專利名稱：TNF受體超家族的成員成熟FLINT(mFLINT)多肽或OPG3的藥學(xué)應(yīng)用的制作方法
本申請要求對下列美國申請的優(yōu)先權(quán)于1998年3月30日提交的60/079,856；于1998年3月20日提交的60/086,074；于1998年9月9日提交的60/099,643；于1998年12月18日提交的60/112,703；于1998年12月17日提交的60/112,577；于1998年12月18日提交的60/112,933；以及于1998年12月22日提交的60/113,407。
背景技術(shù)：
FasL(也稱為CD95L和APO1L)在各種細(xì)胞類型中表達(dá)并可以產(chǎn)生如增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞毒性和編程性細(xì)胞死亡等生物學(xué)反應(yīng)。有趣的是，在TNFR家族受體FAS/APO(Suda等人，1993,Cell 75:1169-78)的配體FasL中的突變與自身免疫有關(guān)(Fisher等人，1995,Cell 81:935-46)，同時(shí)已經(jīng)將FasL的過量產(chǎn)生與藥物誘導(dǎo)的肝炎聯(lián)系起來。FasL在眼、睪丸、腦和一些腫瘤的免疫優(yōu)勢(immune-previliged)組織中表達(dá)。也已經(jīng)在腎和肺以及激活的胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了FasL。
編程性細(xì)胞死亡在發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中都起重要作用。在處于形態(tài)發(fā)生或突觸發(fā)生過程中的發(fā)育中的胚胎內(nèi)、以及在處于組織更新過程中或免疫應(yīng)答末期的成年動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞由于編程性細(xì)胞死亡而死亡。由于編程性細(xì)胞死亡的生理作用是關(guān)鍵的，因此該過程的偏離可能是有害的。例如，某些腦神經(jīng)元的期外編程性細(xì)胞死亡是造成如Alzheimer病和Parkinson病等疾病的原因之一，而正在分裂的細(xì)胞在遭受了嚴(yán)重DNA損傷后不能起始編程性細(xì)胞死亡是造成癌癥的原因之一。
來自細(xì)胞環(huán)境的生存信號(hào)以及細(xì)胞完整性的內(nèi)部傳感器通常阻止細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡機(jī)制。在細(xì)胞失去與環(huán)境的接觸或遭受無法修復(fù)的傷害的情況下，該細(xì)胞起始編程性細(xì)胞死亡。同時(shí)接受促進(jìn)或減弱分裂周期的矛盾信號(hào)的細(xì)胞也觸發(fā)編程性細(xì)胞死亡。而哺乳動(dòng)物已經(jīng)進(jìn)化出另一種機(jī)制，該機(jī)制使生物體能主動(dòng)地指導(dǎo)各個(gè)細(xì)胞進(jìn)行自我毀滅。這種“指導(dǎo)性”的編程性細(xì)胞死亡在免疫系統(tǒng)中尤其重要。死亡受體，即傳遞由特異性“死亡配體”起始的編程性細(xì)胞死亡信號(hào)的細(xì)胞膜受體，在指導(dǎo)性編程性細(xì)胞死亡中起重要作用。這些受體可以在配體結(jié)合后幾秒鐘內(nèi)激活死亡caspase，在幾小時(shí)內(nèi)造成細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。
死亡受體屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體基因超家族，該超家族根據(jù)相似的富含半胱氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域確定。死亡受體另外包含一個(gè)名為“死亡結(jié)構(gòu)域”的同源胞質(zhì)序列。死亡結(jié)構(gòu)域通常使死亡受體能夠使用細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡機(jī)制，但在某些情況下，它們介導(dǎo)與編程性細(xì)胞死亡不同或甚至相對抗的功能。
Fas(也稱為CD95或Apol)是一種已經(jīng)很好地確定了特征的死亡受體。Fas和Fas配體(FasL)在編程性細(xì)胞死亡中起重要作用。FasL是同源三聚體分子。據(jù)顯示有可能每個(gè)FasL三聚體結(jié)合三個(gè)Fas分子。因?yàn)樗劳鼋Y(jié)構(gòu)域有相互結(jié)合的傾向，所以Fas的連接導(dǎo)致受體死亡結(jié)構(gòu)域的聚集。然后一種名為FADD(Fas結(jié)合死亡結(jié)構(gòu)域；也稱為Mortl)通過其本身的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合到聚集的受體死亡結(jié)構(gòu)域。FADD還包含“死亡效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域”，該結(jié)構(gòu)域結(jié)合在caspase-8(也稱為FLICE或MACH)的酶原形式中串聯(lián)重復(fù)的類似結(jié)構(gòu)域。在被FADD募集后，caspase-8的寡聚化通過自我切割促進(jìn)caspase-8的激活。隨后caspase-8激活下游的效應(yīng)物caspase，如caspase-9，使細(xì)胞進(jìn)入編程性細(xì)胞死亡。Ashkenazi A等人，“Death Receptors:Signalingand Modulation Science 281,1305-1308(1998年8月)。
雖然FasL在T淋巴細(xì)胞中觸發(fā)編程性細(xì)胞死亡，但FasL也是促炎的。已經(jīng)顯示FasL刺激嗜中性粒細(xì)胞(也稱為多形核白細(xì)胞(PMN))的激活。(Chen J．等人，Science 282:1714-17(1998))已經(jīng)顯示FasL-Fas結(jié)合涉及外周淋巴組織中自體反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的克隆缺失以及自體反應(yīng)性淋巴細(xì)胞群體的去除，并因此促進(jìn)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FasL在轉(zhuǎn)基因小鼠的肌管或胰島上的表達(dá)誘導(dǎo)加快移植排斥的粒細(xì)胞反應(yīng)(Allison J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci,94:3943-47(1997年4月)；Kang S-M等人，Nature Medicien，第3卷，No.7,738-743(1997年7月))。
至少FasL-Fas受體結(jié)合的其中一種效應(yīng)是編程性細(xì)胞死亡，而編程性細(xì)胞死亡對于體內(nèi)穩(wěn)態(tài)是必要的。然而，有時(shí)在應(yīng)激反應(yīng)(stress)、疾病或創(chuàng)傷中擾亂了配體-受體結(jié)合的平衡。不受調(diào)節(jié)的FasL-Fas結(jié)合的其中一個(gè)負(fù)效應(yīng)是失控或偏離的編程性細(xì)胞死亡。所述結(jié)合的另一個(gè)效應(yīng)是FasL激活的中性粒細(xì)胞引起的對健康細(xì)胞的破壞。
例如，特定器官中失控的編程性細(xì)胞死亡的一個(gè)更不可思議的結(jié)果是急性肝衰竭。急性肝衰竭的特征在于編程性細(xì)胞死亡途徑的過度激活，其中有大量的肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡和出血性肝病變。影響肝的病毒感染、影響肝的細(xì)菌感染、肝炎、肝細(xì)胞損傷和/或其它肝細(xì)胞遭受大量編程性細(xì)胞死亡的病征可以導(dǎo)致急性肝衰竭的發(fā)生。感染導(dǎo)致急性肝衰竭的一個(gè)例子是細(xì)菌誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎。
發(fā)明簡述本發(fā)明包括具有

圖1序列的分離的核酸分子、具有圖3序列的分離的核酸分子、具有圖1序列的分離多肽以及具有圖3序列的分離多肽。本發(fā)明還包括具有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因具有圖1的序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供mFLINT以在治療下列病征中使用急性肝衰竭；肝的炎癥；異常的肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡；膿毒??；與炎癥有關(guān)的疾病；肝炎；治療異常的編程性細(xì)胞死亡；與局部缺血有關(guān)的損傷或疾病；與血凝性過高有關(guān)的損傷或疾病，包括使用由溶栓劑和抗凝劑中選出的組中選出的藥物，如激活的蛋白C；與再灌注有關(guān)的損傷或疾?。挥捎诋惓５男募∪毖鸬男募〖?xì)胞損傷；Ⅰ型糖尿病；癌癥；由化療劑或治療輻射引起的無辜受殃組織(innocent bystander tissue)損傷，其中所述無辜受殃組織包括骨髓、腸上皮、口腔上皮；暴露于治療輻射或化療中的造血祖細(xì)胞的損傷；由治療輻射或化療引起的細(xì)胞損傷，包括對腸上皮細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和外周血細(xì)胞的損傷；再生障礙性貧血；脊髓發(fā)育不良綜合征；以及各類血細(xì)胞減少的病征。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供mFLINT以用于促進(jìn)造血祖細(xì)胞的生長或分化以及促進(jìn)CD34+細(xì)胞的生長或分化。
本發(fā)明的另一方面包括以mFLINT作為有效成分的制劑，所述制劑適用于治療以下病征急性肝衰竭；肝的炎癥；異常的肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡；膿毒??；與炎癥有關(guān)的疾?。桓窝?；治療異常的編程性細(xì)胞死亡；與局部缺血有關(guān)的損傷或疾??；與血凝性過高有關(guān)的損傷或疾病，包括使用由溶栓劑和抗凝劑中選出的組中選出的藥物，如激活的蛋白C；與再灌注有關(guān)的損傷或疾??；由于異常的心肌缺血引起的心肌細(xì)胞損傷；Ⅰ型糖尿?。话┌Y；由化療劑或治療輻射引起的無辜受殃組織損傷，其中所述無辜受殃組織包括骨髓、腸上皮、口腔上皮；暴露于治療輻射或化療中的造血祖細(xì)胞的損傷；由治療輻射或化療引起的細(xì)胞損傷，包括腸上皮細(xì)胞損傷、造血祖細(xì)胞損傷和外周血細(xì)胞損傷；再生障礙性貧血；脊髓發(fā)育不良綜合征；以及各類血細(xì)胞減少的病征。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供以mFLINT作為有效成分的制劑，所述制劑適用于促進(jìn)造血祖細(xì)胞的生長或分化以及促進(jìn)CD34+細(xì)胞的生長或分化。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括使用mFLINT制備在治療以下病征中有用的藥物急性肝衰竭；肝的炎癥；異常的肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡；膿毒?。慌c炎癥有關(guān)的疾?。桓窝?；治療異常的編程性細(xì)胞死亡；與局部缺血有關(guān)的損傷或疾?。慌c血凝性過高有關(guān)的損傷或疾病，包括使用選自溶栓劑和抗凝劑中的藥物，如激活的蛋白C；與再灌注有關(guān)的損傷或疾??；由于異常的心肌缺血引起的心肌細(xì)胞損傷；Ⅰ型糖尿?。话┌Y；由化療劑或治療輻射引起的無辜受殃組織損傷，其中所述無辜受殃組織包括骨髓、腸上皮、口腔上皮；暴露于治療輻射或化療中的造血祖細(xì)胞的損傷；由治療輻射或化療引起的細(xì)胞損傷，包括腸上皮細(xì)胞損傷、造血祖細(xì)胞損傷和外周血細(xì)胞損傷；再生障礙性貧血；脊髓發(fā)育不良綜合征；以及各類血細(xì)胞減少的病征。
依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明包括在制備藥物中使用mFLINT，其中所述藥物可用于促進(jìn)造血祖細(xì)胞的生長或分化以及促進(jìn)CD34+細(xì)胞的生長或分化。
本發(fā)明包括治療遭受異常的肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。本發(fā)明還包括治療患有與炎癥有關(guān)的疾病的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。此外，本發(fā)明包括治療遭受異常的編程性細(xì)胞死亡的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。
本發(fā)明還包括使用mFLINT治療多種肝病。在這一方面，本發(fā)明包括治療患有急性肝衰竭的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。本發(fā)明還包括治療患有肝的炎癥的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。本發(fā)明的另一方法是為治療患有肝炎的個(gè)體，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。
本發(fā)明還包括治療患有膿毒病的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。
本發(fā)明還包括治療患有與局部缺血有關(guān)的損傷或疾病的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。這樣一種損傷或疾病可能與血凝性過高有關(guān)。在這一方面，本發(fā)明還包括治療與血凝性過高有關(guān)的疾病，包括聯(lián)合血栓劑或抗凝劑，給予治療有效量的mFLINT蛋白。這樣一種抗凝劑的一個(gè)例子有激活的蛋白C。
本發(fā)明還包括治療患有與再灌注有關(guān)的損傷或疾病的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。
本發(fā)明還包括在遭受異常的心肌局部缺血的個(gè)體中預(yù)防心肌細(xì)胞損傷的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。
本發(fā)明還包括治療患有Ⅰ型糖尿病的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。本發(fā)明包括的再一個(gè)方法是治療患有癌癥的個(gè)體的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT蛋白。
本發(fā)明還包括在用化療試劑或治療輻射治療的個(gè)體中治療由所述試劑或輻射引起的對無辜受殃組織的損傷的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的mFLINT。這樣的組織包括骨髓和腸上皮，包括口腔上皮。
本發(fā)明包括治療已暴露于治療輻射或化療的造血祖細(xì)胞的方法，包括給予所述細(xì)胞mFLINT。這樣一種方法促進(jìn)造血祖細(xì)胞從治療輻射或化療的副作用中恢復(fù)。本發(fā)明包括促進(jìn)造血祖細(xì)胞的生長或分化的方法，包括給予所述細(xì)胞mFLINT。本發(fā)明還包括促進(jìn)CD34+細(xì)胞的生長或分化的方法，包括給予所述細(xì)胞mFLINT。
本發(fā)明還包括治療癌癥的方法，包括用mFLINT在體外治療骨髓細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞給予所述患者，其中在用治療輻射或化療治療所述患者后進(jìn)行所述給予。所述骨髓細(xì)胞可以是自體的(即來自接受治療的患者)或是異體的(即來自并非所述患者的個(gè)體)。
本發(fā)明還包括在接受治療輻射或化療的患者中治療細(xì)胞損傷的方法，包括將治療有效量的mFLINT與所述輻射或化療一起給予所述患者。所述細(xì)胞損傷可以是對腸上皮細(xì)胞、造血祖細(xì)胞或外周血細(xì)胞的損傷。
本發(fā)明還設(shè)想了治療再生障礙性貧血、脊髓發(fā)育不良綜合征或各類血細(xì)胞減少的病征的方法，包括給予遭受再生障礙性貧血的患者治療有效量的mFLINT。
附圖簡述圖1顯示了人FLINT的組合的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖2顯示了人FLINT的組合的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖3顯示了人mFLINT的組合的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖4顯示了人mFLINT的組合的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖5比較了在給予LPS不同時(shí)間后在動(dòng)物膿毒病模型中mFLINT與其它試劑的表現(xiàn)。
圖6的左圖顯示了在動(dòng)物膿毒病模型中比較mFLINT與抗TNF的實(shí)驗(yàn)。右圖在同一個(gè)模型中比較了更低劑量的mFLINT與抗TNF。
圖7顯示了在動(dòng)物膿毒病模型中比較靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)傳送mFLINT和抗TNF的實(shí)驗(yàn)。
圖8顯示了響應(yīng)mFLINT處理的B16黑素瘤體積減少。
圖9顯示了輻射后mFLINT促進(jìn)的骨髓祖細(xì)胞恢復(fù)。
圖10顯示了5-氟尿嘧啶處理后mFLINT促進(jìn)的骨髓祖細(xì)胞恢復(fù)。
發(fā)明詳述通過使用鑒定結(jié)合Fas配體的化合物的方法，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人FLINT多肽能夠破壞FasL-Fas受體相互作用。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)TNFR蛋白與它們各自的配體相互作用的方法，其中所述相互作用引起或加重疾病，申請人還發(fā)現(xiàn)了預(yù)防或治療疾病的方法。
如上文所提到的，相當(dāng)確定FasL-Fas受體結(jié)合的下游效應(yīng)之一是編程性細(xì)胞死亡。在表現(xiàn)出該途徑的異常激活的情況中，導(dǎo)致了失控的編程性細(xì)胞死亡，而失控的編程性細(xì)胞死亡是多種疾病病理學(xué)中的作用因素。FasL-Fas受體結(jié)合的另一個(gè)下游效應(yīng)是激活中性粒細(xì)胞，其中FasL激活的中性粒細(xì)胞破壞細(xì)胞。
最近發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)asL在腹膜滲出細(xì)胞(PEC)中誘導(dǎo)IL-1β的加工和釋放，而IL-lβ的加工和釋放引起中性粒細(xì)胞浸潤。尤其是Miwa K.等人Nature Medicine,4(11):1287-1292(1998年11月)發(fā)現(xiàn)，在野生型小鼠中接種表達(dá)Fas配體的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)大量的中性粒細(xì)胞浸潤，而與此相反，在IL-1αβ刪除的小鼠中中性粒細(xì)胞的浸潤受到抑制。這表明FasL具有炎性作用。還暗示編程性細(xì)胞死亡本身在某些情況下可能誘導(dǎo)炎癥。此外，已知某些炎性因子可以誘導(dǎo)Fas介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡途徑。因此，有可能FasL在施加它的病理影響時(shí)，通過兩個(gè)有可能不同但相關(guān)的途徑起作用。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LINT多肽以與FasL結(jié)合的親和生如果不是比Fas受體本身結(jié)合的親和性更大則至少相同。作為結(jié)合FasL的結(jié)果，F(xiàn)LINT多肽可以干擾FasL結(jié)合Fas受體并干擾下游事件。本發(fā)明人使用在下文的實(shí)施例中展示的各種體外模型和動(dòng)物模型，證明了FLINT多肽預(yù)防Fas介導(dǎo)的有害效應(yīng)的能力。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，明顯地看出FLINT可以作用于FasL活性的編程性細(xì)胞死亡方面和促炎方面兩方面，這意味著它在下面討論的幾種疾病狀態(tài)和損傷狀態(tài)中的應(yīng)用。
下面展示的數(shù)據(jù)顯示mFLINT抑制FasL的編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性和促炎活性兩者。通過拮抗FasL,mFLINT多肽可以調(diào)節(jié)由FasL激活的中性粒細(xì)胞引起的健康細(xì)胞破壞以及FasL-Fas相互作用直接介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡損傷引起的健康細(xì)胞破壞。因此，本發(fā)明的利用mFLINT的治療方法可以用于治療和預(yù)防與FasL的直接編程性細(xì)胞死亡效應(yīng)有關(guān)的疾病和/或FasL的促炎效應(yīng)介導(dǎo)的損傷，而不論這些效應(yīng)是否代表不同的病理學(xué)途徑。
因此，如一般所確定特征的，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療由“異常的編程性細(xì)胞死亡”引起或加重的病征，其中所述“異常的編程性細(xì)胞死亡”尤其指Fas配體(FasL)和Fas受體(Fas)結(jié)合(也稱為FasL-Fas結(jié)合)誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療由促炎反應(yīng)引起的病征，其中所述促炎反應(yīng)尤其指由Fas誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞激活引起的促炎反應(yīng)。
在本申請的全文中，標(biāo)題僅用于方便組織的目的，而不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是限制本文所述的主題。Ⅰ．定義下面的定義使用在本申請中。
如本申請所用，術(shù)語“FLINT”指任何全長的FLINT多肽。這樣一種全長的多肽包括前導(dǎo)序列，即FLINT多肽的第1-29氨基酸。FLINT的例子包括圖1中陳述的氨基酸序列的蛋白，即人FLINT，以及包括圖2中陳述的氨基酸序列的蛋白，即人FLINT的變異體。
如本申請所用，術(shù)語“mFLINT”指成熟的FLINT，即不具有前導(dǎo)(也稱為信號(hào))肽的FLINT。mFLINT的例子包括具有圖3陳述的氨基酸序列的蛋白，即缺少前導(dǎo)肽的圖1的蛋白，以及具有圖4陳述的氨基酸序列的蛋白，即缺少第1-29氨基酸的圖2的蛋白。因此，“mFLINT基因”是編碼mFLINT多肽的核酸。圖3和圖4中陳述的核酸是依照本發(fā)明的mFLINT基因的例子。
如本文所用，術(shù)語“不合適的”和“異常的”在指FasL或Fas表達(dá)或相互作用以及指任何引起的編程性細(xì)胞死亡時(shí)，應(yīng)當(dāng)被理解為包括從正常表達(dá)、相互作用或編程性細(xì)胞死亡水平的任何偏離。這樣的偏離包括暫時(shí)、定量和定性的異常。FasL或Fas“表達(dá)”不僅指轉(zhuǎn)錄、翻譯以及相關(guān)事件，還指任何導(dǎo)致有活性的FasL或Fas的可得性增加的過程，如轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞表面可得性/可達(dá)性。
如本文所用，術(shù)語“異常的編程性細(xì)胞死亡”指過量和/或不適當(dāng)?shù)木幊绦约?xì)胞死亡。通常在遭受物理、化學(xué)或生物損傷的細(xì)胞和組織中觀察到異常的編程性細(xì)胞死亡。這樣的損傷包括但不限制于物理損傷、病毒感染、細(xì)菌感染、局部缺血、輻射、化療等等。
術(shù)語“融合蛋白”代表在自然中未發(fā)現(xiàn)的雜種蛋白分子，包括翻譯融合體或酶促融合體，其中兩個(gè)或更多的不同蛋白或其片段在一條多肽單鏈中共價(jià)連接。
“宿主細(xì)胞”指適于增殖和/或表達(dá)包含在載體中的克隆基因的任何真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，其中所述載體通過，例如，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等引入所述宿主細(xì)胞。
“分離的核酸化合物”指無論是構(gòu)建或合成的在位置上與其天然位置不同的任何RNA或DNA序列。
術(shù)語“質(zhì)粒”指染色體外的遺傳元件。本文所公開的質(zhì)粒在商業(yè)上可得到、在無限制的基礎(chǔ)上公眾可得到、或可以按照公開的方法由容易得到的質(zhì)粒構(gòu)建。
“引物”是用作例如核酸化合物的酶促延伸或合成延伸的起始底物的核酸片段。
術(shù)語“啟動(dòng)子”指的是指導(dǎo)例如DNA轉(zhuǎn)錄為RNA的核酸序列。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是可以由如碳源、熱或金屬離子等環(huán)境信號(hào)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子通常在恒定的水平上操作，并且是無法調(diào)節(jié)的。
如本文所用，“重組DNA克隆載體”指任何自我復(fù)制的因子，包括但不限于質(zhì)粒和噬菌體，其中包括可以或已經(jīng)引入一個(gè)或多個(gè)附加DNA區(qū)段的DNA分子。
如本文所用，術(shù)語“重組DNA表達(dá)載體”或“表達(dá)載體”指任何重組DNA克隆載體，例如質(zhì)?；蚴删w，其中所述克隆載體中存在啟動(dòng)子和其它調(diào)節(jié)元件，因此使得插入的DNA(可能編碼一種多肽)能夠轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語“選擇性結(jié)合”指FLINT多肽結(jié)合FasL而不結(jié)合TNF∝的能力。
用于指肽或蛋白的“大致純”意味著所述肽或蛋白與其它細(xì)胞和非細(xì)胞分子(包括其它蛋白分子)分離。大致純的制備物的純度將至少為約85％；最好約95％。如本文所述，“大致純”的蛋白可以通過熟練技術(shù)人員所熟知的各種技術(shù)制備，包括例如IMAC蛋白純化方法。
如本文所用，術(shù)語“載體”指用于將外源或內(nèi)源DNA引入宿主細(xì)胞的核酸化合物。載體包括可以編碼一種或多種蛋白分子的核苷酸序列。通常使用的載體的例子有處于天然狀態(tài)或經(jīng)過重組工程化的質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體。
本文公開和描述的各種限制酶在商業(yè)上可以得到，并且本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟知使用所述酶的方法，包括反應(yīng)條件、輔因子和其它對活性的要求。按照廠家的建議實(shí)施特定酶的反應(yīng)條件。Ⅱ．FLINT結(jié)合FasL和LIGHTFLINT是TNFR超家族的新鑒定的成員。該受體家族介導(dǎo)TNF配體的各種生物學(xué)效應(yīng)，包括但不限制于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞毒性和編程性細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的FLINT多肽是包括胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。FLINT多肽不包括任何跨膜結(jié)構(gòu)域，因此是可溶性的。FLINT也稱為OPG3(osteoprotegrin 3)或TNFRsol。據(jù)信FLINT與TNFR 6α和TNFR 6β以及TR4密切相關(guān)，其中TNFR 6α和TNFR 6β在要求U.S.S.N.60/035,496的優(yōu)先權(quán)的WO98/30694中討論，TR4在EP 0861850A1中討論。
下面顯示的數(shù)據(jù)展示mFLINT在體外結(jié)合FasL和LIGHT。如已經(jīng)提到的，F(xiàn)asL參與觸發(fā)炎性反應(yīng)和誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。LIGHT的生物學(xué)功能包括但不限于細(xì)胞增殖。LIGHT是由激活的T細(xì)胞產(chǎn)生的29kDaⅡ型跨膜TNFR超家族成員蛋白。Mauri D.M.,Immunity,8:21(1998)。至于FasL，有證據(jù)將LIGHT與中性粒細(xì)胞浸潤和編程性細(xì)胞死亡聯(lián)系起來。Zhai等人，J.Clin.Investig.102:1142-51,1998。因此，如下文所述，預(yù)期mFLINT介導(dǎo)的LIGHT活性抑制在治療上確實(shí)可以用于mFLINT介導(dǎo)的FasL抑制，尤其是在免疫調(diào)節(jié)和癌癥治療中。Ⅲ．FLINT-治療應(yīng)用本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，mFLINT在體外防止FasL誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡?？笴D3抗體激活這些細(xì)胞，導(dǎo)致它們表達(dá)FasL并遭受編程性細(xì)胞死亡。mFLINT還以依賴于劑量的方式在體外有效抑制抗CD3誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。
由于mFLINT阻止FasL與Fas的相互作用，因此本發(fā)明可應(yīng)用于治療和/或預(yù)防與不合適的或異常的這種相互作用有關(guān)的疾病。例如，由于FasL和/或Fas的表達(dá)或可得性增加，可能出現(xiàn)這種不合適的相互作用。由于已知FasL-Fas相互作用誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，因此本發(fā)明的方法一般還應(yīng)用于特征在于不合適的或異常的編程性細(xì)胞死亡的疾病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療由FasL-Fas結(jié)合引起或加重的病征，其中包括FasL介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡和/或促炎反應(yīng)，更具體地說，是由FasL誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞激活引起的促炎反應(yīng)。
例如，可以使用mFLINT治療Down氏綜合征。神經(jīng)元細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡增強(qiáng)可能涉及Down氏綜合征。在這一方面，Seidi等人，Neuroscience Lett.260:9(1999)報(bào)道，在Down氏綜合征成人患者的顳葉和小腦內(nèi)，F(xiàn)as蛋白的水平升高，這暗示與Fas有關(guān)的編程性細(xì)胞死亡是Down氏綜合征中神經(jīng)變性的重要特征。因此，預(yù)期用mFLINT治療Down氏綜合征患者可能是有效的。尤其是本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)顯示mFLINT結(jié)合FasL、防止Fas-FasL結(jié)合并抑制編程性細(xì)胞死亡。相似地，已經(jīng)將編程性細(xì)胞死亡與Alzheimer氏病和其它神經(jīng)變性疾病聯(lián)系起來。預(yù)期給予mFLINT將降低與Down氏綜合征、Alzheimer氏病和其它神經(jīng)變性疾病有關(guān)的編程性細(xì)胞死亡增強(qiáng)。
本發(fā)明人已經(jīng)在顯示出不同疾病和損傷狀態(tài)的多種模型系統(tǒng)中測試了mFLINT。一些典型的疾病包括但不限于依賴于抗體的細(xì)胞毒性、人類免疫缺陷病毒的感染、溶血性尿毒綜合征、變態(tài)反應(yīng)和支氣管肺發(fā)育不良。因此，下面部分在對應(yīng)模型系統(tǒng)的范圍內(nèi)討論疾病和損傷狀態(tài)。
本發(fā)明還包括產(chǎn)生具有FLINT轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。具體地說，本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了產(chǎn)生可測量水平mFLINT的轉(zhuǎn)基因小鼠。如這些的動(dòng)物可用于評估m(xù)FLINT對下文詳述的多種疾病的效應(yīng)，其中所述疾病如內(nèi)毒素引起的休克、腦缺血、心臟再灌注損傷以及由癌癥治療(如治療輻射和化療)引起的損傷。A．用mFLINT治療肝損傷和炎癥已經(jīng)將FasL與急性肝衰竭聯(lián)系起來，其中所述肝衰竭包括但不限于在肝炎中對肝造成的損傷。在急性肝炎的小鼠模型中，給予小鼠抗FasL抗體在肝細(xì)胞中導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的肝衰竭，并且動(dòng)物在數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。Kondo等人，1997 Nature Medicine 3(4)409-413。還可見Galle等人，J.Exp.Med,1995年11月，182:1223-1230。
Tsuji等人(1998)，Infect.Immun.65:1892-1898描述了細(xì)菌誘發(fā)的暴發(fā)性肝炎的模型系統(tǒng)。如下文所述，該系統(tǒng)是肝和其它組織的多種疾病的預(yù)兆。在Tsuji等人的方法中，先給小鼠注射瘡皰丙酸桿菌(Propionbacterium acnes)，隨后給小鼠注射脂多糖(LPS)。在正常小鼠中，第一次注射導(dǎo)致肝中形成肉芽腫，而第二次注射誘導(dǎo)大量編程性細(xì)胞死亡以及隨后的肝損傷。Tsuji等人使用該方法將TNFRp55與肉芽腫形成聯(lián)系起來，將TNFRp55和Fas與編程性細(xì)胞死亡聯(lián)系起來。
本申請人使用Tsuji等人的動(dòng)物模型的改變形式，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)給予mFLINT顯著地提高測試動(dòng)物的存活率。如已經(jīng)指出的，許多依照本發(fā)明可治療和/或可預(yù)防的疾病共同具有FasL-Fas相關(guān)的病原學(xué)。因此，目標(biāo)疾病通常或者涉及組織不適當(dāng)?shù)?如暫時(shí)地、定性地或定量地)表達(dá)Fas，或者涉及組織在表達(dá)Fas時(shí)不適當(dāng)?shù)嘏cFasL接觸。許多這些疾病遵循不適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)Fas、隨后FasL介導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)的一般病理學(xué)模式。例如，炎癥損傷可以誘導(dǎo)Fas(或FasL)的不適當(dāng)表達(dá)，其中某些與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子有可能誘導(dǎo)表達(dá)。
例如，已知一期單核細(xì)胞浸潤導(dǎo)致多種細(xì)胞因子的分泌，而這可以導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)腇as和/或FasL表達(dá)。例如，已知IL-1α、IL-1β和TNF-α可以誘導(dǎo)Fas表達(dá)。這種增強(qiáng)的Fas表達(dá)實(shí)際上可以使受影響的組織對帶有FasL的效應(yīng)細(xì)胞敏感，其中所述效應(yīng)細(xì)胞如自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。帶有FasL的效應(yīng)細(xì)胞與帶有Fas的靶的接觸誘導(dǎo)后者的編程性細(xì)胞死亡。換句話說，這種肝損傷模型是特征在于(a)炎癥損傷和/或(b)FasL-Fas介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡和/或壞死的某些疾病的體內(nèi)替代。
與該模型一致的是移植物抗宿主疾病(GVHD)的病理學(xué)，該疾病在例如自體骨髓移植中非常普遍。破壞宿主細(xì)胞(至少部分通過FasL介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡)的宿主反應(yīng)性T細(xì)胞的存在導(dǎo)致GVHD。GVHD通常分為兩個(gè)期，稱為植入(afferent)期和排斥(efferent)期。植入期的特征在于對宿主抗原的識(shí)別和供體T細(xì)胞的增殖。在傳出期內(nèi)，如皮膚、肝和胃腸道等組織發(fā)炎，并且排斥期的特征在于單核細(xì)胞浸潤和組織病理損傷。事實(shí)上，使用FasL缺陷型小鼠的實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)asL在GVHD中肝、皮膚和淋巴器官損傷的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。因此，GVHD遵循炎癥損傷和Fas介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡的變化規(guī)律(paradigm)。
橋本甲狀腺炎(HT)也遵循這一規(guī)律。HT源于對甲狀腺濾泡細(xì)胞的自體免疫反應(yīng)。正常的甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生FasL并表達(dá)痕量水平的Fas。然而，在HT中，引起的炎癥導(dǎo)致激活的巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，這隨后誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生Fas。這就建立了導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡的致死FasL-Fas自分泌回路。
相似的，與動(dòng)脈粥樣硬化損傷有關(guān)的氧化的低密度脂蛋白(OxLDL)促進(jìn)慢性炎性反應(yīng)。雖然血管內(nèi)皮通常表達(dá)FasL和Fas兩者，但在不受到OxLDL損傷時(shí)它并不遭受編程性細(xì)胞死亡。然而，在用OxLDL處理時(shí)，F(xiàn)asL的表達(dá)增加并且內(nèi)皮細(xì)胞遭受編程性細(xì)胞死亡。
慢性腎衰竭與IL-1α和TNF-α的分泌有關(guān)，而已經(jīng)顯示這二者在腎小管上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)Fas表達(dá)。該疾病的特征在于通過FasL-Fas編程性細(xì)胞死亡途徑減少腎小管上皮細(xì)胞。而且在急性腎衰竭的內(nèi)毒素休克(膿毒病)模型中，在腎小管細(xì)胞中觀察到同樣的細(xì)胞因子介導(dǎo)的Fas表達(dá)的誘導(dǎo)。
在侵襲肝的病毒感染、侵襲肝的細(xì)菌感染、肝炎、肝細(xì)胞損傷和/或其它肝細(xì)胞遭受大量編程性細(xì)胞死亡的病理情況中，可以發(fā)現(xiàn)急性肝衰竭。例如，Galle等人(J.Exp Med.，1995年11月,182:1223-1230)發(fā)現(xiàn)FasL-Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡在人類肝衰竭中起作用。Galle等人知道FasL-Fas介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡是去除衰老肝細(xì)胞的一種機(jī)制。例如，已經(jīng)在肝再生中、停止用親脂化合物(如苯巴比妥)治療后的肝衰退中以及病毒感染中發(fā)現(xiàn)了這一機(jī)制。通過實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)在病毒性肝炎中，激活的T細(xì)胞攻擊肝細(xì)胞。Fas在肝細(xì)胞中組成型表達(dá)。這就是說，在T細(xì)胞激活時(shí)，F(xiàn)asL在T細(xì)胞中表達(dá)。據(jù)認(rèn)為T細(xì)胞在從肝清除HBV的過程中，有可能殺死表達(dá)乙型肝炎(HBV)抗原的肝細(xì)胞。
本發(fā)明人使用改良的Tsuji模型的成功還指出mFLINT可用于治療和預(yù)防膿毒病。膿毒病的特征在于在血液或組織中存在一種或多種致病生物或它們的毒素。此外，膿毒病的特征在于與多種宿主防御機(jī)制激活有關(guān)并介導(dǎo)的對感染的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，其中所述宿主防御機(jī)制包括細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)、淋巴細(xì)胞以及補(bǔ)體和凝固/纖維蛋白溶解作用系統(tǒng)。見Mesters等人，Blood,88:881(1996)。
已知內(nèi)毒素誘導(dǎo)組織壞死因子(TNF)，而組織壞死因子又誘導(dǎo)炎性反應(yīng)和FasL，因此促進(jìn)肝衰竭和死亡。然而，在治療膿毒病中使用結(jié)合TNF-α的抗體的努力都已經(jīng)一律失敗。這可能是由于以下事實(shí)TNF-α除了在膿毒病的病理學(xué)中的效應(yīng)外，還是更完全的正常免疫功能介質(zhì)。此外，如下文在實(shí)施例中所展示的，TNF抑制物在治療損傷后膿毒病中很少有用；比較起來它們在預(yù)防上更有用。
下面實(shí)施例中顯示的數(shù)據(jù)證實(shí)在動(dòng)物膿毒病模型中，mFLINT比TNF抑制物在促進(jìn)存活上更有效。事實(shí)上，這些數(shù)據(jù)顯示，TNF抑制物僅在用于預(yù)處理方案(即在給予LPS/半乳糖胺前)中有效，但mFLINT可以用于處理后方法。這在臨床上是有意義的，因?yàn)榛颊邔?shí)際上常常在暴露于內(nèi)毒素后才在外觀上表現(xiàn)出來。換句話說，這些數(shù)據(jù)顯示與TNF抑制物形成顯著對比，mFLINT可用于預(yù)防方法也可用于改善方法。這些數(shù)據(jù)最低限度指出，mFLINT可以在疾病進(jìn)行中比抗TNF遲一些給予；因此預(yù)期這可以避免在臨床上TNF抑制物所面臨的問題。
此外，這些數(shù)據(jù)顯示mFLINT在至少兩個(gè)水平上具有治療效果。已知內(nèi)毒素誘導(dǎo)TNF，而TNF直接誘導(dǎo)炎性反應(yīng)和FasL。上面Tsuji等人的數(shù)據(jù)指出這些代表兩個(gè)不同的途徑，而這兩個(gè)途徑都是造成肝衰竭和死亡的原因之一。尤其是，他們使用Fas缺陷型小鼠得到的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地暗示，在他們的模型中相當(dāng)大量的損傷是通過不依賴于Fas而依賴于TNF的途徑發(fā)生的。然而，下面展示的數(shù)據(jù)顯示，依賴于Fas途徑的抑制物mFLINT可以抑制所述模型中所有誘導(dǎo)的損傷，不管所述損傷是不是依賴于Fas的。因此，即使它們代表兩個(gè)不同的途徑，mFLINT也可以抑制由炎性反應(yīng)和FasL誘導(dǎo)所介導(dǎo)的損傷。
此外，設(shè)想mFLINT可以與其它在治療膿毒病中有用的藥物有利地聯(lián)合使用。例如，美國專利第5,009,889號(hào)展示了激活的蛋白C(aPC)在治療狒狒膿毒病模型中有效?？梢允褂眠@樣一種模型來確定合適的使用例如mFLINT和aPC的聯(lián)合治療方法。aPC可以預(yù)防與膿毒病有關(guān)的彌漫性血管內(nèi)凝血和在微脈管系統(tǒng)中的廣泛血纖蛋白沉積，其中后者是膿毒病/膿毒性休克的早期表現(xiàn)。
因此，基于在mFLINT處理的動(dòng)物中觀察到的改善的存活率，本發(fā)明人設(shè)想可以用mFLINT治療以下疾病中的一種或多種急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)；甲狀腺腫；肝細(xì)胞損傷(病毒性、細(xì)菌性、癌癥、創(chuàng)傷)；單核細(xì)胞增多癥；粘膜炎(mucocites)(粘膜的炎癥)；胰炎；牙周病/齒齦炎；腎衰竭；satellite organ failure；系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)；手術(shù)；血管出血(vascular bleed)；血管滲漏綜合征(vascular leak sydrome)；全器官移植；多器官功能紊亂(MODS)；冠狀動(dòng)脈旁路移植；同種移植；移植排斥；感染(如微生物感染、肺炎、組織壞死感染、病毒感染)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的骨損失；橋本甲狀腺炎；病毒，包括丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、Ebola(溶血熱)病毒和Epstein-Barr(EBV)病毒；皮膚炎癥；牛皮癬；炎性腸疾??；潰瘍性結(jié)腸炎；Crohn氏?。粍?dòng)脈粥樣硬化；晚期腎??；以及膿毒病。
更具體地說，本發(fā)明設(shè)想了治療與炎癥有關(guān)的疾病的方法。有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些疾病包括但不限于GVHD、橋本甲狀腺炎、ARDS、肝細(xì)胞損傷(病毒性、細(xì)菌性、癌癥、創(chuàng)傷)；粘膜炎(粘膜的炎癥)；胰炎、牙周病/齒齦炎；腎衰竭；(衛(wèi)星氣管衰竭(satelliteorgan failure)；系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)；全器官移植；多器官功能紊亂(MODS)；冠狀動(dòng)脈旁路移植；同種移植；移植排斥；感染(如微生物感染、肺炎、組織壞死感染、病毒感染)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；病毒感染，其中包括丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、Ebola(溶血熱)病毒和Epstein-Barr(EBV)病毒；皮膚炎癥；炎性腸疾??；動(dòng)脈粥樣硬化；以及膿毒病。B．用mFLINT治療局部缺血和再灌注局部缺血的特征在于到組織的血流減少，由此導(dǎo)致多種有毒代謝物的積累。這些代謝物是造成源于壞死和/或編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡的原因之一?？赡荏@人的是，當(dāng)再灌注組織時(shí)，編程性細(xì)胞死亡損傷增加。這可能是通過局部缺血誘導(dǎo)的代謝物與血清成分的反應(yīng)產(chǎn)生了自由基和其它毒素。在任何情況下，研究顯示編程性細(xì)胞死亡損傷至少部分源于Fas介導(dǎo)的途徑。下面顯示的實(shí)驗(yàn)展示了mFLINT可用于阻止局部缺血/再灌注損傷(可能是通過抑制FasL)。
下面顯示的數(shù)據(jù)證實(shí)了mFLINT組合物在治療或預(yù)防與大腦局部缺血有關(guān)的疾病(如中風(fēng)和頭部創(chuàng)傷)中的有用性。顯示了使用廣泛性中風(fēng)的活體沙土鼠模型的模型。通過暫時(shí)阻塞頸總動(dòng)脈誘導(dǎo)大腦缺血，然后用mFLINT或載體對照進(jìn)行治療。數(shù)據(jù)顯示，用mFLINT處理的沙土鼠比用載體處理的對照組保留了顯著更多的活的神經(jīng)元。
這些數(shù)據(jù)與其它研究相一致，在這些研究中比較了在缺乏有功能的Fas受體的小鼠中受到大腦局部缺血損傷后梗塞腦組織的程度，發(fā)現(xiàn)比正常對照顯著小得多的損傷。Rosenbaum等人，Annals ofNeurology,44(3),441,1998。因此，預(yù)料mFLINT將在已經(jīng)遭受大腦局部缺血發(fā)作的患者體內(nèi)干擾Fas受體的正常信號(hào)過程，因此保護(hù)腦組織不會(huì)變壞。
另外，在一個(gè)心肌梗死模型中，已經(jīng)將Fas介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡與局部缺血再灌注損傷聯(lián)系起來。Kajstura等人，Laboratoryinvestigation 74:86-107(1996)。因此，前述的沙土鼠模型可能是廣義的局部缺血再灌注損傷的前兆。為支持這一觀點(diǎn)，本發(fā)明人使用心肌細(xì)胞進(jìn)行了體外分析。具體地說，將心肌細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)8小時(shí)，然后在正常O2下培養(yǎng)16小時(shí)，這模擬了在局部缺血的心組織中的低氧環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用mFLINT處理心肌細(xì)胞保護(hù)所述細(xì)胞免受低氧誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。尤其是使用10μg/ml mFLINT的處理導(dǎo)致抑制90％的低氧誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。用mFLINT處理也抑制心肌細(xì)胞的FasL誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。
根據(jù)前述觀察和數(shù)據(jù)，本發(fā)明人設(shè)想可以用mFLINT治療下面的一種或多種疾病中風(fēng)；脊髓局部缺血；子癇/子癇前期；再灌注損傷；心肌梗塞，心肌梗塞的急性、亞急性和慢性后遺癥以及相關(guān)的臨床綜合征，其中包括但不限于充血性心力衰竭。因此，F(xiàn)LINT可用于促進(jìn)心臟搶救和預(yù)防代償性心臟肥大。
再灌注損傷可以在許多組織中發(fā)生，源于多種損傷，其中包括腸損傷、燒傷、心臟旁路機(jī)械損傷(cardiac bypass machine injury)、肝損傷(創(chuàng)傷引起的)、溶血熱(Ebola)、新生兒毒性(高氧含量的氧過多的恒溫箱)、limb crush lung injury/ARDS、器官移植、多處創(chuàng)傷(multipletrauma)(如源于車禍)、血管床的保護(hù)、常常出現(xiàn)在膿毒病和其它疾病中的血管性器官衰竭(vascular organ failure)。這些觀察還指出，mFLINT可用于預(yù)防/減弱急性心肌梗塞后心肌細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡，并且廣泛地用于預(yù)防由于低氧對心組織和其它組織造成的損傷。
例如，在器官保存的情況下為采集作準(zhǔn)備時(shí)，在預(yù)防上可用mFLINT預(yù)防器官一旦從供體中取出后與對所述器官造成局部缺血再灌注損傷有關(guān)的編程性細(xì)胞死亡。典型的方法涉及在采集器官前用有效量的mFLINT預(yù)處理供體。用另一種方法，可以用含有mFLINT的溶液灌注或浸洗采集的器官，或者可以將兩種方法結(jié)合起來。例如，這種方法可應(yīng)用于腎、心臟、肺和其它器官和組織。
在另一個(gè)實(shí)施例中，mFLINT可用于治療與血栓形成或血凝性過高有關(guān)的局部缺血再灌注損傷。因此，可以將mFLINT與溶栓劑(如尿激酶和鏈激酶)和/或抗凝劑(如激活的蛋白C(aPC))一起給予。美國專利第5,350,578號(hào)描述了aPC的抗凝活性。該文公布的狒狒動(dòng)物模型可用于確定所設(shè)想的聯(lián)合治療的有益給藥方案。在這一方面，預(yù)期可以用添加或不添加aPC的mFLINT治療下述疾病子癇和子癇前期，其特征在于凝血病增加的狀態(tài)；HELLP(血小板減少并發(fā)子癇前期、溶血和肝功能異常)；HITS(肝素誘導(dǎo)的血小板減少)；彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)；燒傷；以及源于手術(shù)的血管栓塞并發(fā)癥。
如上文所提到的，研究顯示在再灌注時(shí)引起了大量編程性細(xì)胞死亡損傷。這種損傷看起來至少部分源于氧化損傷，因?yàn)榭寡趸瘎┛梢詼p少所述損傷。同樣，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗氧化劑維生素E可以用作肉類防腐劑，可能其作用是預(yù)防導(dǎo)致酸敗的同樣類型的損傷。已經(jīng)顯示在屠宰前幾天給予豬維生素E增加豬肉的儲(chǔ)藏期限。因此，設(shè)想mFLINT可以相似地用于保存組織和器官。這對于增加人類消費(fèi)的器官和肉類的儲(chǔ)藏期限特別有用。C．用mFLINT治療造血疾病如本申請所討論，mFLINT抑制Fas/FasL相互作用，從而預(yù)防編程性細(xì)胞死亡。如下面所討論的，已經(jīng)將Fas/FasL相互作用與血細(xì)胞形成的過程聯(lián)系起來。因此，本申請?jiān)O(shè)想了改善從多種治療和疾病的血液恢復(fù)的基于mFLINT的治療方法，其中所述治療和疾病包括骨髓移植、化療、放射療法、再生障礙性貧血以及脊髓發(fā)育不良綜合征、各類血細(xì)胞減少的病征。本發(fā)明還覆蓋對任何需要骨髓細(xì)胞譜系的擴(kuò)增的病征的基于mFLINT的治療，其中所述治療單獨(dú)進(jìn)行或與其它血液生長因子組合進(jìn)行。這樣的生長因子包括但不限制于促紅細(xì)胞生成素(EPO)、FLT-3配體、血小板生成素(TPO)、干細(xì)胞生長因子(SCF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)以及粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
自體和異體骨髓移植常常用來治療許多腫瘤疾病。在自體骨髓移植中，從待治療的患者體內(nèi)取出骨髓細(xì)胞并在體外培養(yǎng)。在化療和/或放射治療后，將所述細(xì)胞再引入所述患者。在異體骨髓移植中，由第二個(gè)個(gè)體提供骨髓細(xì)胞。用于治療這些疾病的化療或放射治療由于對骨髓腔和腸上皮造成傷害，引起顯著的骨髓抑制，使患者遭受免疫抑制并對微生物的侵襲易感。已經(jīng)顯示用造血細(xì)胞因子處理移植的骨髓細(xì)胞，導(dǎo)致血液中骨髓譜系和紅細(xì)胞譜系恢復(fù)的改善，雖然通常存在與使用這些細(xì)胞因子有關(guān)的毒性，并且一種細(xì)胞因子通常不能增強(qiáng)所有譜系的恢復(fù)。Moore,M.A.S.Blood 78:1(1991)；Metcalf,D.Science 254:529(1991)。
已經(jīng)顯示輻射或化療誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。已知Fas/FasL途徑在易感細(xì)胞中誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。最近的報(bào)道描述了Fas/FasL涉及造血作用。綜述可見Niho等人；CurrentOpinion in Hematology,5:163(1998)。Fas在CD34+祖細(xì)胞上表達(dá)，并且這些細(xì)胞對Fas刺激的編程性細(xì)胞死亡效應(yīng)敏感。Nagafuji等人，Blood,86:883-889(1995),Sato等人，Br J Haematol,97:356(1997)。Yamane等人，Eur J Haematol,58:289(1997)。此外，已經(jīng)顯示用細(xì)胞因子體外擴(kuò)增造血祖細(xì)胞正調(diào)節(jié)有功能的Fas的表達(dá)，并且目前認(rèn)為Fas可能在造血的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中作為負(fù)調(diào)節(jié)物在體內(nèi)起作用。Takenaka等人，Blood,88:2871(1996),Stahnke等人，Exp.Hematol.26:844(1998)。1．mFLINT與輻射和化療本發(fā)明人已經(jīng)顯示mFLINT改善曾經(jīng)暴露于輻射中的骨髓祖細(xì)胞的恢復(fù)。具體地說，用輻射照射小鼠，然后取出骨髓細(xì)胞并用細(xì)胞因子IL-6和CSF在體外培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入mFLINT顯著改善骨髓祖細(xì)胞(即紅細(xì)胞系細(xì)胞的祖先)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞和紅細(xì)胞系單核細(xì)胞巨核細(xì)胞(erythroid monocyte megakaryocyte)的恢復(fù)。本發(fā)明人也已經(jīng)顯示mFLINT提高從5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠收獲的骨髓細(xì)胞的存活率。抗FasL抗體也增加取自5-FU處理的小鼠的細(xì)胞的存活率。
因此，本發(fā)明包括使用mFLINT作為輻射保護(hù)劑和/或化學(xué)保護(hù)劑。mFLINT可用于在自體或異體移植之前增強(qiáng)骨髓祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增和成熟。在用輻射或化療治療患者后，也可以用mFLINT促進(jìn)祖細(xì)胞的擴(kuò)增和成熟。在這一方面，預(yù)期當(dāng)用癌癥療法(化療或放射治療)治療患者后，給予所述患者mFLINT將促進(jìn)祖細(xì)胞的擴(kuò)增和成熟。在用癌癥療法和骨髓抑制劑(在癌癥治療中阻止祖細(xì)胞的循環(huán))治療的患者中，預(yù)期mFLINT將促進(jìn)祖細(xì)胞的擴(kuò)增和成熟。
如上文所提到的，在接受癌癥治療的患者中，細(xì)胞因子用于在體外和體內(nèi)增強(qiáng)紅細(xì)胞系和骨髓細(xì)胞譜系的擴(kuò)增。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)顯示mFLINT改善用細(xì)胞因子處理的細(xì)胞的擴(kuò)增。因此，本發(fā)明設(shè)想與一種或多種細(xì)胞因子聯(lián)合使用mFLINT，在體外和體內(nèi)擴(kuò)增骨髓祖細(xì)胞。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)用于改善由化療或放射治療所引起的骨髓抑制的恢復(fù)。因此，本發(fā)明設(shè)想使用mFLINT和GM-CSF的組合去改善從骨髓抑制的恢復(fù)。
本發(fā)明人還已經(jīng)顯示抗FasL抗體也改善從5-FU處理的骨髓細(xì)胞的恢復(fù)。因此，本發(fā)明設(shè)想使用抗FasL在化療或放射治療之后改善骨髓細(xì)胞的恢復(fù)。這樣一種抗體可用于為異體或自體移植在體外擴(kuò)增骨髓細(xì)胞。也可以體內(nèi)給予抗FasL抗體以改善化療、放射治療和/或給予骨髓抑制劑引起的骨髓抑制的恢復(fù)。
當(dāng)用mFLINT治療患者時(shí)，系統(tǒng)地給予將是合適的。如在本申請中使用，與化療或輻射“一起”給予mFLINT包括所有以下給予mFLINT的模式(1)用mFLINT預(yù)處理，然后進(jìn)行放射治療或化療；(2)同時(shí)給予mFLINT和化療或放射治療；(3)首先化療或放射治療，然后給予mFLINT；(4)用mFLINT預(yù)處理，接著進(jìn)行放射治療或化療，隨后給予mFLINT。本發(fā)明包括在一種或多種前述的治療模式中使用mFLINT。2．治療外周血細(xì)胞減少癥本發(fā)明還設(shè)想治療與造血疾病(如再生障礙性貧血和脊髓發(fā)育不良綜合征)有關(guān)的外周血細(xì)胞減少。已經(jīng)顯示Fas/FasL介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡抑制淋巴細(xì)胞生成。Yasutomo等人，J.Immunol.157:1981(1996)。已經(jīng)在來自患有再生障礙性貧血的患者的祖細(xì)胞中觀察到增強(qiáng)的Fas表達(dá)。Young,N.S.,Eur.，Hematol.60(增刊):55(1996)。在來自患有脊髓發(fā)育不良綜合征的患者的祖細(xì)胞中也觀察到了增強(qiáng)的Fas表達(dá)。
另外，Maria等人報(bào)道，F(xiàn)as在早期成紅血細(xì)胞中迅速地受到正調(diào)節(jié)并在整個(gè)終末成熟期間以高水平表達(dá)。Blood 93:796(1999)。Maria等人還報(bào)道，未成熟的血細(xì)胞是依賴于EPO的，并且表達(dá)有功能的Fas分子。在產(chǎn)生FasL的成熟成紅血細(xì)胞的存在下，未成熟的細(xì)胞除非暴露于高水平的EPO中，否則遭受編程性細(xì)胞死亡。Maria等人提出Fas/FasL系統(tǒng)與EPO一起促成紅細(xì)胞生成的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
雖然不希望受限于任何具體的理論，但造血作用的減少和因此而發(fā)生的血細(xì)胞減少可能是編程性細(xì)胞死亡的直接結(jié)果，而編程性細(xì)胞死亡可能是通過Fas和Fas配體的正調(diào)節(jié)而介導(dǎo)的。如在本申請中別處所述，mFLINT抑制Fas/FasL結(jié)合，抑制編程性細(xì)胞死亡，并且mFLINT還增強(qiáng)造血祖細(xì)胞的生長和成熟。因此，預(yù)期使用mFLINT將抑制造血疾病所引起的編程性細(xì)胞死亡，因此減輕與這些疾病有關(guān)的一種或多種癥狀。此外，由于未成熟的造血細(xì)胞對FasL誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡易感，并且個(gè)體缺乏分化的造血細(xì)胞，因此預(yù)期給予這樣的個(gè)體mFLINT將通過抑制FasL誘導(dǎo)的未成熟造血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡而改善這些成熟缺陷。
可以通過直接給予受影響的個(gè)體mFLINT、或通過用mFLINT體外處理骨髓細(xì)胞，然后將其移植進(jìn)患病個(gè)體，進(jìn)行對所述患有造血疾病的個(gè)體的治療。
通過給予EPO和其它促進(jìn)造血祖細(xì)胞生長和/或成熟的化合物，可以增強(qiáng)使用mFLINT的治療。已知細(xì)胞因子刺激造血祖細(xì)胞的生長。因此，本發(fā)明還包括在患有如血小板減少和脊髓發(fā)育不良綜合征等疾病的個(gè)體中，使用mFLINT與一種或多種細(xì)胞因子的組合來促進(jìn)這樣的祖細(xì)胞的生長和分化。3．基因治療也可以將mFLINT與基因治療聯(lián)用。當(dāng)要將造血祖細(xì)胞移植進(jìn)個(gè)體中時(shí)，用合適的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染所述造血祖細(xì)胞，并且還用mFLINT處理，可選地與一種或多種細(xì)胞因子聯(lián)用。在培養(yǎng)所述細(xì)胞后，將它們移植進(jìn)個(gè)體。這樣的基因治療可用于將所需的性質(zhì)賦予所述血細(xì)胞。D．用mFLINT保護(hù)無辜受殃組織眾所周知許多損傷細(xì)胞的治療方法，如用于治療癌癥的化療和治療輻射導(dǎo)致所謂“無辜受殃”組織的損傷和編程性細(xì)胞死亡。如本申請中所用，“無辜受殃”組織是藥物治療、放射治療或儀器輔助治療損傷的無病組織。這些組織包括但不限于胃上皮(包括襯于口腔、食管、胃和腸道的上皮)、肺上皮、血細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板)、腎上皮和毛囊。許多這些組織的特征在于它們的組成細(xì)胞的快速生長和/或更新。
“損傷細(xì)胞的”治療包括但不限于化療(如順式鉑氨、阿霉素、絲裂霉素C、喜樹堿和氟尿嘧啶以及其它核苷類似物)、治療輻射、激光治療以及給予吸入的毒素(如博來霉素)。與儀器輔助的治療有關(guān)的物理操作，如從冠狀動(dòng)脈中物理去除阻塞，也可能對無辜受殃組織造成損傷。如上文所提到的，雖然這些損傷細(xì)胞的治療由于損傷和殺死患病組織而是有用的，但它們具有不希望的損傷“無辜受殃”組織和誘導(dǎo)“無辜受殃”組織的編程性細(xì)胞死亡的副作用。
如本申請別處所討論的，mFLINT阻斷Fas/FasL相互作用。本文也已經(jīng)展示mFLINT在體外抑制FasL誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡，并且mFLINT在治療輻射和化療后提高骨髓細(xì)胞的存活率。因此，本發(fā)明的目的之一是減輕由損傷細(xì)胞的治療對無辜受殃組織造成的損傷。
已經(jīng)顯示癌癥治療如輻射和化療在腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。已知許多化療劑通過誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡起作用。見如Micheau等人，J.Natl.Can.Inst.89:783(1997)。這種編程性細(xì)胞死亡與輻射和化療引起的骨髓抑制一起使得有可能發(fā)生大量的機(jī)會(huì)感染。目前還沒有有效地處理與化療和治療輻射有關(guān)的腸功能破壞的療法。如上文所提到的，已經(jīng)顯示用細(xì)胞因子的治療改善從骨髓抑制的恢復(fù)，但細(xì)胞因子可能產(chǎn)生不希望的毒性。
因此，預(yù)期mFLINT將減輕輻射和/或化療引起的對腸上皮的損傷。雖然不希望受限于任何具體的理論，但預(yù)期mFLINT將通過抑制腸上皮的編程性細(xì)胞死亡和/或腸上皮的炎癥來減輕這種損傷。
已經(jīng)將Fas/FasL相互作用與慢性胃炎聯(lián)系起來。已經(jīng)顯示在來自患有慢性胃炎的個(gè)體的胃上皮細(xì)胞中，F(xiàn)as和FasL的表達(dá)增加。見Rudi等人，J.Clin.Invest.102:1506(1998)。Rudi還報(bào)道螺桿菌(Helicobacter)感染的胃上皮細(xì)胞具有提高的FasL(CD95配體)和Fas(CD95受體)水平，并且用抗APO-1抗體封閉FasL減少了螺桿菌誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。因此，預(yù)期mFLINT可以有效地抑制(ⅰ)由螺桿菌誘導(dǎo)的胃炎，以及上文所提到的(ⅱ)損傷細(xì)胞的治療，如化療和輻射。
此外，接受高劑量化療(HD-CT)的患者有患嚴(yán)重的粘膜炎的危險(xiǎn)，其中粘膜炎的特征在于胃上皮的編程性細(xì)胞死亡和炎癥。Wymenga等人，Br.J.Cancer 76:1062(1997)研究了用HD-CT治療的乳癌患者的口腔中的粘膜炎。在用HD-CT治療的患者中，在口腔洗液中出現(xiàn)的活上皮細(xì)胞的百分率增加，暗示口腔粘膜表層的脫落。同時(shí)，在HD-CT患者的口腔粘膜中有較高百分率的未成熟細(xì)胞。
其它無辜受殃組織也可以從mFLINT治療中受益。例如，已經(jīng)將Fas/FasL誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡與博來霉素在肺上皮中誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡和纖維變性聯(lián)系起來。Hagimoto等人，Am.J.Repir.Cell.Mol.Biol.16:91(1997)。該研究顯示在用博來霉素處理的肺泡上皮細(xì)胞中，F(xiàn)as mRNA受到正調(diào)節(jié)，并且FasL mRNA在浸潤的淋巴細(xì)胞中受到正調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明人預(yù)期，mFLINT可以減輕由損傷細(xì)胞的治療在肺組織(如上皮)中引起的損傷。E．用mFLINT治療癌癥本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，給予小鼠mFLINT減少了在給小鼠注射黑素瘤細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的腫瘤的體積。mFLINT可能是通過mFLINT/FasL結(jié)合和隨后的對FasL介導(dǎo)的T細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的抑制，使T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有可能發(fā)生以便利對腫瘤的破壞，從而介導(dǎo)這種效應(yīng)。在這樣方面，已知FasL在黑素瘤、人結(jié)腸直腸癌、肝細(xì)胞癌、星形細(xì)胞癌和肺癌中表達(dá)。O’Connell等人，ImmunologyToday插頁*，Chappell等人，Cancer Immunol.Immunother.47:65(1998)。也已經(jīng)報(bào)道結(jié)腸癌細(xì)胞系表達(dá)FasL并可以在體外通過誘導(dǎo)FasL介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡而殺死T細(xì)胞。O’Connell。因此，本申請中觀察到的黑素瘤可能表達(dá)FasL，觸發(fā)表達(dá)Fas的浸潤T細(xì)胞的FasL介導(dǎo)的死亡。然而，其它機(jī)制也可能是在本申請中展示的腫瘤減小的原因。
基于本發(fā)明的發(fā)明人用mFLINT介導(dǎo)的腫瘤體積減小獲得的成功，預(yù)期可以用mFLINT成功地治療其它類型的癌癥。這些癌癥包括但不限于星形細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、食管癌、肺癌、黑素癌和肝細(xì)胞癌。其它可以用mFLINT治療的癌癥包括膀胱癌和卵巢癌。F．用mFLINT治療自身免疫病Ⅰ型糖尿病(依賴于胰島素)和Ⅱ型糖尿病(不依賴于胰島素)的特征都在于高血糖。如本文所用，本領(lǐng)域內(nèi)熟知的術(shù)語“高血糖”描述了特征在于血糖濃度高于正常人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的血糖濃度的病征。正常人的禁食血糖水平低于110mg/ml。The Expert Committee on theDiagnosis and Classification of Diabetes Mellitus,Diabetes Care,21(增刊1)，S5-S19(1992)。
Ⅰ型依賴于胰島素的糖尿病(IDDM)是涉及通過FasL-Fas途徑破壞胰(產(chǎn)生胰島素的)β細(xì)胞的慢性自身免疫病。可能炎癥過程激活了這個(gè)破壞途徑。正常β細(xì)胞不表達(dá)Fas，但在胰島炎期間Fas在這些細(xì)胞中表達(dá)。因此與淋巴細(xì)胞有關(guān)的FasL有可能是通過FasL-Fas相互作用造成這些Fas+細(xì)胞局部破壞的原因之一。在某種程度上mFLINT可用于拮抗這個(gè)途徑，它可用于預(yù)防或治療IDDM。
多發(fā)性硬化(MS)是一種退行性炎癥脫髓鞘病。在急性和慢性MS中，都已經(jīng)在位于病灶邊緣和臨近的白色物質(zhì)中的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Fas，而正常的組織中幾乎沒有或沒有Fas。有可能炎癥過程中釋放的細(xì)胞因子誘導(dǎo)這種Fas的異常表達(dá)。此外，已經(jīng)將表達(dá)FasL的細(xì)胞與表達(dá)Fas的編程性細(xì)胞死亡的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一起定位，暗示該途徑涉及這種疾病的病理學(xué)。也可以用mFLINT治療另一種自身免疫病狼瘡。G．用mFLINT治療骨質(zhì)蔬松癥下面實(shí)施例中顯示的數(shù)據(jù)表明，mFLINT可用于預(yù)防或治療骨損失的疾病，如骨質(zhì)疏松癥。mFLINT也可用于抑制骨吸收。這些數(shù)據(jù)與顯示最近報(bào)道在調(diào)節(jié)骨吸收中起作用的TNFR超家族天然出現(xiàn)的分泌成員的數(shù)據(jù)一致。Simonet等人，Cell 89:309(1997)(名為osteoprotegrin(OPG)；Tsuda等人，Biochem.and Biophys.Res.Comm.234:137(1997)(名為破骨細(xì)胞生成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF))，所述成員主要作為吸收骨的破骨細(xì)胞的分化的抑制物起作用。與此一致的是，研究已經(jīng)將Fas與破骨細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡直接聯(lián)系起來。Jilka等人，J.Bone & Mineral Res.13:793-802；Kawakami等人，1997,J.Bone & Mineral Res.12:1637-46。Ⅳ．mFLINT的治療制劑以與醫(yī)療質(zhì)量管理規(guī)范(good medical practice)一致的方式配制和給予mFLINT多肽組合物，其中考慮各個(gè)患者的臨床情況(特別是單獨(dú)使用mFLINT多肽治療的副作用)、mFLINT多肽組合物的傳送位點(diǎn)、給藥方法、給藥計(jì)劃以及其它醫(yī)師知道的因素。
有效量的多肽導(dǎo)致在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著調(diào)節(jié)所選定的TNFR家族配體(如FasL或LIGHT)的生物活性。FasL的生物活性包括但不限于編程性細(xì)胞死亡。LIGHT的生物活性包括但不限于細(xì)胞增殖。LIGHT是由激活的T細(xì)胞產(chǎn)生的29kDa的Ⅱ型跨膜TNF超家族成員蛋白。Mauri d.M.,Immunity,8:21-30,1998年1月。
此外，可以根據(jù)對要治療的疾病、損傷或紊亂的不利病征或癥狀的預(yù)防或減輕而確定有效劑量。因此根據(jù)這樣的考慮確定本文為此目的的“治療有效量”的mFLINT。應(yīng)該注意到mFLINT是一種免疫調(diào)節(jié)物，并且對這樣的物質(zhì)的一般觀察是鐘形的劑量反應(yīng)曲線。這樣一種現(xiàn)象在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且一般的臨床醫(yī)生因此在調(diào)節(jié)治療有效量的mFLINT時(shí)會(huì)將這一點(diǎn)考慮在內(nèi)。
作為一般的比例，腸胃外給予的每劑量總的治療有效量mFLINT將處于根據(jù)患者體重的約1μg/kg/天到10mg/kg/天的范圍內(nèi)，尤其是2-8mg/kg，優(yōu)選2-4mg/kg，更優(yōu)選2.2mg/kg到3.3mg/kg，最好是2.5mg/kg。然而，如上文所指出的，這將由治療判斷決定。該劑量最好是至少0.01mg/kg天。
假如連續(xù)給予mFLINT，通常將mFLINT多肽以約0.1μg/kg/小時(shí)到約50μg/kg/小時(shí)的劑量率給予，所述給予或者通過每日注射1-4次，或者通過，例如，使用微型泵連續(xù)皮下輸注。也可以使用靜脈內(nèi)袋裝溶液(intravenous bag solution)。觀察到變化所需的治療時(shí)間長度以及治療后發(fā)生反應(yīng)所需的間隔看起來依據(jù)所需效應(yīng)而不同。
可以使用多種方法給予本發(fā)明的含有mFLINT的藥用組合物，其中所述方法包括但不限于口服給予、直腸給予、顱內(nèi)給予、腸胃外給予、腦池內(nèi)給予、陰道內(nèi)給予、腹膜內(nèi)給予、體表給予、經(jīng)皮給予(如通過粉劑、軟膏劑、滴劑或經(jīng)皮貼劑、經(jīng)頰給予或作為口腔噴霧劑或鼻噴霧劑給予?！八帉W(xué)上可接受的載體”是指無毒的固體、半固體或液體填充物、稀釋劑、成膠囊材料或任何形式的配制輔助劑。如本文所用，術(shù)語“腸胃外的”是指包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下以及關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注的給藥模式。也可以使用含有mFLINT的植入物。
也可以通過持續(xù)釋放系統(tǒng)合適地給予mFLINT多肽。持續(xù)釋放的組合物的合適例子包括成形制品(如膜或微膠囊)形式的半透性聚合物基質(zhì)。持續(xù)釋放的基質(zhì)包括聚交酯(美國專利第3,773,919號(hào)、EP58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman,U.等人，Biopolymers 22:547-556(1983))、聚異丁烯酸2-羥乙酯(R.Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)，以及R.Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(R.Langer等人，同前)或聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。持續(xù)釋放的mFLINT多肽組合物也包括脂質(zhì)體包裹的mFLINT多肽。通過本身已知的方法制備含有mFLINT多肽的脂質(zhì)體DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EDP143,949；EP 142,641；日本專利申請83-118008；美國專利第4,485,045號(hào)和第4,544,545號(hào)；以及EP 102,324。一般來說，所述脂質(zhì)體是小的(約200-800埃)單層類型，其中脂質(zhì)含量是大于約30％(摩爾)的膽固醇，根據(jù)最適的TNFR多肽療法調(diào)節(jié)選定的比例。
在一個(gè)實(shí)施方案中，為腸胃外給予，通常將mFLINT多肽以所需要的純度并以可注射單位劑型(溶液、懸浮液或乳濁液)與藥學(xué)上可接受的載體混合，其中所述藥學(xué)上可接受的載體是在所使用的劑量和濃度下對受體無毒并且與制劑中的其它成分相容的載體。例如，所述制劑最好不包括氧化劑以及其它已知對多肽有害的化合物。
通常通過使mFLINT多肽與液體載體或細(xì)碎的固體載體或者這二者均勻并且密切地接觸，制備所述制劑。然后，如果需要，將所述產(chǎn)品定型成所需的制劑。所述載體最好是腸胃外載體，更優(yōu)選是與受體的血液等滲的溶液。這樣的載體的例子包括水、鹽水、Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。本文中也可以使用非水性的載體，如固定油和油酸乙酯以及脂質(zhì)體。
所述載體可以包含少量添加劑，如增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這樣的材料在所使用的劑量和濃度下對受體是無毒的，并且包括緩沖液(如磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、琥珀酸緩沖液、乙酸緩沖液以及其它有機(jī)酸或它們的鹽的緩沖液)；抗氧化劑(如抗壞血酸)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽(如多聚精氨酸或三肽)；蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；親水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸)；單糖、二糖以及其它糖(包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合劑(如EDTA)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；平衡離子(如鈉離子)；和/或非離子表面活性劑(如聚山梨酯、聚羥亞烴(poloxamers)或PEG)。
通常在這樣的載體中，以約3到8的pH，在約0.1mg/ml到100mg/ml、最好是1-10mg/ml的濃度下配制mFLINT多肽。可以理解使用某些前述的賦形劑、載體或穩(wěn)定劑將導(dǎo)致mFLINT多肽鹽的形成。
用于治療用給予的FLINT多肽必須是無菌的。通過用除菌濾膜(如0.2微米的膜)過濾，可以容易地達(dá)到無菌。通常將治療用mFLINT多肽組合物置于帶有無菌進(jìn)入口的容器中，所述容器如靜脈溶液袋(intravenous solution bag)或具有可被皮下注射針頭穿透的塞子的管形瓶。
通常將FLINT多肽作為水溶液或需要復(fù)原的凍干制劑儲(chǔ)存在單位或多劑量容器，如密封的安瓿或管形瓶。作為凍干制劑的一個(gè)例子，在10ml管形瓶內(nèi)注入5ml無菌過濾的1％(w/v)mFLINT多肽水溶液，并將得到的混合物凍干。使用抑菌的注射用水復(fù)原凍干的mFLINT多肽，制備輸注用溶液。
本發(fā)明還提供了包括一個(gè)或多個(gè)容器的藥包或藥盒，其中所述容器盛有本發(fā)明的藥用組合物的一種或多種成分。與這樣的容器在一起的是采用由管制藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的注意事項(xiàng)，該注意事項(xiàng)反映了該機(jī)構(gòu)同意為給予人體的生產(chǎn)、使用或銷售。此外，可以與其它治療化合物一起使用本發(fā)明的多肽。Ⅴ．多肽生產(chǎn)方法本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及基本純化的由mFLINT基因編碼的蛋白或基本純化mFLINT基因。
熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的多肽可以用多種不同的方法合成，如本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的化學(xué)方法，其中包括固相肽合成或重組方法。美國專利4,617,149描述了這兩種方法。
固相化學(xué)合成多肽的原理是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，可以在本領(lǐng)域內(nèi)的一般教科書中找到。例如，見H.Dugas和C.Penney,BIOORGANIC CHEMISTRY(1981)Springer-Verlag,New York,54-92。例如，可以利用由Applied Biosystem提供的Applied Biosystems430A肽合成儀(Applied Biosystems,Foster City,CA)和合成循環(huán)，通過固相方法合成多肽。
也可以用克隆的FLINT基因通過重組DNA方法產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。如果需要高產(chǎn)量，那么優(yōu)選重組方法?？梢栽诙喾N本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的合適宿主細(xì)胞中進(jìn)行克隆基因的表達(dá)。為此目的，可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的任何合適方法將FLINT基因引入宿主細(xì)胞。雖然本發(fā)明的范圍包括克隆基因的染色體整合，但優(yōu)選將所述基因克隆進(jìn)合適的染色體外保持的表達(dá)載體，以便所述FLINT基因的編碼區(qū)操作性地連接組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
重組產(chǎn)生FLINT多肽的基本步驟是
a)構(gòu)建天然、合成或半合成的編碼FLINT多肽的DNA；b)以適于表達(dá)所述FLINT多肽的方法，將所述DNA或者單獨(dú)、或者作為融合多肽整合進(jìn)表達(dá)載體；c)將所述載體通過轉(zhuǎn)化或其它方法引入合適的真核或原核宿主細(xì)胞，形成重組宿主細(xì)胞；d)以表達(dá)所述FLINT多肽的方式培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞；然后e)通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的任何合適方法回收和基本純化所述FLINT多肽。1．在原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組FLINT多肽在重組FLINT多肽的生產(chǎn)中可以使用原核細(xì)胞。例如，大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株294(ATCC第31446號(hào))對于外源多肽的原核表達(dá)特別有用。在克隆和表達(dá)本發(fā)明的重組多肽中也可以用作宿主細(xì)胞的有大腸桿菌的其它菌株、桿菌如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、腸桿菌科如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella tryphimurium)或粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、各種假單胞菌屬(Pseudomonas)的物種以及其它細(xì)菌，如鏈霉菌屬(Streptomyces)。
適于在原核細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列包括β-內(nèi)酰胺酶[如載體pGX2907,ATCC 39344，包含一個(gè)復(fù)制子和β-內(nèi)酰胺酶基因]、乳糖系統(tǒng)[Chang等人，Nature_(London),275:615(1978)；Goeddel等人，Nature(London),281:544(1979)]、堿性磷酸酶以及色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)[載體pATHl(ATCC 37695)]，其中所述色氨酸啟動(dòng)子系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于促進(jìn)在trp啟動(dòng)子控制下表達(dá)作為trpE融合多肽的可讀框。雜種啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子(可由質(zhì)粒pDR540,ATCC-37282分離)也是合適的?？梢詫⒑塑账嵝蛄幸呀?jīng)眾所周知的其它細(xì)菌啟動(dòng)子連接到編碼本發(fā)明的多肽的DNA，其中使用接頭或連接物以提供任何所需要的限制位點(diǎn)。在細(xì)菌系統(tǒng)中使用的啟動(dòng)子也將包含操作性地連接編碼所需多肽的DNA的Shine-Dalgarno序列。這些例子是說明性的，而不是限制性的。
可以通過直接表達(dá)或作為融合多肽合成本發(fā)明的多肽，其中所述融合多肽包含與另一個(gè)可以通過酶促切割或化學(xué)切割除去的多肽或肽翻譯性融合體的目的多肽。在重組系統(tǒng)中生產(chǎn)某些多肽常常觀察到融合多肽的表達(dá)使所需肽的壽命延長、產(chǎn)量增加或是提供了純化所述多肽的方便方法。當(dāng)在原核宿主中表達(dá)哺乳動(dòng)物多肽時(shí)，這一點(diǎn)特別相關(guān)。已知多種在特定位點(diǎn)切割多肽(如腸激酶和凝血酶)或從肽鏈的氨基末端或羧基末端消化所述多肽(如二氨肽酶)的肽酶。此外，特定的化學(xué)藥品(如溴化氰)將在特定位點(diǎn)切割多肽鏈。熟練的技術(shù)人員將知道引入位點(diǎn)特異性內(nèi)部切割位點(diǎn)所需的對氨基酸序列(如果使用重組方法，則是合成或半合成的編碼序列)的修飾。例如，見P.Carter，“融合多肽的位點(diǎn)特異性蛋白水解”，第13章，PROTEINPURFICATION:FROM MOLECULAR MECHANISMS TO LARGESCALE PROCESSES,American Chemical Society,Washington,D.C.(1990)。
除原核細(xì)胞外，可以使用多種兩棲動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(如蛙卵母細(xì)胞)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。具體宿主細(xì)胞的選擇在某種程度上取決于所使用的具體表達(dá)載體。適于在本發(fā)明中使用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子包括，例如，HepG-2(ATCC HB 8065)、CV-1(ATCC CCL 70)、LC-MK2(ATCC CCL 7.1)、3T3(ATCC CCL 92)、CHO-K1(ATCC CCL61)、HeLa(ATCC CCL 2)、RPMl8226(ATCC CCL 155)、H4IIEC3(ATCC CCL 1600)、C127I(ATCC CCL 1616)、HS-Sultan(ATCC CCL1484)、以及BHK-21(ATCC CCL 10)。
廣泛多種載體適于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。例如，pSV2型載體包含猴病毒40(SV40)基因組中轉(zhuǎn)錄和聚腺苷酸化所需的區(qū)段。已經(jīng)構(gòu)建了許多SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)插入基因轉(zhuǎn)錄的pSV2型載體，如pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr、pSV2-hyg和pSV2-β-球蛋白。這些載體可以從廣泛的來源得到，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852或國立農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research),1815North University Street,Peoria,Illinois 61604-39999。
適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子包括SV40晚期啟動(dòng)子、來自真核基因的啟動(dòng)子、胸苷激酶基因啟動(dòng)子以及主要早期和晚期腺病毒基因的啟動(dòng)子，其中所述真核基因如雌激素誘導(dǎo)的雞卵清蛋白基因、干擾素基因、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因。
質(zhì)粒pRSVcat(ATCC 37152)包含已知感染雞細(xì)胞和其它宿主細(xì)胞的勞斯肉瘤病毒的長末端重復(fù)部分。該長末端重復(fù)包含適于在本發(fā)明的載體中使用的啟動(dòng)子。H.Gorman等人，Proc Nat.Acad.Sci.(USA),79,6777(1982)。質(zhì)粒pMSVi(NRRL B-15929)包含已知感染小鼠細(xì)胞和其它宿主細(xì)胞的鼠類肉瘤病毒的長末端重復(fù)部分。已經(jīng)很好地確定小鼠金屬硫蛋白的啟動(dòng)子可用于真核宿主細(xì)胞中并且適于在本發(fā)明中使用。該啟動(dòng)子存在于質(zhì)粒pdBPV-MMTneo(ATCC 37224)中，該質(zhì)?？梢杂米鳂?gòu)建本發(fā)明的其它質(zhì)粒的起始材料。
可以通過許多眾所周知的方法用載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述方法包括但不限于原生質(zhì)體融合、磷酸鈣共沉淀、電穿孔等等。見，如Maniatis等人，同上。
一些病毒也構(gòu)成合適的載體。例子包括腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、皰疹病毒、桿狀病毒和勞斯肉瘤病毒，如美國專利4,775,624中所述，特此通過引用結(jié)合到本文中。例如，桿狀病毒pFastBac-1(GIBCO/BRL)可用于感染合適的宿主細(xì)胞(如SF9)以產(chǎn)生重組蛋白。
諸如酵母和其它真菌的真核微生物也是合適的宿主細(xì)胞。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)是優(yōu)選的真核微生物。其它酵母，如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)也是合適的。為在酵母屬中表達(dá)，可以使用例如質(zhì)粒YRp7(ATCC-40053)。見，如L.Stinchcomb等人，Nature,282,39(1979)；J.Kingsman等人，Gene,7,141(1979)；S.Tschemper等人，Gene,10,157(1980)。質(zhì)粒YRp7包含TRP1基因，該基因?yàn)樵趖rp1營養(yǎng)缺陷型突變體中使用提供了選擇標(biāo)記。
純化重組產(chǎn)生的FLINT多肽使用標(biāo)準(zhǔn)方法將帶有克隆的FLINT基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的宿主細(xì)胞。在適于表達(dá)所述重組FLINT多肽的條件下繁殖包含所述載體的細(xì)胞。例如，假如將所述重組基因置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下，則合適的生長條件將包括合適的誘導(dǎo)物。通過任何合適的方法，可以由轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞提取物純化重組產(chǎn)生的多肽。
在多肽純化的優(yōu)選方法中，在5′端修飾FLINT基因以在FLINT多肽的氨基末端引入幾個(gè)組氨酸殘基。該“組氨酸標(biāo)志”使得能夠基本按照美國專利4,569,794所述的方法，進(jìn)行稱為“固定化金屬離子親和層析”(IMAC)的單步多肽純化方法，該專利特此通過引用結(jié)合到本文中。IMAC方法使得能夠從如上所述表達(dá)修飾的重組多肽的細(xì)胞的粗提取物開始，快速分離大致純的重組FLINT多肽。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括分離編碼圖1、2、3、4的核酸?？梢酝ㄟ^化學(xué)合成方法產(chǎn)生這些核酸中的任何一種。核酸的合成是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。見，如，E.L.Brown,R.Belagaje,M.J.Ryan和H.G.Khorana,Methods in Enzymology,68:109-151(1979)?？梢允褂贸Ｒ?guī)DNA合成儀器，如Applied Biosystems Inc.(850 Lincoln CenterDrive,Foster City,CA 94404)的380A型或380B型DNA合成儀，用亞磷酰胺化學(xué)產(chǎn)生對應(yīng)于FLINT基因或mFLINT基因的DNA序列的片段，隨后連接所述片段以重新構(gòu)建完整的基因。可替代地，可以使用磷酯三酯化學(xué)合成本發(fā)明中使用的核酸。見，如，Gait,M.J.編輯，OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS,A PRACTICALAPPROACH(1984)。
在一個(gè)可替代的方法，即PCR中，可以從許多起始材料產(chǎn)生包含例如圖1的本文所公開和描述的DNA序列。例如，從表達(dá)FLINT基因的組織得到的cDNA制備物(如cDNA文庫)開始，如美國專利第4,889,818所述制備與圖1或其中任何亞區(qū)互補(bǔ)的合適的寡核苷酸引物。PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHOD ANDAPPLICATIONS,Michael A Innis等人編輯，Academic Press,Inc(1990)中公開了PCR的其它合適方法。
可以通過上面討論的多核苷酸合成方法制備本發(fā)明的核糖核酸，或者可以通過例如使用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄FLINT DNA模板而酶促制備本發(fā)明的核糖核酸。制備本發(fā)明的核糖核酸的最優(yōu)選系統(tǒng)使用來自噬菌體T7或噬菌體SP6的RNA聚合酶。這些RNA聚合酶具有高度特異性，要求在要轉(zhuǎn)錄的模板的5′端插入噬菌體特異性序列。見Maniatis等人，同上。本發(fā)明還提供與圖1-4互補(bǔ)的核酸，即RNA或DNA。2．載體本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明的核酸的重組DNA克隆載體和表達(dá)載體。
熟練的技術(shù)人員知道最合適的克隆載體或表達(dá)載體的選擇取決于多種因素，其中包括限制酶切位點(diǎn)的可得性、載體要轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞類型、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的目的(如作為染色體外元件穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，或整合進(jìn)載體染色體中)、是否存在容易分析或選擇的標(biāo)記(如抗生素抗性以及一種類型和其它類型的代謝標(biāo)記)以及在宿主細(xì)胞中所需要的基因拷貝數(shù)。
適于攜帶本發(fā)明核酸的載體包括RNA病毒、DNA病毒、烈性噬菌體、溶原性噬菌體、穩(wěn)定噬菌體、質(zhì)粒、類病毒等等。最優(yōu)選的載體是質(zhì)粒。
在制備表達(dá)載體時(shí)，熟練的技術(shù)人員知道需要考慮許多變量，如使用組成型還是誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。專業(yè)人員也知道要產(chǎn)生的核酸或多肽的量部分決定了表達(dá)系統(tǒng)的選擇。關(guān)于啟動(dòng)子序列，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生與其操作性地連接的基因的高水平的可調(diào)節(jié)表達(dá)。熟練的技術(shù)人員會(huì)知道響應(yīng)多種誘導(dǎo)物(如碳源、金屬離子和熱)的多種合適的啟動(dòng)子。其它關(guān)于表達(dá)載體的相關(guān)考慮包括是否包括指導(dǎo)重組多肽定位的序列。例如，編碼位于基因編碼區(qū)之前的信號(hào)肽的序列可用于指導(dǎo)所得到的多肽的胞外輸出。
本發(fā)明還提供了構(gòu)建能夠表達(dá)包含圖1-4的多肽的重組宿主細(xì)胞的方法。該方法包括將重組DNA載體通過轉(zhuǎn)化或其它方法引入宿主細(xì)胞中，其中所述重組DNA載體包含圖1到4中任何一幅所描述的分離DNA序列。
優(yōu)選的宿主細(xì)胞是能容納外源引入的基因或多肽的高水平表達(dá)、并將所述多肽摻入其膜結(jié)構(gòu)中的任何真核細(xì)胞。用于表達(dá)的載體是那些包含圖1到4的序列中任一序列的載體。在熟練技術(shù)人員所熟悉的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞以表達(dá)FLINT或mFLINT，由此在所述重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組FLINT或mFLINT多肽。
下面的實(shí)施例將更全面地描述本發(fā)明。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員會(huì)知道所述的具體試劑、設(shè)備和方法僅僅是說明性的而不是為了以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1從mRNA RT-PCR擴(kuò)增FLINT基因使用常規(guī)方法通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)分離FLINT基因。使用標(biāo)準(zhǔn)方法由表達(dá)所述FLINT基因的組織(如肺)制備總RNA。使用商業(yè)上可得到的試劑盒(SuperScriptTM系統(tǒng)；Life Technologies)通過PCR與導(dǎo)向圖1-4的任何合適區(qū)的特異性引物完成第一鏈FLINTcDNA的合成。
在第一鏈cDNA(在真空下干燥)中加入以下試劑，進(jìn)行擴(kuò)增8μl的10X合成緩沖液(200mM Tris-HCl,pH8.4；500mM KCl,25mMMgCl2,1ug/ul BSA)；68μl蒸餾水；每種引物10uM的溶液各1μl；以及1μl Taq DNA聚合酶(2到5U/μl)。反應(yīng)物在94℃加熱5分鐘以使RNA/cDNA雜交物變性。然后使用任何合適的熱循環(huán)儀進(jìn)行15到30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增?？梢酝ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增的樣品以檢查合適大小的片段。
實(shí)施例2產(chǎn)生在宿主細(xì)胞中表達(dá)FLINT的載體容易制得在多種原核宿主細(xì)胞，如大腸桿菌中適于表達(dá)FLINT或其片段的表達(dá)載體。所述載體包含復(fù)制原點(diǎn)(Ori)、氨芐青霉素抗性基因(Amp)以及操作性地連接FLINT編碼區(qū)的T7啟動(dòng)子和T7終止子序列，其中所述氨芐青霉素抗性基因用于在轉(zhuǎn)化程序后選擇已經(jīng)引入所述載體的細(xì)胞。質(zhì)粒pETllA(得自Novogen,Madison WI)是合適的親代質(zhì)粒。通過用內(nèi)切核酸酶NdeⅠ和BamHⅠ限制性消化而線性化pET11A。將線性化的pET11A連接至帶有NdeⅠ和BamHⅠ粘端并且包含如圖1-4所公開的FLINT基因的編碼區(qū)的DNA片段。
可以在5′端(所編碼多肽的氨基末端)略微修飾在所述構(gòu)建中使用的FLINT基因以簡化所編碼的多肽產(chǎn)物的純化。為此目的，在ATG起始密碼子之后插入編碼8個(gè)組氨酸殘基的寡核苷酸。在所編碼多肽的氨基末端放置組氨酸殘基用于使得能夠進(jìn)行IMAC單步多肽純化方法。
實(shí)施例3FLINT多肽的重組表達(dá)和純化用標(biāo)準(zhǔn)方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)(hsdS galλcIts857 indlSam7nin5lacUV5-T7基因)，其中所述載體帶有編碼FLINT或其片段的可讀框(ORF)并且所述可讀框操作性地連接表達(dá)啟動(dòng)子。使用快速質(zhì)粒制備，通過瓊脂糖凝膠電泳隨機(jī)選擇根據(jù)對氨芐青霉素的抗性選出的轉(zhuǎn)化子和測試所述載體的存在。將帶有所述載體的菌落在L肉湯中培養(yǎng)，并基本如美國專利4,569,794所述，通過固定化金屬離子親和層析(IMAC)純化載體所帶的ORF編碼的多肽產(chǎn)物。
簡要地說，如下制備IMAC柱。在蒸餾水中洗滌無金屬螯合樹脂(如Sepharose 6B IDA,Pharmacia)以去除防腐物質(zhì)，然后加入50mM金屬氯化物或金屬硫酸鹽水溶液，輸注合適的金屬離子[如Ni(Ⅱ)、Co(Ⅱ)或Cu(Ⅱ)]直到約75％的樹脂孔隙空間被有色的金屬離子飽和。然后所述柱子就可以裝載包含重組多肽產(chǎn)物的細(xì)胞粗提物。
在用任何合適的緩沖液在pH7.5洗滌柱子去除未結(jié)合的多肽和其它物質(zhì)后，用任何合適的緩沖液在pH4.3，或最好用含有咪唑的緩沖液在pH7.5洗脫結(jié)合的多肽。
實(shí)施例4FLINT mRNA的組織分布通過RNA印跡分析多種人類組織中FLINT mRNA的存在。通過標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸胍(guanidine chloride)/酚提取方法分離來自不同組織或培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，并使用7型寡聚(dT)-纖維素(Pharmacia)分離poly-A+RNA。在甲醛中進(jìn)行RNA樣品的電泳，然后用毛細(xì)管將RNA轉(zhuǎn)移到Zeta-ProbeTM尼龍膜(Bio-Rad,Hercules,Calif)。圖1是使用MultiPrimeTM隨機(jī)引發(fā)試劑盒(Amersham,Arlington Heights,Ⅲ.)產(chǎn)生探針的模板。標(biāo)記反應(yīng)的效率約為每μg模板引入4×1010cpm。雜交緩沖液含有0.5M磷酸鈉、7％SDS(重量/體積)、1％BSA(重量/體積)和1mM EDTA。65℃下在雜交緩沖液中預(yù)雜交2小時(shí)，加入32P標(biāo)記的探針，然后溫育過夜。將濾膜在緩沖液A(40mM磷酸鈉pH7.2,5％SDS[重量/體積]，0.5％BSA[重量/體積]和1mM EDTA)中于65℃下洗滌1小時(shí)，然后在緩沖液B(40mM磷酸鈉pH7.2,1％SDS[重量/體積]和1mM EDTA)中于65℃下洗滌20分鐘。將濾膜風(fēng)干并使用增感屏在-80℃對Kodak X-OMAT AR底片曝光。
結(jié)果顯示FLINT mRNA存在于多種組織中，包括胃、脊髓、淋巴結(jié)、氣管、脾、結(jié)腸和肺。
實(shí)施例5針對多肽的抗體的產(chǎn)生使用本領(lǐng)域內(nèi)任何眾所周知的方法，或通過本文具體公開的方法，從轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分離大致純的多肽或其片段。通過，如，Amicon過濾裝置過濾，調(diào)整最終制備物中的多肽濃度以便所述水平為約1到5ug/ml?？梢匀缦轮苽鋯慰寺】贵w或多克隆抗體。
可以根據(jù)Kohler和Milstein(Nature,256,495,1975)的方法或根據(jù)其修改的方法，由鼠雜交瘤制備單克隆抗體。簡要地說，在幾周時(shí)間內(nèi)，用幾微克所述多肽或其片段或其融合肽反復(fù)接種小鼠。然后處死小鼠并分離脾中產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞。將所述脾細(xì)胞通過聚乙二醇與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。用任何合適的免疫分析鑒定產(chǎn)生抗體的融合細(xì)胞，其中所述免疫分析的例子有，例如，ELISA，如E.Engvall,Meth.Enzymol,70,419,1980中所述。
可以用涉及用本文公開的多肽、其片段或其融合多肽免疫合適動(dòng)物的眾所周知的方法制備多克隆抗血清，其中所述方法如，例如，J.Vaitukaitis等人，Clin.Endocirnol.Metab.33,988(1971)所述。在多個(gè)皮內(nèi)位點(diǎn)給予小劑量(如納克量)抗原看起來是最可靠的方法。
實(shí)施例6構(gòu)建哺乳動(dòng)物FLINT-Flag表達(dá)載體為便于FLINT表達(dá)的確認(rèn)(不使用抗體)，將“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)”/增強(qiáng)的綠熒光多肽(IRES/eGFP)PCR片段插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pGTD(Gerlitz,B.等人，1993,Biochemical Journal 295:131)，構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體(pIG1-FLINTF)。這個(gè)名為pIGl的新載體包含下列序列標(biāo)記Ela反應(yīng)性GBMT啟動(dòng)子(D.T.Berg等人，1993BioTechniques 14:972；D.T.Berg等人，1992 Nucleic Acids Research 205485)；唯一的BclⅠ cDNA克隆位點(diǎn)；來自腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列；eGFP(Clontech)編碼序列(Cormack等人，1996 Gene 173:33)；SV40小“t”抗原剪接位點(diǎn)/聚腺苷酸化序列；SV40早期啟動(dòng)子和復(fù)制原點(diǎn)；鼠二氫葉酸還原酶(dhfr)編碼序列；以及pBR322氨芐青霉素抗性標(biāo)記/復(fù)制原點(diǎn)。所得到的蛋白在C末端連接Flag序列，產(chǎn)生[FLINT]-DYKDDDDK。
根據(jù)人FLINT序列，合成下面的引物5’-TAGGGCTGATCAAGGATGGGCTTCTGGACTTGGGCGGCCCCTCCGCAGGCGGACCGGGG-3’；和5’-AGGGGGGCGGCCGCTGATCATCACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGTGCACAGGGAGGAAGCGC-3’。后者(反向引物)包含F(xiàn)lag表位序列(第24-47位，雙下劃線)(Micele,R.M.等人，1994 J.Immunol.Methods 167:279)。然后將這些引物用于PCR擴(kuò)增FLINT cDNA。得到的1.3Kb PCR產(chǎn)物隨后用BclⅠ(限制位點(diǎn)已引入引物，上面的下劃線部分)消化并連接進(jìn)pIG1的唯一的BclⅠ位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pIG1-FLINTF。通過限制性消化并對插入物進(jìn)行雙鏈測序，確認(rèn)人FLINT cDNA的取向和核苷酸序列。
實(shí)施例7構(gòu)建哺乳動(dòng)物FLINT-無Flag表達(dá)載體為產(chǎn)生無Flag的表達(dá)載體(pIG1-FLINT)，使用Quick Change誘變試劑盒(Stratagene)從pIG1-FLINTF構(gòu)成物缺失編碼八個(gè)氨基酸的FLAG表位的24個(gè)堿基DNA序列。合成35個(gè)堿基的引物以及其與FLAG的側(cè)翼19堿基序列相同的互補(bǔ)部分，用于使用pIG1-FLINTF質(zhì)粒作為模板的PCR擴(kuò)增。用DpnⅠ限制性內(nèi)切核酸酶消化PCR反應(yīng)混合物以去除親代DNA，并將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Epicurean XLI-blue大腸桿菌細(xì)胞。挑出十六個(gè)氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子并通過限制消化分析質(zhì)粒DNA。16個(gè)中有10個(gè)給出與缺失24個(gè)堿基的序列相一致的結(jié)果。通過對pIG1-FLINT的DNA測序確認(rèn)24個(gè)堿基的序列的精確缺失。該質(zhì)粒中的FLINT核苷酸序列顯示于圖1。
實(shí)施例8從AV12 RGT18轉(zhuǎn)染子分離大量產(chǎn)生FLINT的克隆帶有FLINT基因的重組質(zhì)粒(pIG1-FLINT)編碼對氨甲蝶呤的抗性。此外，該構(gòu)成物包含與FLINT基因在同一個(gè)轉(zhuǎn)錄物上并緊接著FLINT基因3’端的編碼熒光多肽GFP的基因。由于GFP的高水平表達(dá)需要FLINT-GFP mRNA的高水平表達(dá)，因此具有高度熒光的克隆將更有可能產(chǎn)生高水平的FLINT。用pIG1-FLINT和pIG1-FLINTF轉(zhuǎn)染AV12 RGT18細(xì)胞。選擇抗250mM氨甲蝶呤的細(xì)胞并合并這樣的細(xì)胞。對抗性細(xì)胞的合并物進(jìn)行熒光輔助細(xì)胞分類(FACS)，并將熒光值在群體的最高5％以內(nèi)的細(xì)胞作為單獨(dú)的細(xì)胞分入一個(gè)庫中。對高熒光的庫進(jìn)行三個(gè)連續(xù)的分類循環(huán)。通過SDS-PAGE分析得自第二和第三個(gè)循環(huán)的庫和各個(gè)克隆的FLINT產(chǎn)生。根據(jù)考馬斯染色判斷在最高水平表達(dá)FLINT的庫或克隆用于放大生產(chǎn)和純化FLINT。圖3顯示了用該質(zhì)粒產(chǎn)生的成熟FLINT蛋白(即mFLINT)的氨基酸序列。
實(shí)施例9mFLINT多肽的大規(guī)模純化進(jìn)行mFLINT的大規(guī)模生產(chǎn)首先在幾個(gè)10升旋轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)穩(wěn)定的克隆，即穩(wěn)定的包含pIG1-FLINT的AV12 RGT 18細(xì)胞。在達(dá)到匯合后，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2-3天以使最大量的FLINT分泌進(jìn)培養(yǎng)基。將含有mFLINT的培養(yǎng)基調(diào)整到0.1％CHAPS并在Amicon ProFluxM12切向過濾系統(tǒng)中濃縮到350ml。濃縮的培養(yǎng)基在19,000rpm(43,000xg)離心15分鐘，然后以8ml/分鐘的流速通過SP-5PW TSK-GEL柱(21.5mm×15cm；TosoHass)。用緩沖液A(20mM MOPS,0.1％CHAPS,pH6.5)洗滌柱子直到吸光度(280nm)回到基線，然后用0.1M-0.3M NaCl(在緩沖液A中)的線性梯度洗滌超過85分鐘，洗脫結(jié)合的多肽。合并含有mFLINT的流分并通過在緩沖液B(50mM Tris,0.1％CHAPS,0.3M NaCl,pH7.0)中平衡的(7.5mm×7.5cm)Heparin-5PW TSK-GEL柱。用0.1M-0.3M NaCl(在緩沖液B中)的線性梯度洗超過60分鐘，洗脫結(jié)合的多肽。合并含有mFLINT的流分并通過用0.1％TFA/H2O平衡的1cm×15cm Vydac C4柱。用0-100％CH3CN/0.1％TFA的線性梯度洗脫結(jié)合的多肽。通過SDS-PAGE分析含有mFLINT的流分，發(fā)現(xiàn)純度超過95％，然后將含有mFLINT的流分對8mM NaPO4,0.5M NaCl,10％甘油，pH7.4透析。用純化的多肽確認(rèn)mFLINT的N末端序列。質(zhì)譜分析和糖苷內(nèi)切酶F消化顯示mFLINT是糖基化的。
實(shí)施例10A．構(gòu)建FLINT-Flag和FLINT表達(dá)載體為獲得足夠的重組蛋白以供研究，在桿狀病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)Flag標(biāo)記的以及天然形式的人FLINT。為進(jìn)行表達(dá)，如下工程化人FLINT cDNA。用XbaⅠ切割pIG3(pIG1的衍生物；Gerlitz,B和Grinnell,B.W.未發(fā)表的數(shù)據(jù))并補(bǔ)平以產(chǎn)生平端，其中所述pIG3含有編碼FLAG標(biāo)記形式FLINT的cDNA。然后用SalⅠ切割載體。凝膠純化得到的包含所述編碼區(qū)的918個(gè)堿基對的片段，將其連接進(jìn)用BamHⅠ消化的桿狀病毒載體pFastBac-1(GIBCO/BRL)，使末端平端化，隨后用SalⅠ消化，產(chǎn)生質(zhì)粒pBacOPG3Flag。該構(gòu)成物設(shè)計(jì)用于表達(dá)全長的分子(包括構(gòu)成信號(hào)肽的29個(gè)NH2端氨基酸)并在蛋白的COOH端表達(dá)FLAG標(biāo)記。所述表達(dá)處于桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子的控制之下。
為構(gòu)建表達(dá)天然形式所述蛋白的載體，用XbaⅠ和HindⅢ切割事先已經(jīng)亞克隆進(jìn)pCDNA3.1(+/-)[購自Invitrogen]的編碼全長蛋白的920個(gè)堿基對的XbaⅠ/HindⅢ cDNA片段。凝膠純化所述片段并連接進(jìn)已經(jīng)用XbaⅠ和HindⅢ消化的桿狀病毒載體pFastBac-1(GIBCO/BRL)，產(chǎn)生質(zhì)粒pBacOPG3。
B．桿狀病毒的產(chǎn)生和蛋白產(chǎn)生如經(jīng)銷商(GIBCO/BRL)所述，將兩種載體pBacOPG3Flag和pBacOPG3分別用于產(chǎn)生兩種重組桿狀病毒(vBacOPG3Flag和vBacOPG3)。為產(chǎn)生蛋白，分別用每種病毒感染SF-9細(xì)胞。通過蛋白質(zhì)印跡分析和考馬斯染色分析測定從被感染的SF-9細(xì)胞收集的上清液中的重組蛋白。
實(shí)施例11FAS配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測mFLINT與FasL的相互作用進(jìn)行斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)以檢測已知的TNF配體(即商業(yè)上可得到的TRAIL和FasL)與mFLINT的相互作用。
將TRAIL(RnD系統(tǒng))和FasL(Kamiya Biomedical Company)點(diǎn)樣在硝酸纖維素紙上并與純化的mFLINT-Flag一起溫育。洗去mFLINT并用抗Flag抗體檢測與mFLINT的結(jié)合。按照上述的實(shí)施例過量表達(dá)并純化OPG2Fc和mFLINT-Flag。然后用PBS中的5％脫脂乳在室溫下封閉濾膜30分鐘。隨后將硝酸纖維素紙與含有FasL-Myc的細(xì)胞裂解物混合，室溫下在旋轉(zhuǎn)器上繼續(xù)溫育1小時(shí)。用抗myc抗體進(jìn)行第二次溫育1小時(shí)，用抗小鼠IgG-HRP進(jìn)行第三次溫育30分鐘。通過在顯示mFLINT特異性結(jié)合FasL的X膠片上檢測化學(xué)發(fā)光，檢測包含myc表位的多肽。沒有檢測到可檢測的與TNFα、TNFβ、TRAIL、CD40L或TRANCE的結(jié)合。
首先進(jìn)行體外Fas-Fas配體相互作用的基線實(shí)驗(yàn)。除非特別指出，否則所有的洗滌步驟都使用TBST(含Tween20的Tris緩沖鹽溶液，得自SIGMA)進(jìn)行3-6次。
將mrecFas(100ng)吸附至ELISA板。然后用加了0.1％明膠的TBST封閉板。此后，加入在包含0.1％含1微克/ml M2 Abs (通過Kodak的Scientific Imaging System部門購買的抗flag抗體)溶液的TBST中從最高濃度300ng直到1ng的不同濃度的hFas配體(Flag標(biāo)記)。洗板6次后，在孔中加入抗小鼠-Abs-HRP(3000倍稀釋，Bio-Rad)。洗3次后，用ABTS作為底物進(jìn)行顯色酶促反應(yīng)。除非特別指出，否則使用由Molecular Devices Corp.(Menlo Park,California)商業(yè)化的ELISA讀板儀。
收集到下面的數(shù)據(jù)
使用實(shí)時(shí)生物分子相互作用分析，確認(rèn)FLINT-FasL結(jié)合并確定結(jié)合的特性(如動(dòng)力學(xué)、特異性、親和性、協(xié)同性、類似結(jié)合模式、濃度)。該技術(shù)賦予實(shí)時(shí)研究生物分子的相互作用而不必標(biāo)記任何相互作用物的能力。具體地說，該技術(shù)利用光學(xué)現(xiàn)象表面等離子體共振(optical phenomenon surface plasmon resonance)，并根據(jù)生物特異性界面處的大分子的質(zhì)量濃度的變化進(jìn)行檢測。實(shí)時(shí)跟蹤相互作用，以便可以容易地得到動(dòng)力學(xué)信息。在許多情況下，可以不首先純化成分而進(jìn)行研究。
使用BiaCore 2000儀器完成測量。從Biacore AB,Rapsgatan 7,S-754 50 Uppsala，瑞典獲得所述儀器、所附的芯片、固定化和保養(yǎng)的試劑盒及緩沖液。從Kamiya Biomedical Company,910 Industry Drive,Seattle,WA 98188獲得FasL，從GibcoBRL獲得異硫氰酸胍溶液，如實(shí)施例8和實(shí)施例9中所述制備mFLINT。
實(shí)驗(yàn)采用固定化的FasL，裝載含有mFLINT的溶液。在本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)asL-FLINT相互作用的KD是1.13×10-7，低于FasL結(jié)合Fas的KD1.62×10-7。這可以解釋為FasL是三體，而本文中結(jié)合的是FasL單體。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)利用在溶液中與FasL結(jié)合的FLINT，這使得三體能夠形成。在這些實(shí)驗(yàn)中得到的FLINT-FasL的KD要好兩個(gè)數(shù)量級(jí)(即KD降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí))。該觀察指出FLINT應(yīng)該有效地與Fas競爭結(jié)合FasL，這有可能解釋在下文詳述的實(shí)驗(yàn)中觀察的治療好處。FLINT阻止Fas-Fas配體相互作用如上所述，將mrecFas(100ng)吸附到ELISA板上。然后用TBST和0.1％明膠封閉板。此后，在每孔中加入在包含含1微克/ml M2 Abs的0.1％溶液、在不同mFLINT濃度(從最高濃度300ng降至1ng)存在下的TBST上的hFas配體(Flag標(biāo)記，每個(gè)點(diǎn)30ng)。如前所述，洗板后，在孔中加入抗小鼠-Abs-HRP(3000倍稀釋，Bio-Rad)。洗滌后，用ABTS作為底物進(jìn)行顯色酶促反應(yīng)。數(shù)據(jù)顯示于下表中
Fas配體以不同親和性結(jié)合Fas和mFLINT將FLINT和Fas(各100ng)吸附至ELISA板上。加入在包含含1微克/ml M2 Abs的0.1％溶液的TBST上從最高濃度300ng降至0.1ng的不同濃度的hFas配體(FIag標(biāo)記)。洗板后，在孔中加入抗小鼠-Abs-HRP(1∶3000倍稀釋，Bio-Rad)。洗滌后，用ABTS作為底物進(jìn)行顯色酶促反應(yīng)。下表顯示了數(shù)據(jù)。
實(shí)施例12測量mFLINT對于抗CD3誘導(dǎo)的Jurkat編程性細(xì)胞死亡的效應(yīng)用0.5ml PBS中的1μg/ml抗CD3(Farmingen)在37℃包被無組織處理的24孔板(Decton Dickinson,Mansfield,MA)90分鐘。用PBS洗板一次。在每孔中加入1ml 1×106細(xì)胞/ml，進(jìn)行或不進(jìn)行以下處理10μM DEVD-cmk,1μg OPG2-Fc,1或2μg mFLINT和1μg抗FasLAb。按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。
在37℃恒溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞過夜，然后通過Annexin V和PI染色法染色細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀(FACS)分析編程性細(xì)胞死亡。用AnnexinV的陽性染色指示細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。
實(shí)施例13測量mFLINT對重組FasL誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡的效應(yīng)在24孔組織培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入1微升1×106細(xì)胞/ml并用下面的試劑處理可溶性FasL(200ng)、FasL加1μg mFLINT、FasL加1μg OPG2-Fc、Trail(200ng)、Trail加1μg mFLINT。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)過夜，然后用Annexin V和PI染色細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀(FACS)分析編程性細(xì)胞死亡。按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。
實(shí)施例14測量mFLINT以依賴于劑量的方式對于抗CD3誘導(dǎo)的Jurkat編程性細(xì)胞死亡的效應(yīng)進(jìn)行實(shí)施例13中陳述的同樣板包被和細(xì)胞處理步驟，但在每孔中加入不同量的mFLINT。按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。下表顯示了所加的量
實(shí)施例15使用小鼠T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(LTT細(xì)胞)測量人mFLINT對鼠FasL介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡的效應(yīng)(Annexin V分析)按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造FLINT。在這個(gè)Annexin V分析中使用LTT,2,14,11細(xì)胞(LTT細(xì)胞)，見Glasebrook,Eur.J.Immunol.17:1561-65(1987)。在第一天，用抗CD3(2C11)以連續(xù)稀釋度包被96孔板。在第二天，每孔中加入在50μl培養(yǎng)基中的100,000 LTT細(xì)胞，并在對照孔中加入50μl培養(yǎng)基，在其它孔中加入含以下的50μl培養(yǎng)基組1．可溶性Fas(sFasFc)(FasFc，小鼠)，終濃度為1μg/ml組2．mFLINT(人)，終濃度為1ug/ml組3．抗FasL(小鼠)，終濃度為1ug/ml然后將它們在37℃下5％CO2中培養(yǎng)過夜。
在下一天(第3天)，從每個(gè)孔收獲細(xì)胞，洗滌并用Annexin V和PI標(biāo)記，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。
實(shí)施例16使用小鼠T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(LTT細(xì)胞)測量人mFLINT對鼠FasL介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡的效應(yīng)(細(xì)胞毒性分析)在第1天和第2天進(jìn)行與實(shí)施例16中同樣的步驟。第3天在細(xì)胞中加入20μl MTS溶液(Promega)，然后在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。使用讀板儀收集490nm波長處的吸光度。
實(shí)施例17LIGHT結(jié)合實(shí)驗(yàn)為確認(rèn)LIGHT和mFLINT間的斑點(diǎn)印跡結(jié)合，用LIGHT表達(dá)構(gòu)成物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞過夜。第二天，使細(xì)胞脫落并與mFLINT-Flag在冰上培育。隨后用綴合了熒光染料的抗Flag檢測Flag表位，并用流式細(xì)胞儀檢測顯示與mFLINT特異性結(jié)合的細(xì)胞群體。我們使用載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。為確認(rèn)結(jié)合是特異性的，用10倍過量的未標(biāo)記mFLINT進(jìn)行競爭分析。
更具體地說，如上轉(zhuǎn)染6孔板的細(xì)胞。提供既表達(dá)載體也表達(dá)m-LIGHT的細(xì)胞。用P100滴管猛烈吸放，使細(xì)胞與板分離。然后在PBS/BSA 0.1％中，將細(xì)胞暴露于如a-d所陳述的下列溶液中的一種。
a．20nM GST/flag,mFLINT/flag，或HVEM；
b．20nM FLINT/flag+200nM GST/flag或mFLINT或HVEM；c．20nM FLINT/flag+HVEM+200nM抗人FAS配體；d．1μg/ml抗人FAS配體-生物素在冰上培育細(xì)胞30分鐘并用PBS/BSA,0.1％洗滌。然后將細(xì)胞或者暴露于1μg/ml抗人IgG生物素(為檢測HVEM)，或者暴露于2μg/ml M2-生物素(為檢測flag綴合物)。在冰上培育細(xì)胞30分鐘并用PBS/BSA,0.1％洗滌。此后，將細(xì)胞暴露于以1∶1000稀釋的鏈霉抗生物素Alexa 488(SIGMA)。再次在冰上培育細(xì)胞30分鐘并用PBS/BSA.0.1％洗滌。用FACSORT流式細(xì)胞儀(Decton Dickinson)分析細(xì)胞以檢測結(jié)合。
使用流式細(xì)胞儀的細(xì)胞表面結(jié)合分析確認(rèn)僅當(dāng)用mFLINT-Flag染色表達(dá)LIGHT的細(xì)胞時(shí)，才發(fā)生峰偏移(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)用mFLINT-Flag染色時(shí)，對照細(xì)胞中沒有偏移。當(dāng)用10倍過量的未標(biāo)記mFLINT與細(xì)胞預(yù)培育而因此預(yù)先占據(jù)所有的mFLINT-Flag的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，偏移峰完全與基線峰相反。
實(shí)施例18在治療肝損傷方面體內(nèi)測試mFLINT用小鼠做實(shí)驗(yàn)，使用在Tsuji H.等人，1995,Infection and Immunity,65(5):1892-1898中陳述的方法的修改形式，誘導(dǎo)肝損傷模型。按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。
明確地說，使用下面的程序測定本發(fā)明的多肽對抗急性炎癥和編程性細(xì)胞死亡的活性。簡要地說，給每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的BALB/c小鼠(Harlan)給予皮下注射(尾側(cè)靜脈)100μl PBS(GIBCO/BRL)中的6mgD(+)-半乳糖胺(Sigma,39F-0539)以及100μl PBS中的3μg脂多糖B大腸桿菌026:B6(LPS)(Difco,3920-25-2)。在靜脈給予半乳糖胺5分鐘后，通過靜脈注射給予LPS。LPS攻擊后，在0、2、4、6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)分別腹膜內(nèi)給動(dòng)物注射mFLINT(200μg)、倉鼠IgG(500μg,Cappel,30926)、抗鼠TNF mAb、TN3-19.12(500μg,Sheehan K.C.F.等人，J.Immunol.1989.142:3884)以及抗小鼠Fas配體(500μg,PharMingen,MO24301)。LPS注射24和48小時(shí)后測定小鼠的存活率。
在小鼠中，腹膜內(nèi)注射200μg mFLINT多肽(FLINT)后用3μg LPS攻擊對動(dòng)物的存活率有正效應(yīng)。當(dāng)在攻擊后2小時(shí)給予mFLINT時(shí)，100％的動(dòng)物存活；在攻擊后4小時(shí)給予mFLINT時(shí)，73％的動(dòng)物存活；在攻擊后6小時(shí)給予mFLINT時(shí)，60％的動(dòng)物存活。與此相比，在攻擊后4小時(shí)給予抗TNF∝，僅保護(hù)10％的動(dòng)物。
圖5比較了在用LPS/GalN攻擊之前和之后靜脈給予200μgmFLINT和其它分子的效應(yīng)。當(dāng)在LPS/GalN攻擊之前2小時(shí)給予時(shí)，抗TNF和mFLINT處理都導(dǎo)致100％的小鼠存活。80％用抗FasL處理的小鼠存活，而約30％用IgG處理的小鼠存活。
與此相比，當(dāng)在LPS/GalN攻擊之后4小時(shí)給予抗TNF，在48小時(shí)少于10％的動(dòng)物存活。驚人的是，當(dāng)在LPS/GalN處理后4小時(shí)用mFLINT處理時(shí)，80％的動(dòng)物存活。在LPS/GalN處理后4小時(shí)給予抗FasL也導(dǎo)致80％的存活率。IgG對存活率基本沒有影響，只有約2％的動(dòng)物存活。因此，mFLINT對治療晚期疾病有效。
圖6顯示，當(dāng)在LPS和GalN攻擊前2小時(shí)腹膜內(nèi)給予小鼠400μgmFLINT時(shí)，100％的動(dòng)物在給予LPS/GalN 48小時(shí)后存活。假如在LPS/GalN攻擊前2小時(shí)腹膜內(nèi)給予400μg抗TNF時(shí)，約95％的動(dòng)物在48小時(shí)時(shí)存活。與此相比，未用mFLINT處理的動(dòng)物僅20％在48小時(shí)時(shí)存活。在LPS/GalN之前2小時(shí)給予IgG僅增加存活率到30％。
圖6顯示了降低mFLINT的劑量到50μg仍然有保護(hù)效果。給予LPS/GalN 48小時(shí)后，約70％的動(dòng)物存活到48小時(shí)，而未處理的動(dòng)物有0％存活。
圖7顯示，不管在給予LPS/GalN前12小時(shí)或2小時(shí)、腹膜內(nèi)給予或是靜脈內(nèi)給予，100μg mFLINT對存活率的效應(yīng)是一樣的。當(dāng)在給予LPS/GalN后4小時(shí)給予mFLINT時(shí)，靜脈內(nèi)給予導(dǎo)致100％的存活率，而腹膜內(nèi)給予導(dǎo)致80％的存活率。該圖還顯示了給予LPS/GalN后4小時(shí)靜脈內(nèi)給予的劑量/反應(yīng)關(guān)系50ug得到80％的存活率，10ug得到40％的存活率，5ug得到20％的存活率，而1ug僅得到約2％的存活率。
實(shí)施例19本實(shí)施例證明了mFLINT在治療與中風(fēng)、頭部創(chuàng)傷以及其它相似疾病在臨床上相關(guān)的大腦局部缺血方面的有效性。
腹膜內(nèi)注射40mg/kg戊巴比妥鈉(Nembutal)麻醉成年雄性沙土鼠(體重70到80g,Charles River Laboratories,Wilmington,MA)，當(dāng)需要維持麻醉的手術(shù)水準(zhǔn)(surgical plane)時(shí)另外再腹膜內(nèi)注射10mg/kg。將動(dòng)物置于恒溫控制的加熱毯上以維持體溫在37℃。暴露頸的前側(cè)表面，剃毛，并用2％碘溶液清潔皮膚。
進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)備后，中線切開，并打開皮膚。分開胸骨舌骨肌，暴露并分離頸總動(dòng)脈(CCA)以將其夾住。使用無菌clip applier，將無菌的動(dòng)脈瘤夾(夾口0.15mm，閉合力約10gm)固定在左頸總動(dòng)脈和右頸總動(dòng)脈上5分鐘。然后去除所述夾具，目視檢查所述動(dòng)脈的開放。用手術(shù)用縫線縫合頸上的傷口。
緊接在大腦局部缺血程序之后并且在沙土鼠仍未蘇醒時(shí)，剃去頭部背面的毛，用2％碘溶液清潔皮膚。在外科麻醉的情況下，通過利用定向儀(stereotaxic apparatus)(SA)將沙土鼠的頭固定在穩(wěn)定的位置，中線切開以暴露顱骨。根據(jù)SA的游尺所指出的前鹵外側(cè)1mm和后面1mm的位置，用裝有直徑0.5mm的鉆頭的牙鉆修磨顱骨使其變薄。用配備27號(hào)鈍頭針的微量注射器穿刺變薄的區(qū)域，插入3mm深，一次性注射(bolus injection)5μl(0.63mg/ml)磷酸緩沖鹽水(PBS)中的mFLINT。根據(jù)實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。
在所述注射后，將注射器針頭更換為連接到Alzet滲透泵(AlzaCorp.,Palo Alto,CA)的腦輸注組合件(brain infusion assembly)上的輸注插管(長3mm)，其中所述腦輸注組合件的貯液器置于沙土鼠肩部皮膚之下。用牙科粘固粉將輸注插管固定在顱骨的表面上。用手術(shù)用縫線縫合傷口。所述Alzet滲透泵裝有mFLINT溶液(0.63mg/ml)或PBS，以1μl/小時(shí)的流速連續(xù)輸送3天。使沙土鼠存活5天(手術(shù)當(dāng)天定為第0天)。
在存活到第五天時(shí)，在CO2室中處死沙土鼠。進(jìn)行胸廓切開術(shù)，以心內(nèi)(transcardiac)灌注鹽水3分鐘，甲醛2分鐘。取出腦部，進(jìn)行按照本領(lǐng)域內(nèi)通常適用的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行組織處理。在前鹵后部約1.7mm獲得冠狀切片。用甲酚紫染色后，在顯微鏡下用40x的放大倍數(shù)觀察冠狀切片以進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，定量沿著兩個(gè)大腦半球的背面CAl區(qū)(長0.5 mm)的完整海馬神經(jīng)元。用Student t檢測和Wilcoxon秩評定檢測分析數(shù)據(jù)。
結(jié)果顯示mFLINT與載體相比對神經(jīng)元的存活率有顯著效應(yīng)(在t檢測中p=0.0039；在Wilcoxon秩和檢驗(yàn)中p=0.0037)，而與正常對照沒有差異。
實(shí)施例20處理組動(dòng)物數(shù)對照 10靜脈給予FLINT(50μg/注射)10第4-13天靜脈給予OPG2(50μg/注射) 10第4-13天總數(shù)30只小鼠為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從a brie of供體腫瘤制備B16黑素瘤的單細(xì)胞懸浮液。在第0天將腫瘤細(xì)胞(2×106)皮下植入來自Taconic Farms的雄性C5781小鼠的后腿。在第4天開始處理。從第4天到第13天，每天一次通過靜脈注射入尾靜脈而給予mFLINT或OPG2，共注射10次。按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。上文顯示了本方法的概述。
通過測量腫瘤體積監(jiān)測腫瘤反應(yīng)，其中在第4、8、11、17、21、25、30和34天用測徑器測量腫瘤的兩維，確定腫瘤體積。將腫瘤體積作為半橢圓計(jì)算。按照與上述相同的計(jì)劃稱量動(dòng)物重量。
對照腫瘤在第17.4±0.3天達(dá)到500mm3的體積，在第21.1±0.3天達(dá)到1000mm3的體積。用mFLINT處理的動(dòng)物腫瘤在第19.3±0.3天達(dá)到500mm3的體積，在第23.0±0.4天達(dá)到1000mm3的體積。用OPG2處理的動(dòng)物腫瘤在185.±0.4天達(dá)到500mm3的體積，在第22.2±0.4天達(dá)到1000mm3的體積。因此，由mFLINT產(chǎn)生的腫瘤生長延遲是1.8天，而用OPG2產(chǎn)生的腫瘤生長延遲是1.1天。這些數(shù)據(jù)在圖8中作圖顯示。如圖8所示，在mFLINT處理的小鼠中，20天后的腫瘤體積約為730mm3，但對照小鼠的腫瘤體積約為1000mm3。根據(jù)動(dòng)物的體重?fù)p失，沒有來自給予mFLINT或OPG2的毒性的跡象。
實(shí)施例2130只六周齡NOD小鼠購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Marine)。在每個(gè)籠子中放養(yǎng)三只小鼠，使其自由取食(Purina 5001)和飲水。適應(yīng)一周后，通過剪尾以從小鼠取血，并測量血糖和血漿胰島素。不麻醉而剪尾，使用Precision G血糖分析儀(Medisense Inc.,Bedford,MA)測量血糖。使用RIA試劑盒(Linco Inc.,St.Louis.MO.)測量血漿胰島素。然后將小鼠任意分成三組對照、注射mFLINT和注射OPG2。在分配小鼠到各組后，每周一次測量體重和血糖。從明顯的糖尿病(血糖＞200mg％；約14周齡)發(fā)病時(shí)開始，每天一次給小鼠腹膜內(nèi)注射稀釋于PBS中的mFLINT(50μg/天)或是OPG2(50μg/天)。對照小鼠注射等體積的PBS。注射兩周后，通過吸入麻醉(二氧化碳)來麻醉小鼠，通過心臟穿刺取血以測量葡萄糖和胰島素。此外，通過Animal Studies Support Team收獲胰腺并在鋅-福爾馬林中固定24小時(shí)，以進(jìn)行隨后的β細(xì)胞完整性的組織化學(xué)分析(蘇木精和曙紅)以及胰島素的免疫組織化學(xué)染色(George Sanduskys laboratory)。按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。
實(shí)施例22本實(shí)施例證明了mFLINT在一個(gè)模擬局部缺血再灌注損傷的體外模型中抑制編程性細(xì)胞死亡。這些數(shù)據(jù)指出mFLINT可用于預(yù)防和治療這樣的損傷。
通過胰蛋白酶消化，從1-3日齡新生大鼠的心臟中分離心室的心肌細(xì)胞，并通過預(yù)貼壁(pre-plating)除去非肌細(xì)胞。將原代培養(yǎng)物接種到在無血清培養(yǎng)基中特殊包被(special coated)的96孔板。
將培養(yǎng)物在無葡萄糖和無氧(5％CO2和95％N2)條件下培養(yǎng)8小時(shí)，誘導(dǎo)低氧血。在正常氧條件的含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，模擬再灌注。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用胞質(zhì)核小體相關(guān)DNA ELISA方法測定心肌細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。用mFLINT(2μg/ml或5μg/ml)培育測試樣品，用商業(yè)化的caspase抑制物Z-YVAD-fmk(50μM)培育對照樣品。復(fù)份實(shí)驗(yàn)顯示了基本完全的對低氧/再灌注誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡的抑制。按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。
為確定這些數(shù)據(jù)并查詢所觀察到的結(jié)果是否是Fas介導(dǎo)的，通過與可溶性FasL培育誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡，并如上所述測量編程性細(xì)胞死亡。在這些實(shí)驗(yàn)中，抗Fas中和抗體(1μg/ml)或mFLINT(10μg/ml)抑制編程性細(xì)胞死亡。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)mFLINT抑制編程性細(xì)胞死亡，并指出mFLINT至少部分通過抑制FasL-Fas編程性細(xì)胞死亡途徑而做到這一點(diǎn)。
實(shí)施例23鼠破骨細(xì)胞分化分析如Galvin等人(Endocrinology 137:1254 1996)所述修改Takahashi等人(Endocrinology 123:2600,1988)的共培養(yǎng)方法，并用所述方法研究各種試劑對破骨細(xì)胞分化的效應(yīng)。按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造mFLINT。
用CO2無痛致死雄性Balb/C小鼠(4-8周齡)，取出股骨，用生長培養(yǎng)基將骨髓洗滌出股骨。在500xg離心6分鐘，沉淀骨髓細(xì)胞并重懸浮于生長培養(yǎng)基中(RPMI 1640加5％熱變性的胎牛血清和1％抗生素-抗真菌劑溶液)。將骨髓群體(5×104細(xì)胞/cm2)接種進(jìn)在加入骨髓前兩小時(shí)已經(jīng)加入了BALC細(xì)胞(由新生小鼠顱蓋得到的穩(wěn)定細(xì)胞系，1.5×104細(xì)胞/cm2)的組織培養(yǎng)皿。所述細(xì)胞在潮濕的培養(yǎng)箱中37℃下5％CO2培養(yǎng)7天，其中在第3天和第5天更換培養(yǎng)基。在第0天、第3天和第5天用或不用10-8M 1,25-(OH)2D3處理培養(yǎng)物。此外，用或不用由mFLINT基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化的分泌mFLINT蛋白(圖1)處理所述細(xì)胞。培養(yǎng)7天后，用福爾馬林(3.7％10分鐘)固定24孔細(xì)胞群集板(cluster dish)中的細(xì)胞，然后用Graves,L和Jilka RL,J Cell Physiology 145:102 1990所述方法的修改形式，用酒石酸抗性的酸性磷酸酶(TRAP)染色細(xì)胞。定量破骨細(xì)胞(含有3個(gè)或更多核的TRAP陽性細(xì)胞)的數(shù)量。結(jié)果在下表中報(bào)告。
表FLINT(ng/ml)破骨細(xì)胞/孔a0.00145.50±7.330.0140.50±2.39*0.1065.50±3.33*1.0097.50±3.10*10.00 170.17±8.26100.00 335.00±8.90*a-每個(gè)值代表6個(gè)孔的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。*與對照組相比，p＜0.05
實(shí)施例24豬破骨細(xì)胞分化分析用CO2無痛處死新生豬(1到5日齡)，用70％乙醇沖洗附器，去除軟組織，切下肱骨、橈骨、尺骨、股骨、脛骨和腓骨。將長骨置于冰冷的無鈣及無鎂Hank氏平衡鹽溶液(CMF-HBSS,Gibco BRL)中并清除所有的軟組織?？v向切開這些骨，敲開骨內(nèi)的表面以取出骨髓和小梁骨。猛烈振蕩，攪拌脊柱骨顆粒和骨髓細(xì)胞的懸浮液，并依次序通過200mm和100mm的篩。4℃下在500xg離心細(xì)胞10分鐘，將沉淀重懸浮于CMF-HBSS中，然后在Ficoll-Paque梯度(Pharmacia,Piscataway,NJ)上分離。用CMF-HBSS洗滌得自所述梯度的單核細(xì)胞組份兩次，然后通過35mm的篩。所述細(xì)胞懸浮于含a-MEM(pH7.2，調(diào)整到含8.3mM NaHCO3(Gibco BRL,Grand Island,NY))、10％熱變性的胎牛血清(FBS,Hyclone,Logan,UT)以及2％抗生素/抗真菌劑溶液(Gibco BRL,Grand Island,NY)的生長培養(yǎng)基中，并以1×106細(xì)胞/cm2的密度接種到組織培養(yǎng)皿。一般的骨髓細(xì)胞產(chǎn)量在1-2×109細(xì)胞/動(dòng)物之間，根據(jù)動(dòng)物的大小而有所不同。細(xì)胞在潮濕的培養(yǎng)箱中37℃下5％CO2培養(yǎng)。24-48小時(shí)后，取出未貼壁的細(xì)胞并以7.5×105細(xì)胞/cm2的密度接種在24孔細(xì)胞群集培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，其中所述培養(yǎng)基含有或不含有10-8M 1,25-(OH)2D3(Biomol,Plymouth Meeting,PA)和mFLINT蛋白(如實(shí)施例8和實(shí)施例9獲得)。細(xì)胞培養(yǎng)至多10天，并且每48-72小時(shí)用含或不含1,25-(OH)2D3和mFLINT的生長培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)5天后，如實(shí)施例6中所述，用福爾馬林(3.7％10分鐘)固定細(xì)胞，然后用酒石酸抗性的酸性磷酸酶(TRAP)染色細(xì)胞。定量破骨細(xì)胞(含有3個(gè)或更多核的TRAP陽性細(xì)胞)的數(shù)量。結(jié)果在下表中報(bào)告。
表FLINT(ng/ml) 破骨細(xì)胞/孔a0.00 214.83±14.220.01 68.83±6.28*0.10 176.17±23.011.00 228.50±17.2610.00 228.50±29.29100.00 382.33±26.59*a-每個(gè)值代表6個(gè)孔的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。*與對照組相比，p＜0.05實(shí)施例25用mFLINT的體外治療按照實(shí)施例8和實(shí)施例9制造FLINT并使用于下面的實(shí)驗(yàn)。
A-來自照射過的小鼠的骨髓細(xì)胞-本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于通過用造血細(xì)胞因子強(qiáng)迫體外擴(kuò)增，確定mFLINT是否可以改善鼠造血祖細(xì)胞從照射恢復(fù)。給小鼠腹膜內(nèi)注射3mg 5-氟尿嘧啶，四天后，取出股骨并洗滌以分離骨髓(BM)細(xì)胞。一式三份，接種1×106BM細(xì)胞到24孔板的每個(gè)孔中的Iscoves改良dulbeccos培養(yǎng)基(IMDM)+10％FBS中，并用細(xì)胞因子干細(xì)胞生長因子(SCF)和IL-6在mFLINT(1μg/ml)存在或不存在時(shí)刺激細(xì)胞3天。3天的體外擴(kuò)增期后，一式三份地從板中取出(plated out)5×103細(xì)胞以進(jìn)行CFU分析。
與未用mFLINT處理的細(xì)胞相比，用mFLINT培育的骨髓細(xì)胞顯著增加了CFU的數(shù)量。圖9顯示CFU集落/3×106刺激過的BM細(xì)胞。這些結(jié)果暗示，mFLINT保護(hù)祖細(xì)胞免受編程性細(xì)胞死亡，并增加能夠形成集落的有活力細(xì)胞的數(shù)量。該圖顯示了對下列集落形成單位的結(jié)果-紅細(xì)胞系細(xì)胞(CFU-E)(對照-15,000集落；mFLINT處理-33,000集落)(p＜0.003)-粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞(CFU-GM)(對照-8,000集落；mFLINT處理-15,000集落)(p＜0.039)；以及更原始的粒細(xì)胞紅細(xì)胞系單核細(xì)胞巨核細(xì)胞(CFU-GEMM)(對照-750集落；mFLINT處理-3,000集落)(p＜0.007)。按照Student’s T檢驗(yàn)計(jì)算的p值顯示了顯著性差異。
B-來自用化療試劑處理的小鼠的骨髓細(xì)胞-本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于證明mFLINT或抗FasL抗體可以在鼠造血祖細(xì)胞已經(jīng)暴露于化療劑并用造血細(xì)胞因子體外擴(kuò)增后，改善所述細(xì)胞的恢復(fù)。將來自5-FU處理的小鼠的2×106骨髓細(xì)胞一式三份接種到24孔板的每個(gè)孔中的IMDM培養(yǎng)基+10％FBS中，并用SCF和IL-6以及下列化合物中的一種刺激3天1)mFLINT(1ug/ml)2)抗FasL(1ug/ml)3)FasL(0.15ug/ml)4)對照-無添加在用細(xì)胞因子體外擴(kuò)增3天后，計(jì)數(shù)有活力的細(xì)胞并用于建立CFU分析。如果mFLINT或抗FasL抗體保護(hù)祖細(xì)胞免受編程性細(xì)胞死亡，則預(yù)期這些組在CFU分析中將有更大量的克隆。圖10顯示了結(jié)果，該圖顯示了骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)(x1000)。得到的值是對照細(xì)胞3,300；FasL處理細(xì)胞3,000；抗FasL處理細(xì)胞4,200；mFLINT處理細(xì)胞4,900。
C-CD34+細(xì)胞-本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于確定mFLINT或抗FasL抗體是否可以改善來自純化的人CD34+祖細(xì)胞的祖細(xì)胞的恢復(fù)。在存在或不存在mFLINT或抗FasL抗體的情況下，用100U/ml人IL-6和100ng/ml人SCF體外刺激純化的人CD34+細(xì)胞(1×106/ml)3天以擴(kuò)增祖細(xì)胞。在該擴(kuò)增和處理之后，計(jì)數(shù)細(xì)胞并進(jìn)行CFU分析。
實(shí)施例26轉(zhuǎn)基因FLINT小鼠A-轉(zhuǎn)基因小鼠的準(zhǔn)備本實(shí)施例展示了表達(dá)FLINT的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建。這些動(dòng)物表達(dá)顯著水平的FLINT，但未顯示負(fù)效應(yīng)，這指出FLINT具有有利的毒性分布型。這些動(dòng)物也可用于進(jìn)一步描述針對上文所述病癥的有用治療方法。
構(gòu)建轉(zhuǎn)基因。如上所述，合成聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物并用于從質(zhì)粒pIG1-FLINTF擴(kuò)增融合的FLINT-FLAG DNA序列。5’引物5’-GAAGATCTTCTTTGATCAAGGATGGGCTTCTGGACTT-3’包含一個(gè)BglⅡ限制位點(diǎn)，而3’引物5’-GGACTAGTCCTGATCATCACTTGTCGTCGTCGTCCTT-3’包含一個(gè)SpeⅠ限制酶位點(diǎn)。這些引物用于擴(kuò)增完整的FLINT和FLAG編碼區(qū)。將擴(kuò)增的1.1kb片段連接進(jìn)質(zhì)粒pMTmcs2的多克隆位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pMTmcs2-FLINT(6.7kb)。見Fox等人，Eur.J.Pharmacol.308:195(1996)。
通過BglⅡ和SpeⅠ消化，從pMTmcs2-FLINT上切下FLINT基因片段并進(jìn)行凝膠純化。然后將該片段用克列諾酶平端化并連接進(jìn)質(zhì)粒pLIV.7的克列諾片段平端化MluⅠ位點(diǎn)，其中所述質(zhì)粒pLIV.7由J.David Gladstone Institutes的John Taylor提供。見Fan等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.91:8724(1994)。得到的質(zhì)粒pLIV7-FLINT也含有apoE基因啟動(dòng)子/5’側(cè)翼區(qū)以及名為“肝控制區(qū)”(HCR)的肝增強(qiáng)子序列。為微注射進(jìn)胚，用SalⅠ和SpeⅠ消化，從質(zhì)粒pLIV7-FLINT上切下包含Apo E基因啟動(dòng)子-FLINT/FLAG-HCR融合基因的7.0kb DNA片段，然后通過凝膠電泳和玻璃珠提取純化。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)育，使用已經(jīng)建立的技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述技術(shù)由例如Hogan,B.等人(1986)MANIPULATING THE MOUSEEMBRYO:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory(Cold Spring Harbor,NY)所述并如Fox和Solter,Molec.Cell.Biol.8:5470(1988)所修改。簡要地說，將包含Apo E基因啟動(dòng)子-FLINT-HCR融合基因的7.0kb DNA片段微注射進(jìn)FVB/N株的新受精的單細(xì)胞期胚(受精卵)的雄性原核中。在體外培養(yǎng)所述胚過夜以使其發(fā)育到二細(xì)胞期。隨后將二細(xì)胞期胚移植進(jìn)假孕的CD-1株小鼠的輸卵管中，使其發(fā)育到足月。為測試新生小鼠中轉(zhuǎn)基因的存在，從每只動(dòng)物切下一小片腳趾，用蛋白酶K消化以釋放核酸。隨后使用人FLINT特異性引物，對腳趾提取物的樣品進(jìn)行PCR分析以鑒定含有轉(zhuǎn)基因的小鼠。經(jīng)鑒定，五只建立者轉(zhuǎn)基因小鼠包含一個(gè)FLINT轉(zhuǎn)基因，并將它們命名為6494、7262、7353、7653和7659。繁殖每一個(gè)建立者以產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因系。
已經(jīng)廣泛鑒定了6494系的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和病理學(xué)。通過RNA印跡分析、RT-PCR(TaqMan)、蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)分析，在6494系子代中檢測到廣泛組織的表達(dá)，并且在肝和腎中的表達(dá)最高。在6494系小鼠循環(huán)中經(jīng)ELISA分析檢測到高水平的FLINT蛋白；建立者水平=490ng/ml；子代水平從285ng/ml到1360ng/ml(n=6)。通過這些分析沒有檢測到內(nèi)源FLINT。在5周齡或8周齡6494子代中沒有檢測到顯著的組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。初步血化學(xué)分析暗示6494小鼠中的甘油三酯水平可能提高。這些動(dòng)物沒有可觀察到的異?，F(xiàn)象。
B-保護(hù)小鼠免受輻射的傷害-本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于評價(jià)是否轉(zhuǎn)基因FLINT小鼠受到保護(hù)免受輻射的負(fù)效應(yīng)影響。用850 cGy致死照射18只轉(zhuǎn)基因小鼠和18只非轉(zhuǎn)基因小鼠。每組的18只小鼠中，有8只沒有給予骨髓移植物。在這8只小鼠中，用5只作為輻射誘導(dǎo)死亡的對照，3只用于輻射后3天腸粘膜和骨髓腔的組織學(xué)分析。
將來自正常非轉(zhuǎn)基因供體的3×104骨髓細(xì)胞移植進(jìn)每組余下的10只小鼠。由于肝未被輻射損傷，因此FLINT轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)該還能夠系統(tǒng)地產(chǎn)生FLINT蛋白。在已經(jīng)如本文所述照射的野生型動(dòng)物中，該骨髓細(xì)胞的給予通常在30天時(shí)導(dǎo)致約50％的存活率。在移植后第7、15、21和30天通過尾部取血獲得50-100μl的血并進(jìn)行血液學(xué)分析以監(jiān)測外周血的恢復(fù)(n=每組10只小鼠；總共20只小鼠)。所述血液分析將包括白血球計(jì)數(shù)(WBC)、紅血球計(jì)數(shù)(RBC)、血細(xì)胞比容以及血液涂片鏡檢觀察，以確定血液中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量。測量小鼠的存活率和外周血細(xì)胞的恢復(fù)。
預(yù)期由于FLINT防止擴(kuò)增中的祖細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡和/或增強(qiáng)腸上皮從輻射誘導(dǎo)的損傷中恢復(fù)，因此兩組間在存活率、腸上皮和骨髓的組織學(xué)以及外周血細(xì)胞的恢復(fù)上會(huì)有差異。
C-保護(hù)小鼠免受化療傷害-本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于確定FLINT和GM-CSF的組合的給予對于祖細(xì)胞從亞致死照射和化療誘導(dǎo)的骨髓抑制中恢復(fù)的效應(yīng)。具體地說，本實(shí)驗(yàn)檢查轉(zhuǎn)基因FLINT小鼠中白血球從化療和亞致死照射中的恢復(fù)是否改善。這樣一種化療方法的一個(gè)例子是用卡鉑處理。
在15只轉(zhuǎn)基因小鼠和15只對照小鼠中一次腹膜內(nèi)注射卡鉑(1.2mg/小鼠)4小時(shí)后，給予500 cGY輻射。該方法誘導(dǎo)伴隨延長的血小板減少和嚴(yán)重貧血的嚴(yán)重骨髓抑制。Leonard等人，Blood,83:1499(1994)。從照射后24小時(shí)開始，每天腹膜內(nèi)注射10μg/kg體重的重組鼠rmGM-CSF共12天，以促進(jìn)WBC計(jì)數(shù)的恢復(fù)。Mayer等人，J.Inf.Diseases 163:584(1991),Gamba-Vitalo等人，1991,Blood Cells 17:193(1991)。每7天通過尾部取血收集血液，直到第30天，然后進(jìn)行完全的血液分析。所述血液分析將包括白血球計(jì)數(shù)(WBC)、紅血球計(jì)數(shù)(RBC)、血細(xì)胞比容以及血液涂片鏡檢觀察以確定血液中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量。在第12天和第30天，在每組處死3只小鼠。由這些小鼠分析脾細(xì)胞構(gòu)成和骨髓細(xì)胞構(gòu)成。同時(shí)，匯集骨髓細(xì)胞并用于建立CFU分析以檢測祖細(xì)胞的含量。
D-FLINT對祖細(xì)胞的外周活動(dòng)的效應(yīng)- 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于測試祖細(xì)胞的外周遷移。為測試祖細(xì)胞的外周遷移，腹膜內(nèi)注射3mg 5-FU，處理FLINT轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠，4天后，或者從分離的骨髓細(xì)胞建立CFU分析，或者連續(xù)3天每天腹膜內(nèi)給予100ng GM-CSF，然后通過CFU分析確定骨髓的細(xì)胞構(gòu)成以及祖細(xì)胞含量。移植方法在上文的實(shí)施例B中描述。如上所述，用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)用基因療法將改善祖細(xì)胞在用細(xì)胞因子在體內(nèi)或體外刺激后的恢復(fù)。
權(quán)利要求
1．用于治療急性肝衰竭的mFLINT。
2．用于治療肝臟炎癥的mFLINT。
3．用于治療異常的肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的mFLINT。
4．用于治療膿毒病的mFLINT。
5．用于治療與炎癥有關(guān)的疾病的mFLINT。
6．用于治療肝炎的mFLINT。
7．用于治療異常編程性細(xì)胞死亡的mFLINT。
8．用于治療與局部缺血有關(guān)的損傷或疾病的mFLINT。
9．依照權(quán)利要求8的mFLINT，其中所述損傷或疾病與血凝性過高有關(guān)。
10．依照權(quán)利要求8的mFLINT，還包含選自溶栓劑和抗凝劑的藥物。
11．依照權(quán)利要求10的mFLINT，其中所述抗凝劑是激活的蛋白C。
12．用于治療與再灌注有關(guān)的損傷或疾病的mFLINT。
13．用于預(yù)防由于異常的心肌缺血對心肌細(xì)胞損傷的mFLINT。
14．用于治療Ⅰ型糖尿病的mFLINT。
15．用于治療癌癥的mFLINT。
16．用于治療由化療劑或治療輻射引起的對無辜受殃組織損傷的mFLINT。
17．依照權(quán)利要求16的mFLINT，其中所述組織是骨髓。
18．依照權(quán)利要求16的mFLINT，其中所述組織是腸上皮。
19．依照權(quán)利要求18的mFLINT，其中所述上皮位于口腔內(nèi)。
20．用于治療造血祖細(xì)胞的mFLINT，其中所述造血祖細(xì)胞已經(jīng)暴露于治療輻射或化療。
21．用于促進(jìn)造血祖細(xì)胞的生長或分化的mFLINT。
22．用于促進(jìn)CD34+細(xì)胞的生長或分化的mFLINT。
23．用于治療源于治療輻射或化療的細(xì)胞損傷的mFLINT。
24．依照權(quán)利要求23的mFLINT，其中所述細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞、造血祖細(xì)胞或外周血細(xì)胞。
25．用于治療再生障礙性貧血的mFLINT。
26．用于治療脊髓發(fā)育不良綜合征的mFLINT。
27．用于治療各類血細(xì)胞減少的病癥的mFLINT。
28．具有圖1的序列的分離核酸分子。
29．具有圖3的序列的分離核酸分子。
30．具有圖1的序列的分離多肽。
31．具有圖3的序列的分離多肽。
32．包含轉(zhuǎn)基因的小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因具有圖1的序列。
33．適于治療急性肝衰竭的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
34．適于治療肝臟炎癥的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
35．適于治療異常的肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
36．適于治療膿毒病的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
37．適于治療與炎癥有關(guān)的疾病的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
38．適于治療肝炎的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
39．適于治療異常的編程性細(xì)胞死亡的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
40．適于治療與局部缺血有關(guān)的損傷或疾病的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
41．依照權(quán)利要求40的制劑，其中所述損傷或疾病與血凝性過高有關(guān)。
42．依照權(quán)利要求40的制劑，所述制劑還包含選自溶栓劑和抗凝劑的藥物。
43．依照權(quán)利要求42的制劑，其中所述抗凝劑是激活的蛋白C。
44．適于治療與再灌注有關(guān)的損傷或疾病的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
45．適于在患有異常心肌缺血的患者中預(yù)防對心肌細(xì)胞的損傷的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
46．適于治療Ⅰ型糖尿病的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
47．適于治療癌癥的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
48．適于治療對無辜受殃組織的損傷的制劑，其中所述損傷由化療劑或治療輻射引起，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
49．依照權(quán)利要求48的制劑，其中所述組織是骨髓。
50．依照權(quán)利要求48的制劑，其中所述腸上皮。
51．依照權(quán)利要求50的制劑，其中所述上皮位于口腔內(nèi)。
52．適于治療造血祖細(xì)胞的制劑，其中所述造血祖細(xì)胞已經(jīng)暴露于治療輻射或化療，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
53．適于促進(jìn)造血祖細(xì)胞的生長或分化的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
54．適于促進(jìn)CD34+細(xì)胞的生長或分化的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
55．適于治療源于治療輻射或化療的細(xì)胞損傷的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
56．依照權(quán)利要求55的制劑，其中所述細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞、造血祖細(xì)胞或外周血細(xì)胞。
57．適于治療再生障礙性貧血的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
58．適于治療脊髓發(fā)育不良綜合征的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
59．適于治療各類血細(xì)胞減少的病癥的制劑，所述制劑包含mFLINT作為活性成分。
60．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療急性肝衰竭。
61．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療肝臟炎癥。
62．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療異常的肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡。
63．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療膿毒病。
64．在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療與炎癥有關(guān)的疾病。
65．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療肝炎。
66．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療異常的編程性細(xì)胞死亡。
67．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療與局部缺血有關(guān)的損傷或疾病。
68．依照權(quán)利要求67的用途，其中所述損傷或疾病與血凝性過高有關(guān)。
69．依照權(quán)利要求67的用途，其中所述制備還包括選自溶栓劑和抗凝劑的藥物。
70．依照權(quán)利要求69的用途，其中所述抗凝劑是激活的蛋白C。
71．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療與再灌注有關(guān)的損傷或疾病。
72．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于預(yù)防由異常的心肌缺血引起的對心肌細(xì)胞的損傷。
73．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療Ⅰ型糖尿病。
74．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療癌癥。
75．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療由化療劑或治療輻射引起的對無辜受殃組織的損傷。
76．依照權(quán)利要求75的mFLINT，其中所述組織是骨髓。
77．依照權(quán)利要求75的mFLINT，其中所述組織是腸上皮。
78．依照權(quán)利要求77的mFLINT，其中所述上皮位于口腔內(nèi)。
79．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療已經(jīng)暴露于治療輻射或化療的造血祖細(xì)胞。
80．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于促進(jìn)造血祖細(xì)胞的生長或分化。
81．mFLINT制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于促進(jìn)CD34+細(xì)胞的生長或分化。
82．mFLINT制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療源于治療輻射或化療的細(xì)胞損傷。
83．依照權(quán)利要求82的用途，其中所述細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞、造血祖細(xì)胞或外周血細(xì)胞。
84．mFLINT制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療再生障礙性貧血。
85．mFLINT制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療脊髓發(fā)育不良綜合征。
86．mFLINT在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于治療各類血細(xì)胞減少的病癥。
全文摘要
成熟的FLINT蛋白(mFLINT)結(jié)合FasL和LIGHT,并防止FasL－Fas相互作用介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡和促炎活性,可用于治療與異常的編程性細(xì)胞死亡和炎癥相關(guān)的疾病。本發(fā)明提供了FLINT和成熟FLINT的氨基酸序列和核苷酸序列。公開了表達(dá)FLINT的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備和鑒定。也提供了利用mFLINT治療的治療組合物和方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1303429SQ99806639
公開日2001年7月11日 申請日期1999年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月30日
發(fā)明者T·F·布莫爾, S·竇, A·L·格拉瑟布羅克, K·E·古爾德, J·E·哈勒, J·G·霍伊爾, K·Y·惠, A·卡里托寧科夫, J·米茲拉希, S·南, T·W·諾布利特, C·A·雷迪, H·Y·宋, J·王, X·吳, S·H·朱克爾曼 申請人:伊萊利利公司