專利名稱：抗－gp39抗體在狼瘡及相關(guān)腎病的治療和/或逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本發(fā)明涉及B細(xì)胞抗原CD40的反-受體，文獻(xiàn)中選擇性稱為CD40CR、gp39或最新的CD154，以及這類受體的可溶性配體，包括至少含有一部分CD40蛋白的融合分子。這是基于，至少是部分基于對(duì)可溶性CD40/免疫球蛋白的融合蛋白可通過與輔助性T細(xì)胞膜上新的39kD的蛋白受體結(jié)合而抑制輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的B細(xì)胞的活化的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供大致純的CD40CR受體；提供CD40CR的可溶性配體，包括抗-gp39抗體及其片段和至少含有一部分CD40蛋白的融合分子；并提供控制B細(xì)胞激活的方法，該方法在治療變態(tài)反應(yīng)或自身免疫性疾病中特別有用。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及抗-gp39抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或藥物引起的狼瘡的治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Mitchison、Benacerraf和Raff的研究首次提出Th和B細(xì)胞間相互的物理性相互作用是體液免疫應(yīng)答發(fā)生的基礎(chǔ)。隨后的研究證實(shí)Th與Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相容性抗原-提呈B細(xì)胞形成物理綴合物(Vitetta等，Immunol.Rev.,99:193-239(1987))，在這些綴合物中B細(xì)胞應(yīng)答Th(Barrett等，J.Immunol.,143:1745-1754(1989))。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)Th-衍生淋巴因子對(duì)B細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化發(fā)揮有效的影響，提出活化的Th附近釋放的可溶性因子介導(dǎo)相互作用的B細(xì)胞的激活。然而，沒有任何一種分子克隆的淋巴因子，無論是單獨(dú)或結(jié)合，表現(xiàn)出誘導(dǎo)進(jìn)入B細(xì)胞周期的能力。與可溶性因子不同，活化Th的漿膜部分可誘導(dǎo)B細(xì)胞周期進(jìn)入(Hodgkin等，J.Immunol.,145:2025-2034(1990)；Noelle等，J.Immunol.,146:1118-1124(1991))。應(yīng)用活化Th的純化漿膜部分的研究提示，在活化的Th的膜上表達(dá)的一種蛋白始動(dòng)體液免疫(Noelle等，J.Immunol.,146:1118-1124(1991)；Bartlett等，J.Immunol.,145:3956-3962(1990))。
已將活化Th細(xì)胞膜的純化漿膜(PMACT)用于研究這種效應(yīng)因子功能的性質(zhì)(Hodgkin等，J.Immunol.,145:2025-2034(1990)；Noelle等，J.Immunol.,146:1118-1124(1991))。活化Th的PMACT而不是靜息Th(PMREST)表現(xiàn)出以抗原非特異性、Ⅱ類-非限制性方式中誘導(dǎo)B細(xì)胞周期進(jìn)入的活性。此外，證實(shí)這種由PMACT表達(dá)的活性需要活化4-6小時(shí)、從新合成RNA，而且在本質(zhì)上是蛋白質(zhì)(Bartlett等，J.Immunol.,145:3956-3962(1990))。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及命名為CD40CR的B細(xì)胞抗原CD40的反-受體和這一受體的可溶性配體，包括至少含有一部分CD40蛋白的融合分子。這是基于，至少是部分基于對(duì)可溶性CD40/免疫球蛋白的融合蛋白可通過與輔助性T細(xì)胞膜上新的39kD的蛋白受體(CD40的反-受體命名為“CD40CR”)結(jié)合而抑制輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的B細(xì)胞的活化的發(fā)現(xiàn)，以及基于命名為MR1的直接針對(duì)該39kD受體的單克隆抗體能夠抑制輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的B細(xì)胞的激活的發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明提供CD40CR的可溶性配體(包括抗體)的大致純CD40CR受體，和至少含有一部分CD40蛋白的融合分子；并提供控制B細(xì)胞激活的方法。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，通過將治療有效量可溶性配體或CD40CR與受試者的輔助性T細(xì)胞接觸而抑制受試者的B細(xì)胞的激活。對(duì)B細(xì)胞激活的這種抑制或許在變態(tài)反應(yīng)或自身免疫性疾病的治療中特別有用。
更具體地說，本發(fā)明為需要這種治療的狼瘡病受試者，如進(jìn)行性系統(tǒng)性紅斑狼瘡或藥物性狼瘡，甚至處于疾病過程的晚期階段(此時(shí)常觀察到腎臟損害)的患者，提供治療方法，該治療方法為給予治療有效劑量的抗-gp39抗體，例如公開于普通轉(zhuǎn)讓的美國(guó)第08/475,847號(hào)(1995年6月7日申請(qǐng))中、現(xiàn)在已允許使用的抗-人gp39抗體或其片段。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以介入抗原非特異性的免疫應(yīng)答的一個(gè)方面。目前變態(tài)反應(yīng)的許多療法包括對(duì)特定抗原的脫敏療法，都需要對(duì)每個(gè)患者進(jìn)行檢測(cè)以便于鑒定與過敏性有關(guān)的抗原。實(shí)際問題是，將患者對(duì)每個(gè)和每種潛在變應(yīng)原作詳盡分析事實(shí)上是不可能的。而且，大多數(shù)自身免疫性疾病中，病因性抗原通常是未知的甚或與疾病進(jìn)程無關(guān)。涉及抗原非特異性CD40/CD40CR相互作用的本發(fā)明避免了對(duì)變態(tài)反應(yīng)或自身免疫性有關(guān)的抗原的特征鑒定的需要。因此，本發(fā)明在那些免疫原未知或具有多組分免疫原的變態(tài)反應(yīng)和自身免疫性疾病如枯草熱、普魯卡因酰胺所致的狼瘡或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的治療應(yīng)用中特別具有優(yōu)勢(shì)。也可將其應(yīng)用于急性治療免疫激活，如過敏反應(yīng)的治療。
縮略語Ig 免疫球蛋白Mab 單克隆抗體PMACT由活化的輔助性T細(xì)胞制備的漿膜PMREST由靜息輔助性T細(xì)胞制備的漿膜PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳rIL4重組白細(xì)胞介素-4rIL5重組白細(xì)胞介素-5SN 上清液Th輔助性T細(xì)胞Th1指D1.6，為Ⅰ-Ad-限制性兔免疫球蛋白特異性克隆插圖說明

圖1．單克隆抗體和CD40-Ig通過PMACT對(duì)引導(dǎo)B細(xì)胞RNA合成的影響。
A組．將靜息B細(xì)胞與Th1的Pmtest或PMACT一起培養(yǎng)。向含有PMACT的各孔中加入25μg/ml抗-CD4、抗-LFA-1或抗-ICAM-1或這些物質(zhì)的復(fù)合物(每種25μg/ml)，并通過[3H]-尿嘧啶核苷的摻入測(cè)定B細(xì)胞的RNA合成。培養(yǎng)42-48小時(shí)后評(píng)估B細(xì)胞的RNA合成。所給出的結(jié)果為三個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)物的算術(shù)平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差，并且代表5個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
B組．將靜息B細(xì)胞與Th1(●,▲)或Th2(□)的PMACT一起培養(yǎng)。向含有Th1PMACT的培養(yǎng)物(●,▲)的孔中加入逐漸增量的CD40-IG(▲)或?qū)φ盏鞍踪|(zhì)CD7E-Ig( )向含有培養(yǎng)物Th2PMACT(□)的孔中加入逐漸增量的CD40-Ig。培養(yǎng)42-48小時(shí)后評(píng)估B細(xì)胞的RNA合成。所述結(jié)果為三個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)物的算術(shù)平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差，并且代表3個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
C組．將靜息B細(xì)胞與LPS(50μg/ml)或PMACT一起培養(yǎng)。向培養(yǎng)物的孔中加入CD40-Ig(25μg/ml；孵化)或CD7E-Ig(25μg/ml；固體)。按A組中所述測(cè)定RNA合成。所示結(jié)果為三個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)物的算術(shù)平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差，并且代表3個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
圖2．CD40-Ig抑制B細(xì)胞的分化和增殖A組．將靜息B細(xì)胞與PMACT、rIL4(10ng/ml)以及rIL5(5ng/ml)一起培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始時(shí)或在培養(yǎng)開始后第一、第二或第三天時(shí)，加入CD40-Ig或CD7E-Ig(25μg/ml)。在培養(yǎng)第六天時(shí)，收集各孔SN并按Noelle等(J.Immunol.,146:1118-1124(1991))所述，用抗-同種型特異性的ELISA定量IgM(■)和IgG1(●)。在PMACT、IL4和IL5存在下(未加入CD40-Ig)，IgM和IgG1的濃度分別是IgM為4.6μg/ml和IgG1為126ng/ml。在IL4和IL5缺乏時(shí)，未測(cè)到IgM或IgG1。結(jié)果代表3個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
B組．用抗-CD3靜息或活化Th116小時(shí)，輻射后在IL4(10ng/ml)存在下，以1×104/孔與靜息B細(xì)胞(4×104/培養(yǎng)物)一起培養(yǎng)。向培養(yǎng)物中加入從0-25μg/ml的CD40-Ig(▲)或CD7E-Ig(●)。在培養(yǎng)后66-72小時(shí)，用1.0μCi的[3H]-胸腺嘧啶核苷對(duì)各孔施以脈沖并收集該培養(yǎng)物。所述虛線表示B細(xì)胞對(duì)靜息Th細(xì)胞的應(yīng)答。所示結(jié)果為三個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)物的算術(shù)平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差，并且代表2個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
圖3．CD40-Ig測(cè)定在活化Th而不是靜息Th上表達(dá)的分子。收獲靜息和活化Th，并與融合蛋白一起于4℃孵育20分鐘后，加入FITC-偶合的羊抗-hIgG(25μg/ml)。通過分析至少5000細(xì)胞/樣品，測(cè)定百分率陽性細(xì)胞和MFI。結(jié)果代表6個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。CD40-Ig以實(shí)心分布圖表示。
圖4．CD40-Ig免疫沉淀活化Th1溶解物的39kD蛋白。用不溶性的抗-CD3靜息或活化Th116小時(shí)。用純化抗體或融合蛋白(1-10μ)免疫沉淀靜息或活化Th的[35S]-標(biāo)記的蛋白。所述凝膠分布圖代表3個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
圖5．誘導(dǎo)的39kD Th膜蛋白特異性單克隆抗體抑制PMACT誘導(dǎo)的B細(xì)胞RNA合成。將靜息B細(xì)胞和PMACT分別與各10μg/ml的抗-α/β、抗-CD3、CD40-Ig或MR1一起培養(yǎng)。按圖1所述測(cè)定RNA合成。結(jié)果以三個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)物的算術(shù)平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差表示，并且代表3個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
圖6．MR1和CD40-Ig識(shí)別活化Th上表達(dá)的相同分子。
A組．將活化Th用MR1或?qū)φ誌g熒光染色。為評(píng)估CD40-Ig和MR1是否競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合活化Th，將不同濃度梯度的MR1或?qū)φ諅}(cāng)鼠Ig(抗-α/βTCR)與抗-CD40(20μg/ml)一起加入到其中。于4℃孵育20分鐘之后，洗滌樣品品并與FITC-偶合的、抗人IgG1的單克隆抗體一起孵育。結(jié)果代表3個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
B組．用MR1(10μg/樣品)或CD40-Ig(10μg/樣品)免疫沉淀[35S]-蛋氨酸-標(biāo)記的活化Th的蛋白并通過PAGE和熒光自顯影分離該蛋白。結(jié)果代表2個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
圖7．CD40-Ig與人細(xì)胞系的結(jié)合。將多種人T-細(xì)胞系暴露于生物素-標(biāo)記的CD40-Ig，并通過流式細(xì)胞法評(píng)估其結(jié)合。
圖8．A組．Stamenkovic等的CD40 cDNA的核苷酸序列(EMBO J.,8:1403-1410(1989))。下劃線為跨膜區(qū)。
B組．可用于表達(dá)CD40-Ig的質(zhì)粒示意圖?！鰿D40融合位點(diǎn)的氨基酸序列標(biāo)示于以下的CD40蛋白的圖解部分。
圖9．不同治療組NZB/NZW F1小鼠所產(chǎn)生的抗-(ss)DNA抗體的滴度?？招沫h(huán)(---○---)代表用MR-1治療的4-10月齡小鼠；空心三角(---△---)代表在發(fā)生蛋白尿后接受MR-1不發(fā)生反應(yīng)的小鼠；實(shí)心方塊(---■---)代表在發(fā)生蛋白尿后接受MR1發(fā)生反應(yīng)的小鼠，而實(shí)心環(huán)(---●---)代表未接受治療的小鼠。得出的數(shù)值是每組三個(gè)滴度的平均值+/-SEM。
圖10．不同治療組的NZB/NZW F1小鼠的存活率。空心環(huán)(---○---)代表用MR1治療的4-10月齡小鼠；空心三角(---△---)代表在發(fā)生蛋白尿后接受MR1不發(fā)生反應(yīng)的小鼠； 實(shí)心方塊(---■---)代表在發(fā)生蛋白尿后接受MR1發(fā)生反應(yīng)的小鼠，而實(shí)心環(huán)(---●---)代表未接受治療的小鼠。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供大致純CD40CR受體；提供CD40CR的可溶性配體，包括抗-gp39的抗體及其片段和含有CD40的融合分子；并提供應(yīng)用可溶性配體控制B細(xì)胞激活的方法。
為了公開清楚而不是限制本發(fā)明，將本發(fā)明的詳細(xì)說明分成下述部分
(ⅰ)結(jié)合CD40CR的己體；(ⅱ)用于鑒定CD40CR的方法；(ⅲ)純化的CD40CR的制備；(ⅳ)結(jié)合CD40CR的配體的用途；和(ⅴ)CD40CR的用途。
(ⅲ)純化CD40CR的制備；(尤其是治療進(jìn)行性狼瘡，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡或藥物性狼瘡)。
本發(fā)明提供CD40CR的可溶性配體，包括(ⅰ)至少含有一部分CD40蛋白的融合分子和(ⅱ)與CD40CR特異性結(jié)合的抗體或抗體片段、或gp39、或已知所述抗原的CD154。
本文所用術(shù)語“可溶性”，表示本發(fā)明的配體并非總是與細(xì)胞漿膜結(jié)合。然而，本發(fā)明的可溶性配體可固定在非細(xì)胞性固體支持物上，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、或碳水化合物分子、圓珠、囊泡、磁性顆粒、纖維等，或可包埋于植入物或囊泡中。
這樣的配體與CD40CR結(jié)合的能力可通過證明所述配體與CD40-Ig(如下)或MR1(如下)相同的蛋白結(jié)合、或結(jié)合CD40CR的另一種抗體(如普通轉(zhuǎn)讓的美國(guó)第08/475,847號(hào)中所公開的抗體)而證實(shí)。
本發(fā)明的配體可與合適的載體一起組成藥用組合物。
本發(fā)明提供為CD40CR配體的可溶性融合分子。這類融合分子含有至少與第二個(gè)分子連接的一部分CD40蛋白。所述CD40部分優(yōu)選缺乏CD40跨膜區(qū)?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的CD40蛋白的一部分定義為能與CD40CR結(jié)合的任何部分，如顯示與相同蛋白如MR1或CD40-Ig結(jié)合的部分。
可使用的第二分子包括肽類和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物，在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，可以為免疫球蛋白分子或其部分(如Fv、Fab、F(ab’)2或Fab’片段)、或CD8、或其它粘附分子如B7。第二分子可得自非人類來源或人類來源，或可以是嵌合體。第二分子也可以是一種酶、毒素、生長(zhǎng)因子、淋巴因子、抗增殖劑、烷化劑、抗代謝劑、抗生素、長(zhǎng)春花生物堿、鉑配位配合物、放射性同位素或熒光化合物。
可通過化學(xué)合成或優(yōu)選通過DNA重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的融合分子。
例如，可將至少編碼一部分CD40蛋白的核酸序列與編碼第二個(gè)分子的核酸序列在合適的表達(dá)載體中組合，然后在原核或優(yōu)選真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母、桿狀病毒或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)中表達(dá)。
或者，至少一部分CD40蛋白可通過電泳技術(shù)或用與CD40或第二個(gè)分子結(jié)合的配體作親和層析表達(dá)。與CD40結(jié)合的配體包括(但不局限于)抗-CD40抗體如由雜交瘤產(chǎn)生的G28-5(該雜交瘤保藏號(hào)為HB9110并保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)和CD40CR，下文將作詳細(xì)說明。如果第二個(gè)分子是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，可應(yīng)用含有抗-免疫球蛋白抗體的親和層析柱；如果第二個(gè)分子含有Fc片段，可應(yīng)用蛋白A柱。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，可用編碼CD40蛋白(該蛋白從跨膜區(qū)域上游截?cái)?的核酸序列生產(chǎn)CD40的一部分?？赏ㄟ^消化含有編碼CD40抗原的cDNA的質(zhì)粒來制備這種核酸序列，如按Stamenkovic等(EMBO J.,8:1403-1410(1989))所述，用PstⅠ(P)和Sau3A(S3)限制性酶消化。將所得到的P/S3片段亞克隆入用P和BamHⅠ(B)消化的相同質(zhì)粒中，以生產(chǎn)截短的CD40基因(見圖8)。
在本發(fā)明非限性具體實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)含有至少一部分CD40以及免疫球蛋白序列的表達(dá)載體可優(yōu)選由病毒性復(fù)制起點(diǎn)、細(xì)菌性復(fù)制起點(diǎn)、細(xì)菌性選擇標(biāo)記、以及通過限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)從編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA序列中分離的真核啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列組成，后接多聚腺苷酸信號(hào)序列，所述限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可允許亞克隆編碼至少一部分CD40的DNA序列(見圖8.b)。
在本發(fā)明特定實(shí)施方案中，可將截短的CD40基因亞克隆到免疫球蛋白的融合質(zhì)粒中，如Aruffo等所述(Cell,61:1303-1313(1990))，用MIu I和B消化，構(gòu)建pCD40-Ig質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼融合分子CD40-Ig(見圖8)。然后可通過將pCD40-Ig質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COS細(xì)胞，形成瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)而產(chǎn)生CD40-Ig融合蛋白。自COS細(xì)胞上清液收集所產(chǎn)生的CD40-Ig，并按Aruffo等，Cell,161:1303-1313(1990)所述經(jīng)蛋白A柱層析進(jìn)行純化。
本發(fā)明的可溶性配體優(yōu)選包括抗體分子、單克隆抗體分子、或含有與CD40CR(gp39)(優(yōu)選人gp39)結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的這些抗體分子的片段。這類配體還可含有第二個(gè)分子，該分子可是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、酶、毒素、生長(zhǎng)因子、淋巴因子、抗增殖劑、烷化劑、抗代謝劑、抗生素、長(zhǎng)春花生物堿、鉑配位配合物、放射性同位素或熒光化合物并且可與所述抗體分子或片段連接。
當(dāng)所述配體是單克隆抗體或其片段時(shí)，可應(yīng)用任何能提供由細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)而產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)制備抗CD40CR(gp39)的單克隆抗體。例如，由Kohler和Milstein首先研制的雜交瘤技術(shù)(1975,Nature,256:495-497)以及近來可用的其它技術(shù)，如人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar等，1983,Immunology Today,4:72)和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥的治療，Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁)第均在本發(fā)明范圍內(nèi)。通常優(yōu)選人源化或嵌合型抗-gp39抗體，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮o藥后不易引起免疫原性應(yīng)答(HAMA應(yīng)答)。
可通過已知技術(shù)產(chǎn)生含有獨(dú)特型所述分子的抗體片段。例如，這類片段包括但不局限于F(ab’)2片段，它可通過應(yīng)用胃蛋白酶處理所述抗體分子產(chǎn)生；Fab’片段，它可通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生；F(ab’)2片段，它可通過應(yīng)用木瓜蛋白酶處理所述抗體分子產(chǎn)生；以及2Fab或Fab片段，它們可通過應(yīng)用木瓜蛋白酶和還原二硫鍵的還原劑處理所述抗體分子產(chǎn)生。
如上所述，本發(fā)明也提供通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生的嵌合體或人的抗體，如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,8 1:6851-6855(1984)或歐洲專利申請(qǐng)第85305604.2號(hào)、公布第0173494號(hào)(Morrison等，1986年3月5日公布)中所述的技術(shù)。
用于產(chǎn)生抗體的免疫原可以是含CD40CR的任何來源。例如，活化的Th，如可將活化的人Th細(xì)胞用作免疫原。此外，可應(yīng)用按下述5.3部分所述制備的大致純CD40CR。如果將活化的Th用作免疫原，可測(cè)試抗血清的抗活化Th細(xì)胞而不是靜息Th細(xì)胞的反應(yīng)性。
所述免疫原也可包括重組gp39或其片段。在這點(diǎn)上，已用重組方法克隆并表達(dá)編碼鼠和人gp39的DNA。這些蛋白質(zhì)為抗-gp39抗體的產(chǎn)生提供潛在的免疫原。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述可溶性配體是抗-人gp39單克隆抗體，更優(yōu)選人源化或嵌合型抗-人gp39抗體。將下述方法用于產(chǎn)生MR1單克隆抗體，該抗體特異性地與鼠gp39結(jié)合，并可用來產(chǎn)生針對(duì)CD40CR的其它抗體。
將5-106活化的Th1細(xì)胞(D1.6)每隔一周腹腔注射，持續(xù)6周免疫倉(cāng)鼠。當(dāng)抗鼠Th1的血清滴度大于1∶10,000時(shí)，采用免疫倉(cāng)鼠的脾細(xì)胞和NSI，用聚乙二醇進(jìn)行細(xì)胞融合。用流式細(xì)胞儀在靜息和活化Th1上從含有生長(zhǎng)的雜交瘤的孔中篩選上清液。進(jìn)一步測(cè)試一種產(chǎn)生選擇性識(shí)別活化Th的單克隆抗體的具體雜交瘤，并將其亞克隆以衍生出MR1。在腹水中產(chǎn)生MR1并通過離子交換高壓液相層析純化。
此外，更優(yōu)選根據(jù)美國(guó)第08/475,847號(hào)制備抗-人gp39抗體，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到此處。
本發(fā)明也提供包括單克隆抗體或其片段的配體，該單抗或其片段能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制MR1與其靶抗原或CD40-Ig與其受體的結(jié)合。
可通過(ⅰ)CD40CR結(jié)合CD40、至少含有一部分CD40的融合分子和諸如MR1的抗體的能力；(ⅱ)CD40CR能夠刺激B細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期、增殖和分化的功能特性；以及(ⅲ)CD40CR的細(xì)胞分布來鑒定CD40CR。
可通過CD40CR結(jié)合諸如CD40、含有CD40的融合分子以及針對(duì)CD40CR的抗體的配體的能力鑒定CD40CR。
如下文更詳細(xì)的討論，將幾種技術(shù)用于鑒定CD40CR。例如，證實(shí)CD40-Ig和MR1能識(shí)別同樣的39kD分子。發(fā)現(xiàn)CD40-Ig和MR1二者均可從放射性標(biāo)記的Th溶解物中免疫沉淀39kD蛋白質(zhì)(圖5b)。此外，39kD蛋白質(zhì)與CD40-Ig的免疫沉淀去除了由MR1從Th溶解物中識(shí)別的抗原。
還可用CD40CR刺激B進(jìn)入細(xì)胞周期、增殖和分化能力鑒定CD40CR。
例如，發(fā)現(xiàn)活化的(PMACT)而不是靜息的(PMREST)Th細(xì)胞漿膜(PM)可誘導(dǎo)B細(xì)胞的RNA合成(圖1a)；指示B細(xì)胞的活化的該誘導(dǎo)作用不受抗體如抗-LFA-1、抗-CD4、抗-ICAM-1的影響。然而，如圖1b和圖6所示，發(fā)現(xiàn)CD40-Ig或MR1能夠抑制PMACT-誘導(dǎo)的B細(xì)胞活化。
可通過諸如[3H]-尿嘧啶核苷摻入RNA(如B細(xì)胞分化，RNA合成增加)或通過[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入(測(cè)定與細(xì)胞增殖有關(guān)的DNA合成)技術(shù)測(cè)定B細(xì)胞活化的誘導(dǎo)作用。為獲得CD40CR對(duì)B細(xì)胞增殖的影響的最佳測(cè)定，可以約10ng/ml濃度將白細(xì)胞介素-4(IL4)加入到培養(yǎng)基中。
此外，可根據(jù)免疫球蛋白分泌的功能測(cè)定B細(xì)胞的活化。例如，可將CD40CR(大致純形式，或存在PM中，或反之)與IL4(10ng/ml)和IL5(5ng/ml)一起加入到靜息B細(xì)胞中。培養(yǎng)3天后，可加入額外體積的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)的第6天時(shí)，收集各培養(yǎng)物的上清液(SN)并按照Noelle等所述(J.Immunol.,146:1118-1124(1991))測(cè)定IgM和Ig1的量。
也可通過CD40CR的細(xì)胞分布鑒定CD40CR。例如，根據(jù)流式細(xì)胞儀測(cè)定，觀察到CD40-Ig與活化而非靜息Th1結(jié)合(圖3)。而且，觀察到CD40-Ig與Jurkat細(xì)胞、HSB2細(xì)胞和人外周血中的活化T細(xì)胞的結(jié)合，但未表現(xiàn)出明顯的與CEM細(xì)胞、HPBALL細(xì)胞、或鼠thyoma細(xì)胞的結(jié)合。
例如，并不是限制，可如下通過流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)存在于特定細(xì)胞類型(“測(cè)試細(xì)胞”)上的CD40CR?？捎渺o息(陰性對(duì)照)和活化(陽性對(duì)照)Th細(xì)胞平行測(cè)試受試細(xì)胞。所有細(xì)胞以約1×105細(xì)胞/50μl的濃度與配體(如CD40-Ig或MR1)在4℃培養(yǎng)20分鐘，然后加入FITC-偶合的抗-配體的抗體。可在所有樣品中加入終濃度為2μg/ml的碘化丙錠。然后在例如BDFACSCAN上進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。在正向門控細(xì)胞前向散射與側(cè)向散射后，紅色為陰性(因?yàn)榈饣V排阻)，可確定活細(xì)胞的綠色熒光對(duì)數(shù)。
本發(fā)明提供大致純CD40CR?？赏ㄟ^下述方法，由攜帶CD40CR的細(xì)胞如活化的輔助性T細(xì)胞、Jurkat和HSB2細(xì)胞制備這種CD40CR。
可按照Noelle等所述(J.Immunol.,146:1 118-1124(1991))，通過不連續(xù)蔗糖梯度的沉降作用，從合適的細(xì)胞如活化的Th1細(xì)胞，制備細(xì)胞漿膜。然后可通過以下方法分離CD40CR用溫和去污劑抽分離膜粗提取物，之后進(jìn)行尺寸排阻層析，再后用結(jié)合到固體支持物上合適配體(如MR1或CD40-Ig)進(jìn)行親和層析、免疫沉淀(如用CD40-Ig或MR1)和/或凝膠電泳。
可以預(yù)期所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的分子量約為39kD。
本發(fā)明提供可溶性CD40CR(即無細(xì)胞)，該可溶性CD40CR可包含在與合適的載體一起組成的藥用組合物中。它更進(jìn)一步提供與第二個(gè)分子結(jié)合的CD40CR，所述第二個(gè)分子可以是肽、蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、酶、毒素、生長(zhǎng)因子、淋巴因子、抗增殖劑、烷化劑、抗代謝劑、抗生素、長(zhǎng)春花生物堿、鉑配位配合物、放射性同位素或熒光化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供通過化學(xué)合成或DNA重組技術(shù)制備的大致純CD40CR。例如，可通過將從活化的輔助性T細(xì)胞制備的cDNA插入到λgt10表達(dá)系統(tǒng)中，然后用MR1或CD40-Ig結(jié)合篩選，以鑒定CD40CR-表達(dá)克隆，從而分離出CD40CR的基因?；蛘撸蓪幕罨妮o助性T細(xì)胞制備的cDNA轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中，用MR1或CD40-Ig篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，鑒定CD40CR產(chǎn)物。然后可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的表達(dá)系統(tǒng)將CD40CR的基因用于表達(dá)CD40CR。
本發(fā)明提供利用與CD40CR結(jié)合的配體控制B細(xì)胞激活的方法。具體地講，它提供抑制B細(xì)胞激活的方法，包括將B細(xì)胞和Th細(xì)胞的混合物暴露于與CD40CR結(jié)合的有效濃度配體。在前面5.1部分對(duì)可應(yīng)用的配體已有說明?？梢栽隗w外或體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明的方法。有效濃度指能抑制B細(xì)胞激活的配體的濃度，可用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)(包括前述5.2部分所述技術(shù))測(cè)定，至少約30％，優(yōu)選約75％。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的、特定的非-限制性實(shí)施方案，可將CD40-Ig用作配體，在此情況下有效濃度可以至少是約10μg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)具體的非-限制性實(shí)施方案中，可應(yīng)用MR1單克隆抗體，在該情況下有效濃度可以至少是約10μg/ml。如果在體內(nèi)實(shí)施所述方法，配體的有效濃度指配體的血漿濃度或局部濃度。例如，最好是在局部區(qū)域抑制B細(xì)胞的激活，以便于限制對(duì)整個(gè)免疫系統(tǒng)的影響。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療患有與B細(xì)胞激活有關(guān)的疾患的受治療者的方法，包括對(duì)受試者給予治療量的與CD40CR結(jié)合的配體。受試者可以不是人類或優(yōu)選人類。
與B細(xì)胞激活有關(guān)的疾患包括但不局限于變態(tài)反應(yīng)(包括過敏癥)；自身免疫性疾病，包括藥物性狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、Sjogren氏綜合征等；以及涉及B細(xì)胞的病毒性疾病，包括EB病毒(Epstein-Barr)感染和包括人類免疫缺陷病毒感染的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
由于已提出B細(xì)胞激活與誘發(fā)潛伏期人類免疫缺陷病毒復(fù)制有關(guān)，最好是將本發(fā)明的所述配體給予那些還未發(fā)展為艾滋病(AIDS)或ARC的人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性個(gè)體。
如上所述，及在下述實(shí)施例中，特別優(yōu)選使用抗-gp39抗體或其片段，包括其在藥物性狼瘡或系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用。如下述實(shí)施例的基本數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，已發(fā)現(xiàn)所述抗-gp39抗體的治療減少了自身抗體的產(chǎn)生和減輕腎病，并使NZB/NZW(公認(rèn)的人類SLE的動(dòng)物模型)存活期延長(zhǎng)。
此外，在蛋白尿2-3+的小鼠(活動(dòng)性狼瘡狀態(tài))中進(jìn)一步證實(shí)，給予抗-gp39抗體竟然逆轉(zhuǎn)病情(證據(jù)是給予抗體后生存期延長(zhǎng)和無蛋白尿)。因此，在公認(rèn)的人類狼瘡的動(dòng)物模型發(fā)生腎病后，用抗-gp39抗體治療顯示，逆轉(zhuǎn)狼瘡病進(jìn)程。這證實(shí)在治療狼瘡和其它自身免疫性疾病中，抗-gp39抗體用于人類的治療用途的可能性。特別是它證實(shí)了可將這類抗體用于治療活動(dòng)性進(jìn)行性疾病、甚至處于疾病晚期階段的患者。這種治療將有效地治療甚至可能逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程如狼瘡患者常見的腎損害。
在合適的藥用載體中，可通過本領(lǐng)域已知的任何方法給予配體，包括靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、鞘內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射或肌肉注射，以及口腔、鼻內(nèi)、眼內(nèi)和直腸給藥，并且其可微球體、脂質(zhì)體和/或緩釋植入物中。
將配體的治療量定義為可顯著減輕B細(xì)胞激活或T細(xì)胞活化的臨床有害影響的量，并且可隨所用的配體和所治療而變化。如果應(yīng)用CD40-Ig，則無論是系統(tǒng)(血漿濃度)或局部治療濃度可以為約10μg/ml。如果應(yīng)用MR1或其它抗-gp39抗體，如人源化或嵌合型抗-人gp39抗體或其片段，則無論是系統(tǒng)(血漿濃度)或局部治療濃度可以是約10μg/ml。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，上述方法可利用含有毒素或抗代謝劑的配體，這樣將殺死Th細(xì)胞或使其受損，因?yàn)槠茐腡h細(xì)胞使得增加B細(xì)胞激活。
也可用本發(fā)明的配體來標(biāo)記活化的T細(xì)胞，是一種可用于T細(xì)胞疾病的診斷的技術(shù)。為此，可將含有酶、放射性同位素、熒光化合物或其它可檢測(cè)標(biāo)記的配體體外或體內(nèi)暴露于T細(xì)胞，測(cè)定所述結(jié)合量。
也可將本發(fā)明的配體用于傳遞活化T細(xì)胞的物質(zhì)如生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明提供利用CD40CR或含CD40CR的分子控制B細(xì)胞激活的方法，所述CD40CR或含CD40CR的分子是按照前述方法制備。具體地說，提供促進(jìn)B細(xì)胞激活的方法，包括將B細(xì)胞暴露于有效濃度的CD40CR?？稍隗w內(nèi)或體外實(shí)施該方法。有效濃度指誘導(dǎo)B細(xì)胞激活的受體的濃度，可通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)測(cè)定，至少約30％。在本發(fā)明特定的、非限制性實(shí)施方案中，局部或系統(tǒng)的CD40CR濃度可為約10μg/ml。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明給患有與體液免疫減弱有關(guān)的免疫缺陷疾病的受試者提供治療方法，包括給予受試者治療量的CD40CR。受試者可以不是人類，但是優(yōu)選人類。
與體液免疫減弱有關(guān)的免疫缺陷疾病包括獲得性免疫缺陷，如由化療或放射治療導(dǎo)致的，以及涉及到體液免疫的遺傳性疾病。
在合適的藥用載體中，可通過本領(lǐng)域已知的任何方法給予CD40CR，包括靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、鞘內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射或肌肉注射，以及口腔、鼻內(nèi)、眼內(nèi)和直腸給藥，并且它可包含在微球體、脂質(zhì)體、和/或緩釋植入物中。
CD40的CD40CR治療量定義為可至少增加產(chǎn)生約30％免疫球蛋白的量。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可將CD40CR偶合到毒素上，給予處于優(yōu)選破壞表達(dá)CD40的B細(xì)胞的情況下的受試者。這種情況的實(shí)例包括接受器官移植或患有多發(fā)性骨髓瘤或其它B細(xì)胞惡性腫瘤或自身免疫病的患者。
也可將CD40CR用于標(biāo)記表達(dá)CD40的B細(xì)胞，為一種可用于B細(xì)胞疾病的診斷的技術(shù)。為此，將與酶、放射性同位素、熒光化合物或其它可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合的受體體外或體內(nèi)暴露于B細(xì)胞，并測(cè)定所述結(jié)合的量。
也可用CD40CR將與其結(jié)合的分子傳遞給B細(xì)胞。
實(shí)施例1活化的輔助性T細(xì)胞上的新型受體CD40CR結(jié)合CD40并轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞關(guān)聯(lián)性激活信號(hào)材料和方法動(dòng)物將雌性DBA/2J小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)用于制備填料細(xì)胞(filler cell)以支持Th克隆的生長(zhǎng)，并用于制備靜息B細(xì)胞。
D1.6為一種Ⅰ-Ad-限制性的兔免疫球蛋白-特異性Th1克隆(Kurt-Jones等，J.Exp.Med.,166:1774-1787(1987))，得自David Parker博士(University of Massachusetts,Worcester)。D1.6在本文稱為Th1。
按照Noelle等(J.Immuno.,146:1118-1124(1991))所述，將Th1(8×106/孔)于簇集孔(6孔板，Coming,NY)中培養(yǎng)，該板各孔已用抗-D340μg/4ml PBS包被16小時(shí)。
按照Noelle等(同上)所述，通過不連續(xù)蔗糖梯度沉降制備細(xì)胞漿膜。
按照Defranco等(J.Exp.Med.,155:1523(1982))所述，通過在不連續(xù)珀可(Percoll)梯度沉降制備靜息脾B細(xì)胞。從70-75％(密度為1.087-1.097)珀可的界面分離的細(xì)胞通常＞95％mIg+，具有均勻、低度接近前向的光散射并且對(duì)Con A不應(yīng)答。
用離子交換HPLC從小鼠(該小鼠經(jīng)過輻射并且骨髓業(yè)已重建)腹水中純化下述單克隆抗體抗-CD3:145-2C11(Leo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:1374-1378(1987))；抗-α,β:H57-597；抗-CD4:GK1.5(Wilde等，J.Immunol.,131:2178-2183(1983))；抗-ICAM:YN1/1.7.4(Prieto等，Eur.J.Immunol.,19:1551-1557(1989))；抗-LFA-1:FD441.8(Sarniento等，Immunol.Rev.,68:135(1982))；以及抗-大鼠/倉(cāng)鼠κ鏈RG-7(Springer,Hybrid.,1:257-273(1982))。
通過用限制性酶PstⅠ(P)和Sau 3A(S3)消化質(zhì)粒制備CD40的融合蛋白，該質(zhì)粒含有編碼CD40抗原的cDNA(Stamenkovic Seed,EMBO J.,8:1403-1410(1989))。將這一P/S3片段亞克隆到同樣的質(zhì)粒中，該質(zhì)粒用P和Bam H1(B)消化。允許制備編碼從跨膜結(jié)構(gòu)域上游截?cái)嗟腃D40蛋白質(zhì)的CD40△。然后將編碼CD40△的DNA片段亞克隆到該免疫球蛋白融合質(zhì)粒中(Aruffo等，Cell,61:1303-1313(1990))，用MIuⅠ和B消化。按照Aruffo等所述(Cell,61:1303-1313(1990))，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中產(chǎn)生所述CD40-Ig融合蛋白并將其在蛋白A柱上純化。
白細(xì)胞介素4(IL4)重組鼠IL4由C.Maliszewski和K.Grabstein博士慷慨提供(Immunex Corporation,Seattle,WA.)。
白細(xì)胞介素5(IL5)重組鼠IL5購(gòu)自R&D研究所(Sarrento,CA.)。
將3×104靜息B細(xì)胞在A/2微量滴定板孔(Costar,Cambridge,MA)中培養(yǎng)于50μl cRPMI中。向這些孔中，加入0.5μgTh1或Th2膜蛋白。在42-48小時(shí)，各孔用2.5μCi3H-尿嘧啶核苷(New England Nuclear,Boston,MA)施以脈沖，收集各孔，并通過液體閃爍分光術(shù)測(cè)定放射活性。所述結(jié)果以cpm/培養(yǎng)物+/-標(biāo)準(zhǔn)差表示。
如上所述培養(yǎng)靜息B細(xì)胞。向培養(yǎng)孔中，加入0.5μg Th1膜蛋白、IL4(10ng/ml)和IL5(5ng/ml)。培養(yǎng)第三天，加入另外的50μl cRPMI。培養(yǎng)第六天，收集各孔的上清液并按Noelle等(J.Immunol.,146:1118-1124(1991))所述，測(cè)定IgM和IgG1的量。
將4×104靜息B細(xì)胞在A/2微量滴定板孔(Costar,Cambridge,MA)中培養(yǎng)于50μl cRPMI中。向這些孔中，加入1×104靜息或活化、輻射的(500拉德(rad))Th1和IL4(10ng/ml)。培養(yǎng)第三天，按照Noelle等在J.Immunol.,146:1118-1124(1991)中所述，各孔用1μCi3H-胸腺嘧啶核苷脈沖處理。
將5-10×104活化的Th1(D1.6)隔周腹腔注射，持續(xù)免疫倉(cāng)鼠6周。當(dāng)抗鼠Th1的血清滴度大于1∶10,000時(shí)，采用免疫倉(cāng)鼠的脾細(xì)胞和NSI，用聚乙二醇進(jìn)行細(xì)胞融合。用流式細(xì)胞儀在靜息和活化Th1上篩選含有生長(zhǎng)的雜交瘤的孔的上清液。進(jìn)一步測(cè)試一種能產(chǎn)生選擇性識(shí)別活化Th的單克隆抗體的特定雜交瘤，并將其亞克隆以衍生MR1。在腹水中產(chǎn)生MR1并通過離子交換HPLC純化。
收集靜息和活化Th(與抗-CD3一起16小時(shí))并以1×105細(xì)胞/50μl與融合蛋白在4℃培養(yǎng)20分鐘，然后加入FITC-偶合的羊抗-人(h)IgG(25μg/ml；Southern Biotechnology,Birmingham,AL)。在所有樣品中加入碘化丙錠至終濃度為2μg/ml。在BD FACSCAN上進(jìn)行流式細(xì)胞分析。在正向門控細(xì)胞前向散射與側(cè)向散射后，紅色為陰性(因?yàn)榈饣V排阻)，可確定活細(xì)胞的綠色熒光對(duì)數(shù)。
陽性細(xì)胞百分率和MFI的測(cè)定至少要分析5,000存活細(xì)胞。用MR1染色利用FITC-偶合的RG7，為小鼠抗-大鼠/倉(cāng)鼠k鏈的單克隆抗體。
用不溶性抗-CD3靜息或活化Th1 16小時(shí)。用1mCi[35S]-甲硫氨酸/半胱氨酸標(biāo)記靜息和活化Th(20×106/ml)的蛋白質(zhì)1小時(shí)，此時(shí)如所述(Noelle等，(1986)J.Immunol.,137:1718-1726)，將其用含10％胎牛血清的RPMI洗滌兩次并在抽提緩沖液中溶解所述細(xì)胞沉淀。向500μl的溶解物(相當(dāng)于5×106細(xì)胞)中加入純化的抗體或融合蛋白(1-10μg)于4℃作用16小時(shí)。此時(shí)，將溶解物移至含有50μl填充蛋白A-瓊脂糖的試管中。將沉淀蛋白A-瓊脂糖重新懸浮并將試管于4℃振蕩孵育1小時(shí)。然后用3×高嚴(yán)格性洗滌緩沖液洗滌樣品。將沉淀的蛋白A-瓊脂糖重新懸浮于30μl的SDS樣品緩沖液中，并在10％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。在電泳凝膠后，固定所述凝膠并進(jìn)行熒光自顯影。
為確定所述細(xì)胞表面分子，該分子介導(dǎo)由PMACT誘導(dǎo)進(jìn)入B細(xì)胞周期，向PMACT和B細(xì)胞的培養(yǎng)物中加入針對(duì)Th膜蛋白的單克隆抗體。PMACT誘導(dǎo)B細(xì)胞的RNA合成是用PMREST觀測(cè)的8倍(圖1a)。單獨(dú)或以結(jié)合形式加入抗-LFA-1、抗-CD4、抗-ICAM-1，都不能抑制由PMACT引起的B細(xì)胞RNA合成。
在人類體系中，已證實(shí)抗-CD40的單克隆抗體誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖(Clark和Lane,(1991)Ann.Rev.Immunol.9:97-127)，因此暗示CD40是B細(xì)胞的重要觸發(fā)分子。為測(cè)定CD40是否參與由PMACT引起的B細(xì)胞RNA的合成，將人CD40的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1(CD40-Ig)的Fc結(jié)構(gòu)域的可溶性融合蛋白加入到PMACT和B細(xì)胞的培養(yǎng)物中。制備從Th1和Th2衍生的PMACT并將其用于刺激B細(xì)胞RNA的合成。CD40-Ig加入培養(yǎng)物導(dǎo)致對(duì)B細(xì)胞RNA合成的劑量依賴性的抑制，由Th1和Th2衍生的PMACT引起，而CD40-Ig約為5μg/ml。而CD7E-Ig融合蛋白(Damle和Aruffo,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:6403-6407(1991))甚至當(dāng)應(yīng)用25μg/ml時(shí)仍無作用。
為研究CD40-Ig是否抑制由T-非依賴性活化劑引起的B細(xì)胞的激活，在有LPS和CD40-Ig存在下培養(yǎng)B細(xì)胞。第二天，評(píng)定RNA合成(圖1c)。CD40-Ig對(duì)由LPS引起的B細(xì)胞激活無抑制作用，但抑制B細(xì)胞對(duì)PMACT的應(yīng)答。
在PMACT、IL4和IL5存在時(shí)，B細(xì)胞多克隆性分化產(chǎn)生Ig(Hodgkin等，(1990)J.Immunol.145:2025-2034；Noelle等，(1991)J.Immunol.146:1118-1124)。為評(píng)價(jià)這一過程中對(duì)CD40信號(hào)的需要，在培養(yǎng)初始、或在培養(yǎng)的隨后數(shù)天加入CD40-Ig。在培養(yǎng)初始CD40-Ig的加入(圖2a)與其缺乏時(shí)的對(duì)照水平相比，其對(duì)產(chǎn)生多克隆IgM和IgG1的抑制大于95％。與此相反，在培養(yǎng)的第一天和第二天CD40-Ig的加入則表明，其對(duì)IgM和IgG1的產(chǎn)生的抑制作用即使有的話，也是極微小的。這些數(shù)據(jù)表明24小時(shí)后，通過CD40發(fā)出的信號(hào)對(duì)于B細(xì)胞的分化分泌Ig不再是必需的。
因此，數(shù)據(jù)進(jìn)一步提示了CD40參與了PMACT引起的B細(xì)胞的激活。為證實(shí)CD40也和由完整、存活、活化的Th引起的B細(xì)胞的激活有關(guān)，進(jìn)行了研究。用不溶性抗-CD3激活Th1 16小時(shí)，收集并輻射所述Th1。在IL4存在下，將該輻射過的Th1與B細(xì)胞一起培養(yǎng)并在培養(yǎng)第三天檢測(cè)B細(xì)胞的增殖。用Th1達(dá)到B細(xì)胞增殖時(shí)需要外源性的IL4，因?yàn)門h1不產(chǎn)生IL4(Noelle等，(1989)J.Immunol.143:1807-1814)。與用PMACT的觀察相同，CD40-Ig以劑量依賴性方式抑制由輻射過的Th引起的B細(xì)胞的增殖(圖2b)。其陰性對(duì)照，CD7E-Ig未顯示明顯作用。
為觀察活化的Th1是否表達(dá)對(duì)CD40的結(jié)合蛋白，將靜息和活化的Th1(16小時(shí))用CD40-Ig或CD7E-Ig染色，隨后用FITC-抗-HigG。通過流式細(xì)胞儀法評(píng)估CD40-Ig的結(jié)合(圖3)。將用抗-CD3激活16小時(shí)的Th1，而非靜息Th1，用CD40-Ig而不用對(duì)照的CD7E-Ig染色，陽性率56％。為鑒定該CD40-Ig結(jié)合蛋白，將Th1蛋白質(zhì)用[35S]-甲硫氨酸/半胱氨酸生物合成性標(biāo)記并用CD40-Ig或CD7E-Ig免疫沉淀蛋白質(zhì)。將該免疫沉淀的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離并熒光自顯影(圖4)。一條顯著帶的表觀分子量為39kD和一條低分子量的帶是β2微球蛋白。在缺少單克隆抗體時(shí)，則看不到顯著的帶。也可從用125Ⅰ向量(vectorially)標(biāo)記的活化Th中免疫沉淀39kD帶，證實(shí)所述39kD蛋白質(zhì)是膜蛋白。
研制了針對(duì)在活化Th上而不在靜息Th上選擇性表達(dá)的抗原的特異性單克隆抗體，用以鑒定引起Th效應(yīng)階段活性的Th分子。一種這樣的單克隆抗體MR1，識(shí)別在活化Th1上選擇性表達(dá)的抗原。為研究MR1和CD40-Ig是否識(shí)別相同的分子，進(jìn)行了流式細(xì)胞學(xué)和阻斷研究?；罨亩皇庆o息的Th細(xì)胞，其CD40-Ig和MR1的染色分別大約為56％和61％(圖5a)。MR1，但不是另一倉(cāng)鼠抗-T細(xì)胞單克隆抗體抗α/β TCR，以劑量依賴性方式阻斷活化Th細(xì)胞與CD40-Ig的染色。這些數(shù)據(jù)提示CD40-Ig和MR1識(shí)別39kD Th蛋白上的重疊或同一表位。為進(jìn)一步證實(shí)CD40-Ig和MR1識(shí)別相同的分子，通過從放射標(biāo)記的Th溶解物中免疫沉淀蛋白質(zhì)，鑒定結(jié)合MR1的所述抗原。CD40-Ig和MR1兩者均免疫沉淀39kD的蛋白質(zhì)(圖1.5b)。最后，39kD蛋白質(zhì)與CD40-Ig的免疫沉淀去除了由來自活化Th的放射標(biāo)記的溶解物中的MR1識(shí)別的抗原，支持所述MR1抗原和CD40結(jié)合蛋白質(zhì)是相同的這一原則。
用MR1進(jìn)行功能性研究，以闡明這一單克隆抗體是否中和由PMACT表達(dá)的活性。將PMACT和B細(xì)胞單獨(dú)、或在倉(cāng)鼠單克隆抗體或CD40-Ig存在下培養(yǎng)。兩種倉(cāng)鼠單克隆抗體，抗α/β TCR和α-CD3不能抑制由PMACT引起的靜息B細(xì)胞的激活。與此相反，MR1或CD40-Ig抑制B細(xì)胞激活(圖6)。
所述數(shù)據(jù)顯示用單克隆抗體阻斷突出的Th表面分子(LFA-1、CD4、ICAM-1、CD3、α/β TCR)不妨礙活化Th誘導(dǎo)進(jìn)入B細(xì)胞周期的能力。與此相反，特異性針對(duì)CD40結(jié)合蛋白的CD40-Ig或單克隆抗體，以劑量依賴性方式阻斷T-依賴性B細(xì)胞的激活。而且，所述CD40結(jié)合蛋白被鑒定為是在活化而非靜息的Th膜上選擇性表達(dá)的39kD的蛋白質(zhì)。特異性針對(duì)所述39kD CD40結(jié)合蛋白的CD40-Ig和單克隆抗體二者均阻斷由PMACT引起的B細(xì)胞的激活。
盡管許多膜蛋白與Th-依賴性B細(xì)胞發(fā)送信號(hào)有關(guān)，但此處提供的證據(jù)排除了某些分子(LFA-1、CD4、CD3、α/β TCR、ICAM-1)的作用，暗示CD40作為B細(xì)胞受體用于由Th關(guān)聯(lián)發(fā)送信號(hào)。數(shù)據(jù)顯示特異性針對(duì)CD40結(jié)合蛋白的CD40-Ig和單克隆抗體抑制Th-依賴性B細(xì)胞的激活。
CD40的配體是表達(dá)于活化的、而非靜息的Th上的39kD的蛋白質(zhì)。生化研究指出，該39kD蛋白質(zhì)是一單鏈分子，因?yàn)殡娪镜倪w移不受還原劑的影響。根據(jù)在該研究中提供的功能性研究，活化的Th1和Th2二者均表達(dá)所述39kD CD40結(jié)合蛋白。這與所述功能性研究是一致的，所述研究顯示Th1和Th2二者均誘導(dǎo)B進(jìn)入細(xì)胞周期。在試圖進(jìn)一步鑒定所述39kD蛋白質(zhì)的特征時(shí)，將編碼分子量范圍為39kD的CD蛋白質(zhì)(Cd53、CD27和CD69)的cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中并測(cè)試所述細(xì)胞的CD40-Ig的結(jié)合。沒有一個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)結(jié)合CD40-Ig的蛋白質(zhì)。因此猜測(cè)該39kD蛋白質(zhì)不是這類CD蛋白質(zhì)中的一種。
在Th和B細(xì)胞間傳導(dǎo)信號(hào)的生化基礎(chǔ)是令人難以捉摸的。對(duì)作為輔助性T細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)的分子的CD40的鑒別，引起對(duì)已知偶合于CD40分子的特異性生化途徑的關(guān)注。借助于其胞外區(qū)域的4個(gè)富含半胱氨酸的基元的存在，CD40成為神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)家族的一員。已表明單克隆抗體通過CD40發(fā)送信號(hào)(Uckun等，J.Biol.Chem.266:17478-17485(1991))參與酪氨酸激酶的激活，結(jié)果增加了肌醇三磷酸的產(chǎn)生和至少4個(gè)獨(dú)特的絲氨酸/蘇氨酸激酶的激活?；趶乃鯪GF受體家族其它成員發(fā)送信號(hào)中獲得的信息，預(yù)期活化Th和B細(xì)胞間的相互作用將在同一生化過程許多環(huán)節(jié)中產(chǎn)生作用。
關(guān)于免疫熒光結(jié)合研究，用生物素-琥珀酰亞胺(Sigma)將CD40Ig融合蛋白與生物素偶合。然后通過用藻紅蛋白(PE)-鏈霉親和素(Becton-Dickinson)的二步染色法和Coulter Epics C儀器進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析。篩選多個(gè)T細(xì)胞系的代表結(jié)果在下面提呈。發(fā)現(xiàn)Jurkat和HSB2細(xì)胞系特異性地結(jié)合，而其它T細(xì)胞系包括CEM、HPBALL和小鼠thyoma則不與CD40Ig融合蛋白結(jié)合(圖7)。
實(shí)施例2用于治療或預(yù)防狼瘡的抗gp39抗體的應(yīng)用系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種特征為產(chǎn)生多種致病性自身抗體(Boumpas,Ann Int Med,1995)的疾病。這些抗體直接通過識(shí)別正常細(xì)胞上的抗原決定簇或間接通過免疫復(fù)合物的形成而引起損害，所述免疫復(fù)合物可沉積于正常組織中并激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。
如同正常的抗體應(yīng)答一樣，目前從對(duì)近親交配的小鼠品系的SLE和類-狼瘡病的研究中已了解清楚，狼瘡B細(xì)胞自身抗體的產(chǎn)生依賴于CD4+的輔助性T(Th)細(xì)胞的協(xié)同作用。實(shí)施例來自于傳統(tǒng)的SLE小鼠模型的研究，該模型為在許多方面(包括自身抗體的產(chǎn)生和免疫復(fù)合物性腎小球腎炎的發(fā)生)與人SLE相似的NZB/NZW的雌性后代病鼠。用給小鼠減少抗-CD4抗體的治療方法阻止并確實(shí)逆轉(zhuǎn)了腎炎。不幸的是，從治療的角度來說，對(duì)人類自身免疫性疾病甚至是抗-CD4抗體的短暫性治療試驗(yàn)，也可在某些病例中引起該重要的淋巴細(xì)胞的亞群的長(zhǎng)期衰竭。而且抗-CD4抗體在諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病中的小規(guī)模臨床試驗(yàn)中的功效令人失望。
更特異性的免疫抑制是切實(shí)可行的，因?yàn)殍b定了參與Th細(xì)胞輔助的數(shù)種分子相互作用，使得可以僅靶向提供積極參與為抗體產(chǎn)生提供幫助的Th細(xì)胞。一個(gè)實(shí)例是通過Th細(xì)胞上的CD28/CTLA4和B細(xì)胞上的B7.1/B7.2之間的相互作用傳遞第二信號(hào)。針對(duì)此二者的任何一個(gè)參與者的阻斷抗體可在體外使T細(xì)胞低應(yīng)答。當(dāng)給予NZB/NZW小鼠甚至疾病晚期病鼠時(shí)，目前含有小鼠細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域CTLA-4與小鼠Ig Cg2a鏈結(jié)合的融合蛋白顯示出可阻斷自身抗體的產(chǎn)生，據(jù)推測(cè)是在所治療小鼠中通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制B7.2與內(nèi)源性CTLA-4的結(jié)合發(fā)揮作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們?cè)贜ZB/NZW鼠中研究了給予抗-CD40L抗體對(duì)4到10月齡SLE小鼠的效應(yīng)。抗-CD40L抗體的治療顯著減少了這些小鼠的抗-DNA自身抗體的產(chǎn)生，緩解了腎病并延長(zhǎng)了生存期，在治療小鼠中未引發(fā)抗-抗體應(yīng)答或容易引起明顯的體液免疫系統(tǒng)的損害。這些數(shù)據(jù)包含于圖6中。在11月齡時(shí)，60％的抗-CD40L抗體治療的小鼠仍然存活，而不是未治療或Hig治療的小鼠(圖9)。對(duì)抗-CD40L抗體治療后的長(zhǎng)期存活者的腎組織學(xué)檢查顯示微不足道的病理變化并且在腎小球沒有明顯的免疫沉積。
獲得的數(shù)據(jù)也提示，抗-CD40L抗體療法可避免兩個(gè)主要的使用抗-淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面分子的抗體的免疫療法顧慮發(fā)生抗-抗體應(yīng)答和治療后長(zhǎng)期免疫抑制。在我們的一組實(shí)驗(yàn)(cohort)中，對(duì)抗-CD40L抗體治療有效、在11個(gè)月時(shí)存活的小鼠未發(fā)生抗-抗體應(yīng)答，在接受另一種屬來源抗體的動(dòng)物中幾乎是一固定現(xiàn)象。我們推測(cè)這是由于抗-CD40L抗體防止了針對(duì)自身的抗體的產(chǎn)生。在用相同的抗-CD40L抗體MR-1處理的正常小鼠研究中，未觀察到抗-MR-1的應(yīng)答，提示我們?cè)贜ZB/NZW小鼠上觀察到的應(yīng)答可能代表一種局限于自身免疫性小鼠的特別的超敏反應(yīng)。總之，這個(gè)觀察對(duì)于抗-人CD40L抗體的治療性應(yīng)用具有重要意義，因?yàn)橛每?CD40L抗體特別是用“人源化”型抗體治療避免抗體治療的嚴(yán)重并發(fā)癥。在我們的研究中，發(fā)生抗-抗-CD40L抗體應(yīng)答的小鼠在其抗-DNA抗體的產(chǎn)生或生存方面并不比對(duì)照小鼠好，提示無論如何，抗-CD40L抗體不能防止該類小鼠的產(chǎn)生抗體防。抗-抗-CD40L抗體的產(chǎn)生可導(dǎo)致快速清除隨后給予的抗-CD40L抗體，并因此失去治療療效。為支持該觀點(diǎn)，當(dāng)用非特異性倉(cāng)鼠IgG處理小鼠時(shí)，在抗-CD40L抗體處理無反應(yīng)小鼠亞群的腎小球中鑒定發(fā)現(xiàn)倉(cāng)鼠抗體沉積，而抗-CD40L抗體應(yīng)答者則無此現(xiàn)象。這一觀察與抗-抗-CD40L抗體免疫復(fù)合物在連續(xù)給予抗-CD40L抗體的腎臟中的形成和沉積是一致的，這可能使腎小球腎炎惡化而非預(yù)防。
最后，證實(shí)隨著用抗-CD40L抗體治療的停止，至多4個(gè)月后抗-KLH抗體應(yīng)答能力恢復(fù)，確立所述抗體對(duì)體液免疫系統(tǒng)的免疫抑制作用是潛在可逆的，因此抗-CD40L抗體的治療法適用于人類治療的應(yīng)用。
在這些實(shí)驗(yàn)中，將200μg的MR-1每周兩次腹腔注射給予4-10月齡NZB/NZW小鼠。同樣，通過將MR-1劑量增加到250μg，每周三次，腹腔注射4到10月齡小鼠的治療方案，實(shí)現(xiàn)治療。將這個(gè)劑量用于膠原蛋白-引起的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，導(dǎo)致治療小鼠100％存活(Durie,Science,1993)。應(yīng)用這一方案，現(xiàn)在所述NZB/NZW小鼠在11月齡時(shí)都100％存活(圖10)，而小鼠的兩個(gè)對(duì)照組在10月齡時(shí)全部死亡。
確定狼瘡疾病的治療盡管目的是用抗-gp39抗體防止NZB/NXWF1小鼠的SLE，但是并沒有預(yù)示可將這一抗體用于介入活動(dòng)性進(jìn)展性疾病狀態(tài)。為測(cè)定是否可用抗體治療而逆轉(zhuǎn)所確立的疾病，使一組小鼠發(fā)展到用尿測(cè)驗(yàn)片測(cè)定有2-3+蛋白尿(相當(dāng)與100mg/天到500mg/天)。此時(shí)，將小鼠隨機(jī)分組為繼續(xù)不治療組或接受MR1(100μg/天)組。所述10只未治療小鼠在10月齡時(shí)全部死亡。與此相對(duì)照，10只MR-1治療小鼠中的5只存活至11月齡。其中3只小鼠健康且無蛋白尿。然而，有趣的是，這些小鼠中有1只未出現(xiàn)高-滴度的抗-DNA抗體(表1)。5只存活鼠中有2只表現(xiàn)出疾患并具高滴度的抗-DNA抗體和4+蛋白尿。
因此，發(fā)現(xiàn)在腎病發(fā)生后用MR1治療可逆轉(zhuǎn)部分小鼠的疾病。在1只應(yīng)答小鼠中發(fā)現(xiàn)用MR1臺(tái)療逆轉(zhuǎn)了蛋白尿，但未逆轉(zhuǎn)抗-DNA抗體的產(chǎn)生，進(jìn)一步增加了MR1發(fā)揮著不同于消除T-依賴性抗體產(chǎn)生的其它機(jī)理的可能性。
同樣，用腫瘤壞死因子(TNF-α)治療NZB/NZW小鼠也顯示能顯著延緩腎炎的發(fā)展(Jacob,Science,1988；Gordon,1989)。令人感興趣的是，在NZB/NZW F1小鼠中觀察到的重型腎炎，部分是由于自NZW親代獲得的定位于H-2復(fù)合體上的顯性基因。所述NZW小鼠具有降低的TNF-α水平，該水平與位于H-2復(fù)合體中的TNF-α基因的多態(tài)性有關(guān)。所述NZB/NZW F1小鼠也具有顯著降低的TNF-α的水平。此外，用抗-IL-10抗體治療的NZB/NZW F1小鼠基本上延遲了腎炎的發(fā)生并延長(zhǎng)了存活期。當(dāng)與抗-TNF-α抗體聯(lián)合治療時(shí)，在治療小鼠中出現(xiàn)由IL-10-誘導(dǎo)的TNF-α水平上調(diào)介導(dǎo)的有益作用，消除了抗-IL-10應(yīng)答。
在初步實(shí)驗(yàn)中，我們也用ELISA測(cè)定了小鼠TNF-α的水平，該小鼠分別為給予前和給予后MR-1的4個(gè)治療組。所述水平示于表2。根據(jù)蛋白尿和抗-DNA抗體產(chǎn)生的降低，僅有對(duì)MR-1治療應(yīng)答的小鼠證實(shí)了TNF-α從治療前的2.16pg/ml增加到治療后的35.01pg/ml。這些數(shù)據(jù)提示所述MR-1效應(yīng)至少可部分通過NZB/NZW F1小鼠的TNF-α的增加介導(dǎo)。
此外，這些結(jié)果都證實(shí)利用抗-gp39抗體和其活性片段用于治療人類狼瘡病即系統(tǒng)性紅斑狼瘡或藥物引起的狼瘡。特別是，可將這些抗體用于特征常表現(xiàn)為腎炎的活動(dòng)性、進(jìn)行性狼瘡的治療介入中。這類抗體應(yīng)抑制所述疾病的進(jìn)程，甚至有逆轉(zhuǎn)病程的可能性。表1年齡 MR1治療 治療后 緩解 用MR1 持續(xù)時(shí)間 治療后(月) (周)蛋白尿 (周) 再治療 (周) 蛋白尿713 +4 N/AN/A --960 0 無 --660 12 無 --560 11 有 6(0) 081 死亡 - ---618 死亡 - ---660 9 有 3(+4) +466 死亡 - ---75 死亡 - --62 死亡 - --
表2．
*每一治療組的1只小鼠。
#值表示用TNF-αELISA試劑盒(Genzyme,Cambridge,MA)測(cè)定的復(fù)份的平均值。
本文引述的多種公開出版物通過引用整體結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1．一種治療需要這種治療的狼瘡患者的方法，該方法包括給予治療有效量的特異性結(jié)合gp39的抗-gp39抗體或其片段。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述狼瘡是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述藥物性狼瘡。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是人源化抗-人gp39抗體。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是嵌合型抗-人gp39抗體。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體全身性給予。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體是給予患有與狼瘡相關(guān)的腎病的狼瘡受治療者的。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述給藥導(dǎo)致減少和/或逆轉(zhuǎn)了所述腎病，其證據(jù)是抗-gp39治療后減輕了蛋白尿。
9．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-gp39抗體與腫瘤壞死因子一起聯(lián)合給予。
10．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-gp39抗體的劑量范圍從10μg/ml到1000μg/ml。
全文摘要
提供一種用抗－gp39抗體或片段治療狼瘡的方法。這種治療方法已顯示可逆轉(zhuǎn)疾病,特別是逆轉(zhuǎn)為狼瘡患者主要致死原因的狼瘡性腎病。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1303301SQ99806756
公開日2001年7月11日 申請(qǐng)日期1999年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月3日
發(fā)明者R·J·諾伊勒, C·M·伯恩斯 申請(qǐng)人:達(dá)特茅斯學(xué)院理事