專利名稱：：生理活性多肽的緩釋制劑及其生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含生理活性多肽的緩釋制劑及其生產(chǎn)方法。例如，生長激素(以下有時(shí)稱作GH)，它是一種最初在垂體腺前部產(chǎn)生并分泌的代表性激素，它是具有多種不同生理活性的多肽，如促進(jìn)機(jī)體生長、葡萄糖和脂質(zhì)的代謝、蛋白質(zhì)的合成代謝及細(xì)胞的增殖和分化。并且最近在基因重組
技術(shù)領(lǐng)域：
，利用大腸桿菌大規(guī)模生產(chǎn)GH，并在世界范圍內(nèi)應(yīng)用于臨床醫(yī)藥。然而由于GH生物半衰期短，為了保持有效的血液濃度，必須頻繁給藥。尤其是垂體性侏儒癥，幾乎在數(shù)月至10年或更久的長時(shí)間內(nèi)，每天給嬰幼兒或年輕患者皮下注射給藥。JP-A3055/1966(EP-A633030)公開了一種生產(chǎn)緩釋制劑的方法以及用這種方法制備的緩釋微膠囊，所述方法包括使水溶性多肽滲入可生物降解的基質(zhì)中，后者包含可生物降解的聚合物和脂肪酸金屬鹽的水溶液。JP-A217691/1996(WO96/07399)公開了用水溶性肽類生理活性物質(zhì)和氯化鋅水溶液等生產(chǎn)水溶性或略溶于水的多價(jià)金屬鹽，以及生產(chǎn)含有這種鹽和可生物降解聚合物的緩釋制劑的方法。WO94/12158公開了添加聚合物侵蝕速率調(diào)制劑如氫氧化鋅至聚合物溶液中，氫氧化鋅相對于聚合物的量為0.1-30％(w/w)，用作生產(chǎn)包含人GH(以下有時(shí)稱hGH)和可生物降解聚合物的緩釋制劑的方法。該公布進(jìn)一步公開了通過噴霧一種hGH和聚合物的有機(jī)溶劑溶液至液態(tài)氮中并保留生物活性，從而生產(chǎn)為有孔顆粒的微膠囊的方法。WO92/17200和NatureMedicine，第2卷，第795頁(1996)公開了利用人GH的鋅鹽生產(chǎn)緩釋制劑的方法。WO95/29664公開了生產(chǎn)緩釋微膠囊的方法，它包括以下步驟將金屬鹽如固態(tài)的碳酸鋅分散入聚合物溶液中，加入生理活性物質(zhì)(激素等)并將生理活性物質(zhì)和金屬陽離子組分分別分散入可生物降解的聚合物中。雖然如上所述，作了各種償試以生產(chǎn)保留生理活性多肽的生理活性的緩釋制劑，但仍未獲得臨床上令人滿意的制劑，因?yàn)橛行┥砘钚远嚯拇嬖诟鞣N問題如生理活性多肽在制劑中包裹率(entrapmentrate)低、在給藥后初始階段過量釋放、不能在長時(shí)間內(nèi)達(dá)到恒定釋放或不能在長時(shí)間內(nèi)保持滿意的血液濃度。而且在許多情況下，生產(chǎn)方法不符合在目前條件下大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化前提。在采用一種直接將生理活性多肽粉(固相以下稱為S相)加入并分散入溶解聚合物的有機(jī)溶劑(O相)中獲得的稱為S/O的乳劑，生產(chǎn)緩釋制劑的方法中，以相對穩(wěn)定形式包裹生理活性多肽是可能的。然而，需要將大量的生理活性多肽有效處理成為固體，且在緩釋制劑的生產(chǎn)過程中存在許多問題，如S/O分散體中粉末顆粒大小的控制是必要的，因?yàn)轭w粒大小顯著影響所獲得的緩釋制劑的質(zhì)量。因此，要求有一種除了解決如保持生理活性多肽的穩(wěn)定性、制備具有處理優(yōu)勢的粉末、在生產(chǎn)該制劑過程中霧化粉末等問題外，還能夠大規(guī)模高產(chǎn)率生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的緩釋制劑的方法。發(fā)明的公開本發(fā)明人研究解決上述問題，并且出乎意料地首次發(fā)現(xiàn)這樣的事實(shí)生理活性多肽粉除在生產(chǎn)所述制劑過程中具有處理優(yōu)勢外，其顆粒小，同時(shí)通過在生理活性多肽的水溶液中加入水混溶性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽，并將所得溶液冷凍干燥，從而保持所述多肽的生理活性。而且本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了將按上述制得的生理活性肽分散入溶解了可生物降解聚合物溶解入有機(jī)溶劑的溶液中，再除去有機(jī)溶劑以生產(chǎn)緩釋制劑，從而可以提高制劑的包裹比率和緩釋效果這一事實(shí)。如上所述，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明與以下有關(guān)(1)生產(chǎn)緩釋制劑的一種方法，它包括將生理活性多肽分散入可生物降解聚合物有機(jī)溶劑溶液中，并去除有機(jī)溶劑；其中所述多肽是由其水溶液冷凍干燥獲得的多肽粉末，所述水溶液含有水混溶性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽。(2)按照上述(1)的方法，其中所述粉末的平均顆粒大小不超過10μm；(3)按照上述(1)的方法，其中所述生理活性多肽是生長激素；(4)按照上述(3)的方法，其中所述生長激素是人生長激素；(5)按照上述(1)的方法，其中所述水混溶性有機(jī)溶劑是醇；(6)按照上述(5)的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇；(7)按照上述(5)的方法，其中所述醇是乙醇；(8)按照上述(1)的方法，其中所述揮發(fā)性鹽是銨鹽；(9)按照上述(8)的方法，其中所述銨鹽是醋酸銨、碳酸氫銨或碳酸銨；(10)按照上述(8)的方法，其中所述銨鹽是醋酸銨；(11)按照上述(5)的方法，其中加入至生理活性多肽水溶液中的醇終濃度是0.03-0.5％(V/V)；(12)按照上述(8)的方法，其中鹽與生理活性多肽的摩爾比是10-80；(13)按照上述(1)的方法，其中所述可生物降解聚合物是乳酸/乙醇酸聚合物；(14)按照上述(13)的方法，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物的乳酸/乙醇酸的摩爾比例是100/0至40/60；(15)按照上述(13)的方法，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物重均分子量是3,000至50,000；(16)按照上述(13)的方法，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物為多價(jià)金屬鹽形式；(17)按照上述(16)的方法，其中所述多價(jià)金屬是鋅；(18)按照上述(1)的方法，其中所述緩釋制劑是微膠囊；(19)按照上述(18)的方法，其中所述微膠囊的平均顆粒大小是0.1μm-300μm；(20)按照上述(1)的方法，其中所述緩釋制劑為注射用；(21)用按上述(1)的方法生產(chǎn)的緩釋制劑；(22)生產(chǎn)生理活性多肽粉末的方法，包括將(ⅰ)水混溶性有機(jī)溶劑和/或(ⅱ)揮發(fā)性鹽加至生理活性多肽的水溶液中，并冷凍干燥所得溶液；(23)用按上述(22)的方法得到的生理活性多肽粉末；(24)按照上述(23)的生理活性多肽粉末，其中所述粉末的平均顆粒大小不超過10μm；(25)按照上述(23)的生理活性多肽粉末用于生產(chǎn)藥物的用途；(26)(ⅰ)水混溶性有機(jī)溶劑和/或(ⅱ)揮發(fā)性鹽用于生產(chǎn)小顆粒的生理活性多肽粉末的用途；(27)按上述(26)的(ⅰ)水混溶性有機(jī)溶劑和/或(ⅱ)揮發(fā)性鹽的用途，其中所述顆粒大小不超過10μm；(28)可用上述(1)中所述方法獲得的緩釋制劑；(29)含生理活性多肽和可生物降解聚合物的多價(jià)金屬鹽的緩釋制劑，其中所述初始釋放比例不超過40％；(30)按照上述(29)的緩釋制劑，其中所述生理活性多肽為粉末形式，其平均顆粒大小不超過10μm；(31)按照上述(29)的緩釋制劑，其中所述生理活性多肽是生長激素；(32)按照上述(29)的緩釋制劑，其中所述可生物降解聚合物是乳酸/乙醇酸聚合物；(33)按照上述(29)的緩釋制劑，其中所述緩釋制劑是微膠囊；(34)按照上述(33)的緩釋制劑，其中所述微膠囊的平均顆粒大小為0.1-300μm；(35)按照上述(29)的緩釋制劑，它可在一周至一月的時(shí)間段內(nèi)有效釋放生理活性多肽；(36)按照在上述(29)的緩釋制劑，它含有0.1-30％(w/w)的所述生理活性多肽。在本發(fā)明中所使用的可生物降解聚合物實(shí)例包括采取無催化劑的脫水縮聚作用、由一種或多種α-羥基羧酸(如乙醇酸、乳酸等)、羥基二羧酸(如蘋果酸等)、羥基三羧酸(如檸檬酸等)所合成并具有游離的羧基的聚合物及其混合物，聚α-氰基丙烯酸酯、聚氨基酸(聚-γ-苯甲基-L谷氨酸等)和馬來酸酐共聚物(如苯乙烯/馬來酸共聚物等)。聚合物可以是均聚物或共聚物。聚合作用可以是無規(guī)、嵌段或接枝型。當(dāng)上述α-羥基羧酸、羥基二羧酸和羥基三羧酸在其分子結(jié)構(gòu)中具有光學(xué)活性中心時(shí)，它們可以具有D-,L-或DL構(gòu)型。在這些聚合物中，具有游離的末端羧基基團(tuán)的可生物降解的聚合物如由α-羥基羧酸(如乙醇酸、乳酸等)合成的聚合物(如乳酸/乙醇酸共聚物、聚乳酸等)和聚-α-氰基丙烯酸酯是優(yōu)選的?？缮锝到獾木酆衔锔鼉?yōu)選由α-羥基羧酸等合成的聚合物，特別優(yōu)選乳酸/乙醇酸共聚物等。在本說明書中，乳酸/乙醇酸共聚物及均聚物如聚乳酸和聚乙醇酸有時(shí)就簡稱為乳酸/乙醇酸聚合物。當(dāng)所用的可生物降解的聚合物是乳酸/乙醇酸聚合物(乳酸/乙醇酸共聚物或均聚物)時(shí)，其組成比例(mol％)優(yōu)選約100/0至約40/60，更優(yōu)選約85/15至約50/50。上述乳酸/乙醇酸聚合物的重均分子量優(yōu)選為約3,000-50,000，更優(yōu)選約3,000-25,000，進(jìn)一步更優(yōu)選約5,000-20,000。乳酸/乙醇酸聚合物的分散度(重均分子量/數(shù)均分子量)優(yōu)選為約1.2-4.0，更優(yōu)選約1.5-3.5。對于重均分子量和分散度，本說明書堅(jiān)持前者根據(jù)聚苯乙烯的凝膠透析色譜法(GPC)，以9種重均分子量分別為120,000、52,000、22,000、9,200、5,050、2,950、1,050、580和162的聚苯乙烯作為參考物質(zhì)測得的苯乙烯，并由此計(jì)算出后者。上述測量采用KF804L×2GPC柱(由日本ShowaDenko制造)和一個(gè)L-3300RJ監(jiān)測器(日本Hitachi有限公司出品)進(jìn)行，以氯仿作為流動(dòng)相。含有末端游離羧基的可生物降解的聚合物是其中基于GPC測量的數(shù)均分子量和基于末端基團(tuán)定量的數(shù)均分子量幾乎互相一致的可生物降解的聚合物?；谀┒嘶鶊F(tuán)定量的數(shù)量-分子量按如下計(jì)算將約1-3克可生物降解的聚合物溶解在丙酮(25ml)和甲醇(5ml)的混合溶劑中，并迅速在室溫下(20℃)邊攪拌，邊以0.05N的氫氧化鉀醇溶液滴定該溶液，用酚酞作指示劑，以確定羧基基團(tuán)的含量?；谀┒嘶鶊F(tuán)定量的數(shù)均分子量按如下公式計(jì)算基于末端基團(tuán)定量的數(shù)均分子量=20000×A/BA可生物降解的聚合物重量質(zhì)量(g)B到達(dá)滴定終點(diǎn)時(shí)所加的0.05N氫氧化鉀醇溶液的量(ml)盡管基于末端基團(tuán)定量的數(shù)均分子量是絕對值，但是基于GPC測量值是相對值，依不同的分析條件(如流動(dòng)相的種類、柱子的種類、參照物質(zhì)、選定的切片寬度、選定的基線等)而異，因此難以絕對數(shù)量表示這兩個(gè)值。然而，基于GPC測量的數(shù)均分子量和基于末端基團(tuán)定量的數(shù)均分子量的描述幾乎一致，例如在由一種或多種α-羥基羧酸合成的聚合物中，基于末端基團(tuán)定量的數(shù)均分子量是基于GPC測量的數(shù)均分子量的約0.5-2倍的范圍內(nèi)，最好是約0.7-1.5倍。例如，對于具有游離的末端羧基，并由一種或多種α-羥基羧酸通過無觸媒的脫水縮聚作用合成的聚合物，基于GPC測量的數(shù)均分子量和基于末端基團(tuán)定量的數(shù)均分子量幾乎相一致。另一方面，對于大體上無游離的末端羧基并用觸媒由環(huán)形二聚體通過開環(huán)聚合而合成的聚合物，基于末端基團(tuán)定量的數(shù)均分子量明顯高于(約2倍或2倍以上)基于GPC測量的數(shù)均分子量。該差別使得清楚區(qū)分具有游離的末端羧基的聚合物和無游離的末端羧基的聚合物成為可能?？赏ㄟ^本身已知的方法如在JP-A28521/1986中所描述的方法(如通過無觸媒的脫水縮聚反應(yīng)或在無機(jī)固體酸觸媒存在下，脫水縮聚反應(yīng)的方法)生產(chǎn)具有游離末端羧基基團(tuán)的乳酸/乙醇酸聚合物。乳酸/乙醇酸聚合物的分解/消除速率依組成比率或重均分子量有很大的差異。因?yàn)槿樗?乙醇酸聚合物的分解/消除通常隨著乙醇酸比率的增加而延遲，可通過降低乙醇酸的比例或增加分子量而延長生理活性多肽的釋放期(如延長至約6個(gè)月)。相反，通過增加乙醇酸的比例或降低分子量可縮短藥物釋放期(如縮短至約一周)。為了獲得能夠在一周到2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)有效釋放生理活性多肽的緩釋制劑，最好使用組成比例和重均分子量在上述范圍內(nèi)的乳酸/乙醇酸聚合物。因此，本發(fā)明中使用的可生物降解聚合物的成分最好按所需生理活性多肽的種類和所期望的作用期限作選擇。在一個(gè)具體實(shí)施例中，例如當(dāng)使用GH作為生理活性多肽時(shí)，可生物降解聚合物優(yōu)選乳酸/乙醇酸聚合物，更優(yōu)選乳酸/乙醇酸共聚物。在乳酸/乙醇酸共聚物中，乳酸/乙醇酸組成比例(mol％)最好是約85/15-50/50，更優(yōu)選約75/25-50/50。乳酸/乙醇酸共聚物的重均分子量優(yōu)選約8,000至約20,000，更優(yōu)選約10,000至約20,000。而且乳酸/乙醇酸聚合物的分散度(重均分子量/數(shù)均分子量)優(yōu)選為約1.2至4.0，更優(yōu)選約1.5至3.5。所使用的乳酸/乙醇酸聚合物可用已知的方法生產(chǎn)，如上面公開中所描述的方法等。所述聚合物最好是通過無觸媒的脫水縮聚生產(chǎn)的聚合物。最好是使用基于末端基團(tuán)定量的數(shù)均分子量和基于GPC測量的數(shù)均分子量幾乎相互一致的乳酸/乙醇酸聚合物(PLGA)。而且，組成比例和/或重均分子量各異的兩類乳酸/乙醇酸聚合物可以給定比例的混合物使用。典型的例子是乳酸/乙醇酸聚合物和乳酸/乙醇酸共聚物的混合物，其中乳酸/乙醇酸聚合物的乳酸/乙醇酸組成比例(摩爾％)約為75/25且重均分子量約為10,000，在而乳酸/乙醇酸共聚物中乳酸/乙醇酸的組成比例(摩爾％)約為50/50，且重均分子量約為12,000。這些混合物的共聚物的優(yōu)選重量比分別為約25/75至75/25。在本發(fā)明中所使用的可生物降解聚合物可以是上面提到的可生物降解聚合物的金屬鹽。例如，可使用所述可生物降解聚合物的各種多價(jià)金屬鹽及在WO97/01331中所描述的類似物質(zhì)。可優(yōu)選使用乳酸/乙醇酸聚合物的多價(jià)金屬鹽等(更優(yōu)選鋅鹽、鈣鹽，鎂鹽等，進(jìn)一步更優(yōu)勢鋅鹽等)。在本發(fā)明中所使用的多價(jià)金屬鹽中的金屬，只要不引起活體的任何副反應(yīng)，就不特別受限制。以多價(jià)金屬作為實(shí)例，例如二價(jià)鹽(如鐵、鋅、銅、鈣、鎂、鋁、錫、錳等)、三價(jià)鹽(如鐵、鋁、錳等)、四價(jià)鹽(如錫等)等。在本說明書中，可生物降解的聚合物當(dāng)為其金屬鹽的情況下有時(shí)也稱為可生物降解的聚合物。例如乳酸/乙醇酸聚合物當(dāng)為其多價(jià)金屬鹽時(shí)有時(shí)也稱作乳酸/乙醇酸聚合物。上面可生物降解的聚合物的多價(jià)金屬鹽可由WO97/01331中所述的方法或其它以該方法為依據(jù)的方法制得。在可生物降解的多價(jià)金屬鹽為鋅鹽的情況下，它可通過可生物降解的聚合物與氧化鋅在有機(jī)溶劑中的反應(yīng)而制備。在上述方法中，首先可生物降解的聚合物-氧化鋅復(fù)合物的有機(jī)溶劑溶液通過可生物降解的聚合物與氧化鋅在有機(jī)溶劑中共存而制得。在這種情況下，雖然溶劑中可生物降解的聚合物的濃度依賴于它的分子量或有機(jī)溶劑的種類等，但是例如該濃度約是0.1至80％(w/w)，優(yōu)選約為1-70％(w/w)，更優(yōu)選約2-60％(w/w)。雖然所加氧化鋅的量依有機(jī)溶劑的種類而不同，例如該數(shù)量為基于可生物降解的聚合物量的約0.001-2％(w/w)，優(yōu)選約0.01-1.5％(w/w)，更優(yōu)選約0.1-1％(w/w)，如JP-A231252/1998中所描述。按可生物降解的聚合物和氧化鋅順秩加入至有機(jī)溶劑中，粉末狀或懸浮在有機(jī)溶劑中的氧化鋅可加入到通過溶解可生物降解聚合物于有機(jī)溶劑的方法制備的溶液中，或相反，可生物降解的聚合物的有機(jī)溶劑溶液加入到將氧化鋅懸浮于有機(jī)溶劑的方法制備的懸浮液中?？缮锝到饩酆衔锖脱趸\都可在粉末狀態(tài)下混合，然后再加入有機(jī)溶劑。在本發(fā)明中所使用的生理活性多肽包括分子量優(yōu)選為約1,000至約50,000，更優(yōu)選約5,000至約40,000的生理活性多肽。生理活性多肽代表性活性是激素活性。生理活性多肽可以是天然產(chǎn)物、合成產(chǎn)品、半合成產(chǎn)品及它們的衍生物和類似物。生理活性多肽的作用模式可以是對抗性的(agonistic)或拮抗性的。在本發(fā)明中所用的生理活性多肽包括肽激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)肽、造血因子、各種生長因子、酶、多肽抗生素和鎮(zhèn)痛肽等。肽類激素的例子包括胰島素、促生長素抑制素、促生長素抑制素衍生物(Sandostatin；見美國專利第4,087,390、4,093,574、4,100,117和4,253,998號)、生長激素(GH)、利尿肽鈉、胃泌素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、ACTH衍生物(如依比拉肽(ebiratide))、黑色素細(xì)胞刺激激素(MSH)、促甲狀腺激素釋放激素(TRH)及其鹽和衍生物(見JP-A121273/1975和116465/1977)、甲狀腺刺激激素(TSH)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激激素(FSH)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、胸腺素、促胃動(dòng)素、加壓素、加壓素衍生物[去氨加壓素，見FoliaEndocrinologicaJaponica,第54卷，第5期，第676-691頁(1978)]、催產(chǎn)素、降鈣素、甲狀旁腺素(PTH)、高血糖素、分泌素、促胰酶素、縮膽囊素、血管緊張素及人胎盤催乳素等。肽激素最好是胰島素及生長激素等。細(xì)胞因子包括淋巴因子和單核因子等。淋巴因子包括如干擾素(α、β和γ)和白細(xì)胞介素(IL-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)等。單核因子包括如白細(xì)胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF)等。優(yōu)選細(xì)胞因子為淋巴因子等，干擾素等更優(yōu)選，尤其以α-干擾素為佳。神經(jīng)遞質(zhì)肽包括P物質(zhì)、5-羥色胺和GABA等。造血因子包括紅細(xì)胞生成素(EPO)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF、M-CSF等)、血小板生成素(TPO)、血小板衍生生長因子和巨核細(xì)胞增強(qiáng)因子等。各種生長因子包括如堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)及它們的家族(如EGF、TGF-α、TGF-βPDGF、酸性FGF、堿性FGF、FGF-9等)、神經(jīng)生長因子(NGF)和它的家族(例如BDNF、NF-3、NT-4、CNTF、GDNF等)、胰島素生長因子(例如IGF-1、IGF-2等)和骨形成蛋白(BMP)和它的家族等。酶類包括如超氧化物歧化酶(SOD)、尿激酶、組織纖溶酶原激活物(TPA)、天門冬酰胺酶和血管舒緩素等。多肽抗生素包括如polymixinB、粘菌素、短桿菌肽和桿菌肽等。鎮(zhèn)痛肽類包括如腦啡呔、腦啡呔衍生物(見美國專利第4,277,394號和EP-A31567)、內(nèi)啡呔和京都啡呔(kyotorphin)等。此外，生理活性多肽包括胸腺生成素、強(qiáng)啡呔、鈴蟾肽、雨蛙肽(Caerulein)、胸腺刺激素、胸腺體液因子(THF)、血液胸腺因子(FTS)和它的衍生物(見美國專利第4,229,438號)、其它胸腺因子[IgakunoAyumi，第125卷，第10期，第835-843頁(1983)]、神經(jīng)降壓素、緩激肽及內(nèi)皮素-拮抗肽(見EP-A436189、457195及496452和JP-A94692/1991及130299/1991)等。特別優(yōu)選的生理活性多肽包括生長激素和胰島素等，更優(yōu)選生長激素(尤其是人生長激素)。在本發(fā)明中，當(dāng)生理活性多肽包含金屬時(shí)，金屬的含量最好不大于0.1％(w/w)，更優(yōu)選不超過0.01％(w/w)，最優(yōu)選不超過0.001％(w/w)。因此，基本上不含金屬的生理活性多肽最適合本發(fā)明。例如結(jié)晶胰島素通常含有少量的重金屬，如鋅、鎳、鈷和鎘等。含0.4％(w/w)鋅的胰島素以穩(wěn)定的六聚物存在，且在與可生物降解的聚合物的金屬鹽相互作用時(shí)，呈現(xiàn)相對的惰性。如果有必要，存在于生理活性多肽中的金屬可先被去除。至于去除金屬的方法，可采取已知的方法。例如，可在水或醋酸銨水溶液中，透析酸性的胰島素鹽酸水溶液，并將透析液冷凍干燥可獲得含極少量金屬的無定形胰島素。任何物種來源的生長激素均可采用，以人的生長激素為優(yōu)選。而且雖然從腦垂體腺提取的天然產(chǎn)物可用于本發(fā)明，但是優(yōu)選基因重組型的GH(見JP-B12996/1994、JP-B-48987/1994)。更優(yōu)選與在N-末端不含蛋氨酸的天然類型結(jié)構(gòu)相同的重組型hGH。這種GH可以是金屬鹽的形式，也采用基本上不含金屬的GH?？刹捎?0K道爾頓型hGH(見JP-A101877/1995、JP-A265404/1998)及22K道爾頓型hGH。而且，可以采用hGH的衍生物或類似物(見WO99/03887)。作為生理活性多肽，它可用得自生物體的提取物或純化物質(zhì)、化學(xué)合成物質(zhì)、生物技術(shù)或類似方法的產(chǎn)品，并可以為上述方法生產(chǎn)的任何產(chǎn)品。為了大規(guī)模合成高純度產(chǎn)品，最好采用生物技術(shù)。在采用上述方法的任何情況下，必需從所述粗制品如組織、體液、合成物質(zhì)或重組細(xì)胞或重組真菌凈化或純化生理活性多肽。在這種情況下，可采用眾所周知的方法分離或純化肽或蛋白質(zhì)(“蛋白質(zhì)”，作者KazuoSATAKE，由AsakuraSyoten出版；“生理活性多肽”為藥物綜述，第3期，由日本制藥協(xié)會(huì)出版)。尤其是通過結(jié)合液相色譜法(“High-speedLiquidChromatographyofProteinorPeptide”,NobuoUI等編輯，Kagakudojin出版)，不損失生理活性而獲得高純度高產(chǎn)量的生理活性多肽是可能的。如果必要，鹽析的步驟最好作為純化過程的最后一步采取。生理活性多肽水溶液濃度為例如0.01％(W/V)至30％(W/V)、優(yōu)選0.03％至10％(W/V)、更優(yōu)選0.05％至3％(W/V)等。然而它并不受特別的限制。當(dāng)生理活性多肽為hGH時(shí)，hGH水溶液濃度以0.01％至5％(W/V)為優(yōu)選，0.05％至0.5％(W/V)更為優(yōu)選。在本發(fā)明中，可加入到生理活性多肽溶液中的水混溶性有機(jī)溶劑為例如醇類(如甲醇、乙醇、異丙醇等，優(yōu)選甲醇、乙醇等)、丙酮等?？墒褂蒙鲜鲇袡C(jī)溶劑的適當(dāng)混合比的混合物。有機(jī)溶劑優(yōu)選醇類，更優(yōu)選單獨(dú)的乙醇。所加的水混溶性有機(jī)溶劑的量(濃度)按體積比約為0.03％至0.5％(V/V)，優(yōu)選約0.06％至0.25％(V/V)，更優(yōu)選約0.1％至0.15％(V/V)。通過冷凍干燥加入易與水混合的有機(jī)溶劑所得生理活性多肽水溶液，就能夠制備易于處理(處理優(yōu)勢)且非常精細(xì)的(顆粒小)生理活性多肽粉。作為揮發(fā)性的鹽，它可加入到生理活性多肽的水溶液中，例如在本發(fā)明中是銨鹽(如醋酸銨、碳酸氫銨、碳酸銨、氯化銨等，最好是醋酸銨等)。揮發(fā)性鹽可按指定的比例其混合物而使用。所加入的揮發(fā)性鹽相對于生理活性多肽水溶液的量按摩爾比約是10-80倍，優(yōu)選約10-70倍，更優(yōu)選約15-70倍，進(jìn)一步更優(yōu)選20-70倍，最優(yōu)選約20-50倍。與此相類似地加入水混溶性有機(jī)溶劑，通過冷凍干燥加入揮發(fā)性鹽所獲得的生理活性多肽水溶液，就能夠制備易于處理(處理優(yōu)勢)且非常精細(xì)的(顆粒小)生理活性多肽粉。在本發(fā)明中，加入到生理活性多肽水溶液的水混溶性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽，可單獨(dú)使用或以其混合物使用。當(dāng)水混溶性有機(jī)溶劑和揮發(fā)性鹽以它們的混合物使用時(shí)，它們可分別按上面的量加入到生理活性多肽水溶液中。當(dāng)使用上述方法獲得的含有水混溶性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽的生理活性多肽水溶液冷凍干燥時(shí)，冷凍干燥可采用任何領(lǐng)域如水有關(guān)任何領(lǐng)域以及制藥或食品領(lǐng)域中所使用的任何一種方法(“藥物開發(fā)”，第11卷，YoshinobuNAKAI編輯，HirokawwaSyoten出版)。例如，將生理活性多肽水溶液灌裝在一個(gè)小瓶或安瓿等容器中，冷凍后，使水溶液進(jìn)行干燥處理。在這種情況下，雖然從相應(yīng)的裝置中冷凍后取出的樣品可以放入干燥器中，通常最好將樣品冷凍于控制在適當(dāng)溫度的相應(yīng)裝置中。可逐漸完成干燥過程。最近的冷凍干燥裝置能夠控制溫度或真空度，且能夠選擇處理生理活性多肽的最佳條件。進(jìn)行冷凍干燥處理的生理活性多肽的濃度是如0.01％(W/V)至30％(W/V)的水溶液，優(yōu)選0.03％(W/V)至10％(W/V)的水溶液，更優(yōu)選0.05％(W/V)至3％(W/V)等，但它并不受特別的限制。當(dāng)生理活性多肽為hGH時(shí)，hGH水溶液濃度優(yōu)選為0.01％(W/V)至5％(W/V)，更優(yōu)選0.05％(W/V)至0.5％(W/V)。在本發(fā)明中所用的有機(jī)溶劑其沸點(diǎn)最好不超過120℃。這樣的有機(jī)溶劑包括鹵代烴(如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等)、醇類(如乙醇、甲醇。1,4-丁二醇、1,5-戊二醇等)、醋酸乙酯、乙腈等。這些溶劑也可以以一定比例的混合物使用。單獨(dú)使用的優(yōu)選有機(jī)溶劑包括例如二氯甲烷和乙腈等。用作混合物使用的優(yōu)選有機(jī)溶劑包括例如鹵代烴(如二氯甲烷、氯仿等)和醇類(如乙醇、甲醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇)或乙腈的混合物。尤其是二氯甲烷和乙腈的混合物被廣泛使用。鹵代烴相對于醇類或乙腈的混合比例(體積比)大約在40∶1至1∶1的范圍內(nèi)，最好是約20∶1至約1∶1。尤其優(yōu)選單獨(dú)使用鹵代烴(如二氯甲烷等)，或使用基本上由鹵代烴和乙腈按9∶1至1∶1混合比組成的混合溶劑。可生物降解聚合物溶液的濃度依分子量、有機(jī)溶劑種類等而不同。例如，它可約為0.01至約80％(w/w)，優(yōu)選約0.1至約70％(w/w)，更優(yōu)選約1至約60％(w/w)。本發(fā)明中的緩釋制劑是通過從S/O分散體中除去有機(jī)溶劑而生產(chǎn)的，在S/O分散體中通過冷凍干燥其中加入水混溶性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽的生理活性多肽溶液，獲得的生理活性多肽粉末(S相)，將其分散入可生物降解聚合物溶解入所述有機(jī)溶劑的溶液(O相)中。這種方法是例如(a)水中干燥法(S/O/W法)，(b)相分離法(凝聚(Coacervation)法)和(c)噴霧干燥法，或基于這些方法的其它方法。例如，下面描述生產(chǎn)作為緩釋制劑的微膠囊的方法。(a)水中干燥法(S/O/W法)按照該方法，首先將與水易混合有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽加入到生理活性多肽水溶液中，然后通過冷凍干燥制得生理活性多肽粉末(S相)。將可生物降解的聚合物溶解于有機(jī)溶劑中，然后將上述生理活性多肽粉末分散入所得有機(jī)溶劑溶液中。生理活性多肽和可生物降解的聚合物的比例(重量比)例如約為1∶1000至約1∶1，優(yōu)選約1∶200至1∶5，更優(yōu)選約1∶100至1∶5。最好施加外部的物理能量將生理活性多肽粉末均勻地分散入有機(jī)溶劑溶液中。如上所述，例如使用超聲波輻射、渦輪攪拌器、勻漿器等。至于有機(jī)溶劑溶液中的生理活性多肽的平均顆粒大小，優(yōu)選不超過約10μm，更優(yōu)選約0.1至10μm，甚至更優(yōu)選約0.5至5μm，且這一點(diǎn)容易通過采用本發(fā)明中的方法獲得的生理活性多肽粉末而實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明中，生理活性多肽的平均顆粒大小是指用勻漿器將生理活性多肽分散入二氯甲烷這樣的有機(jī)溶劑中后，使用激光衍射顆粒大小分析儀(ShimadzuCorp以商品名SALD2000A銷售)所測得的值。在這一過程中，生理活性多肽以濃度約20-100mg/ml加入有機(jī)溶劑中，然后用勻漿器分散開，例如用Polytron(Kinematica)，轉(zhuǎn)速約為20,000rpm，時(shí)間約為30至60秒。分散液用有機(jī)溶劑充分稀釋，以便使用激光衍射顆粒大小分析儀測量平均顆粒大小。進(jìn)一步，把如上所述制得的有機(jī)溶劑分散體(S/O分散體)加入到水性溶劑(W相)中，然后施加與上述同樣的外物理能，如超聲波輻射、渦輪攪拌器、勻漿器等，制成S/O/W乳劑。然后，蒸發(fā)O相有機(jī)溶劑，得到微膠囊。水相的體積以O(shè)相體積為基準(zhǔn)，大體上從1倍至約10,000倍的數(shù)內(nèi)選擇，優(yōu)選約2倍至約5,000倍，更優(yōu)選約5倍至約2,000倍。乳化劑可加入到上述外部的水相中。至于乳化劑，可使用任何可形成基本穩(wěn)定的S/O/W乳劑的任何乳化劑。如上所述，乳化劑例如陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、聚氧乙烯衍生物、蓖麻油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇類、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠、透明質(zhì)酸等。這些乳化劑可按指定比例以混合物的形式使用。外部水相中的乳化劑濃度優(yōu)選為約0.001％至20％(w/w)，更優(yōu)選約0.01％至10％(w/w)，特別優(yōu)選約0.05％至5％(w/w)。因此獲得的微膠囊通過離心或過濾回收，用蒸餾水洗滌去除粘附在微膠囊表面的乳化劑等，重新分散于蒸餾水中，并冷凍干燥。然后，如果必要，通過加熱進(jìn)一步去除微膠囊中的水和有機(jī)溶劑。加熱可在減壓條件下進(jìn)行。至于加熱條件，加熱和干燥在不低于可生物降解聚合物玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，且也不可高到引起各微膠囊顆粒聚集的溫度下進(jìn)行。加熱和干燥最好在可生物降解聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度至比玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高約30℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度定義為當(dāng)溫度以每分鐘10-20℃的速度上升時(shí)，使用差示掃描量熱計(jì)獲得的玻璃轉(zhuǎn)化中點(diǎn)。(b)相分離方法(凝聚法)當(dāng)用目前的方法生產(chǎn)微膠囊時(shí)，將凝聚劑逐漸加入至如上面(a)中所述S/O分散體中，同時(shí)攪拌以使微膠囊沉淀并固化。所用凝聚劑的量約為0.01至1,000倍體積，優(yōu)選約0.05至約500倍體積，尤其優(yōu)選約0.1至約200倍體積?？墒褂萌魏我环N凝聚劑，只要它是可與溶解可生物降解聚合物有機(jī)溶劑混溶的聚合的礦物油或植物油混合物，且它不溶解所用的可生物降解聚合物。具體地說，這類凝聚劑實(shí)例包括硅油、芝麻油、豆油、玉米油、棉子油、椰子油、亞麻子油、礦物油、n-己烷和n-庚烷等。可聯(lián)合使用其中兩種或多種。這樣獲得的微膠囊通過過濾回收，用庚烷等反復(fù)清洗去除凝聚劑。而且，清洗采取與上面(a)中同樣的方式，接著冷東干燥。用水中干燥法或凝聚法生產(chǎn)微膠囊時(shí)，可加入抗聚集劑，以防止顆粒聚集，可使用的抗聚合劑實(shí)例例如水溶性多糖如甘露醇、乳糖、葡萄糖、淀粉(如玉米淀粉等)、透明質(zhì)酸和其堿金屬鹽；蛋白質(zhì)如甘氨酸、纖維素和膠原；以及無機(jī)鹽如氯化鈉和磷酸氫二鈉等。(c)噴霧干燥法當(dāng)用目前的方法生產(chǎn)微膠囊時(shí)，通過噴嘴將如上述(a)中所描述的S/O分散體噴入含噴霧干燥劑的干燥室中，以便在很短的時(shí)間內(nèi)使精細(xì)微滴中的有機(jī)溶劑揮發(fā)產(chǎn)生微膠囊。這樣的噴嘴包括如雙流體型噴嘴、壓力型噴嘴和轉(zhuǎn)盤型噴嘴等。如果必要，通過另外的噴嘴噴霧上述抗聚集劑的水溶液，以防止各微膠囊顆粒相互聚集也是有益的。將這樣獲得的微膠囊按與上面(a)中同樣的方式洗滌，若有必要，接著加熱(如果有必要，在減壓條件下)以去除水和有機(jī)溶劑。在本發(fā)明中的緩釋制劑最好是微顆粒。因?yàn)榫忈屩苿┦峭ㄟ^注射針應(yīng)用的，由于擔(dān)心患者會(huì)感到過分疼痛，通常是經(jīng)皮下注射或肌肉注射使用。緩釋制劑的顆粒大小為例如顆粒平均大小約0.1至300μm，優(yōu)選約1至150μm，更優(yōu)選約2至100μm。在本發(fā)明的緩釋制劑中所含的生理活性多肽的量為例如約0.1至30％(w/w)，優(yōu)選約0.2至20％(w/w)，更優(yōu)選約0.5至10％(w/w)。生理活性多肽的平均顆粒大小優(yōu)選不超過約10μm，更優(yōu)選約0.1至10μm，甚至更優(yōu)選約0.5至5μm。在本發(fā)明緩釋制劑中所含的可生物降解的聚合物的量為例如約30至99.9％(w/w)，優(yōu)選約60至97％(w/w)，更優(yōu)選約70至90％(w/w)。生理活性多肽從緩釋制劑中初始釋放比例優(yōu)選不超過約40％，更優(yōu)選約1％至40％，甚至更優(yōu)選約3％至35％。初始釋放比例是指皮下注射給藥后一天(24小時(shí))內(nèi)所釋放的比例。這一比值可通過第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)所釋放的量計(jì)算。初始釋放量可根據(jù)皮下注射給予本發(fā)明緩釋制劑后，24小時(shí)內(nèi)測得的血藥濃度曲線下面積AUC(血藥濃度曲線下面積)獲得；并將AUC值應(yīng)用到劑量-AUC標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，該曲線是通過皮下給予生理活多肽溶液而獲得的。本發(fā)明緩釋制劑可用于以所述微膠囊作原材料制備不同劑量形式，且能夠作為腸外制劑(如植入肌肉制劑、皮下、組織等的注射劑或制劑，給予鼻腔、直腸、子宮等粘膜的制劑)、口服制劑(如膠囊劑，例如硬膠囊和軟膠囊，固體制劑如顆粒劑和散劑，溶液劑如懸浮劑等)等給藥。在本發(fā)明中的緩釋制劑最好是用于注射。例如，在緩釋制劑是微膠囊的情況下，通過水性懸浮液獲得注射用實(shí)際緩釋制劑是可能的，在該水性懸浮液中所述微膠囊與分散劑(例如表面活性劑如吐溫80、HCO-60等，多糖如羧甲基纖維素、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸等)、防腐劑(如羥苯甲酯、丙對苯等)、張力劑(如氯化鈉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖等)等一起懸浮。也可通過油性懸浮液獲得注射用實(shí)際緩釋制劑，其中所述微膠囊與植物由例如芝麻油、玉米油、其與磷脂如卵磷脂的混合物或中鏈脂肪酸甘油三酯(如Miglyol812)一起懸浮。當(dāng)緩釋制劑為如微膠囊時(shí)，可注射用的緩釋制劑懸浮液的顆粒大小可根據(jù)滿足分散度要求和通過注射針的范圍選擇。例如，作為平均顆粒大小的顆粒大小在約0.1至300μm的范圍內(nèi)，優(yōu)選約1至150μm，更優(yōu)選約2至100μm。制備為無菌制劑的上述微膠囊的方法包括但不僅僅限于如下方法整個(gè)生產(chǎn)過程為無菌的方法，使用γ射線作為消毒劑的方法和在生產(chǎn)過程中加入殺菌劑的方法。本發(fā)明中的緩釋制劑可低毒性地安全用于哺乳動(dòng)物(如人、牛、豬、狗、貓、小鼠、大鼠、兔子等)中。緩釋制劑的適應(yīng)癥依所用的多肽的生理活性而不同。當(dāng)胰島素用作生理活性多肽時(shí)，緩釋制劑可用于預(yù)防或治療糖尿??；當(dāng)使用α-干擾素作為生理活性多肽時(shí)，緩釋制劑可用于預(yù)防或治療病毒性肝炎(如丙型肝炎、Hbe抗原陽性的活動(dòng)性肝炎等)和癌癥(如腎癌、多發(fā)性骨髓瘤等)；當(dāng)使用紅細(xì)胞生成素作為生理活性多肽時(shí)，可用于預(yù)防或治療貧血(如腎臟透析期間的貧血等)；當(dāng)使用G-CSF作為生理活性多肽時(shí)，可用于預(yù)防或治療中性粒細(xì)胞減少癥(如在癌癥的治療等)和感染；當(dāng)使用IL-2作為生理活性多肽時(shí)，可用于預(yù)防或治療癌癥(如血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤等)；當(dāng)使用FGF作為生理活性多肽時(shí)，可用于預(yù)防或治療骨折、傷口(如褥瘡等)、牙周炎和胃腸潰瘍；當(dāng)使用FGF-9時(shí)可用于預(yù)防或治療血小板減少癥；當(dāng)使用NGF時(shí)可用于預(yù)防或治療老年性癡呆和神經(jīng)??；當(dāng)使用TPA作為生理活性多肽時(shí)，可用于預(yù)防或治療血栓形成；以及當(dāng)使用腫瘤壞死因子作為生理活性多肽時(shí)，可用于預(yù)防或治療癌癥。此外，含有GH的緩釋制劑，基于GH的生長激素作用，應(yīng)用于Turner′s綜合癥、慢性腎病、軟骨發(fā)育不全癥，成人垂體功能低下及垂體性侏儒癥。進(jìn)一步因?yàn)閾?jù)報(bào)道GH應(yīng)用于諸如Down綜合癥、Silver綜合癥、hypochondroplasia和少年慢性關(guān)節(jié)炎等疾病，獲得極好的治療效果，所以含有GH的緩釋制劑可以應(yīng)用于這些疾病。含有GH的緩釋制劑也可以用于預(yù)防或治療充血性心力衰竭等。雖然緩釋制劑的劑量依生理活性多肽的種類和含量、藥物釋放時(shí)間、所治療的疾病、動(dòng)物種類及其它因素而有變化，但是只要生理活性多肽在體內(nèi)保持有效的濃度，緩釋制劑的劑量可設(shè)定在任何水平。例如，當(dāng)所設(shè)計(jì)的緩釋制劑的釋放時(shí)間為兩周時(shí)，生理活性多肽的劑量最好在每個(gè)成人約0.0001-10mg/kg體重范圍內(nèi)適當(dāng)選擇，更優(yōu)選約0.05-1mg/kg體重。緩釋制劑的給藥頻率，依據(jù)生理活性多肽的種類和含量、劑型、藥物釋放持續(xù)時(shí)間、所治療的疾病、動(dòng)物種類及其它因素，適當(dāng)選擇每周一次、每兩周一次、每月一次，每兩月一次等。緩釋制劑能有效釋放生理活性多肽的釋放時(shí)間優(yōu)選一周至一月，更優(yōu)選一周至三周，甚至更優(yōu)選10天至20天。其中最優(yōu)選在兩周的時(shí)間內(nèi)有效釋放生理活性多肽的緩釋制劑為最佳。這意味著每兩周給予一次所述緩釋制劑。當(dāng)在緩釋制劑中作為活性成分的生理活性多肽為如胰島素時(shí)，作為有效成分，每一個(gè)成年糖尿病患者每次給藥劑量通常在有效成分約0.001-1mg/kg體重的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇，優(yōu)選約0.01-0.2mg/kg體重。且最佳的給藥頻率是一周一次。當(dāng)緩釋制劑中作為活性成分的生理活性多肽是GH時(shí)，雖然給藥劑量依GH的種類和含量、藥物釋放時(shí)間、所針對的疾病、動(dòng)物種類及其它因素而有變化，只要GH在體內(nèi)保持有效的濃度，它的劑量可設(shè)定在任何水平。關(guān)于上述疾病的治療，當(dāng)緩釋制劑的釋放時(shí)間設(shè)定為兩周時(shí)，對于每一個(gè)兒童或成人，GH的安全給藥量可在約0.01-5mg/kg體重(約0.03-15IU/mg/kg體重)范圍內(nèi)適當(dāng)選擇，更優(yōu)選約0.05-1mg/kg體重(約0.15-3IU/mg/kg體重)。優(yōu)選給藥頻率依據(jù)GH的含量、劑型、釋放時(shí)間、所針對的疾病、動(dòng)物種類及其它因素，在每周一次、每兩周一次、每月一次等范圍內(nèi)作適當(dāng)選擇。含有GH的緩釋制劑能有效釋放GH，釋放時(shí)間優(yōu)選一周至一月，更優(yōu)選一周至三周，甚至更優(yōu)選10天至20天。其中以在兩周的時(shí)間內(nèi)有效釋放GH的含GH緩釋制劑為最佳。這意味著每兩周給予一次該緩釋制劑。緩釋制劑最好貯存在常溫或低溫處。更優(yōu)選緩釋制劑貯藏于低溫處?！俺亍焙汀暗蜏靥帯痹谌毡舅幍渲杏衅涠x。即“常溫”是指15至25℃，“低溫處”是指溫度不超過15℃。在低溫處，溫度大約在2-8℃則更佳。圖2是表示當(dāng)免疫抑制的SD大鼠，給予用加入醋酸銨的GH粉末獲得的含GH的微膠囊后，血清中GH濃度的變化，其中-▲-表示25倍摩爾醋酸銨，-●-表示50倍摩爾醋酸銨。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明在此后通過下面的參考實(shí)施例、實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例作更為詳細(xì)描述，且不能將其解釋為限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明說明書中，氨基酸的縮寫基于由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦縮寫、或在相關(guān)領(lǐng)域中通常使用的縮寫。下面是一些實(shí)例(除非另有說明，縮寫代表L-型)。SDS十二烷基硫酸鈉Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val纈氨酸Leu亮氨酸Ile異亮氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Cys半胱氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Gln谷氨酰胺Asp天門冬氨酸Asn天門冬酰胺Lys賴氨酸Arg精氨酸His組氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸Asx:Asp+ASnGlx:Glu+Gln參考實(shí)施例1使用T7啟動(dòng)子構(gòu)建人生長激素(hGH)的表達(dá)載體通過用EcoRⅠ和EcoRⅤ切割，從日本專利公開第12996/1994號中所描述的質(zhì)粒pHGH107(ATCC31538或ATCC40011)中分離約0.75Kb片段的hGH結(jié)構(gòu)基因。另一方面，通過用NdeⅠ和BamHⅠ切割，從pET-3C[Rosenberg等，Gene,56,125(1987)]中分離約4.6kb片段的T7啟動(dòng)子和氨芐青霉素抗性基因。兩個(gè)片斷均用T4DNA聚合酶(DNA平端化試劑盒；TakaraShuzo,Inc.)處理并用T4DNA連接酶連接，接著導(dǎo)入大腸肝菌JM109，并選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。從所獲的12個(gè)菌落中，用PstⅠ制備并消化質(zhì)粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hGH基因以正確的方向插入6個(gè)菌落的質(zhì)粒中。把從6個(gè)菌落中的一個(gè)轉(zhuǎn)化菌落中所獲得的質(zhì)粒命名為pTGA201。參考實(shí)施例2Met-hGH在大腸桿菌中的表達(dá)用含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的λ噬菌體(Studie,Supura)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。然后將在參考實(shí)施例1中獲得的hGH表達(dá)載體pTGA201導(dǎo)入所得的大腸桿菌JM109(DE3)中，得到大腸桿菌JM109(DE3)/pTGA201。將大腸桿菌JM109(DE3)/pTGA201接種到含有1升包括50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基[1％蛋白胨、0.5％酵母菌提取物、0.5％氯化鈉]的2升容量的瓶中，然后在30℃旋轉(zhuǎn)振動(dòng)培養(yǎng)16小時(shí)。將所獲得的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含有20升LB培養(yǎng)基的50升發(fā)酵罐中，然后再置于37℃、通氣攪拌下培養(yǎng)6小時(shí)。然后將所獲得的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含有360升液體生產(chǎn)培養(yǎng)基(1.68％磷酸氫二鈉、0.3％磷酸二氫鉀、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、0.0246％硫酸鎂、0.02％NewPoleLB-625、0.0005％鹽酸維生素B1、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的500L發(fā)酵罐中，然后在37℃、通氣攪拌下培養(yǎng)。當(dāng)Klett值大約為500時(shí)，在培養(yǎng)基中加入5.95mg/L/min的異丙基-β-D-thiogalactopyronoside(IPTG)，并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。將培養(yǎng)液離心，得到4.5kg的濕細(xì)胞，將其冷凍于-80℃下。上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109(DE3)/pTGA201保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(NIBH)(AgencyofIndustrialScienceandTechnlogy,MinistryofInternationalTradeandIndustry,Japan)，指定保藏號為FERMBP-5632。也將其保藏在InstituteforFermentation(Osaka,Japan)(IFO)，指定保藏號為IFO1600l。參考實(shí)施例3Met-hGH的活化將在參考實(shí)施例2中獲得的2kg濕細(xì)胞溶解在6升50mMTris-HCl和鹽酸胍(pH8.0)中，接著離心(10000rpm,120min)。在所獲得的6L上清液中，加入18升含有50mMTris-HCl、0.28mMGSSG和0.7M精氨酸的溶液(pH8.0)，調(diào)節(jié)pH8.0，接著在4℃下靜置5天，使Met-hGH繼續(xù)活化。參考實(shí)施例4Met-hGH的純化將在參考實(shí)施例3中獲得的溶液，通過加入20mMTris-Hcl和2.5M尿素的的溶液(pH8.0)至Pellicon卡式系統(tǒng)(PTGC膜；Millipore公司)鹽析并濃縮，直到電導(dǎo)率不超過10mS。將所獲得的濃縮液離心(10000rpm,60min)獲得5升上清液。將上清液上樣在用含20mMTris-HCl和2.5M尿素的溶液(pH8.0)平衡的DEAE-Toyopearl650M柱(20cmφ×84cm,Tosoh)中，接著吸附并洗滌。柱子用由0-25％溶液B(B=20mMTris-HCl、2.5M尿素、1MNaCl,pH8.0)組成的濃度梯度液以300ml/min的流速下洗脫100分鐘。將含Met-hGH的10L洗出液通過Pellicon卡式系統(tǒng)(PTGC膜；Millipore公司)再次鹽析并濃縮。用HPLC法(GilsonHPLC系統(tǒng)；Gilson)使?jié)饪s液通過DEAE-5PW柱(21cmφ×30cm,Tosoh)。將柱子用由70-85％的溶液B(A=50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B=50mMMES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸酯(ethanesulfonate)]和2.5M尿素(pH4.0))組成的pH梯度液以320ml/min的流速洗脫70分鐘。向所獲得的6LMet-hGH流分中加入2MTris-HCl(pH7.8)，調(diào)節(jié)pH至7.2，接著通過Pellicon卡式系統(tǒng)(PTGC膜；Millipore)鹽析和濃縮，得到9,979mgMet-hGH。參考實(shí)施例5去除N-末端Met向1650ml在參考實(shí)施例4中獲得的Met-hGH溶液中加入413ml含35mM硫酸銅、2.5M水合乙醛酸和6M吡啶的溶液，并攪拌該混合物，在25℃下靜置60分鐘。將該反應(yīng)液以3L/h的流速通過用20mMTris-HCl和2.5M尿素溶液(pH8.0)平衡的SephadexG-25柱(11.3cmφ×125cm,Pharmacia)，并以同一溶液洗滌柱子，收集Met-hGH的二酮衍生物部分。把洗脫的流分直接加入4L含4M醋酸、4M醋酸鈉、80mMO-苯二胺和3M尿素的溶液中，并攪拌。洗脫后，使8L反應(yīng)液在4℃下靜置3天。通過Pellicon卡式系統(tǒng)(PTGC膜；Millipore公司)使溶液鹽析。使4L濃縮液以3L/h的流速通過用20mMTris-HCl和2.5M尿素溶液(pH8.0)平衡的SephadexG-25柱(11.3cmφ×140cm,Pharmacia)，收集4.7L的hGH流分。使用HPLC法(GilsonHPLC系統(tǒng)；Gilson)，將所收集的流分通過DEAE-5PW柱(21emφ×30cm,Tosoh)。將柱子用由70-85％的溶液B(A=50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B=50mMMES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸酯]和2.5M尿素(pH4.0))組成的pH梯度液以320ml/min的流速洗脫70分鐘，收集10L的hGH流分。向所獲得的hGH流分中加入500ml2MTris-HCl(pH7.8)溶液，調(diào)節(jié)pH7.2，接著用MinitanⅡ(PTGC膜；Millipore)濃縮。將500ml濃縮液以2L/h的流速通過用蒸餾水平衡的SephacrylS-100柱(11.3cmφ×50cm,Pharmacia)，收集1651ml的hGH流分，接著用Millipack60(Millipore)過濾，得到1487mlhGH溶液(3309mghGH)。參考實(shí)施例6hGH特點(diǎn)的證實(shí)(a)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析向在參考實(shí)施例5中獲得的hGH溶液中加入同樣體積的含100mMDTT的樣品緩沖液(Samplebuffer)[Laemmli,Nature,227,680(1970)]，并將該混合液在95℃下加熱2分鐘，接著用MultiGel10/20(DaiichiPureChemicals)進(jìn)行電泳。電泳后將凝膠用考馬斯亮蘭染色，并只有約22kd的純化蛋白質(zhì)處獲得單一條帶。因此證實(shí)幾乎是單一hGH。(b)氨基酸組成的分析用氨基酸分析儀(L-8500A,Hitachi)，使用參考實(shí)施例5中所獲得的hGH，測定氨基酸的組成。在參考實(shí)施例5中所獲得的hGH的氨基酸組成與根據(jù)hGHcDNA序列預(yù)測的氨基酸組成相一致。結(jié)果見表1。表1氨基酸組成的分析<tablesid="table1"num="001"><table>氨基酸每摩爾的殘基數(shù)量根據(jù)hGHcDNA序列的預(yù)測值A(chǔ)sx20.220Thr1)10.010Ser1)16.718Glx27.027Pro8.18Gly8.28Ala7.67CysN.D.2)4Val7.07Met3.03Ile7.78Leu27.926Tyr8.18Phe12.713His3.23Lys8.99Arg10.911Trp0.81</table></tables>酸水解(6NHCl,4％巰基乙酸，110℃，水解24小時(shí)和48小時(shí)后所得數(shù)值的平均值)1)假設(shè)水解時(shí)間為0小時(shí)時(shí)的推斷值2)未檢測到用20ughGH進(jìn)行分析(c)N-末端氨基酸序列分析用氣相蛋白序列儀(AppliedBiosystems,477A型)測定在參考實(shí)施例5中獲得的hGH的N-末端氨基酸序列。在參考實(shí)施例5中獲得的hGH的N-末端氨基酸序列與根據(jù)hGHcDNA序列預(yù)測的氨基酸序列相一致。結(jié)果見表2。表2N-末端氨基酸序列分析<tablesid="table2"num="002"><table>殘基序號所檢測的PTH1)-氨基酸(pmol)根據(jù)hGHcDNA序列預(yù)測的氨基酸1Phe(949)Phe2Pro(404)Pro3Thr(422)Thr4Ile(744)Ile5Pro(283)Pro6Leu(514)Leu7Ser(136)Ser8Arg(36)Arg9Leu(377)Leu10Phe(408)Phe11Asp(77)Asp12Asn(230)Asn13Ala(435)Ala14Met(334)Met15Leu(398)Leu16Arg(67)Arg17Ala(488)Ala18His(30)His19Arg(42)Arg20Leu(406)Leu</table></tables>1)乙內(nèi)酰苯硫脲用1nmolhGH進(jìn)行分析(d)C-末端氨基酸的分析使用在參考實(shí)施例5中所獲得的hGH，通過氨基酸分析儀(L-8500A，Hitachi)進(jìn)行C-末端氨基酸的測定。在參考實(shí)施例5中獲得的hGHC-末端氨基酸與根據(jù)hGHcDNA序列預(yù)測的氨基酸相一致。結(jié)果見表3。表3(d)C-末端氨基酸的分析C-末端氨基酸產(chǎn)率(％)Phe52氣相肼解作用(100℃,6小時(shí))用18nmolhGH進(jìn)行分析(e)hGH活性的測定按照J(rèn)ournalofClinicalEndocrinologyandMetabolism,51,1058(1980)中所述方法，用Nb2細(xì)胞分析在參考實(shí)施例5中純化獲得的hGH，顯示在參考實(shí)施例5中純化獲得的hGH促進(jìn)細(xì)胞生長的活性大體上與標(biāo)準(zhǔn)品一致。在按參考實(shí)施例5所制備的重組hGH水溶液(hGH終濃度=2mg/ml)中，既不加乙醇，也不加醋酸銨。將溶液冷凍干燥以獲得hGH粉末。(2)含hGH微膠囊的生產(chǎn)按照如上述實(shí)施例1(2)中所描述的方法，采用上述(1)中所制備的hGH粉末獲得含有hGH的微膠囊。實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例1對于在實(shí)施例1(1)和比較實(shí)施例1(1)中所獲得的hGH粉末，處理的容易程度從粉末的體積和帶靜電量這兩點(diǎn)進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果見表4。從表4的結(jié)果中可明顯看出，與不用乙醇制備的hGH粉末相比，用乙醇制備的hGH粉末在處理的容易程度上得到極大的提高。實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例2將2ml二氯甲烷加入到在實(shí)施例1(2)和比較實(shí)施例1(2)的中間過程中所得的50ulhGH粉末/PLGA有機(jī)溶劑的S/O分散體中。然后采用激光衍射顆粒大小分析儀(ShimadzuCorp.有售，名為SALD2000A)測量hGH粉末平均顆粒大小。結(jié)果見表4。從表4中的結(jié)果明顯看出，不用乙醇所制備的hGH粉末的顆粒平均大小不小于10μm，而用乙醇制備的hGH粉末的顆粒平均大小不超過10μm。表4<tablesid="table3"num="003"><table>乙醇濃度處理的容易程度*平均顆粒大小0.03％+8.2μm0.06％++5.6μm0.10％++5.0μm0.15％++6.1μm0.25％++8.0μm0.50％++9.1μm無乙醇-10.2μm</table></tables>*按粉末的體積和帶靜電量以3個(gè)等級進(jìn)行評定(-難，+容易，++非常容易)實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例3下面的檢測是采用在實(shí)施例1(2)和比較實(shí)施例1(2)中所生產(chǎn)的含hGH的微膠囊進(jìn)行的。(1)hGH含量將0.3ml乙腈加入到5mg微膠囊中，并用超聲處理混合物。向所得溶液中加入0.7ml10mM的磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，以提取hGH，后者是活性成分。接著，在下面的條件下對hGH提取物進(jìn)行尺寸排阻高效液相色譜分析，然后測量hGH含量，以計(jì)算包裹比率。結(jié)果見表5。柱TSKgelG3000SWXL(Tosoh有售)萃取0.2M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)-0.2MNaCl流速0.6ml/min從表5的結(jié)果中可明顯看出，與不用乙醇所制備的hGH粉末所生產(chǎn)的微膠囊(含hGH)相比，采用乙醇制備的hGH粉末所生產(chǎn)的含hGH微膠囊，表現(xiàn)出更高的hGH包裹比率。表5(2)體內(nèi)釋放形式給免疫抑制SD大鼠(雄性，6周齡)皮下給予微膠囊(劑量為6mghGH/大鼠)。然后按時(shí)間連續(xù)收集大鼠的血液。用放射免疫分析法(EIKENCHEMICALCo.,LTD有售，名為AbbeadsHGH)測量血清中hGH的濃度，從而評估hGH的釋放形式。給大鼠皮下注射Prograf_(FujisawaPharmaceuticalCo.,Ltd.有售)制備免疫抑制SD大鼠，注射時(shí)間與注射劑量為在首次給予微膠囊前3天，注射量為0.4mg/大鼠，首次給藥時(shí)為0.2mg/大鼠，首次給予微膠囊后第4天、第7天、第11天和第14天為0.2mg/大鼠。結(jié)果見圖1。從圖1的結(jié)果可明顯看出，對于采用以乙醇制備的hGH粉末生產(chǎn)的微膠囊(含有hGH)，初始釋放量(就是給藥后1天(24小時(shí))內(nèi)所釋放的hGH的量)較低，但所持續(xù)的濃度(也就是說，除初始釋放外，在給藥后2周內(nèi)所釋放的hGH的量)較高。也就是說，用乙醇制備的hGH粉末，其初始釋放量減少，hGH高血液濃度保持兩周。實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例4對于在實(shí)施例2(1)和比較實(shí)施例1(1)中所獲得的hGH粉末，處理的容易程度從粉末的體積和帶靜電量進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果見表6。從表6的結(jié)果可明顯看出，與不用乙酸銨制備的hGH粉末相比，用乙酸銨制備的hGH粉末在處理的容易程度上有極大的提高。實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例5根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例2中所述的方法，采用激光衍射顆粒大小分析儀(ShimadzuCorp.有售，名為SALD2000A)，測量在實(shí)施例2(2)和比較實(shí)施例1(2)的中間過程中所獲得的hGH粉末/PLGA有機(jī)溶劑的S/O分散體的hGH粉末的平均顆粒大小。結(jié)果見表6。表6*按粉末的體積和帶靜電量以3個(gè)等級進(jìn)行評定(-難，+容易，++非常容易)實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例6下面的實(shí)驗(yàn)是用實(shí)施例2(2)和比較實(shí)施例1(2)中所生產(chǎn)的含有hGH的微膠囊進(jìn)行的。(1)hGH含量根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例1(1)中所描述的方法，評估每種微膠囊的hGH包裹比率，結(jié)果見表7。從表7的結(jié)果可明顯看出，與不用醋酸銨制備的hGH粉末所生產(chǎn)的微膠囊(含有hGH)相比，用以醋酸銨制備的hGH粉末生產(chǎn)的微膠囊(含有hGH)呈現(xiàn)更高的hGH裹比率。(2)初始釋放按下面所提的方法，計(jì)算微膠囊的初始釋放比率。這些結(jié)果也見表7。給免疫抑制的SD大鼠(雄性，6周齡)皮下注射hGH的水溶液(濃度為5、10、20mg/kg)。然后按時(shí)連續(xù)收集大鼠血液，一直到注射后24小時(shí)。在每一水溶液中，用放射-免疫分析(AbbeadsHGH:EikenKagakuCo.)測量大鼠血液的血清hGH濃度?；诿恳凰芤核@得的AUC值，得到一個(gè)用藥劑量和AUC的校準(zhǔn)曲線。給免疫抑制SD大鼠(雄性，6周齡)皮下給予微膠囊(劑量為6mghGH/大鼠)。然后連續(xù)收集大鼠血液，一直到注射后24小時(shí)。用放射免疫分析(商品名為AbbeadsHGH,EIKENCHEMICALCo.,LTD出售)測量大鼠血清hGH濃度，以評估hGH釋放形式。將所得AUC值應(yīng)用到上述用藥劑量和AUC的校準(zhǔn)曲線，從而得到hGH的初始釋放量，然后由此來計(jì)算初始釋放比率。表7<tablesid="table6"num="006"><table>所加醋酸銨量HGH包裹比率初始釋放比率10倍摩爾100％11.0％20倍摩爾92％11.8％25倍摩爾95％19.8％40倍摩爾85％20.0％50倍摩爾83％23.3％70倍摩爾82％29.5％100倍摩爾70％48.7％不用醋酸銨77％41.7％</table></tables>(3)體內(nèi)釋放形式根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例1(2)中所描述的方法，用免疫抑制SD大鼠評價(jià)微膠囊的hGH釋放形式。結(jié)果見圖2。從圖2的結(jié)果可明顯看出，采用以醋酸銨制備的hGH粉末所生產(chǎn)的微膠囊(含有hGH)，其初始釋放量(即給藥后1天(24小時(shí))內(nèi)所釋放的hGH的量)較低，但維持濃度(換句話說，給藥后2周內(nèi)，除去初始釋放量外所釋放的hGH的量)較高。也就是說，采用醋酸銨制備的hGH粉末初始釋放量減少，實(shí)現(xiàn)血液中高h(yuǎn)GH濃度維持兩周。工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，在生產(chǎn)所述制劑過程中處理生理活性多肽粉末的容易程度得到改善，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)緩釋制劑是可能的。此外，提供的緩釋制劑其活性成分在血液中長期呈高且穩(wěn)定的濃度，而且生理活性多肽的初始釋放比率低。本發(fā)明方法提高了生理活性多肽在緩釋制劑中的包裹比率。權(quán)利要求1．生產(chǎn)緩釋制劑的方法，它包括將生理活性多肽分散入可生物降解的聚合物的有機(jī)溶劑溶液中，并去除有機(jī)溶劑；其中所述多肽是通過冷凍干燥所述多肽水溶液獲得的粉末，所述溶液含有水混溶性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽。2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述粉末的平均顆粒大小不超過10μm。3．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述生理活性多肽是生長激素。4．按照權(quán)利要求3的方法，其中所述生長激素是人生長激素。5．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述水混溶性有機(jī)溶劑是醇。6．按照權(quán)利要求5的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇。7．按照權(quán)利要求5的方法，其中所述醇是乙醇。8．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述揮發(fā)性鹽是銨鹽。9．按照權(quán)利要求8的方法，其中所述銨鹽是醋酸銨、碳酸氫銨或碳酸銨。10．按照權(quán)利要求8的方法，其中所述銨鹽是醋酸銨。11．按照權(quán)利要求5的方法，其中加入到生理活性多肽水溶液中的所述醇的終濃度是0.03-0.5％(V/V)。12．按照權(quán)利要求8的方法，其中所述銨鹽相對于生理活性多肽的摩爾比是10-80。13．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述可生物降解聚合物是乳酸/乙醇酸聚合物。14．按照權(quán)利要求13的方法，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物的乳酸/乙醇酸的摩爾比是100/0至40/60。15．按照權(quán)利要求13的方法，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物的重均分子量是3,000-50,000。16．按照權(quán)利要求13的方法，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物是多價(jià)金屬鹽的形式。17．按照權(quán)利要求16的方法，其中所述多價(jià)金屬是鋅。18．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述緩釋制劑是微膠囊。19．按照權(quán)利要求18的方法，其中所述微膠囊平均顆粒大小是0.1μm-300μm。20．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述緩釋制劑用于注射。21．用按照權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的緩釋制劑。22．生產(chǎn)生理活性多肽粉末的方法，它包括將(1)水混溶性有機(jī)溶劑和/或(2)揮發(fā)性鹽加入到生理活性多肽水溶液中，并冷凍干燥所得溶液。23．用按照權(quán)利要求22的方法獲得的生理活性多肽粉末。24．按照權(quán)利要求23的生理活性多肽粉末，其中所述粉末平均顆粒大小不超過10μm。25．按照權(quán)利要求23的生理活性多肽粉末用于生產(chǎn)藥物的用途。26．(1)水混溶性有機(jī)溶劑和/或(2)揮發(fā)性鹽用于生產(chǎn)小顆粒生理活性多肽粉末的用途。27．按照權(quán)利要求26的(1)水混溶性有機(jī)溶劑和/或(2)揮發(fā)性鹽的用途，其中所述顆粒大小不超過10μm。28．可用權(quán)利要求1要求保護(hù)的方法獲得的緩釋制劑。29．含有生理活性多肽和可生物降解聚合物的多價(jià)金屬鹽的緩釋制劑，其中所述初始釋放比率不超過40％。30．按照權(quán)利要求29的緩釋制劑，其中所述生理活性多肽是平均顆粒大小不超過10μm的粉末形式。31．按照權(quán)利要求29的緩釋制劑，其中所述生理活性多肽是生長激素。32．按照權(quán)利要求29的緩釋制劑，其中所述可生物降解聚合物是乳酸/乙醇酸聚合物。33．按照權(quán)利要求29的緩釋制劑，其中所述緩釋制劑是微膠囊。34．按照權(quán)利要求33的緩釋制劑，其中所述微膠囊平均顆粒大小是0.1-300μm。35．按照權(quán)利要求29的緩釋制劑，它能夠在一周至一月的時(shí)間段內(nèi)有效釋放生理活性多肽。36．按照權(quán)利要求29的緩釋制劑，它含有0.1％-30％(W/W)的生理活性多肽。全文摘要生產(chǎn)緩釋制劑的方法,它包括將生理活性多肽分散至可生物降解聚合物的有機(jī)溶劑中,并去除所述有機(jī)溶劑,其中所述多肽是通過冷凍干燥多肽的水溶液而獲得的粉末,所述水溶液含有與水混溶性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽;這種方法使生產(chǎn)該制劑的工藝中處理生理活性多肽粉末的容易程度得以提高;該方法可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)緩釋制劑;它并提供長期在血液中保持高且穩(wěn)定的所述活性成分濃度、生理活性多肽初始釋放比率低和多肽包裹入所述緩釋制劑比率高的緩釋制劑。文檔編號A61K38/27GK1301172SQ99806413公開日2001年6月27日申請日期1999年3月18日優(yōu)先權(quán)日1998年3月20日發(fā)明者山縣豐,御前雅文,巖佐進(jìn)申請人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社