用于基因治療，以治療磷酸鹽代謝紊亂性疾病，例如X聯(lián)鎖的血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病。而且，骨礦質(zhì)流失性疾病中因發(fā)生不明繼發(fā)性或原發(fā)性改變(例如，與婦女絕經(jīng)、骨質(zhì)疏松、年老相關(guān))所致的MEPE基因失調(diào)和/或翻譯后修飾失當(dāng)，輔助激素替代療法的激素(和/或受體或激素的活化劑-拮抗劑)補(bǔ)充將恢復(fù)磷酸鹽和骨礦質(zhì)的平衡。MEPE生物學(xué)活性的一種重要特征，因而也是疾病治療的一個(gè)重要特征，是這一推論N-末端序列調(diào)節(jié)腎的磷酸鹽吸收，而C末端(尤其是前述MEPE基序相關(guān)區(qū)域)是骨正常礦化和發(fā)育的先決條件。
在腎移植后，慢性血磷酸鹽過(guò)多，或者有時(shí)是血磷酸鹽過(guò)少，是造成主要臨床并發(fā)癥的重要特征。例如，曾報(bào)道，將正常的腎移植給男性HYP患者，在正常的被移植腎內(nèi)發(fā)生了病理性生理改變，從而發(fā)生“佝僂型”腎磷酸鹽漏失(Morgan,Arch．國(guó)際醫(yī)學(xué)(Intem.Med.).134(1974),549-552)。臨床使用切除N末端的MEPE片段可有效抵抗血磷酸鹽過(guò)少。相比之下，引起血磷酸鹽過(guò)多的腎移植可用完整的重組MEPE或以獨(dú)特N末端殘基構(gòu)建的活性衍生肽來(lái)治療?？捎肕EPE、MEPE衍生肽、受體拮抗劑-活化劑(能夠經(jīng)修飾而提高作用強(qiáng)度和特異性的肽)治療的其他疾病包括腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、腎中毒、佩吉特(Pagets)骨病、常染色體性佝僂病、某些形式的腎Fanconi綜合征。而且，如果在一定范圍的組織(例如小腸，等)和腎內(nèi)表達(dá)受體，就有可能治療晚期腎病患者(即，腎功能完全喪失)。
同樣，phosphatonin多肽的抗體也可用于治療疾病。例如，給予phosphatonin多肽的抗體可以結(jié)合多肽和減少其過(guò)量產(chǎn)生。同樣，給予抗體也可以激活多肽，例如通過(guò)與多肽結(jié)合和將其剪切成另一種活性形式。
至少，phosphatonin多肽可作為分子量標(biāo)記，用于本領(lǐng)域熟知的SDS-PAGE凝膠，或用于分子篩凝膠過(guò)濾柱。phosphatonin多肽還可用于產(chǎn)生抗體，然后用抗體測(cè)定重組細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)，以此作為評(píng)價(jià)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一種方法。
而且，phosphatonin聚核苷酸和多肽可在用于試驗(yàn)測(cè)定一種或多種生物學(xué)活性。如果phosphatonin聚核苷酸和多肽表現(xiàn)出特定活性，可能phosphatonin參與了與這種活性相關(guān)的疾病。phosphatonin因此可用于治療該相關(guān)疾病。phosphatonin基因的調(diào)控序列本發(fā)明還涉及一段啟動(dòng)子調(diào)控序列，它自然調(diào)節(jié)編碼本發(fā)明phosphatonin多肽的聚核苷酸或與之同源的聚核苷酸的表達(dá)。用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)能夠分離出天然調(diào)節(jié)上述DNA序列表達(dá)的啟動(dòng)子調(diào)控序列。例如，熟練技術(shù)人員可用上述核酸分子作為探針篩選人基因組DNA克隆在噬菌體或細(xì)菌載體中構(gòu)建而成的基因組文庫(kù)。這樣的文庫(kù)是，例如，由人血細(xì)胞制備的基因組DNA，剪切成5-50kb的片段，克隆在λGEM11(Promega)中構(gòu)建而成。純化與探針雜交的噬菌體。從中抽提DNA并測(cè)序。例如，實(shí)施例11用標(biāo)記的cDNA探針篩選了人基因組P1文庫(kù)(Genomic System,Inc.)。分離出與編碼上述phosphatonin蛋白的基因?qū)?yīng)的基因組序列后，就能夠通過(guò)本領(lǐng)域熟知的轉(zhuǎn)錄融合或翻譯融合將異源DNA序列與啟動(dòng)子或其調(diào)控序列融合。為了鑒定這些phosphatonin基因的調(diào)控序列和特定元件，可將5＇上游基因組片段克隆在luc、gfp或GUS編碼區(qū)等標(biāo)記基因之前，所得的嵌合基因可轉(zhuǎn)染細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行臨時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含有本發(fā)明調(diào)控序列調(diào)控之下的標(biāo)記基因，將觀察到的其表達(dá)方式與實(shí)施例10所述phosphatonin基因的表達(dá)方式相比較，從而揭示啟動(dòng)子及其調(diào)控序列的邊界。通常，所述調(diào)控序列是重組DNA分子(如前述載體)的一部分。本發(fā)明還涉及用調(diào)控序列或含本發(fā)明調(diào)控序列的DNA分子或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞；參見(jiàn)前文。診斷磷酸鹽代謝性疾病本發(fā)明還涉及藥物基因組法選擇用于磷酸鹽代謝紊亂患者的藥物或前藥，以及可能用于藥物治療的候選物質(zhì)。因此，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)新藥用于藥理干預(yù)提供了選擇，旨在恢復(fù)發(fā)生了遺傳改變的phosphatonin蛋白的功能。而且，本發(fā)明還設(shè)想了一種基因療法。
因此，本發(fā)明提供一種診斷疾病的方法，它包括(a)測(cè)試個(gè)體細(xì)胞或體液內(nèi)phosphatonin基因的表達(dá)水平；和(b)將上述phosphatonin基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)phosphatonin基因表達(dá)水平比較，所測(cè)phosphatonin基因表達(dá)水平相比標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的提高或降低指示例如在腎或骨系統(tǒng)，或其他組織內(nèi)磷酸鹽代謝紊亂。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種診斷對(duì)象與磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)的病理狀況或其易患性的方法，包括(a)測(cè)定編碼phosphatonin的聚核苷酸內(nèi)是否發(fā)生了突變；和(b)根據(jù)有否所述突變?cè)\斷病情或易患性。
本發(fā)明還涉及一種診斷對(duì)象與磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)的病理狀況或其易患性的方法，包括(a)測(cè)定生物樣品內(nèi)phosphatonin多肽或其突變體是否表達(dá)或表達(dá)量；和(b)根據(jù)所述多肽是否表達(dá)或其表達(dá)量診斷病情或易患性。
顯然，前述核酸探針和抗體適合用于上述方法。
以上診斷方法還可用來(lái)確定所述疾病的狀態(tài)。與本發(fā)明相關(guān)的“病理狀況”包括基因、mRNA、蛋白或轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)序列帶有突變、缺失或與野生型正常基因產(chǎn)物相比回影響基因整體活性的任意其他改變。該術(shù)語(yǔ)包括蛋白的翻譯后修飾。
本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述對(duì)象中的所述狀態(tài)反映了某種形式的磷酸鹽代謝紊亂。而且，較好的是，在本發(fā)明方法中，所述對(duì)象的所述狀態(tài)是在胎兒或新生兒狀態(tài)下，用例如羊水診斷術(shù)測(cè)定的。
對(duì)于胎兒、新生兒或成人階段(潛在)磷酸鹽代謝紊亂狀態(tài)的特定分析將進(jìn)一步揭示，例如，與各階段相關(guān)的特定疾病狀態(tài)。例如，希望用本發(fā)明的方法能夠揭示X聯(lián)鎖的血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病(XHL)或瘤原性血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化(OHO)的病因。根據(jù)這一認(rèn)識(shí)，將可以開(kāi)發(fā)和測(cè)試新的藥學(xué)活性藥物。根據(jù)研究目的，本發(fā)明方法還可用于多種動(dòng)物。因此，優(yōu)選實(shí)施例之一中，所述動(dòng)物是小鼠。該實(shí)施例對(duì)于基礎(chǔ)研究特別有用，可更清除地理解調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的不同蛋白之間功能上的相互關(guān)系。另一實(shí)施例中，所述動(dòng)物是人。該實(shí)施例設(shè)想了診斷和治療性應(yīng)用。
上述方法的優(yōu)選實(shí)施方式中還包括一步藥物治療新生兒以消除或緩解磷酸鹽代謝中的紊亂。磷酸鹽代謝紊亂或?qū)ζ浼膊∫谆夹缘脑缙谠\斷特別有利，而且在醫(yī)療上相當(dāng)重要。該優(yōu)選實(shí)施例可用來(lái)診斷coronar villi期，即胚胎植床前的狀態(tài)。而且，用本發(fā)明方法可通過(guò)羊水診斷來(lái)診斷疾病狀態(tài)。運(yùn)用本發(fā)明各種方法早期診斷磷酸鹽吸收和/或重吸收中的紊亂可以直接在出生后、臨床癥狀出現(xiàn)前給予治療。
對(duì)X聯(lián)鎖的佝僂病患者和瘤源性骨軟化患者(腫瘤摘除前，或者，如果不可能摘除腫瘤)的治療是高劑量鈣三醇或1,25-二羥基維生素D3(即市售的Roche的Rocaltrol；詳細(xì)信息查詢(xún)網(wǎng)址http://www.rochecanada.com/rocaltrol.pml.e.html)，并口服磷酸鹽補(bǔ)充劑(磷酸二氫鈉和/或磷酸)。有時(shí)也用維生素D類(lèi)似物(例如二氫速甾醇)，而且據(jù)報(bào)道，加用噻嗪利尿劑，如氫氯噻嗪和阿米洛利可進(jìn)一步減少磷和鈣的尿流失(Alon，兒科學(xué)(Paediarics)75(1985),754-763)。有關(guān)當(dāng)前治療方法的全面論述參見(jiàn)(Carpenter,北美兒科臨床(Pediatric Clinics of North America)44(1997),443-466)。在幼兒中，需要通過(guò)折斷畸形四肢骨來(lái)進(jìn)行骨重接(骨切開(kāi)術(shù))，而且，上述藥物療法會(huì)造成嚴(yán)重的嘔吐和腹瀉。當(dāng)前的治療方法無(wú)法很好的治療與家族性相關(guān)的發(fā)育缺陷。
用phosphatonin和/或phosphatonin肽衍生物替代上述藥物治療能夠矯正臨床癥狀和發(fā)育缺陷，但沒(méi)有不良副作用，而且不需要骨切開(kāi)術(shù)。
前述方法的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，還包括將功能性和表達(dá)性phosphatonin基因引入磷酸鹽代謝紊亂患者或易患者的細(xì)胞。在這部分和本說(shuō)明書(shū)全文中，“功能性”phosphatonin基因指所編碼蛋白具有前述生物學(xué)活性的phosphatonin多肽部分或完全一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)像的基因。如果檢測(cè)到突變phosphatonin的表達(dá)，就可以判斷所述表達(dá)與磷酸鹽代謝紊亂的發(fā)生或持續(xù)相關(guān)。因此，就可以采用其他或附加步驟來(lái)降低表達(dá)的水平，從而降低突變phosphatonin的水平，或?qū)⑵湎?。這可以通過(guò)(例如)用生物學(xué)手段至少部分消除突變基因的表達(dá)，例如使用核糖酶、反義核酸分子或抗該蛋白突變體的胞內(nèi)抗體。而且，可以開(kāi)發(fā)出降低相關(guān)突變基因表達(dá)的藥物產(chǎn)品。結(jié)合活性本發(fā)明還涉及鑒定phosphatonin多肽結(jié)合伙伴的方法，這包括(a)令本發(fā)明phosphatonin多肽與待篩選化合物接觸；和(b)測(cè)定化合物是否影響多肽的活性。
phosphatonin多肽可用來(lái)篩選與phosphatonin結(jié)合的蛋白，或篩選phosphatonin與之結(jié)合的蛋白。phosphatonin與分子的結(jié)合可能激活(活化劑)、提高、抑制(拮抗劑)或降低被結(jié)合phosphatonin或分子的活性。此類(lèi)分子的例子有抗體、寡核苷酸、蛋白質(zhì)(例如受體)或小分子。
較好的是，所述分子與phosphatonin的天然配體密切相關(guān)，例如，是配體的片段或天然底物、配體、結(jié)構(gòu)或功能類(lèi)似物；參見(jiàn)，例如，Coligan，當(dāng)前免疫學(xué)方法(Current Protocols in Immunology)1(2)(1991)；第5章。同樣，所述分子可與phosphatonin所結(jié)合的天然受體密切相關(guān)，或者，至少是可被phosphatonin結(jié)合的受體的片段(例如活性位點(diǎn))。以上兩種情況中，所述分子可用已知技術(shù)特別設(shè)計(jì)；參見(jiàn)，上述文獻(xiàn)。
較好的是，此類(lèi)分子的篩選包括產(chǎn)生合適的以分泌蛋白形式或在細(xì)胞膜上表達(dá)phosphatonin的細(xì)胞。優(yōu)選細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、果蠅或大腸桿菌。然后，讓表達(dá)phosphatonin的細(xì)胞(或含有被表達(dá)多肽的細(xì)胞膜)與可能含所述分子的測(cè)試化合物接觸，觀察結(jié)合，以及phosphatonin或分子活性的激發(fā)或抑制。
以上試驗(yàn)可在通過(guò)標(biāo)記檢測(cè)結(jié)合的試驗(yàn)，或涉及與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)者競(jìng)爭(zhēng)的試驗(yàn)中只檢測(cè)候選化合物與phosphatonin的結(jié)合。該試驗(yàn)也可以測(cè)試候選化合物是否因與phosphatonin結(jié)合而產(chǎn)生某種信號(hào)。
或者，可用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)、固定在固相支持體上的多肽/分子、化合物文庫(kù)或天然產(chǎn)物混合物進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)的步驟可以只是將候選化合物與含phosphatonin溶液混合，測(cè)定phosphatonin/分子的活性或結(jié)合，并就測(cè)得活性或結(jié)合與標(biāo)準(zhǔn)比較。
較好的是，ELISA可用單克隆或多克隆抗體測(cè)定樣品(例如生物樣品)中的phosphatonin水平或活性?？贵w可以通過(guò)與phosphatonin直接或間接結(jié)合，或通過(guò)與phosphatonin競(jìng)爭(zhēng)底物來(lái)測(cè)定phosphatonin水平或活性。
以上各種試驗(yàn)都可用作著或預(yù)后標(biāo)記。用這些方法發(fā)現(xiàn)的分子可通過(guò)激活或抑制phosphatonin/分子用于治療疾病或在患者中產(chǎn)生某種特定的效果(例如，提高血液中的磷酸鹽水平)。而且，這些試驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)能抑制或增強(qiáng)經(jīng)適當(dāng)處理的細(xì)胞或組織中phosphatonin的產(chǎn)生。
所以，本發(fā)明包括鑒定與phosphatonin結(jié)合的化合物的方法，包括(a)候選結(jié)合性化合物與phosphatonin共孵育；和(b)測(cè)定是否發(fā)生結(jié)合。
本發(fā)明還包括鑒定活化劑/拮抗劑的方法，包括(a)候選化合物與phosphatonin共孵育；(b)如前所述測(cè)定生物學(xué)活性；和(c)確定phosphatonin的生物學(xué)活性是否被改變。
如前所述，本發(fā)明的聚核苷酸和多肽為開(kāi)發(fā)可能是phosphatonin或其基因的抑制劑或活化劑的模擬化合物提供了基礎(chǔ)?？梢岳斫猓景l(fā)明還提供了基于細(xì)胞的大量篩選(HTS)所述抑制劑和活化劑候選化合物的篩選方法。
本發(fā)明還涉及鑒定并獲得治療磷酸鹽代謝紊亂的候選藥物的方法，包括(a)在磷酸鹽代謝許可性條件下，在能夠應(yīng)磷酸鹽吸收而產(chǎn)生可測(cè)信號(hào)的物質(zhì)存在下，將本發(fā)明多肽或表達(dá)所述多肽的細(xì)胞與所述候選藥物接觸；和(b)檢測(cè)來(lái)自磷酸鹽代謝信號(hào)的有無(wú)或是否增加，信號(hào)的存在或增加指示是推定藥物。
例如，可用腎細(xì)胞系CL8、原代人腎細(xì)胞或原代人成骨細(xì)胞，用Rowe，1996；(同上)所述方法測(cè)定放射性Na+依賴(lài)性磷酸鹽吸收和/或維生素D代謝。
而且，可用抽提自(a)中所述細(xì)胞的聚A+RNA或總RNA，與磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)者基因(NPTⅡ，等)、腎24-羥化酶、α羥化酶、PTH或骨橋蛋白序列互補(bǔ)的寡核苷酸引物，用聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)測(cè)定這些基因的表達(dá)。
此外，還可以用von kossa染色來(lái)測(cè)定原代人成骨細(xì)胞的礦化。該方法包括，例如·使用Clonetics推薦的培養(yǎng)基補(bǔ)充劑和條件，培養(yǎng)原代人成骨細(xì)胞(得自Clonetics-Biowhitaker)至鋪滿(mǎn)；·給用于礦化實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞補(bǔ)充磷酸鹽供體β-磷酸鹽甘油酯；給對(duì)照補(bǔ)充氫可的松-11-半琥珀酸酯；·給實(shí)驗(yàn)細(xì)胞補(bǔ)充β-磷酸鹽甘油酯和MEPE 25ng/ml；·不斷更換培養(yǎng)基并培養(yǎng)3周后，根據(jù)Clonetics所述用von kossa染料(AgNO3；銀鹽沉淀)染色成骨細(xì)胞，測(cè)定骨的礦化?！ざ?，還包括以下測(cè)定試驗(yàn)·大鼠灌注實(shí)驗(yàn)，測(cè)定phosphatonin對(duì)腎磷酸鹽吸收的影響；·測(cè)定一系列相關(guān)基因在人腎細(xì)胞系CL8中的表達(dá)，以及補(bǔ)充MEPE的影響，例如·Na+磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)者，·24和1-α羥化酶，·骨橋蛋白和骨鈣蛋白；·與MEPE和PEHX共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞；·用含有前述基序至少其一的肽片段進(jìn)行生物試驗(yàn)研究。因此，另一種檢測(cè)方法包括用現(xiàn)有方法測(cè)定蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ，酪氨酸激酶或其他受phosphatonin及衍生肽影響的信號(hào)傳導(dǎo)路徑。而且，后文實(shí)施例所述的方法稍加改動(dòng)既可用于上述篩選方法。
候選藥物可以是一種化合物或多種化合物。“多種化合物”在本發(fā)明方法中應(yīng)理解成可能相同可能不同的許多物質(zhì)。
所述化合物或多種化合物可化學(xué)合成或微生物法產(chǎn)生和/或含于，例如，樣品中，例如植物、動(dòng)物或微生物的細(xì)胞抽提物。而且，所述化合物可以是本領(lǐng)域已知但不知其能夠抑制或激活磷酸鹽代謝中的phosphatonin多肽或其他組分的化合物。反應(yīng)混合物可以是無(wú)細(xì)胞抽提物，或含有細(xì)胞或組織的培養(yǎng)物。適合本發(fā)明方法的系統(tǒng)對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，例如，參見(jiàn)，Albert等，細(xì)胞的分子生物學(xué)(Molecular Biology of Cell)，第三版(1994)，以及后文實(shí)施例。例如，多種化合物可加入反應(yīng)混合物、培養(yǎng)基，注入細(xì)胞，或以其他方式給予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。可用于本發(fā)明方法的細(xì)胞或組織宜為，后文實(shí)施例所述的宿主細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
如果在本發(fā)明方法中鑒定到一種含化合物或多種化合物的樣品，可以從鑒定為含能夠抑制或激活phosphatonin的化合物的原樣品中分離出該化合物，或者，如果樣品含多種化合物，可以進(jìn)一步區(qū)分原樣品以減少每份樣品中不同物質(zhì)的數(shù)量，然后對(duì)原樣品的小份重復(fù)鑒定方法。根據(jù)樣品的復(fù)雜性，前述步驟可進(jìn)行多次，直到用本發(fā)明方法鑒定，樣品只含一定數(shù)量或僅一種物質(zhì)。較好的是，所述樣品含化學(xué)和/或物理性質(zhì)相似的物質(zhì)，最好是同一種物質(zhì)。
可用本發(fā)明方法測(cè)試和鑒定的化合物可以是表達(dá)文庫(kù)，例如cDNA表達(dá)文庫(kù)，肽，蛋白質(zhì)，核酸，抗體，小有機(jī)化合物，激素，擬肽，PNA等(Milner，自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)1(1995),879-880；Hupp，細(xì)胞(Cell)83(1995),237-245；Gibbs，細(xì)胞(Cell)79(1994),193-198；和前述文獻(xiàn))。而且，可鑒定編碼推定是phosphatonin蛋白調(diào)節(jié)者或?qū)Ρ景l(fā)明phosphatonin蛋白具有正或下調(diào)作用的基因，例如用插入誘變，用本領(lǐng)域已知的基因定向載體(例如，定向于細(xì)胞核、線(xiàn)粒體或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的pShooter質(zhì)粒系列pEF/myc/nuc、pCMV/myc/nuc、pEF/myc/mito、pCMV/myc/mito、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto，和定向于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面表達(dá)重組蛋白的pDISPLAY表達(dá)載體。以上載體都可以從Invitrogen(http://www.invitrogen.com/))獲得。
確定某化合物是否能夠抑制或激活phosphatonin蛋白，可通過(guò)(例如)測(cè)定Na+依賴(lài)性磷酸鹽吸收或骨礦化來(lái)進(jìn)行；參見(jiàn)前文。這也可以通過(guò)監(jiān)測(cè)本發(fā)明中與化合物接觸的細(xì)胞的表型特征，并將其與野生型細(xì)胞比較。在另一實(shí)施例中，所述特征可與接觸了已知能夠或不能抑制或激活phosphatonin多肽的化合物的細(xì)胞比較。
鑒定并得到所述化合物后，最好將其制成治療學(xué)上認(rèn)可的形式。因此，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)治療劑的方法，這包括(ⅰ)合成足量本發(fā)明方法中步驟(b)獲得或鑒定到的化合物或其類(lèi)似物或衍生物，以向患者提供治療有效量的所述制劑；和/或(ⅱ)將本發(fā)明方法中步驟(b)獲得或鑒定到的化合物或其類(lèi)似物或衍生物與藥學(xué)上認(rèn)可的載體混合。
制備化學(xué)衍生物和類(lèi)似物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，參見(jiàn)，例如，Beilstein,有機(jī)化學(xué)手冊(cè)(Handbook of Organic Chemistry),Springer edition New York Inc.,175 Fifth Avenue,New York,N.Y.10010 U.S.A.和有機(jī)化學(xué)合成(OrganicSynthesis),Wiley,New York U.S.A.。而且，可以用已知方法合成和測(cè)試所述衍生物和類(lèi)似物的效果。參見(jiàn)前文和后文。
總之，本發(fā)明提供了鑒定因能直接/間接活化phosphatonin而能夠調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的化合物的方法。因此，本發(fā)明方法所鑒定的可能是phosphatonin活性抑制劑和活性劑的化合物也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
以上所述顯示，本發(fā)明主要涉及含至少一種前述聚核苷酸、核酸分子、載體、蛋白質(zhì)、調(diào)控序列、重組DNA分子、抗體或化合物的組合物。較好的是，所述組合物含以下成分，例如緩沖液，防凍劑等，這些成分并不天然地與本發(fā)明化合物相關(guān)，但同樣適合特定的用途。
較好的是，所述組合物被用作藥物、診斷工具或試劑盒。實(shí)施例6和實(shí)施例7對(duì)藥物組合物有更詳細(xì)的描述。例如，前述生物活性片段可用作藥物治療磷酸鹽代謝紊亂，例如X聯(lián)鎖的佝僂病和骨軟化以及其他骨礦質(zhì)代謝疾病。本發(fā)明還提供phosphatonin和PHEX金屬肽酶聯(lián)合制劑，作為藥物同時(shí)、各自或先后使用。用這種方式，PHEX金屬肽酶可用于剪切phosphatonin產(chǎn)生活性phosphatonin片段用于治療前述磷酸鹽代謝疾病。雖然上述疾病在人類(lèi)中尤其重要，其他哺乳動(dòng)物也可用本發(fā)明方法進(jìn)行治療。
本發(fā)明首次提供了沒(méi)有污染的，基本分離或基本純形式的phosphatonin。沒(méi)有污染(如SDS和或其他干擾蛋白)的天然phosphatonin和天然phosphatonin片段能夠調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝，并能提供藥物組合物中的活性成分，用于治療與磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)的疾病。
因此，本發(fā)明涉及用本發(fā)明phosphatonin多肽或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA、其抗體、活化劑/激動(dòng)劑、抑制劑/拮抗劑或結(jié)合伙伴用于制備治療磷酸鹽代謝紊亂的藥物的用途。
具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有phosphatonin活性的phosphatonin多肽或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA、其抗體、活化劑、抑制劑/拮抗劑或產(chǎn)生phosphatonin活性的結(jié)合伙伴，用于制備治療血磷酸鹽過(guò)多癥中的用途，最好是在腎透析/預(yù)透析中治療腎病性骨營(yíng)養(yǎng)不良、血磷酸鹽過(guò)多癥，治療甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)或囊狀纖維性骨炎。
另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及本發(fā)明具有反phosphatonin活性的phosphatonin多肽或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA、本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的核酸分子或抑制劑/拮抗劑用于制備治療血磷酸鹽過(guò)少癥的藥物的用途，最好是制各治療X聯(lián)鎖的血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病、伴有尿鈣過(guò)多的遺傳性血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病(HHRH)、礦質(zhì)過(guò)少性骨損傷、青少年矮小、瘤原性血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化、腎病性磷酸鹽漏失、腎病性骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨質(zhì)疏松、耐維生素D性佝僂病、終末器官抗性、腎病性Fanconi綜合癥、常染色體性佝僂病、Paget＇s病、腎衰竭、腎小管酸中毒、囊性纖維化或口炎性腹瀉的藥物。
本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，具有反phosphatonin活性的phosphatonin多肽或編碼并能夠表達(dá)它的DNA、本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的抑制劑/拮抗劑被用于制造治療骨礦質(zhì)流失性疾病的藥物。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涉及phosphatonin多肽和PHEX金屬肽酶用于制造一種聯(lián)合制劑的用途，聯(lián)合制劑同時(shí)、各自或先后使用，以治療磷酸鹽代謝紊亂。
實(shí)施例6更詳細(xì)地描述了上述用途和方法。
另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及能夠過(guò)表達(dá)phosphatonin的轉(zhuǎn)化成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞系用于生產(chǎn)和分離phosphatonin的用途。
以下實(shí)施例向本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員充分公開(kāi)了如何實(shí)施本發(fā)明的各項(xiàng)內(nèi)容，但不是對(duì)本發(fā)明范圍的限定，也不代表或暗示以下是發(fā)明人所進(jìn)行過(guò)的所有或僅有實(shí)驗(yàn)。雖然努力確保數(shù)據(jù)(例如量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但仍需考慮存在著試驗(yàn)誤差和偏差。若非另作說(shuō)明，份數(shù)都是重量份數(shù)，分子量都是重均分子量，溫度都是攝氏度。實(shí)施例1從腫瘤中純化phosphatonin從患者體內(nèi)取出具有磷酸鹽沉著表達(dá)的間充質(zhì)腫瘤，提取以下樣品A純腫瘤組織樣品，兩粒大豌豆大小，放在含DMEM Eagles/10％FCS/谷氨酰胺/抗菌素抗真菌劑Gibco-BRL的2ml試劑瓶?jī)?nèi)。
B硬膜下腫瘤樣品，同樣大小或可能較小。放在與A相同的介質(zhì)中。
C異常硬膜樣品硬的白色物質(zhì)放在與A相同的介質(zhì)中。
D腫瘤粘液樣品。
樣品的加工第1天用消毒手術(shù)刀將各樣品切成0.5cm的小塊。各取一半樣品放入冷凍試管，N2(1)下急凍。收集組織周?chē)囊后w(DMEM/10％FCS，等)，也冷凍。將各樣品的另一半加入DMEM Eagles/10％FCS/谷氨酰胺/抗真菌劑另加膠元酶A10.2mg/ml(～15ml)，37℃過(guò)夜。
第2天1.在補(bǔ)充血清的DMEM中培養(yǎng)過(guò)夜后，大多數(shù)細(xì)胞成為RBC，只看到很少的粘附細(xì)胞。室溫下離心沉淀細(xì)胞，收集上清液并立即冷凍(～15ml)。
2．將沉淀重懸于10ml補(bǔ)充抗生素/抗真菌劑的DMEM Eagles(中瓶)中，再培養(yǎng)8小時(shí)10分鐘。
3．如步驟1所述收集無(wú)血清上清液(～10ml)，將細(xì)胞重懸于含10％FCS等的DMEM EAG中(～15ml)，繼續(xù)培養(yǎng)。上清液保存于-80℃。
第6天1．經(jīng)第2天的培養(yǎng)后，如第2天步驟1所述離心沉淀細(xì)胞。收集10％FCS樣品并冷凍。
2．如第2天所述將細(xì)胞沉淀重懸于無(wú)血清DMEM中，靜置4小時(shí)。
3．與第2天步驟3相同。
第7天1．硬膜下腫瘤培養(yǎng)物已經(jīng)發(fā)展成無(wú)數(shù)含細(xì)胞集落的點(diǎn)，粘附在塑料組織培養(yǎng)板上。在這些息肉狀隆起下面是一層成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，從腫瘤樣結(jié)構(gòu)的下面迅速散開(kāi)。這一層似乎是錨著息肉狀腫瘤的基質(zhì)。這些在硬膜樣品中沒(méi)有看到，該樣品該階段似乎沒(méi)有細(xì)胞，但含有纖維樣編織狀結(jié)構(gòu)。
2．離心沉淀培養(yǎng)物，收集上清液(10％FCS)。然后將沉淀置于一側(cè)。
3．培養(yǎng)板然后在10ml胰蛋白酶EDTA溶液Gibco/BRL PBS 1/10稀釋液中培養(yǎng)～15分鐘。然后劇烈拍打培養(yǎng)板，并加入5ml FCS。
4．然后將重懸細(xì)胞加入步驟2獲得的沉淀中，重懸并離心沉淀。棄去上清液。
5．然后將細(xì)胞接種在18ml 10％FCS Eagles平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中補(bǔ)充有谷氨酰胺抗生素抗真菌素(用大培養(yǎng)瓶)。
6．最后將細(xì)胞培養(yǎng)在37℃的CO2中。
第9天1．腫瘤細(xì)胞和部分硬膜下細(xì)胞成為無(wú)數(shù)細(xì)胞集落，形狀與胰蛋白酶處理前的細(xì)胞相同。部分細(xì)胞集落很大，肉眼就可看到。
2．收集血清補(bǔ)充培養(yǎng)基，保存。用大瓶，每瓶加18ml培養(yǎng)基(DMEM 10％FCS抗真菌素/抗生素/谷氨酰胺)。
第13天1．冷凍細(xì)胞(～15ml)，保存在falcons即10％FCS DMEM條件培養(yǎng)基中。
2．在11:10am將細(xì)胞重懸于無(wú)血清DMEM Eags(～11ml),37℃(CO2培養(yǎng)箱)培養(yǎng)6小時(shí)。
3．然后離心沉淀細(xì)胞，收集上清液(無(wú)血清對(duì)照培養(yǎng)基)。在留下的細(xì)胞中加10％FCS DMEM EAG。
第16天重復(fù)以上過(guò)程，收集數(shù)周的腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)?；蛘?，收集Saos-2細(xì)胞(ECACC 89050205)或U-2 OS細(xì)胞(ATCC HTB-96)的TCM。
phosphatonin的純化伴刀豆蛋白A瓊脂糖親和性層析1．在3ml TCM中加入1M磷酸鈉pH7.2和5M NaCl，得到最終濃度0.06M磷酸鈉pH7.2,0.5M NaCl加0.01％疊氮鈉。
2．Con A瓊脂糖(Pharmacia目錄號(hào)17-0440-01)，來(lái)時(shí)處于20％乙醇中，先用數(shù)倍柱體積的水洗柱，然后以層析緩沖液平衡。用Con A充填小的C10/10柱(Pharmacia目錄號(hào)10mm的C10/10)，至5.5cm高度(約4.3-5.0ml體積)。以最大流速0.5ml/min進(jìn)行平衡。
3．然后利用重力將樣品(調(diào)節(jié)至pH7.2磷酸鈉/0.5M NaCl/0.01％疊氮鈉)上柱，重復(fù)3次。因?yàn)闃悠酚猩阅芸吹狡湓谥型ㄟ^(guò)。然后收集非結(jié)合物質(zhì)，保存?zhèn)渥鲄⒈取?br> 4．然后連接Waters LC系統(tǒng)，用數(shù)倍柱體積的上樣緩沖液洗滌樣品。
5．上樣和洗滌后，用磷酸鈉緩沖液60mM pH7.2/0.5M NaCl/0.5M α-甲基-D-吡喃葡萄糖/0.01％疊氮化物緩沖液洗脫。參見(jiàn)圖1a。測(cè)得一單峰，收集該峰。
6．然后洗柱至基線(xiàn)即約40ml最大體積，然后放置過(guò)夜。
7．甲基葡糖苷緩沖液中孵育過(guò)夜后，洗出第二個(gè)峰(見(jiàn)圖1b)，位于～5ml處。
8．收集第二峰，用0.05M乙酸透析，然后冷凍干燥。伴刀豆蛋白峰A1(低親和性)和伴刀豆蛋白峰A2(高親和性)都能在人腎細(xì)胞(CL8)系中強(qiáng)效抑制Na+依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)和維生素D代謝。有關(guān)高親和性組分，人腎細(xì)胞系(CL8)和試驗(yàn)條件，參見(jiàn)Rowe等，1996。另一種已知的適合進(jìn)行試驗(yàn)的細(xì)胞系是OK細(xì)胞系，保藏號(hào)為ECACC910210202。
用HiTrap SP陽(yáng)離子交換1ml柱(目錄號(hào)17-1151-01:Pharmacia)陽(yáng)離子交換層析1．將冷凍干燥的蛋白溶于0.05M乙酸銨pH5中，上樣到已平衡的1ml HiTrapSP瓊脂糖陽(yáng)離子交換柱上。
2．柱在上樣前通過(guò)水洗進(jìn)行平衡，然后加5體積起始緩沖液(0.02M乙酸銨，pH5)。
3．如下洗脫樣品

得到一個(gè)單峰，然后用0.05M乙酸透析樣品，并凍干；參見(jiàn)圖2。
重懸于20μl 10mM磷酸鹽緩沖液pH7.2后，分成等份重懸在SDS-PAGE樣品緩沖液中(最終濃度=125mM TRIS-HCL pH6；2.5％甘油；0.5％w/v SDS；5％β-巰基乙醇；0.01％溴酚藍(lán))，煮沸(5min)，冷卻，然后進(jìn)行SDS PAGE凝膠(12.5％)電泳(參見(jiàn)色層譜)，分離出55kD的雙帶(參見(jiàn)Rowe等，1996)。伴刀豆蛋白A和陽(yáng)離子帶也都是凝聚體形式的。所有組分，包括腫瘤條件培養(yǎng)基，都在人腎細(xì)胞系(1/1000diln.)中強(qiáng)烈抑制Na+依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)，并改變維生素D代謝。有關(guān)測(cè)定磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)和維生素D代謝方法的詳細(xì)描述參見(jiàn)Rowe等，1996。所有純化程式都在計(jì)算機(jī)千年軟件編程的waters HPLC/FPLC系統(tǒng)上進(jìn)行。活性最強(qiáng)的是OHO腫瘤的伴刀豆蛋白A1組分。用抗術(shù)前抗血清來(lái)篩選固定化的純化組分。該組分還在人腎細(xì)胞系(CL8)中強(qiáng)烈抑制NaPi，并影響維生素D代謝。實(shí)施例2用術(shù)前/術(shù)后抗血清篩選腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)和純化組分加糖蛋白篩選有關(guān)患者的術(shù)前/術(shù)后抗血清參見(jiàn)Rowe等，1996。只有術(shù)前抗血清檢測(cè)到純化組分和TCM中的激素，用加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑成功進(jìn)行了TCM和純化組分的Western和糖蛋白檢測(cè)。將蛋白標(biāo)記生物素化，并加上鏈霉親和素過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物標(biāo)簽。箭頭表示凝聚體和活性糖蛋白。術(shù)后血清和家兔免疫前血清沒(méi)有檢測(cè)到任何組分。而且，只有分泌磷酸鹽沉著因子的腫瘤呈陽(yáng)性。培養(yǎng)基和皮膚對(duì)照呈陰性。Con A1、Con A2和CA1樣品的特征是在人腎細(xì)胞系(CL8)中強(qiáng)烈抑制NaPi和改變維生素D代謝的能力。所有純化組分都有凝聚成一種SDS-PAGE上低移率形式的傾向。而且，純化組分和TCM活性組分高度糖基化。糖基化程度的測(cè)定為在PVDF膜上高碘酸鹽氧化固定化的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行糖基部分的生物素化。然后用連有辣根過(guò)氧化酶的鏈霉親和加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑篩選。活性形式(抑制NaPi)與58-60kDa組分相關(guān)。純化蛋白的另一種有效方法是用中性pH7的SDS-PAGE系統(tǒng)，用4-12％Bis-Tris凝膠，用MOPS電泳緩沖液。預(yù)制凝膠可向Novex購(gòu)買(mǎi)。實(shí)施例3用4-12％聚丙烯酰胺梯度Bis-Tris凝膠，用MOPS電泳緩沖液的中性SDS-PAGE(Novex的Nu-PAGE系統(tǒng))激素遷移率降低在該系統(tǒng)上，一種糖基化激素組分遷移率降低，走到～200kDa處。還可以在58-60kDa處看到更低分子量形式。出現(xiàn)～200kDa的蛋白可能是因?yàn)榈鞍椎牡入婞c(diǎn)(中性pH下電荷不同)和糖基部分與凝膠基質(zhì)的相互作用。而且，在梯度凝膠的頂端，由于丙烯酰胺濃度低(4-12％梯度)，高分子量組分的電-印跡效率提高。組分在該系統(tǒng)中運(yùn)行提高了分子的純度和均一性。用該系統(tǒng)進(jìn)行Western印跡，包括以下樣品(用術(shù)前抗血清，加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑篩選印跡)1蛋白質(zhì)標(biāo)記；2顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞系OHO3毗鄰腫瘤的硬膜下細(xì)胞；4靠近硬膜下的硬膜細(xì)胞；5HTB6細(xì)胞系；6Saos-2細(xì)胞系；7培養(yǎng)基對(duì)照；8皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)照；9線(xiàn)性皮脂痔息肉瘤。結(jié)果顯示，痔息肉瘤在SDS-PAGE中性凝膠上～200kDa處展現(xiàn)一條特異性磷酸鹽沉著條帶。實(shí)施例4:phosphatonin的克隆與測(cè)序1．文庫(kù)的構(gòu)建切取患者的腫瘤(BD,Rowe等，1996)，用標(biāo)準(zhǔn)方法抽提mRNA。用逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制mRNA成cDNA，然后克隆到噬菌體載體λ-ZAPⅡuni(購(gòu)自Stratagene Ltd.,Unit 140,Cambridge Science Park,Milton Road,Cambridge,CB4 4GF UK)。克隆是單向的，基因5＇端連T3啟動(dòng)子，并緊靠一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)。cDNA的3＇端緊靠一個(gè)細(xì)菌T7啟動(dòng)子上游的Xho-1位點(diǎn)。簡(jiǎn)而言之，將切取自BD患者的腫瘤切成1mm的塊，用鏈霉親和素-磁性珠順磁性顆粒技術(shù)(PolyATract系統(tǒng)Promega)直接抽提聚A+RNA。mRNA純化后，用Stratagene的cDNA合成試劑盒生成cDNA模板。在cDNA中加入接頭引物產(chǎn)生5＇EcoRⅠ相容性cDNA末端和Xho相容性3＇末端，這有助于強(qiáng)制定向克隆到λ-ZAPⅡuni噬菌體載體內(nèi)。接種在大腸桿菌XL1-Bluemrf上并擴(kuò)增重組噬菌體。原代克隆總數(shù)800000，其中6％為野生型。
2．用術(shù)前抗血清篩選將cDNA噬菌體文庫(kù)接種在NZY瓊脂板上培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶操縱子。然后將表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)移到hybond-C膜(Amersham)上，用患者的術(shù)前抗血清篩選膜。所用抗血清參見(jiàn)(Rowe等，1996)。用前，抗血清用大腸桿菌裂解物和全血充分預(yù)吸附，降低噪音信號(hào)水平?？够颊連D術(shù)前血清的家兔抗血清(Rowe,Bone(18)1996)用正常人血清和大腸桿菌裂解物成分預(yù)吸附，以去除大腸桿菌抗體和背景人血清中的抗體。簡(jiǎn)而言之，在大腸桿菌全裂解物(Stratagene)中加5張直徑80mm的硝酸纖維素濾膜，將第二組5張濾膜浸在正常人血清(10ml)中。各張濾膜依次用以下溶液室溫下孵育10min:250ml以1％BSA按1∶1000稀釋的抗家兔術(shù)前抗血清；20mM Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl(TBS)；0.02％NaN3。然后，用預(yù)吸附的術(shù)前抗血清(pre-Anti-op)篩選cDNA文庫(kù)。噬菌體λ-ZAPⅡuni OHO cDNA克隆平板培養(yǎng)在大腸桿菌XL1-Blue mrf上，37℃培養(yǎng)3小時(shí)。然后在產(chǎn)生的噬斑上蓋以用10mM IPTG預(yù)孵育的hybond-N+濾膜，42℃培養(yǎng)3小時(shí)。然后，取下濾膜，用補(bǔ)充了Tween 20(TBST)的TBS洗滌，用含1％BSA和0.02％NaN3的TBS4℃封閉過(guò)夜。然后將pre-Anti-op加到封閉后的濾膜上，室溫下放置1小時(shí)。按照Stratagenes picoublueTM免疫篩選試劑盒所述，洗滌濾膜，與山羊抗家兔堿性磷酸酶偶聯(lián)物孵育，然后用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/氮藍(lán)四唑顯示。篩選了約600,000個(gè)克隆后，挑選出了9個(gè)陽(yáng)性克隆，進(jìn)行二級(jí)和三級(jí)篩選。噬菌體克隆用ExAssist輔助噬菌體拯救成為噬菌粒，克隆到E coli SOLR細(xì)胞中。ExAssist輔助噬菌體和SOLR細(xì)胞購(gòu)自Stratagenes Ltd.,Suite 140,CambridgeScience Park,Milton Road,Cambridge,CB4 4GF,UK。
3。測(cè)序克隆制備噬菌粒，并測(cè)定DNA序列。9個(gè)克隆都測(cè)序。三級(jí)篩選后，用無(wú)菌中空刺針挑取陽(yáng)性噬菌體空斑。將含有溶菌斑的瓊脂塊加到0.5ml補(bǔ)充了0.02％氯仿的SM緩沖液中，4℃過(guò)夜。如Stratagenes所述，用ExAssist噬菌體進(jìn)行噬菌體克隆的拯救和向BSCPT SKⅡ-噬菌粒的轉(zhuǎn)化。用于純化噬菌粒的宿主細(xì)胞是Ecoli SOLR細(xì)胞。用標(biāo)準(zhǔn)方法制備噬菌粒DNA(Rowe,Nulciec Acids Res.22(1994),5134-5136)，用ABⅠ熒光劑自動(dòng)測(cè)序法和標(biāo)準(zhǔn)載體特異性引物測(cè)序。其中6個(gè)克隆重疊，與細(xì)菌的β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子同框，得到具有相同重疊DNA序列的相鄰/重疊表位和表達(dá)蛋白。最長(zhǎng)的測(cè)序克隆含其他5個(gè)克隆cDNA序列之和，見(jiàn)圖8。這是phosphatonin的全序列(氨基酸/cDNA)。共克隆了430個(gè)氨基酸殘基(SEQID NO:2)，1655bp的DNA序列(SEQ ID NO:1)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示是一種高度親水性蛋白，COOH末端糖基化，氨基末端具有一段細(xì)胞結(jié)合三肽(RGD)，見(jiàn)圖8。該蛋白還具有高度抗原性，具有許多主螺旋結(jié)構(gòu)域(圖10)。用BLAST對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的全面篩選沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與已知基因或蛋白序列的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)同源性。
4．重組人phosphatonin的純化分離的cDNA克隆的形式是Bscpt SKⅡ-載體(Stratagene載體)中的獲救噬菌粒，且含于SOLR大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)。用IPTG誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子，獲得了融合蛋白的低水平表達(dá)。phosphatonin克隆融合產(chǎn)物在Western印跡中與術(shù)前抗血清反應(yīng)。將其亞克隆到pCAL-n-EK載體(Stratagene載體)中可提高該融合蛋白的表達(dá)和活性(見(jiàn)后文)。含人phosphatonin的構(gòu)建物含于大腸桿菌(BL21(DE3)pLysS)細(xì)胞(購(gòu)自Stratagene)內(nèi)。IPTG對(duì)融合蛋白的誘導(dǎo)高得多，通過(guò)對(duì)細(xì)胞裂解液的鈣調(diào)蛋白親和性層析可獲得基本純的蛋白質(zhì)。在Ca2+存在下，帶有融合標(biāo)簽的重組phosphatonin與鈣調(diào)蛋白樹(shù)脂結(jié)合。然后用EGTA洗滌釋放phosphatonin融合蛋白。用腸激酶去除小的細(xì)菌融合標(biāo)簽，留下純的人phosphatonin。
4a.phosphatonin在pCAL-n-EK載體內(nèi)的亞克隆將完整的phosphatonin(MEPE)推導(dǎo)cDNA序列(根據(jù)最大cDNA克隆pOHO11.1推導(dǎo))亞克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pCAL-n-EK(Stratagene載體)中，將該構(gòu)建物分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和大腸桿菌XL1-Blue mrf(菌株來(lái)自Stratagene)中。按照Stratagene AffinityTM克隆和蛋白質(zhì)純化試劑盒(目錄號(hào)#214405和#214407)，進(jìn)行不依賴(lài)于連接的克隆(LIC)。根據(jù)phosphatonin序列的5＇和3＇末端設(shè)計(jì)引物，帶有附加的突出接頭序列(粗體表示接頭)正向5＇:GACGACGACAAG.GTGAATAAAGAATATAGTATCAGTAA3＇接頭(SEQ IN NO:8)反向5＇:GGAACAAGACCCGT.CTAGTCACCATCGCTCTCACT3＇接頭(SEQ IN NO:8)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括編碼第一個(gè)纈氨酸起至phosphatonin終止密碼子(圖8)，外加接頭序列的DNA序列。用Pfu聚合酶和dATP處理PCR片段，產(chǎn)生接頭序列的5＇突出端。培養(yǎng)細(xì)胞并添加IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。PCR條件預(yù)變性；95℃3min，20輪變性循環(huán)；95℃45sec,59℃退火60sec,72℃2min，然后72℃最后延伸7min；然后4℃冷卻。用Perkin Elmer 9600熱循環(huán)儀編程進(jìn)行PCR，并用以下PCR緩沖液(PB):10mM Tris-HCl,pH8,50mM KCl,1μM引物，200μMdNTPs。在PB緩沖液中補(bǔ)充2mM MgCl2。對(duì)于不依賴(lài)于連接的克隆(LIC)，然后如Stratagene所述，用pfu聚合酶和dATP處理擴(kuò)增產(chǎn)物，并直接與帶有互補(bǔ)接頭突出段的線(xiàn)性化pCAL-n-EK質(zhì)粒載體退火結(jié)合。然后將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌XL1-Blue mrf宿主細(xì)胞和感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)中。在氨芐青霉素平板上挑出克隆，制備質(zhì)粒并測(cè)序。圖14顯示了載體和融合構(gòu)建物的總結(jié)。用大腸桿菌XL1-Blue mrf宿主實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒的高拷貝數(shù)。用大腸桿菌BL21(DE3)獲得了重組蛋白的高表達(dá)。
4b.用鈣調(diào)蛋白親和性樹(shù)脂純化phosphatonin可采用Stratagene(目錄號(hào)214406)所述的方法。phosphatonin特異性殘基的上游序列中含有一段鈣調(diào)蛋白結(jié)合序列。在鈣存在下，將鈣調(diào)蛋白加入粗細(xì)胞裂解液，讓蛋白發(fā)生結(jié)合。然后用含鈣緩沖液洗滌該漿狀物，在Tris緩沖液(50mMTris-HCl,pH0)中加EGTA 2ml，用其洗脫phosphatonin融合蛋白。然后用位點(diǎn)特異性蛋白酶EK消化，去除鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白標(biāo)簽，留下純的重組人phosphatonin。較好的是，該方法可如下進(jìn)行(有關(guān)緩沖液組成參見(jiàn)后文表格)1．按照Stratagene有關(guān)pCAL-n-EK載體(目錄號(hào)214405)的方案培養(yǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞，用含質(zhì)粒p1BL21的BL23(DE3)大腸桿菌宿主細(xì)胞；見(jiàn)圖14。
2．按照Stratagene的方案但用CCBB-Ⅱ作為重懸緩沖液(來(lái)自500ml的細(xì)胞沉淀重懸在10ml CCBB-Ⅱ中)制備蛋白質(zhì)裂解液。必需進(jìn)行30sec的超聲波脈沖處理和隨后的4min冰冷卻。將含有細(xì)胞的試管保持在冰上進(jìn)行超聲波處理。
3．超聲波處理后，10000g離心沉淀細(xì)胞，倒出上清液。大多數(shù)重組MEPE留在上清液(蛋白質(zhì)-裂解液)中。
4．然后用VIVASCIENCE VIVASPIN(目錄號(hào)VS1521，稱(chēng)30,000 MWCO PES)濃縮儀濃縮蛋白質(zhì)-裂解液，分子量截?cái)嘀禐?0000。來(lái)自500ml細(xì)胞的8ml上清液濃縮至3.2ml(2.5倍濃縮)。不宜進(jìn)一步濃縮。
5．對(duì)由190-200ml細(xì)胞制備的蛋白質(zhì)-裂解液(約1.3ml蛋白質(zhì)-裂解液)，加1ml平衡過(guò)的鈣調(diào)蛋白樹(shù)脂(按照Stratagene所述，用CCBB-Ⅱ緩沖液平衡樹(shù)脂)。
6．懸浮液4℃轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)夜。
7．然后離心沉淀懸浮液(eppendorf離心機(jī)上約3000rpm離心2min)，去除上清液，將樹(shù)脂重懸于1ml CCBB-Ⅱ緩沖液中。
8．再次離心沉淀樹(shù)脂，棄去第一次的洗液。如此再重復(fù)2次(共用CCBB-Ⅱ洗滌3次)。
9．然后，用WB-Ⅲ洗一次；注意，包括最后洗滌緩沖液在內(nèi)的緩沖液都不能含除垢劑。用于生物試驗(yàn)的細(xì)胞對(duì)即使微量的除垢劑也非常敏感。WB-Ⅲ除不含蛋白酶抑制劑之外與CCBB-Ⅱ都相同。
10．用EB-Ⅰ緩沖液(1ml)進(jìn)行2次洗脫非特異性蛋白。
11．用EB-Ⅱ(1ml)2-3次洗脫MEPE。
12．用flowgen 10K microsep濃縮儀4℃濃縮蛋白。一般，3ml MEPE洗脫液可在2小時(shí)內(nèi)濃縮至約170μl。
13．在SDS-PAGE凝膠上電泳測(cè)定樣品的純度和含量后，將其分成多份冷凍于-80℃。需避免反復(fù)凍融。
緩沖液

使用時(shí)，每10ml加1片蛋白酶抑制劑片(BoehringerMannheim)，蛋白酶抑制劑w/o EDTA(目錄號(hào)1836 170)。最后用1M NaCl,EGTA(4mM)緩沖液洗脫后，phosphatonin純度超過(guò)95％。實(shí)施例5:phosphatonin的結(jié)構(gòu)1．一級(jí)結(jié)構(gòu)和基序圖8顯示了該蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和核酸序列。分離到的MEPE的最大cDNA克隆有1655bp，含有完整的基因3＇和聚A+尾和一段聚腺苷酸化序列(AA[T/U]AAA)(圖8)。發(fā)現(xiàn)一個(gè)430殘基的開(kāi)放讀碼框，它與分離到的其他較小的MEPE cDNA克隆重疊，并有延伸，預(yù)計(jì)Mr是47.3kDa,p1是7.4。最適共有起始密碼子(kozak,Nucleic Acids Res.15(1987),8125-8148)出現(xiàn)在第255bp，雖然此前另有2個(gè)甲硫氨酸。附加的5＇序列可能丟失而需要確定更早的起始密碼子和延伸的5＇非翻譯序列。GCG-二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白有很強(qiáng)的親水性，有3個(gè)弱疏水區(qū)(圖9)。該蛋白的糖基化基序在殘基382和385(NNST)，和殘基383-386(NSTR)。在殘基161-164還有一個(gè)糖胺聚糖結(jié)合位置(SGDG)。非糖基化分子量約54kDa，與純化的糖基化形式很接近(58-60kDa)。有許多磷酸化位點(diǎn)(表1)，這些可能與激素或其片段的生物學(xué)活性相關(guān)。
表1


該蛋白的一個(gè)重要特征是殘基152-154處的細(xì)胞結(jié)合序列(RGD)。通常，Arg-Gly-Asp序列參與受體相互作用，在纖連蛋白中則為細(xì)胞表面受體與特定整聯(lián)蛋白的結(jié)合所必需。更值得注意的是，該基序存在于某些形式的膠原蛋白(骨基質(zhì)蛋白)、血纖蛋白原、玻連蛋白、von Willebrand因子(VWF)、蛇蛻皮素和圓盤(pán)粘菌素(discoidin)中。很可能，phosphatonin的這部分與受體和/或骨礦物基質(zhì)的相互作用有關(guān)。而且，這種相互作用介導(dǎo)了1．骨的礦化(成骨細(xì)胞)。
2．Na依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者基因表達(dá)調(diào)節(jié)。
3．24羥化酶和/或1α羥化酶基因表達(dá)調(diào)節(jié)(腎)。
4．骨和牙質(zhì)礦化基質(zhì)相互作用和通過(guò)成核作用調(diào)節(jié)礦物質(zhì)沉淀。
殘基161-164處的糖胺聚糖結(jié)合序列(SGDG)對(duì)于骨礦物質(zhì)的結(jié)合和相互作用具有重要意義。有關(guān)蛋白聚糖在骨中信號(hào)傳導(dǎo)中的作用文獻(xiàn)記載甚多。很可能，該分子的這一部分對(duì)前述生物活性(第1-4點(diǎn))也很重要，尤其對(duì)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨的礦化來(lái)說(shuō)。
RGD基序位于一個(gè)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)角區(qū)(Gamier預(yù)測(cè)Antheprot)，兩側(cè)是兩個(gè)β平面(殘基134-141和172-178)。預(yù)測(cè)平面結(jié)構(gòu)兩側(cè)是兩個(gè)延長(zhǎng)α螺旋區(qū)(121-132和196-201)。總體結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)角和RGD細(xì)胞結(jié)合序列與骨橋蛋白的相似。該蛋白還有一系列蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ、酪氨酸激酶和cAMP/cGMP-依賴(lài)性蛋白激酶的預(yù)測(cè)的磷酸化基序。還發(fā)現(xiàn)MEPE具有大量N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)，這些位點(diǎn)似乎是含RGD磷酸糖蛋白(骨橋蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白、h-整聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白、牙質(zhì)-唾液酸磷酸蛋白、牙質(zhì)-基質(zhì)-蛋白-1、骨-唾液酸蛋白-Ⅱ和纖連蛋白)的特征之一。和在骨橋蛋白中一樣(37％)，天冬氨酸、絲氨酸和谷氨酸的含量異常得高(26％)。特別重要的是，MEPE序列中完全沒(méi)有半胱氨酸殘基，表明半胱氨酸-半胱氨酸二硫橋?qū)υ摲肿拥亩?jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有作用。MEPE序列篩選震顫數(shù)據(jù)庫(kù)(tremble database)后顯示與牙質(zhì)phosphoryn(DPP)的序列同源性。MEPE的C末端具有一段富含天冬氨酸和絲氨酸殘基的序列(殘基414-427)，與DPP中的一段重復(fù)基序幾乎完全相同(同源性80％)(圖26A和圖26B)。MEPE基序(DDSSESSDSGSSSESD)與DSP基序(SDSSDSSDSSSSSDSS)的理化比較使同源性上升到93％。在MEPE中，MEPE基序只在C末端出現(xiàn)一次(殘基414-427)，而類(lèi)似物DSP則在DSP殘基位點(diǎn)686-699,636-646和663-677反復(fù)出現(xiàn)。而且，在576-589和800-813的DSP中還發(fā)現(xiàn)兩段與MEPE基序同源性80％的相關(guān)序列DSSDSSDSNSSSDS和DSSDSSDSSNSSDS。骨橋蛋白中也發(fā)現(xiàn)一段同源性60％的類(lèi)似基序(殘基101-116)(DDSHQSDESHHSDESD)，而且，該同源區(qū)內(nèi)有一個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(圖12)。X聯(lián)鎖的佝僂病存在骨骼酪蛋白激酶Ⅱ活性缺陷(Rifas,Ioc.cit)。雖然骨橋蛋白的MEPE基序在中間而不是C末端，據(jù)報(bào)道，骨橋蛋白的體內(nèi)剪切產(chǎn)生一種MEPE基序位于C末端的肽(Smith,J.Biol.Chem.271(1996),28485-28491)。還在DMA-1的殘基408-429處發(fā)現(xiàn)了與C末端MEPE基序同源的另一序列(SSRRRDDSSESSDSGSSSESDG)。圖12以“l(fā)lanview”統(tǒng)計(jì)圖的形式顯示DSSP、DMA-1和OPN中MEPE基序的局部序列同源性，表2列出了序列對(duì)比中的相似性。
表2MEPE與DSSPMEPE的上游序列411 DSSESSDSGSSSES 427 (SEQ ID NO:7)686 DSSDSSDSSSSSDS 699 (SEQ ID NO:13)414 DSSESSDSGSSSES 427 (SEQ ID NO:7)633 DSSDSSDSSSSSDS 646 (SEQ ID NO:13)413 DDSSESSDSGSSSES 427 (SEQ ID NO:10)551 DDSSDSSDSSDSSDS 565 (SEQ ID NO:14)414 DSSESSDSGSSSES 427 (SEQ ID NO:7)576 DSSDSSDSNSSSDS 589 (SEQ ID NO:15)414 DSSESSDSGSSSES 427 (SEQ ID NO:7)663 DSSDSSDSSSSSDS 677 (SEQ ID NO:13)414 DSSESSDSGSSSES 427 (SEQ ID NO:7)752 DSSESSDSSNSSDS 765 (SEQ ID NO:16)414 DSSESSDSGSSSES 427 (SEQ ID NO:7)800 DSSDSSDSSNSSDS 813 (SEQ ID NO:17)MEPE與骨橋蛋白MEPE的上游序列413 DDSSESSDSGSSSESD 428 (SEQ ID NO:11)101 DDSHQSDESHHSDESD 116 (SEQ ID NO:18)骨橋蛋白與DSSP骨橋蛋白的上游序列106 SDESHHSDESD 116(SEQ ID NO:19)638 SDSSSSSDSSD 648(SEQ ID NO:20)106 SDESHHSDESD 116(SEQ ID NO:19)846 SDSSDSSDSSD 857(SEQ ID NO:21)106 SDESHHSDESD 116(SEQ ID NO:19)857 SDSSDSSDSSN 878(SEQ ID NO:22)MEPE與DMA-1MEPE的前端序列408 SSRRRDDSSESSDSGSSSESDG 429 (SEQ ID NO:12)443 SSRSKEDSN-STESKSSSEEDG 463 (SEQ ID NO:23)值得注意的是基序在DSSP C末端或牙質(zhì)-phosphoryn部分的重復(fù)出現(xiàn)。圖13顯示高嚴(yán)謹(jǐn)和低嚴(yán)謹(jǐn)條件下MEPE與DSSP的點(diǎn)-矩陣序列比較，顯示出DSSP中富含天冬氨酸-絲氨酸的MEPE基序的重復(fù)出現(xiàn)。
DPP由一個(gè)較大的蛋白翻譯后剪切產(chǎn)生，即牙質(zhì)唾液酸磷酸蛋白(DSSP)被剪切成DPP和牙質(zhì)唾液酸蛋白(DSP)兩種蛋白。MEPE和骨橋蛋白與牙質(zhì)唾液酸磷酸蛋白的牙質(zhì)phosphoryn(DPP)部分有相當(dāng)?shù)耐葱裕c牙質(zhì)唾液酸蛋白部分(DSP)則沒(méi)有同源性(圖13)。值得注意的是，DPP和MEPE中，RGD基序、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化基序和N-糖基化位點(diǎn)緊密排列(圖13)。而且，所有與DSSP相關(guān)的蛋白激酶C位點(diǎn)都集中在與MEPE重疊的區(qū)域(牙質(zhì)phosphoryn部分)，DSP部分則沒(méi)有。
2．二級(jí)結(jié)構(gòu)圖3至6顯示疏水性/親水性、抗原性、柔性和細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)可能性的肽結(jié)構(gòu)GCG預(yù)測(cè)結(jié)果。這些圖顯示對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列的肽結(jié)構(gòu)GCG預(yù)測(cè)分析。疏水性和親水性分別以三角和橢圓代表。382-386處的糖基化基序以莖環(huán)表示。圖6中的糖基化符號(hào)更清楚。蛋白轉(zhuǎn)角以代表一級(jí)氨基酸序列的線(xiàn)形表示。α-螺旋、卷曲和平面結(jié)構(gòu)以局部波浪線(xiàn)表示(圖7較為詳細(xì))。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)是用HGMP資源中心，Cambridge(Rice,1995)EGCG包程序說(shuō)明中的GCG軟件進(jìn)行的。(Cambridge,CB10 1RQ,England:Hinxton Hall)。一驚人特征是沒(méi)有Sistine殘基和高度的親水性，只有4個(gè)低疏水性指數(shù)的小位點(diǎn)(殘基48-53,59-70,82-89和234-241)。該蛋白沒(méi)有用antheorplot軟件預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)所推導(dǎo)的跨膜特征。而且，該蛋白具有高度的抗原性和柔性(圖4和5)。二級(jí)結(jié)構(gòu)總體特征顯示是一種胞外分泌蛋白，這與提出的該蛋白功能相符。圖7顯示，phosphatonin的螺旋、平面結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)。其根據(jù)是用antheorplot v2.5e軟件包的Gamier分析所做的預(yù)測(cè)。各部分中的4條線(xiàn)(由上至下)代表了一級(jí)氨基酸序列的螺旋、卷曲、平面和轉(zhuǎn)角的概率。最下方的圖是相同數(shù)據(jù)的條碼形式。值得注意的是高螺旋含量，特別是在NH2末端，也靠近C末端，這可能與功能有關(guān)。實(shí)施例6:phosphatonin和phosphatonin片段的醫(yī)學(xué)用途許多疾病可用本發(fā)明的多肽進(jìn)行治療。
X聯(lián)鎖的佝僂病(血磷酸鹽過(guò)少癥)(HYP)X聯(lián)鎖的血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病是最常見(jiàn)的遺傳性骨礦物質(zhì)代謝疾病(Rowe,1997)。phosphatonin生物活性片段(例如PHEX剪切而得的)和未剪切的激素將在該病的治療中起重要作用。本發(fā)明克隆和描述的蛋白預(yù)計(jì)與其腎內(nèi)同種受體相互作用，從而抑制腎Na-依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者(NaPi)的表達(dá)，并直接或間接上調(diào)腎24羥化酶。還預(yù)計(jì)下調(diào)腎1α羥化酶的表達(dá)(直接/間接)。經(jīng)PHEX剪切后或其他翻譯后修飾后，該激素的衍生片段具有相反的生物功能(上調(diào)NaPi，下調(diào)腎24羥化酶，上調(diào)腎1α羥化酶)。預(yù)計(jì)含RGD細(xì)胞結(jié)合殘基(152-154)的片段參與受體相互作用，但其他肽衍生物也可能介導(dǎo)引起不同生物活性的配體受體相互作用。而且，phosphatonin衍生物還在礦物質(zhì)減少性骨損傷的正常化中起重要作用。預(yù)計(jì)這是由于介導(dǎo)改變了成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)礦化，和矯正骨礦化基質(zhì)蛋白(骨橋蛋白/骨鈣素)表達(dá)/磷酸化異常所致。RGD細(xì)胞結(jié)合序列和糖胺聚糖結(jié)合基序可能是功能性核形成和羥基磷灰石和骨礦物質(zhì)結(jié)晶所必需的。
影響發(fā)育是HYP的主要特征，當(dāng)前的療法是不合適的。給予phosphatonin衍生片段而不是無(wú)機(jī)磷酸鹽加維生素D可糾正這種錯(cuò)誤。
因此，phosphatonin衍生片段的應(yīng)用作用包括
1．矯正血磷酸鹽過(guò)少癥(NaPi，最好是腎內(nèi)的)；2．24-羥化酶1α羥化酶活性正常化(腎內(nèi)的)；3．骨的礦化和骨的修復(fù)(矯正/預(yù)防佝僂病)；4．消除骨痛癥狀；5．糾正發(fā)育阻滯。
瘤原性血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化(OHO)OHO的臨床特征與HYP相似。包括腎磷酸鹽漏失，1,25-二羥基維生素D3(鈣三醇)循環(huán)水平低，堿性磷酸酶升高，骨礦化不全(在成人中則表現(xiàn)為全面骨軟化(骨軟化))和磷酸鹽血清含量低。HYP與OHO的病理生理學(xué)明顯重疊。佝僂病中，缺陷是無(wú)功能PHEX基因。然而，OHO中則是循環(huán)中的未加工phosphatonin。腫瘤通常很難找到，要切除可能極端困難和危險(xiǎn)。如果不宜切除腫瘤，則控制磷酸鹽代謝和骨礦化成為至關(guān)重要。給予患者PHEX以剪切激素是危險(xiǎn)的，因?yàn)槠渌h(huán)激素和蛋白也會(huì)受非特異性剪切的影響。取而代之的是，可以設(shè)計(jì)具有高度受體親和性和生物活性的phosphatonin片段，這樣，它們就能夠有效地與未加工的腫瘤產(chǎn)生的循環(huán)激素競(jìng)爭(zhēng)。
其他佝僂病或磷酸鹽過(guò)少性病癥有許多原因會(huì)引起HYP和OHO之外的佝僂病，最常見(jiàn)的包括維生素D異常，但也包括諸如血磷酸鹽過(guò)少、腎小管酸中毒、某些藥物的使用、口炎性腹瀉、囊性纖維化，等。使用phosphatonin片段或phosphatonin本身可有效治療這些疾病。以下簡(jiǎn)單論述了其中幾種(可用全激素治療造成血磷酸鹽過(guò)少的疾病)。
腎移植和腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良腎移植的一慢性特征是發(fā)生腎磷酸鹽漏失(血磷酸鹽過(guò)少)和骨礦化失常。phosphatonin片段可治療該疾病，且沒(méi)有目前藥物的副作用。
骨營(yíng)養(yǎng)不良(骨病的并發(fā)癥)一般是由慢性腎衰(腎病)引起的。除非進(jìn)行透析，腎衰會(huì)造成死亡(腎病晚期)。所以，骨營(yíng)養(yǎng)不良患者一般接受透析治療。這種骨病，又稱(chēng)“腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良”，常見(jiàn)于接受長(zhǎng)期血透析的患者。大多數(shù)慢性腎衰患者發(fā)生繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)，伴以組織學(xué)發(fā)現(xiàn)囊性纖維性骨炎。該病的特征是兒童，尤其是極幼兒童發(fā)育不良和嚴(yán)重的骨畸形。腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良的病因與磷酸鹽積累有關(guān)(血磷酸鹽過(guò)多)及其對(duì)鈣和鈣三醇代謝的作用有關(guān)，還包括代謝性酸中毒、細(xì)胞因子和甲狀旁腺素降解的影響。治療方法包括限制飲食磷攝入，磷酸鹽結(jié)合劑，和使用維生素D的活性代謝產(chǎn)物。在這種情況中，增加未加工激素是調(diào)控磷酸鹽水平的高效手段，將導(dǎo)致骨愈合。如果phosphatonin的受體在包括腎臟的一系列組織內(nèi)表達(dá)，則有可能用于治療腎病晚期患者(即，完全喪失腎功能)。
骨質(zhì)疏松/骨礦物質(zhì)流失絕經(jīng)后的婦女容易發(fā)生骨礦物質(zhì)流失，最后危及骨骼健康。雖不知道病因，但很可能與遺傳和環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用有關(guān)。目前的研究注重于完善數(shù)據(jù)模型來(lái)分析諸如骨質(zhì)疏松等多因素疾病。
使用phosphatonin衍生片段可通過(guò)有效逆轉(zhuǎn)骨礦物質(zhì)流失而協(xié)助治療該病。而且，可以修飾生物活性肽來(lái)提高其作用的效力和特異性。
骨佩吉特病(變形性骨炎)骨佩吉特病是因?yàn)楣侵厮軈f(xié)調(diào)障礙。即，骨的礦化(由成骨細(xì)胞介導(dǎo))與骨的重吸收(由破骨細(xì)胞介導(dǎo))不同步。出現(xiàn)破骨細(xì)胞過(guò)度的重吸收(主要在早期重吸收階段)，骨髓被纖維組織和結(jié)構(gòu)破壞的小梁所替代。雖然不知道其病因，但給予phosphatonin的肽衍生物可能有助于該病的治療。
與腎以外組織內(nèi)NaPi失調(diào)相關(guān)的疾病鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者(NaPi)不僅在腎內(nèi)而且在許多其他組織內(nèi)表達(dá)。目前記述了三種類(lèi)型的NaPi:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，據(jù)稱(chēng)，它們都在腎內(nèi)表達(dá)。在腎以外組織內(nèi)，Ⅲ型普遍表達(dá)(Murer，歐洲生理學(xué)雜志(Eur.J.Physiol.)433(1997)379-389；Kavanaugh，腎臟研究(Kidney Int.)49(1996)956-963)，Ⅰ型除腎之外在肝和腦內(nèi)表達(dá)(Hilfiker,PNAS 95(1998),14564-14569)。另一方面，Ⅱ型被認(rèn)為只在腎的近曲小管內(nèi)表達(dá)。
雖然已知腎的近曲小管內(nèi)表達(dá)全部上述三種類(lèi)型，但普遍認(rèn)為，Ⅱ型在該部位的磷酸鹽重吸收中起著最重要的作用。這已由編碼Ⅱ型NaPi的基因(Npt2)被滅活的失能小鼠所證實(shí)。純合突變體(Npt2-/-)表現(xiàn)為尿中磷酸鹽排泄增加，血磷酸鹽過(guò)少，1,25-二羥基維生素D血清濃度升高及其他伴有尿鈣過(guò)多的遺傳性血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病(HHRH)的典型癥狀(Beck,PNAS 95(1998),5372-5377)。由于哺乳動(dòng)物內(nèi)磷酸鹽體內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)主要決定于腎，因此認(rèn)為，三種類(lèi)型中，Ⅱ型NaPi在全身性磷酸鹽體內(nèi)平衡中起著最重要的作用。而且，以上事實(shí)，結(jié)合實(shí)施例中CL8細(xì)胞系試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在腎內(nèi)受phosphatonin調(diào)節(jié)的NaPi主要是Ⅱ型。
腎衰患者主要臨床問(wèn)題之一是血磷酸鹽過(guò)多。若能控制這種過(guò)量的血清磷酸鹽將具有極大的臨床價(jià)值。因此，能夠下調(diào)NaPi和降低血磷酸鹽水平的phophatonin，其片段或衍生物有著潛在的價(jià)值。在發(fā)展性腎衰患者中(在所謂腎病晚期(ESRD)之前)，用phosphatonin下調(diào)腎內(nèi)的NaPi表達(dá)將是有價(jià)值的。
然而，一旦上述患者進(jìn)入ESRD并喪失了大部分腎功能，phosphatonin將失去其在腎內(nèi)的作用部位，因?yàn)槟I小球?qū)⒉辉俜置诹姿猁}。在此疾病階段，潛在價(jià)值在于控制消化道內(nèi)飲食磷酸鹽的吸收。消化道，尤其是小腸，是從飲食中吸收磷酸鹽進(jìn)入循環(huán)的唯一場(chǎng)所。因此，這是腎功能喪失后控制磷酸鹽吸收的又一個(gè)主要目標(biāo)。
據(jù)報(bào)道，已經(jīng)從小鼠的小腸克隆了Ⅱ型NaPi的一種亞類(lèi)，Ⅱb型(Hilfiker,PNAS 95(1998)14564-14569)。雖然還不知道phosphatonin是否能影響小腸內(nèi)Ⅱb型NaPi，但有理由預(yù)計(jì)，小腸內(nèi)的Ⅱb型NaPi在來(lái)自飲食的磷酸鹽吸收中起著重要作用，而且phosphatonin可能是其上調(diào)和下調(diào)最重要的因子。實(shí)施例7藥物組合物可配制含有本發(fā)明多肽和可選的藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑、稀釋劑或載體的藥物組合物。此類(lèi)組合物中過(guò)組分的確切性質(zhì)和含量可憑經(jīng)驗(yàn)確定，并在一定程度上取決于組合物的給予方式。給予患者的方式包括口服、頰側(cè)、舌下、局部(包括眼內(nèi))、直腸、陰道、鼻子和胃腸外(包括靜脈、動(dòng)脈、肌內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi))。為了避免不期望的蛋白酶解，優(yōu)選胃腸外途徑。
本發(fā)明分子的合適劑型取決于所治疾病、給藥途徑和患者年齡及體重等因素。例如，對(duì)胃腸外給藥來(lái)說(shuō)，每日0.1μg-1.5mg/kg本發(fā)明分子適合治療一般成人。更合適的可能是約1-150μg。因此，可以看出，對(duì)于成人可每日給予約0.01-100mg劑量的活性多肽，一般是0.1-10mg。
例如，適合胃腸外給藥的組合物一般含本發(fā)明分子溶于認(rèn)可的載體，最好是水性載體中所成的溶液?？刹捎枚喾N水性載體，例如水、緩沖水溶液、0.4％鹽溶液、0.3％甘油，等。此類(lèi)溶液最好是消過(guò)毒的，且沒(méi)有凝聚體或其他顆粒物質(zhì)。所述組合物可含有藥學(xué)上認(rèn)可的緩沖液以調(diào)節(jié)pH或改變毒性，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉，等。此類(lèi)制劑中所述分子的濃度范圍較寬，例如約0.5％以下至15或20％(重量)，可由熟練技術(shù)人員進(jìn)行適當(dāng)選擇。
典型的藥物組合物參見(jiàn)Remington藥物科學(xué)(Remington＇s PharmaceuticalScience)，15th版，Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(1980)。例如，注射用組合物可含1ml無(wú)菌緩沖水溶液和50mg本發(fā)明分子。典型的輸注用組合物可含250ml無(wú)菌Ringer溶液和150mg本發(fā)明分子。制備組合物的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的。配制和給予多肽類(lèi)藥物組合物的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的，并可參見(jiàn)P.Goddard的高級(jí)藥物傳遞論述(Advanced DrugDelivery Reviews),6(1991),103-131。實(shí)施例8:phosphatonin(MEPE)及其編碼基因的進(jìn)一步描述瘤原性骨軟化患者(BD、ND、EM和DS)的臨床特征現(xiàn)有文獻(xiàn)中已對(duì)患者BD進(jìn)行了描述(Rowe，骨(Bone)18(1996),159-169),并曾公開(kāi)過(guò)一例患者ND(David，神經(jīng)外科雜志(J.Neurosug.)84(1996),288-292)。兩患者都表現(xiàn)出典型的瘤原性骨軟化，表現(xiàn)為低血清磷酸鹽和放射性骨軟化和低血清1,25維生素D3?；颊連D(44歲的婦女)和患者ND(66歲的婦女)在分別去除了左鼻腔(血管周皮細(xì)胞瘤)和顱內(nèi)空間(間充質(zhì)周皮細(xì)胞瘤樣腫瘤)的腫瘤后，癥狀大部分緩解。患者ND在20年內(nèi)接受過(guò)3次手術(shù)，每次術(shù)后都緩解。
腫瘤條件培養(yǎng)基術(shù)后立即采取BD、ND和EM的腫瘤樣品。將樣品制成約1mm的切片，部分冷凍于液氮中。其余的腫瘤組織切片按先前所述組織培養(yǎng)(Rowe,Bone 18(1996),159-169)。簡(jiǎn)而言之，樣品用膠原酶消化過(guò)夜，然后交替地在有和無(wú)血清(DMEM培養(yǎng)基)存在下培養(yǎng)。對(duì)于患者ND，再采集硬膜下周?chē)陀材悠?，如上所述進(jìn)行處理。而且，在摘除腫瘤的當(dāng)日獲取患者BD的對(duì)照皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，并用處理腫瘤樣品的方法進(jìn)行處理?；颊連D的樣品標(biāo)記為1腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM-BD)；2皮膚條件培養(yǎng)基(SCM-BD)?；颊逳D的樣品標(biāo)記為1腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM-ND)；2硬膜下條件培養(yǎng)基(SDCM-ND)；3硬膜條件培養(yǎng)基(DCM-ND)；4顱內(nèi)腫瘤周?chē)?FST-ND)。所有樣品都采集自細(xì)胞于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)循環(huán)，除非在以上縮寫(xiě)上方加上“補(bǔ)充血清”。
TCM的伴刀豆蛋白A親和層析按實(shí)施例1所述進(jìn)行患者ND的腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)的伴刀豆蛋白A親和層析，結(jié)果分離出高親和性組分和低親和性組分(分別是HCA和LCA)。HCA和LCA都用α-甲基-D-吡喃葡萄糖(0.5M)洗脫緩沖液洗脫。簡(jiǎn)而言之，對(duì)Wangner，遺傳比較內(nèi)分泌學(xué)(Gen.Comp.Endocrinol.)63(1986),481-491中的方法加以改進(jìn)，用伴刀豆蛋白A親和層析進(jìn)行TCM蛋白的部分純化。20％乙醇中的伴刀豆蛋白A瓊脂糖(Pharmacia編號(hào)17-0440-01,14ml)先用數(shù)倍柱體積的水洗滌，然后在運(yùn)行緩沖液(CRB:0.06M磷酸鈉，pH7.2和0.5MNaCl)中平衡。將平衡后的漿狀物裝入12mm×115mm的Pharmacia螺紋頭柱內(nèi)，以0.4ml/min流速加入3倍柱體積的CRB運(yùn)行緩沖液(FPLC/HPLC millenium Waters層析系統(tǒng))。然后在柱內(nèi)加入以CRB緩沖液平衡的條件培養(yǎng)基(10ml)，任其結(jié)合。然后，用數(shù)倍體積的CRB上樣緩沖液洗柱，然后以0.2ml/min流速加入磷酸鈉洗脫緩沖液(ERB；60mMpH7.2/0.5M NaCl/0.5M α-甲基-D-吡喃葡萄糖/0.01％疊氮化物)(40ml)洗脫結(jié)合的蛋白。柱在ERB緩沖液中培養(yǎng)過(guò)夜，然后ERB緩沖液以0.2ml/min流速第二次通過(guò)，洗出高親和性蛋白。高和低伴刀豆蛋白A親和性TCM蛋白的洗脫特征相同，在約1.6柱體積處產(chǎn)生單一對(duì)稱(chēng)峰。峰LCA為峰HCA總量的1/3,ND患者的10ml腫瘤條件培養(yǎng)基中獲得1μgHCA物質(zhì)。
TCM和伴刀豆蛋白A組分的SDS-PAGESDS-PAGE分離腫瘤條件培養(yǎng)基、條件培養(yǎng)基和伴刀豆蛋白A親和性峰(HCA和LCA)，并在Sybr橙染色后顯示。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳用Novex NuPAGETM電泳系統(tǒng)進(jìn)行，該系統(tǒng)包括4-12％Bis-Tris丙烯酰胺梯度凝膠(pH6.4)，和MOPS-SDS(50mM 3-[N-嗎啉代]戊烷磺酸；50mM Tris堿；3.5mM SDS；1.0mMEDTA；pH7.7)運(yùn)行緩沖液。200伏恒壓電泳50min。樣品在NuPAGE LDS緩沖液(10％甘油；1.7％Tris堿；1.7Tris-HCl；2％十二烷基硫酸鋰；二硫蘇糖醇50mM；0.015％EDTA；0.075％Serva藍(lán)G250；0.025％苯酚紅；pH7.5最終濃度)中70℃變性10min。按照生產(chǎn)商所述在上電泳室中加入NuPAGE抗氧化劑。電泳后，凝膠在含SYPRO橙的7.5％乙酸中孵育染色。用Bio-Rad FluorImager凝膠顯影系統(tǒng)在UV光源下觀察蛋白質(zhì)。HCA和LCA組分染色呈陽(yáng)性，分別為56kDa和200kDa的蛋白質(zhì)，特征相同。來(lái)自患者ND顱內(nèi)腫瘤、硬膜下(緊靠患者腫瘤)和硬膜的條件培養(yǎng)基中含有跨50-80kDa的數(shù)條主條帶。所有制劑中都含有約66kDa處的主帶，腫瘤和硬膜下樣品中還有約200kDa處的一種較弱的高分子量成分。腫瘤樣品中約200kDa的相對(duì)強(qiáng)度最高，硬膜樣品中則沒(méi)有。腫瘤和硬膜樣品中有一組約55-60kDa的擴(kuò)散帶，硬膜條件培養(yǎng)基中則沒(méi)有(患者ND)。來(lái)自皮膚和培養(yǎng)基對(duì)照的條件培養(yǎng)基都沒(méi)有蛋白染色?；颊連D和EM的條件培養(yǎng)基情況與此相似，但沒(méi)有200kDa的高分子量蛋白。
患者LA和SL的非磷酸鹽沉著腫瘤組織和皮膚對(duì)照都有66kDa帶，且都在50-60kDa處有擴(kuò)散染色帶。伴刀豆蛋白A親和層析峰HCA和LCA富含200kDa高分子量蛋白，還含50-66kDa的蛋白。來(lái)自骨細(xì)胞系HTB96和SaOs2的條件培養(yǎng)基產(chǎn)生的蛋白特征與來(lái)自O(shè)HO患者ND的腫瘤條件培養(yǎng)基的幾乎完全相同。SaOs2中的200kDa帶的強(qiáng)度比之來(lái)自腦腫瘤(患者ND)、硬膜下(患者ND)的TCM和HTB96的CM相對(duì)較弱。
TCM和純化組分的免疫印跡和糖蛋白染色為了進(jìn)行Western印跡，通過(guò)水下(submarine)電泳將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Amersham)上。SDS-PAGE電泳后，凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris-HCl；0.38M甘油；0.2％SDS(TB))中室溫下平衡1h。PVDF膜切割成一定大小，在甲醇中略微漂洗，在蒸餾水中洗滌，然后在TB中平衡。然后，將平衡后的凝膠和PVDF膜夾在濾紙之間，放在盒中，然后將盒子放入含TB緩沖液的Hoeffer系統(tǒng)水下電印跡儀中，用溫差環(huán)流冷卻儀保持于4℃冷卻。然后轉(zhuǎn)移蛋白將夾心多層的PVDF端至于陰極，0.4A(45V)恒流電泳45min。分別按照加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham；ECL+)或鈣調(diào)蛋白親和性檢測(cè)試劑盒(Stratagene)的方法，用1/1000稀釋的術(shù)前抗血清，術(shù)后抗血清或與堿性磷酸酶偶聯(lián)的鈣調(diào)蛋白篩選印跡。用Bio-RadFluoImaging系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光，并攝影，用前文克隆檢測(cè)中論述過(guò)的比色系統(tǒng)(Stratagene)觀察鈣調(diào)蛋白親和性結(jié)合。用生物素化的分子量標(biāo)記作為內(nèi)部對(duì)照評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)移和分子量。將與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素加入第二抗體(與HRP偶聯(lián)的山羊抗家兔IgG)，以促進(jìn)通過(guò)化學(xué)發(fā)光觀察生物素化的標(biāo)記。
OHO患者的磷酸鹽沉著腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)的Western印跡在用預(yù)吸收的術(shù)前抗血清篩選時(shí)顯示化學(xué)發(fā)光陽(yáng)性帶。非磷酸鹽沉著性腫瘤、皮膚組織對(duì)照和培養(yǎng)基對(duì)照在用預(yù)吸收的術(shù)前抗血清篩選時(shí)都為陰性。而且，所有TCM和條件培養(yǎng)基樣品在用術(shù)后抗血清篩選時(shí)都呈陰性。
用預(yù)吸收的術(shù)前抗血清篩選患者ND和骨肉瘤細(xì)胞系HTB96和SaOS2的TCM蛋白，顯示位于約54-57kDa和約200kDa處的兩條免疫陽(yáng)性帶?；颊逳D腫瘤樣品和毗鄰硬膜下組織的54-57kDa信號(hào)比腦硬膜樣品條件培養(yǎng)基的強(qiáng)得多，而且，硬膜條件培養(yǎng)基中沒(méi)有200kDa的染色帶。HCA和LCA伴刀豆蛋白A組分都具有很強(qiáng)的200kDa帶信號(hào)，54-57kDa的信號(hào)雖然弱但仍然可見(jiàn)。細(xì)胞系HTB96和SaOS2也具有相同的陽(yáng)性帶，但SaOS2條件培養(yǎng)基的200kDa帶信號(hào)比TCM和HTB96弱。
皮膚條件培養(yǎng)基(患者ND和BD)和對(duì)照在用術(shù)后抗血清篩選時(shí)呈陰性(Rowe，Bone 18(1996),159-169)。重組MEPE(rec-MEPE)用預(yù)吸收術(shù)前抗血清染色呈陽(yáng)性，這可能與加入的rec-MEPE所競(jìng)爭(zhēng)所致。用Sybr-橙染色，和用預(yù)吸收術(shù)前抗血清篩選rec-MEPE，觀察到一條54-57kDa的陽(yáng)性帶。這和患者ND的腫瘤條件培養(yǎng)基和骨肉瘤細(xì)胞系HTB96和SaOS2中的55-57kDa帶(預(yù)吸收術(shù)前Western篩選)大小相同。重組MEPE在N末端有一個(gè)附加的4.5kDa CBP標(biāo)簽，這降低了其遷移率，造成在SDS-PAGE凝膠上的表觀分子量升高。因此，腫瘤產(chǎn)生的蛋白與rec-MEPE大小相同可能是由于對(duì)腫瘤產(chǎn)生的MEPE的翻譯后修飾(可能是糖基化)。
OHO患者BD和EM的TCM Western印跡在略低分子量處(48-52kDa)含有主要的預(yù)吸收術(shù)前抗血清陽(yáng)性帶，和一個(gè)55-57kDa處與rec-MEPE共遷移的條帶。在61、75、80和93kDa處還有其他的更高分子量帶(信號(hào)較弱)。
在所有樣品中，在用預(yù)吸收術(shù)前抗血清篩選時(shí)，66kDa處的主要SYBR-橙染色蛋白帶都呈陰性。對(duì)一式兩份糖蛋白用術(shù)前抗血清篩選時(shí)得到相同結(jié)果，54-57kDa和200kDa帶染色陽(yáng)性證實(shí)，這些蛋白是糖基化的。按照前述方法，用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用檢測(cè)糖蛋白的免疫印跡試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行特異性的糖蛋白檢測(cè)，加入Amersham的生物素化標(biāo)記作為內(nèi)部對(duì)照。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)移后，膜用10mM高碘酸鈉在乙酸鈉/EDTA緩沖液中所成的溶液處理，以氧化糖基部分。然后，在PBS中洗滌印跡，在乙酸鈉/EDTA緩沖液中與酰肼一起室溫孵育60分鐘。濾膜然后用TBS洗滌3次(10min)。用加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham)和鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶，用前述方法進(jìn)行封閉和檢測(cè)。不使用第一抗體和第二抗體山羊抗家兔HRP。
結(jié)論預(yù)吸收術(shù)前抗血清特異性檢測(cè)到瘤原性血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化-TCM蛋白。測(cè)得的主要蛋白分成3種分子量大小范圍48-52kDa,54-57kDa和200kDa。所有OHO-TCM樣品的54-57kDa蛋白都呈陽(yáng)性，而且，用預(yù)吸收術(shù)前抗血清測(cè)得的蛋白在篩選糖蛋白時(shí)呈染色陽(yáng)性。非OHO腫瘤對(duì)照組織和培養(yǎng)基在用預(yù)吸收術(shù)前抗血清篩選時(shí)呈陰性。實(shí)施例9由pCAL-n-EK載體表達(dá)MEPE融合蛋白將完整的cDNA編碼序列亞克隆到實(shí)施例4a所述的pCAL-n-EK中。如前所述，用術(shù)前抗血清和與堿性磷酸酶偶聯(lián)的鈣調(diào)蛋白篩選Western印跡，確認(rèn)IPTG引入大腸桿菌宿主BL21(DE3)產(chǎn)生的融合構(gòu)建物。具有細(xì)菌CBP標(biāo)簽(4.5kDa的鈣調(diào)蛋白結(jié)合性肽)的該融合蛋白含有鈣調(diào)蛋白肽、腸激酶位點(diǎn)和凝血酶位點(diǎn)，根據(jù)SDS-PAGE推斷為56kDa。這大致符合預(yù)計(jì)分子量(約48kDa)。如前所述用鈣調(diào)蛋白親和性層析純化蛋白。術(shù)前抗血清與純化的融合蛋白構(gòu)建物預(yù)培養(yǎng)，減弱了篩選TCM Western印跡中看到的55-57kDa信號(hào)，但不消除200kDa帶。未能完全消除55-57kDa信號(hào)可能是因?yàn)樾律鶰EPE-蛋白(TCM)中的高抗原性糖基化部分被特異性地識(shí)別，而rec-MEPE的細(xì)菌融合構(gòu)建物中則沒(méi)有這部分。融合蛋白可溶于水性Tris緩沖液，在純化的各步驟都不需要使用除垢劑。實(shí)施例10組織表達(dá)(RT/PCR和Northern分析)用MEPE cDNA篩選含聚A+RNA的Northern印跡，沒(méi)有測(cè)得與胃、甲狀腺、脊髓、淋巴結(jié)、氣管、腎上腺、骨髓、心臟、腦、肺、肝、骨骼肌、腎和胰臟的雜交(Clontech MTN-印跡Ⅰ和Ⅱ)。在Northern分析中，用特異性?xún)?nèi)部引物(Pho433-111F和PHO877-111R)擴(kuò)增得到的MEPE cDNA篩選含有以下聚A+RNA的印跡(MTNTM和MTNTMⅢ)1心臟；2腦；3胎盤(pán)；4肺；5肝；6骨骼肌7腎；8胰臟；9胃；10甲狀腺；11脊髓；12淋巴結(jié)；13氣管；14腎上腺；15骨髓。圖8中突出顯示了Pho433-111F和PHO877-111R的引物序列(核苷酸433-456(SEQ ID NO:24)和核苷酸877-900(SEQ ID NO:25))，采用以下PCR條件預(yù)變性95℃3min；30輪變性循環(huán)95℃45sec；退火63℃30sec；聚合72℃45sec；最后72℃延伸7min，然后冷卻至4℃。使用最終濃度為2mM MgCl2的PCR緩沖液(PB)。然后用水下瓊脂糖電泳分辨出444bp的MEPE cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，溴乙錠染色顯示，用玻璃珠純化(Gene-cleanⅡ試劑盒Bio101 INC)。用Amersham的MegaPrime標(biāo)記試劑盒，以α-p32dCTP(3000ci/mmol)放射性標(biāo)記純化的DNA。一般獲得5×109cpm/μg的比活性。用公知方法(Rowe，Hum.Genet.97(1996)，354-352)進(jìn)行印跡的雜交(60℃)和預(yù)雜交(60℃)，如下進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌1室溫下用2×SSC 0.1％SDS 30min洗滌2次，60℃用0.1×SSC0.1％SDS 30min洗滌2次。濾膜與膠片在-80℃接觸7天，然后顯影膠片。雖然以cDNA為模板，發(fā)現(xiàn)腦、腎、肝和胰臟有低水平的表達(dá)，但來(lái)自腎上腺、腦、十二指腸、心臟、腎、肝、肺、皮膚、脾臟、胸腺、甲狀腺、扁桃體的總?cè)薘NA用RT/PCR和MEPE特異性引物時(shí)并不擴(kuò)增。為了進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，抽提以下人組織的總RNA:1胸腺；2腦；3睪丸；4十二指腸；5心臟；6皮膚；7肝；8扁桃體；9脾臟；10甲狀腺；11腎上腺；12肺；13腎；14OHO腫瘤組織；15人原代成骨細(xì)胞。另獲取大鼠原代成骨細(xì)胞的總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR和Perkin Elmer-Roche RNA PCR試劑盒，用上述MEPE內(nèi)部引物(Pho433-111F和PHO877-111R)復(fù)制總RNA。簡(jiǎn)而言之，將1μg總RNA溶于20μl10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,5mM MgCl2,1mM dNTPs,1單位/μl核糖核酸酶抑制劑，2.5單位/μl MULV逆轉(zhuǎn)錄酶，0.75μM下游引物(PHO877-111R)。以上混合物37℃保溫10分鐘。加入上游引物(Pho433-111F)、dNTPs、MgCl2和AmpliTaq DNA聚合酶，最終濃度分別為0.15μM、200μMH 2.5單位/100μl，總體積為100μl。用Perkin Elmer熱循環(huán)儀(9700系統(tǒng))進(jìn)行PCR，程序設(shè)定如下預(yù)變性95℃,3min； 35輪變性95℃,45sec；退火65℃,30sec；聚合72℃,45sec；最后延伸72℃,7min，冷卻至4℃。用瓊脂糖凝膠電泳分辨擴(kuò)增產(chǎn)物，用Southern印跡驗(yàn)證，并測(cè)序。同樣，來(lái)自一系列非OHO腫瘤(乳房癌、肺癌Ⅰ、結(jié)腸腺癌Ⅰ、肺癌Ⅱ、前列腺癌、結(jié)腸腺癌Ⅱ、卵巢癌、胰腺癌；Clontech人腫瘤組#K1422-1)的一組歸一化的cDNA都呈MEPE PCR陰性，只有結(jié)腸腺癌、卵巢癌和前列腺癌中有極低水平的表達(dá)(以放射性標(biāo)記的MEPE cDNA對(duì)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern篩選后測(cè)得)。截然相反的是，用MEPE引物進(jìn)行的RT-PCR擴(kuò)增患者BD、DM、EM和DS的OHO腫瘤的聚A+RNA，表現(xiàn)出高水平的表達(dá)(相對(duì)甘油醛3-磷酸酯脫氫酶和運(yùn)鐵蛋白進(jìn)行歸一化)。OHO患者的非磷酸鹽沉著性腫瘤和對(duì)照組織(皮膚和腫瘤毗鄰物質(zhì))的聚A+RNA，CL8人腎細(xì)胞系，人原代成骨細(xì)胞(購(gòu)自Clonetics H-OST，參見(jiàn)材料)和抽提自線(xiàn)性皮脂腺痔綜合征患者的預(yù)測(cè)腫瘤息肉的聚A+RNA(息肉的TCM在人腎細(xì)胞系CL8中不抑制磷酸鹽的吸收)都不能擴(kuò)增用MEPE特異性引物。用購(gòu)自Clonetics的心臟、腦、胎盤(pán)、肺、肝、骨骼肌、腎和胰臟的cDNA(人組I#K1420-1)作為模板進(jìn)行MEPR引物PCR，可在腦、肝、肺和胰臟內(nèi)檢測(cè)到低水平的表達(dá)。對(duì)MEPE引物擴(kuò)增帶進(jìn)行測(cè)序顯示與MEPE cDNA完全同源，用MEPE cDNA對(duì)擴(kuò)增帶進(jìn)行的Southern篩選證實(shí)了測(cè)序結(jié)果。所有OHO患者的OHO模板聚A+RNA都擴(kuò)增出預(yù)計(jì)的480bp帶和下方的190bp帶。測(cè)序和Southern放射自顯影證實(shí)上方帶與MEPE序列完全同源，Southern篩選證實(shí)下方帶是一種MEPE衍生物。在低水平表達(dá)的正常組織和非OHO腫瘤中沒(méi)有下方帶。這說(shuō)明，交替剪接可能與腫瘤衍生的MEPE相關(guān)。全部RT/PCR和PCR實(shí)驗(yàn)都相對(duì)G3PDH和運(yùn)鐵蛋白歸一化。
總之，只在OHO腫瘤樣品中發(fā)現(xiàn)MEPE的高表達(dá)(根據(jù)mRNA水平測(cè)定)，腦、肝、腎和11種非OHO腫瘤中3種中有極低水平的表達(dá)(可能是異位表達(dá)。11種腫瘤的8種MEPE mRNA表達(dá)呈陰性(RT/PCR)，全部結(jié)果都相對(duì)G3PDH和運(yùn)鐵蛋白R(shí)T/PCR引物作歸一化。實(shí)施例11:Southern分析(基因組印跡)常染色體佝僂病家族的固定化DNA的基因印跡(Rowe,Hum.Genet.91(1993),571-575)分別用PstⅠ、EcoRⅠ、PvuⅡ和MspⅠ消化，如前所述用放射性標(biāo)記的MEPE cDNA篩選。用已知方法(Rowe,Hum.Genet.93(1994),291-294)用抽提自血液的DNA的基因組消化產(chǎn)物進(jìn)行Southern分析。16名家族成員接受篩選，其中一人的PstⅠ印跡顯示一條11bk帶和一條4kb的多形性帶。EcoRⅠ、PvuⅡ和MspⅠ印跡分別呈單條6kb、6.5kb和4kb帶陽(yáng)性，證明了該基因的人類(lèi)起源。因?yàn)闆](méi)有基因信息，所以無(wú)法推斷在這一常染色體佝僂病家族中，該基因是否與該疾病相分離。實(shí)施例12人腎細(xì)胞系CL8中的磷酸鹽吸收補(bǔ)充TCM和MEPE用已知方法(Rowe,Bone 18(1996),159-169)以人腎細(xì)胞系CL8進(jìn)行磷酸鹽和葡萄糖吸收實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，在24格平底組織培養(yǎng)板(Falcon 3047)中，將細(xì)胞培養(yǎng)在確定成分培養(yǎng)基(DM)中，直至鋪滿(mǎn)或培養(yǎng)過(guò)夜。然后用補(bǔ)充了純化融合蛋白或伴刀豆蛋白親和性純化的TCM的DM替換原DM,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后測(cè)定p32和C14甲基葡萄糖的吸收(Rowe,Bone 18(1996),159-169)。
如現(xiàn)有記述所述，將TCM(1/20稀釋)加入人腎細(xì)胞系顯著降低Na依賴(lài)性磷酸鹽吸收(Rowe,Bone 18(1996),159-169)。又如現(xiàn)有記述所述，TCM與術(shù)前抗血清預(yù)培養(yǎng)可避免這種抑制，但術(shù)后抗血清則不能(Rowe,Bone 18(1996),159-169)。加入40ng/ml的高和低伴刀豆蛋白A親和性純化組分(HCA和HLA)也抑制Na+依賴(lài)性磷酸鹽吸收(NaPi)。在TCM和伴刀豆蛋白A組分中，抑制都特異性針對(duì)磷酸鹽吸收，而不影響Na+依賴(lài)性α-甲基-D-葡萄糖的吸收。以上作用都呈劑量依賴(lài)性。
用鈣調(diào)蛋白親和性層析純化的MEPE融合蛋白進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。出人意料的是，重組MEPE不抑制Na+依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者，而以劑量依賴(lài)性方式增加磷酸鹽的吸收(參見(jiàn)圖24)。1000ng/ml時(shí)觀察到雙倍的磷酸鹽吸收(p＜0.001)。以上實(shí)驗(yàn)證明，在人腎細(xì)胞系CL8中，MEPE融合蛋白特異性增加Na+依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)者。
雖然以上通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該明白，可進(jìn)行許多符合本發(fā)明范圍和構(gòu)思的改變和等效替換。而且，根據(jù)特定的情況、材料、物質(zhì)組成、方法步驟，可進(jìn)行許多修正，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的、構(gòu)思或范圍。所有這些修改都包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明參考了在發(fā)明背景、詳細(xì)描述和實(shí)施例部分引用的各篇文獻(xiàn)(包括專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、雜志論文、摘要、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、教科書(shū)等)。而且，附上序列表以供參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)University College London(B)街道Rowland Hill Street(C)城市London(D)郡無(wú)(E)國(guó)家英國(guó)(F)郵政編碼NW3 2PF(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)一種新的肽激素phosphatonin(ⅲ)序列數(shù)量25(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release.#1.0，Version 1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1655bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/代號(hào)CDS(B)位置1..1290(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID N0:1:GTG AAT AAA GAA TAT AGT ATC AGT AAC AAA GAG AAT ACT CAC AAT GGC 48Val Asn Lys Glu Tyr Ser Ile Ser Asn Lys Glu Asn Thr His Asn Gly1 5 10 15CTG AGG ATG TCA ATT TAT CCT AAG TCA ACT GGG AAT AAA GGG TTT GAG 96Leu Arg Met Ser Ile Tyr Pro Lys Ser Thr Gly Asn Lys Gly Phe Glu20 25 30GAT GGA GAT GAT GCT ATC AGC AAA CTA CAT GAC CAA GAA GAA TAT GGC 144Asp Gly Asp Asp Ala Ile Ser Lys Leu His Asp Gln Glu Glu Tyr Gly35 40 45GCA GCT CTC ATC AGA AAT AAC ATG CAA CAT ATA ATG GGG CCA GTG ACT 192Ala Ala Leu Ile Arg Asn Asn Met Gln His Ile Met Gly Pro Val Thr50 55 60GCG ATT AAA CTC CTG GGG GAA GAA AAC AAA GAG AAC ACA CCT AGG AAT 240Ala Ile Lys Leu Leu Gly Glu Glu Asn Lys Glu Asn Thr Pro Arg Asn65 70 75 80GTT CTA AAC ATA ATC CCA GCA AGT ATG AAT TAT GCT AAA GCA CAC TCG 288Val Leu Asn Ile Ile Pro Ala Ser Met Asn Tyr Ala Lys Ala His Ser85 90 95AAG GAT AAA AAG AAG CCT CAA AGA GAT TCC CAA GCC CAG AAA AGT CCA 336Lys Asp Lys Lys Lys Pro Gln Arg Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro100 105 110GTA AAA AGC AAA AGC ACC CAT CGT ATT CAA CAC AAC ATT GAC TAC CTA 384Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu115 120 125AAA CAT CTC TCA AAA GTC AAA AAA ATC CCC AGT GAT TTT GAA GGC AGC 432Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser130 135 140GGT TAT ACA GAT CTT CAA GAG AGA GGG GAC AAT GAT ATA TCT CCT TTC 480Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe145 150 155 160AGT GGG GAC GGC CAA CCT TTT AAG GAC ATT CCT GGT AAA GGA GAA GCT 528Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala165 170 175ACT GGT CCT GAC CTA GAA GGC AAA GAT ATT CAA ACA GGG TTT GCA GGC 576Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala Gly180 185 190CCA AGT GAA GCT GAG AGT ACT CAT CTT GAC ACA AAA AAG CCA GGT TAT 624Pro Ser Glu Ala Glu Ser Thr His Leu Asp Thr Lys Lys Pro Gly Tyr195 200 205AAT GAG ATC CCA GAG AGA GAA GAA AAT GGT GGA AAT ACC ATT GGA ACT 672Asn Glu Ile Pro Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gly Asn Thr Ile Gly Thr210 215 220AGG GAT GAA ACT GCG AAA GAG GCA GAT GCT GTT GAT GTC AGC CTT GTA 720Arg Asp Glu Thr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Val Asp Val Ser Leu Val225 230 235 240GAG GGC AGC AAC GAT ATC ATG GGT AGT ACC AAT TTT AAG GAG CTC CCT 768Glu Gly Ser Asn Asp Ile Met Gly Ser Thr Asn Phe Lys Glu Leu Pro245 250 255GGA AGA GAA GGA AAC AGA GTG GAT GCT GGC AGC CAA AAT GCT CAC CAA 816Gly Arg Glu Gly Asn Arg Val Asp Ala Gly Ser Gln Asn Ala His Gln260 265 270GGG AAG GTT GAG TTT CAT TAC CCT CCT GCA CCC TCA AAA GAG AAA AGA 864Gly Lys Val Glu Phe His Tyr Pro Pro Ala Pro Ser Lys Glu Lys Arg275 280 285AAA GAA GGC AGT AGT GAT GCA GCT GAA AGT ACC AAC TAT AAT GAA ATT 912Lys Glu Gly Ser Ser Asp Ala Ala Glu Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ile290 295 300CCT AAA AAT GGC AAA GGC AGT ACC AGA AAG GGT GTA GAT CAT TCT AAT 960Pro Lys Asn Gly Lys Gly Ser Thr Arg Lys Gly Val Asp His Ser Asn305 310 315 320AGG AAC CAA GCA ACC TTA AAT GAA AAA CAA AGG TTT CCT AGT AAG GGC 1008Arg Asn Gln Ala Thr Leu Asn Glu Lys Gln Arg Phe Pro Ser Lys Gly325 330 335AAA AGT CAG GGC CTG CCC ATT CCT TCT CGT GGT CTT GAT AAT GAA ATC 1056Lys Ser Gln Gly Leu Pro Ile Pro Ser Arg Gly Leu Asp Asn Glu Ile340 345 350AAA AAC GAA ATG GAT TCC TTT AAT GGC CCC AGT CAT GAG AAT ATA ATA 1104Lys Asn Glu Met Asp Ser Phe Asn Gly Pro Ser His Glu Asn Ile lle355 360 365ACA CAT GGC AGA AAA TAT CAT TAT GTA CCC CAC AGA CAA AAT AAT TCT 1152Thr His Gly Arg Lys Tyr His Tyr Val Pro His Arg Gln Asn Asn Ser370 375 380ACA CGG AAT AAG GGT ATG CCA CAA GGG AAA GGC TCC TGG GGT AGA CAA 1200Thr Arg Asn Lys Gly Met Pro Gln Gly Lys Gly Ser Trp Gly Arg Gln385 390 395 400CCC CAT TCC AAC AGG AGG TTT AGT TCC CGT AGA AGG GAT GAC AGT AGT 1248Pro His Ser Asn Arg Arg Phe Ser Ser Arg Arg Arg Asp Asp Ser Ser405 410 415GAG TCA TCT GAC AGT GGC AGT TCA AGT GAG AGC GAT GGT GAC 1290Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser Asp Gly Asp420 425 430TAGTCCACCA GGAGTTCCCA GCGGGGTGAC AGTCTGAAGA CCTCGTCACC TGTGAGTTGA 1350TGTAGAGGAG AGCCACCTGA CAGCTGACCA GGTGAAGAGA GGATAGAGTG AAGAACTGAG 1410TGAGCCAAGA ATCCTGGTCT CCTTGGGGGA ATTTTTGCTA TCTTAATAGT CACAGTATAA 1470AATTCTATTA AAGGCTATAA TGTTTTTAAG CAAAAAAAAA TCATTACAGA TCTATGAAAT 1530AGGTAACATT TGAGTAGGTG TCATTTAAAA ATAGTTGGTG AATGTCACAA ATGCCTTCTA 1590TGTTGTTTGC TCTGTAGACA TGAAAATAAA CAATATCTCT CGATGATAAA AAAAAAAAAA 1650AAAAA 1655(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度430氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Val Asn Lys Glu Tyr Ser Ile Ser Asn Lys Glu Asn Thr His Asn Gly1 5 10 15Leu Arg Met Ser Ile Tyr Pro Lys Ser Thr Gly Asn Lys Gly Phe Glu20 25 30Asp Gly Asp Asp Ala Ile Ser Lys Leu His Asp Gln Glu Glu Tyr Gly35 40 45Ala Ala Leu Ile Arg Asn Asn Met Gln His Ile Met Gly Pro Val Thr50 55 60Ala Ile Lys Leu Leu Gly Glu Glu Asn Lys Glu Asn Thr Pro Arg Asn65 70 75 80Val Leu Asn Ile Ile Pro Ala Ser Met Asn Tyr Ala Lys Ala His Ser85 90 95Lys Asp Lys Lys Lys Pro Gln Arg Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro100 105 110Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu115 120 125Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser130 135 140Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe145 150 155 160Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala165 170 175Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala Gly180 185 190Pro Ser Glu Ala Glu Ser Thr His Leu Asp Thr Lys Lys Pro Gly Tyr195 200 205Asn Glu Ile Pro Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gly Asn Thr Ile Gly Thr210215 220Arg Asp Glu Thr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Val Asp Val Ser Leu Val225 230 235 240Glu Gly Ser Asn Asp Ile Met Gly Ser Thr Asn Phe Lys Glu Leu Pro245 250 255Gly Arg Glu Gly Asn Arg Val Asp Ala Gly Ser Gln Asn Ala His Gln260 265 270Gly Lys Val Glu Phe His Tyr Pro Pro Ala Pro Ser Lys Glu Lys Arg275 280 285Lys Glu Gly Ser Ser Asp Ala Ala Glu Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ile290 295 300Pro Lys Asn Gly Lys Gly Ser Thr Arg Lys Gly Val Asp His Ser Asn305 310 315 320Arg Asn Gln Ala Thr Leu Asn Glu Lys Gln Arg Phe Pro Ser Lys Gly325 330 335Lys Ser Gln Gly Leu Pro Ile Pro Ser Arg Gly Leu Asp Asn Glu Ile340 345 350Lys Asn Glu Met Asp Ser Phe Asn Gly Pro Ser His Glu Asn Ile Ile355 360 365Thr His Gly Arg Lys Tyr His Tyr Val Pro His Arg Gln Asn Asn Ser370 375 380Thr Arg Asn Lys Gly Met Pro Gln Gly Lys Gly Ser Trp Gly Arg Gln385 390 395 400Pro His Ser Asn Arg Arg Phe Ser Ser Arg Arg Arg Asp Asp Ser Ser405 410 415Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser Asp Gly Asp420 425 430(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度4氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Ser Gly Asp Gly1(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度7氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Ala Asp Ala Val Asp Val Ser1 5(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Ser Ser Arg Arg Arg Asp Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser1 5 10 15Ser Ser Glu Ser Asp Gly20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Ser Ser Arg Ser Lys Glu Asp Ser Asn Ser Thr Glu Ser Lys Ser Ser1 5 10 15Ser Glu Glu Asp Gly20(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度38bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GACGACGACA AGGTGAATAA AGAATATAGT ATCAGTAA 38(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GGAACAAGAC CCGTCTAGTC ACCATCGCTC TCACT 35(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Asp Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser15 10 15(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Asp Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Ser Ser Arg Arg Arg Asp Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser1 5 10 15Ser Ser Glu Ser Asp Gly20(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Asp Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Asn Ser Ser Ser Asp Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Asp Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Asp Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu Ser Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu Ser Asp1 5 10(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Asp1 5 10(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp771 510(2)SEQ ID NO:22的信息:(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:Ser Ser Arg Ser Lys Glu Asp Ser Asn Ser Thr Glu Ser Lys Ser Ser15 10 15Ser Glu Glu Asp Gly20(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:GGTTATACAG ATCTTCAAGA GAGAG 25(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅲ)假設(shè)是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:GTTGGTACTT TCAGCTGCAT CACT2權(quán)利要求
1．一種分離或基本純形式的多肽，具有phosphatonin活性。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，它在SDS-PAGE上測(cè)得的分子量為53-60kDa。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，它在pH7的bis-tri SDS-PAGE上測(cè)得的分子量為200kDa。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的多肽，它是糖基化和/或磷酸化的。
5．根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的多肽，它自Saos-2細(xì)胞(保藏號(hào)ECACC 89050205)純化得到的。
6．權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的多肽或其免疫活性片段和/或生物學(xué)活性片段，編碼其所含氨基酸序列的聚核苷酸選自(a)編碼至少含氨基酸序列SEQ ID NO:2(圖8)的該多肽成熟形式的聚核苷酸；(b)含編碼序列SEQ ID NO:1(圖8)，編碼至少該多肽成熟形式的聚核苷酸；(c)聚核苷酸(a)或(b)所編碼的多肽因其氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或增加而衍生得到的多肽的編碼聚核苷酸；(d)含有與(a)至(c)中任一聚核苷酸雜交的互補(bǔ)鏈的聚核苷酸；(e)所編碼的多肽與(a)至(d)中任一聚核苷酸所編碼的多肽具有60％或更高氨基酸序列一致性的聚核苷酸；(f)所編碼的多肽能夠調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的聚核苷酸，該多肽含有(a)至(e)中任一聚核苷酸所編碼多肽的片段或帶表位部分；(g)編碼phosphatonin多肽的帶表位部分的聚核苷酸，所述的帶表位部分包含SEQ ID NO:2(圖8)中的1-40,141-180和/或401-429氨基酸殘基；(h)包含(a)至(g)任一聚核苷酸中至少15個(gè)核苷酸，并編碼一段能調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的多肽的聚核苷酸；(i)編碼能調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝的多肽的聚核苷酸，該多肽含有(a)至(h)中任一聚核苷酸所編碼多肽的細(xì)胞和/或糖胺聚糖結(jié)合基序和/或骨礦化基序；(j)因遺傳密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生的(a)至(i)中任一聚核苷酸的簡(jiǎn)并性聚核苷酸。
7．根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多肽，它能夠調(diào)節(jié)磷酸鹽的代謝。
8．一種分離的聚核苷酸，它編碼權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)中所述的多肽。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的聚核苷酸，包括RNA或DNA。
10．根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的聚核苷酸，其中的核苷酸序列具有C末端或N末端的連續(xù)核苷酸缺失。
11．一種聚核苷酸，它與權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的聚核苷酸雜交，它編碼權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述多肽的喪失了至少部分phosphatonin活性的突變體。
12．一種載體，它含有權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的聚核苷酸。
13．一種宿主細(xì)胞，由權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的聚核苷酸，權(quán)利要求12所述的載體基因工程構(gòu)建而成，或者該細(xì)胞是通過(guò)在宿主細(xì)胞內(nèi)引入一段表達(dá)調(diào)空序列介導(dǎo)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述多肽的基因的表達(dá)而得到的。
14．一種分離phosphatonin多肽的方法，它的步驟包括(a)培養(yǎng)腫瘤-條件培養(yǎng)基或骨肉瘤細(xì)胞，在血清補(bǔ)充培養(yǎng)基(DMEMEagles/10％FCS/谷胺酰胺/抗真菌素(DMFCS))中培養(yǎng)至鋪滿(mǎn)；(b)隔天將上述細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM Eagles/谷胺酰胺/抗真菌素(DM)中培養(yǎng)5小時(shí)；(c)收獲無(wú)血清條件培養(yǎng)基，將其與細(xì)胞分開(kāi)，在pH7.2,0.06M磷酸鈉和0.5M NaCl(PBS)中平衡條件培養(yǎng)基；(d)將(c)獲得的培養(yǎng)基上樣到平衡過(guò)的伴刀豆蛋白A瓊脂糖柱上；(e)用PBS充分洗柱；(f)用加有0.5Mα-甲基-D吡喃葡萄糖的PBS洗伴刀豆蛋白A柱；(g)對(duì)(f)得到的洗脫物質(zhì)進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析；(h)用0.5M NaCl洗脫含phosphatonin多肽的組份。
15．一種生產(chǎn)具有phosphatonin生物學(xué)活性和/或免疫活性的多肽的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，和從培養(yǎng)物中回收所述聚核苷酸所編碼的多肽。
16．一種多肽，它是用權(quán)利要求14或15所述的方法獲得的，或者是通過(guò)蛋白酶剪切權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述phosphatonin多肽而獲得的，或者是用PHEX金屬肽酶進(jìn)行權(quán)利要求14或15所述方法而獲得的。
17．根據(jù)權(quán)利要求1至7或權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的多肽，它至少具有以下活性之一(a)能夠下調(diào)鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)；(b)能夠上調(diào)腎25-羥基維生素D3-24-羥化酶；和/或(c)能夠下調(diào)腎25-羥基-D-1-α-羥化酶。
18．根據(jù)權(quán)利要求1至7或權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的多肽，它至少具有以下活性之一(a)能夠上調(diào)鈉依賴(lài)性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)；(b)能夠下調(diào)腎25-羥基維生素D3-24-羥化酶；和/或(c)能夠上調(diào)腎25-羥基-D-1-α-羥化酶。
19．根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽，它喪失了至少一種權(quán)利要求17或18所述活性。
20．一種分離的抗體，它特異性結(jié)合權(quán)利要求1至7或16至19中任一項(xiàng)所述的分離的多肽。
21．一種核酸分子，至少有15個(gè)核苷酸，特異性地與權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的聚核苷酸或其互補(bǔ)鏈雜交。
22．一段分離的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列，它調(diào)節(jié)含權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述聚核苷酸的核酸分子的表達(dá)。
23．一種重組DNA分子，它包含權(quán)利要求22所述的調(diào)節(jié)序列。
24．一種治療與磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況的方法，包括給予哺乳動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1至7或16至19中任一項(xiàng)所述的多肽，或權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的聚核苷酸，或權(quán)利要求11所述的載體，或權(quán)利要求20所述的抗體。
25．一種診斷已患或易患磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)病理狀況的方法，包括(a)檢測(cè)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的聚核苷酸內(nèi)是否發(fā)生突變；和(b)根據(jù)是否發(fā)生上述突變來(lái)診斷已患或易患所述病理狀況。
26．一種診斷已患或易患磷酸鹽代謝紊亂相關(guān)病理狀況的方法，包括(a)檢測(cè)生物樣品內(nèi)權(quán)利要求1至7或16至19中任一項(xiàng)所述的多肽是否表達(dá)或其表達(dá)量；和(b)根據(jù)所述肽是否表達(dá)或其表達(dá)量來(lái)診斷已患或易患所述病理狀況。
27．一種鑒定phosphatonin多肽的結(jié)合伙伴的方法(a)將權(quán)利要求1至7或16至19中任一項(xiàng)所述的多肽與待篩選化合物接觸；和(b)檢測(cè)該化合物是否激發(fā)所述肽的活性。
28．一種鑒定和獲得治療磷酸鹽代謝紊亂的候選藥物的方法，其步驟包括(a)在磷酸鹽代謝許可性條件下，在能夠應(yīng)磷酸鹽吸收而發(fā)出可測(cè)信號(hào)的物質(zhì)的存在下，將權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的多肽或表達(dá)所述多肽的細(xì)胞與待篩選候選藥物一起培養(yǎng)；和(b)檢測(cè)是否有磷酸鹽代謝信號(hào)或該信號(hào)的增強(qiáng)，信號(hào)的存在或增強(qiáng)說(shuō)明是推定藥物。
29．一種生產(chǎn)治療藥物的方法，包括權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)所述的步驟；和(ⅰ)合成步驟(b)所得到或鑒定到的化合物或其類(lèi)似物或衍生物，合成量應(yīng)足以向患者提供治療有效量；和/或(ⅱ)將成步驟(b)所得到或鑒定到的化合物或其類(lèi)似物或衍生物與藥學(xué)上認(rèn)可的載體混合。
30．磷酸鹽代謝的活化劑/激動(dòng)劑或抑制劑/拮抗劑或phosphatonin的結(jié)合伙伴，它是以權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)所述的方法獲得的。
31．一種組合物，它包含權(quán)利要求1至7或16至19中任一項(xiàng)所述的多肽，權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的聚核苷酸，權(quán)利要求12所述的載體，權(quán)利要求20所述的抗體，權(quán)利要求21所述的核酸分子或權(quán)利要求30所述的活化劑/激動(dòng)劑、抑制劑/拮抗劑或結(jié)合伙伴。
32．根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，它是一種藥物組合物，還包含藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑、稀釋劑或載體。
33．根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，它是一種診斷用組合物，還包含檢測(cè)工具。
34．權(quán)利要求1至7或16至19中任一項(xiàng)所述的多肽，或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA，或權(quán)利要求30所述的活化劑/激動(dòng)劑、結(jié)合伙伴，或權(quán)利要求20所述的抗體的用途，即用于制備治療磷酸鹽代謝疾病的藥物。
35．權(quán)利要求1至7或16或17或19中任一項(xiàng)所述的多肽，或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA，或權(quán)利要求30所述的活化劑/激動(dòng)劑、結(jié)合伙伴，或權(quán)利要求20所述的抗體的用途，即用于制備治療血磷酸鹽過(guò)多癥的藥物。
36．權(quán)利要求1至7或16或17或19中任一項(xiàng)所述的多肽，或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA，或權(quán)利要求30所述的活化劑/激動(dòng)劑、結(jié)合伙伴，或權(quán)利要求20所述的抗體的用途，即用于制備在腎透析/預(yù)透析中治療腎病性骨營(yíng)養(yǎng)不良、血磷酸鹽過(guò)多癥，治療繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)或囊狀纖維性骨炎的藥物。
37．權(quán)利要求1至7或16或18或19中任一項(xiàng)所述的多肽，或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA，或權(quán)利要求20所述的抗體，權(quán)利要求21所述的核酸分子，或權(quán)利要求30所述的抑制劑/拮抗劑的用途，即用于制備療血磷酸鹽過(guò)少癥的藥物。
38．權(quán)利要求1至7或16或18或19中任一項(xiàng)所述的多肽，或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA，或權(quán)利要求20所述的抗體，權(quán)利要求21所述的核酸分子，或權(quán)利要求30所述的抑制劑/拮抗劑的用途，即用于制備治療X染色體聯(lián)鎖的血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病、伴有尿鈣過(guò)多的遺傳性血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病(HHRH)、礦質(zhì)過(guò)少性骨損傷、青少年發(fā)育遲緩、瘤原性血磷酸鹽過(guò)少性骨軟化、腎病性磷酸鹽漏失、腎病性骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨質(zhì)疏松、耐維生素D性佝僂病、終末器官抗性、腎病性Fanconi綜合癥、常染色體性佝僂病、佩吉特(Paget＇s)病、腎衰竭、腎小管酸中毒、囊性纖維化或口炎性腹瀉的藥物。
39．權(quán)利要求1至7或16或18或19中任一項(xiàng)所述的多肽，或編碼并能表達(dá)所述多肽的DNA，或權(quán)利要求20所述的抗體，權(quán)利要求21所述的核酸分子，或權(quán)利要求30所述的抑制劑/拮抗劑的用途，即用于制備治療骨礦質(zhì)流失的藥物。
40．權(quán)利要求1至7或16或18或19中任一項(xiàng)所述的多肽和PHEX金屬肽酶的用途，即用于制備治療磷酸鹽代謝紊亂性疾病。
41．能夠過(guò)表達(dá)phosphatonin的轉(zhuǎn)化成骨細(xì)胞或轉(zhuǎn)化骨細(xì)胞系的用途，即用于生產(chǎn)phosphatonin。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人蛋白,稱(chēng)phosphatonin,以及編碼該蛋白的聚核苷酸。本發(fā)明還提供載體、宿主細(xì)胞、抗體和該人蛋白的重組生產(chǎn)方法。本發(fā)明還涉及診斷和治療與這種新的人蛋白相關(guān)的疾病的方法。
文檔編號(hào)A61P19/08GK1308677SQ99806361
公開(kāi)日2001年8月15日 申請(qǐng)日期1999年5月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月18日
發(fā)明者彼得·羅維 申請(qǐng)人:倫敦大學(xué)專(zhuān)科學(xué)院